[go: up one dir, main page]

WO1986006080A1 - gamma-INTERFERON COMPOSITION - Google Patents

gamma-INTERFERON COMPOSITION Download PDF

Info

Publication number
WO1986006080A1
WO1986006080A1 PCT/JP1985/000190 JP8500190W WO8606080A1 WO 1986006080 A1 WO1986006080 A1 WO 1986006080A1 JP 8500190 W JP8500190 W JP 8500190W WO 8606080 A1 WO8606080 A1 WO 8606080A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
solution
ifn
aqueous solution
composition
buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1985/000190
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasaburo Akagi
Yasumoto Miura
Tetsuo Hoshino
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Priority to PCT/JP1985/000190 priority Critical patent/WO1986006080A1/ja
Priority to EP85108409A priority patent/EP0168008A3/en
Priority to ES544991A priority patent/ES8608542A1/es
Publication of WO1986006080A1 publication Critical patent/WO1986006080A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a heat-type interferon composition.
  • the human interface is currently classified into three types: type, type 3 and type a.
  • ⁇ - and ⁇ -type interferons are relatively stable, are provided to the clinic mainly in the form of parenteral administration, and are undergoing systematic clinical research.
  • type 7 interferon (sometimes abbreviated as IF-pair) is extremely unstable and easily loses its activity or freezes during storage, freezing or lyophilization of aqueous solutions.
  • There are problems such as rejection of the dried product after re-dissolving, making it extremely difficult to obtain a stable composition worthy of clinical use. Therefore, it has a remarkably strong antiviral and antitumor activity among interferons [Salvin et al., Journal of National Cancer Institute, Vol. 55, p. 1233 (1975)]. It is a big bob for clinical application of IFN-—, which is the most promising drug.
  • the drug substance of interferon to be used in pharmaceutical preparations is usually obtained as a high-purity product from a crude interface through a separation and purification process using various types of chromatography and the like.
  • various inorganic and organic compounds are used.
  • inorganic ions used for adjusting pH and ionic strength are also present in the purified aqueous solution of interferon. It was thought that it would also work advantageously as a stabilizing agent when formulated.
  • ⁇ -type interferon having no sugar chain can be stabilized by adding an inorganic salt (Japanese Patent Laid-Open No. No. 19—25364).
  • the present inventors surprisingly formulate a pharmaceutical preparation using an aqueous IFN-a solution in which the concentration of an inorganic salt is reduced.
  • concentration of an inorganic salt is reduced.
  • the IFN- ⁇ activity was further reduced, and that a stable IFN- ⁇ composition was obtained in which a solution obtained by re-dissolving the obtained composition did not show any swelling.
  • the present inventors completed further research and completed the present invention.
  • the present invention provides a human-type interferon composition which is substantially free of inorganic salts and free from amino acids or freeze-dried or freeze-dried under cows.
  • rlFN-7 includes a polypeptide consisting of 146 amino acids and various fragments of the polypeptide exemplified in FIG.
  • Various fragments include, for example, N-terminal-deleted splices in which four or less amino acids at the N-terminal part of the polypeptide are deleted; 31 Examples include C-terminal missing pieces cut at the site after the amino acid residue.
  • the above rIFN-r also includes those in which the cysteine residue of the above polypeptide is substituted with serine or threonine.
  • the N-terminal part of the polypeptide consisting of 146 amino acids shown in Fig. 1 lacking four or less amino acids at the N-terminal part of the polypeptide It is preferable that the C-terminal portion of the species or the N-terminal-less fragment is truncated.
  • Tyr-Cys-missing spices [Des (Cys-Tyr-Cys) IF-r] are preferred.
  • an aqueous solution containing human IFN-7 at a high concentration obtained by genetic recombination technology is advantageously used.
  • Human IF - deactivation of ⁇ is 1 is preferably X 1 is 0 5 ⁇ 1 XI 0 7 international units Zmg (I UZmg), as the IFN- ⁇ aqueous, IX 1 0 2 ⁇ 1 X 1 0 7 Those having an activity of IU / ml, especially 1 ⁇ 10 + to 1 ⁇ 10 7 IU / l are preferred.
  • the concentration of the inorganic salt may be Q.1M or less, preferably 0.05M or less, particularly preferably 1 mM or less.
  • the inorganic ion intensity may be an ion intensity calculated from inorganic ions of 0.1 or less, preferably 0.05 or less, particularly preferably 0.01 or less.
  • the inorganic salt is preferably at most 30%, more preferably at most 15%, particularly preferably at most 0.3%, based on the total weight thereof.
  • the aqueous solution of IFN-a substantially free of inorganic salts can be obtained, for example, by using a buffer solution containing no inorganic salts as a buffer used in the purification step of IFN-y, particularly in the final step of chromatography, or by using purified IFN-y.
  • A Can be produced by removing inorganic salts from an aqueous solution.
  • amino acid monoamino aliphatic amino acids such as daricin, ⁇ -alanine, 3-alanine, leucine, glutamic acid, and aspartic acid are preferred, and glycine is particularly preferred. Further, a physiologically acceptable salt or derivative thereof may be used. One or more of these amino acids can be used, and the amino acids used are those that can be used in Osaka. For clinical application of the product, it is preferable that it be of a quality that can be used for parenteral administration. ⁇
  • the total amount of the acid and the acid is 1 mg or more, preferably 5 to 50 mg, per 1 ml of the IFN-7 aqueous solution.
  • a reducing sulfur compound may be allowed to coexist when IFNa has a cysteine residue.
  • the reducing sulfur compounds include glutathione (reduced form), thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, monothioglycerol, dithiothreitol, and thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms. Glutathione (reduced form) is particularly preferred.
  • the reducing sulfur compound is preferably 0.1 mg or more, particularly preferably 0.5 to 1 Omg per IFN-'/ l ml aqueous solution.
  • Still other stabilizers may include human serum albumin (HSA) or (and) glucose.
  • HSA human serum albumin
  • the HS A may be of any type, but for the clinical application of the present composition, it is preferably of such a quality as to be used for parenteral administration.
  • fractionated and purified from healthy human plasma by the C'ohn ethanol fractionation method 6 is used.
  • HSA may contain acetyltriptosodium sodium or sodium caprylate as a stabilizer.
  • HS A is more than 1 mg / ml of aqueous solution of IFN-
  • composition of the present invention contains a HS A is in solution to adjust to indicate pH 4.0 to 5.0 or 7.5 to 8.5: Rukoto are preferred. More specifically, it is preferable to adjust the pH to 4.0 to 5.0 when the amino acids are neutral amino acids, and to adjust the pH to 7.5 to 8.5 when the amino acids are acidic amino acids.
  • the saccharides are selected from, for example, polysaccharides such as dextran and hydroxyxetyl starch, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose and monosaccharides such as glucose, fructose, mannose and galactose. One or more substances may be mentioned.
  • dextran and hydroxyxetil starch commercially available ones can be used. However, in order to clinically apply the present composition, those having a quality enough to be used for parenteral administration as a plasma substitute are preferable.
  • Dextran has an average molecular weight of 10,000 to 100,000, especially 40,000 to 70,000. Are advantageously used.
  • the saccharide be contained in an amount of 1 iig or more, preferably 3 mg to 50 mg, per 1 ml of the aqueous solution of IF ⁇ - ⁇ .
  • the present composition may further contain the saccharide or (and) amino acid as an osmotic pressure regulator, but the addition of an inorganic salt such as sodium chloride is warped. It is not preferable because it deteriorates the quality of the composition.
  • the above-mentioned preferable osmotic pressure adjusting agent may be added to the composition in advance, or may be added to a solvent for re-dissolving the freeze-dried product.
  • the frozen and freeze-dried human IFN-A composition of the present invention can be produced, for example, by the following method.
  • Amino acids are added to the aqueous solution containing I / ml to a concentration of 1 mg / ml or more, preferably 5 to 50 mg / ml.
  • the above-mentioned amino acid can be added to the aqueous solution containing IFN- ⁇ during the production process.
  • the aqueous solution of IFN- ⁇ can be used as it is or as necessary.
  • Amino acid can be added up to the concentration of amino acid and subjected to the following steps. Further, the above-mentioned HSA and sugars can be added together.
  • the aqueous IFN-a solution may contain a reducing sulfur compound or a trace amount of a surfactant of Q.lmg / ml or more, preferably Q.5 to 10 mg / ml, and like the above-mentioned stabilizer, These can be newly added.
  • the frozen human IFN-A composition of the present invention can be produced, for example, by freezing the above aqueous solution usually at 180 to 130 ° C.
  • the frozen composition is stored at 180 ° to 110 ° C.
  • the freeze-dried human IFN7 composition of the present invention may be obtained by, for example, drying the above-mentioned frozen composition under reduced pressure by an ordinary method, or subdividing the above-mentioned aqueous solution or an aqueous solution obtained by thawing the above-mentioned frozen composition, if desired, and freezing as described above. After that, it can be manufactured by drying under reduced pressure by a conventional method.
  • the aqueous solution of the composition or its components (each of which is purified by sterilization filtration or the like) before the subdivision is subjected to aseptic operation. And then freeze-drying is preferably performed.
  • the frozen or freeze-dried human IFN- ⁇ composition of the present invention has a very small decrease in IF- ⁇ activity and quality during the freeze-freezing or freeze-drying operation and during storage, and does not cause shuffling during re-thawing.
  • the freeze-dried composition is obtained as a stabilized human IFN-a powder and can be advantageously used particularly as a parenteral administration preparation.
  • the composition to which HSA is further added has little adhesion to the vessel wall and can be advantageously used.
  • the freeze-dried human IFN- ⁇ composition of the present invention is used as an injection preparation.
  • Used in. It can also be used as ophthalmic, otic and nasal dosage forms using appropriate carriers, excipients and diluents.
  • the frozen or freeze-dried human IFN-'/ composition of the present invention has low toxicity and can be used for the same purpose as that of the known human IFN- ⁇ by the same usage.
  • I U the international unit (I U) was determined as the activity of IFN- ⁇ (antiviral activity) as follows.
  • the international standard IFN- ⁇ with a defined unit (unit: soto) and the target material were compared with the Sindbis virus (S indbis) against FL cell line derived from human amniotic membrane.
  • FIG. 1 shows an example of the amino acid sequence of rIFN— ⁇ consisting of 146 amino acids.
  • FIG. 2 shows a construction diagram of the plasmid PLC2 disclosed in Reference Example 6 (i).
  • the IFN- ⁇ used in the Examples was a high-concentration human rIF- ⁇ aqueous solution substantially free of inorganic salts produced by the method described in Reference Example 1.
  • the human rIFX- ⁇ has the amino acid sequence shown in FIG.
  • the transformant Escherichia coli 294 / HI Ttr 2101 disclosed in Reference Example 3 was obtained from March 19, 1980, on March 19, 1980 at the Research Institute of Microbial Industry (FRI) Deposit No. FE RM P — 7550.
  • Example 1 was carried out in the same manner as in Example 1 except that 157.5 mg of glycine was mixed with 37.5 mg of hydroxyxethyl starch (average molecular weight: 200,000). The results are shown in Table 1.
  • Example 1 was carried out in the same manner as in Example 1 except that the amount of glycine was increased to 3 Omg and 7.5 g of sodium glutamate was further added. The results are shown in Table 1.
  • Joran filtered obtained was glutathione (reduced form) containing 3mg 3.7x 1 0 6 IU / ml of human IFN- ⁇ aqueous 1 mi solution was sterile filtration containing glycine 3 0 mg to 0.5ml In addition, lyophilization was performed in vials. The freeze-dried product is redissolved in 1 ml of distilled water for injection, and the solution is visually observed and IFN- ⁇ Was measured.
  • the aqueous solution 0.5ml was sterile filtration containing human IFN- ⁇ aqueous 1 mU this Dali Shin 3 0 mg of 4.6X 1 0 8 IU / ml including sterile filtration obtained was glutathione (reduced form) 3 mg In addition, ⁇ 3 ° C. for one week. After cryopreservation, IFN- ⁇ titer was measured. The frozen product exhibited a titer of 97% of the solution before freezing.
  • the titer of the human IFa solution before freeze-drying was 102%.
  • the residual ratio to the titer at the start of storage after storage at 40 ° C for one month was stable at 106%.
  • Example 9 was carried out in the same manner as in Example 9 except that the amount of HS A was increased to 10 mg / ml. The results are shown in Table 2.
  • Example 10 was carried out in the same manner as in Example 9, except that HS A was reduced to 20 mg / ml. The results are shown in Table 2.
  • Example 9 was carried out in the same manner as in Example 9 except that hydroxyxethyl starch (average molecular weight: 40,000) was further added to 5 mgZml. The results are shown in Table 2. ⁇
  • Example 10 was carried out in the same manner as in Example 10 except that sodium glutamate was added instead of glycine to 27 mg / ml to adjust the pH to 7.8 with a 0.1 M NaOH aqueous solution. The results are shown in Table 2. Table 2
  • the residual ratio to the potency of the aqueous solution before freeze-drying was 96%.
  • This solution was preliminarily equilibrated with 25 mM acetate buffer (pH 6.0) containing 10 mM reduced glutathione, 150 mM sodium chloride and 0.01% Tween 20, pH G: 2 Load onto column 5 (14 x 100 cm), filter by gel with the same buffer, and elute fraction of human IFN-a from which guanidine hydrochloride has been removed 3,180 ml (155.8 mg) I got The protein content of this solution was 0.049 mg / ml. The protein recovery was 84.4%. Its specific activity was 3.5X 1 0 6 I UZmg data down white. This solution was aged at 4 ° C.
  • the specific activity of the IFN- ⁇ was 3.7X 1 0 6 IU / mg ⁇ protein.
  • Reference Example 2 Production of high concentration rl F-a aqueous solution
  • Reference Example 1 38 mi of an aqueous solution (protein content: 0.952 mg / ml) containing human IFN-7 at a high concentration obtained by the method of (m) was previously dissolved in 10 mM reduced glutathione and 4 OmM chloride. The column was loaded on a Sephadex G-25 column (5.0 X 50. Ocm) equilibrated with 25 sodium acid buffer (pH 6.0) containing sodium. The solution was developed with one buffer to obtain 52 ml of a clear IFN- ⁇ solution containing 0.04 M of sodium chloride having a protein content of 0.658 mg / ml.
  • the specific activity of the IFN- ⁇ was found to be 4.6X 1 0 6 IU / mg ⁇ protein.
  • silica gel (Separation, Indus' Tries) was added to the diluted solution, stirred at 4 ° C for 45 minutes, allowed to stand for 5 minutes, and the upper solution was discarded by a gradient method.
  • the silica gel was sufficiently washed with a phosphate buffer (PH 7.2) containing 1 M sodium chloride, and then packed in a column (11 ⁇ 11 cm). Then elute with 0.01M boric acid buffer (pH 8.0) containing tetramethylammonium chloride, and elute 2 (H is 5 x 8 cm antibody column [AKMo ⁇ ⁇ 2-11.i); Out] load, 75 0
  • the fraction was eluted with M phosphate solution (pH 7.0), and a fraction (183 ml) having antiviral (hereinafter abbreviated as AV) activity was collected.
  • Reference Example 2 2 ⁇ mM acetate buffer 5 (pH 6.0) containing 0.01 M reduced glutathione and Q.5 M guanidine hydrochloride in 35 ml (11.48 mg) of the rIFiN T -r aqueous solution obtained in (H) ) was added to add 0.055 mg Zml concentration solution 200 ml
  • the solution is then aged for 2 days with 4 parts, concentrated to 9.4 ml by ultrafiltration on a Diaflo PM-10 membrane, and treated with inorganic salts (10%) at a protein content of i.07 mg / ml. ppm) and a clear rIF-r solution without acetic acid buffer.
  • the rl FN- ⁇ will converge mono mers in SDS-PAGE, the specific activity was 3.62 X 1 0 8 IU / mg ⁇ protein.
  • NdeI-NcoI710 bp DNA fragment (A) containing the 1 F N-a gene portion was collected.
  • plasmid pRC23 was digested with restriction enzymes BglII and EcoRIII, and a DNA fragment (B) of 265 bp containing ⁇ PL promoter was isolated.
  • Oligonucleotide adapters that also contain a protein synthesis initiation codon obtained by chemically synthesizing ( ⁇ ), ( ⁇ )
  • Escherichia coli E. coli RRI (pLC2, RK248cIts) containing the plasmid constructed in (i) above was converted to 1% peptotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% saline, 7 gZml Shaking culture was carried out in 50 ml of a liquid medium containing cyclin at 3 ⁇ ° C for 12 hours. Transfer the culture to 2.5fi of M9 medium containing 0.5% casamino acid, 0.5% glucose and 7 g / ml of tetracycline. C The cells were cultured for 4 hours and then at 42 ° C for 3 hours. The cells were collected by centrifugation and stored at 180 ° C.
  • the mixture was subjected to eccentric separation at 10,000 Xg for 30 minutes to obtain 24 ml of the supernatant.
  • the supernatant was diluted with 300 ml of a buffer solution (pH 7.4) consisting of 137 mM sodium chloride, 2.7 mM chloride, 8.1 mM sodium phosphate and 1.5 mM phosphate, and diluted.
  • the mixture was applied to an antibody column (Mor 2-11.
  • the human IFN- ⁇ composition of the present invention which is substantially free of inorganic salts and frozen or lyophilized under the co-presence of amino acid, can obtain IFN- ⁇ during the freezing or freeze-drying operation and storage. (7) Since the activity is extremely low and no turbidity occurs upon dissolution, it can be advantageously used as a pharmaceutical or the like.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

明 細 書
ァ型インターフヱロン組成物
技 術 分 野
本発明は、 ヒ ト ァ型インタ—フヱロン組成物に関する。
背 景 技 術
ヒ トインタ—フ ヱロ ンは現在、 型， 3型およびァ型の 3種類に分類 されている。 α型および^型インタ—フヱロンは比铰的安定で、 主とし て非経口投与剤の形態で臨床に供せられ、 組織的臨床研究も進んでいる。 一方、 7型インタ一フ ヱロン（I F Ν—ァと略称することがある）は.極め て不安定で、 水溶液の保存、 凍結あるいは凍結乾燥の操作中において、 容易にその活性を減じ、 また凍結 燥品を再溶解した液に蜀りを認める 等の問題点を有し、 臨床上使用するに値する安定な組成物を得ることを、 極めて困難にしている。 その為、 インタ—フ ヱロンの中でも著しく強い 抗ウイルス作用ゃ抗'腫瘍作用 [サルビンら，ジャ—ナル ォブ ナショナ ル キャ ンサー インスチチュー ト，第 5 5巻， 1233頁（1975)]を有し、 医薬として最も期待の大きい I F N—ァの臨床応用への大きな坊げとな ている。
ところで、 製剤に供せられるインターフ ヱロンの原体は通常、 粗イン ターフ 口ンから各種のクロマトグラフィ 一等を駆使した分離 ·精製ェ 程を経て高純度のものとして得られる。 本分離 .精製工程では、 種々の 無機、 有機化合物が使用され、 例えば PHおよびイオン強度の調整に用 . いられた無機イオンも精製ィンターフヱロン水溶液中に存在するが、 該 無機イオン（無機塩）は製剤化した場合にも、 安'定化剤等として有利に作 用すると考えられていた。
たとえば、 糖鎖を持たない ^型インタ—フヱロ ンにおいては、 無機塩 を添加することにより安定化されるとの知見が開示されている（特開昭； 5 1 9— 25364号公報）。
本発明者らはかかる技術背景下、 無機塩の濃度を低下せしめた I F N ーァ水溶液を用いて製剤化すると意外にも、 凍結および凍結乾燥の操作 において、 従来の無機塩含有 I F N—ァ水溶液の上記操作におけるより δ も、 一層 I F N—ァ活性の低下が少なく、 また得られた組成物を再溶解 した液に蜀りを認めることのない安定な I F N— ァ組成物が得られるこ とを見い出し、 さらに研究を重ね本発明を完成した。
発 明 の 開 示
本発明は、 実質的に無機塩が存在せず、 アミノ酸が共存する条 ί牛下に0 凍結もしくは凍結乾燥したヒ トァ型インターフヱロン組成物を提供する ものである。
より具体的には、 上記 r l F N— 7は、 第 1図で例示される 1 4 6個 のァミ ノ酸からなるポリペプチ ドやそのポリペプチドの種々のフラグメ ントを包含する。 種々のフラグメントとしては、 例えば上記ポリべプチ5 ドの N末端部分の 4個以下のアミノ酸が欠落した N末端部欠落スピーシ —ズゃ上記ポリペプチドもしくは N耒端欠落スピ—シ—ズの第 1 3 1番 ァミノ酸残基以降の部位で切断された C末端部欠落スピ—シーズなどが 挙げられる。 さらに上記 r I F N - rは上記ポリぺプチドのシスティン 残基がセリ ンもしくはスレオニンに置換されたものも包含する。
0 上記種々のフラグメ ン トの中では、 第 1図で示ざれる 1 4 6個のアミ ノ酸からなるポリべプチドの N末端部分の 4個以下のァミノ酸が欠落し た N末端部欠落スピーシーズまたは当該 N末端鄧欠落スピ—シ―ズの C 末端部分が切断されたものが好ましい。
とりわけ本発明のヒ ト I F N -ァとしては第 1図で示される 1 4 6個δ 1
のァミノ酸からなるポリペプチドまたはそのポリペプチドの C ys— 2 3 ]_ 2 3
Tyr- Cys欠落スピ—シ―ズ [デス（C ys— T yr— C ys) I F -r ]が好 ましい。
また.遺伝子組み換え技術で得られるヒ ト I F N - 7を高濃度に含有す る水溶液が有利に使用される。
ヒ ト I F —ァの非活性は、 1 X 1 05〜 1 X I 07国際単位 Zmg ( I UZmg)であることが好ましく、 I F N—ァ水溶液としては、 I X 1 02〜 1 X 1 07 I U/ml、 とりわけ 1 X 1 0 +〜 1 X 1 07 I U/ lの 活性を有するものが好ましい。
上記 I F N-ァ水溶液として実質的に無機塩を含有しないものが用い られるが、 ここで無機塩の濃度は Q.1M以下であればよく、 0.05M以下、 とりわけ 1 mM以下であることが好ましい。 また無機ィォン強度として は、 無機イオンから計算されるイオン強度が 0. i以下であればよく、 0.05以下、 とりわけ 0.Q01以下であることが好ましい。 さらに凍結乾燥 組成物においては、 ·その全重量に対し、 無機塩が 3 0 %以下であればよ く 1 5 %以下、 とりわけ 0.3%以下であることが好ましい。
実質的に無機塩を含まない I F N—ァ水溶液は、 たとえば I F N— y の精製工程とりわけその最終工程のクロマトグラフィ一操作で用いる緩 衝液として無機塩非含有緩衝液を用いることにより、 あるいは精製され た I F N—ァ水溶液から無機塩を除去することにより製造することがで きる。
アミ ノ酸としては、 ダリ シン， α—ァラニン， 3—ァラニン，ロイシン， グルタ ミ ン酸，ァスパラギン酸などモノァミノ脂肪族ァミ ノ酸が好まし く、 とりわけグリ シンが好ましい。 またこれらの生理学的に許容される 塩もしくは誘導体でもよい。 これらァミノ酸は 1種または 2種以上使用 することができ、 使用するアミ ノ酸は巿阪のものを使用できる力'、 本組 成物を臨床応用する為には、 非経口投与に用いられる程度の品質のもの が好ましい。 ·
了ミ,ノ酸はそれらの全量として、 I F N— 7水溶液 1 ml当り 1 mg以上、 好ましくは 5〜 5 0 mg配合することが好ましい。
また本発明の組成物は、 I F N—ァがシスティン残基を有する場合還 元性硫黄化合物を共存せしめてもよい。 該還元性硫黄化合物として、 グ ' ルタチオン（還元型），チォク ト酸，チォジグリコ—ル，チォェタノ ールァ ミ ン，モノチォグリセ口—ル，ジチオスレイ ト—ルおよび炭素数 1〜 7の チオアルカン酸が挙げられるがとりわけ、 グルタチオン（還元型）が好ま しい。 還元性硫黄化合物を共存せしめる場合、 I FN - '/水溶液 l ml当 り還元性硫黄化合物 O.lmg以上、 とりわけ 0.5〜 1 Omgが好ましい。
更に他の安定化剤としてヒ ト血清アルブミ ン（HS A)または（および） 糖穎を加えることができる。 HS Aとしては、 いかなるものでもよいが、 本組成物 臨床応用するためには、 非経口投与に用いる程度の品質のも のが好ましい。 例えば、 健康人血漿を原料として C'ohnのエタノ ール分 画第 6法によって、 分画精製したもの [ジャーナル ォブ アメ リカン ケミカル ソサイエティ ,第 6 8卷， 4 :5 9— 4 7 5頁（1946)]が用い られる。 また H S Aは安定剤としてァセチルトリプ.トフアンナトリウム や、 カプリル酸ナトリゥムを含有するものであってもよい。
HS Aは I F N—ァ水溶液に対し水溶液 1 ml当り' 1 mg以上、 とりわけ
2 mg〜 2 0 mg含有させることが好ましい。
本発明の組成物が HS Aを含有する場合においては、 溶液状態で pH 4.0〜5.0または 7.5〜8.5を示すように調整す :ることが好ましい。 より詳 しくは、 上記アミノ酸類が中性アミノ酸類である場合は、 pH4.0〜5.0 に、 酸性アミノ酸額である場合は pH7.5〜8.5に調整することが好まし い。 ' 糖類としては、 例えばデキストラン，ヒ ドロキシェチル殿粉のような 多糖類、 ショ耱、 マルトースおよび乳糖のような二糖類およびブドウ糖、 果糖、 マンノ ースおよぴガラク トースのような単糖類から選ばれた 1種 または 2種以上の物質が挙げられる。
上記デキス トランおよびヒ ドロキシェチル澱粉に関し、 これらは市販 の 0のを使用できるが、 本組成物を臨床応用するためには、 代用血漿と して非経口投与に用いられる程度の品質のものが好ましい。 デキス トラ ンは、 平均分子量 1万〜 1 0万、 とりわけ 4万〜 7万のものが、 ヒ ドロ キシェチル澱粉は、 平均分子量 1万〜 2 0万、 とりわけ 2万〜 6万また は 2 0万のものが有利に使用される。
上記した糖類を加える場合は、 I F Ν —ァ水溶液 1 ml当り 1 iig以上、 好ましくは 3 mg〜 5 0 mg含有させることが好ましい。
本組成物は、 更に浸透圧の調整剤としての前記糖類または（および）ァ ミ ノ酸類等を含有していてもよいが、 塩化ナトリウ 'ムのような無機塩を 添加することは、 反って組成物の品質を劣化させるので、 好ましく ない。 上記の好ましい浸透圧の調整剤は該組成物に予め加えておくか、 凍結乾 燦品を再溶解する溶媒中に加えてもよい。
本発明の凍結および凍結乾燥したヒ ト I F N—ァ組成物は、 例えば以 下の方法により製造することができる。
実質的に無機塩が存在しないヒ ト I F N —ァ 1 X 1 0 2 ~ 1 X 1 0 7
I じ/ ml含有水溶液に、 アミノ酸を 1 mg/ml以上、 好ましくは 5〜 5 0 mg/mlの濃度になるように加える。 なお該 I F N —ァ含有水溶液には、 その製造過程において上記ァミ ノ酸を添加することができ、 このアミ ノ 酸をも含有する I F N —ァ水溶液を用いる場合は、 そのまま、 または必 要により上記アミ ノ酸の濃度までァミ ノ酸を追加して以下の工程に付す ことができる。 更に上記した H S Aや糖類なども合せて加えることができる。
上記 I F N—ァ水溶液には Q . lmg/ml以上、 好ましくは Q . 5〜10mg/ml の還元性硫黄化合物や微量の界面活性剤を含有していてもよく、 また上 記安定剤と同様、 これらを新たに加えることもできる。
また所望により PH調整を行う場合は、 鉱酸（塩酸，硫酸など）または（お よび）無機塩基（水酸化ナトリゥム，炭酸ナトリゥムなど）水溶液を加え所 定の PHに調整する。
本発明の凍結したヒ ト I F N—ァ組成物は、 例えば上記水溶液を通常 一 8 0 ° 〜一 3 0 °Cで凍結することにより製造できる。 該凍锆組成物は 一 8 0 ° 〜一 1 0てで保管することが好ましい。
本発明の凍結乾燥したヒ ト I F N 7組成物は、 例えば上記凍結組成 物を常法により減圧乾燥するか上記水溶液または上記凍結組成物の融解 により得られる水溶液を、 所望により小分けし、 上記同様凍結した後、 常法により減圧乾燥することにより製造することができる。
注射用製剤としての本発明の凍結乾燥したヒ ト I F N—ァ組成物を製 造する場合は、 小分けする前に該組成物水溶液あるいはその成分 ¾それ ぞれ除菌ろ過等により精製し、 無菌操作によりパイアル瓶等に分注小分 けした後上記凍結乾燥処理に付すことが好ましい。
本発明の凍結もしくは凍結乾燥したヒ ト I F N—ァ組成物は、 その凍 結あるいは凍結乾燥操作および保存中の I F -ァ活性や品質の低下が 極めて少なくまたその再溶解時に蜀りが生じないため有用である。 また 凍锆乾燥した組成物は、 安定化されたヒ ト I F N—ァの粉末として得ら れとりわけ非経口投与製剤として有利に用いることができる。 この場合 さらに H S Aを加えた組成物は、 器壁への付着が少なく有利に用いるこ とができる。
本発明の凍結乾燥したヒ ト I F N—ァ組成物を注射用製剤として用い る場合は、 通常用時、 凍結乾燥組成物をバイアル当り 1〜 1 0 O mlの注 射用蒸留水またはブドゥ糖注射液等に溶解し、 溶液の浸透圧が生理的に 許容される範囲内で使用する。 また適当な担体，賦型剤，希釈剤を用いて 眼，耳，鼻内投与用の剤形として用いることができる。
本発明の凍結したもしくは凍結乾燥したヒ ト I F N — '/組成物は、 低 毒性で、 公知のヒ ト I F N—ァと同様の目的に同様の用法により使用す ることができる。
本願明細書中、 I F N—ァの活性（抗ウィルス活性）として国際単位（I U )は以下により求めた。
単位（ュ二.ソ ト）の確定した国際標準 I F N—ァと目的とする資料をヒ ト羊膜由来 F L細胞株に対するシン ドビス ウィルス（S indb i s
V irus)の細胞変性効果阻止試験を用いて測定し、 その比率から力価を 算出して求めた。
なお溶液中の'蛋白量は、 E： 2 8 0 nm= 1. 0を 1 mgとして計算して求め た。
. 図面の簡単な説明
第 1図は 1 4 6個のアミ ノ酸からなる r I F N —ァのァミノ酸配列の 一例を示す。 第 2図は参考例 6 ( i )に開示するプラスミ ド P L C 2の構 築図を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
実施例で用いた I F N —ァは、 特に注意し'ない場合は、 参考例 1 に記 載した方法で製造した実質的に無機塩を含まない高濃度ヒ ト r I F — ァ水溶液を使用した。 なお該ヒ ト r I F X —ァは第 1図に示すアミ ノ酸 配列を有する。 参考例 3に開示した形質転換体ェシエリ ヒア コリ（Escherichia coli) 2 94 / H I Ttr 2 1 0 1は、 昭和 5 9年 3月 1 9日から通商 産業省工業技術院微生物工業研究所（F R I )に受託番号 F E RM P— 7 5 5 0として寄託されている。
実施例 1〜8に記載の組成物の製造においては、 積極的な PH調整を 行なっていないが、 これら注射用蒸留水による再溶解時の P Hは p H 5.5 〜7の範囲である。
実施例 1
除蘭ろ過して得たグルタチオン（還元型） 3mgを含む 2.4X 1 06 I U/ mlのヒ ト I F N— 7水溶液 1 mlにグリ シン 1 5 mgを含有する除菌ろ過し た水溶液 0.5mlを加え、 バイアル瓶中で凍結乾燥を行った。 凍結乾燥品 は注射用蒸留水 1 mlで再溶解して、 溶液の溶状の肉眼観察と I FN - 7 の力価測定を行った。 その結果は第 1表に示す。 · 実施例 2
実施例 1において、 グリシン 1 5 mgと共にヒ ドロキシェチル澱粉（平 均分子量 2 0万） 37.5mgを配合した以外は実施例 1 と同様に行った。 そ の結果は第 1表に示す。
実施例 3
実施例 1において、 グリ シンを 3 Omgに増量し、 更にグルタ ミ ン酸ナ トリゥム 7.5tngを配合した以外は実施例 1 と同様に行った。 その結果は . 第 1表に示す。
実施例 4
除蘭ろ過して得たグルタチオン（還元型） 3mgを含む 3.7x 1 06 I U/ mlのヒ ト I F N—ァ水溶液 1 miにグリ シン 3 0 mgを含有する除菌ろ過し た水溶液 0.5mlを加え、 バイアル瓶中で凍結乾燥を行った。 凍結乾燥品 は注射用蒸留水 1 mlで再溶解して、 溶液の溶状の肉眼観察と I F N— ァ の力価測定を行った。
象としてグリ シンを配合せずに、 除菌ろ過して得たグルタチォン (還元型） 3 mgを含むヒ ト I F N— ァ水溶液 i mlをバイアル瓶中で凍結乾 燥を行い、 同様に I F N-ァのカ価を測定した。 その結果は第 1表に示 す。
第 1 表
実 施 例 溶 伏 i力価残存率'〉
1 澄 明 1 0 0 ¾
2 澄 明 9 4 %
3 澄 明 1 04 %
4 澄 明 9 8 %
4 (対照品） 澄 明 8 6 %
凍結乾燥前の溶液に対する凍結乾燥品の力価残存率
実施例 5 ' '
除菌ろ過して得たグルタチオン（還元型） 3mgを含む 4.6X 1 08 I U/ mlのヒ ト I F N—ァ水溶液 1 mUこダリ シン 3 0 mgを含有する除菌ろ過し た水溶液 0.5mlを加え、 — 3 0°Cに 1週間.凍結保存した後、 I F N -ァ の力価を測定した。 該凍結品は凍結前の溶液に対して 9 7 %の力価を示 した。
実施例 6
参考例 2で得た r I F N - y含有溶液を除菌ろ過して得たグルタチォ ン（還元型） 3 mg/π および塩化ナトリゥム 2.5mgノ mlを含む 4.6X 1 06 I U/nUのヒ ト I FN—ァ水溶液 0.25mlにダリ シン 1 5 mgを含有する除 菌ろ過した水溶液 0.75mlを加え、 バイアル瓶中で凍結乾燥を行った。 凍 結乾燥品は注射用蒸留水 1 mLで再溶解すると少量の微細不溶物が生じ、 そのまま これの I F X—ァの力価測定を行つた。 1 その結果、 凍結乾燥前のヒ ト I F N—ァ溶液の力価に対して 9 8 %で
' あった。
実施例 7
除菌ろ過して得たダルタチオン（還元型） 3 mg/mlを含む 2.6x 1 06 5 I UZmlのヒ ト I F N— ァ水溶液 0.5mUこグリ シン 1 0 ragおよびヒ ドロ キシェチル澱粉（平均分子量 4万） 1 5 mgを含有する除菌ろ過した水溶液 0.25mlを加えパイアル瓶中で凍結乾燥を行った。 凍結乾燥品は注射用蒸 留水 0.5mlで再溶解して溶液が澄明であることを確認し、 I F N—ァの 力価測定を行った。
その結果、 凍結乾燥前のヒ ト I F N—ァ溶液の力価に対して 94 %で
• あった。 また 4 0 C 1力月保存後の保存開始時の力価に対する残存率は 1 0 0 %と安定であつた。
実施例 8
除菌ろ過して得たグルタチオン（還元型） 3 mg mlを含む 2.6X 1 085 I UZmlのヒ ト I F N— 7水溶液 0.5mlにグルタ ミ ン酸ナ ト リ ウム 1 5 m gおよびヒ ドロキシェチル澱粉（平均分子量 4万） 1 5 mgを含有する除菌 ろ過した水溶液 0.25mlを加えバイアル瓶中で凍結乾燥を行った。 凍結乾 . 燥品は注射用蒸留水 0.5mlで再溶解し'て溶液が澄明であることを確認し、
I F - rの力価測定を行った。
0 その結果、 凍結乾燥前のヒ ト I F ァ溶液の力価に対して 1 0 2 % であった。 また 4 0°C 1力月保存後の保存開始時の力価に対する残存率 は 1 0 6 %と安定であつた。
実施例 9 '
ダルタチオン（還元型） 3 mg/mlを含む 3.8X 1 08 I UZnilのヒ ト I Fδ N -ァ水溶液 0.16ml、 H S A 5 mg/miおよびグリ シン 2 3 mgZmlを含有 し、 H C 1で pH4.5に調製した除菌ろ過した水溶液の各 1 mlをバ ィアル瓶に分注し、 凍結乾燥を行った。 凍結乾燥品は注射用蒸留水 1 ml で再溶解して溶液の溶状の肉眼観察、 pHの測定および I F N— 7の力 価測定を行った。 その結果は第 2表に示す。
実施例 10
実施例 9において、 HS Aを 1 0 mg/mlに増量した以外は実施例 9と 同様に行った。 その結果は第 2表に示す。
実施例 11
実施例 1 0において、 HS Aを 2 0 mg/mlに增量した以外は実施例 9 と同様に行った。 その結果は第 2表に示す。
実施例 12 4 5465
実施例 9において、 更にヒ ドロキシェチル澱粉（平均分子量 4万）を 5 mgZmlになるように加えた以外は実施例 9と同様に行った。 その結果は 第 2表に示す。 ―
実施例 13
実施例 1 0においてグリ シンのかわりにグルタ ミ ン酸ナトリウムを 2 7 mg/mlになるように加え 0.1M NaO H水溶液で pH'7.8に調整した 以外は実施例 1 0と同様に行った。 その結果は第 2表に示す。 第 2 表
実施例 溶 伏 PH ； 力価残存率※
9 澄 明 1 0 7 %
1 0 澄 明 1 0 5 %
1 1 澄 明 -9 8 %
1 2 澄 明 1 0 9 %
1 3 澄 明
Figure imgf000013_0001
9 5 %
凍結乾燥前の溶液に対する凍結乾燥品の力価残存率 -12-
1 参考例 3〜 5で得た実質的に無機塩を含まない高濃度 r I F N—ァ水 溶液を用いても上記実施例と同様の锆果が得られる。
実施例 14
1 2 参考例 6に記載の方法で得た 2.5X 1 06 I U/mlのデス（Cys— Tyr o
3
一 Cys) I F - r水溶液 0.25n 、 H S A— 5 mg/mlおよびグリ シン 2 3 mg/mlを含有し、 Q.1N H C 1で pH 4.5に調整した除菌ろ過した水溶液 の各 1 mlをバイアル瓶に分注し、 凍結乾燥を行つた。 凍結乾燥品は注射 用蒸留水 1 mlで再溶解した。 溶液の溶状は澄明で、 PH4.5であった。 ま
10 た凍結乾燥する前の水溶液の力価に対する残存率は 9 6 %であった。
実施例 15 -
1 2 参考例 6に記載の方法で得た 2.5X 1 06 I U/mlのデス（Cys— Tyr
3 '
- Cys) I F -ァ水溶液 ·0.25πι1、 ヒ ドロキシェチル澱粉（平均分子量 4 万）を 1 5 mg/mlおよびダリ シン 2 3 mg/mlを含有するように調整され た除菌ろ過した水溶液の各 1 mlもバイアル瓶に分注し、 凍結乾燥を行つ た。 実施例 1 4と同様に再溶解したときの溶液の溶状は澄明で PH6.5で あった。 また凍結乾燥する前の水溶液の力価に対する残存率は 101 % であった。
参考例 1 実質的に無機塩を含まない高濃度 r l F N—ァ水溶液の製造
(I ) EP C 0 0 8 9 6 7 9号公開公報実施例 8の記載に準じ発 現用ヒ ト I F N—ァ遺伝子を有する菌株 RR 1 (pRK 24 8 c I ts, PRC 2 3 1 / I F I - 9 0 0 )を培養してえた凍結菌体 lOOOgに 7 M塩 酸グァニジンおよび 2 mMフヱニルメチルスルホニルフルオラィ ドを含
Figure imgf000014_0001
む 1 0 0 トリス塩酸緩衝液（PH7.0)を 3QQ0na加え、 4てで 1時間攪 拌したのち遠心分離機（1 7 , 0 0 0 rpm/ 3 0分）に付し、 澄明な上清液 もえた。 この上清液を 1 3 7 塩化ナト リ ウム， 2 7 mM塩化力リウム， 8 mMリ ン酸ニナトリウムおよび 1 4 7 mMリ ン酸カリウムから成る锾衝 液（以下 PB Sと略す）で 7 0倍に希釈し、 生じてく る沈澱物をシャープ レス遠心分離機（ 1 0 , 0 0 0 rpm)に付して除去した。 次いでえられた上 清液 2 2 0 βをペリ コン（ミ リポア社製，分画分子量： 1 0 , 0 0 0 )で 1 5 βにまで濃縮した。 この濃縮液を 4 °Cで一夜放置し、 生じた沈澱物をさ らにシャ―プレス遠心分離機にかけて除去した。 この上清液を予め充填 した 5 X 3 Octnの抗体カラム [ΑΚΜο · ァ 2— 11.1);EP C 0 1 0 3 8 9 8号公開公報実施例 1 2参照]に流速 1， 0 0 Ond/時間で負荷し たのち、 P B Sの 2 , 5 0 0 ml , 1 M塩化ナトリウムおよび 0.1%ツイ— ' ン 2 0を含んだ 1 0 mMリ ン酸緩衝液（PH7.0)の 5 , 0 0 Oml.P B Sの 2 , 5 0 0 mlおよび 塩酸グァニジンを含んだ 2 0 mMリ ン酸緩衝液 (PH7.0)の 2 , 5 0 0 mlの各洗浄液を遂次抗体カラムを通過させたのち、 2 M塩酸グァニジンを含む 2 0 mMリ ン酸緩衝液（PH7.0)で溶出し、 抗 ウィルス活性を有する溶出画分 5 0 0 mlを集めた。
(Π) 参考例 1 (I )の方法で得た溶出画分 4 2 0 mlに還元型グルタチォ ンを 1 0 mM量添加した。 このヒ ト I F N— ァ水溶液の 4 2 0 mlを予め 1 mMェチレンジァミ ン四酢酸塩， 1 5 0 mM塩化ナ ト リ ウム， 1 0 mM還 元型グルタチオンおよび 2M塩酸グァニジンを含んだ 2 5mM酢酸緩衝 液 （PH6.0)で平衡化したセファ ク リ —ル S— 2 0 0 (フアルマシア社製） のカラム（9 X 1 0 0cm)に負荷し、 同一緩衝液で溶出し、 モノマー溶出 画分 4 δ 0mlを集めた。 本操作により比活性 .4X 1 06 I U/mgタン白 の I F N— 7 (Q.41Qmg/ml)を得た。
(I) 参考例 1 (Π)でえたヒ ト I F N— ァ（モノ マー）溶出画分 4 5 0 ml に 1 0 mM還元型グルタチオン， 1 5 0 m i塩化ナトリウム， 0. 塩酸グ ァニジンおよび 0.01%ツイ—ン 2 0を含む 2 5 mMS乍酸緩衝液（PH6.0) の希択液 3 , 24 0 mlを添加、 混合し、 タ ン白含量 0.05mg/mlの低濃度 溶液を調整した。 この溶液を予め、 1 0 mM還元型グルタチオン， 1 5 0 mM塩化ナトリウムおよび 0.01%ツイ—ン 2 0を含む 2 5 mM酢酸緩衝液 (pH 6.0)で平衡化したセフアデ、:/クス G— 2 5のカラム（ 1 4 x 1 0 0 cm)に負荷し、 同一緩衝液でゲルろ過を行い、 塩酸グァニジンを除去し たヒ ト I F N—ァの溶出画分 3 , 1 8 0 ml(155.8mg)をえた。 この溶液の タン白含量は 0.049mg/mlであつた。 タン白回収率は 84.4%であつた。 その比活性は 3.5X 1 06 I UZmgタ ン白であった。 この溶液を 4°Cで 4 8時間熟成させたのち、 ダイアフロ— PM— 1 0 , 43 (アミ コン 社製限外ろ過膜）を用い、 限外ろ過により 1 5 9 π まで濃縮した。 この 濃縮液は澄明で、 そのタン白含量は 0.92mgZmlであった。 タン白回収率 ' は 93.9%(146.3mg)であった。 なお、 ヒ ト I F N—ァの比活性は 6.8 X - 1 06 I UZjngタン白であつた。
(IV) 上記（ΠΙ)の方法で得たヒ ト I F N— yを高濃度に含有する水溶液
(タン白含有量； OJ mgZml)の 3 8 mlを予め 1 OmM還元型ダルタチォ ンを含んだ 2 5 mM酢酸緩衝液（PH6.0)で平衡化したセフアデ'ソ クス G — 2 5のカラム（5.0X50. Ocm)に負荷し、 同一緩衝液で展開し、 タ ン白 含量 0.589mg/mlの実質的に無機塩を含まない（ 1 Oppm未満）澄明な I F 一 7溶液 5 7 mlもえた。
この I F N— ァの比活性は 3.7X 1 06 I U/mg · タン白であった。 参考例 2 高濃度 rl F -ァ水溶液の製造
参考例 1 (m)の方法で得たヒ ト I F N— 7 高濃度に含有する水溶液 (タン白含有量；0.952mg/ml)の 3 8 miを予め 1 0 mM還元型グルタチォ ンおよび 4 OmM塩化ナトリ ゥムを含んだ 2 5 詐酸緩衝液（pH 6.0)で 平衡化したセフアデックス G— 2 5カラム（5.0 X 50. Ocm)に負荷し、 同 一緩衝液で展開し、 タン白含量 0.658mg/mlの塩化ナトリウムを 0.04M 含む澄明な I F N—ァ溶液 5 2 mlをえた。
この I F N—ァの比活性は 4.6X 1 06 I U/mg · タン白であつた。
参考例 3 実質的に無機塩を含まない高濃度 r I F - r水溶液の製造
Π ― .
(I ) EP C 0 i 0 3 8 9 8号公開公報参考例 2に記載の形質転 換体ェシエリ ヒア コリ（Escherichia coli) 2 94 /pH I T trp 2 1 0 1の培養、 凍桔菌体 1 kgに 7 M塩酸グァニジンを含む 0.05Mホウ 酸緩衝液（PH7.2)を 3 , 0 0 Oml加え、 4°Cで 1時間攪拌したのち、 違 心分離（1 7 , 0 0 0 rpm/3 0分）にかけ澄明な抽出液' 2 , 7 0 0 mlをえ た。 この抽出液を 塩化ナトリゥム， 2.7mM塩化力リウム， 8 mMリ ン酸 2ナトリゥムおよび 1.47mMリ ン酸 1カリゥムから成る緩衝液（以下 P . B . Sと略す）で 1 0倍に希釈した。 次いでこの希釈液にシリカゲ ル（セパレイシヨン . ィンダス'トリ—ズ社製） 0.4kgを加え、 4 °Cで 4 5 分間攪拌， i 5分間静置したのち、 傾斜法で上液を棄てた。 このシリカ ゲルを 1 M塩化ナトリゥムを含む、 リ ン酸緩衝液（PH 7.2)で十分洗 净したのち、 カラム（ 1 1 X 1 1 cm)に充填した。 次いで 塩化テト ラメチルアンモニゥムを含む 0.01Mホウ酸锾衝液（pH 8.0)で溶出し、 溶 出液 2 (Hを 5 X 8 cmの抗体カラム [AKMo♦ γ 2— 11. i)；前出]に負荷， 7 5 0|111の？ . B . Sで洗浄したのち、 2 M塩酸グァニジンを含む 0.02
Mリ ン酸锾街液（pH 7.0)で溶出し、 抗ウィルス（以下 A Vと略す）活性を 有する画分 1 8 3 mlを採集した。 この溶出液に還元型グルタチオンを 0.01M量（5 6 2 rag)を添加して比活性 2. IX 1 06 I U/mg · タン白の r I F - r n2mgを含む水溶液をえた。
(Π) 参考例 3 ( I )でえた r I F N -ァ含有水溶液の 1 8 3 mlを予め
1 エチレンジアミ ン四舴酸塩， 塩化ナトリ ゥム， 0.01M還元型 丄 グルタチオンおよび 2 M塩酸グァニジンを含む 2 5 mM酢酸緩衝液（PH ' 6.0)で平衡化したセファクリ—ル S— 2 0 0 (フアルマシア社製）のカラ ム（9 X 7 9 cm)に負荷し、 同一緩衝液で展開し、 モノマー溶出画分
4 3 3 mlを採集した。 このようにしてえられた画分はドデシル硫酸ナト 5 リウムのス ブ電気泳動（以下 S D S— P AGEと略す）でモノマーに収 斂した。 このゲルろ過処理により比活性 3. Qx 1 06 I U/mg · タン白の r I F N—ァを 1 4 2 mg含む水溶液をえた。
(I) 上記（Π)でえた r I F N— 7含有水溶液の 36.6ml(12.0mg)に 0.01 M還元型グルタチオンおよび 0. 塩酸グァニジンを含む 2 5 mMi乍酸緩0 衝液^^¾6.0)の163.4!111を添加し、 0 J6mgZml濃度溶液を 2 0 0 ml調製 した。 この溶液を予め 0.01M還元型グルタチオンを含む 2 5mM酢酸锾 衝液（PH 6.0)で平衡化したセフアデックス G— 2 5 (フアルマシア社製） カラム（5 X 6 0 cm)に負荷し、 同一緩衝液で展開溶出し、 r I F — 7 画分 2 2 0 mlをえた。 この溶液の r I F - r濃度は 0 J47mg/mlであつ5 た。 次いでこの溶液を 4： 。Cで 2日間熟成したのち、 ダイアフロ一 P M—
1 0膜（ァミ コン社製限外ろ過膜）の限外ろ過法で 1 4 mlにまで澳縮し、 タン白含量 0.71 I g/nUで実質的に無機塩を含まない（ 1 0 ppm未溝）澄明 な r I F - r溶液をえた。 このようにしてえられた高濃度 r I F - r i S D S— P A G Eでモノマーに収斂した。 この r I F N—ァの比活性0 は 3.6X 1 0 s Γじ/ mg ·タン白であった。
参考例 4 実質的に無機塩を含まない高濃度 r l F -ァ水溶液の製造
I
参考例 ί (H)でえた r I F iNT - r水溶液の' 3 5 ml(11.48mg)に 0.01M還 元型グルタチオンおよび Q.5M塩酸グァニジンを含む 2 δ mM酢酸緩衝液5 (PH6.0)の 1 6 5 mlを添加して調製した 0.057mgZml濃度溶液 2 0 0 ml
を予め 0.01M還元型グルタチオン溶液 (PH 6.0)で平衡化したセフアデ'：/' クス G— 2 5カラム（5 X 6 0 cm)に負荷し、 0.01M還元型グルタチオン 溶液（PH6.0)で展開し、 r I F N—ァの溶出画分 2 3 5 をえた。 この 溶液の rl F -ァ濃度は 0.046mg/mlであった。 次いでこの溶液を 4 °C で 1 日間熟成したのち、 ダイアフロ— PM— 1 0膜の限外ろ.過法にて 1 0 mlにまで濃縮し、 タ ン白濃度 l.OSmgZmlで実質的に無機塩（ 1 0 ppm 未満）および酢酸緩衝液を含まない澄明な r I F N—ァ水溶液をえた。 こ のようにしてえられた r I F N—ァは S D S— P A G Eでモノマーに収 斂した。 この r I F - 7の比活性は 3.6X 1 06 I U/mg · タン白であつ た。 ' .
参考例 5 実質的に無機塩を含まない高濃度 r I F N -ァ水溶液の製造
W
参考例 1 (H)でえた r I F N—ァの 3 5 ml(11.48mg)に 0.01M還元型グ ルタチオンおよび 0.5M塩酸グァニジンを含む 2 5 tnM酢酸緩衝液（pH 6.0)の 1 6 5 mlを添加して、 Q .057mg/ml濃度の溶液を 2 0 0 ml調製し た。 この溶液を予め Q.267Mダリ シンと 還元型グルタチォンを含 む溶液（PH 6.0)で平衡化したセフアデヅ クス G— 2 5カラム（5 X 6 0 cm)に負荷し、 同一溶液で展開し、 rl F N—ァの溶出画分 2 2 0 mlをえ た。' この溶液の r l F Ν—ァ濃度は Q.046mg/mlであった。 次いでこの溶 液を 4てで 2日間熟成したのち、 ダイアフロ— PM— 1 0膜の限外ろ過 法で 9.4mlまで濃縮し、 タン白含量 i.07mg/mlで実質的に無機塩（1 0 ppm未満）および酢酸锾衝液を含まない澄明な r I F - r溶液をえた。 この r l F N—ァは S D S— PAGEでモノ マーに収斂し、 その比活性 は 3.62 X 1 08 I U/mg · タン白であった。
1 2 ？ 参考例 6 実質的に無機塩を含まない高濃度デス （Cys - Tyr— Cys)
I F X - 7水溶液の製造 ( i ) 形質転換体の製造
I FN- 7発現プラスミ ド PR C 2 3/ I F I - 9 0 0 [EP C公開第
0 0 8 9 6 7 6号公報実施例 7参照]を制限酵素 Nde I ,NcoIで消化し、
1 F N—ァ遺伝子部分を含む Nde I - Nco I 7 1 0 bp DNA断片 (A)を分取した。 一方、 プラスミ ド pR C 2 3を制限酵素 Bgl Π，EcoR ίで消化し、 λ P Lプロモータ—を含む 2 6 5 bpの D N A断片（B)を分 取した。 （Α),(Β)と化学合成して得た蛋白合成開始コ ドンも含むオリ ゴヌクレオチドアダプター
AATT CAT G CAG GAT C CA
GTAC GT C CTAG GTAT - を Τ 4 D Ν Αリガーゼを用いて Nde I と EcoR Iののりしろ部分に結合 させた。得られた D N A断片を Nco I と Bgi Πで処理して得たプラスミ
1 2 Q
ド PR C 23 / I F I— 9 0 ひに結合させ、 Cys— Tyr— Cys欠落 I F N—ァのポリペプチドをコ― ドする発現プラスミ ド pL C 2を構築した (第 2図）。 このプラスミ ド pL C 2を用いて Cohenらの方法 [プロシ―ジ ングス ォブ ナショナル アカデミ ー ォブ サイエンス， 6 9， 2 1 1 0 (1972)]に従って大腸菌 RR I (pRK 24 8 c I ts)を形質転 換し、 形質転換体ェシエリ ヒア コリ（Escherichia co.li =E . coli) R R I (PL C 2 ,pRK 24 8 c I ts)を得た。
(ii) 形質転換体の培養
上記（ i )で構築したプラスミ ドを含む菌株 E. coli RR I (pL C 2 , RK 24 8 c I ts)を 1 %パク ト トリプト.ン， 0.5%酵母エキス， 0.5% 食塩， 7 gZmlテトラサイクリ ンを含む液体培地 5 0 ml中で、 3 δ °C， 1 2時間振とう培養を行った。 培養液を 0.5%カザミノ酸， 0.5%グルコ ース， 7 gノ mlのテトラサイクリ ンを含む M 9培地 2.5fiに移し、 3 5。C 4時間、 ついで 4 2°Cで 3時間培養した。 遠心分離して菌体を集め、 一 8 0°Cで保存した。
(Hi) 精製
上記（Π)と同様の方法で得た凍結菌体 7. lgを 7 M塩酸グァニジンおよ び 2 フヱニルメチルスルフォニルフルオラィ ドを含む トリス塩 酸緩衝液（PH7.0) 2 2 mlに懸凝し、 4てで 1時間攪拌したのち 10 , 000 X g で 3 0分間違心分離にかけて上清 24 mlを得た。 この上清に 1 3 7 mM 塩化ナトリゥム， 2.7mM塩化力リゥム， 8.1mMリ ン酸ニナトリゥムおよび 1.5mMリ ン酸一力リゥムから成る緩衝液（pH7.4) 3 0 0 mlを加えて希釈 し、 抗体カラム（Mo r 2—11.しカラム容量 1 5 ml)に流速 1 mlZ分で かけた。 そののち、 0.5M塩酸グァニジンを含む 2 0 mMリ ン酸ナト リウ ム锾衝液（PH7.0) 6 0 mlでカラムを洗浄し、 ついで、 2M塩酸グァニジ ンを含む 2 OmMリ ン酸ナトリゥム緩衝液（pH 7.0)4 5 mlで溶出し、 抗 ウィルス活性を有する画分 2 5παを得た。 この画分 2 5mlをあらかじめ 1 mMェチレンジァミ ン四舴酸，0.15M塩化ナトリウム， 1 0 mMシスティ ンおよび 2 M塩酸グ'ァ二ジンを含 、 2 5 mM酢酸ァンモニゥム緩衝液 （P H6.0)で平衡化したセファクリール S— 2 0 0 (フ ァルマンァ社製）の力 ラム（2.6X 94 cm),カラム容量 5 0 0 mlにかけ、 同一緩衝液で溶出しセ 抗ウィルス活性を有する画分 4 0 mlを得た。
]_ 2 3
ここで得られた Cys— Tyr— Cys欠落 I F N—ァのポリぺプチ ドニデ ^ 2 3
ス（Cys— Tyr— Cys) I F N—ァ]は、 7.0nigであり、 比活性は 2.7X 1 06 I U/mgであつた。
(iv) 高濃度水溶液の製造 上記（iii)でえたデス（Cys— Tyr— Cys) I F N - γを含む溶出画分 2.2ml(タンパク濃度 0.18mg/ml)を 0.5M塩酸グァニジンを含む 2 5 mM 酢酸アンモニゥム緩衝液（PH6.0)17.6mlで希釈した。 この溶液をあらか じめ 2 5mM詐酸アンモニゥム锾衝液（PH6.0)で平衡化したセフアデッ クス G— 2 5カラム（2.6X 1 5 cm)に負荷して、 同一緩衝液で溶出し、
1 2 3
塩酸グァニジンを除去したデス（Cys— Tyr— C s) I F - rの溶出画 分 2 3 ml (タンパク濃度 O.QISmgZml)を得た。
本溶出画分を 4 °Cで 24時間熟成したのち、 ダイアフロ— Y I— 1 0
(2 5 mm0 ,アミ コン社）を用いて限外ろ過により濃縮し、 フィルター
(0.2 m)でろ過し 0.68mlの澄明な溶液を得た。 タンパク濃度は Q ;41mg/ mlであつた。
産業上の利用可能性
本発明の実質的に無機塩が存在せず、 ァミノ酸が共存する条件下に凍 結もしくは凍結乾燥したヒ ト I F N—ァ組成物は、 その凍結あるいは凍 桔乾燦操作および保存中において I F N— 7活性の低下が極めて少なく またその 溶解時に濁りが生じないため医薬品等として有利に使用する ことができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 実質的に無機塩が存在せず、 アミ ノ酸が共存する条件下に凍結もし く は凍結乾燥したヒ ト ァ型インタ—フヱロン組成物。 ，
2 . ァミノ酸がモノァミ ノ脂肪族ァミ ノ酸である請求の範囲第 1項記載 の組成物。
PCT/JP1985/000190 1984-07-10 1985-04-12 gamma-INTERFERON COMPOSITION Ceased WO1986006080A1 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP1985/000190 WO1986006080A1 (en) 1985-04-12 1985-04-12 gamma-INTERFERON COMPOSITION
EP85108409A EP0168008A3 (en) 1984-07-10 1985-07-06 Stable composition of gamma-interferon
ES544991A ES8608542A1 (es) 1984-07-10 1985-07-09 Un metodo para producir una composicion de gamma-interferon de ser humano.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP1985/000190 WO1986006080A1 (en) 1985-04-12 1985-04-12 gamma-INTERFERON COMPOSITION

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1986006080A1 true WO1986006080A1 (en) 1986-10-23

Family

ID=13846430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1985/000190 Ceased WO1986006080A1 (en) 1984-07-10 1985-04-12 gamma-INTERFERON COMPOSITION

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO1986006080A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE39821E1 (en) 1982-05-06 2007-09-04 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59181224A (ja) * 1983-03-29 1984-10-15 Sumitomo Chem Co Ltd 安定なインタ−フエロン製剤の製法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59181224A (ja) * 1983-03-29 1984-10-15 Sumitomo Chem Co Ltd 安定なインタ−フエロン製剤の製法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE39821E1 (en) 1982-05-06 2007-09-04 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107743494B (zh) 具有极性重组延伸体的胰岛素
US5631347A (en) Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein
US5656730A (en) Stabilized monomeric protein compositions
EP2074140B1 (en) Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues
US4714611A (en) Stable composition of gamma-interferon
IE58161B1 (en) Stable composition of interleukin-2
NO172441B (no) Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive insulinforbindelser
EP1589949B1 (en) Stabilized lyophilized compositions comprising tissue factor pathway inhibitor or tissue factor pathway inhibitor variants
JPS60226821A (ja) 化学修飾リンホカインおよびその製造法
Darrington et al. Evidence for a common intermediate in insulin deamidation and covalent dimer formation: effects of pH and aniline trapping in dilute acidic solutions
EP4059512A1 (en) Aqueous pharmaceutical composition containing fusion protein of serum albumin and growth hormone
JP2010031055A (ja) Ｔｆｐｉおよびｔｆｐｉアナログを精製するための改良された方法
EP0168008A2 (en) Stable composition of gamma-interferon
JPH05331071A (ja) カルシトニン遺伝子関連ペプチド類の凍結乾燥組成物および安定化法
KR102427426B1 (ko) 신규한 인슐린 유사체 및 이의 용도
EP0833659B1 (en) Therapeutic fragments of von willebrand factor
WO2021053578A1 (en) Improved purification processes for liraglutide
IE861095L (en) Preparing recombinant interferon
WO2003006053A1 (en) HUMAN INTERFERON-β FORMULATIONS
JP2021511785A (ja) 組換えポリペプチド生産用ｎ末端融合パートナーおよびこれを用いた組換えポリペプチドの生産方法
WO1986006080A1 (en) gamma-INTERFERON COMPOSITION
IL96839A (en) Method for preparing a dried composition of insulin-like growth factor I
Lin et al. Interferon-β-1b (Betaseron®): A model for hydrophobic therapeutic proteins
JPH10265404A (ja) ヒト成長ホルモンを含有する医薬製剤
JPS6144826A (ja) γ型インタ−フエロン組成物

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): MC