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WO1986003518A1 - PROCEDE DE PRODUCTION D'ACIDES GRAS, EN PARTICULIER D'ACIDE gamma-LINOLENIQUE A PARTIR DE TETRAHYMENA, PRODUITS OBTENUS ET PREPARATION MEDICAMENTEUSE OU ALIMENTAIRE CONTENANT DE L'ACIDE gamma-LINOLENIQUE OU SES DERIVES EN TANT QU'AGENT ANTI-AGREGATION PLAQUETTAIRE - Google Patents

PROCEDE DE PRODUCTION D'ACIDES GRAS, EN PARTICULIER D'ACIDE gamma-LINOLENIQUE A PARTIR DE TETRAHYMENA, PRODUITS OBTENUS ET PREPARATION MEDICAMENTEUSE OU ALIMENTAIRE CONTENANT DE L'ACIDE gamma-LINOLENIQUE OU SES DERIVES EN TANT QU'AGENT ANTI-AGREGATION PLAQUETTAIRE Download PDF

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WO1986003518A1
WO1986003518A1 PCT/BE1985/000020 BE8500020W WO8603518A1 WO 1986003518 A1 WO1986003518 A1 WO 1986003518A1 BE 8500020 W BE8500020 W BE 8500020W WO 8603518 A1 WO8603518 A1 WO 8603518A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
linolenic acid
acid
tetrahymena
fatty acids
aggregation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/BE1985/000020
Other languages
English (en)
Inventor
Raymond Devis
Rachad Saliba
Philippe Thonart
Claude Artois
Daniel Dive
Jean Guillaume
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FACULTE DES SCIENCES AGRONOMIQUES DE L'ETAT
Universite Catholique de Louvain UCL
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
FACULTE DES SCIENCES AGRONOMIQUES DE L'ETAT
Universite Catholique de Louvain UCL
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by FACULTE DES SCIENCES AGRONOMIQUES DE L'ETAT, Universite Catholique de Louvain UCL, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical FACULTE DES SCIENCES AGRONOMIQUES DE L'ETAT
Publication of WO1986003518A1 publication Critical patent/WO1986003518A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6431—Linoleic acids [18:2[n-6]]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Definitions

  • prostaglandins have predominantly dietary precursors and therefore fortuitous.
  • the aim of the present invention is to find a way to neutralize the dangerous effects of 1 'aci' arachidonic whose excess can be responsible for irreversible platelet aggregation and therefore tromboses vascular and stroke.
  • the object of the invention can be achieved by a process characterized in that it comprises at least the stages of production of the Tetrahymena ciliated protozoa in an adequate medium and the extraction of total fatty acids of said Tetrahymena. These fatty acids do not contain any toxic individuals and can be easily identified and measured.
  • Tetrahymena fatty acids are characterized by their richness in 7-linolenic or cis-6,9,12- octadecatrienoic acid which constitutes, depending on the strains and the culture conditions, 20 to 45% by weight of the total fatty acids and by the presence , among others, oleic and cilienic acids which constitute, respectively and according to the strains and the culture conditions, 1 to 15% and 1 to 10% by weight of the total fatty acids.
  • linolenic acid alone, has a relatively less anti-platelet aggregation effect
  • Tetrahymena oil is harmless: this oil can constitute a food or a food additive whose anti-aggregating action is thus opposed to that, always dangerous in the long run, of "medicated" anti-aggregating agents. , such as aspirin and corticosteroids.
  • Said medicinal or food preparations may contain either directly the product, qualified as extraction of Tetrahymena oil, or one or more of : s constituents of this oil, namely at least 7 -linolenic acid or a derivative of '' and possibly other constituents exerting an anti-platelet aggregation effect or other effects.
  • fatty acids can be used in the form of derivatives, such as fatty acid esters, in particular methyl esters.
  • compositions according to the invention generally contain at least 30% by weight of 7-linolenic acid or the equivalent of its derivatives and possibly of adjuvant substances.
  • compositions according to the invention can be administered in human medicine orally in dosage units containing more than 20% by weight of -linolenic acid or the equivalent of its derivatives, with a non-toxic support acceptable in pharmacies.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention can be administered one to several times a day, at appropriate intervals, but always according to the condition of the patient and according to the prescriptions of the doctor.
  • the appropriate daily dose of the compositions according to the invention generally ranges from 20 mg to 150 mg per kg of bodyweight.
  • the active part of the air filters is a sintered stainless steel cartridge with a thickness of 2 mm.
  • the sterile air is introduced at the base of the fermen ⁇ tors via a rotary sparger secured to the shaker shaft ( Figure 32).
  • Fermenters are equipped with automatic regulation, recording and digital display systems for pH, temperature and stirring speed (depending on the concentration of dissolved O2).
  • a computer Hewlett-Packard 9826; printer: Hewlett-Packard 2671G; Interface; Hewlett-Packard 6942A Multiprogram
  • the pH is measured by a pH meter (Tacussel) connected to a sterilizable probe (Ingold) pres ⁇ sure with compressed air. Buffers, at pH 4 and 7, are used for calibration.
  • solutions of H2SO42N connected to the fermenters via variable speed peristaltic pumps.
  • the dissolved O2 is measured by "a sterilizable galvanic probe (Biolafitte, model
  • a liquid container of anti-foam (Antifoam Emulsion, Sigma No. A.5758) is connected to fermenter 100 liters via a peristaltic pump which starts to operate as soon as the foam comes into contact with an electrode adjustable in height.
  • the anti-foaming liquid is added mechanically.
  • a device (Funda) fixed on the upper stage of the 20 liter fermenter, ensures the pumping and breaking of the foams thanks to its rotating discs. _,
  • the media are sterilized by autoclaving at 110-115 ° C for 30 minutes.
  • skim milk powder of 1% (w / v) each.
  • the starting pH is fixed at around 5.5 by H2SO4, it initially decreases slightly probably as a result of the increase in the CO2 concentration at the start of growth, then increases rapidly to reach the value 7 where it will be fixed by automatic pumping of H2S042N.
  • the yield compared to lactose considering that the milk powder contains 50% lac ⁇ tose is 40.1%.
  • the incubation of a plasma enriched in platelets, with an inhibitor of one and / or the other of the two aggregation phases, modifies the platelet response to the aggregating agent: the fact is detected at 1 aggregometer.
  • An anti-aggregant inhibiting the second phase of aggregation for example, attenuates or decreases, during an in vitro test, the response to collagen and the second curve of the response to ADP.
  • the platelet aggregation is monitored, at 25 ⁇ 2 ° C, with a Born Aggregometer MK.III device (from the Pharmacological-Research, Department of Pharmacology, Royal College of Surgeons, London - England) to which is connected a Perkin-Elmer Recor ⁇ der 56 recorder.
  • a monochromatic light ray of 640 nm passes through a silicone glass bowl (10 x 75 mm) containing 1 ml of blood plasma enriched in platelets (PRP).
  • PRP blood plasma enriched in platelets
  • a small magnetic bar covered with poly- ethylene and performing 1150 revolutions / minute, ensures the agi ⁇ tation of the plasma in the bowl.
  • PRP represents 0% optical transmission and a plasma low in platelets (PPP) represents 100% transmission.
  • the addition of an aggregating agent (ADP or collagen) to PRP is followed by a variation in optical transmission. This variation is recorded for 6 minutes, in accordance with the conventional operating mode.
  • PRP and PPP all the utensils used are made of silicone glass or plastic.
  • the blood is taken from citrate: 1 volume of 3.8% citrate (weight / volume) in distilled water for 9 volumes of blood.
  • the PRP is obtained by centrifuging the blood at 300 g for 9 minutes.
  • the platelets of the supernatant are counted using a coulter counter (model ZF, orifice of the electrode 70 microns) and if the number is greater than 300,000 platelets / mm ⁇ , it is adjusted to this value by dilution with PPP.
  • the PPP is obtained by centrifuging the blood at 2000 g for 10 minutes.
  • the PRP and PPP are kept at laboratory temperature during the analysis.
  • Collagen (Stago) is diluted with Micha ' ⁇ lis buffer to a concentration of 400 ⁇ g / ml. Incubate in a water bath at 37 ° C for 10 minutes to polymerize the collagen.
  • the ADP and collagen solutions are stored in the melting ice during the analysis.
  • this test is repeated at regular intervals (2 to 4 times) during the analysis.
  • the results of the collagen aggregation are expressed by the aggregation at 6 minutes from the single aggregation wave B obtained;
  • the results will be expressed by the maximum aggregation of the first wave A and by the 6-minute aggregation of the second wave B.
  • the two waves are not separated in time and the results have been expressed by the intensity of the aggregation at 6 minutes.
  • the aggregation in first or second phase represents the difference in optical transmission between the PRP (0%) and respectively the highest point of wave A and the point reached at the 6th minute for wave B.
  • normal responses means the results recorded in the presence of an aggregator, but in the absence of the substance to be tested.
  • the "blank” tests carried out at regular intervals during the analysis, allow us to calculate the "normal” response of each blood donor.
  • the aggregation obtained with the same aggregating agent, but in the presence of one of the products tested, is compared to that of the normal response.
  • the following example illustrates our calculation method: for the first blood donor, two "blank" tests with 40 ⁇ g of collagen / ml of PRP provided aggregations at 6 minutes, respectively 81.7%
  • This value is greater than E and is therefore significant.
  • Table 2 provides, for each blood donor, the platelet concentration in PRP and the "normal responses" (with E values) to collagen (40 ⁇ g / ml) and ADP (0.25 ⁇ g / ml).
  • methyl y-linolenate is an inhibitor of platelet aggregation and preferentially inhibits the second wave of aggregation at ADP or the unique B collagen aggregation wave.
  • inhibition of the second wave of ADP aggregation is present in four PRPs (out of the five tested) and the average is around 55%.
  • Inhibition of the first wave of aggregation is present, but weakly, in two PRPs, and is not significant in the other two. It could not be measured in the fifth (donor 2).
  • the average (in four PRPs) is very insignificant and is around 10%.
  • the ADP aggregation tests show that the second wave of aggregation is inhibited, on average (for the two PRPs tested) by about 65% and the first wave is inhibited about 29%.
  • dihomo- ⁇ -linolenic (from 7 -linolenic) is faster than its transformation into arachidonic and an equilibrium (dynamic), characterized by an increase in the ratio of dihomo-7-linolenic / arachidonic concentrations , installs in .the ⁇ - plates.
  • the concentration of 7 -linolenic acid and the time required to reach this balance vary from subject to subject. It is possible that this concentration may be less than 1 mg / ml, which would explain the similar responses observed with the concentrations of 1 and 6 mg / ml. Likewise, the equilibrium in question, which supposes a significant reduction in the amount of arachidonic acid present in the plates, does not however completely eliminate this acid. This would prevent total inhibition of the aggregation.
  • Vitamin E By mixing a rich source of 7-linolenic acid (or 7-linolenic acid itself) with vitamin E in food, the antiagregant power of this source is increased. Vitamin E also has another role in the mixture: to prevent, as an antioxidant, the degradation of unsaturated acids including, above all, 7-linolenic.
  • the inhibition reached an average of 54%, - but for two PRPs (donors 5 and 6), it was greater than 80% (see figures) at concentrations greater than 575 ⁇ g / ml, the inhibition is, on average, greater than 70%.
  • the inhibition of the first wave of aggregation is, on average, only significant from concentrations above 230 ⁇ g / ml where it reaches around 15% .
  • Inhibition of the second wave of ADP aggregation reaches approximately 30% at 57.5 ⁇ g / ml, approximately 50% at 115 ⁇ g / ml and becomes greater than 70% from 575 ⁇ g / ml .
  • the inhibition mainly affects wave B (irreversible) and that a fatty acid concentration greater than 230 ⁇ g / ml must be exceeded to detect significant inhibition of the first aggregation wave.
  • the mixture of fatty acids of T. rostrata contains (by weight) about 30% 7 -linolenic acid and about 10% oleic acid. These two acids, taken separately, have only very weak inhibitions compared to the mixture of fatty acids of Tetrahymena and the simple summation of these three inhibitions in pairs (taking into account, * for example, the respective contents and results tables 2 and 3) cannot, in any case, explain the powerful anti-aggregating power of the mixture ge. To try to explain this power, several hypo-
  • oleic acid is a cyclooxygenase inhibitor: it binds to the enzyme without being a substrate of it.
  • Dihomo-7-linolenic and arachidonic acids are, by contrast, substrates.
  • concentration of each of them as well as the respective affinities of the enzyme determine the acid which will preferably be fixed. It can be assumed that the affinity of the cyclooxygenase for the dihomo- ⁇ -linolenic is the most , important and that the competition, in the presence of the three acids, is mainly between arachidonic and oleic.
  • the antiagregant effect due to the increase in dihomo-7-linolenic acid would be augmented by another antiagregant effect: that due to the inhibition by oleic acid of the binding of arachidonic acid to cyclooxygenase.
  • the possible intervention of cilienic acid would have an identical or analogous explanation.
  • Tetra ⁇ hymena fatty acids constitutes in itself a powerful antiagre- glove. Its power far exceeds those of ' acids
  • N.S. non-significant values based on the values of E in Table 1.
  • M average of the values (non-significant values are considered to be zero). M is not significant if it is less than or equal to the average of E.

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Abstract

Procédé de production d'acides gras caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes de production des protozoaires ciliés Tetrahymena dans un milieu nutritif adéquat et d'extraction des acides gras totaux de Tetrahymena. L'invention porte aussi sur les acides gras totaux ainsi obtenus, ainsi que sur l'acide gamma-linolénique ou l'acide dihomo-gamma-linolénique et leurs dérivés ainsi que sur des préparations médicamenteuses ou alimentaires en contenant, à titre d'agent d'antiagrégation plaquettaire ou antithrombotique.

Description

PROCÉDÉ DE PRODUCTION D'ACIDES GRAS, EN PARTICULIER D'ACIDE 7-LINOLÉNIQUE Â PARTIR DE TETRAHYMENA, PRODUITS
OBTENUS ET PRÉPARATION MÉDICAMENTEUSE'. OU ALIMENTAIRE
CONTENANT DE L'ACIDE γ-LINOLÉNIQUE OU SES DÉRIVES EN TANT QU'AGENT ANTI-AGREGATION PLAQUETTAIRE.
La présente invention repose- sur une étude appro¬ fondie de la biochimie et du métabolisme des postaglan- dines chez les vertébrés superieurs-dont 1'Homme-qui a conduit à admettre la possibilité du caractère non phy- siologiques des prostaglandines. Celles-ci semblent n'avoir aucun rôle spécifique; elles agiraient principa¬ lement par un mimétisme inutile des hormones protidiques et certaines d'entre elles sont même dangereuses pour l'organisme, notamment la plupart de celles issues de l'acide arachidonique, dont surtout les endoperoxydes PGG2 et PGH2 et la thromboxane Tx 2» un de leurs métabo- lites, responsable d'une agrégation plaquettaire irré¬ versible.
Or, les prostaglandines ont des précurseurs es- sentiellement alimentaires et donc fortuits. On peut, en principe, régler leur présence qualitative et quantita¬ tive dans 1 'organisme par la seule alimentation. L'ab¬ sence d'acide arachidonique dans l'alimentation pourrait ainsi, théoriquement, empêcher la présence des prosta- glandines dangereuses, et de leurs produits d'accom¬ pagnement.
Cependant, l'on observe que l'acide linoléique ou cis-9, 12-octadécadiènoïque est lui-même transformé par l'organisme en acide arachidonique. Or, quel que soit le régime alimentaire envisagé, il est pratiquement impos¬ sible d'en éliminer toute trace d'acide linoléique, qui est d'ailleurs un acide gras "essentiel".
Le but poursuivi par la présente invention est donc de chercher un moyen de neutraliser les dangereux effets de 1 'aci'de arachidonique, dont un excès peut être responsable d'agrégations plaquettaires irréversibles et donc de tromboses vasculaires et d'infarctus. Les expériences de WILLIS et coll. - Prostaglan-
-dins, VIII, 509, 1974, avaient montré, chez le rat Wis- tar et chez le lapin New Zealand (mais non chez l'Hom¬ me), qu'un régime exempt d'acide arachidonique et riche en acide dihomo-7-linolénique ou cis-8, 11,14-eicosatriè- noïque empêche l'agrégation plaquettaire. Malheureuse¬ ment, ce dernier acide gras est extrêmement rare dans la nature et sa synthèse elle-même est difficile et très coûteuse (Samuelsson, dans Lipid Metabolism, ev. akil, S.J., Acad. Press, New York, London, p.131, 1970).
Il est apparu que le but visé par l'invention peut être atteint par un procédé caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes de production des protozo¬ aires ciliés Tetrahymena dans un milieu adéquat et l'ex- traction des acides gras totaux desdits Tetrahymena. Ces acides gras ne contiennent aucun individu toxique et peuvent être facilement identifiés et dosés.
Les acides gras de Tetrahymena sont caractérisés par leur richesse en acide 7-linolénique ou cis-6,9,12- octadécatriénoïque qui constitue, selon les souches et les conditions de culture 20 à 45% en poids des acides gras totaux et par la présence, entre autres, des acides olêique et ciliénique qui constituent, respectivement et selon les souches et les conditions de culture, 1 à 15% et 1 à 10% en poids des acides gras totaux.
L'hydrolyse acide des cellules de Tetrahymena, suivie d'une saponification, d'un élimination des 1'in- saponifiable et d'un acidification, permet d'obtenir une huile légèrement jaunâtre qualifiée de "huile de Tetra- hymena" dont les propriétés d'anti-agrégation plaquet¬ taire ont été testées et quantifiées sur une série de plasmas humains de sujets jeunes (de 25 à 35 ans) du sexe masculin.
Les résultats ont montré que cette "huile de Tetrahymena" est effectivement un agent d'anti-agréga¬ tion plaquettaire très actif.
De même, 1'acide -linolénique, seul, présente un effet d'anti-agrégation plaquettaire relativement moins
'puissant que celui du "l'huile de Tetrahymena" dont il constitue l'élément principal sur le plan quantatif.
Le mécanisme de cet effet anti-agrégant de l'aci- de 7-ϋnolénique, n'a pas encore été élucidé. A titre d'hypothèse, l'acideΥ -linolénique agit en se transfor¬ mant instantanément en acide dihomo- -linolénique, dont l'effet antiagrêgant est connu. Ou bien il intervient lui-même directement dans les synthèses de protaglondi-
D'autre part, un certain effet de synergie est probablement obtenu par l'utilisation de l'acide
7 -linolénique avec d'autres acides gras contenus dans l'huile de Tetrahymena, vraisemblablement, l'acide olêique et/ou ciliénique.
Ceci expliquerait l'effet anti-agrégant plus puissant de l'huile de Tetrahymena.
Il reste à souligner que l'huile de Tetrahymena est inoffensive: cette huile peut constituer un aliment ou un additif alimentaire dont l'action anti-agrêgante s'oppose ainsi à celle, toujours dangereuse à la longue, des anti-agrégants "médicamenteux", comme l'aspirine et les corticoïdes.
Parmi les souches de Tetrahymena, dont on dispo- sait celle de T.rostrata a été préférée du fait qu'elle présente, dans le milieu lait écrémé-levure ou extrait de levure utilisé, la croissance la plus rapide.
Selon l'invention, la production de Tetrahymena s'effectue en fermenteur. Le milieu de culture préféré est constitué de lait écrémé et de levure ou d'extrait de levure.
Les conditions opératoires préférées pour une transposition à l'échelle industrielle sont : - pH = 5.5 à 7.0 - Température : fixée ou variable entre 25 et 30°C, avec chute éventuelle à des températures plus basses au début de la phase stationnaire de croissance. - Concentration initiale en poudre de lait écrémé : 1 à
3% (poids/volume)
- Concentration initiale en levure : 1 à 2,5% (poids/volume) - Concentration initiale en extrait de levure : 0,5 à 1%
- Débit d'air stérile : 1 volu e/mihute/volume de milieu
- Vitesses périphériques des turbines variables selon la concentration en O2 dissous. Cette vitesse est augmentée si la concentration en O2 dissous devient inférieure à 40% de sa valeur à la saturation ( fixée en absence de Tetrahymena) .
L'invention concerne donc également les produits résultant du procédé précité et des préparations médica¬ menteuses ou alimentaires, notamment à usage diététique, contenant au moins de l'acide 7 -linolénique sous forme d'acide libre ou sous forme d'un dérivé notamment sous forme d'un ester, de préférence sous forme d'un ester mêthylique.
Lesdites préparations médicamenteuses ou alimen- taires peuvent contenir soit directement le produit, d'extraction qualifié d'huile de Tetrahymena, soit un ou plusieurs de:s constituants de cette huile, à savoir au moins l'acide 7 -linolénique ou un dérivé de'celui-ci et éventuellement d'autres constituants exerçant un effet antiagrégation plaquettaire ou d'autres effets.
On entend par dérivé de l'acide 7-linolénique également l'acide dihomo-7-linolénique et ses esters.
L'intégralité des différents acides gras peuvent être utilisés sous forme de dérivés, tels que des esters d'acides gras, en particulier les esters méthyliques.
La préparation des dérivés d'acides gras s'effec¬ tue par les procédés classiques de synthèse organique et, dans le cas particulier de la formation d'un ester par les techniques classiques d' esterification. Les préparations médicamenteuses ou alimentaires peuvent bien entendu contenir d'autres constituants, no¬ tamment des adjuvants utiles pour l'activité souhaitée tels que la vitamine E (acétate d' -—tocophérol) .
• Lorsque les préparations médicamenteuses selon l'invention sont présentées sous forme de compositions pharmaceutiques elles peuvent aussi contenir d'autres substances actives utilisables dans les compositions pharmaceutiques pour la prévention OU le traitement des affections résultant des phénomènes d'agrégation pla¬ quettaire .
Habituellement, elles contiennent également des additifs de formulation permettant de les administrer commodément. Ces additifs peuvent être des supports ou des agents auxiliaires pharmaceutiques solides ou li¬ quides, organiques ou inorganiques, appropriés tels que l'eau, les solvants organiques de type paraffinique, la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magné¬ sium, le talc, des graisses et huiles végétales et ani¬ males adéquates, la gomme, les polyalkylèneglycols ou des liants et autres agents habituels.
Les compositions pharmaceutiques selon 1 'inven- tion contiennent en général au moins 30% en poids d'aci¬ de 7 -linolénique ou l'équivalent de ses dérivés et éven¬ tuellement dés substances adjuvantes.
Parmi les modes d'administration pouvant conve¬ nir, l'administration par voie orale, est préférée. Du fait que les acides gras utilisés, constituent des aliments, il n'existe pas, en dehors de considéra¬ tions diététiques, de doses maximales. Dans les propor¬ tions habituelles d'un régime alimentaire, on n'observe pas de toxicité. Dans une thérapie faisant appel à un traitement continu, les gélules ou capsules peuvents être la forme appropriée de préparation pharmaceutique en raison des effets de longue durée ou d'effet retard obtenus lorsque le médicament est administré par voie orale. Les dites compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées en médecine humai¬ ne par voie orale en unités de dosage contenant plus de 20% en poids d'acide -linolénique ou l'équivalent de ses dérivés, avec un support non toxique acceptable en pharmacie.
Par "unité de dosage", on entend une dose unitai- re qui peut être administrée à un patient e peut faci¬ lement être manipulée et conditionnée, en restant sous forme d'une dose unitaire physiquement stable, compre¬ nant l'ingrédient actif soit seule, soit en mélange avec des diluants ou supports pharmaceutiques solides ou li- quides.
Sous la forme d'unités de dosage, les composi¬ tions pharmaceutiques selon 1 ' invention peuvent être ad¬ ministrées une à plusieurs fois par jour, à intervalles appropriés, mais toujours selon l'état du patient et en fonction des prescriptions du médecin. La dose journa¬ lière appropriée des compositions selon l'invention va¬ rie en général de 20 mg à 150 mg par kg de poids corpo¬ rel .
A titre d'illustration sans caractère limitatif, l'invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent.
Exemple 1 : Production d'acides gras au départ de Tetrahymena.
- Souche : La souche de Tetrahymena rostrata a été four- nie par Mme Fryd-Versavel (Université de Paris XI,
Orsay, France) .
- Milieu de culture : Composé (poids/volume) de 0,5%* d'extrait de levure (Difco) et de 1% de lait écrémé en poudre (Régilait) dans de l'eau. L'addition d'un sup- plément de lait (fed batch) est effectuée s'il y a lieu, à partir d'une boîte stérile de lait écrémé en poudre.
A. Description et principes de fonctionnement des fermenteurs :
On dispose de fermenteurs (Biolafitte de 20 et de 100 litres en acier inoxydable dont les caractéristiques dimensionnelles sont les suivants :
- fermenteur de 20 litres : fond plat ; cuve 22 cm de diamètre et de 55 cm de hauteur ; quatre chicanes
• (contrepales) perpendiculaires de 49 cm de hauteur et de 3,2 cm de largeur ; deux turbines à disque à 4 pales ra¬ diales : élévation du centre du disque de la première turbine par rapport au fond de la cuve 4,5 cm, hauteur séparant les deux turbines 11 cm, • largeur des pales 2 cm, longueur des pales 2 cm, diamètre des disques 5,9 cm, diamètre des turbines 8 cm ;
- fermenteur de 100 litres : fond plat ; cuve de 43 cm de diamètre et de 78 cm de hauteur ; deux chicanes perpendiculaires de 58,5 cm de longueur et de 5,8 cm de largeur ; deux turbines à disque à 4 pales radiales : élévation du centre du disque de la première turbine par rapport au fond de la cuve 4,2 cm, hauteur séparant les deux turbines 17 cm, largeur des pales 2,5 cm, longueur des pales 3,5 cm, diamètre des disques 8,9 cm, diamètre des turbines 12,9 cm ;
La partie active des filtres d'air est une car¬ touche en acier inoxydable fritte d'une épaisseur de 2 mm. L'air stérile est introduit à la base des fermen¬ teurs par l'intermédiaire d'un sparger rotatif solidaire de l'arbre d:'agitation (figure 32). Les fermenteurs sont munis de systèmes automatiques de régulation, d'enregis¬ trement et d'affichage digital du pH, de la température et de la vitesse d'agitation (en fonction de la concen¬ tration en O2 dissous) . Un ordinateur (Hewlett-Packard 9826 ; imprimante : Hewlett-Packard 2671G ; Interface ; Hewlett-Packard 6942A Multiprogramme) permet aussi la régulation, l'enregistrement et l'affichage de ces dif- férents paramètres.
- La mesure du pH se fait par un pH-mètre (Tacussel) relié à une sonde stérilisable (Ingold) pres¬ surisée à l'air comprimé. Des tampons, à pH 4 et 7, ser¬ vent à l'étonnage. Pour le réglage du pH, à la valeur désirée, des solutions de H2SO42N reliée aux fermenteurs par l'intermédiaire de pompes péristaltiques à vitesse variable . - 1 'O2 dissous est mesuré par l'intermédiaire "d'une sonde galvanique stérilisable (Biolafitte, modèle
G2L) . LO2 dissous est exprimé en pour cent : le 100% correspond à un milieu saturé en O2 en l'absence du Tetrahymena.
- La mesure de la température se fait par une sonde en platine (Biolafitte) . La régulation de la tem¬ pérature est assurée par une circulation d'eau ther o- statée dans un échangeur formé par un tube aplati en acier inoxydable immergé dans le milieu de culture.
Un récipient de liquide anti-,mousse (Antifoam Emulsion, Sigma n° A.5758) est relié au fermenteur de 100 litres par l'intermédiaire d'une pompe pêristaltique qui se met en fonctionnement dès que la mousse entre en contact avec un électrode réglable en hauteur. Pour le fermenteur de - 20 litres, le liquide anti-mousse est ajouté mécaniquement. D'autre part, un appareil (Funda) , fixé sur la platine supérieure du fermenteur de 20 litres, assure le pompage et la cassure des mousses grâce à ses disques tournants. _,
B. Stérilisation : La stérilisation des .fermen¬ teurs contenant les milieux de culture est effectuée à 110-115°C pendant 30 minutes sous agitation. La stérili¬ sation se fait à la vapeur, d'une façon indirecte jus- qu'à 100°C, puis au-delà, avec une légère admission de vapeur par le diffuseur d'air pour compenser 1' évapora- tion et stériliser le dispositif d'étanchéité de l'arbre d'agitation et le circuit d'arrivée d'air stérile. Tou¬ tes les canalisations de raccordement sont stérilisées en laissant fuser la vapeur par les purgeurs. La vapeur est introduite directement à contre-courant dans les filtres à air;
Pour les cultures en Erlenmeyer, les milieux sont stérilisés par autoclavage à 110-115°C pendant 30 minu- tes.
La solution aqueuse d'H2S042n (voir plus loin) contenue dans un Erlenmeyer est stérilisé par autoclava- ge à 120-125°C pendant 20 minutes.
C. Cultures en Erlenmeyer : ces cultures sont ef¬ fectuées à 28 ± 1°C dans le milieu base ; le volume oc¬ cupé par le milieu étant inférieur à 15% du volume total de l 'étalonnage.
E. Extraction des acides gras et analyse par GLC: Un . culot sec de Tetrahymena est soumis à une hydrolyse acide puis à une saponification en milieu hydroalcooli-• que. On extrait les insaponifiables, on acidifie et on extrait les acides gras libres.
Un échantillon de ceux-ci est méthyle avec une solution de BF3 à 20% (poids/volume) dans le mêthanol.
Les esters mêthyliques sont analysés par chroma- tographie en phase gazeuse avec, comme standard interne le nonadecanoate de méthyle et des mélanges étalons et avec une colonne de polyéthylène glycol succinate..
C. - cultures en fermenteurs : des cultures en Erlenmeyer en phase logarithmique de croissance dans le milieu de base sont utilisées pour l'inoculation. Leur volume est de 5% à 10% du volume total du milieu dans le fermenteur et la population initiale est de 5-10 x 10-3 cellules/ml .* Pour toutes les cultures en fermenteur, on a. gardé un débit d'air stérile constant et égal à 1 volume/minute/volume de milieu de culture et une tempé- rature de 28 ± 0,2°C.
On a effectué les cultures dans les conditions d'agitation suivantes : la vitesse périphérique des tur¬ bines possède, pour chaque fermenteur, une valeur mini¬ mum qui s'élève à 0.94 mètre/seconde pour le fermenteur de 20 litres et à 1.69 mètres/secone pour le fermenteur de 100 litres. Lors des cultures, la vitesse est réglée de telle sorte qu'elle garde se valeur minimum jusqu'à ce que la concentration en O2 dissous devient inférieure à 40%. Dans ce cas, elle augmente proportionnellement à l'écart.
D. Temps de génération et poids sec :
- La densité cellulaire est suivie par numération électronique à l'aide d'un coulter counter modèle Z2
•(orifice de l'électrode 200 m) après fixation à l'aldé¬ hyde glutarique et le temps de génération est déterminé par régression linéaire. - Le poids sec en Tetrahymena est mesuré après centrifugation à 800 g et à 2°C pendant 10 minutes d'un volume déterminé du milieu de culture suivie d'une lyo¬ philisation du culot humide. Ces mesures du poids sec sont effectuées au début de la phase stationnaire de croissance.
Exemple de culture effectuée et résultats obte¬ nus. Fermenteur de 20 litres
- volume utilisé : 15 litres - pH initial = 5".5 on le laisse évoluer librement lors de la culture sans qu'il dépasse la valeur 7.0 ± 0.1.
- deux ajouts de poudre de lait écrémé de 1% (p/v) chacun. Le pH de départ est fixé à environ 5,5 par du H2SO4, il diminue d'abord légèrement probablement par suite de 1'augmentation de la concentration en CO2 au début de la croissance puis augmente rapidement pour atteindre la valeur 7 où il sera fixé par le pompage automatique d'H2S042N.
Le temps moyenne de génération en minutes pour onze essais (n=ll;σ=7) est 118.
L'ordre de grandeur de la densité cellulaire en phase stationnaire (cellules par/ml) est de 6,9 (n=ll; σ=0, 24) . Le rendement par rapport au lactose en considérant que le poudre de lait contient 50% de lac¬ tose est de 40,1%.
L'analyse des acides gras figure au Tableau 1. Exemple 2 : Action des acides gras de Tetrahymena sur l'agrégation' plaquettaire in vitro. Le principe de la méthode de mesure L'exploration de l'agrégation plaquettaire a été effec- tuée par une méthode photométrique.' Elle consiste à
-ajouter., à du plasma enrichi en plaquettes,un inducteur d'agrégation dont les plus communs sont l'ADP, l'adréna¬ line (ou épinêphrine) et le collagène. Lorsqu'un agent agregant est ajouté au plasme, la transmission optique augmente avec la formation des agrégats plaquettaires et diminue lorsque survient la désagrégation. Cette métho¬ de photomêtrique permet une observation qualitative et quantitative du phénomène d'agrégation et permet de dé- celer certaines anomalies plasmatiques ou plaquettaires qui se traduisent par une absence d'agrégation (throm- bopathies) ou par une hyperagrégation (thrombophilies) .
Les deux vagues d'agrégation (la réversible) et l'irréversible) peuvent être suivies avec un appareil photométrique, 1'agrégomètre. Selon l'agent agregant ajouté au plasma riche en plaquettes, l'une des deux phases peut- manquer. Avec une préparation de collagène, par exemple, la première phase ou phase réversible est absente et la réponse est caractérisée par un temps de latence suivi directement de la phase d'agrégation irré¬ versible. Avec l'ADP, les deux phases sont généralement présentes et- la réponse à 1 'agrégomètre est donc bipha- sique. Mais, selon la concentration en ADP ou selon le donneur de sang, la première phase d'agrégation peut ne pas être suivie de la deuxième. Enfin, les deux phases peuvent ne pas être séparées dans le temps et ne sont alors pas distinguées à 1 'agrégomètre . L'incubation d'un plasma enrichi en plaquettes, avec un inhibiteur de l'une et/ou de l'autre des deux phases d'agrégation, mo- difie la réponse plaquettaire à l'agent agregant : le fait est décelé à 1 'agrégomètre . Un anti-agrégant inhi- bitant la deuxième phase d'agrégation, par exemple, at¬ ténue ou diminue, lors d'un test in vitro, la réponse au collagène et la deuxième courbe de la réponse à l'ADP. Matériel et méthodes
Agrégomètre : l'agrégation plaquettaire est sui¬ vie, à 25 ± 2°C, avec un appareil Born Aggregometer MK.III (du Pharmacological -Research, Department of Phar- macology, Royal Collège of Surgeons, London - England) auquel est raccordé un enregistreur Perkin-Elmer Recor¬ der 56. Un rayon lumineux monochromatique de 640 nm traverse une cuvette en verre siliconé (10 x 75 mm) con¬ tenant 1 ml de plasme sanguin enrichi en plaquettes (PRP) . Un petit barreau magnétique, recouvert de poly- - éthylène et effectuant 1150 tours/minute, assure l'agi¬ tation du plasma dans la cuvette. Le PRP représente le 0% de transmission optique et un plasma pauvre en pla¬ quettes (PPP) représente le 100% de transmission. L'ad- dition d'un agent agregant (ADP ou collagène) au PRP est suivie d'une variation de la transmission optique. Cet¬ te variation est enregistrée pendant 6 minutes, confor¬ mément au mode opératoire classique.
Donneurs de sang : Sept donneurs de sang du sexe masculin, âgés de moins de 35 ans, à jeun depuis au moins 9 heures et sans aucun traitement médical.
PRP et PPP : tous les ustensiles utilisés sont en verre siliconé ou en plastique. Le sang est prélevé sur citrate : 1 volume de citrate à 3,8% (poids/volume) dans de l'eau distillée pour 9 volumes de sang.
Le PRP est obtenu par centrifugation du sang à 300 g pendant 9 minutes. Les plaquettes du surnageant sont comptées à l'aide d'un coulter counter (modèle ZF, ori- . fice de l'électrode 70 microns) et si le nombre est su- périeur à 300.000 plaquettes/mm^, il est ajusté à cette valeur par dilution avec du PPP.
Le PPP est obtenu par centrifugation du sang à 2000 g pendant 10 minutes. Les PRP et PPP sont conservés à la température du labo- ratoire durant l'analyse.
Agents agrégants : De l'ADP (Boehringer) est di¬ lué avec un tampon Micha'élis (Stago, pH = 7,3) jusqu'à une concentration de 5 A'g/ml.
Du ' collagène (Stago) est dilué avec le tampon Micha'ëlis jusqu'à une concentration de 400 μ g/ml . On incube au bain-marie à 37°C pendant 10 minutes pour polymériser le collagène.
Les solutions d'ADP et de collagène sont conser¬ vées dans la glace fondante pendant l'analyse.
Produits testés : les produits sont dissous dans le benzène (Merck, pour analyse) et conservés sous azote jusqu'à utilisation;
- 7-linolénate de méthyle ou 18:-3 Δ6/9f12 (sigma, n° = 5377)
- mélanges de 7-linolénate de méthyle et d'acéta¬ te de méthyle et d'acétate d'α-tocophérol (Rocfte-vitami- ne E) .
- mélange d'acides gras de Tetrahymena rostrata dont la composition est donnée à l'exemple 1, tableau 1 (pH<7.0 ± 0.1) .
- Les tests d'agrégation plaquettaire sont effec- tués dans les quatre heures qui suivent le prélèvement du sang.
Pour un test à blanc, om procède comme suit :
- 1 ml de PPP •= 100% de transmission optique
- 1 ml de PRP = 0% de transmission optique - addition au PRP de 50 μl de la solution d'ADP (—>0,25 g d'ADP/ml de PRP) ou de 100 μl de la solution de col¬ lagène (→ 40 g de collagène/ml de PRP) et on enregistre la réponse pendant 6 minutes.
Pour chaque agent agregant, ce test est répété à intervalles réguliers (2 à 4 fois) durant l'analyse.
Les tests de l'action d'un produit sur l'agréga¬ tion.
Le même procédé est utilisé, mais, dans ce cas, le ml de PRP est préalablement incubé, pendant 30 minutes et sous agitation, avec la quantité désirée du produit à tester. Le benzène dans lequel était dissous le produit, est soigneusement éliminé de la cuvette et avant incubation, par un flux d'azote. Pour chaque donneur de sang, un
-test est effectué, au préalable, avec le résidu de
1 'évaporation à sec de 1 ml de benzène : les réponses obtenues sont analogues à celles obtenues avec les tests à blanc.
Expressions des résultats : •
- Les résultats de l'agrégation au collagène sont exprimés par l'agrégation à 6 minutes de la vague d'agrégation unique B obtenue; Les tests à blanc, avec 0,25 μg d'ADP/ml, ont présenté, pour tous les donneurs, à l'exception du don¬ neur '2, les deux vagues d'agrégation : la réversible A et l'irréversible B. Les résultats seront exprimés par 1'agrégation maximum de la première vague A et par l'agrégation à 6 minutes de la deuxième vague B. Pour le donneur 2, les deux vagues ne sont pas séparées dans le temps et les résultats ont été exprimés par l'intensité de l'agrégation à 6 minutes.
Dans tous les cas, l'agrégation en première ou en deuxième phase, exprimée en %, représente la différence de transmission optique entre le PRP (0%) et respective¬ ment le point le plus élevé de la vague A et le point atteint à la 6ème minute pour la vague B.
- Réponses normales et % d' inhibition de 1 'agré- gation
On entend par "réponses normales", les résultats enregistrés en présence d'un agregant, mais en l'absence de la substance à tester. Pour chaque agent agregant, les tests "à blanc", effectués à intervalles réguliers durant l'analyse, nous permettent de calculer la réponse "normale" de chaque donneur de sang.
L'agrégation obtenue avec le même agent agregant, mais en présence de l'un des produits testés, est com¬ parée à celle de la réponse normale. L'exemple suivant illustre notre méthode de cal¬ cul : pour le premier donneur du sang, deux tests "à blanc" avec 40 μg de collagène/ml de PRP ont fourni des agrégations à 6 minutes, respectivement de 81,7%
' (fig.44) et de 71,7% (fig.47). La "réponse normale" au collagène est caractérisée par une agrégation de 76,7% (moyenne x des deux résultats) avec un écart-type de a x 100
7,1% ce qui correspond, d'après l'équitation E= ,à x 7,1 x 100 E= = 9,2% ' 76.7
Pour le même donneur de sang et avec 1 mg d'acide oléique/ml de PRP, on obtient, et pour la même concen¬ tration en agent agregant, une agrégation de 33,7%. Le % d'inhibition de l'agrégation au collagène est donc de :
(76,7 - 33,7) x 100 = 56,1%
76,7
Cette valeur est supérieure à E et est donc significative.
Résultats et discussions
Le tableau 2 fournit, pour chaque donneur de sang, la concentration des plaquettes dans le PRP et les "réponses normales" (avec les valeurs de E) au collagène (40 μg/ml) et à l'ADP (0, 25 μ g/ml) .
Chacun des tableaux suivants donne, par produit testé, et sur la base des figures précédentes, les % d'inhibition des agrégations induites respectivement par le collagène et par l'ADP.
Notons que ceux-ci varient souvent considérable¬ ment, pour le même produit et pour la même concentra¬ tion, d'un PRP à un autre. 1) 7 -linolénate de méthyle (tableau 3)
Il a été constaté que le y -linolénate de méthyle est un inhibiteur de l'agrégation plaquettaire et inhibe préférentiellement la deuxième vague d'agrégation à l'ADP ou la vague d'agrégation unique B au collagène.
- Avec une concentration de 1 g/ml, l'inhibition de l'agrégation au collagène est variable d'un sujet à un autre. Mais, à cette concentration l'inhibition est significative (et assez importante) chez quatre PRP (des cinq testés). L'inhibition moyenne (sur les cinq) est d'environ 42%.
Pour la même concentration, l'inhibition de la deuxième vague d'agrégation à l'ADP est présente chez quatre PRP (sur les cinq testés) et la moyenne se situe à environ 55%. L'inhibition de la première vague d'agrégation est présente, mais faiblement, chez deux PRP, et est non significative chez les deux autres. Elle n'a pas pu être mesurée chez le cinquième (donneur 2). La moyenne (chez quatre PRP) est très peu signifi¬ cative et se situe à environ 10%.
- Pour une concentration de 6 mg/ml, l'inhibition de l'agrégation au collagène se situe, en moyenne, à en¬ viron 52% et seule l'agrégation d'un PRP sur quatre n'a pas été inhibée d'une manière significative.
A cette même concentration, les tests d'agréga¬ tion à 1 'ADP .montrent que la deuxième vague d'agrégation est inhibée, en moyenne (pour les deux PRP testés) d'en¬ viron 65% et la première vague est inhibée d'environ 29%.
On constate que 1 ' inhibition de la vague B ne va¬ rie pas d'une manière significative en augmentant la concentration de 1 à 6 mg/ml et que , même à ces concen¬ trations élevées, l'inhibition n'est pas totale. Pour expliquer ces effets, l'hypothèse suivante peut être avancée : le 7-linolénate n'est, en lui-même, ni un substrat de la cyclooxygénase, ni un inhibiteur de celle-ci ; son action antiagrégante serait due à l'aug¬ mentation, dans les plaquettes sanguines, de la propor- tion d'acide ddhomo-7 -linolénique (antiagregant) par rapport à 1'arachidonique (agregant), deux acides dont il est le précurseur biologique. Sur la base de cette hypothèse, on peut supposer que la biosynthèse du
•dihomo-γ -linolénique (à partir du 7 -linolénique) est plus rapide que sa transformation en arachidonique et qu'un équilibre (dynamique), caractérisé par une augmen- tation du rapport des concentrations dihomo-7-linoléni¬ que / arachidonique, s'installe dans .les plaquet^- tes.
La concentration en acide 7 -linolénique et le temps nécessaires pour atteindre cet équilibre varient d'un sujet à l'autre. Il est possible que cette concen¬ tration puisse être inférieure à 1 mg/ml, ce qui expli¬ querait les réponses analogues observées avec les con¬ centrations de 1 et de 6 mg/ml. De même, l'équilibre en question, qui suppose une réduction importante de la quantité d'acide arachidonique présente dans les pla¬ quettes, n'élimine toutefois pas complètement cet aci¬ de. Ceci empêcherait une inhibition totale de l'agréga¬ tion.
Selon les résultats obtenus et le mode d'action proposé, on peut conclure que l'introduction, dans la. nourriture, d'une source riche en acide γ-linolénique, ou l'acide lui même, doit prévenir les maladies thrombo- tiques en augmentant la proportion du dihomo—y-linoléni¬ que par rapport à 1 ' arachidonique et en réduisant ainsi la phase d'agrégation ireversible des plaquettes face aux différents agents agrêgants.
2) Mélanges de 7 -linolénate et d'acétate d' -tocophérol (tableau 4)
En mélangeant, dans la nourriture, une source riche en acide 7-linolénique (ou l'acide 7-linolénique lui-même) avec de la vitamine E, le pouvoir antiagregant de cette source est augmenté. La vitamine E a aussi, dans le mélange, un autre rôle : empêcher comme antioxy¬ dant, la dégradation des acides insaturés dont, surtout, le 7-linolénique .
3) Acides gras totaux de Tetrahymena (tableau 5) Ce mélange d'acides gras est, parmi toutes les substances testées, l1"antiagregant le plus puissant.
- Pour le test au collagène,- l'inhibition de l'agrégation demeure significative à une concentration de 57 μg/ml où elle atteint une moyenne d'environ 23%. À cette concentration seuls deux PRP (sur les cinq tes¬ tés) n'ont pas présenté une influence significative, tandis que l'inhibition de l'agrégation d'un PRP (don¬ neur 6, figure 59) atteignait environ 67%. En doublant cette concentration, on a, a peu près, doublé l'inhibi- tion : celle-ci. atteignait en moyenne et pour les cinq PRP testés, environ 41%. À une concentration de 230 μg/ml, l'inhibition a atteint une moyenne de 54%,- mais pour deux PRP (donneurs 5 et 6), elle était supérieure à 80% (voir les figures) à des concentrations supérieures à 575 μg/ml, l'inhibition est, en moyenne, supérieure à 70%.
- Pour le test à l'ADP, l'inhibition de la pre¬ mière vague de l'agrégation n'est, en moyenne, signifi¬ cative qu'à partir des concentrations supérieures à 230 μg/ml où elle atteint environ 15%. L'inhibition de la deuxième vague d'agrégation à l'ADP atteint environ 30% à 57,5 μ g/ml, environ 50% à 115 μg/ml et devient supé¬ rieure à 70% à partir de 575 μg/ml.
On constate que 1 ' inhibition affecte principale- ment la vague B (irréversible) et qu'il faut dépasser une concentration en acides gras supérieure à 230 μg/ml pour déceler une inhibitation significative de la pre¬ mière vague d'agrégation.
Le mélange d'acides gras de T. rostrata contient (en poids) environ 30% d'acide 7 -linolénique et environ 10% d'acide oléique . Ces deux acides, pris séparément, ne présentent que des inhibitions très faibles compara¬ tivement au mélange d'acides gras de Tetrahymena et la simple sommation de ces trois inhibitions par paires (en tenant compte, *par exemple, des teneurs respectives et des résultats des tableaux 2 et 3) ne peut, en tout cas, pas expliquer le puissant pouvoir antiagregant du mélan- ge. Pour tenter d'expliquer ce pouvoir, plusieurs hypo-
'• thèses peuvent être avancées :
1. Une "synergie" existe entre l'action du
7-linolénique et celle de l'oléique et/ou du ciliénique. 2. La présence de l'acide ciliénique (± 7% du poids des acides gras totaux) dont l'action n'est pas connue .
3. Action d'autres acides (ou de mélanges d'aci¬ des) présents dans ce mélange (voir tableau 1; pH <^ 7,0 ± 0,1) .
De ces hypothèses, la première paraît la plus plausible .
On sait que l'acide oléique est un inhibiteur de la cyclooxygénase : il se fixe sur l'enzyme sans pour autant être un substrat de celui-ci. Les acides dihomo-7-linolênique et arachidonique en sont, par con¬ tre, des substrats. En présence des trois acides, il y a compétition. La concentration de chacun d'eux ainsi que les affinités respectives de l'enzyme" déterminent l'aci- de qui sera preferentiellement fixé. On peut supposer que l'affinité de la cyclooxygénase pour le dihomo-γ-li- nolénique est la plus, importante et que la compétition, en présence des trois acides, se fait principalement entre 1 'arachidonique et l'oléique. Dans ce cas, l'effet antiagregant dû à l'augmentation de l'acide dihomo-7-li- nolénique serait augmenté d'un autre effet antiagregant: celui dû à l'inhibition par l'acide oléique de la fixation de l'acide arachidonique sur la cyclooxygénase. L'intervention éventuelle de l'acide ciliénique aurait une explication identique ou analogue.
L'inhibition de la première vague d'agrégation à l'ADP, observée pour des concentrations de mélange supé¬ rieures à 230 μg/ml, est probablement due, comme on l'a souligné pour le cas du 7 -linoléique, à une formation de PGE]_ avant l'addition de l'agent agregant.
Ainsi donc, le mélange des acides gras de Tetra¬ hymena constitue en lui-même un puissant agent antiagrê- gant. Son pouvoir dépasse, de loin, ceux des' acides
'-γ-linolénique et oléique pris séparément. Aucune huile ou mélange d'acides . gras connu ne présente, à la con¬ naissance des Demanderesses, un effet aussi puissant sur l'agrégation plaquettaire in vitro.
Tableau 1 : Composition en acides gras des Tetrahymena par GLC (% en poids par rapport aux acides gras totaux) . Moyennes des résultats obtenus avec trois cultures (n = 3).
Figure imgf000023_0001
Suite du Tableau 1
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
(a) Les PRP qui présentent des concentration supérieures à 300.000 plaquettes/mm3 seront aju cette valeur, pour les différents tests, par dilution avec du PRP
∞ (b) Ce tableau donne, pour chaque facteur, la moyenne des valeurs obtenues dans les tests à
«n t . écart-type x 100
© vo et E =
00 o valeur moyenne
(c) Pour le donneur 2, les deux vagues d'agrégation à l'ADP ne sont pas séparées dans le tem
Tableau 3 : Inhibition de 1'agrégation plaquettaire par le 7-linolénate de méthyle (a) (b) (c)
collagène ADP
40 Mg/ml 0,25 μg/ml
μg/ml % d'inhibition % d'inhibition % d'inhibition de de l'agrégation de la vague B maximum de la la vague B
(donneur) première vague (donneur) (donneur)
6000 86,0 (4) 46,7 (4) 89,4 (4)
36,4 (5) 11,6 (5) 40,6 (5)
86,0 (6) - -
9,1 (7) (x) - -
M = 52,1 M = 29,1 M = 65,0
1000 42,3 (1) — —
- -(2) 42,5 (2)
76,7 (4) 24,7 (4) 88,2 (4)
24,5 (5) 8,4 (5) (x) 10,9 (5)(x)
68,2 (6) 7,3 (6) (x) 75,2 (6)
10,0 (7) (x) 15,4 (7) 67,1
M = 42,3 M = 10,0 M = 54,6
(x) % d'inhibition non significatifs
(a) N.S. = valeurs non significatives sur la base des va¬ leurs de E du tableau 1.
(b) M = moyenne des valeurs (les valeurs non significati¬ ves sont considérées comme nulles). M est non significative si elle est inférieure ou égale à la moyenne des E.
(c) Pour le donneur 2, les deux vagues d'agrégation à l'ADP ne sont pas séparées dans le temps et on mesure seulement l'inhibition de l'agrégation à 6 minutes. Tableau 4 Inhibition de l'agrégation plaquettaire par les mélanges de 7-linolénate de méthyle et d'acétate d'α-tocophérol (a) (b) (c).
Figure imgf000027_0001
(x) % d'inhibition non significatifs (a) (b) (c) : voir notes tableau 3. Tableau 5 : Inhibition de 1'agrégation plaquettaire par les acides gras de T.rostrata ( à) (b) (c).
collagène ADP
40 μ g/ml 0,25 μg/ml
μg/ml % d'inhibition % d' inhibition % d'inhibition de la vague B de l'agrégation de la vague B
(donneur) maximum de la (donneur) première vague (donneur)
2300 92,5 (1) — —
- - 93,3 (2)
86,7 (4) 100 (4) 79,5 (4)
M = 89,6 M = 86,4
1150 81,1 (3) 85,7 (3) 100 (3)
86,3 (4) 40,4 (4) 76,0 (4)
88,6 (5) 75,8 (5) 85,4 (5)
89,8 (6) 80,9 (6) 83,8 (6)
59,7 (7) 43,3 (7) 87,3 (7)
M = 81,1 M = 65,1 M = 86,9
575 69,7 (3) 45,3 (3) 84,3 (3)
84,9 (4) 43,3 (4) 78,7 (4)
91,0 .(5) 22,8 (5) 47,9 (5)
89,8 (6) 30,5 (6) 92,1 (6)
28,6 (7) 41,5 (7) 67,5 (7)
M = 72,8 M = 36,7 M = 74,1
230 28,6 (3) 11,4 (3) 44,5 (3)
55,9 (4) 13,3 (4) 81,7 (4)
88,0 (5) 6,9 (5)(x) 10,1 (5)
84,5 (6) 16,6 (6) 86,3 (6)
13,4 (7) 35,4 (7) 55,5 (7)
M = 54,1 M = 15,3 M = 53,6 Suite du Tableau 5 :
Figure imgf000029_0001
(x) % d'inhibition non significatifs (a) (b) (c) : voir notes tableau 3.

Claims

REVENDICATIONS .
•1. Procédé de production d'acides gras caractéri¬ sé en ce qu'il comporte au moins les étapes de
- culture en masse des protozoaires ciliés Tetra- hymena dans un milieu nutritif adéquat et
- 1 ' extraction des acides gras totaux de Tetrahy¬ mena.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on utilise l'espèce T.rostrata de Tetrahymena.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caracté¬ risé en ce que la production de Tetrahymena s'effectue en fermenteur en utilisant un milieu de culture à base de lait écrémé et de levure ou d'extrait de levure.
4. Produit obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Produit selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il est constitué à raison d'au moins 20% d'aci¬ de 7-linolénique ou d'acide dihomo-7-linolénique ou de ses dérivés, éventuellement mélangé avec 1 à 15% en poids d'acide oléique et 1 à 10% d'acide ciliénique.
6. Produit selon la revendication 5 caractérisé en ce qu' il - contient l'acide 7-linolénique ou l'acide dihomo-7-linolénique sous forme d'acide libre ou sous forme d'un dérivé notamment d'ester, de préférence un ester méthylique .
7. Préparation médicamenteuse ou alimentaire à action d'antiagrêgation plaquettaire ou antithrombotique caractérisée en ce qu'elle contient comme constituant actif au moins de l'acide 7-linolénique ou l'acide dihomo-7-linolénique ou ses dérivés, notamment ses es¬ ters, de préférence l'ester méthylique.
8. Préparation médicamenteuse ou alimentaire caractérisée en ce qu'elle contient l'acide -linolénique en mélange avec de l'acide oléique et/ou de l'acide ciliénique.
9. Préparation médicamenteuse ou alimentaire se¬ lon la revendication 7 ou 8 caractérisée en ce qu'elle comporte comme adjuvant l'acétate d' α-tocophérol.
10. Préparation médicamenteuse ou alimentaire à
• action d'antiagregation plaquettaire ou antithrombotique caractérisée en ce qu'elle contient le produit selon la revendication 4.
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