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WO1987006839A1 - Fraction antigenique de milieu de culture de vibrions choleriques et vaccin - Google Patents

Fraction antigenique de milieu de culture de vibrions choleriques et vaccin Download PDF

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WO1987006839A1
WO1987006839A1 PCT/FR1987/000152 FR8700152W WO8706839A1 WO 1987006839 A1 WO1987006839 A1 WO 1987006839A1 FR 8700152 W FR8700152 W FR 8700152W WO 8706839 A1 WO8706839 A1 WO 8706839A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cholerae
complex
vaccine
culture
antigenic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1987/000152
Other languages
English (en)
Inventor
Gérard GERFAUX
Marie-Christine Mazert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PASTEUR VACCINS
Original Assignee
PASTEUR VACCINS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PASTEUR VACCINS filed Critical PASTEUR VACCINS
Priority to IN423/CAL/87A priority Critical patent/IN165945B/en
Publication of WO1987006839A1 publication Critical patent/WO1987006839A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/107—Vibrio
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Antigenic fraction of culture medium of cholera vibrios and vaccine Antigenic fraction of culture medium of cholera vibrios and vaccine.
  • the present invention relates to a new antigenic fraction obtained by release into a culture medium of pathogenic cholera vibrios, and intended for use in the preparation of an oral cholera vaccine.
  • Cholera is a disease characterized by acute infectious diarrhea due to the enterotoxin of the cholera vibrio and by extremely rapid dehydration. This disease, which rages mainly in poor countries and more particularly in Southeast Asia, in Bangladesh and throughout Africa, is often fatal when it reaches malnourished and weakened organisms.
  • vaccines made up of killed V. cholerae have been administered parenterally, without, however, being certain of the immunity that such vaccines could provide.
  • the vaccines intended to neutralize the cholera toxin are made up of B subunits of this same toxin (choleragenoid) or of procholeragenoid obtained by controlled heating of the toxin.
  • V. cholerae Those intended to prevent colonization of the intestinal mucosa by V. cholerae consist of antigenic components of vibrios, isolated or in mixture, such as flagellum, extracellular enzymes, adhesins, lipopolysaccharide, proteins of the outer membrane.
  • French Patent No. ⁇ 73 03734 discloses a vaccine of this type consists of an antigenic fraction obtained after lysis of a bacterial pellet in order to release the endocellular materials.
  • Oral vaccines have also been proposed to prevent colonization of the intestinal mucosa by V. cholerae, which consist of killed germs or live germs prepared from mutants, either hypotoxigenic (M13) or producing toxin free of fragment A and obtained by cloning after mutation. (TexasStar SR) or by genetic recombination techniques. None of these vaccines, however, has so far been successful, either because of their poor tolerance or because they do not provide a sufficiently long period of protection.
  • the applicant has endeavored to develop a cholera vaccine which can be administered by the oral route, therefore easy to implement, and which can confer long-term protection.
  • An objective of the invention is to propose a new antigenic fraction obtained by release into a culture medium of pathogenic choleric vibrios and which, when administered orally, is capable of inducing in the intestine a local immune response opposing subsequent colonization by live V. cholerae.
  • Another object of the invention is to propose a process for the preparation of such a vaccinating fraction.
  • Yet another objective of the invention is to provide a cholera vaccine containing said fraction as an active ingredient.
  • the separation may preferably include an ultrafiltration at a cutoff threshold of approximately 100,000, followed by a diafiltration which removes all the material originating from the culture and whose molecular weight is less than approximately 100,000.
  • the release of the antigenic complex is completed by heat treatment in the presence of a dissociating agent, such as citric acid.
  • a dissociating agent such as citric acid.
  • inocula are prepared in an agitated culture and in a rich nutritive medium, from strains of V. cholerae, preferably of the Ogawa and Inaba serotypes, chosen from pathogenic strains of a smooth character.
  • Such a medium can be, for example, the MSA medium which has, per liter, the following composition: - Glutamic acid: 1.5 g
  • the culture is carried out with stirring for a period of between 6 and 24 hours and at a temperature between 30 and 35oC, the pH being maintained above 7.
  • a dissociating agent such as a citric acid or ethylene diamine tetraacetic acid solution.
  • the pH is lowered to about 6, and heated to a temperature between about 40 and about 60oC, the culture being maintained at this temperature for about 15 to 60 minutes.
  • centrifugation or filtration is carried out so as to eliminate the bacterial bodies.
  • the supernatant is then collected and filtered through a membrane with a porosity of 0.45 ⁇ .
  • the filtrate is subjected to an ultrafiltration in which only the fraction having a molecular weight greater than 100,000 is retained, which is then subjected to a diafiltration removing the material with a molecular weight less than 100,000.
  • the collected fraction is then lyophilized. This operation is generally carried out in the presence of a lyophilization adjuvant such as mannitol.
  • the lyophilized fraction constitutes the active principle of the cholera vaccine in accordance with the invention.
  • This antigenic fraction is constituted by a complex composed of lipopolysaccharide of smooth character and proteins of external membrane, occurring in particulate form.
  • the lyophilized antigenic fraction constituting the active principle of the vaccine according to the invention is characterized by quite remarkable biological properties.
  • the cholera vaccine according to the invention is presented either in the form of tablets or else in the form of microgranules.
  • the tablets are obtained by mixing the lyophilisate with a compression excipient, and are then coated with an enteric film.
  • the lyophilisate is fixed to the surface of the microgranules by techniques well known to those skilled in the art. These microgranules are then covered with a film which gives them gastroresistance and distributed in capsules.
  • the active principle constituted by the lipopolysaccharide antigenic complex according to the invention a product consisting of, or comprising at least one sequence of cholera toxin and in particular of the B subunit .
  • the vaccine according to the invention can comprise a polypeptide constituted by the sequence 30-50 or 50-75 or 30-75 or also a mixture of these different polypeptides.
  • An oral dose can thus comprise at least 10 mg of mixture of lyophilisates containing the antigenic complex and 50 ⁇ g of the abovementioned product or polypeptide.
  • lyophilisate containing the antigenic complex is mixed with the relevant polypeptide (s).
  • This mixture is advantageously transformed into tablets or into enteric microgranules according to the techniques mentioned above.
  • VCM medium consisting, per liter, of: - Bacto-tryptone (Difco): 10 g - Yeast extract: 1 g
  • a 5 liter flask containing 3 liters of VCM medium is inoculated with this suspension and cultured overnight under magnetic stirring, at 20-22 ° C, protected from light and under aeration constituted by a slow bubbling of air.
  • This culture is used to inoculate a 50 liter fermenter containing 32 liters of VCM medium. The culture is carried out for 6 hours at 33-34oC with sufficient stirring to obtain a large vortex.
  • Aeration is provided at a rate of 35 l / h by surface sweeping.
  • the pH of the culture is maintained above 7.2 by adding KOH 1 N.
  • the culture obtained is used to inoculate a 1500 liter fermenter containing 900 liters of MSA medium consisting, per liter, of:
  • the centrifugation is then immediately carried out continuously and under cooling.
  • the supernatant is collected and filtered at + 4oC on a membrane with a porosity of 0.45 ⁇ .
  • the ultrafiltration-concentration is carried out on a membrane having a cutoff point PM 100,000.
  • the ultrafiltrate is removed until the volume of the preparation reaches 10 liters.
  • the same volume of sterile 8.5 g / l NaCl solution is added thereto and the ultrafiltration is continued to bring the volume of the retentate to 10 liters.
  • This last operation is repeated 5 times and the volume of preparation is adjusted to 20 liters by means of a sterile mannitol solution and of a concentration such that the final mannitol concentration is equal to 20 g / l.
  • the preparation is then subjected to a freeze-drying in bulk for 48 hours comprising a secondary desiccation of 24 hours at 30oC.
  • the procedure is carried out in the same way with V. cholerae, Inaba serotype, eltor biotype, and the lyophilisates obtained from the two strains are mixed.
  • the presentation of the vaccine in the form of gastroresistant microgranules is effected by fixing the mixture of lyophilisates to the surface of neutral microgranules 1 mm in diameter and essentially consisting of starch, using the techniques known to those skilled in the art.
  • microgranules are then covered with an envelope made of cellulose acetophthalate.
  • the lipopolysaccharide-protein complex released into the culture medium is in particulate form.
  • the preparation is in the form of vesicles with a diameter between 20 and 100 nm after negative staining with phosphotungstate.
  • Lipopolysaccharide-protein association This association of components can be demonstrated by the fact that this complex has a sedimentation rate and a density different from that of its isolated components.
  • LPS lipopolysaccharide constituents
  • the lipopolysaccharide protein complex obtained as indicated above is extracted from the lipopolysaccharide by the Westphal technique and subjected the latter to electrophoresis in polyacrylamide gel in dissociating medium according to the Laemmli method. After oxidation by periodate, the constituents are revealed by staining with silver nitrate.
  • the electrophoretic profile obtained is characteristic of the LPS of V. cholerae of a smooth character.
  • vaccine preparations containing LPS which do not exhibit the profile of the smooth character do not have the desired biological activities.
  • the lipopolysaccharide-protein complex causes the intestinal secretion of specific immunoglobulins proteins used in the composition of the complex.
  • the lyophilized active principle has (per mg of lyophilisate) an activity 2 to 10 times greater than that of the reference. b) Administered subcutaneously in rabbits, the active ingredient induces a strong vibriocidal antibody response.
  • the titers of vibriocidal antibodies are greater than 50,000. These titers are similar to those obtained by the injection of a human dose of vaccine composed of germs drawn. c) Administered orally to rabbits, the active principle in the form of a suspension (that is to say presented in non-gastroresistant form) induces the appearance of vibriocidal antibodies in the serum of these animals.
  • Increasing doses are administered orally to rabbits in two divided doses 7 days apart.
  • the vibriocidal antibody titers of the sera collected 14 days after the last administration show an effect linear dose.
  • the administration of increasing doses of LPS extracted from V. cholerae induces vibriocidal antibodies, but at doses 40 times higher.
  • the vaccine causes: a) the appearance of vibriocidal antibodies in the serum at high levels.
  • Rabbits are immunized with a human dose of vaccine on D0 and D7. About 25 days later, intestinal loops are ligated into which increasing doses of V. cholerae are injected. 16 to 18 hours later, the secreted volumes are measured. A large decrease in secreted volumes is observed in immunized animals; the numbers of germs injected necessary to obtain the secretion of 1 ml of liquid per cm of intestine are respectively: control animals 10 5 immunized animals 10 9 c) an anti-adhesion effect and an anti-colonization effect of the intestine by the V. cholerae.
  • Rabbits are administered 200 mg of microgranules on days D 0, D 7 and D 14.
  • the specific IgA present in the intestinal fluid and the intestinal mucosa are then titrated by the ELISA method.
  • the antigenic complex is used as the solid phase. Only the specific IgA present in the sample taken bind to this solid phase and are revealed by means of goat anti-rabbit IgA antibodies conjugated with peroxidase.
  • Microgranules containing for example 50 mg or more of mixture of lyophilisates with or without the addition of relevant polypeptide (s) described below per g of microgranules, are packaged in gastro-resistant capsules containing 200 mg of microgranules.
  • vaccination can be done by absorption of a capsule on D 0, D 7 and D 14, with a reminder for example between six months and a year.
  • the lyophilisate containing the antigenic complex is mixed with the relevant product or polypeptide (s) in proportions, for example, of 10 mg of lyophilisate per 50 ⁇ g of polypeptide.
  • the presentation of the vaccine in the form of gastroresistant microgranules is done in the same way as for lyophilisate alone.
  • microgranules contain 50 mg of lyophilisate + polypeptide (s) per gram of terminated microgranules.

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Abstract

On cultive des vibrions cholériques dans des conditions qui favorisent la biosynthèse des antigènes de surface et la libération dans le milieu de culture d'un complexe antigénique particulaire de lipopolysaccharide de caractère lisse et de protéines de membrane externe, et on soumet le surnageant, après élimination des corps bactériens, à une séparation dans laquelle on récupère les éléments possédant un poids moléculaire supérieur à une valeur d'au moins environ 100.000. Application à un vaccin cholérique oral.

Description

Fraction antigénique de milieu de culture de vibrions cholérique et vaccin.
La présente invention a trait à une nouvelle fraction antigénique obtenue par libération dans un milieu de culture de vibrions cholériques pathogènes, et destinée à être utilisée dans la préparation d'un vaccin cholérique oral.
Elle concerne également le procédé de préparation d'une telle fraction et le vaccin correspondant.
Le choléra est une maladie qui se caractérise par une diarrhée infectieuse aiguë due à l'enterotoxine du vibrion cholérique et par une déshydratation extrêmement rapide. Cette maladie, qui sévit principalement dans les pays pauvres et plus particulièrement en Asie du Sud-Est, au Bengladesh et dans toute l'Afrique, est souvent mortelle lorsqu'elle atteint des organismes mal nourris et affaiblis.
Le développement des transports et des échanges interhumains ont facilité ces dernières années la diffusion des vibrions cholériques, créant des foyers secondaires et constituant une menace pour la santé de nombreux pays. On a cherché, depuis, à mettre au point un vaccin qui puisse efficacement protéger contre le choléra et qui soit facile à administrer.
Pendant très longtemps, on a administré par voie parentérale des vaccins constitués de V. cholerae tués, sans avoir toutefois de certitude sur l'immunité que de tels vaccins pouvaient apporter.
Des résultats d'études menés au Bengladesh, à Calcutta et aux Philippines et ayant porté sur plusieurs centaines de milliers de sujets ont clairement montré que ce type de vaccin, bien que provoquant une réponse serologique importante, n'apportait pas une protection suffisante pour pouvoir modifier l'endémicité et l'épidémicité du choléra.
Plus tard, la toxine cholérique ayant été reconnue comme la seule responsable de la maladie, on a espéré pouvoir se protéger contre le choléra, de la même manière que contre la diphtérie ou le tétanos, en vaccinant au moyen d'une anatoxine administrée par voie parentérale. Ce type de vaccination, bien qu'apportant une certaine protection contre le choléra, a été abandonné par suite d'une mauvaise tolérance et d'une durée de protection trop courte.
C'est à la lumière d'études épidémiologiques, mais surtout au vu des résultats obtenus sur volontaires recevant une dose d'épreuve de vibrions cholériques, qu'il est apparu que la maladie elle-même apportait une protection efficace et de longue durée.
Les recherches se sont alors orientées vers la mise au point de vaccins oraux tendant à reproduire la réponse immunitaire obtenue par la maladie, mais en évitant ses effets pathologiques. Ces effets étant strictement limités à la muqueuse de l'intestin grêle, c'est à ce niveau que l'on a cherché à provoquer une réponse immunitaire capable de s'opposer, soit au développement des vibrions, soit à l'action de l'enterotoxine libérée.
Les vaccins destinés à assurer une neutralisation de la toxine cholérique sont constitués de sousunités B de cette même toxine (choléragénoide) ou encore de procholéragénoïde obtenu par chauffage contrôlé de la toxine.
Ceux destinés à empêcher la colonisation de la muqueuse intestinale par le V. cholerae sont constitués de composants antigéniques de vibrions, isolés ou en mélange, tels que flagelle, enzymes extracellulaires, adhésines, lipopolysaccharide, protéines de la membrane externe.
Le brevet français n● 73 03734 décrit un vaccin de ce type constitué d'une fraction antigenique obtenue après lyse d'un culot bactérien dans le but d'en libérer le matériel endocellulaire.
Il a été également proposé des vaccins oraux visant à empêcher la colonisation de la muqueuse intestinale par le V. cholerae, qui sont constitués par des germes tués ou par des germes vivants préparés à partir de mutants, soit hypotoxigéniques (M13), soit produisant une toxine exempte de fragment A et obtenue par clonage après mutation. (TexasStar SR) ou par des techniques de recombinaison génétique. Aucun de ces vaccins, toutefois, n'a réussi jusqu'ici à s'imposer, soit en raison de leur mauvaise tolérance, soit parce qu'ils ne confèrent pas une durée de protection suffisamment longue.
Enfin, des vaccins combinant des dérivés de la toxine cholérique avec des constituants membranaires ou des germes entiers tués sont actuellement en développement.
Le demandeur s'est attaché à mettre au point un vaccin cholérique qui soit administrable par voie orale, donc facile à mettre en oeuvre, et qui puisse conférer une protection de longue durée.
Un objectif de l'invention est de proposer une nouvelle fraction antigenique obtenue par libération dans un milieu de culture de vibrions cholériques pathogènes et qui, lorsqu'elle est administrée par voie orale, est capable d'induire au niveau de l'intestin une réponse immunitaire locale s'opposant à la colonisation ultérieure par les V. cholerae vivants.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de préparation d'une telle fraction vaccinante. Un autre objectif encore de l'invention est de fournir un vaccin cholérique contenant comme principe actif ladite fraction.
Le procédé de préparation de la fraction antigenique conforme à l'invention est caractérisé en ce qu'il consiste :
- à cultiver des vibrions cholériques, de préférence dans un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer, dans des conditions qui favorisent la biosynthèse des antigènes de surface et la libération dans le milieu de culture d'un complexe antigenique particulaire de lipopolysaccharide de caractère lisse et de protéines de membrane externe ; et
- à soumettre le surnageant, après élimination des corps bactériens, par exemple par centrifugation, à une séparation dans laquelle on récupère les éléments possédant un poids moléculaire supérieur à une valeur d'au moins 100.000 environ.
La séparation peut, de préférence, comporter une ultrafiltration à un seuil de coupure d'environ 100 000, suivie d'une diafiltration qui élimine tout le matériel provenant de la culture et dont le poids moléculaire est inférieur à environ 100.000.
De préférence, on complète la libération du complexe antigenique par un traitement à la chaleur en présence d'un agent dissociant, tel que l'acide citrique.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré, dans une étape préliminaire, on prépare des inoculums en culture agitée et en milieu nutritif riche, à partir de souches de V. cholerae, de préférence de sérotypes Ogawa et Inaba, choisies parmi les souches pathogènes de caractère lisse.
On ensemence, ensuite, à l'aide de ces inoculums, un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer. Un tel milieu peut être, par exemple, le milieu MSA qui présente, par litre, la composition suivante : - Acide glutamique : 1,5 g
- Caséine lactique : 0,8 g
- Proline : 0,18 g
- NaCl : 10 g
- KH2PO4 : 0,45 g - MgSO4 : 0,1 g.
La culture est effectuée sous agitation pendant une durée comprise entre 6 et 24 heures et à une température comprise entre 30 et 35ºC, le pH étant maintenu au-dessus de 7. En fin de culture, on ajoute un agent dissociant, tel qu'une solution d'acide citrique ou d'acide éthylène-diamine-tétraacétique. On abaisse le pH à environ 6, et on chauffe à une température comprise entre environ 40 et environ 60ºC, la culture étant maintenue à cette température pendant environ 15 à 60 minutes. Après refroidissement, on effectue une centrifugation ou une filtration de manière à éliminer les corps bactériens. Le surnageant est ensuite recueilli et filtré sur une membrane de porosité 0,45μ.
Le filtrat est soumis à une ultrafiltration dans laquelle on ne retient que la fraction possédant un poids moléculaire supérieur à 100 000, qui est ensuite soumise à une diafiltration éliminant le matériel de poids moléculaire inférieur à 100 000.
La fraction recueillie est ensuite lyophilisée. Cette opération s'effectue, en général, en présence d'un adjuvant de lyophilisation tel que le mannitol .
La fraction lyophilisée constitue le principe actif du vaccin cholérique conforme à l'invention.
Cette fraction antigenique est constituée par un complexe composé de lipopolysaccharide de caractère smooth et de protéines de membrane externe, se présentant sous forme particulaire.
La fraction antigenique lyophilisée constituant le principe actif du vaccin conforme à l'invention se caractérise par des propriétés biologiques tout à fait remarquables.
Administrée à l'animal par voie orale, elle provoque :
- l'apparition d'anticorps vibriocides dans le sérum, - une protection contre l'infection expérimentale in vivo dans les anses intestinales ligaturées,
- une inhibition de l'adhérence des V. cholerae sur la muqueuse intestinale,
- une inhibition de la colonisation de l'intestin par le V. cholerae, une production intestinale d'immunoglobulines spécifiques.
Administrée à la souris par voie parentérale, elle la protège contre l'infection mortelle par le V. cholerae.
Le vaccin cholérique conforme à l'invention se présente, soit sous la forme de comprimés, soit encore sous la forme de microgranules.
Les comprimés sont obtenus en mélangeant le lyophilisât avec un excipient de compression, et sont ensuite enrobés d'une pellicule gastrorésistante.
Dans le cas d'une présentation sous forme de microgranules, le lyophilisat est fixé sur la surface des microgranules par des techniques bien connues de l'homme de l'art. Ces microgranules sont ensuite recouverts d'une pellicule qui leur confère la gastrorésistance et distribués en gélules.
Cette dernière forme de présentation permet, d'une part, la conservation de toutes les propriétés biologiques du principe actif et, d'autre part, l'administration du vaccin sous forme protégée aux très jeunes enfants.
Selon un perfectionnement particulièrement préféré de l'invention, on peut combiner au principe actif constitué par le complexe antigenique lipopolysaccharidique selon l'invention, un produit constitué de, ou comportant au moins une séquence de la toxine cholérique et notamment de la sous-unité B.
En particulier, le vaccin selon l'invention peut comporter un polypeptide constitué par la séquence 30-50 ou 50-75 ou 30-75 ou encore un mélange de ces différents polypeptides.
Ces polypeptides sont décrits dans la demande de brevet FR-A-82.09167 déposée le 26 mai 1982 au nom de Centre National de la Recherche Scientifique.
Une dose orale peut comporter ainsi au moins 10mg de mélange de lyophilisats contenant le complexe antigénique et 50 μg de produit ou de polypeptide précité.
De préférence, du lyophilisat contenant le complexe antigenique est mélangé avec le ou les polypeptide(s) pertinents. Ce mélange est avantageusement transformé en comprimés ou en microgranules gastrorésistants suivant les techniques citées plus haut.
D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre purement illustratif, et non liraitatif.
Préparation du complexe lipopolysaccharide-protéines.
On reprend une ampoule contenant sous forme congelée le V. cholerae, sérotype Ogawa, biotype eltor, par 2 à 3 ml de milieu VCM constitué, par litre, de : - Bacto-tryptone (Difco) : 10 g - Extrait de levure : 1 g
- Glucose : 1 g
- NaCl : 5 g
- K2HPO4 : 2 g - MgSO4 : 0,1
- le pH étant ajusté à 8,5 avec NaOH.
On ensemence au moyen de cette suspension un flacon de 5 litres contenant 3 litres de milieu VCM et on cultive pendant une nuit sous agitation magnétique, à 20- 22ºC, à l'abri de la lumière et sous aération constituée par un bullage lent d'air.
Cette culture sert à inoculer un fermenteur de 50 litres contenant 32 litres de milieu VCM. La culture est menée pendant 6 heures à 33-34ºC sous agitation suffisante pour obtenir un vortex important.
L'aération est apportée à raison de 35 1/h par balayage en surface. Le pH de la culture est maintenu au-dessus de 7,2 par apport de KOH 1 N.
La culture obtenue sert à inoculer un fermenteur de 1500 litres contenant 900 litres de milieu MSA constitué, par litre, de :
- Acide glutamique : 1,5 g
- Caséine lactique : 0,8 g
- Proline : 0,18 g - NaCl : 10 g
- KH2PO4 : 0,45 g
- MgSO4 : 0, 1 g
- le pH étant ajusté à 8,4 par KOH, et 100 litres de milieu VCM. On cultive pendant 18 heures à une température de l'ordre de 33-34ºC, le pH étant maintenu audessus de 7,2 par addition de KOH 1 N. L'oxygène dissous est maintenu à 50 % de la saturation par apport d'air en profondeur, et agitation à 750 t/mn. Après ce laps de temps, on ajoute une solution d'acide citrique à 125 g/l jusqu'à ce que le pH de la culture soit abaissé à 6,0 et on élève la température de la culture à 55ºC. On maintient cette température pendant 45 mn puis on refroidit la culture à environ 10ºC.
On effectue ensuite immédiatement la centrifugation en continu et sous refroidissement. On recueille le surnageant et on filtre à + 4ºC sur membrane de porosité 0,45μ.
L'ultrafiltration-concentration est effectuée sur membrane possédant un point de coupure PM 100 000. On élimine l'ultrafiltrat jusqu'à ce que le volume de la préparation atteigne 10 litres. On y ajoute un même volume de solution de NaCl à 8,5 g/l stérile et on poursuit l'ultrafiltration pour ramener le volume du rétentat à 10 litres. On répète 5 fois cette dernière opération et on ajuste le volume de préparation à 20 litres au moyen d'une solution de mannitol stérile et de concentration telle que la concentration finale en mannitol soit égale à 20 g/1.
La préparation est ensuite soumise à une lyophilisation en vrac de 48 heures comportant une dessiccation secondaire de 24 heures à 30ºC.
On procède, de la même façon, avec le V. cholerae, sérotype Inaba, biotype eltor, et on mélange les lyophilisats obtenus à partir des deux souches. La présentation du vaccin sous forme de microgranules gastrorésistants se fait par fixation du mélange de lyophilisats à la surface de microgranules neutres de 1 mm de diamètre et essentiellement constitués d'amidon, en utilisant les techniques connues de l'homme de l'art.
Ces microgranules sont ensuite recouverts d'une enveloppe constituée d'acétophtalate de cellulose.
Ils contiennent 50 mg de mélange de lyophilisats par gramme de microgranules terminés. Caractérisation du complexe lipopolysaccharideprotéines. Le complexe lipopolysaccharide-protéines libéré dans le milieu de culture se présente sous forme particulaire.
Le caractère particulaire du complexe est mis en évidence par l'examen au microscope électronique.
La préparation se présente sous forme de vésicules de diamètre compris entre 20 et 100 nm après coloration négative au phosphotungstate.
Association lipopolysaccharide-protéines. Cette association de composants peut être mise en évidence par le fait que ce complexe présente une vitesse de sédimentation et une densité différentes de celles de ses composants isolés.
Une ultracentrifugation de 65 heures à 39.000 t/mn sur un gradient de saccharose 40-60 %, effectuée sur la préparation obtenue comme il a été indiqué plus haut, montre que le complexe possède une densité de flottation de 1,21 alors que le lipopolysaccharide isolé à partir de la même préparation montre une densité de 1,19. Les vitesses de sédimentation déterminées par ultracentrifugation en gradient de saccharose 5-15 % sont respectivement de 30 S pour le complexe de lipopolysaccharide-protéines conforme à l'invention et de
20 S pour le lipopolysaccharide extrait de ce complexe. Cette association lipopolysaccharide-protéines peut être encore mise en évidence par le fait que la dose nécessaire à l'apparition d'un pouvoir vibriocide dans le sérum de lapins ayant reçu la préparation par voie orale est au moins 40 fois inférieure à celle du lipopolysaccharide extrait du V. cholerae.
Nature des constituants lipopolysaccharide (LPS) du V. cholerae de caractère lisse.
On extrait du complexe lipopolysaccharideprotéines obtenu comme on l'a indiqué plus haut, le lipopolysaccharide par la technique de Westphal et on soumet celui-ci à une electrophorese en gel de polyacrylamide en milieu dissociant selon la méthode de Laemmli. Après oxydation par le periodate, les constituants sont révélés par une coloration au nitrate d'argent. Le profil électrophorétique obtenu est caractéristique du LPS de V. cholerae de caractère lisse.
On note que les préparations vaccinales contenant du LPS ne présentant pas le profil du caractère smooth ne possèdent pas les activités biologiques recherchées. protéines de membrane externe du V. cholerae.
Ces protéines participent à la réponse immunitaire induite par le complexe lipopolysaccharideprotéines. Ce rôle des protéines est mis en évidence par les faits suivants :
- la dénaturation des protéines par chauffage, par exemple à une température de l'ordre de 100ºC pendant 30 minutes, détruit totalement les propriétés vaccinantes, - administré par voie orale au lapin , le complexe lipopolysaccharide-protéines provoque la sécrétion intestinale d'immunoglobulines spécifiques des protéines entrant dans la.composition du complexe.
La mise en évidence de ces immunoglogulines est effectuée par la technique d'"immunoblot" sur les protéines du complexe, après que celles-ci ont été séparées par electrophorese en gel polyacrylamide mono- ou bidimensionnelle.
On observe, enfin, que le pouvoir vibriocide des sérums de lapins vaccinés par voie orale n'est inhibé qu'en partie seulement lorsque ces sérums sont additionnés de LPS extrait de V. cholerae, alors que ce pouvoir vibriocide est totalement inhibé par la présence du complexe. L'electrophorese en gel de polyacrylamide en milieu dissociant des protéines du complexe vaccinant permet de mettre en évidence une série de polypeptides de poids moléculaires compris entre 25 à 28 000 et 70 000 daltons. Propriétés biologiques.
Les propriétés biologiques du principe actif ont été mises en évidence par une série d'expérimentations effectuées sur l'animal auquel a été administré soit le principe actif lui-même, soit le vaccin correspondant, et dont les résultats sont rapportés ci-dessous.
A - Pour mettre en évidence les propriétés biologiques du principe actif, on a effectué ces essais : a) Administré par voie parentérale aux souris, il les protège contre l'infection mortelle par le V. cholerae.
En appliquant les conditions recommandées par l'OMS pour le test de protection de la souris, on constate que le principe actif lyophilisé possède (par mg de lyophilisât) une activité supérieure de 2 à 10 fois celle de la référence. b) Administré par voie sous-cutanée à des lapins, le principe actif induit une forte réponse en anticorps vibriocides.
On observe qu'après injection d'une quantité de principe actif équivalente au 1/20 de la dose humaine, Les titres en anticorps vibriocides sont supérieurs à 50 000. Ces titres sont semblables à ceux obtenus par l'injection d'une dose humaine de vaccin composé de germes tirés. c) Administré par voie orale à des lapins, le principe actif sous forme de suspension (c'est-à-dire présenté sous forme non gastrorésistante) induit une apparition d'anticorps vibriocides dans le sérum de ces animaux.
On administre par voie orale à des lapins des doses croissantes en deux prises espacées de 7 jours. Les titres en anticorps vibriocides des sérums recueillis 14 jours après la dernière administration montrent un effet dose linéaire. A titre de comparaison, l'administration de doses croissantes de LPS extrait de V. cholerae induit des anticorps vibriocides, mais à des doses 40 fois supérieures. B - Administré par voie orale à l'animal, le vaccin provoque : a) l'apparition d'anticorps vibriocides dans le sérum à des taux élevés.
Des lapins reçoivent 200 mg de microgranules à J 0 et J 7. On a procédé au titrage des anticorps à J 21. On obtient les titres suivants :
Ogawa Inaba titre des seruras titre des sérums lapin nº avant après avant après immunisation immunisation
6316 <40 30780 <40 40960
6317 <40 15360 <40 20480
6318 <40 20480 <40 20480
6319 <40 20480 <40 20480
6320 <40 20480 <40 5130
6321 <40 31920 <40 20480
b) une protection contre l'infection expérimentale in vivo dans les anses intestinales ligaturées.
On immunise des lapins par une dose humaine de vaccin à J 0 et J 7. Environ 25 jours après, on ligature des anses intestinales dans lesquelles on injecte des doses croissantes de V. cholerae. 16 à 18 heures après, les volumes sécrétés sont mesurés. On observe une forte diminution des volumes sécrétés chez les animaux immunisés ; les nombres de germes injectés nécessaires pour obtenir la sécrétion de 1 ml de liquide par cm d'intestin sont respectivement : animaux témoins 105 animaux immunisés 109 c) un effet anti-adhérence et un effet anticolonisation de l'intestin par le V. cholerae. On administre par voie orale à des lapins 200 mg de microgranules à J 0 et J 7 ; 5 jours après la dernière administration, on opère les animaux et on introduit 109 V. cholerae vivants dans leur duodénum après avoir ligaturé l'intestin grêle au niveau du caecum. Après 2 à 3 heures de contact, on retire la ligature. 16 à 18 heures après, on dénombre les V. Cholerae dans l'iléon et le jéjunum. On obtient des résultats significativement différents chez les animaux immunisés et chez les animaux témoins. lapins nombre de germes/g d'intestin
Ogawa Inaba iléon jéjunum iléon jéjunum témoins 108 107 108 107 immunisés 103 102 105 103
d) production intestinale d'IgA spécifiques.
On administre à des lapins 200 mg de microgranules aux jours J 0, J 7 et J 14. On procède ensuite au titrage des IgA spécifiques présentes dans le liquide intestinal et la muqueuse intestinale, par méthode ELISA.
On utilise le complexe antigenique comme phase solide. Seules les IgA spécifiques présentes dans l'échantillon prélevé se fixent sur cette phase solide et sont révélées au moyen d'anticorps de chèvre anti-IgA de lapin conjugués à la peroxydase.
Après révélation de la réaction enzymatique, on obtient les résultats suivants :
lapins Extrait de muqueuse intestinale dilution 1/20-D.O. mesurée a 425 nm immunisés 1,80 témoins 0,1.
Dosage
Les microgranules, contenant par exemple 50 mg ou plus de mélange de lyophilisats additionné ou non de polypeptide(s) pertinent(s) décrits ci-dessous par g de microgranules, sont conditionnés en gélules gastrorésistantes contenant 200 mg de microgranules. A titre d'exemple, la vaccination peut se faire par absorption d'une gélule à J 0, J 7 et J 14, avec un rappel par exemple entre six mois et un an.
Préparation d'un polypeptide comportant au moins une séquence de la sous-unité B de la toxine cholérique.
La préparation d'un polypeptide constituée par la séquence 30-75 ou 50-75 s'effectue par exemple conformément au procédé décrit dans la demande de brevet
FR-A-82.09167 déposée le 26 mai 1982 au nom du Centre National de la Recherche Scientifique.
Préparation d'un vaccin combiné.
On mélange le lyophilisat contenant le complexe antigenique avec le produit ou le(s) polypeptide(s) pertinent(s) dans des proportions, par exemple, de 10mg de lyophilisat pour 50 ug de polypeptide.
La présentation du vaccin sous forme de microgranules gastrorésistants se fait de la même façon que pour le lyophilisat seul.
Ces microgranules contiennent 50mg de lyophilisat + polypeptide(s) par gramme de microgranules terminés.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'une fraction antigenique destinée à être utilisée comme principe actif dans un vaccin cholérique oral, caractérisé en ce qu'il consiste :
- à cultiver des vibrions cholériques dans des conditions qui favorisent la biosynthèse des antigènes de surface et la libération dans le milieu de culture d'un complexe antigenique particulaire de lipopolysaccharide de caractère lisse et de protéines de membrane externe, et
- à soumettre le surnageant, après élimination des corps bactériens, à une séparation dans laquelle on récupère les éléments possédant un poids moléculaire supérieur à une valeur d'au moins environ 100.000.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on complète la libération du complexe antigenique par un traitement à la chaleur en présence d'un agent dissociant.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en que l'agent dissociant est de l'acide citrique.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'étape de séparation comporte une ultrafiltration à un seuil de coupure d'environ 100 000, suivie d'une diafiltration qui élimine tout le matériel provenant de la culture et dont le poids moléculaire est inférieur à environ. 100.000.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on cultive les vibrions dans un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, dans une étape préliminaire, on prépare des inoculums en culture agitée et en milieu nutritif riche, à partir de souches de V. cholerae de sérotypes Ogawa et Inaba choisies parmi les souches pathogènes de caractère lisse et en ce que l'on ensemence ensuite, à l'aide de ces inoculums, un milieu pauvre en éléments nutritifs et exempt de fer.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la culture est effectuée sous agitation pendant une durée comprise entre 6 et 24 heures et à une température comprise entre 30 et 35ºC, le pH étant maintenu au-dessus de 7.
8. Procédé selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'en fin de culture, on ajoute un agent dissociant, tel qu'une solution d'acide citrique jusqu'à abaissement du pH à environ 6, en ce que l'on chauffe la culture à une température comprise entre 40 et 60ºC et en ce que l'on maintient cette température pendant 15 à 60 minutes.
9. Fraction antigenique obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
10. Fraction antigenique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un complexe particulaire de lipopolysaccharide de V. cholerae de caractère smooth et de protéines de membrane externe.
11. Fraction antigenique selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisée en ce qu'elle comporte un complexe de lipopolysaccharide de V. cholerae de caractère lisse et de protéines de membrane externe qui se présente sous la forme de vésicules de diamètre compris entre 20 et 100 nm.
12. Fraction antigenique selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que,
- lorsque le complexe est soumis à une electrophorese en gel de polyacrylamide en milieu dissociant les protéines du complexe, celle-ci permet de mettre en évidence une série de polypeptides de poids moléculaire compris entre 25000 et 75000 daltons, lorsqu'elle est administrée par voie orale à l'animal, elle provoque l'apparition dans le sérum d'un titre élevé en anticorps vibriocides, elle protège contre l'infection expérimentale dans le test de l'anse ligaturée, elle inhibe l'adhérence des V. cholerae sur la paroi intestinale, elle inhibe la colonisation de l'intestin par les V. cholerae, elle provoque la sécrétion intestinale d ' immunoglobulines spécifiques,
- lorsqu'elle est administrée à la souris par voie parentérale, elle protège celle-ci contre l'infection mortelle par le V. cholerae,
- lorsqu'elle est chauffée à une température de l'ordre de 100ºC pendant une durée de l'ordre de 30 minutes, elle perd ses propriétés vaccinantes.
13. Fraction antigenique selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée en ce qu'elle est lyophilisée en présence d'adjuvant de lyophilisation, tel que le mannitol.
14. Application de la fraction antigenique définie dans l'une des revendications 9 à 13 à la préparation d'un vaccin cholérique oral.
15. Vaccin cholérique oral, caractérisé en ce qu'il contient, comme principe actif, un complexe de lipopolysaccharide de V. cholerae de caractère lisse et de protéines de membrane.
16. Vaccin cholérique oral selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est constitué de la fraction de surnageant de culture possédant un poids moléculaire supérieur à 100 000.
17. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un comprimé.
18. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme de microgranules, recouverts d'une pellicule gastro-résistante et qui peuvent être distribués en gélules.
19. Vaccin cholérique oral selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il contient en outre au moins un produit ou polypeptide constitué de, ou comportant, au moins une séquence de la toxine cholérique, notamment de la sous-unité B de la toxine cholérique.
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