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WO1989000206A1 - Procede d'analyse de fluides biologiques pour depister de l'adn cellulaire oncogene ou des fragments de celui-ci - Google Patents

Procede d'analyse de fluides biologiques pour depister de l'adn cellulaire oncogene ou des fragments de celui-ci Download PDF

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WO1989000206A1
WO1989000206A1 PCT/DE1988/000384 DE8800384W WO8900206A1 WO 1989000206 A1 WO1989000206 A1 WO 1989000206A1 DE 8800384 W DE8800384 W DE 8800384W WO 8900206 A1 WO8900206 A1 WO 8900206A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
oncogene
labeled
product
plasma
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/DE1988/000384
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English (en)
French (fr)
Inventor
Viktor Balazs
Margit BALAZS-FRÖHLICH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of WO1989000206A1 publication Critical patent/WO1989000206A1/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of cellular Onko ⁇ gene DNA, or fragments thereof, according to the preamble of claim 1.
  • the increased activity of two or more cellular oncogenes through mutation, amplification (amplification) or other disorders of gene regulation is a major cause of the malignant transformation and the diversification of the malignant cells.
  • Amplification of the cellular oncogenes on e.g. B. twice to a hundredfold may be the cause of the malignant transformation in question or occur during the progression or diversification of the malignant cells in cases of 30% to 50% of the malignant diseases. Not all types of oncogenes have a tendency to amplify. Interestingly, those oncogenes who tend to occur most frequently in malignant diseases in activated form have this tendency; three out of four in group A, two out of eight in group B and zero out of six in group C, the groups are given on page 16. In 15% to 30% of cases of malignant diseases, the oncogenes which arise from point mutation and are not present in the normal state can be detected in 3T3 NIH cells using the transfection method. It is recently known that the mutation plays an important role in a much higher percentage (40%) of the malignant cases.
  • a very significant disadvantage of this like any other method, which is based on the immunological detection of the proteins or polypeptides of cancer cell origin, is that the presence of specific antibodies, which are produced by the host or introduced for therapeutic purposes, cause unrealistic results and in general can be a significant disruptive factor.
  • the invention has for its object to provide a method for the detection of the DNA, or its fragments, from cellular oncogenes in a cellular biological fluid, such as blood plasma. Since it is necessary for this to first separate the DNA from the blood plasma, it is a further object of the invention to provide a reliable method for separating the DNA from the blood plasma.
  • the DNA that has entered the bloodstream and whose fragments can be extracted from the blood plasma, its oncogene content can be detected by in vitro molecular hybridization.
  • the detection of oncogenes or their fragments in blood plasma by in vitro hybridization is all the more suitable for this purpose because they are not only extremely specific but also highly sensitive and as little as 0.5 to 2 pg DNA / ml are specifically detected can.
  • the combination of the in vitro amplification of the target sequences of the oncogenes with the in vitro hybridization increases the sensitivity of the method by more than two orders of magnitude.
  • the total plasma DNA like the DNA that has entered the bloodstream, or fragments thereof, are isolated from the blood plasma of patients with malignant and non-malignant diseases and examined for the presence of the DNA of cellular oncogenes with in vitro molecular hybridization.
  • the qualitative and quantitative differences enable the method according to the invention for examining the oncogene DNA in the blood plasma to be used as evidence of active malignant processes.
  • the practical applicability of the method for the determination of the DNA, or its fragments, of cellular cancerogens from human blood plasma is a universal malignancy test for the detection of malignant Processes.
  • the most important advantage of this invention is that it specifies a method that can serve as a universal malignancy test: This test is based on the basic principles of the malignant transformation by the activation of cellular oncogenes and the special features of the malignant cells and tumors.
  • the second significant advantage of this method is the high sensitivity (1 pg / ml).
  • Another major advantage of the invention in contrast to irrigation tests, is that the specific antibodies which have been formed by the host or which have been introduced into the bloodstream for therapeutic purposes cannot influence the results.
  • the method according to the invention has the advantage that there is no interference with the result by specific antibodies.
  • This method also has the advantages that the risk of DNA degradation is significantly lower.
  • the greatest advantage is that the detection of the oncogene DNA is able to prove that the activation of the oncogene was caused by point mutation and which point of the oncogene was changed by mutation. For this reason, you can know how the oncogene product (OKP) is changed. All ras oncogenes can be changed in position 12, 13, 61 by point mutation. The mutation particularly affects
  • This change leads to an oncogene product in which the amino acid gly in position 21 (p21) with val (especially in colon and bladder cancer), arg (especially in Lung cancer) or confused with cys (especially in lung cancer).
  • Oligonucleotide samples for these oncogenes for the purpose of this hybridization are commercially available (Oncogene Science Inc., Mineola, NY 11501).
  • this oncogene product is only present in the tumor cells and is not present at all in the normal cells, this mutated oncogene product offers a unique, exclusive diagnostic point and therapeutic point of attack on the malignant cells.
  • the basic character of malignant processes and their behavior in the host is largely determined by which oncogenes have been activated (genetic scripture, cell oncogene profile). Until now, this could only be determined histologically in tumor tissues by in vitro nucleic acid hybridization.
  • the malignancy test according to the invention can provide this information at least partially from the blood plasma (plasma oncogene profile) long before the relatively small tumor cell mass can be visualized and reached for histological examinations.
  • the detection of the oncogene DNA is particularly suitable for examining and observing the amplification of the oncogenes.
  • an intensification (amplification) of the activated oncogenes can occur, which can cause a significantly increased aggressiveness and progression of the malignant cells.
  • the occurrence of such an enhancement can be observed early on during the follow-up with the quantitative maglignity test.
  • This means that a subclone of the tumor cells, which has the amplified oncogene, can be recognized at an early stage before it has been able to spread and could worsen the prognosis.
  • This subclone can be influenced in the early stages by specific immunotherapy or ___ m_ ⁇ onochernot_herapie and possibly destroyed.
  • Amplification of the cellular oncogenes occurs either in the primer or during the progression and diversification of the malignant cells and in approximately 30% to 50% of the cases of malignant diseases.
  • Gene products of the activated cellular oncogenes play an important, even vital function in the transformed malignant cells, many of them act as protein kinase enzymes in the cell membrane.
  • the change or impairment of this function by attacking the malignant cells in an immunospecific manner, targeting their oncogene products with monoclonal antibodies alone or in conjunction with substances having a radioactive or chemotherapeutic effect, can lead to the curative effect before the tumor cell mass could spread.
  • a plasma oncogene profile with early detection shows the specific therapy options.
  • follow-up with new oncogene samples enables new oncogene DNA to be recognized.
  • a quantitative malignancy test during the course of the disease offers an early detection of a possible amplification of a cellular oncogene and gives specific information on how to suppress or destroy this new subclone of malignant cells before a larger progression or aggressiveness is caused.
  • the plasma is quickly separated from the freshly obtained blood. Then the plasma is mixed with a detergent such as sodium duodezyl sulphate (SDS) and a proteolytic enzyme such as Proteinase K (Boehringer Mann ⁇ heim) with an aqueous medium and is then at 37 ° C for 1 to 3 h in a buffer solution (pH 7 , 5) incubated. The viscous mixture is periodically stirred by vortexing. After the incubation, extraction is carried out three times using organic solvent, such as phenol. The result is an organic phase that accounts for the largest share of the proteins, and an aqueous phase that contains essentially all of the DNA. Phenol is removed after centrifugation.
  • a detergent such as sodium duodezyl sulphate (SDS) and a proteolytic enzyme such as Proteinase K (Boehringer Mann ⁇ heim)
  • SDS sodium duodezyl sulphate
  • proteolytic enzyme such as Proteinase K (Boehringer Mann
  • the interphase is re-extracted with additional phenol and buffer.
  • the DNA is incubated in the presence of 0.25 M Na acetate at pH 5.2 with ice-cold ethanol at -20 degrees C, precipitated and centrifuged.
  • the DNA sediment (which is not always visible) is dissolved in the desired buffer or solution.
  • the DNA is subjected to DNase enzyme-free RNase treatment at 37 degrees C for 1 h.
  • the DNA is then extracted twice with phenol / chloroform and precipitated with ethanol as above and dissolved in the desired solvent.
  • the specific target sequences of all oncogenes can be significantly increased specifically by enzymatic amplification in vitro.
  • the plasma DNA is subjected to such an in vitro enzymatic amplification by means of polymerase chain reaction (PKR) in order to significantly increase the specific sequences changed by point mutation.
  • PSR polymerase chain reaction
  • Two oligonucleotide DNA fragments (each of 20 bases), complementary to the sequences flanking the target codon, are used as primers to the adjacent sequences, which have the mutated codon, by the Klen ⁇ w fragment of Escherichia coli DNA- Copy polymerase I according to the principle of Saiki and co-workers (Science 230: 1350 - 1354, 1985). Annealing of the oligomer primers to the corresponding denatured oncogene DNA from the blood plasma is continued by synthesis of the new fragments which contain the target sequence under the action of the enzyme and in the presence of deoxynucleotide triphosphate.
  • the newly synthesized target sequence serves as another template strand for the oligonucleotide primers and for the enzyme. Repeated cycles of denaturation, primer annealing and chain elongation cause an exponential increase in the target sequences. So z. B. 20-25 cycles amplification in vitro in 2 to 2.5 an approximately 200,000-fold increase in the specific target sequences.
  • the DNA is hybridized in vitro with labeled oligonucleotide oncogene samples which have the mutated codon.
  • the hybrid duplexes formed in this way are stable when the match is perfect. In the case of mismatch, the hybrid duplexes are not as stable.
  • the DNA dissolved in the water is denatured by heating to 100 ° C. for 10 min and by mixing with the same volume of 1 M NaOH and at room temperature Incubated for 20 min.
  • the alkali is then neutralized to a neutral value (pH 8.0) by admixing 1 M HCl and the salt concentration is reduced by adding 1 M NaCl, 0.3 M Na citrate, 0.5 M Tris.CL (pH 8 , 0) increased. Then it is cooled in ice.
  • the increase in the salt concentration serves to increase the binding capacity of the DNA to the solid substrate (see below).
  • the resulting solution of denatured DNA is applied in the desired amount on a solid substrate, such as pure nitrocellulose. gene to cause immobilization of the denatured DNA on the solid substrate.
  • the resulting solid substrate is washed at room temperature with 50 ml vol 6 x SSC and dried, then baked in a vacuum oven at 80 degrees C for 2 h. The baked solid substrate is then treated to prevent further binding of nucleic acid to the solid substrate.
  • the (radioisotopically or non-radioisotopically) labeled oncogene DNA sample is denatured and brought into contact in a solution with the solid substrate on which the plasma DNA is already immobilized in order to hybridize it under selected thermal and chemical conditions. This causes the labeled oncogene DNA sample to be (hybridized) by hydrogen bonds with the complementary sequence (s) of the plasma DNA immobilized on the solid substrate, if they have these co-complementary sequences.
  • the solid substrate is subjected to washing in order to remove the non-specifically bound, labeled oncogene DNA sample.
  • the solid substrate is then subjected to an analysis in order to detect the occurrence of the hybridization between the plasma DNA and the marked oncogene DNA sample.
  • an analysis in order to detect the occurrence of the hybridization between the plasma DNA and the marked oncogene DNA sample.
  • radioisotopic labeling this is determined by autoradiography, in the case of non-radioisotopic labeling by detection of the labeling substance by means of an enzyme affinity test by color reaction.
  • Radioisotopes that can be used for this procedure are, for example:
  • P 125 131 3 especially 32 but also I, I and H.
  • the non-radioisotopic labeling of the oncogene DNA samples is carried out, for example, with biotin, also by nick translation (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633-6637, 1981) and most recently with photobiotin (Nueleic Acid Research 13: 745- 761, 1985). Labeling with photobiotin is particularly straightforward, quick and inexpensive. A photobiotin labeling and detection kit is commercially available (BRESA, Sydney, South Australia). Labeling with biotin has a very important advantage: apart from the fact that it is not radioactive, results can be seen within a few hours by color reaction. You don't have to wait days, like with autoradiography.
  • Oncogene DNA samples oncogene oligonucleotide samples, labeled or unlabeled, are commercially available (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY. 11501 USA).
  • Tris.Cl pH 7.5
  • EDTA ethylenediaminotetraacetic acid
  • NaCl 0.6 M
  • SDS sodium duodecyl sulfate
  • proteinase K final concentration 200 micrograms / ml, Boehringer
  • sodium acetate of 2.5 M (pH 5.2) is added to the aqueous phase in order to reach the final concentration of 0.25 M.
  • Two volumes of ice-cold ethanol are added, mixed well and incubated at -20 degrees C and then centrifuged.
  • the DNA sediment (not always visible!) Is dissolved in TE (pH 8.0) (10 M Tris.Cl pH 8.0; 1 M EDTA pH 8.0) and with DNase-free RNase (final concentration 10 micrograms / ml) incubated at room temperature for 60 min, then extracted twice with phenol-chloroform and precipitated with ethanol as above.
  • TE pH 8.0
  • DNase-free RNase final concentration 10 micrograms / ml
  • the plasma DNA ' dissolved in water in the desired concentration, is heated to 100 ° C. for 10 min, then quickly cooled in ice, mixed with the same volume of 1 M NaOH and incubated at incineration temperature for 20 min . The denaturation of the DNA was thus achieved.
  • the denatured DNA is mixed with a solution of 1 M NaCl, 0.3 M Na citrate, 0.5 M Tris.Cl (pH 8.0) and 1M HCl, then cooled in ice.
  • a corresponding volume of the resulting solution (10 micrograms of DNA) is applied to a solid substrate such as pure nitrocellulose, the corresponding volume of the denatured DNA solution being introduced into a well of a "microfilter” plate with 96 wells (minifold I Filtration and Incubation Plate, Schleicher & Schuell, Keene, New Hampshire, 03431, USA) (Bio-Rad, Richmond, Ca, 94 804, USA) and filtered under a gentle vacuum to form a 3.0 mm diameter spot becomes.
  • the resulting filter is washed with a solution of 50 ml of 6 x SSC at Zir ⁇ merte ⁇ peratur, dried and baked at 80 degrees C for 2 h in a vacuum oven.
  • Prehybridization solution For amide 50% (Völ / Vol); 5 x Denhardt's solution; 5 x SSPE; 0.1% SDS; 100 micrograms / ml denatured DNA from herring sperm and 1 microgram / ml poly A. (Denhart's solution: Ficoll 5 g; polyvinyl pirrololidone 5 g; bovine serum albumin (Pentax fraction V. 5 g and H ⁇ 0 to 500 ml.) The filter is incubated in this prehybridization solution at 42 ° C. for 6-8 h. (20 ⁇ SSPE: 174 g NaCl; 27.6 g NaH 2 PO 4 ; 7.4 g EDTA ad 1 liter HO, pH 7.4).
  • the labeled DNA oncogene sample is denatured by heating to 100 degrees C for 5 min and quickly cooled in ice. In denatured form, the pre-hybridization solution in which the filter is already incubated becomes is mixed and further incubated at 42 degrees C for 12-20 h.
  • the solution in which the incubation was carried out is poured away and the filter is subjected to washing 3-4 times for 5-10 minutes (per wash) at a cirrhotic temperature in a large volume of 2 ⁇ SSC and 0.1% SDS .
  • the filter is subjected to two more washes for 1 - 1.5 h in a solution of 1 x SSC and 0.1% SDS at 68 degrees C. If the background is still high, further washes with higher stringencies (sharpening) are necessary: for 60 min in a solution of 0.2 x SSC and 0.1% SDS at 60 degrees C.
  • the samples were radioisotopically labeled with P 32 (specific activity: 10 cpm / mi rograrrm) by nick translation according to Rigby et al (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) or obtained unlabeled.
  • the unlabeled DNA samples were either labeled with biotin (according to Leary, Proc. Nat. Acad. Sci. 80: 4045-4049, 1983) or with photobiotin.
  • Reagents for non-radioisotopic labeling by nick translation according to Rigby et al J. Mol. Biol.
  • the nitrocellulose paper is inserted between clear acetate foils and brought close to a film that is sensitive to the X-rays.
  • An intensifying screen is attached on the opposite side and packed light-tight. After a certain time, the film is developed. The presence of the DNA or its fragments that hybridized with the oncogene DNA sample is determined by the presence of a spot on the film.
  • the DNA samples are applied in 0.1 M EDTA, otherwise the prehybridization is carried out as with radioisotopically labeled DNA samples, but the duration of the Prehybridization is shorter: 4-8 h.
  • the hybridization is carried out as with radioactive samples, but at a higher temperature (55 degrees C) for 20 h in a solution: 4 vol. Prehybridization buffer; 1 volume of about 0.5 g / ml sodium dextran sulfate and 20 ng / ml biotin-labeled DNA sample (oncogene DNA sample).
  • the dried nitrocellulose papers are at 42 degrees C for 30 min in SIMT buffer (1 M NaCl; 0.1 M Tris. Cl. PH 7.5; 2 mM MgCl- 0.05% v / v Triton X-100) with 30 mg of Bovin serum albumin incubated. After the nitrocellose paper has dried, it is incubated at room temperature for 10 min in SIMT buffer with 1 microg / ml Sigma avidin-alkaline phosphate complex, then it is shaken frequently in SIMT buffer (3 x 10 min) and STM buffer (1 M NaCl, Tris. Cl pH 9.5, 5 mM MgCl) for 2 5 min incubated.
  • the nitrocellulose paper at room temperature in the dark with substrate solution (STM buffer but only with 0.1 M NaCl) with 0.33 mg / ml nitro blue tetrazolium, 0.17 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphate and 0.33% v / v N, N-dimethylformamide mixed.
  • substrate solution STM buffer but only with 0.1 M NaCl
  • 0.33 mg / ml nitro blue tetrazolium 0.17 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphate and 0.33% v / v N, N-dimethylformamide mixed.
  • the reaction is carried out by washing the nitrocellulose paper with 10 mM Tris.Cl pH 7.5; 1mM EDTA terminated.
  • 3-5 micrographic plasma DNA is composed to 300-500 microliter buffer from 10 mM Tris.HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 irM MgCl, 1.5 mM deoxynucleotide triphosphate (dBTP, all four), 1 UM each of the two primers mixed in a plastic centrifuge tube.
  • the plasma DNA is denatured by heating at 95 degrees C for 5 min, then centrifuged to remove the condensation.
  • the tubes are incubated immediately at 30 degrees C for 2 min in order to be able to bind the two oligonucleotide primers to their target sequences by hybridization (annealing).
  • the dried filters are evaluated by autoradiography at -70 degrees C with a reinforcement label (for the night).
  • the DNA in denatured form is freely mixed in solution with the labeled oncogene DNA sample, incubated for 1-2 hours at 70 ° C. in the presence of nuclease inhibitors. Then hydroxapatite is added, incubated for 5 min at 70 degrees C in order to adsorb the product of the hybridization (plasma-DNA-labeled oncogene-DNA hybrid complexes).
  • the resulting hydroxyapatite fraction is separated as sediment by centrifugation.
  • the sediment is washed for 5 min at 70 degrees C and the product compared to the background in the hydroxyapatite fraction determined based on the label.
  • the procedure according to the invention for the detection of the DNA or its fragments, of cellular oncogenes in human blood plasma comprises several favorable reaction methods and steps in order to result in a high reliability and reproducibility.
  • Proteinase K facilitates the removal of the proteins, the guanidinium isothiocyanate treatment, the denaturation of the proteins and the cleavage of the DNA-protein complexes.
  • the rest of the proteins are removed by organic extraction.
  • the degradation and removal of the RNA is achieved by RNase treatment, because otherwise the RNA could interfere with the hybridization.
  • In vitro amplification enables a substantial increase in the target sequence and thus increases the sensitivity of the method by two orders of magnitude.
  • Baking ensures the reliability of the tight binding of the DNA to the filter. Treatment of the filter after baking prevents unspecific binding and also ensures reliability. Washing the filter after hybridization removes unnecessary, or non-specifically bound, labeled oncogene DNA samples and also contributes to reliability.
  • a semi-quantitative evaluation can also be carried out.
  • the intensity of the black spot on the X-ray film is measured by densitometry and quantitative comparisons can be made (reflectance densitometer, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA).
  • a blood plasma DNA with an oncogene sample has shown a positive test
  • the relative amount can be stormed by the dilution method.
  • a 1: 2 serial dilution is made from the blood plasma DNA and each dilution is tested by hybridization.
  • the highest dilution from which a positive signal is still emitted is the titer.
  • quantitative comparisons can be carried out during the observation period. In this way you can e.g. B. observe the amplification of one of the activated oncogenes: If the titer of an oncogene is increased disproportionately compared to other oncogenes during the follow-up, this means the amplification of this oncogene.
  • a positive test in the case of a malignant disease is usually obtained when the plasma DNA hybridizes only with oncogene group A (see above), because these oncogenes are activated in all or almost all types of malignancy. It is less common to extend hybridization to Group B.
  • oncogenes are particularly often activated in this cancer. New oncogenes are still being discovered. In the future, this may also be used as a sample.

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Description

Bezeichnung: Verfahren zur Untersuchung einer biologi¬ schen Flüssigkeit auf zellulare Onkogen-DNA bzw. deren Fragmente
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zellularer Onko¬ gen-DNA, bzw. deren Fragmente, nach dem Oberbegriff des Anspruch 1.
Verfahren zur Feststellung der zellularen Onkogen-DNA einschließlich Trennung von DNA, Denaturierung und Hybridisierung und dgl. sind auf dem Gebiet der molekularbiologischen Forschung bekannt. Reproduzier¬ barkeit, Zuverlässigkeit, Spezifizität und extreme Sensitivität der in vitro Hybridisierung zwischen DNA und DNA, sowie zwischen RNA und DNA sind aus der Literatur bekannt, die als Standardmethode für spezifische Problemlösungen Anwendung gefunden hat.
Die Hybridisierung mit DNA unter Verwendung von festem Substrat zur Immobilisierung ist seit 1965 bekannt (J. Mol. Biol. 12: 829-942; 1965) . Seitdem wurden mehrere Verbesserungen dieser Methode sowie der Methoden der Trennung der DNA aus Zellen und Geweben veröffentlicht.
Die erhöhte Aktivität von zwei oder mehreren zellularen Onkogenen durch Mutation, Verstärkung (Amplifikation) oder andere Störungen der Gen- Regulation ist eine wesentliche Ursache der malignen Transformation und der Diversifikation der bösartigen Zellen.
Amplifikation der zellularen Onkogene auf z. B. das Zweifache bis Hun¬ dertfache, kαrrnen als Ursache der malignen Transformation am Anfang in Frage oder treten während der Progression oder der Diversification der bösartigen Zellen in Fällen von 30 % bis 50 % der bösartigen Krankhei¬ ten auf. Nicht alle Sorten von Onkogenen haben die Neigung zu Amplifi¬ kation. Interessanterweise haben diejenige Onkogene diese Neigung, die in aktivierter Form am häufigsten in bösartigen Krankheiten vorkom¬ men; drei aus vier in Gruppe A, zwei aus acht in Gruppe B und null aus sechs in Gruppe C, die Gruppen sind auf Seite 16 angegeben. Durch Punkt-Mutation entstehende, neue, in normalem Zustand nicht vor¬ handene Onkogene sind in 15 % bis 30 % der Fälle von bösartigen Krank¬ heiten mit dem Transfektionsverfahren in 3T3 NIH Zellen nachweisbar. Es ist neuerdings bekannt, daß die Mutation in wesentlich höherem Prozent¬ satz (40 %) der bösartigen Fälle eine bedeutende Rolle spielt.
Die folgenden Ursachen und önstände kann man als maßgebend betrachten, für den veränderten DNA-Inhalt des Blutplasmas in bösartigen Krankhei¬ ten möglicherweise verantwortlich zu sein:
1. Amplifizierung der Onkogene, die das Mehrfache bis zu mehrfach Hun¬ dertfache des normalen Zustandes erreichen kann.
2. Neue Onkogene, die durch Mutation auftreten und in normalen Zellen überhaupt nicht vorhanden sind.
3. Erhöhte Leckage von DNA bzw. deren Fragmente aus den malignen Zellen a) aus lebenden Zellen durch defekte Membranen, b) aus sterbenden oder toten bösartigen Zellen.
4. Gesteigerter Zeil-Umsatz in bösartigen Zuständen.
5. Größere Sterberate der bösartigen Zellen.
6. Erhöhte Permeabilität der Kapillaren und Gefäße in den bösartigen Tumoren für Zellen und Makromoleküle wegen der ungeeigneten und unvollständigen Entwicklung der sonst reichlich vorhandenen Gefäße.
7. Akkumulation der bösartigen Zellen, Hauptsächlich sterbender Zellen, in den Kapillaren und Arteriolen der malignen Tumore, so können Zellelemente und Makromoleküle ohne größeren Abbau direkt in die Blutbahn langen.
8. Erhöhte Resistenz der DNA gegen degradierende Enzyme, weil sie ge¬ schützt sind wegen a) Bindung zu Proteine, b) Bindung zu RNA als DNA-RNA Komplexe, und c) Anwesenheit in ds.DNA Form.
9. Längerer Aufenthalt in der Blutbahn, weil die Clearance-Mechanismen, die für die Entfernung der DNA bzw. deren Fragmente aus der Kreis¬ lauf verantwortlich sind, wegen der ständigen "Überflutung" der Zirkulation mit diesen Substanzen in den bösartigen Zuständen, oder wegen noch nicht bekannter Ursachen, ausgeschöpft sind.
Diese Ursachen und Umstände sind in verschiedenen Kombinationen und in verschiedenem Maße in den verschiedenen Sorten von bösartigen Krankhei¬ ten und in deren verschiedenen Phasen für den veränderten DNA-Inhalt in der Blutbahn verantwortlich.
Da die rechtzeitige Erkennung die wichtigste Voraussetzung für eine Remission bzw. für die Heilung bösartiger Krankheiten ist, ist ein Universal-Malignitätstest notwendig, der im breiten Spektrum maligner Krankheiten schon relativ kleine Mengen maligner Zellen aufspüren bzw. nachweisen kann.
Einen derartigen universalen Test gibt es noch nicht. Nur zwei Verfah¬ ren haben bis jetzt als Verlaufskontrolltest routinemäßig Anwendung gefunden: Der Alpha-Feto-Proteintest für Leberkrebs und Teratocarzinom und das carcionoembryonale Antigen (CEA) für Krebssorten des digestiven Systems, die CEA produzieren.
In 1985 wurde ein Flotationsverfahren mit 16 stündigem Ultrazentrifu- gieren des Serums bekannt, das eine auf Krebs charakteristische
+ Lipoprotein-Fraktion nachweisen kann, die auch RNA mit Poly(A) RNA
Komponenten enthält. Dieses Verfahren wurde aber in präkanzerδsen Zuständen, in benignen monoklonalen Gaπmopathien und in vielen anderen Zuständen noch nicht erprobt. Die Sensitivität dieses Flotationsverfah¬ ren ist relativ gering, 0.2 mikrogramm/ml, im Vergleich zu dem hochgra¬ dig sensitiven Hybridisierungsverfahren. Damit kann man vielleicht erklären, daß das Flotationsverfahren in einigen klinisch gesicherten Krebsfällen negativ ausgefallen ist. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die RNA in der Lipoprotein Fraktion nur ein Teil der Gesamt-Plasma- Nuklein-Säuren ist, die aus den bösartigen Zellen in die Blutbahn gelangt sind. (Gesamt-Plasma-Nuklein-Säuren bösartigen Ursprungs) . Ferner ist die lange Ultrazentrifugation ein großer Nachteil des Flota¬ tionsverfahrens.
Jüngstens wurden auch zwei Immuntests als diagnostische Krebs-Tests vorgeschlagen. Ein Verfahren für die Isolierung des sogenannten "Cancer Associated Protein" (CAP) wurde veröffentlicht mit der Absicht der Ver¬ wendung als ein Krebstest (Immuntest) .
In 1985 wurde als Möglichkeit für Krebstests der Nachweis im Urin von Onkogen-Polypeptiden durch monoklonalen Antikörper mittels Iππiunoblot gedacht. Mit Polypeptiden von drei Onkogenen durchgeführte Untersuchun¬ gen haben gezeigt, daß der Unterschied zwischen normalen und pathologi¬ schen Werten nicht sehr groß ist und die Schwangerschaft höhere Werte produziert als eine bösartige Krankheit. Für die vollständige Beurtei¬ lung muß jedes Onkogen-Polypeptid für verschiedene Größen untersucht werden, was ein sehr großer Zeit- und Materialaufwand ist. Ferner zeig¬ ten die normalen Werte eine große Streuung und so kann ein bedeutendes Überlappen der normalen und der pathologischen Werte vorkommen. Zum Beispiel Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern gegen nur ein Onkogen-Polypeptid zeigten positive Werte in 25-29% der bösartigen und in 6-9% der nicht-bösartigen Fälle.
Ein sehr wesentlicher Nachteil dieser wie jeder anderen Methode, die auf dem immunologischen Nachweis der Proteine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, ist, daß die Anwesenheit von spezifischen Antikörpern, die durch den Wirt gebildet, oder für Therapiezwecke eingeführt werden, unrealistische Ergebnisse verursachen und überhaupt ein bedeutender Störfaktor sein können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis der DNA, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen in einer azel¬ lularen biologischen Flüssigkeit, wie Blutplasma anzugeben. Da es hier¬ für notwendig ist, erst die DNA aus dem Blutplasma zu trennen, ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein zuverlässiges Verfahren zur Trennung der DNA aus dem Blutplasma anzugeben.
Durch die Behandlung des Blutplasmas zur Trennung des DNA-Inhaltes, durch Unterziehen der DNA einer enzymatischen Amplifizierung in vitro, durch Immobilisierung der DNA in denaturierter Form an einem festen Substrat und durch Kontakt des festen Substrats mit der markierten denaturierten Onkogen-DNA um diese miteinander, wenn die Plasma-DNA und Onkogen-DNA-Probe komplementäre Sequenz(en) haben, zu binden (zu hybri¬ disieren) , wird ein zuverlässiges Nachweisverfahren erreicht. Diese Tatsache wird durch den Nachweis der Markierungssubstanz, oder im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie bestürmt.
Die in die Blutbahn gelangte DNA, deren Fragmente aus dem Blutplasma extrahiert werden können, kann dessen Onkogen-Inhalt durch in vitro molekulare Hybridisierung nachgewiesen werden. Der Nachweis von Onkoge¬ nen bzw. deren Fragmente im Blutplasma durch in vitro Hybridisierung ist umscmehr geeignet für diesen Zweck, weil sie nicht nur äußerst spezifisch sondern auch hochgradig empfindlich ist und so wenig wie 0,5 bis 2 pg DNA/ml spezifisch nachgewiesen werden kann. Durch die Kombina¬ tion der in vitro Amplifizierung der Target-Sequenzen der Onkogene mit der in vitro Hybridisierung erhöht sich die Empfindlichkeit der Methode um mehr als zwei Größenordnungen.
Erfindungsgemäß werden die Gesamt-Plasma DNA wie die in die Blutbahn gelangte DNA, bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma von Patienten mit bösartigen und nicht bösartigen Krankheiten isoliert und auf die Anwe¬ senheit der DNA zellularer Onkogene mit in vitro molekularer Hybridi¬ sierung untersucht.
Man konnte feststellen, daß Plasma-DNA in nicht-malignen und malignen Zuständen isoliert werden kann. Wenn die isolierte DNA des Blutplasmas auf Onkogen-Inhalt durch molekulare Hybridisierung in vitro mit mar¬ kierten Onkogen-DNA Proben untersucht wurde, konnten wesentliche Unter¬ schiede (qualitative und quantitative) zwischen bösartigen und nicht- bösartigen Krankheiten festgestellt werden.
Die qualitativen und quantitativen Unterschiede ermöglichen, daß erfin¬ dungsgemäße Verfahren zur Untersuchung der Onkogen DNA im Blutplasma als Nachweis auf aktive maligne Prozesse angewendet werden kann. Die praktische Anwendbarkeit des Verfahrens zur Feststellung der DNA, bzw. deren Fragmente, von zellularen Cnkogenen aus menschlichem Blutplasma ist ein Universal-Malignitätstest für den Nachweis bösartiger Prozesse.
Der wesentlichste Vorteil dieser Erfindung ist es, daß sie ein Verfah¬ ren angibt, das als Universal-Malignitätstest dienen kann: Dieser Test beruht auf den Grundprinzipien der bösartigen Transformation durch die Aktivierung von zellularen Onkogenen und der Besonderheiten der bösar¬ tigen Zellen und Tumore.
Der zweite bedeutende Vorteil dieses Verfahrens ist die große Empfind- lichkeit (1 pg/ml) .
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Erfindung ist im Gegenteil zu Irrmuntests, daß die spezifischen Antikörper, die sich durch den Wirt gebildet haben, oder die für Therapiezwecke in die Blutbahn eingeführt wurden, die Ergebnisse nicht beeinflussen können.
Gegenüber Nachweisverfahren, die auf irπmunologischem Nachweis der Pro¬ teine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, hat das erfin¬ dungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß eine Störung des Ergebnisses durch spezifische Antikörper entfällt.
Dieses Verfahren hat auch den Vorteile, daß die Gefahr des Abbaus der DNA ist wesentlich kleiner ist.
Der größte Vorteil ist, daß der Nachweis der Onkogen-DNA fähig ist, zu beweisen, daß die Aktivierung des Onkogens durch Punktmutation verur¬ sacht wurde und welcher Punkt des Onkogens durch Mutation verändert wurde. Aus diesem Grund kann man wissen, wie das Onkogen-Produkt (OKP) verändert ist. Alle ras Onkogene können in der Position 12, 13, 61 durch Punktmutation verändert werden. Die Mutation betrifft besonders
Ki das ras Onkogen, und zwar in der Position Codon 12. Diese Veränderung führt zu einem Onkogenprodukt, in dem die Aminosäure gly in der Posi¬ tion 21 (p21) mit val (besonders in Kolon und Harnblase-Krebs) , arg (besonders in Lungenkrebs) oder mit cys (besonders in Lungenkrebs) verwechselt wird. Oligonukleotid-Proben für diese Onkogene zum Zweck dieser Hybridisierung sind im Handel erhältlich (Oncogene Science Inc., Mineola, NY 11501) .
Da dieses Onkogen-Produkt nur in den Tumorzellen vorhanden ist und in den normalen Zellen überhaupt nicht anwesend ist, bietet dieses durch Mutation veränderte Onkogen-Produkt diagnostisch und therapeutisch einen einmaligen ausschließlichen spezifischen Angriffspunkt an den bösartigen Zellen.
So kann man, zum Beispiel, durch Irtmunoi aging, intravenöse Verwendung von monoklonalen Onkogen-Produkt Antikörpern, verbunden mit einem Ra¬ dioisotop, bösartige Zellen im Körper schon in einem Stadium der bösar¬ tigen Krankheit, wenn die üblichen bildgebenden Maßnahmen noch negative Resultaten geben, Visualisieren.
Mit monoklonalen anti-OKP spezifischen Antikörpern, allein oder in Ver¬ bindung mit radioaktiven oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen, oder durch Hemπung der translationalen Aktivität der entsprechenden Onkogen-Transkripte (mKNA) kann man ausschließlich nur die bösartigen Zellen beeinflussen bzw. vernichten, ohne die normalen Zellen zu be¬ schädigen.
Der Nachweis zellularer Onkogen-DNA bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma bietet weitere, für die Therapie maßgebende Informationen:
1. a. Der Grundcharakter maligner Prozesse und ihr Verhalten im Wirt ist wesentlich dadurch bestimmt, welche Onkogene aktiviert wurden (Ge- netic Scripture, Zell-Onkogenprofil) . Dies konnte bisher nur hi- stologisch in Tumorgeweben durch in vitro Nukleinsäure-Hybridisie- rung bestiitmt werden. Der erfindungsgemäße Malignitätstest kann diese Auskunft zumindest teilweise aus dem Blutplasma liefern (Plasma-Onkogen-Profil) , lange bevor die relativ kleine Tumorzell¬ masse visualisierbar und für histologische Untersuchungen erreich¬ bar ist.
b. Während der malignen Prozesse in vitro sowie während des Bestehens der bösartigen Krankheit in Patienten können neue Onkogene zusätz- lieh aktiviert werden, was zu einer bedeutenden Progression der Bösartigkeit führen kann. Diese Gefahr kann mit den Malignitäts- test während der Verlaufskontrolle frühzeitig dadurch erkannt werden, daß eine neue Onkogen-DNA aus dem Blutplasma identifiziert wird, welche bisher im Plasma nicht vorhanden war.
c. Der Nachweis der Onkogen-DNA ist besonders geeignet, um die Ampli¬ fikation der Onkogene zu untersuchen und zu beobachten. Während des Krankheitsablaufs kann eine Verstärkung (Amplifikation) der aktivierten Onkogene auftreten, wodurch eine wesentlich erhöhte Aggressivität und Progression der bösartigen Zellen verursacht werden kann. Das Auftreten einer solchen Verstärkung kann mit dem quantitativ ausgeführten Maglignitätstest schon frühzeitig während der Verlaufskontrolle beobachtet werden. Das bedeutet, daß ein Subklon der Tumorzellen, der das amplifizierte Onkogen hat, früh¬ zeitig, bevor er sich ausbreiten konnte und die Prognose sehr verschlechtern könnte, erkannt werden kann. Dieser Subklon kann im Frühstadium durch spezifische Immuntherapie oder ___m_τιonochernot_hera- pie beeinflußt und gegebenenfalls vernichtet werden. Amplifikation der zellularen Onkogene (auf das Zwei- bis Hundertfache) tritt entweder im Primertu or oder während der Progression und Diversi¬ fikation der bösartigen Zellen und in ungefähr 30 % bis 50 % der Fälle der bösartigen Krankheiten auf.
2. Genprodukte der aktivierten zellularen Onkogene spielen eine wich¬ tige, sogar vitale Funktion in den transformierten bösartigen Zellen, viele von ihnen fungieren als Protein-Kinase-Enzyme in der Zellmem¬ bran.
Die Veränderung bzw. Beeinträchtigung dieser Funktion durch Angriff auf die bösartigen Zellen immunspezifisch, gezielt auf ihre Onkogen- produkte mit monoklonalen Antikörpern allein oder gebunden mit radio¬ aktiv oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen kann zur heilenden Wirkung führen, bevor die Tumorzellmasse sich verbreiten konnte. Ein Plasma-Onkogenprofil bei Früherkennung zeigt die spezifischen Thera- pieπvöglichkeiten. Die Verlaufskontrolle mit neuen Onkogen-Proben er- möglicht es, neu aufgetretene Onkogen-DNA zu erkennen. Ein quantita¬ tiv durchgeführter Malignitätstest bietet während des Krankheitsver¬ laufs eine Früherfassung einer eventuellen Amplifizierung eines zel¬ lularen Onkogens und gibt spezifische Hinweise, wie man diesen neuen Subklon von bösartigen Zellen unterdrücken bzw. vernichten kann, bevor eine größere Progression oder Agressivität verursacht ist.
Die Kombination von in vitro enzymatischer Amplifizierung mit der in vitro (Oligonukleotide) Hybridisierung erhöht die Empfindlichkeit der Methode um mehr als zwei Größenordnungen. Dieses kombinierte Verfah¬ ren übertrifft hinsichtlich der Sensitivität alle zur Zeit möglichen Methoden, inbegriffen ELISA, für den Nachweis von Onkogen-Produkten.
Die Erhöhung um zwei Größenordnungen der Sensitivität eines Maligni- tätstests bedeutet einen therapeutisch sehr wichtigen Vorsprung von mehreren Monaten in der Früherkennung maligner Prozesse und deren Rekurrenz nach durchgeführter Therapie.
Da die durch Punktmutation veränderten und so aktivierten Onkogene in den normalen Zellen überhaupt nicht vorkommen, ist der Nachweis dieser Onkogene immer von einer großen diagnostischen Bedeutung. Zwar wurden durch Mutation aktivierte ras Onkogene gelegentlich in einigen Präkanzerosenzuständen aus Geweben nachgewiesen, aber damit die DNA oder deren Fragmente dieser Onkogene in die Blutbahn gelangen können, sind die Besonderheiten der malignanten Transformation und der bösar¬ tigen Tumore notwendig.
Im folgenden wird die Erfindung genauer erläutert.
Aus dem frischgewonnenen Blut wird das Plasma schnell separiert. Dann wird das Plasma mit einem Detergens, wie Natriumduodezylsulphat (SDS) und einem proteolytischen Enzym, wie Proteinase K (Boehringer Mann¬ heim) mit einem wassrigen Medium vermischt und wird dann bei 37 Grad C für 1 bis 3 h in einer Pufferlösung (pH 7,5) inkubiert. Die viskose Mischung wird durch Vortexing periodisch umgerührt. Nach der Inkuba¬ tion wird durch organisches Lösungsmittel, wie Phenol, dreimal extra¬ hiert. Das Ergebnis ist eine organische Phase, die den größten Anteil der Proteine, und eine wassrige Phase, die im wesentlichen die gesamte DNA enthält. Phenol wird nach Zentrifugieren entfernt. Die Interphase wird mit zusätzliehen Phenol und Puffer reextrahiert. Nach der dritten Extraktion wird die DNA in Anwesenheit von 0,25 M Na-azetat bei pH 5,2 mit eiskaltem Äthanol bei -20 Grad C inkubiert, prezipitiert und zen- trifugiert. Das DNA-Sediment (das nicht immer sichtbar ist) wird in den gewünschten Puffer oder der Lösung gelöst.
Die DNA wird einer DNase-Enzym-freien RNase-Behandlung bei 37 Grad C für 1 h unterzogen. Danach wird die DNA zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Äthanol wie oben prezipitiert und in dem gewünsch¬ ten Lösungsmittel gelost.
Die spezifischen Target-Sequenzen aller Onkogene können durch enzyma- tische Amplifizierung in vitro spezifisch wesentlich vermehrt werden.
Im Fall der durch Punktmutation veränderten Onkogene wird die Plasma- DNA einer solchen in vitro enzy atischen Amplifizierung mittels Poly- merase-Ketten-Reaktion (PKR) unterzogen, um die spezifischen, durch Punktmutation veränderten Sequenzen wesentlich zu vermehren.
Zwei Oligonukleotid-DNA Fragmente (je von 20 Basen) , komplementär zu den Sequenzen, die das Target-Kodon flankieren, werden als Primere benutzt, um die angrenzenden Sequenzen, welche das mutierte Kodon haben, durch das Klenσw-Fragment von Escherichia coli DNA-Polymerase I zu kopieren nach dem Prinzip von Saiki und Mitarbeiter (Science 230: 1350 - 1354, 1985) . Annealing der Oligαner-Primere zu den entsprechen¬ den denaturierten Onkogen-DNA aus den Blutplasma wird durch Synthese der neuen Fragmente, die die Target Sequenz enthalten, unter der Wirkung des Enzyms und in der Anwesenheit von Deoxynukleotid-Triphos- phat fortgesetzt. Die neu synthetisierte Target Sequenz dient als weiterer Templat-Strang für die Oligonukleotid-Prirnere und für das Enzym. Wiederholte Zyklen von Denaturierung, Primer-Annealing und Kettenelongation verursachen eine exponentielle Vermehrung der Target Sequenzen. So ergeben z. B. 20 - 25 Zyklen Amplifizierung in vitro in 2 bis 2,5 eine etwa 200.000-fache Vermehrung der spezifischen Target-Sequenzen.
Die so vermehrten Onkogen-DNA. Sequenzen werden denaturiert und auf vorbereitete Nylon-Filter aufgetragen, dann entweder durch UV-Licht oder Backen in Vakuum-Ofen immobilisiert. Die Nylon-Filter werden dan so behandelt, daß das Binden weiterer Nuklein Säuren verhindert wird. Die so behandelten Filter werden mit verschiedenen Oligonukleotid- Onkogen Proben, die das durch Punktmutation veränderte Kodon enthal¬ ten, in Kontakt gebracht.
Um die durch Punktmutation veränderten Onkogen-Sequenzen in der Plasma-DNA vor und besonders nach der in vitro enzymatischen Amplifi¬ zierung zu identifizieren, wird die DNA mit markierten Oligonukleotid Onkogen-Proben, die das mutierte Kodon haben, in vitro hybridisiert. Die so geformten Hybrid-Duplexe sind dann stabil, wenn das Match perfekt ist. Im Falle von Mismatch sind die Hybrid-Duplexe nicht so stabil. Diese Unterschiede werden ausgenutzt, um die Mismatch-Duplexe durch Auswahl der Temperatur, der Ion-Stärke und der Zusaπtnensetzung der Waschlösung besonders beim Waschen (nach Empfehlung des Herstel¬ lers) zu eliminieren und die durch perfektes Match entstandenen Hybrid-Duplexe zu behalten. Deren Anwesenheit wird dann durch Autora- diographie nachgewiesen.
Wenn die Plasma-DNA auf nicht-mutierte Onkogene ohne in vitro Ampli¬ fizierung untersucht wird, wird die im Wasser gelöste DNA denaturiert durch Erhitzen auf 100 Grad C für 10 min und durch Mischen mit glei¬ chem Volumen 1 M NaOH, und bei Zimmertemperatur 20 min inkubiert. Dan wird das Alkali neutralisiert auf einen neutralen Wert (pH 8,0) durch Zumischung von 1 M HCl und die Salzkonzentration wird durch Zugabe von 1 M NaCl, 0,3 M Na-zitrat, 0,5 M Tris.CL (pH 8,0) erhöht. Dann wird in Eis gekühlt. Die Erhöhung der Salzkonzentration dient der Erhöhung der Bindefähigkeit der DNA an das feste Substrat (siehe unten) .
Die resultierende Lösung von denaturierter DNA wird in gewünschter Menge auf einem festen Substrat, wie reine Nitrozellulose, aufgetra- gen, um eine Immobilisierung der denaturierten DNA an dem festen Substrat zu bewirken. Das resultierende feste Substrat wird einer Wäsche bei Zimmertemperatur mit 50 ml vol 6 x SSC unterzogen und getrocknet, dann in einem Vakuumherd bei 80 Grad C für 2 h gebacken. Das gebackene feste Substrat wird danach behandelt, um ein weiteres Binden von Nuklein Säure an das feste Substrat zu verhindern.
Die (radioisotopisch oder nicht-radioisotopisch) markierte Onkogen DNA-Probe wird denaturiert und in einer Lösung mit dem festen Substrat, auf dem die Plasma-DNA schon immobilisiert ist, in Kontakt gebracht, um damit unter ausgewählten thermischen und chemischen Bedingungen zu hybridisieren. So wird bewirkt, daß die markierte Onkogen DNA-Probe durch Wasserstoffbindungen mit der komplementären Sequenz(en) der auf dem festen Substrat imobilisierten Plasma-DNA, wenn sie diese komplanentären Sequenzen haben, verbunden (hybridi¬ siert) ist.
Nach einem vorbestiπmten Zeitraum wird das feste Substrat einer Wäsche unterzogen, um die nicht spezifisch gebundene, markierte Onkogen DNA- Probe zu entfernen.
Das feste Substrat wird anschließend einer Analyse unterzogen, umd das Stattfinden der Hybridisierung zwischen der Plasma-DNA und der mar¬ kierten Onkogen-DNA Probe nachzuweisen. Das wird im Falle der radio¬ isotopischen Markierung durch Autoradiographie, im Falle der nicht- radioisotopischen Markierung durch Nachweis der Markierungssubstanz mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion bestimmt.
Eine Menge von gereinigter molekularisch klonierter DNA, die die Sequenz als Kode für Onkogen enthält, wird entweder radioisotopisch oder nicht-radioisotopisch markiert. Die radioisotopische Markierung wird durch Nick-Translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113:237- 251, 1977) im Fall von oligonukleotide Onkogen Proben durch Endmar- kierung durchgeführt, um hohe spezifische Aktivität zu erreichen. Für diese Verfahrensweise verwendbare Radioisotope sind beispielsweise •
P 125 131 3 besonders 32 aber auch I , I und H . Die nicht-radioisotopische Markierung der Onkogen-DNA Proben wird beispielsweise mit Biotin, auch durch Nick-Translation (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:6633-6637, 1981) und jüngstens mit Photobiotin (Nueleic Acid Research 13: 745-761, 1985) durchgeführt. Die Markierun mit Photobiotin ist besonders unkompliziert, schnell und preisgünstig. Ein Photobiotin-Markierungs- und Nachweis-Kit wird kommerziell angebo¬ ten (BRESA, Adelaide, South Australia) . Die Markierung mit Biotin hat einen sehr wichtigen Vorteil: Abgesehen davon, daß sie nicht radioak¬ tiv ist, kann man Ergebnisse innerhalb einiger Stunden durch Farbreak¬ tion sehen. Man muß nicht Tage warten, wie bei der Autoradiographie.
Onkogen-DNA Proben, Onkogen-Oligonucleotid-Proben, markiert oder un¬ markiert, sind kommerziell erhältlich (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY. 11501 USA) .
Das folgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken:
Beispiel
Es wird 20 ml Blut mit 20 IE/ml Heparin entnommen und das Blutplasma wird so schnell wie möglich separiert. Es wird in zwei Einweg Plastik- Zentrifugen-Rδhrchen je 5 ml Blutplasma pipettiert. Eines wird tiefge¬ kühlt für eventuelle Wiederholung, oder für ergänzende Untersuchungen als Reserve aufbewahrt. Das andere wird gleich in Bearbeitung genαtmen.
Es wird ein Gemisch aus 0,4 M Tris.Cl (pH 7,5) ; 50 mM Äthylendiaminote- traessigsäure (EDTA) ; 0,6 M NaCl; 2 % (Gew/Vol) Natriumduodecylsulfat (SDS) und Proteinase K (Endkonzentrtion 200 mikrogramm/ml,Boehringer) hinzugefügt und bei 37 Grad C für 1 bis 3 h inkubiert mit häufigem Vortexing.
Anschließend wird gleiches Volumen von Phenol und Chloroform-Isoamylal- kohol (24:1) eingemischt und durch Schütteln extrahiert, sodann durch Zentrifugieren die organische und die unorganische (wassrige) Phase getrennt. Die unorganische Phase wird separiert und aufbewahrt. Die Interphase wird mit Phenol-Chloroform wie oben extrahiert. Die wassrigen Phasen werden gemeinsam wieder mit Phenol und Chloroform noch zweimal extrahiert.
Nach der dritten Extraktion wird zu der w ssrigen Phase Natriumazetat von 2,5 M (pH 5,2) zugemischt, um die Endkonzentration von 0,25 M zu erreichen. Zwei Volumina von eiskaltem Äthanol werden zugefügt, gut vermischt und bei -20 Grad C inkubiert und danach zentrifugiert.
Das DNA-Sediment (nicht immer sichtbar!) wird in TE (pH 8,0) (10 M Tris.Cl pH 8,0; 1 M EDTA pH 8,0) gelöst und mit DNase-freier RNase (Endkonzentration 10 mikrogramm/ml) bei Zimmertemperatur für 60 min inkubiert, danach wird mit Phenol-Chloroform zweimal extrahiert und mit Äthanol wie oben präzipitiert.
Die Extrahierung der DNA ist wesentlich erleichtert und es wird eine serienweise Untersuchung ermöglicht durch die Anwendung des Instruments "Nueleic Acid Extractor" (Analytic Biosystem, Foster City, Ca, 94404, USA) . Das oben geschriebene Verfahren ist leicht adaptierbar für den "Nueleic Acid Extractor".
Bei der Untersuchung der nicht-mutierten Onkogene wird die Plasma-DNA ' gelöst in Wasser in der gewünschten Konzentration auf 100 C für 10 min erhitzt, dann schnell in Eis gekühlt, mit gleichem Volumen von 1 M NaOH gemischt und bei Ziirniertemperatur für 20 min inkubiert. Damit wurde die Denaturierung der DNA erreicht.
Die denaturierte DNA wird mit einer Lösung von 1 M NaCl, 0,3 M Na¬ zitrat, 0,5 M Tris.Cl (pH 8,0) und IM HCl gemischt, dann in Eis gekühlt.
Ein entsprechendes Volumen von der resultierenden Lösung (10 mikrogramm DNA) wird auf einem festen Substrat wie reines Nitrozellulose aufgetra¬ gen, wobei das entsprechende Volumen von der denaturierter DNA Lösung in eine Vertiefung einer "Mikrofilter"-Platte mit 96 Vertiefungen ein¬ gebracht (Minifold I Filtration und Inkubations-Platte, Schleicher & Schuell, Keene, New Hampshire, 03431, USA) (Bio-Rad, Richmond, Ca, 94 804, USA) und unter gelindem Vakuum unter Bildung eines Flecks von 3,0 mm Durchmesser, filtriert wird. Der resultierende Filter wird von einer Lösung von 50 ml von 6 x SSC bei Zirπmerteπperatur gewaschen, getrocknet und bei 80 Grad C für 2 h im Vakuumherd gebacken.
Nach dem Backen wird der resultierende Filter einer Behandlung, der sogenannten Prehybridisierung in Prehybridisierungslosung unterzogen. Prehybridisierungslosung: For amid 50% (Völ/Vol) ; 5 x Denhardt"s Lösung; 5 x SSPE; 0,1 % SDS; 100 mikrogramm/ml denaturierte DNA aus Heringssper¬ ma und 1 mikrograπm/ml Poly A. (Denhart's Lösung: Ficoll 5 g; Polyvinyl- pirrololidon 5 g; Rinderserumalbumin (Pentax Fraktion V. 5 g und H~0 zu 500 ml) . Der Filter wird in dieser Prehybridisierungslosung bei 42 Grad C für 6 - 8 h inkubiert. (20 X SSPE: 174 g NaCl; 27,6 g NaH2P04; 7,4 g EDTA ad 1 Liter H-O, pH 7,4) .
Die markierte DNA-Onkogen Probe wird durch Erwärmung auf 100 Grad C für 5 min denaturiert und schnell in Eis abgekühlt. In denaturierter Form wird zu die Prehybridisierungslosung, in der der Filter schon inkubiert ist, zugemischt und weiter inkubiert bei 42 Grad C für 12 - 20 h.
Nach der Inkubierung wird die Lösung, in der die Inkubation durchgeführt wurde, weggegossen und der Filter 3 - 4 mal für 5 - 10 min (je Wäsche) einer Wäsche bei Zirrmerte peratur im großen Volumen von 2 x SSC und 0,1 % SDS unterzogen. Der Filter wird zwei weiteren Wäschen für 1 - 1,5 h in einer Lösung von 1 x SSC und 0,1 % SDS bei 68 Grad C unterworfen. Wenn der Hintergrund noch iiπner hoch ist, sind weitere Wäschen bei höheren Stringenzien (Schärfen) notwendig: Für 60 min in einer Lösung von 0,2 x SSC und 0,1 % SDS bei 60 Grad C.
Die folgenden, gut bekannten, käuflichen 18 molekularisch klonierten menschlichen Onkoge wurden als Onkogen-DNA Probe gebraucht, die hier ungefähr nach Häufigkeit ihres Vorkoπmens mit erhöhter Aktivität in menschlichen Bösartigkeiten gruppiert sind:
In allen bzw. praktisch in seltenen, nur in in sehr seltenen allen Bösartigkeiten: gewissen Formen von Bös- Formen von Bösar- artigkeiten: tigkeiten:
A. B. C.
fos myc Ha-ras Ki-ras
Figure imgf000018_0001
Oligonucleotid-Proben: ras Ki (codon 12) , siehe auch S. 6, waren durch
Endmarkierung markiert. Die Proben wurden radioisotopisch mit P 32 markiert (spezifische Akti- o vität: 10 cpm/mi rograrrm) durch Nick-Translation nach Rigby et al (J. Mol. Biol. 133:237-251, 1977) oder unmarkiert erhalten. Die unmarkierten DNA Proben wurden entweder mit Biotin (nach Leary, Proc. Nat. Acad. Sei. 80:4045 - 4049, 1983) oder mit Photobiotin markiert. Reagenzien für die nicht-radioisotopische Markierung durch Nick-translation nach Rigby et al (J. Mol. Biol. 133:237-251, 1977) mit Biotin und für die Visuali¬ sierung der Resultate der Hybridisierung mit Enymaffinitätsverfahren durch Farbreaktion werden in Handel angeboten (Amersham, Little Chalfont, England) . Markierungen mit Photobiotin erfolgt nach Vorschrif des Herstellers (BRESA, Adelaide, South Australia) : Nach kurzer Be¬ strahlung mit sichtbarem Licht geht Photobiotin eine stabile Bindung mi Nukleinsäuren ein. Die so mit Biotin markierte DNA kann mit 2-Butanol Extraktion mit Äthanol-Precipitation isoliert werden und kann als sta¬ bile markierte Probe für ein halbes Jahr in 0.1 M EDTA bei -15 Grad C stabil aufbewahrt werden.
Das Nitrocellulose-Papier im Falle radioisotopischer Markierung wird zwischen klaren Azetatfolien eingesetzt und in die Nähe eines für die Röntgenstrahlen empfindlichen Filmes gebracht. Ein Verstärkerschirm wir an der entgegengesetzten Seite angebracht und lichtdicht verpackt. Nach einer bestimmten Zeit wird der Film entwickelt. Die Anwesenheit der DNA bzw. deren Fragmente, die mit der Onkogen-DNA Probe hybridisierten, wir durch die Anwesenheit eines Flecks auf dem Film bestimmt.
Im Falle nicht-radioisotopisch markierter Onkogen-DNA Proben, wie im Falle der mit Photobiotin markierten Onkogen-DNA Proben, werden die DNA Proben in 0.1 M EDTA aufgetragen, sonst wird die Prehybridisierung so ausgeführt wie mit radioisotopisch markierten DNA Proben, aber die Dauer der Prehybridisierung ist kürzer: 4-8 h. Die Hybridisierung wird durchgeführt wie mit radioaktiven Proben, aber bei höherer Temperatur (55 Grad C) für 20 h in einer Lösung: 4 Vol. Prehybridisierungspuffer; 1 Vol. von etwa 0.5 g/ml Natrium Dextransulfat und 20 ng/ml Biotin-mar- kierte DNA Probe (Onkogen-DNA Probe) .
Die getrockneten Nitrocellulose-Papiere werden bei 42 Grad C für 30 min in SIMT Puffer (1 M NaCl; 0,1 M Tris. Cl. pH 7.5; 2 mM MgCl- 0.05% v/v Triton X-100) mit 30 mg von Bovin Serum Albumin inkubiert. Nachdem das Nitrocellose-Papier getrocknet ist, wird es bei Zimmertemperatur für 10 min in SIMT-Puffer mit 1 mikrogra m/ml Sigma Avidin-alkalische Phospha- tase-Komplex inkubiert, dann wird mit häufigem Schütteln in SIMT Puffer (3 x 10 min) und STM Puffer (1 m NaCl, Tris. Cl pH 9.5, 5 mM MgCl ) für 2 5 min inkubiert.
Für Farbreaktionen wird das Nitrocellulose Papier bei Ziπmertemperatur im Dunkeln mit Substrat-Lösung (STM Puffer aber nur mit 0.1 M NaCl) mit 0.33 mg/ml Nitro-blau-tetrazolium, 0.17 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphat und 0.33% v/v N,N-dimethylformamid vermischt. Die Reaktion wird durch Waschen des Nitrocellulose Papiers mit 10 mM Tris.Cl pH 7.5; 1 mM EDTA beendet.
Für die Amplifizierung in vitro wird 3 - 5 mikrograπm Plasma-DNA zu 300 - 500 mikroliter Buffer zusaπmengesetzt aus 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 irM MgCl, 1,5 mM Deoxynukleotid-Triphosphat (dBTP, alle vier) , 1 UM je von der zwei Primeren in einem Plastik-Zentrifugenrδhr- chen zugemischt. Die Plasma-DNA wird durch Erhitzen bei 95 Grad C für 5 min denaturiert, dann zentrifugiert, um die Kondensation zu entfernen. Die Röhrchen werden gleich bei 30 Grad C für 2 min inkubiert, um die zwei Oligonukleotid-Primere zu ihren Target-Sequenzen durch Hybridi¬ sierung binden zu können (Annealing) . Danach wird 6 - 10 mikroliter von Klenow Fragment des Escherichia coli DNA Polymerase I Enzymes (Biolabs, 0,5 Einheit/ul in 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 50 mM Nacl und 10 mM MgCl2) zugenischt. Diese Mischung wird zusätzlich noch für 2 min bei 30 Grad C inkubiert. Diese Zyklen von Denaturieren, Zentrifugieren, Annealing und Kettenelongation werden 19-24-mal wiederholt, die Zeit für die Dena¬ turierung wird aber hier anstatt 5 min auf 2 min reduziert. Durch die 20 - 25 Wiederholung wird ein Endvolumen von 420 - 700 ul erhalten.
Ca. 110 - 200 ng der in vitro amplifizierten Plasma DNA wird auf Nylon- Filter (Zetabind oder Zetaprobe) , die vorher 20x SSPE befeuchtet wurden, aufgetragen, dann werden die Filter einer Wäsche in 20x SSPE unterzogen und danach durch Backen bei 80 Grad C für 60 min iirmobilisiert, dann in 5x SSPE, 5x Denhardfs Lösung, 0,5 % SDS und 30 % Formamid für 4 h bei 42 Grad C inkubiert (prehybridisiert) .
32 Die Hybridisierung wird mit P -endmarkierten Oligonukleotid-Onkogen- c
Proben (2x10 cpm/ l) , die die mutierte Sequenz haben, im selben Buffer bei 42 Grad C für 18 h durchgeführt. Dann werden die Filter einer Wäsche in 2x SSPE, 0,1 % SDS zweimal bei Zimmertemperatur für 30 min und danach in 5x SSPE, 0,1 SDS für 6 min für 60 Grad C und in Hybridisationsbuffer aber ohne Denhardt's Lösung und ohne Hering-Sperma-DNA für zwei kurze Wäschen bei Zimmertemperatur unterzogen. Schließlich wird eine Wäsche in diesem Buffer für 30 min bei 58 Grad C durchgeführt.
Die getrockneten Filter werden durch Autoradiographie bei -70 Grad C mit Verstärkungsschild (fürs Übernacht) ausgewertet.
Bei der frei in Lösung Hybridisierung wird die DNA in denaturierter Form frei in Lösung mit der markierten Onkogen-DNA Probe gemischt, inkubiert für 1 - 2 h bei 70 Grad C in Anwesenheit von Nuklease-Inhibitoren. Dann wird Hydroxapatit zugeführt, für 5 min bei 70 Grad C inkubiert, um das Produkt der Hybridisierung (Plasma-DNA-markierte Onkogen-DNA Hybrid- Komplexe) zu adsorbieren.
Die so entstandene Hydroxyapatit-Fraktion, wird als Sediment durch Zen- trifugieren separiert. Das Sediment wird einer Wäsche für 5 min bei 70 Grad C unterzogen und das Produkt im Vergleich zum Hintergrund in der Hydroxyapatit-Fraktion aufgrund der Markierung bestimmt.
Die erfindungsgemäße Arbeitsweise zum Nachweis der DNA bzw. deren Frag¬ mente, von zellularen Onkogenen im menschlichen Blutplasma umfaßt meh¬ rere günstige Reaktionsweisen und Schritte, um eine hohe Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit zu ergeben.
Die Verwendung von Proteinase K erleichtert die Entfernung der Proteine, die Guanidinium-Isothiocyanat-Behandlung die Denaturierung der Proteine sowie die Spaltung der DNA-Protein Komplexe. Der Rest der Proteine wird durch organische Extraktion entfernt. Der Abbau und das Entfernen der RNA wird durch RNase-Behandlung erreicht, weil die RNA sonst bei der Hybridisierung interferieren könnte. In vitro Amplifizierung ermöglicht eine wesentliche Vermehrung der Target-Sequenz und erhöht so die Em¬ pfindlichkeit der Methode um zwei Größenordnungen. Das Backen sorgt für die Zuverlässigkeit der festen Bindung der DNA an das Filter. Die Be¬ handlung des Filters nach dem Backen verhindert unspezifische Bindungen und sorgt auch für Zuverlässigkeit. Die Wäsche des Filters nach Hybridi¬ sierung entfernt überflüssige, oder unspezifisch gebundene, markierte Onkogen-DNA Proben und trägt auch zur Zuverlässigkeit bei.
Es sind zahlreiche Modifizierungen möglich.
Eine quantitative Auswertung des positiven Tests ist möglich.
Eine semiquantitative Auswertung kann auch durchgeführt werden. In die¬ sem Fall wird die Intensität des schwarzen Flecks am Röntgenfilm durch Densitcmetrie gemessen und können quantitative Vergleiche gemacht werden (Reflectance Densitometer, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA) .
Quantitativer Test:
Wenn ein Blutplasma-DNAmit einer Onkogen Probe einen positiven Test gezeigt hat, kann die relative Menge durch das Dilutionsverfahren be¬ stürmt werden. In diesem Fall wird aus der Blutplasma-DNA eine 1:2 Se- rialverdünnung gemacht und wird jede Verdünnung durch Hybridisierung getestet. Die höchste Verdünnung, aus der noch ein positives Signal ausgeht, ist der Titer. So können bei der Verlaufskontrolle eines Pa¬ tienten, während der Beobachtungszeit, quantitative Vergleiche durchge¬ führtwerden. Auf diese Weise kann man z. B. die Amplifizierung eines der aktivierten Onkogene beobachten: Wenn während der Verlaufskontrolle der Titer eines Onkogens unproportionell erhöht wird im Vergleich zu anderen Onkogenen, bedeutet das die Amplifizierung dieses Onkogens.
Der Test ist positiv:
1. Wenn eine der durch Mutation veränderten Onkogen-Proben (Oligonucleo- tid-Proben) mit der Plasma-DNA ein positives Signal gibt.
2. Wenn, zwei oder mehrere zellulare Onkogene, die nicht durch Mutation aktiviert sind, im Blutplasma nachweisbar sind.
3. Wenn, die Anwesenheit eines der Onkogene, das nicht durch Mutation aktiviert ist, in höherem Titer nachweisbar ist.
Die Möglichkeiten 2 oder 3 können aber gelegentlich auch in nicht¬ bösartigen Krankheiten vorkamen, besonders in Zuständen mit Fieber und großen Zellabbau. In diesen Fällen wird der Zeitablauf entscheidend sein: In bösartigen Krankheiten bleibt die Positivität, oder steigt sie sogar, während sie in den nicht-bösartigen Fällen abklingt.
Im allgemeinen bekommt man einen positiven Test im Fall einer bösartige Krankheit meistens, wenn die Plasma-DNA erst nur mit der Onkogen-Gruppe A (siehe oben) hybridisierte, weil diese Onkogene in allen bzw. beinahe in allen Sorten von Bösartigkeiten aktiviert sind. Seltener braucht man die Hybridisierung auf die Gruppe B auszuweitern.
Wenn man die Krebsart kennt (in der Verlaufskontrolle) oder Verdacht ha auf eine Krebsart, kann man solche Onkogene als Proben verwenden, die i dieser Krebsart besonders häufig aktiviert sind. Es werden noch immer neue Onkogene entdeckt. Diese kann man zukünftig gegebenenfalls auch al Probe benutzen.
Wenn man aber wissen möchte, welche aktivierten Onkogene in der Blutbah anwesend sind (Plasma-Onkogen-Profil) , muß man die Blutplasma-DNA mit allen Onkogenen von Gruppe A und B und seltener von Gruppe C hybridisie ren. Dasselbe muß man tun, wenn man das Erscheinen von neuen Onkogenen in der Blutbahn während der Krankheitsablauf erfassen möchte, was aufgrund der prognostischen und therapeutischen Bedeutung sehr wichtig ist.
Es ist möglich, spezifische DNA-Fragmente von zwei oder mehreren ver¬ schiedenen Onkogenen aus dem Blutplasma simultan in demselben System, z.B. in einem Röhrchen, spezifisch zu amplifizieren. Die in vitro Amplifizierung benötigt keine intakten, vollständigen Onkogen-DNA Mole¬ küle. In Anwesenheit eines einzigen, relativ kleinen Onkogen-spezifi- schen DNA-Fragments, das die Strecke zwischen den 5'Enden der zwei Oligonukleotid-Primere überbrückt, findet eine spezifische Amplifi¬ zierung durch Primer-Kettenreaktion statt.

Claims

22P atentansp rüche
1. Verfahren zur Untersuchung einer azellularen biologischen Flüssigkeit auf die Anwesenheit von zellularer Onkogen-DNA, bzw. deren Fragmente, als Malignitätstest, bei dem man
a) aus der azellularen biologischen Flüssigkeit die DNA konzentriert oder trennt, b) das so erhaltene DNA-Produkt denaturiert und in dieser Form entwe¬ der auf einen festen Träger üimobilisiert oder frei in Lösung beläßt, c) das Produkt des Schrittes b) mit markierten Onkogen-DNA- oder Oligonukleotid-Proben in Kontakt bringt, um diese mit der DNA zu hybridisieren, wenn komplenentäre Sequenz vorliegt, die überflüs¬ sige und nicht spezifisch gebundene markierte Onkogen-DNA- oder Oligonukleotid-Proben entfernt und d) das Produkt auf die Anwesenheit markierter DNA oder Oligonukleotid bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Schritt a) eine enzymatische Amplifizierung in vitro mit der Plasma- DNA durchführt, um die spezifischen Target-Sequenzen der Onkogene zu vermehren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die azellulare biologische Flüssigkeit menschliches Blutplasma ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe radioisotopisch markierte Onkogen-DNA ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, 23
daß die Probe nicht radioisotopisch markierte, vorzugsweise mit Bio¬ tin markierte Onkogen-DNA ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Blutplasma vor der Trennung der DNA und der Immobilisierung der DNA auf den festen Träger mit einem organischen Lösungsmittel behandelt wird, um Eiweißmaterial in einer organischen Phase zu entfernen und um die DNA in der w ssrigen Phase zu erhalten.
7. Verfahren nach Anspruch 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestürmung auf Anwesenheit markierter DNA mittels autoradiographi¬ scher Technik durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung auf Anwesenheit markierter DNA mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als festes Substrat reine Nitrocellulose oder Nylon verwen¬ det.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die lirmobilisierung ein Vakuum eingesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) das Plasma mit einem Detergens und proteolytischen Enzym in Kontakt bringt; b) das Produkt der Stufe a) mit einer proteindenaturierenden Lösung, wie Guanidinium-isothiocyanat vermischt und behandelt; c) das Produkt der Stufe b) mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert unter Bildung einer im wesentlichen proteinfreien wass¬ rigen Phase, die die DNA enthält; d) das Produkt der Stufe c) mit einem Detergens und einem proteoly¬ tischen Enzym in Kontakt bringt, inkubiert, und dann die Extrak- tion der Stufe c) wiederholt; e) das Produkt der Stufe d) mit (2 vol) Äthanol präzipitiert, wäscht und in sterilem Wasser löst; f) das Produkt der Stufe e) einer RNase Enzym Behandlung unterzieht um die vorhandene RNA abzubauen und zu entfernen und dann die Extraktion der Stufe d) wiederholt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle von durch Punktmutation veränderter Onkogene die Plasma- DNA einer in vitro enzymatischen Amplifizierung mittels Polymerase- Ketten-Reaktion unterzogen wird, um sie zu vermehren.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man a) das Produkt der Stufe f) behandelt und dann denaturiert; b) das Produkt der Stufe a) auf ein festes Substrat aufträgt und durch Backen im Vakuum immobilisiert; c) das feste Substrat der Stufe b) mit einer Lösung von markierter Onkogen-DNA Probe in Kontakt bringt, um sie mit der auf dem festen Substrat immobilisierten DNA zu hybridisieren; d) das Produkt der Stufe c) im Fall radioisotopisch markierter Onko¬ gen-DNA Probe, durch Autoradiographie bestimmt; e) das Produkt der Stufe c) im Fall nicht-isotopisch markierter Onkogen-DNA Probe durch Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion be¬ stimmt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das feste Substrat der Stufe b) behandelt, um eine weitere Bindung von Nüklein- säure daran zu hindern.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die verbliebene nicht-radioaktive Markierungssubstanz des festen Substrats, die durch die Hybridisierung zwischen Plasma-DNA und der markierten Onkogen-DNA gebunden ist, mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion bestimmt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet,
ERSATZBLATT daß man als Onkogen-DNA-Probe eine individuelle Onkogen-DNA oder ein Mischung individueller Onkogen-DNAs nimmt.
17. Verfahren nach einem der der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeich net, daß man die Onkogen-DNA, die mit der auf dem festen Substrat gebundenen Plasma-DNA hybridisierte, entfernt, um das feste Substrat mit der daran verbliebenen Plasma-DNA mit einer neuen Onkogen-DNA- Probe wieder zu hybridisieren (rehybridiseren) .
ERSATZBLATT ISA/EP
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