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WO1984004539A1 - Production de la catechol 2,3-oxygenase par des levures, plasmide pour sa mise en oeuvre et application - Google Patents

Production de la catechol 2,3-oxygenase par des levures, plasmide pour sa mise en oeuvre et application Download PDF

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Publication number
WO1984004539A1
WO1984004539A1 PCT/FR1984/000133 FR8400133W WO8404539A1 WO 1984004539 A1 WO1984004539 A1 WO 1984004539A1 FR 8400133 W FR8400133 W FR 8400133W WO 8404539 A1 WO8404539 A1 WO 8404539A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
yeast
plasmid
catechol
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1984/000133
Other languages
English (en)
Inventor
Michel Aigle
Yves Lemoine
Gerard Loison
Jean-Pierre Lecocq
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Transgene SA
Original Assignee
Transgene SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR8308292A external-priority patent/FR2546179B1/fr
Priority claimed from FR8404453A external-priority patent/FR2561662B2/fr
Application filed by Transgene SA filed Critical Transgene SA
Publication of WO1984004539A1 publication Critical patent/WO1984004539A1/fr
Priority to DK27385A priority Critical patent/DK27385A/da
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11002—Catechol 2,3-dioxygenase (1.13.11.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to the production of the enzyme catechol 2, 3-oxygenase (hereinafter called C 2,3-O) of Pseudomonas by a yeast such as Saccharomyces cerevisiae, as well as the applications which result therefrom, in particular the production of colored markers.
  • C 2,3-O catechol 2, 3-oxygenase
  • Colored markers have been used in genetics from the start of this science to easily track gene segregation in plants, animals and microorganisms.
  • the molecular biology of bacteria has largely developed around the lactose system of Escherichia coli, using different chromogenic analogs of lactose (o-nitrophenyl-ß-D-galactoside yellow, 5-bromo, 4-chloro, 3-indolyl- ß-D-galactoside, named Xgal, blue).
  • lactose o-nitrophenyl-ß-D-galactoside yellow, 5-bromo, 4-chloro, 3-indolyl- ß-D-galactoside, named Xgal, blue.
  • the colored halo developed by the clones containing a ⁇ -galactosidase activity allows the extremely fast sorting of the positive or negative colonies as regards this characteristic.
  • the system has also been adapted in numerous constructions, in particular for cloning pieces of DNA into the bacteriophage M13 or for studying the expression of genes.
  • a marker colored in yellow has recently been described in E. coli, phage M13 and gram-positive bacteria of the Bacillus type (Zukowski et al., 1983).
  • the present invention relates to the specific adaptation of this system using catechol 2,3-oxygenase encoded by the xylE gene, to yeast and the developments which are linked to it.
  • the xylE gene is normally carried by the TOL plasmid of some Pseudomonas species which degrade toluene (Franklin, 1981). This gene was cloned in E. coli (Franklin, 1981), in bacteriophage M13 and in Bacillus subtilis (Zukowski et al., 1983).
  • This gene codes for the enzyme catechol 2,3-oxygenase which oxidizes catechol to muconic semialdehyde 2-OH according to the reaction:
  • catechol semialdehyde 20H colorless muconic yellow
  • the substrate (catechol) is colorless and the oxidation product is yellow.
  • Such a yellow labeling system implementing the C 2,3-O encoded by the xylE gene, in yeast would offer the advantages requested for this type of test, in particular very low cost price, non destruction of the clones, reaction clear and fast, in addition it is not necessary to use a special medium.
  • yeast can be a very interesting organism for producing the enzyme in large quantities, given the industrial know-how concerning the production of this organism and the fact that it is recognized as non-pathogenic for humans and animals. .
  • the present invention relates to an expression block for catechol 2,3-oxygenase in yeast, characterized in that it comprises, according to the reading direction, and with the correct orientation, at least:
  • yeast promoter a yeast promoter,. the xylE gene,. a yeast terminator.
  • expression block of catechol 2,3-oxygenase in yeast does not necessarily mean that the xylE gene is expressed. Indeed, as we will see below, it is possible to use this expression block as part of a colored marker, in this case we will use either the appearance of a coloration (expression of the C 2,3-O) or, on the contrary, disappearance of a coloration (blocking of the expression of C 2,3-O), in this case, although the "expression block” is present, C 2,3-O does not is not expressed because an exogenous DNA fragment is, for example, present within the xylE gene, in the second case we will use, however, the terms "expression block".
  • the reading direction used in this definition is that of the reading of the DNA of the expression block by the RNA polymerase; as for the correct orientation, it is understood in relation to the meaning defined above.
  • the yeast promoter is a DNA fragment generally originating from the yeast itself and which allows the specific start of the synthesis of mRNA.
  • the yeast terminator is a DNA fragment which stops the synthesis and which ensures the correct modeling of the mRNA in order to obtain an important protein yield.
  • yeast promoters which can be used, mention should be made more particularly of the promoter of the URA 3 + gene, but it is possible to use other promoters, in particular those of the genes coding for the enzymes of glycolysis (Dobson et al., 1982 ; Hitzeman et al., 1983).
  • the yeast terminators which can be used mention should be made more particularly of the terminator of the URA 3 + gene, but it is of course possible to use other terminators of genes coding for proteins expressed by yeasts.
  • xylE gene has been described in various documents and its structure is known; however, as part of the pre sente invention means by "xylE gene” means not only the gene itself, but also its derivatives, the expression of which also leads to catechol 2,3-oxygenase activity.
  • the structure of the "naked" xylE gene can be changed as to the precise nature of its proximal end.
  • the number and sequence of base pairs present just before the ATG initiator codon may vary.
  • the introduction of the base A at position -3, position 0 being the A of the ATG codon may be of interest. Indeed, this characteristic is common to most yeast genes (Dobson et al., 1982).
  • the modifications can be used in studies concerning the transcription and translation of genes (research) and in the optimization of gene expression in order to obtain better yields of enzyme (industry).
  • This "expression block” can be used in different ways, it can be integrated into an autonomous replication vector, or else it can be integrated into the chromosome of a yeast.
  • the vector can, moreover, comprise other elements ensuring its good functioning in yeasts, but also its replication in bacteria.
  • the present invention also relates to the yeast strains transformed by the vectors described or comprising one or more "expression blocks" integrated into their chromosomes.
  • Saccharomyces strains such as S. cerevisiae, S. uvarum, S. carlsbergensis, S. diastaticus, but also Schizosaccharomyces pombe (Chevallier et al., 1982).
  • strains thus obtained can be used for the preparation of catechol oxygenase. Optimization of all the parameters described above must make it possible to achieve yields of enzyme compatible with commercial requirements.
  • Yeast cells can be easily grown in large quantities on inexpensive substrates (musts, molasses). The cells are easily extractable from the medium by simple decantation. the enzyme can be extracted from cells by grinding the cells with known techniques.
  • This property can be used to detect yeast clones that have been transformed by the xylE gene. This technique can advantageously replace the ⁇ -lactamase test (Reipen, 1982) because of its much easier handling.
  • the chromogenic properties of C 2,3-O may further find applications in the cloning and expression of genes other than the xylE gene.
  • the creation of a hybrid protein with chromogenic properties can lead to a rapid and efficient method of measuring the production of the other part of the protein. Indeed, many molecules produced by genetic engineering are very difficult to measure (interferons, coagulation factors, antigenic molecules, etc.). The substitution of these costly and time-consuming tests by the simple colored or enzymatic test of the described enzyme can be a clear advantage in many cases.
  • this system can be used as a "probe" for termination and promotion functions.
  • this system can be used as a "probe" for termination and promotion functions.
  • Mendelian red mutations (ade-) with the typically non-Mendelian segregation of the xylE system on a self-replicating vector, it is easy and spectacular to demonstrate the two types of segregation in the same experiment.
  • Such a system also meets the specific requirements of education: simplicity, low cost, reproducibility, clarity.
  • the present invention also relates to the labeling of industrial strains.
  • the yeast strains used in the context of recombinant DNA techniques are most of the time laboratory strains which are easily transformable by means of auxotrophies, for example for leucine.
  • Industrial strains in particular baker's or brewer's yeast strains, on the other hand, are very difficult to work because they have no auxotrophic character.
  • the main character of auxotrophy for leucine necessary for the use of the plasmid pJDB207-xylE being absent, it is impossible to rely on this method to transform them.
  • a system has been described by Jimenez et al.
  • the present invention also relates to a block for the expression of catechol-2,3-oxygenase in a yeast as described above, characterized in that it comprises, as selection marker, the gene for resistance to a chemical compound. .
  • genes for resistance to chemical compounds mention should be made more particularly of the genes of resistance to antibiotics and in particular resistance to G418, that is to say the Neo gene.
  • This gene for resistance to a chemical compound is preferably under the promotion of a yeast promoter such as the promoter of the yeast PGK (phosphoglycerokinase) gene and terminated by a termination segment of the same PGK gene.
  • a yeast promoter such as the promoter of the yeast PGK (phosphoglycerokinase) gene and terminated by a termination segment of the same PGK gene.
  • This type of expression block is more particularly usable in industrial yeasts, in particular the yeast strains for baking, brewing and wine making.
  • This improvement must make it possible to mark strains of industrial yeasts and thus to be able to monitor and control said fermentations.
  • FIG. 1 diagrammatically shows a strategy for cloning the "naked" xylE gene
  • Figure 2 shows schematically the construction of an expression block
  • FIG. 3 diagrams the strategy for obtaining a self-replicating vector carrying the xylE gene
  • Figure 4 shows schematically the construction of a yeast containing an expression block integrated into the chromosome
  • FIG. 5 represents the assay of the activity of C 2,3-O in a crude yeast extract
  • FIG. 6 represents the kinetics of action of C 2,3-O produced by the yeast
  • FIG. 7 represents a comparison of the activities of the yeast C 2,3-O and of E. coli as a function of the pH
  • Figure 8 shows the preparation scheme for pTG840
  • Figure 9 shows the preparation scheme for pTG861.
  • the starting point of this construction is the phage M13mp9 (sold by the company NE Biolabs USA) in which the xylE gene is cloned in the form of a SalI / SalI fragment. These sites have been described in French Patent No. 82 01 574. As described in FIG. 1, this phage contains a unique PstI site located downstream of the coding sequence of the xylE gene. This site will be used as the end point of the "naked" gene. If we now consider the start of the gene, we must, as explained above, remove most of the DNA located upstream of the ATG initiator codon. To this end, the 4 HgiDI sites present on the structure are to be analyzed.
  • the first on the left (HgiDI (O)) is on the DNA of the phage itself. For an unknown reason, this site is not cut by the HgiDI enzyme under working conditions.
  • the other 3 sites are located in the DNA sequences from Pseudomonas.
  • the first, far upstream of the start of translation (ATG) is of no interest.
  • the second (HgiDI (2)) is located just before the ATG of the xylE gene (in fact 4 base pairs upstream). It can therefore be used as the proximal end of the "naked" xylE gene because no ATG is present in these 4 base pairs.
  • the last site (HgiDI (3)) is inside the gene and, if cut, will destroy the structure of the gene.
  • the plasmid pRG5 (Loison et al., 1981) is a derivative of PBR322 which contains an insertion of 2.5 kb in its HindIII site. This fragment allows the expression of the resistance to tetracycline carried by pBR322.
  • pRG5 is cut with PstI and ClaI, then the large fragment thus generated is isolated as before from an agarose gel. This fragment is mixed with the "naked" xylE gene, the isolation of which has just been described, and the mixture is incubated overnight at 15 ° C. in the presence of phage T4 ligase. The mixture is used to transform a strain of E. coli using the calcium chloride technique (Maniatis et al., 1982). The bacterial population is spread on a medium containing tetracycline. The resistant tetracycline clones obtained were analyzed for their plasmid content and the plasmid pTG820 was extracted therefrom.
  • This structure must contain, as previously indicated, a yeast promoter upstream of the xylE gene and a terminator behind this gene.
  • the base plasmid in this construct is plasmid pTG802. It consists of a plasmid derived from pBR322 without a PstI site, and into the HindIII site from which the yeast URA3 gene was cloned. The only PstI site of pTG802 is located in the yeast DNA sequence, exactly 20 base pairs before the ATG initiator codon of the URA3 gene. This plasmid is cut with PstI and treated with the "Klenow" fragment of DNA polymerase I, which generates blunt ends at each end of the fragment.
  • the “naked” xylE gene is prepared as described in Example 1 by a PstI and HindIII digestion of pTG820.
  • the 1.1 kb fragment is isolated from a gel, also treated with the "Klenow" fragment of polymerase I and coprecipitated with pTG802 treated as described above.
  • the mixture is resuspended in the ad hoc buffer and ligated as described above.
  • the transformation of E. coli and selection on medium containing ampicillin provides thousands of colonies.
  • the promoter of the URA3 gene functions in the bacterium E. coli. As the construction can lead to a fusion between the xylE gene and the promoter, bacterial clones producing catechol 2,3-oxygenase are sought among the colonies resistant to ampicillin.
  • the plasmid pTG821 thus obtained can release by a simple cut with HindIII a fragment of 2.2 kb which contains in order: the promoter of the yeast gene URA3, the gene xylE, and the yeast URA3 gene which has the functions of termination in its distal part.
  • This HindIII / HindIII fragment therefore groups together all of the functions necessary for the expression of the xylE gene in yeast and will be called "expression block" below.
  • EXAMPLE 2 Construction of a yeast strain carrying the expression block on an autonomous replicating plasmid (FIG. 3)
  • the introduction of foreign DNA and the use of autonomous replicating plasmids in yeasts are known (Beggs, 1981 ), in particular using plasmids derived from the yeast "2 ⁇ m plasmid".
  • the use of structures derived from the natural yeast plasmid, called "2 ⁇ m” has the advantages of ensuring a high transformation frequency and a large number of copies per cell. If the expression block is coupled with this type of plasmid, the large number of copies of the xylE gene may allow yeast produce a significant amount of catechol 2,3-oxygenase.
  • the plasmid pJDB207 (Beggs, 1981) is used. After cleavage with the enzyme HindIII, the large fragment is isolated and mixed with the expression block itself released from pTG821 by cleavage HindIII. The mixture is ligated and used to transform E. coli.
  • Clones resistant to ampicillin are obtained and among them many yellow clones appear in contact with catechol as described above.
  • This plasmid comprises: a selection marker for yeast (gene
  • LEU2 an autonomous replication system for yeast (2 ⁇ m)
  • an autonomous replication system for yeast (2 ⁇ m)
  • a selective marker for E. coli Amp R or Tet R
  • This plasmid pJDB207-xylE is used to transform a yeast strain (leu-).
  • the cells which have received the plasmid are selected on a leucine-free medium.
  • the exogenous DNA can recombine with its homolog of the chromosome of the receiving yeast (Hinnen et al., 1978). This event is however very rare. It has been shown recently that linear and non-circular DNA as in the case of plasmids has the property of recombining much more frequently with the chromosome. On the other hand, during the transformation event, each cell "takes" a large number of DNA molecules from the medium (Beggs, 1981). These two elements made it possible to develop the strategy described below in order to integrate the expression block in the chromosome V of yeast.
  • ura- A large number of strains (ura-) are then selected from the population obtained previously. To do this, a positive selection of the cells sought is used by spreading them on a medium containing uracil and 5-fluoro-orotate (10 -2 M). The colonies that grow on this medium are genetically (ura-) (this technique was transmitted by F. Lacroute in France). In this way, a hundred strains (ura-) are isolated. Among those
  • Example 2 which contains the xylE gene on an autonomous replicating plasmid, is analyzed with a view to in situ staining.
  • a cell population of this strain is spread on a medium allowing the plasmid to be maintained, that is to say a medium devoid of leucine.
  • the petri dishes are sprayed with a catechol solution (0.5 M in water).
  • yeast transformation technique In a second study, the yeast transformation technique must be considered precisely (Hinnen et al., 1978). The last step is to wrap the yeast protoplasts in a layer of agarose gel. These protoplasts regenerate into cells which give rise to very small clones included inside the agar. If catechol is sprayed on such dishes, it quickly diffuses into the agar layer and the small lenticular colonies turn yellow. The examination of such boxes under a binocular magnifier (magnification 100 times) allows a clear recognition of the yellow micro-colonies.
  • EXAMPLE 6 The following tests are carried out with the strains described in Example 3 which contain the expression block of the xylE gene integrated into chromosome V.
  • the essential difference with the strain containing this block on an autonomous replicating plasmid is that the gene is present here in a single copy, against 30 to 50 on the plasmid. We therefore expect an enzymatic activity per cell 30 to 50 times lower.
  • the vaporization of catechol on this type of strains, containing only a single copy of the gene does not make it possible to see a yellow coloration appear directly. This is undoubtedly due to the too weak enzymatic activity of the cells.
  • Another solution may be to search for mutants expressing xylE sufficiently by the simple search for yellow clones after mutagenesis.
  • the construction of the plasmid pTG840 is recalled in FIG. 8.
  • the starting plasmid is the plasmid pTG902 obtained from pBR322 by deletion of the PstI and NdeI sites.
  • the plasmid pTG803 is obtained.
  • the 2 ⁇ yeast plasmid is digested with
  • Avall and HindIII and the ends are made blunt by treatment with Klenow polymerase.
  • This 2 ⁇ Avall / HindIII fragment is ligated with pTG803 digested with SmaI to provide the plasmid pTG807.
  • the ura3 gene and the origin of 2 ⁇ replication are released in the form of a single fragment by digestion of pTG807 with HindIII. This fragment is treated with the polymerase of
  • the yeast phosphoglycerate kinase (PGK) gene is mutated so that the unique BglII site is introduced to the ATG to initiate translation of the PGK protein.
  • the HindIII / SalI fragment (2.15 kb) comprising the promoter and the start of the coding region of the gene corresponding to the yeast phosphoglycerate kinase, was cloned into the same sites of the vector M13mp8.
  • the creation of a BglII site at the level of the ATG initiator of phosphoglyceratekinase was carried out according to conventional techniques of in vitro mutagenesis (Gillam and Smith, 1979 gene 8, 99-106).
  • a synthetic oligonucleotide of sequence 5 'ATATAAAACAAGATCTTTATC 3', was used to modify the original sequence 5 'ATATAAAACAATGTCTTTATC 3'; the initiating ATG is thus rendered non-functional due to its replacement by the AGA sequence.
  • This thus modified gene is cloned into the plasmid pTG831 to give the plasmid pTG832.
  • the PGK terminator located in the EcoRI / HindIII fragment is cloned into the PvuII site of pTG832 after treatment of its ends with polymerase from
  • the resulting plasmid, pTG833 is digested with BglII and recircularized to give the final expression vector pTG834.
  • the unique BglII site in this vector can be used for the expression of heterologous gene in yeast.
  • This manipulation is done in parallel with or without pTG86l DNA.
  • Yeast clones resistant to G418 are thus obtained, essentially on dishes corresponding to the series with DNA.
  • the frequencies are however very low (from 1 to 1OO clones per box).
  • the colonies obtained are subcultured on fresh medium with antibiotic and without sorbitol, then brought into contact with catechol according to the technique described in Example 4 of the patent.
  • the presence or absence of pTG861 in the yellow and white clones respectively was verified by the presence of ⁇ -lactamase in the strains (Chevallier et al. 1979).
  • Another advantage of the method is linked to the instability of the plasmid (see example 4).
  • the clones obtained with the brewery and bakery strains are cultured without antibiotics and then subcloned.
  • the subclone populations are analyzed using the same rapid catechol method.
  • Chevallier MR Lacroute JF (1982), The Embo Jl 1, 3, p.375-377. De Louvencourt L., Wesolowski M., Fukuhara H., Heslot H. (1982) in The proceeding of the XI th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, p.48.

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Abstract

La présente invention concerne un bloc d'expression de la catéchol 2,3-oxygénase dans une levure, caractérisé en ce qu'il comporte selon le sens de lecture et avec l'orientation correcte, au moins: un promoteur de levure, le gène xylE, et un terminateur de levure. Par intégration du bloc d'expression dans un plasmide et transformation d'une levure on obtient des transformants capables de produire de la C 2,3-0.

Description

Production de la catechol 2,3-oxygénase par des levures, plasmide pour sa mise en oeuvre et application.
La présente invention concerne la production de l'enzyme catéchol 2, 3-oxygénase (ci-après dénommée C 2,3-O) de Pseudomonas par une levure telle que Saccharomyces cerevisiae, ainsi que les applications qui en découlent, notamment la réalisation de marqueurs colorés.
Les marqueurs colorés ont été utilisés en génétique dès le début de cette science pour suivre facilement la ségrégation des gènes chez les plantes, les animaux et les microorganismes. La biologie moléculaire des bactéries s'est largement développée autour du système lactose d'Escherichia coli, en utilisant différents analogues chromogènes du lactose (o-nitrophényl-ß-D-galactoside jaune, 5-bromo, 4-chloro, 3-indolyl-ß-D-galactoside, nommé Xgal, bleu). L'utilisation de ces substrats chromogènes permet une quantification aisée des activités enzymatiques in vitro. In vivo, le halo coloré développé par les clones contenant une activité β-galactosidase permet le tri extrèmement rapide des colonies positives ou négatives quant à ce caractère. Le système a également été adapté dans de nombreuses constructions, notamment pour cloner des morceaux d'ADN dans le bactériophage M13 ou pour étudier l'expression des gènes.
Toutefois, il existe peu de marqueurs colorés dans le domaine de la génétique des levures. Classiquement, les mutations (ade 1) et (ade 2) confèrent aux clones une couleur rouge. Cette particularité a été largement exploitée. Par contre, si on considère le champ d'étude utilisant le clonage et l'expression des gènes, aucun marqueur réellement pratique n'a été développée jusqu'à présent. Le couple β-galactosidase/ Xgal bleu précédemment décrit a été introduit chez les levures (Rose et coll., 1981). Mais ce système souffre du fait que, normalement, la levure ne possède pas de perméase pour les β-galactosides, contraignant les expérimentateurs à utiliser de grandes quantités (40 μg/ml) de substrat Xgal qui est extrèmement cher. Dans le domaine de la transformation et du marquage des souches, la mise en évidence de 1' activité β-lactamase a été développée (Reipen et coll., 1982), mais le test est trop complexe pour être utilisé de manière routinière.
Un marqueur coloré en jaune a été récemment décrit dans E. coli, le phage M13 et des bactéries gram-positives de type Bacillus (Zukowski et coll., 1983).
La présente invention concerne 1' adaptation spécifique de ce système mettant en oeuvre la catéchol 2,3-oxygénase codée par le gène xylE, à la levure et les développements qui y sont liés.
Le gène xylE est normalement porté par le plasmide TOL de quelques espèces de Pseudomonas qui dégradent le toluène (Franklin, 1981). Ce gène a été cloné dans E. coli (Franklin, 1981), dans le bactériophage M13 et dans Bacillus subtilis (Zukowski et coll., 1983).
Ce gène code pour l'enzyme catéchol 2,3-oxygénase qui oxyde le catéchol en semialdéhyde 2-OH muconique suivant la réaction :
Figure imgf000004_0001
catéchol semialdéhyde 20H incolore muconique jaune Comme indiqué ci-dessus, le substrat (catéchol) est incolore et le produit d'oxydation est jaune.
Un tel système de marquage jaune, mettant en oeuvre la C 2,3-O codée par le gène xylE, dans la levure offrirait les avantages demandés pour ce type de test, en particulier prix de revient très bas, non destruction des clones, réaction claire et rapide, en outre il n'est pas nécessaire d'utiliser un milieu spécial.
De plus, l'enzyme elle-même a été proposée pour des utilisations industrielles variées (brevet français n° 82 01574 au nom de la Demanderesse) à partir de cultures bactériennes. Ici aussi, la levure peut être un organisme très intéressant pour produire l'enzyme en grande quantité, compte tenu du savoir faire industriel concernant la production de cet organisme et du fait qu'il est reconnu comme non pathogène pour l'homme et les animaux.
La présente invention concerne un bloc d'expression de la catechol 2,3-oxygénase dans une levure, caractérisé en ce qu'il comporte selon le sens de lecture, et avec l'orientation correcte, au moins :
. un promoteur de levure, . le gène xylE, . un terminateur de levure.
La terminologie "bloc d'expression" de la catéchol 2,3-oxygénase dans une levure ne signifie pas nécessairement que le gène xylE est exprimé. En effet, comme on le verra ci-après, il est possible d'utiliser ce bloc d'expression à titre d'élément d'un marqueur coloré, dans ce cas on utilisera soit l'apparition d'une coloration (expression de la C 2,3-O) ou, au contraire, disparition d'une coloration (blocage de l'expression de la C 2,3-O), dans ce cas, bien que le "bloc d'expression" soit présent, la C 2,3-O ne s'exprime pas car un fragment d'ADN exogène est, par exemple, présent au sein du gène xylE, dans ce second cas on utilisera, néanmoins, les termes "bloc d'expression".
Le sens de lecture retenu dans cette définition est celui de la lecture de l'ADN du bloc d'expression par l'ARN polymérase ; quant à l'orientation correcte, elle s'entend par rapport au sens défini précédemment.
Le promoteur de levure est un fragment d'ADN généralement originaire de la levure elle-même et qui permet le démarrage spécifique de la synthèse du mARN.
Afin d'assurer l'expression de la catechol oxygénase, il est important qu'il n'existe entre ce promoteur et le codon initiateur ATG du gène xylE aucun autre codon initiateur ATG.
Le terminateur de levure est un fragment d'ADN qui arrête la synthèse et qui assure le modelage correct du mARN afin d'obtenir un rendement en protéine important. Parmi les promoteurs de levure utilisables, il faut citer plus particulièrement le promoteur du gène URA3 +, mais il est possible d'utiliser d'autres promoteurs, notamment ceux des gènes codant pour les enzymes de la glycolyse (Dobson et coll., 1982 ; Hitzeman et coll., 1983). Parmi les terminateurs de levure utilisables, il faut citer plus particulièrement le terminateur du gène URA3 +, mais il est bien entendu possible d'utiliser d'autres terminateurs de gènes codant pour des protéines exprimées par des levures. Le gène xylE a été décrit dans divers documents et sa structure est connue ; toutefois, dans le cadre de la pré sente invention, on entend désigner par "gène xylE" non seulement le gène lui-même, mais également ses dérivés dont l'expression conduit également à une activité de catéchol 2,3-oxygénase. Ainsi, la structure du gène xylE "nu" peut être changée quant à la nature précise de son extrémité proximale. Le nombre et la séquence des paires de bases présentes juste avant le codon initiateur ATG peuvent varier. En particulier, l'introduction de la base A en position -3, la position 0 étant le A du codon ATG, peut être intéressante. En effet, cette caractéristique est commune à la plupart des gènes de levure (Dobson et coll., 1982). Les modifications peuvent être utilisées dans des études concernant la transcription et la traduction des gènes (recherche) et dans l'optimisation d'expression du gène afin d'obtenir de meilleurs rendements en enzyme (industrie).
Ce "bloc d'expression" peut être utilisé de différentes façons, il peut être intégré dans un vecteur à replication autonome, ou bien être intégré dans le chromosome d'une levure.
Dans le cas d'un vecteur à réplication autonome, il faut prévoir un fragment supplémentaire assurant l'autoréplication dans les levures, notamment tout ou partie du plasmide 2 μ . L'utilisation de ce fragment d'ADN présente de nombreux avantages, en particulier celui d'assurer une haute fréquence de transformation et celui de permettre un grand nombre de copies par cellule, donc potentiellement une production importante de C 2,3-O.
Mais il existe également d'autres vecteurs possédant la même propriété de réplication autonome. Par exemple, l'utilisation des "séquences à replication autonome" (Beggs, 1981) issues des chromosomes de la levure ou d'autres eucaryotes, couplées ou non avec des séquences de centromères (Beggs, 1981), est possible. L'utilisation de dérivés de l'ADN "killer" de Kluyveromyces lactis est également envisageable (De Louvencourt et coll., 1982).
Ces variations permettent l'étude et l'optimisation des paramètres essentiels intervenant dans la production d'une protéine par la levure, en particulier la stabilité, la pression sélective, les milieux, les paramètres de fermentation et la nature des souches de base.
Le vecteur peut, en outre, comporter d'autres éléments assurant son bon fonctionnement dans les levures, mais également sa réplication dans des bactéries.
Ainsi, il est possible de prévoir un système de réplication dans les bactéries telles que E. coli ou B.subtilis, ainsi qu'un ou plusieurs marqueurs sélectifs tels que des résistances à certains antibiotiques, ampicilline ou tétracycline. On obtient ainsi un vecteur polyvalent pour les cellules de levure et procaryotes.
Dans le cas ou l'on désire assurer une intégration du bloc d'expression dans les chromosomes de levure, un ADN exogène au bloc d'expression peut se recombiner avec son homologue du chromosome de la levure réceptrice. Il est ainsi possible d'utiliser un "bloc d'expression" complémenté par un fragment "d'ADN porteur". Ainsi, il sera démontré que l'intégration du bloc d'expression est dirigée dans les chromosomes de la levure par les extrémité des séquences d'ADN présentes dans le fragment à intégrer. Ce type de résultats a été obtenu pour d'autres systèmes (Orr-Weaver et coll., 1981). Il est ainsi possible d'intégrer la séquence xylE dans n'importe quel point précis des 17 chromosomes de la levure, pourvu qu'on dispose d'un fragment d'ADN correspondant. Avec la même technologie, il est possible d'intégrer plusieurs copies du bloc d'expression en répétant l'expérience avec différents fragments d'ADN"porteurs". Ceci aboutira à une meilleure expression du gène xylE sans instabilité appréciable.
La présente invention concerne également les souches de levures transformées par les vecteurs décrits ou comportant un ou plusieurs "blocs d'expression" intégrés dans leurs chromosomes.
Parmi les souches utilisables, en particulier avec les éléments du gène URA3+, il faut citer les souches de Saccharomyces telles que S. cerevisiae, S . uvarum, S. carlsbergensis, S. diastaticus, mais également Schizosaccharomyces pombe (Chevallier et coll., 1982).
Les souches ainsi obtenues peuvent être utilisées pour la préparation de la catechol oxygénase. Une optimisation de tous les paramètres décrits précédemment doit permettre d'atteindre des rendements en enzyme compatibles avec les impératifs commerciaux. Les cellules de levure peuvent être cultivées aisément en grande quantité sur des substrats bon marché (moûts, mélasses). Les cellules sont facilement extractibles du milieu par simple décantation. l'enzyme peut être extraite des cellules en broyant les cellules avec des techniques connues.
Les utilisations de la catechol 2,3-oxygénase dans les procédés chimiques, alimentaires, agriculturaux et pharma cologiques ont été décrites notamment dans le brevet français n° 82 01574. Les points essentiels spécifiques de la levure pour cette production restent le savoir faire industriel lié aux levures et la non pathogénicité des souches. Mais, la présente invention permet également le marquage de souches de levures grâce au changement de coloration du catéchol en présence de la C 2,3-O produite.
Comme cela sera démontré, la vaporisation d'une solution 0,5 M de catéchol sur des colonies exprimant le gène xylE aboutit au développement d'une couleur jaune intense sur celles-ci.
Cette propriété peut être utilisée pour détecter les clones de levures ayant été transformées par le gène xylE. Cette technique peut avantageusement remplacer le test de la β-lactamase (Reipen, 1982) à cause de sa manipulation beaucoup plus aisée.
Avec l'intégration de gènes xylE dans les chromosomes de la levure, un marquage permanent peut être obtenu. Il est intéressant de noter que le caractère étant dominant, ce marqueur peut être utilisé dans les souches industrielles polyploïdes, voire même celles dont on ignore tout de la structure génétique. Il est également important de noter que la coloration n'est pas létale pour les colonies et que celles-ci peuvent être normalement repiquées après le test. Ce type de marquage des souches peut être exploité dans le contexte de fermentation mixte. Une des souches peut être ainsi marquée et suivie aisément dans la population complexe des cuves de fermentation. Ce type d'étude trouvera une application majeure dans l'étude de la vinification où la population levurienne et son évolution est encore très mal connue. Son intérêt en génétique des populations au niveau de la recherche est également évident.
Les propriétés chromogènes de la C 2,3-O peuvent, en outre, trouver des applications dans le clonage et l'expression de gènes autres que le gène xylE.
Ainsi, on peut couper le gène à l'intérieur de la séquence codante, après le codon initiateur ATG. Ceci fournit un fragment qui peut être fusionné avec n'importe quel autre gène. Cette fusion peut également être réalisée avec le fragment contenant quelques paires de bases avant l'ATG initiateur. La création d'une protéine hybride ayant des propriétés chromogènes peut aboutir à une méthode rapide et efficace de mesure de la production de l'autre part de la protéine. En effet, de nombreuses molécules produites par le génie génétique sont très difficilement dosables (interférons, facteurs de coagulation, molécules antigéniques, etc.). La substitution de ces tests coûteux en argent et en temps par le simple test coloré ou enzymatique de l'enzyme décrit peut être un net avantage dans de nombreux cas. Une autre modification déjà proposée pour les systèmes viraux et bactériens (brevet français n° 82 01574) consiste à introduire dans la région codante du gène xylE un petit fragment d'ADN comportant quelques sites de clonage. L'introduction d'un nouveau fragment, assez important, d'ADN dans ces sites détruira le gène xylE, aboutissant à la perte du marqueur jaune. Ce système permet de reconnaître immédiatement les molécules recombinantes et évite les recherches fastidieuses chez la levure des structures d'ADN particulières. En fait, on utilisera dans ce cas de préférence un plasmide comportant au moins un site unique de restriction situé de façon telle que l'insertion d'un fragment d'ADN dans ce site inhibe la synthèse de la C 2,3-O.
Enfin, la mise en évidence des propriétés fluorescentes de la C 2,3-O ouvre des perspectives considérables au niveau industriel pour automatiser les applications précédentes.
Avec une optimisation appropriée, les cellules contenant ou pas le gène xylE pourraient être comptées directement sous le microscope à fluorescence sans devoir attendre le développement de colonies. Ceci peut amener à une technique d'analyse en "temps réel" des fermentations complexes, l'observation des cellules au microscope à fluorescence ne prenant que quelques minutes. Pour des études automatisées, l'utilisation de "cell counters" équipés pour la fluorescence (Falaiya et coll., 1979) peut permettre des études extrèmement précises sur des populations importantes. En recherche fondamentale, l'étude des phénomènes génétiques liés aux plasmides peut être abordée directement sur les cellules elles-mêmes et non sur les clones dérivés de celles-ci, ce qui jusqu'à présent n'était pas réalisable par les marqueurs connus.
Bien entendu, la présente invention peut être utilisée à des fins de recherches plus fondamentales ou à titre didactique. Ainsi, ce système peut être utilisé comme "sonde" pour les fonctions de terminaison et de promotion. Ou bien, si on couple les mutations rouges mendeliennes (ade-) avec la ségrégation typiquement non mendelienne du système xylE sur un vecteur autoreplicatif, il est aisé et spectaculaire de démontrer les deux types de ségrégation dans une même expérience. Un tel système répond en outre aux impératifs particuliers de l'enseignement : simplicité, prix de revient peu élevé, reproductibilité, clarté.
A titre particulier la présente invention concerne également le marquage des souches industrielles. En effet, les souches de levures mises en oeuvre dans le cadre des techniques d'ADN recombinant sont la plupart du temps des souches de laboratoire aisément transformables grâce à des auxotrophies par exemple pour la leucine. Les souches industrielles, en particulier les souches de levures de boulangerie ou de brasserie, sont par contre très difficiles à travailler car elles ne possèdent aucun caractère d'auxotrophie. Notamment, le caractère principal d'auxotrophie pour la leucine nécessaire à l'utilisation du plasmide pJDB207-xylE étant absent, il est impossible de se baser sur cette méthode pour les transformer. Un système a été décrit par Jimenez et coll. (1980) qui utilise le couple antibiotique G4l8/résistance au G418 pour sélectionner avec des levures sans auxotrophie des événements de transformation. La méthode est cependant limitée par le fait que des levures non transformées par les plasmides peuvent devenir naturellement résistantes à l'antibiotique. Une analyse longue. et peu réalisable sur de grandes séries doit suivre chaque expérience de transformation pour différencier ces deux types de colonies. Le couplage du bloc d'expression de xylE avec le gène de résistance au G418 permet de résoudre ce problème immédiatement. En effet, les souches transformées deviennent jaunes au contact du catechol, alors que les résistants spontanés restent blancs.
C'est pourquoi la présente invention concerne également un bloc d'expression de la catéchol-2,3-oxygénase dans une levure tel que décrit précédemment, caractérisé en ce qu'il comporte comme marqueur de sélection le gène de résistance à un composé chimique.
Parmi les gènes de résistance à des composés chimiques, il faut citer plus particulièrement les gènes de résistance aux antibiotiques et en particulier la résistance à G418, c'est-à-dire le gène Néo.
Ce géne de résistance à un composé chimique est, de préférence, sous la promotion d'un promoteur de levure tel que le promoteur du géne PGK (phosphoglycérokinase) de levure et terminé par un segment de terminaison du même gène PGK.
Ce type de bloc d'expression, est plus particulièrement utilisable dans les levures industrielles, en particulier les souches de levures de boulangerie, de brasserie et de vinification.
Ce perfectionnement doit permettre de marquer des souches de levures industrielles et ainsi de pouvoir suivre et contrôler lesdites fermentations.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans les exemples ci-après qui se réfèrent, en tant que de besoin, aux figures annexées sur lesquelles : la figure 1 schématise une stratégie de clonage du gène xylE "nu" ; la figure 2 schématise la construction d'un bloc d'expression ; la figure 3 schématise la stratégie permettant d'obtenir un vecteur autoreplicatif portant le gène xylE ; la figure 4 schématise la construction d'une levure contenant un bloc d'expression intégré dans le chromosome ; la figure 5 représente le dosage de l'activité de C 2,3-O dans un extrait brut de levure ; la figure 6 représente la cinétique d'action de C 2,3-O produite par la levure ; la figure 7 représente une comparaison des activités de la C 2,3-O de levure et de E. coli en fonction du pH ; la figure 8 représente le schéma de préparation de pTG840 ; la figure 9 représente le schéma de préparation de pTG861.
EXEMPLE 1
Construction du bloc d'expression nécessaire au fonctionnement du gène dans la levure a) Clonage du gène xylE "nu" (figure 1)
Le point de départ de cette construction est le phage M13mp9 (commercialisé par la Société N.E. Biolabs U.S.A.) dans lequel le gène xylE est cloné sous forme d'un fragment SalI/SalI. Ces sites ont été décrits dans le brevet français n° 82 01 574. Comme il est décrit dans la figure 1, ce phage contient un site PstI unique situé en aval de la séquence codante du gène xylE. Ce site sera utilisé comme point terminal du gène "nu". Si on considère à présent le début du gène, on doit, comme cela a été précisé précédemment, enlever la plus grande partie de l'ADN située en amont du codon initiateur ATG. A cette fin, les 4 sites HgiDI présents sur la structure sont à analyser.
Le premier à gauche (HgiDI (O)) se trouve sur l'ADN du phage lui-même. Pour une raison inconnue, ce site n'est pas coupé par l'enzyme HgiDI dans les conditions de travail. Les 3 autres sites sont situés dans les séquences d'ADN provenant de Pseudomonas. Le premier, loin en amont du départ de traduction (ATG) ne présente pas d'intérêt. Le second (HgiDI (2)) est situé juste avant l'ATG du gène xylE (en fait 4 paires de bases en amont). Il peut donc être utilisé comme extrémité proximale du gène xylE "nu" car aucun ATG n'est présent dans ces 4 paires de bases. Le dernier site (HgiDI (3)) se trouve à l'intérieur du gène et, s'il est coupé, va détruire la structure du gène.
Dans le but de produire un fragment HgiDI (2)/PstI contenant en entier le gène xylE "nu", on fait une digestion partielle de 30 μg du clone M13xylE décrit ici (1 unité d'enzyme par μg d'ADN dans 60 μl de tampon contenant 5 μg/ml de bromure d'éthidium à 37°C pendant environ 2 heures). Le mélange obtenu est extrait au phénol puis avec un mélange de chloroforme-alcool isoamylique (24:1) (mélange dit "Sevag"), précipité à l'alcool et resuspendu dans un tampon approprié.
Une digestion totale par l'enzyme PstI est effectuée sur cette solution. Le mélange de digestion est ensuite analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % et résolu en ses différents fragments, la taille de ces fragments d'ADN peut toujours être expliquée par la double digestion décrite ci-dessus. Parmi eux, le fragment de 1,1 kilobase (kb), théoriquement limité par les sites HgiDI (2) et PstI, est isolé du gel grâce à la technique de Girvitz (1980).
Afin d'obtenir ce fragment plus facilement et en grande quantité, si cela est nécessaire, il est cloné de la manière décrite ci-dessous :
Le plasmide pRG5 (Loison et coll., 1981) est un dérivé de PBR322 qui contient une insertion de 2,5 kb dans son site HindIII. Ce fragment permet l'expression de la résistance à la tétracycline portée par pBR322. pRG5 est coupé par PstI et Clal, puis le gros fragment ainsi généré est isolé comme précédemment d'un gel d'agarose. Ce fragment est mélangé avec le gène xylE "nu" dont l' isolement vient d'être décrit, et le mélange est incubé une nuit à 15°C en présence de ligase du phage T4. Le mélange est utilisé pour transformer une souche d'E. coli suivant la technique au chlorure de calcium (Maniatis et coll., 1982). La population bactérienne est étalée sur un milieu contenant de la tetracycline. Les clones tétracycline résistants obtenus ont été analysés quant à leur contenu en plasmide et le plasmide pTG820 en a été extrait.
Le fait que les extrémités générées par HgiDI et Clal sont complémentaires sur l'ADN permet la formation du plasmide pTG820. Si on coupe celui-ci par les enzymes PstI et HgiIII , on libère un fragment de 1,1 kb contenant le gène xylE "nu" contenant 9 paires de bases entre le codon initiateur ATG et l'extrémité HindIII. Ces 9 paires de bases ne contiennent aucun codon ATG. b) Construction du "bloc d'expression" (figure 2)
Cette structure doit contenir, comme cela a été précédemment indiqué, un promoteur de levure en amont du gène xylE et un terminateur derrière ce gène.
Le plasmide de base dans cette construction est le plasmide pTG802. Il consiste en un plasmide dérivé de pBR322 sans site PstI, et dans le site HindIII duquel a été clone le gène URA3 de levure. Le seul site PstI de pTG802 se situe dans la séquence d'ADN de levure, exactement 20 paires de bases avant le codon initiateur ATG du gène URA3. Ce plasmide est coupé par PstI et traité avec le fragment "Klenow" de l'ADN polymérase I, ce qui génère des extrémités franches à chaque bout du fragment.
Le gène xylE "nu" est préparé comme décrit à 1' exemple 1 par une digestion PstI et HindIII de pTG820. Le fragment de 1,1 kb est isolé d'un gel, traité également avec le fragment "Klenow" de la polymérase I et coprécipitê avec pTG802 traité comme décrit précédemment. Le mélange est resuspendu dans le tampon ad'hoc et ligué comme décrit précédemment. La transformation d'E. coli et la sélection sur milieu contenant de l'ampicilline fournit des milliers de colonies.
Le promoteur du gène URA3 fonctionne dans la bactérie E. coli. Comme la construction peut aboutir à une fusion entre le gène xylE et le promoteur, des clones bactériens produisant de la catechol 2,3-oxygénase sont recherchés parmi les colonies résistantes à l'ampicilline.
A cette fin, une solution de catechol (0,5 M) est vaporisée sur les boîtes et quelques clones jaunes apparaissent. Des plasmides provenant de ces clones sont extraits et analysés. On peut démontrer que l'orientation du gène xylE est "correcte" dans ces plasmides, par rapport au promoteur de levure.
Le plasmide pTG821 ainsi obtenu peut libérer par une simple coupure par HindIII un fragment de 2,2 kb qui contient dans l'ordre : le promoteur du gène de levure URA3, le gène xylE, et le gène URA3 de levure qui a les fonctions de terminaison dans sa partie distale.
Ce fragment HindIII/HindIII regroupe donc toutes les fonctions nécessaires à l'expression du gène xylE dans la levure et sera dénommé "bloc d'expression" par la suite.
EXEMPLE 2 Construction d'une souche de levure portant le bloc d'expression sur un plasmide à réplication autonome (figure 3) L'introduction d'ADN étranger et l'utilisation des plasmides à réplication autonome dans les levures sont connues (Beggs, 1981), en particulier en utilisant des plasmides dérivés du "plasmide 2 μm" de levure. L'utilisation de structures dérivées du plasmide naturel de la levure, appelé "2 um" présente comme avantages d'assurer une haute fréquence de transformation et un grand nombre de copies par cellule. Si le bloc d'expression est couplé avec ce type de plasmide, le grand nombre de copies du gène xylE peut permettre à la levure de produire une quantité notable de catéchol 2,3-oxygénase.
Comme élément de base dans cette construction on utilise le plasmide pJDB207 (Beggs, 1981). Après coupure par l'enzyme HindIII, le grand fragment est isolé et mélangé avec le bloc d'expression lui-même sorti de pTG821 par coupure HindIII. Le mélange est ligué et utilisé pour transformer E. coli.
On obtient des clones résistants à l'ampicilline et parmi eux de nombreux clones jaunes apparaissent au contact du catéchol comme décrit précédemment.
L'un d'eux est cultivé et le plasmide qu'il contient est décrit dans la figure 3 (pJDB207-xylE).
Ce plasmide comporte : un marqueur de sélection pour la levure (gène
LEU2), un système de réplication autonome pour la levure (2 μm), un marqueur sélectif pour E. coli (AmpR ou TetR), un système de réplication autonome pour E. coli
(oRi), le bloc d'expression xylE.
Ce plasmide pJDB207-xylE est utilisé pour transformer une souche de levure (leu-). Les cellules ayant reçu le plasmide sont sélectionnées sur un milieu sans leucine.
Des milliers de colonies sont obtenues ainsi et pratiquement toutes expriment le gène xylE en produisant de la catéchol 2,3-oxygénase. EXEMPLE 3 Construction d'une souche de levure contenant le bloc d'expression intégré dans le chromosome V (figure 4)
Si on transforme la levure avec un fragment d'ADN ne portant aucun système de réplication autonome, l'ADN exogène peut se recombiner avec son homologue du chromosome de la levure réceptrice (Hinnen et coll., 1978). Cet événement est cependant très rare. Il a été montré récemment que de l'ADN linéaire et non circulaire comme dans le cas des plasmides a la propriété de recombiner beaucoup plus fréquemment avec le chromosome. D'un autre côté, pendant l'évènement de transformation, chaque cellule "prend" dans le milieu un grand nombre de molécules d'ADN (Beggs, 1981). Ces deux éléments ont permis de mettre au point la stratégie décrite ci-dessous afin d'intégrer le bloc d'expression dans le chromosome V de la levure.
30 μg du plasmide pTG820 sont traités par HindIII pour libérer le bloc d'expression, puis traités avec le fragment "Klenow" de la polymérase I pour éviter toute reconstitution de la molécule. A ce mélange on ajoute
5 μg de plasmide pJDB207 intact. Ce mélange est utilisé pour transformer une levure (leu2-), en sélectionnant sur milieu sans leucine, mais contenant de l'uracile.
En effet, si le bloc d'expression s'intègre à la place du gène URA3 endogène de la levure, celle-ci va devenir auxotrophe pour l'uracile et aura besoin de ce composé dans le milieu de culture pour se développer. La transformation aboutit à des milliers de clones. 200 d'entre eux sont analysés pour voir s'ils sont devenus (ura-) pour la raison décrite ci-dessus. Des analyses génétiques ultérieures ont montré que pour l'une de ces souches elle était bien (ura-) comme prévu. Une recherche de l'enzyme catéchol 2,3-oxygénase dans cette souche particulière s'avère toutefois négative.
On sélectionne alors un grand nombre de souches (ura-) parmi la population obtenue précédemment. Pour ce faire, on utilise une sélection positive des cellules recherchées en les étalant sur un milieu contenant de l'uracile et du 5-fluoro-orotate (10-2 M). Les colonies qui croissent sur ce milieu sont génétiquement (ura-) (cette technique a été transmise par F. Lacroute à Strasbourg). De cette façon, on isole une centaine de souches (ura-). Parmi celles-ci
4 produisent une très faible quantité de catechol 2,3-oxygénase.
EXEMPLE 4
Test coloré sur les colonies et les cellules
La souche précédemment décrite dans l'exemple 2, qui contient le gène xylE sur un plasmide à réplication autonome, est analysée dans l'optique de la coloration in situ. Premièrement, une population cellulaire de cette souche est étalée sur un milieu permettant le maintient du plasmide, c'est-à-dire un milieu dépourvu de leucine. Après croissance des colonies (3 jours à 28°C), les boîtes de Pétri sont vaporisées avec une solution de catechol (0,5 M dans l'eau).
Après quelques minutes à température ambiante ou à 28°C, les colonies deviennent jaunes foncés.
La coloration persiste sur la colonie même après plusieurs jours à température ambiante. Aucune diffusion appréciable de la couleur n'apparaît. Le pH bas (environ
5) du milieu évite le brunissement de la boîte de Pétri, ce qui se passe pour des pH voisins de 7.
De la même manière, une population mixte contenant des cellules contenant le plasmide pJDB207-xylE et des cellules ne le contenant pas est étalée, après croissance des colonies, le même test de coloration (vaporisation de catéchol) est réalisé, on observe que les deux sortes de colonies (avec et sans gène xylE) sont très nettement différenciées par la couleur.
Il est connu (Beggs, 1981) que le type de plasmide utilisé n'est pas stable dans la levure en condition non sélective, c'est-à-dire en présence de leucine dans le milieu. La souche originale contenant le plasmide pJDB207-xylE est cultivée 3 jours dans des conditions non sélectives puis étalée sur milieu également non sélectif. Après croissance des colonies, on effectue le test de coloration. On peut observer, malgré la non sélectivité du milieu, une majorité de clones jaunes contenant encore le plasmide et des clones blancs l'ayant perdu. De plus, un examen attentif des colonies permet de voir une hétérogénéité dans l'intensité de la couleur. Certaines sont claires, d'autres plus foncées.
Une analyse rapide de chacune des classes de couleur montre que plus une colonie est intensément colorée, plus le pourcentage de cellules (à l'intérieur de cette colonie) contenant le plasmide est élevé.
EXEMPLE 5
Dans une seconde étude, il faut considérer précisément la technique de transformation des levures (Hinnen et coll., 1978). La dernière étape consiste à envelopper les protoplastes de levure dans une couche d'un gel d'agarose. Ces protoplastes régénèrent en cellules qui donnent naissance à de très petits clones inclus à l'intérieur de la gélose. Si du catécholest vaporisé sur de telles boîtes, il diffuse rapidement dans la couche de gélose et les petites colonies lenticulaires deviennent jaunes. L'examen de telles boîtes sous une loupe binoculaire (grossissement 100 fois) permet une claire reconnaissance des micro-colonies jaunes.
Enfin, la même préparation peut être examinée grâce à un microscope à fluorescence. Dans ce cas la différenciation est encore plus nette car les clones exprimant le gène xylE fluorescent nettement sous le rayonnement ultraviolet, alors que ceux qui ne l'expriment pas restent noirs et donc invisibles sur le champ d'observation. Une recherche extrèmement efficace peut ainsi être effectuée sur des colonies très peu développées. On peut également utiliser un grossissement supérieur (400 fois) et observer que les cellules elles-mêmes sont fluorescentes. Une autre propriété intéressante des cellules a pu être mise en évidence. Les souches normales de levure ne sont intoxiquées par le catéchol qu'à des doses très importantes, supérieures à 10 mM ; or, les souches décrites ici, qui expriment le gène xylE, montrent une hypersensibilité au substrat, aucune croissance n'apparaissant au delà de 1 mM. Ainsi, il est possible de coupler un test de développement avec le test coloré, comme c'est le cas pour les souches (ade-) précédemment citées.
EXEMPLE 6 Les essais suivants sont effectués avec les souches décrites à l'exemple 3 qui contiennent le bloc d'expression du gène xylE intégré dans le chromosome V. La différence essentielle avec la souche contenant ce bloc sur un plasmide à réplication autonome est que le gène est ici présent en une seule copie, contre 30 à 50 sur le plasmide. On attend donc une activité enzymatique par cellule 30 à 50 fois plus faible. La vaporisation de catéchol sur ce type de souches, ne contenant qu'une seule copie du gène, ne permet pas de vpir apparaître une coloration jaune directement. Ceci est sans doute du à la trop faible activité enzymatique des cellules.
Par contre, un traitement détruisant les cellules grâce à l'action (1 heure, 37°C, 1 mg/ml) de l'enzyme
Zymolase 60 000® (Miles Laboratory) suivi d'une incubation in situ des colonies dans du tampon approprié (phosphate, pH 7, 0, 1 M) contenant 0,1 M de catéchol permet de révéler une coloration jaune des colonies exprimant ce gène. Afin d'aboutir à une plus forte expression, on peut envisager la modification du bloc d'expression qui permettra sans aucun doute la réalisation du test simple sur les colonies intactes.
Une autre solution peut être de chercher des mutants exprimant xylE suffisamment par la simple recherche de clones jaunes après mutagénèse.
Enfin, un enrichissement de ce type de souches peut être effectué grâce à la nystatine, comme on peut s'en rendre compte au vu du phénotype de sensibilité au catechol mis en évidence à l'exemple 5.
EXEMPLE 7 Afin de quantifier le phénomène macroscopique de coloration, des tests biochimiques ont été effectués.
Environ 3 g de cellules cultivées en milieu sans leucine sont récoltées, lavées dans du tampon phosphate, 0,1 M, pH 7, contenant 10 % d'acétone (Zukowski et coll., 1983) puis broyées grâce à des billes de verre dans ce même tampon. Après centrifugation (40 000 g, 30 minutes) l'extrait cellulaire est testé quant à son activité enzymatique catéchol 2,3-oxygénase dans les conditions standards (Zukowski et coll., 1983). Les résultats de ce dosage sont donnés dans la figure 5 qui donne l'activité, une cinétique typique est présentée par la figure 6.
Le calcul de l'activité spécifique de l'enzyme aboutit à une activité de 25 mUnités/min/mg de protéines. Ce chiffre est extrêmement faible comparé à ceux obtenus d'autres organismes : E.coli ou B. subtilis. Il est remarquable que si peu d'activité mène à un test macroscopique sur colonie si prononcé.
On effectue ensuite une étude de la cinétique de l'enzyme issue de la levure en fonction du pH pour la comparer à celle issue de E.coli. Les résultats (figure 7) montrent que les deux enzymes se comportent de manière identique, indiquant par là que la catéchol 2,3-oxygénase fabriquée par la levure a essentiellement les mêmes propriétés que celle fabriquée par les autres organismes.
EXEMPLE 8
Construction de pTG840
La construction du plasmide pTG840 est rappelée dans la figure 8. Le plasmide de départ est le plasmide pTG902 obtenu à partir de pBR322 par délétion des sites PstI et Ndel.
Par digestion de pTG902 et du plasmide portant le gène ura3 (ne possédant pas de site PstI) avec HindIII et ligation du produit de digestion, on obtient le plasmide pTG803.
Le plasmide 2μ de levure est mis en digestion avec
Avall et HindIII et les extrémités sont rendues franches par traitement avec la polymérase de Klenow. Ce fragment de 2μ Avall/HindIII est lige avec pTG803 digéré par SmaI pour fournir le plasmide pTG807.
Le gène ura3 et l'origine de réplication du 2μ sont libérés sous forme d'un fragment unique par digestion de pTG807 avec HindIII. Ce fragment est traité par la polymérase de
Klenow et cloné dans le site EcoRI de pBR322 traité de façon similaire pour donner pTG831.
Le gène de levure phosphoglycerate kinase (PGK) est muté de façon que le site unique BglII soit introduit à l'ATG d'initiation de la traduction de la protéine PGK. Le fragment HindIII/SalI (2,15 kb), comprenant le promoteur et le début de la région codante du gène correspondant à la phosphoglycérate kinase de levure, a été clone dans les mêmes sites du vecteur M13mp8. La création d'un site BglII au niveau de l'ATG initiateur de la phosphoglycératekinase a été effectuée suivant les techniques classiques de mutagénèse in-vitro (Gillam and Smith, 1979 gène 8, 99-106). Pour ce faire, un oligonucléotide synthétique, de séquence 5' ATATAAAACAAGATCTTTATC 3', a été utilisé afin de modifier la séquence originale 5' ATATAAAACAATGTCTTTATC 3 ' ; l'ATG initiateur est ainsi rendu non fonctionnel du fait de son remplacement par la séquence AGA.
Ce gène ainsi modifié est cloné dans le plasmide pTG831 pour donner le plasmide pTG832.
Le terminateur de PGK situé dans le fragment EcoRI/HindIII est clone dans le site PvuII de pTG832 après traitement de ses extrémités à la polymérase de
Klenow. Le plasmide résultant, pTG833, est mis en digestion avec BglII et recircularisé pour donner le vecteur d'expression final pTG834. Comme cela est indiqué précédemment, le site unique BglII dans ce vecteur est utilisable pour l'expression de gène hëtérologue dans la levure.
C'est dans ce site BglII que le fragment BamHI/BglII du gène pNeo est inséré par ligation.
EXEMPLE 9
Construction du plasmide pTG861 On prélève dans le plasmide pTG82l décrit à l'exemple 1 du brevet un fragment HindIIl/HindIII qui regroupe toutes les fonctions d'expression du gène xylE dans la levure et on l' introduit par digestion et ligation dans le site unique HindIII de pTG840. On obtient ainsi le plasmide définitif pTG861.
Les différents éléments de ce plasmide sont rappelés dans le tableau ci-après.
Figure imgf000029_0001
EXEMPLE 10
On utilise deux souches cultivées industriellement qui ne portent pas d'auxotrophie. L'une est utilisée en brasserie, l'autre en boulangerie. Ces souches ont été transformées par le plasmide pTG861 selon la méthode décrite par Hinnen et coll. (1978) avec quelques modifications : après le processus tel qu'il est décrit par ces auteurs, les protoplastes sont incubés 5 heures à 3O°C dans le milieu complet contenant du sorbitol (IM).
Après ce temps d'expression, ils sont mélangés à 10 ml de milieu complet à 45°C contenant du sorbitol (IM), 3 % d'agar. 10 ml du même milieu contenant 600 ug/ml de G418 pour la levure de brasserie et 2 mg/ml de G418 pour la levure de boulangerie sont coulés sur la première couche après une incubation de 6 à 15 heures à 30°C.
Cette manipulation est faite en parallèle avec ou sans ADN pTG86l.
On obtient ainsi des clones de levure résistant au G418, essentiellement sur les boîtes correspondant à la série avec ADN. Les fréquences sont cependant très faibles (de 1 à 1OO clones par boîte).
Les colonies obtenues sont repiquées sur du milieu frais avec antibiotique et sans sorbitol, puis mises au contact du catéchol selon la technique décrite dans l'exemple 4 du brevet. On trouve alors qu'une fraction importante des clones issus de la série avec ADN deviennent jaunes alors que tous les clones de la série sans ADN restent blancs. La présence ou l'absence de pTG861 dans les clones respectivement jaunes et blancs ont été vérifiées par la présence de β-lactamase dans les souches (Chevallier et coll. 1979). Un autre avantage de la méthode est lié à l'instabilité du plasmide (voir exemple 4). Les clones obtenus avec les souches de brasserie et de boulangerie sont cultivés sans antibiotique puis subclonés. Les populations de subclones sont analysées selon la même méthode rapide au catéchol. On peut voir alors très aisément l'apparition de clones dépourvus de plasmide. Cette application de l'invention peut être très utile, d'une part pour analyser des fermentations industrielles conduites avec de telles souches, d'autre part pour rechercher facilement des souches dépourvues de plasmide dans des manipulations de cotransformation (Rothstein, 1983).
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Claims

REVENDICATIONS
1. - Bloc d'expression de la catéchol 2,3-oxygénase dans une levure, caractérisé en ce qu'il comporte selon le sens de lecture et avec l'orientation correcte, au moins :
. un promoteur de levure,
. le gène xylE, et
. un terminateur de levure.
2. - Bloc d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur et le terminateur sont le promoteur et le terminateur du gène URA3+ dans
Saccharomyces cerevisiae.
3. - Bloc d'expression selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le gène xylE est inséré dans le site PstI du gène URA3.
4. - Bloc d'expression selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est limité par deux sites HindIII.
5. - Bloc d'expression de la catéchol-2,3-oxγgénase dans une levure selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte comme marqueur de sélection le gène de résistance à un composé chimique.
6. - Bloc d'expression selon la revendication 5, caractérisé en ce que le gène de résistance à un composé chimique est un gène de résistance à un antibiotique.
7. - Bloc d'expression selon la revendication 6, caractérisé en ce que le gène de résistance à un antibiotique est le gène de résistance à G418.
8. - Bloc d'expression selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le gène est sous la promotion d'un promoteur de levure et est terminé par un terminateur de levure.
9. - Bloc d'expression selon la revendication 8, caractérisé en ce que le promoteur et le terminateur de levure proviennent du gène PGK.
10. - Plasmide caractérisé en ce qu'il comporte un bloc d'expression selon l'une des revendications 1 à 9, et un système de replication autonome pour la levure.
11. - Plasmide selon la revendication 10, caractérisé en ce que le système de réplication autonome est celui du plasmide 2 μm de levure.
12. - Plasmide selon l'une des revendications 10 et II, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, un marqueur de sélection pour la levure.
13. - Plasmide selon la revendication 12, caractérisé en ce que le marqueur de sélection est le gène LEU2.
14. - Plasmide selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, un système de réplication autonome pour une bactérie.
15. - Plasmide selon la revendication 14, caractérisé en ce que le système de réplication autonome dans une bactérie est celui du plasmide pBR322.
16. - Plasmide selon l'une des revendications 12 à
15, caractérisé en ce qu'il comporte un marqueur sélectif pour une bactérie.
17. - Plasmide selon la revendication 16, caractérisé en ce que le marqueur sélectif pour une bactérie est un gène de résistance à un antibiotique.
18. - Plasmide selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisé en ce qu'il comporte au moins :
. le promoteur du gène URA3, . le gène xylE, . le terminateur du gène URA3,
. l'origine de réplication de pBR322, . le gène de résistance à l'ampicilline, . le gène LEU2, . tout ou partie du plasmide 2 μm.
19. - Plasmide selon l'une des revendications 12 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un site unique de restriction situé de façon telle que l'insertion d'un fragment d'ADN dans ce site inhibe la synthèse de la catéchol oxygénase.
20. - Plasmide selon la revendication 19, caractérisé en ce que ce site unique de restriction est situé dans le gène xylE.
21. - Plasmide selon l'une des revendications 19 et 20, caractérisé en ce qu'il comporte dans le site unique de restriction l'ADN codant pour une protéine.
22. - Souche de levure transformée par un plasmide selon l'une des revendications 10 à 21.
23. - Souche de levure caractérisée en ce qu'elle comporte un bloc d'expression selon l'une des revendications 1 à 9 incorporé sur son chromosome.
24. - Souche selon l'une des revendications 22 et 23, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Saccharomyσes ou de Schizosaccharomyces.
25. - Souche selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Saccharomyces cerevisiae.
26. - Souche selon l'une des revendications 22 et 23, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure de boulangerie ou d'une levure de brasserie.
27. - Catéchol 2,3-oxygénase obtenue par fermentation d'une souche selon l'une des revendications 22 à 26.
28. - Application des blocs d'expression selon l'une des revendications 1 à 9 et des plasmides selon l'une des revendications 10 à 21 à titre de marqueurs colorés dans les levures par intégration des blocs d'expression sur les chromosomes desdites levures ou par transformation desdites levures par les plasmides et détection de la catechol 2,3-oxygénase produite.
29. - Application selon la revendication 28, caractérisée en ce que la souche de levure marquée est une souche de levure utilisée en vinification.
30. - Application selon l'une des revendications 28 et 29, caractérisée en ce que la détection est effectuée par mesure de la fluorescence des souches produisant la catéchol 2,3-oxygénase.
31. - Application selon l'une des revendications 28 et 29, caractérisée en ce que la détection est effectuée par pulvérisation des souches par du catéchol et observation d'une coloration jaune pour les souches produisant de la catéchol oxygénase.
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