UA130005C2 - Біосенсорна система для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми - Google Patents

Abstract

Пропонований винахід належить до галузі біотехнології, аналітичної біохімії та медицини може бути використаний, зокрема, для високочутливого визначення олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми в біологічних рідинах з метою діагностування хронічної мієлоїдної лейкемії, а більш конкретно, до біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів (БСВО). В основу запропонованого винаходу поставлено задачу створення такої БСВО, яка б дозволила значно покращити мінімальну границю визначення методу, більш специфічно визначати вміст послідовностей олігонуклеотидів та була б більш перспективною для масового виробництва та застосування. Поставлена задача вирішується запропонованою БСВО, яка відрізняється тим, що складається з золотої пластини із іммобілізованими олігонуклеотидами mod-Ph, що комплементарні до ділянки олігонуклеотиду 80-mer BCR-ABL філадельфійської хромосоми та золотих наночастинок, поверхня яких вкрита олігонуклеотидами SH-DP, що комплементарні до іншої ділянки того ж олігонуклеотиду філадельфійської хромосоми, саму золоту пластину під'єднують до приладу на основі поверхневого плазмонного резонансу для визначення рівня гібридизаційної взаємодії. Порівняно з відомими біосенсорами, використання в роботі запропонованої БСВО, дозволило зі значно більшою чутливістю та значно меншою межею детектування визначати концентрацію 80-mer BCR-ABL в досліджуваному розчині. У випадку вимірювання концентрації 80-mer BCR-ABL запропонованою біосенсорною системою межа детектування була рівною 100 пМ, що в 500 разів менше, ніж у відомих біосенсорів. Чутливість системи - 1201×10-6 кут. град. /нМ, що в 6 разів краще за відомий біосенсор. Лінійний діапазон роботи запропонованої системи було посунуто у низькі концентрації на два порядки, що є більш перспективним задля застосування її для аналізу в реальних біологічних зразках.

Description

Пропонований винахід належить до галузі біотехнології, аналітичної біохімії та медицини, може бути використаний, зокрема, для високочутливого визначення олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми в біологічних рідинах з метою діагностування хронічної мієлоїдної лейкемії, а більш конкретно, до біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми.

Хронічна мієлоїдна лейкемія (ХМЛ) виникає внаслідок реципрокної транслокації між 9 та 22 хромосомами людини, що призводить до утворення гібридного гена ВСК-АВІ 1 і відповідного білка, який і є головним фактором розвитку захворювання |1.2|. На сьогодні найпоширенішими молекулярно- біологічними способами його детекції с методи з використанням геномних зондів (|З), полімеразної ланцюгової реакції І4Ї, флуоресцентної гібридизації іп ви (РІБН) |5Ї, "РСК іп сеї" |ЄЇ тощо.

Незважаючи па численні переваги зазначених методів, їхніми суттєвими недоліками є значна тривалість аналізу, трудоємність та висока вартість обслуговування (71.

Новітнім напрямом в діагностиці захворювань, викликаних точковими та хромосомними мутаціями є гібридизаційні ДНК-сенсори на основі специфічного зв'язування цільової ДНК з олігонуклеотидами певної послідовності, попередньо іммобілізованими на сенсорній поверхні, що безпосередньо генерує сенсорний сигнал. Наразі розробники таких систем, зокрема, Інститут молекулярної біології і генетики

ПАП України та Інститут фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НЛН України, застосовують для формування сенсорних сигналів метод поверхневого плазмонного резонансу (ППР) |8).

Метод спектрометрії поверхневого плазмонного резонансу (ППР) дозволяє детектувати нативні біомакромолекули в режимі реальною часу і без застосування молекулярних міток шляхом реєстрації змін діелектричних властивостей тонкого шару середовища, що прилягає до робочої поверхні сенсорного чипа, на якому іммобілізовано одноланцюгові олігонуклеотиди-зонди. Після формування нанорозмірного квазі-моношару олігонуклеотидів-зондів на сенсорній поверхні і при наявності у досліджуваному зразку цільових комплементарних послідовностей (мішеней) на поверхні сенсорного чіна відбувається їх гібридизація, що викликає відгук біосенсора (9,101.

Ефективність гібридизаційного ДНК-біосенсора залежить від кількості іммобілізованих одноланцюгових олігонуклеотидів-зондів та їх здатності до гібридизації з олігонуклеотидами-мішенями в досліджуваному зразку. Для іммобілізації тіольованих олігонуклеотидів на поверхні носія, покритого шаром золота, в попередніх роботах використовували умови запропоновані Негпе і Тапом (11) з деякими модифікаціями, а саме в розчині 0,5 М КНоРОх (рн 4) впродовж 60 хв (12). Вважається, що при низькій величині рН та високій іонній силі електростатичне відштовхування негативно заряджених ланцюгів ДНК мінімізується, що створює сприятливі умови для високої поверхневої концентрації тіольованих олігонуклеотидів на поверхні золота.

На даний момент у світі відомо про розробку низки біосенсорів для детекції послідовностей олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми. Зокрема Її та ін. (13| розробили вольтаметричний біосенсор на основі золотих наночастинок (АиМР5), синтезованих іп зйи на поверхні багатошарових вуглецевих нанотрубок, відомих своєю здатністю до переносу електронів. Такий підхід призвів до збільшення площі контакту біоселективного шару з досліджуваним зразком, що /дозволило встановити межу детектування специфічних олігонуклеотидів таким біосенсором на рівні 500 ФМ.

Електрохімічний біосенсор з винятково низькою межею детектування (69.4 ам) був розроблений

Амеїйпо та ін. (14). Він заснований на методі спектрометрії електрохімічного імпедансу системи з

А!йМР»5. занурених в поліанілін та зв'язаних із зондовими олігонуклеотидами. Оптичні аналізатори також успішно застосовуються для детекції специфічних послідовностей ДНК: наприклад, ППР- біосенсор, описаний Веїаззаї та ін. (15), здатен детектувати ДНК-мішені в аттомолярних концентраціях через посилення сигналу ППР наночастинками золота. Наночастинки золота впливають на відгук ППР не лише завдяки своїй великій молекулярній масі, а й шляхом генерування власного локалізованого поверхневого плазмону (16), що багатократно покращує аналітичні характеристики такої біосенсорної системи.

Згадані сенсори володіють певними недоліками: електрохімічні аналізатори є чутливими до концентрації заряджених молекул, яка може значно різнитися між біологічними зразками; біоселективні шари на основі складних полімерів є нестійкими та вимагають регулярної заміни, а золоті наночастинки діаметром З нм і менше, що часто використовуються для посилення сигналу біосенсорів, є цитотоксичними |17, 181.

Відомий і найбільш близький за технологією біосенсор на основі поверхневого плазмонного резонансу для детекції послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми описано в роботі

ІВЇ, де використано метод спектрометрії поверхневого плазмонного резонансу (ППР). Сенсорний відгук спектрометра ППР залежить від поверхневої концентрації молекул, адсорбованих на його чутливому елементі. Це дозволяє проводити прямі вимірювання концентрації певної ДНК-мішені в розчині, попередньо іммобілізувавши на чутливому елементі олігонуклеотиди-зонди, комплементарні до такої мішені. Однак, описаний пристрій недостатньо чутливий та селективний для аналізу реальних біологічних зразків, що містять послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми

(мінімальна границя визначення - 50 нМ, чутливість біосенсора - 195х105 кут. град. /нМ).

В основу запропонованого винаходу поставлено задачу створення такої біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми, яка б дозволила значно покращити мінімальну границю визначення методу, більш специфічно визначати вміст послідовностей олігонуклеотидів та була б більш перспективною для масового виробництва та застосування.

Поставлена задача вирішується запропонованою біосенсорною системою для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми, яка відповідно до пропозиції складається з золотої пластини із іммобілізованими олігонуклеотидами тод-Рі, що комплементарні до ділянки олігонуклеотиду 80-тег ВСК-АВІ. філадельфійської хромосоми та золотих наночастинок, поверхня яких вкрита олігонуклеотидами 5Н-ЮОР, що комплементарні до іншої ділянки того ж олігонуклеотиду філадельфійської хромосоми, саму золоту пластину під'єднують до приладу на основі поверхневого плазмонного резонансу для визначення рівня гібридизаційної взаємодії.

Біоселективний елемент біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми формується у вимірювальній комірці спектрометра ППР шляхом проходження афінних взаємодій, в які вступають три молекули ДНК. А саме: олігонуклеотид-зонд тоа-

Рпи (5Н-(СНг)-ОСТ БАА ооо СТ ТО ААС ТСТ ОСТ), комплементарний до 24-основної ділянки олігонуклеотиду-мішені 80-тег ВСК-АВІ (ТСА ТСО ТСС АСТ САС ССА СТО САТ ТТА АОС АСА ОТ

САД АДОо ССС ТТ АОС Ос СдОо ТАС САТ СТО АСТ ТО АОС Ст Ав), та другий олігонуклеотид- зонд 5Н-ОР (5Н-(СНг)є-ТТТ ТТ ТТ ОС ТОА СТО САС АТ СА), комплементарний до іншої ділянки мішені 80-тег ВСК-АВІ. довжиною 18 азотистих основ. Зонд тод-Рі! є іммобілізованим на сенсорній поверхні спектрометра ППР, а зонд 5Н-ОР - на поверхні наночастинок золота.

Відповідно, при наявності у вимірювальній комірці послідовності 80-тег ВСК-АВІ. відбуваються дві гіоридизаційні взаємодії, після чого детектується сенсорний відгук аналізатора шляхом порівняння рівня сигналу біосенсорної системи до та після введення в неї цільового розчину з послідовністю ДНК 80-тег ВСК-АВІ.. Використання АимМРз» як молекулярної мітки олігонуклеотиду 80-тег ВСК-АВІ. значно підвищує рівень сенсорного відгуку ППР, завдяки чому межа детектування біосенсора знижується на декілька порядків.

Суть винаходу пояснюється графічними матеріалами, де: на фіг. 1 показано схематичний вигляд біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми; на фіг. 2 наведено схему підключення біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми до експериментальної установки; на фіг. З показано приклад реального відгуку запропонованої біосенсорної системи на збільшення концентрації послідовності 80-тег ВСК-АВІ. в аналізованому середовищі; на фіг. 4 наведено калібрувальну криву для визначення концентрації послідовності 80-тег ВСК-АВІ у розчині з використанням запропонованої біосенсорної системи; на фіг. 5 наведено графік відтворюваності сигналів біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми.

Пропонована біосенсорна система 1 /БС/ для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми складається з золотої пластини (шар золота товщиною 50 нм на пластинці з оптичного скла) 2 /ЗП/ із іммобілізованими олігонуклеотидом тоа-РИ 3 /О-тоа-Рн/, що комплементарні до ділянки олігонуклеотиду філадельфійської хромосоми 4 /ОФХ/ та наночастинок золота 5 /НЗ/, поверхня яких вкрита олігонуклеотидами ЗН-ОР 6 /0-5Н-ОР/, що комплементарні до іншої ділянки того ж олігонуклеотиду філадельфійської хромосоми 4 /ОФХ)/ (Фіг. 1). У свою чергу, під час роботи біосенсорна система 1 /БС/ знаходиться у вимірювальній комірці (120 мкл.) 7 /ВК/, в яку за допомогою перистальтичного насосу 8 /ПН/ (фіг. 2) подається робочий буферний розчин 2х2«5560, досліджуваний зразок 9 /ДЗ/, тощо. Отримані результати по зміні резонансного кута ППР під час гіоридизації детектгуються двоканальним спектрометром ППР "Плазмон-б" в оптичній конфігурації

Кречмана, що розроблений в Інституті фізики напівпровідників імені В.С. Лашкарьова НАН України 10 /СППР/, далі обробляються спеціалізованою програмою "Віозиріаг" (Мімйес СтрН-Апа|уїїса! р-

Зузіетв, м/млм.ріозиріаг.ає) і виводяться на екран комп'ютера 11 /ПК/ (Фіг. 2).

Пропонована біосенсорна система для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми виготовлялася в два етапи: біофункціоналізації сенсорної поверхні спектрометра ППР та біофункціоналізації наночастинок золота. На обох етапах, функціоналізація золотої поверхні біомолекулами виконувалася за методом ковалентного зв'язування наночастинок золота з тіольними групами (5Н-) цих сполук. Висока афінність тіольних груп до атомів благородних металів дозволяє утворення стабільного ковалентного зв'язку І|19).

Для іммобілізації тіольованого зондового олігонуклеотиду тоа-Рі на золотій сенсорній поверхні, розчин 1 мкМ тод-Рп в 0,5 М КНоРОх (рН 3,8) вводився у вимірювальну проточну комірку та витримувався протягом 1 години. Після цього ділянки на поверхні золота, вільні від іммобілізованого тод-Рі, блокувалися шляхом введення 0,1 мМ водним розчином меркаптогексанолу протягом 10 хвилин.

Паралельно в складі біосенсорної системи використовувались АЛиМмР5, попередньо модифіковані тіольованими олігонуклеотидами 5Н-ОР та вищеописаними блокувальними молекулами у наступних умовах: розчин 2,5 НМ АиМР» та 0,75 мкм ЗН-ОР інкубувався протягом 12 годин в буферному розчині 0,1х55С2 (1,5 мМ цитрат натрію, 15 мМ масі, рН 7.0) при кімнатній температурі. Після цього до розчину додавалися аліквоти меркаптогексанолу та ліпоєвої кислоти, розведені в 0,ї1х550. Об'єм даних аліквот розраховувався таким чином, щоб у вихідному розчині концентрація кожної з двох блокувальних молекул дорівнювала 2 мкМ. Отриманий розчин інкубувався при кімнатній температурі протягом 1 години, після чого наночастинки відокремлювалися від незв'язаних тіольованих молекул шляхом центрифугування при 13000 об/хв протягом 30 хв., відкидання супернатанту та ресуспендування осаджених АиМР» в буферному розчині 0,2х555.

Співвідношення компонентів запропонованої біосенсорної системи та умови її функціонування було отримано експериментально. їх підібрали для покращення аналітичних характеристик біосенсорної системи, таких як чутливість до 80-тег ВСК-АВІ, специфічність відносно не комплементарних олігонуклеотидів, ефективність регенерації, відтворюваність сигналу та ін.

Пропонована біосенсорна система для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми працює наступним чином. На початку кожного експерименту з детекції 80-тег ВСК-АВІ. виконуються наступні дії: для отримання стабільної базової лінії сенсорна поверхня функціоналізована зондами тод-Рпй (що повністю комплементарні до 80-тег ВСК-АВІ) ретельно промивається проточним буферним розчином 2х555 (30 мМ цитрату натрію, 300 мМ Масі, рн 7). Всі наступні досліди проводяться в цьому ж розчині. Далі досліджуваний зразок, що містить олігонуклеотид 80-тег ВСК-АВІ. у певній концентрації, вводиться у вимірювальну проточну комірку та витримується 10 хв, що призводить до відгуку системи (Фіг. 3). Після цього, задля підвищення сенсорного відгуку на 80-тег ВСК-АВІ,, проводиться введення біофункціоналізованих ЛиМмРе5 (АиМРз- 5Н-ОР) концентрацією 450 пМ та інкубація біосенсорної системи протягом 1 години (Фіг. 3). Що більша кількість 80-тег ВСК-АВІ. з досліджуваного зразка осяде та іммобілізується на сенсорній поверхні, тим стрімкіше проходить гібридизаційна взаємодія з ЛиИМРь-5Н-ОР, тобто тим швидше зростає рівень сигналу, зареєстрованого спектрометром ППР. Визначення сенсорного відгуку на введення досліджуваного зразка виконується шляхом порівняння рівня сигналу ППР до введення досліджуваного зразка з сигналом ППР після закінчення інкубації біосенсорної системи (Фіг. 3). Для повторного використання біосенсорної системи необхідно розірвати зв'язки між гібридизованими ланцюгами ДНК додатковим введенням водного розчину 8 М сечовини.

Шляхом додавання до вимірювальної комірки із біосенсорною системою різної кількості модельних розчинів 80-тег ВСЕ-АВІ. з різною концентрацією було побудовано калібрувальну криву біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми (Фіг. 4).

Приклад аналізу послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми в реальному біологічному зразку. Спочатку отримували залежності величин сигналів біосенсорної системи від концентрації цього олігонуклеотиду в досліджуваному розчині - одержували калібрувальний графік (фіг. 4). Для визначення умовно невідомої концентрації олігонуклеотиду 80-тег ВСК-АВІ в досліджуваному розчині, вносили досліджуваний розчин (імітація реального зразку) та отримували відгук біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми. Величина відгуку біосенсорної системи прямо пропорційно залежить від концентрації 80- тег ВСК-АВІ в зразку в діапазоні 100 пМ - 100 нМ, і за калібрувальною кривою визначаємо концентрацію 80-тег ВСК-АВІ, яка співпадає з умовно невідомою концентрацією цього олігонуклеотиду у досліджуваному розчині. Задля підтвердження високої відтворюваності сигналів запропонованої біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми, було отримано 12 відгуків біосенсорної системи на додавання у вимірювальну однакової концентрації - 80 нМ 80-тег ВСК-АВІ (Фіг. 5). Як видно з графіку, система мала добре відтворювані відгуки з похибкою вимірювання К5О-7,6 95.

Порівняно з відомим біосенсором |8|, використання в роботі запропонованої біосенсорної системи для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми, дозволило зі значно більшою чутливістю та значно меншою межею детектування визначати концентрацію 80-тег ВСК-АВІ. в досліджуваному розчині. У випадку вимірювання концентрації 80-тег ВСК-АВІ запропонованою біосенсорною системою межа детектування була рівною 100 пМ, що в 500 разів менше, ніж у відомого біосенсора |8). Чутливість системи - 1201х1055 кут. град. /нМ, що в 6 разів краще за відомий біосенсор.

Лінійний діапазон роботи запропонованої системи було посунуто у низькі концентрації на два порядки, що є більш перспективним задля застосування її для аналізу в реальних біологічних зразках.

Джерела інформації: 1. МомжеїІЇ, Р.С, 5 Нипдегога, О.А. (1960). Спготовзоте 5ішаіе5з оп погтаї! апа ІешКетіс питап

ІеиКосуїез. Уошигпаї ої (пе Майопа! Сапсег ІпзІйШе, 25, 85-109. 2. КоулЛеу У.О. (1973). ГеЦег А пем/ сопвівїепі спготозота! абпогітаїйу іп спгопіс туеіодепои5

ІеиКаєтіа ідепійей Бу дпиіпасгіпе ПЯногезсепсе ап Сіетвза бвіаіїпіпу. Майшге, 243(5405), 290-293.

пере: //доїі.огд/10.1038/243290а0. 3. зош йет Е.М. (1975). ЮОеїесіоп ої 5ресійс зедоепсе5з атопд ОМА Ігадітепів зерагаїед ру деї еІесігорпогевів. Уоигпаї ої тоїІесціаг Біоіоду, 98(3), 503-517. перз://дої.огд/10.1016/50022-2836(75)80083- 0. 4. Телегеєв Г.Д., Дубровська А.М., Дибков М.В., Мачило В.М., Гартовська І.Р. (2000). Діагностика

Рі" лейкозів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Гематологія та трансфузіологія, 1, 37-40. 5. Ткаспик, О.С, УуезібгоокК, С.А., Апагееїйї, М., Юопіоп, Т.А., СІвагу, М.Г., з,игуапагауап, К., Нотае,

М., Кедпег, А., Огау, у., « РіпКеї, ОЮ. (1990). Оєїесійоп ої рег-арі Тивіоп іп спгопіс туеіодепеоиз ІениКетіа ру іп 5ІШ пубгіаігайоп. зЗсіепсе (Мем Уогк, М.У.), 250(4980), 559-562. пере: //доїі.огд/10.1126/5сіепсе.2237408. 6. Тевіопі, М., Мапіпеїїї, с., Рагабеодоїї, Р., 7ассагіа, А., Атабііе, М., Казрадогі, О., Реїсопі, 5., 2йшМа,

Е., Сагропі, С., 5. Тига, 5. (1996). А пем/ теїпоа ої "іп-сеї! гемегзе Ігапзсгіріазе-роїутегазе спаїп геасійоп"

Тог Ше адеїесіюп ої ВСК/АВІ. Ігапзсегірі іп спгопіс туеїоій ІеиКетіа райепів. Віоса, 87(9), 3822-3827. пере: //доїі.огд/10.1182/бІоса.У87.9.3822.ріоодіоигпаІ8793822. 7. Рооп, 5. 5., 5 Іапзаогр, Р. М. (2001). Оцапійайме Пиогезсепсе іп 5йи пургіаіїгайоп (О-РІБН).

Ситепі ргоїосої5 іп сеї! Біоіоду, 12(1), 18-40. перз://дої.огоа/10.1002/0471143030.ср1804512. 8. Маїбвівзпіп, М.9У., О5Пепіп, І.иМ., КасиКом, А.Е., 5 зЗоїаїКкіп, А.Р. (2016). 5РК Оеїесіп апа

Оівсгітіпайоп ої (Ше ОІідописіеоїіде5 КеїЇаїеуд їо Ше Могта! апа (Ше Нубгій рсг-арІі Сепе5 Бу Тмо

Зііпдепсу Сопіго! Зіга(едіез. Мапозса|е гезеагсп ІеЦеге, 11(1), 19. перз://дої.огд/10.1186/511671-016- 1226-у. 9. Нотоїа, 9. (2008). БипПасе ріазтоп гезопапсе зепзоге5 Гог деїесіоп ої спетіса! апа Біоіодіса! зресіез. Спетісаї геміемув, 108(2), 462-493. пЕрз://дої.ога/10.1021/сг0681074. 10. Рачков О.Е, Холодова Ю.В., Дибков М.В, Телегеев Г.Д., Солдаткін О.П. (2009). Формування та дослідження біоселективного елементу сенсора поверхневого плазмонного резонансу для розпізнавання специфічних олігонуклеотидних послідовностей. Зепзог ЕІесігопісв апа Місгозузїет

Тесппоїіодіев, 4, 63-72. 11. Непте, Т. М, « Тапом, М. У. (1997). Спагасіегігайноп ої ОМА ргобез іттобіїйей оп доїй зигпасев.

Удоигпаї ої (Пе Атегісап Спетісаї босієїу, 119(38), 8916-8920. пере: /дої.ого/10.1021/Ла9719586. 12. Регегзоп, А. МУ., Неаоп, К. у)., « Сеогдіадів, К. М. (2001). Тне ейесі ої зипасе ргобе депзйу оп

ОМА Пубгіаігайоп. Мисієїс асіаз гезеагсі, 29(24), 5163-5168. перзе://дої.ого/ 0.1093/паг/29.24.5163. 13. 1, 5., Мапд, Г., П, М., Пи, Х., 2попо, Г., Си, Г., 2Напо, МУ., Ми, В., Хіє, б., 5 Репод, МУ. (2013).

ЕІесігоспетіса! дегептіпайоп ої ВСК/АВІ. Тив5іоп депе Базеа оп іп зйи зупіпезі7ей доїа папорапісіез апа сепцт аіїохіде папорагісіез. СоМПоїй5 апа зципасе5. В, ВіоіпіепПасе5, 112, 344-349. пере: //доїі.ого/10.1016/).соівипЬ.2013.07.027. 14. Амеїїпо, К. У. Р. 5., Егіаз, І. А. М, Гисепа-5іЇма, М., ботезв, К. б., де Меїйо, С. Р., ОїЇїмеіга, М.О. Ї.., 84, Апагаде, С. А. 5. (2016). Анотоїаг еІесігоспетісаї! адесесіїоп ої їе ВСК/АВІ. Тизіоп депе разей оп ап атрійуїпд зеїг5ідпа! тега! папорапісіе-сопдисіїпд роїЇутег пубгій сотрозйе. СоПоїаз апа зипасез. В,

Віоіпіегпасевз, 148, 576-584. пере: //дої.огд/10.10161).соівитЬ.2016.09.029. 15. ВеПаззаї, М., С'Адаїа, К., Магії, А., Ко7і, А., Моїірі, 5., АПедгейі, М., Соїтадіпі, К., Сіасотіпі, Р.,

НизхкКепв, -)., 5 рою, 0. (2021). Оеїесіоп ої Титог ОМА іп Нитап Ріазіта м/йй а Рипсіопаї! РІ -Вазей зипПасе Ї ауег апа Ріазітопіс Віозепвзіпд. АСс5 зепзоїгв, 6(6), 2307-2319. пере: //доїі.огд/10.1021/ас55епзоїгз.1с00360. 16. К. І апсе КеПу, Едиагао Согопадо, Гіп іп 7пао, Сеогде С. Зспаї? (2003). Те Оріїсаї! Ргорегпієв ої

Мета! Мапорапісіез: Те ІпПйепсе ої 5іге, ЗПпаре, апа ОіеїІесігіс Епмігоптепі. Те Уошигпа! ої РНузісаї

Спетівігу В 107 (3), 668-677. пЕре://дої.ога/10.1021/Лро26731у. 17. Аікіапу, А. М., 5 МигрпНу, С. У. (2010). Тохісйу апа сейПаг иріаКе ої доїй папорапісіев: мпаї ме

Ппаме Івагпеа 50 Таг? доигпаї ої папорапісіє гезеагсі: ап іпіегаізсірііпагу Тогит ог папозсаїе зсіепсе апа

Іесппоіоду, 12(7), 2313-2333. пирз://дої.ога/10.1007/511051-010-9911-8. 18. боодтап, С.М., МеСизкКег, С.О., МіІта, Т., 5 КоїейПо, М.М. (2004). Тохісйу ої доїд папорапісіе5

Типсіопаїйлей й сайопіс апа оапіопіс іде спаіпб5. Віосопійпдафе сПпетівїгу, 15(4), 897-900. перз://дої.ога/10.1021/ос0499511. 19. Заззоїав, А., І еса-Вошмієг, В.О., 5 Вішт, С. 9. (2008). ОМА Біозепзоїз апа тісгоагітауз. Спетісаї геміему5, 108(1), 109-139. пере: //дої.огоа/10.1021/сг0684467.

о,

ЗХ у шо х жк Фк Кетку дод п Сан; лк

Я хх днк що Ж ех ; ї они еу

К : ГУ й Є з 7 з 3 ! ; й ( х о і у ве ї ; С : ї ї її : У З У : ії Її

У р Ї ї ї я й

Ж й Е ї х С є і і : і ; як сої х х х х і й Зайнецьену ї

ААУ у

Є ; : А КО

Е ї Я Х к й Я і 4 і і З ї

КОН о в пе

Ми М

ЗЕОККОВ вра

Фіг. 1 : о ! П ! : ши а в : зла А : КО В і : НН я : ї МИТИ МИПИИИ : І : ВЖЕ : : : ПИЙИМТ МРПГЦИТИПИ УМ ИЩИУТТиХ : і о. ! ше ! : ОБ я

СО о ще ЗУ і : РОБ п КО

ОМ Мі їх т і : ко 1 БО спро Ж : ЕЕ КК події ті Ту 1 оре ї КИ ПИ пИЩЕ ОЇ : ВЕН я Ї Меню ОЇ Тк, М ОЛУВКУ Р бос РО фо ЖК о ші ен : Бо : ДАНКО ї рого штор : РОВІ : ; : роти шою ТЕ : : вою : і яп; : : Смт Я й і ШИ : їх х

Фіг. 2

Уа : с ї . х мл . и : - и що шля : 2 ї : «А: - Я - : : : - : : : ї : хі: і. :

ІБ пре ТЖИН Й МЕЖ же : «кі: копи ЕК СИ н

ТК : ДОН вай : : зі . 2 . МАКТИНОТИМ І І меди Мор ДА сирне : : змісти код дек ля ; пдеиМ . й : . :

ПЕ п ТОЩО. ДЕ ї І

ПЕЖЕЖІ Мі ОККО Коли, : пиАЖИМ : : ї

ФЕЕКиит дулю : ПИТ : :

ШЕМЕЕ и ТЕЖ КТ УНК флот ТТ и : и и ї : ї

МНЕ ї й ща ДИН ЦИ п с с с с п с полимиМт с У т. Ши ї

ПІДХО, МН ШК 7 ПИПИМИ ЦИ ПИЙ ПИШИ шию еИге ит ПЛ ла ноу

ПЕВНО : : т : г т ї : а и ОО 1

ПЕКИ ПЛ ППКП МИТ с ї : п ПО ие Вени цеЕН МТ,

КМ Ш МВ КВІНКЕ Біти ен

ПИВ КИШКИ ЛИПИ г І ППИМИНИМИТИТТ т ПО МИ 1

ОХДЮВНИН В КН НЯ штдекк фот орицлтиоу

ПВП КП И ЖИЛИИИПИИПИЛИИИИИИЛИИИИТ с п т. У т. : ТИМИ МКУЖУМІКМ Ки щі

ПЕКУН КИ ДПП ПИТ ПЛИТ ПИЛА М Тл пу

ПКУ ЕХ ЗОВ внннв ння : : : пдччук нн кт кими

ПІК скрорхужкх У ПЕН ИН ї ї х. я ї :

СУ фей СКОБ о В : : - я - : тота пи ІТИ ЕК ИИИИ : ой : : ПИЙ : : : і

ПИТИ 0 ижхдв КЕЛИХ с : : : : ї ї

ПУХУ ОМОЯеНКМ роком п : о я ТЛІ ВІИ : : ї і 1

ШОКУ ВІТА АЕН ОК ПИ ДИ с т 7 І : ї ї

ПІШКИ я ї ПН ПИЛИП ПИ ДИНИ ДИНИ п : ЩЕ тон ї

ПІДЕ КПП ППП ППП ЛИПИ пт т ПДПЛИПИШИЦИИИИНИПИДИПИЦИКИТЕ с с : г пл І

ПН ИН ПИЛИП ККД ДПИП ДИПИИИИИИИлИлИ : пт ї

ЕКО КК ППП КОНИКИ КПІ ЕШЛІ ПІ пдККнНя

ПИВККІ ИН ДК НКВД КИЕВ КПК НИ ЕП КИШКИ

ВЕК ЕК КИ НИ и ПИ НИ НП І ИН НИ МИ КМ К ТКЛТІ ї

МИМЕИЦЕ КИ ДПП ИИЛИИПІКИИШИ ТИЛ : ПИЖИИКХ ї

ПДЖуИН НВК ПІДПИПИПИИИИКИИИИИДОТ в о ооо а

ПИШЕ КК КК КК ВК КК КК КК КК КК КК НК КК ПК КПІ КЖ ПК КВ КК ЕК ТК ЖИ ЖК ЖОВТИМ

Фіг. З

Бе : ппдленн : І п чжж КахУ ик КІМ ИК : ї для МКК МКОЦІВХ КИТИ зн: ї ле - -

МК: х дих шт . : : Ї ши МІ ЖК ИК нав МИи МКК ; Ж х У - : ї

Ух. : ї

Мод Ї ше ЩО: Її

КОЖ: З х ї х

З Х

ГУ Ж

У М

Кк ї : й

КО т:

Що ТІ

МО т ще С

Х Зі

Ж їх

Ж К:

З Кі;

КУ - й я;

Ж яд Ку : "а ЛЮ ОК їх Її:

Го І;

Ко НУ хх ПЕ 3: го доб: її дики ПКЕЕ К МК УМХ ММ ТЕТ МИХ х. ди т В АХ САЖІ МЛ п ЕЖІ ХА ТИХІ Ж каное вація Кк вва В

Ж уд луствучіяі шій течі ті СК і Ж ЖИ рухи МИТІ й БІ сенсовні п уки на во М тег ВСТАВ, ще і

Я Я

: ж. а ї Бе

ОБЖ 0. . . 0. .

ОК: Ж - Ж хо : Я о КУ

Ж : Ж ж сх : У х сх у з ЕК»

Ж : ву : п я ї к : :Щ : о :

Я ож ди

Яр : хе : вх їх ту КУ с с їх

М Я й їх х М . ї се . х коди є. ч Є

МНежер послижуваНнОоГгО ЗрааКа

Фіг. 5

Claims (1)

1. Біосенсорна система для визначення послідовності олігонуклеотидів філадельфійської хромосоми, яка відрізняється тим, що складається з золотої пластини з іммобілізованими олігонуклеотидами тод-Рй - 5Н-(СНо)-ОСТ САА СОС СТТ ТТО ААС ТСТ ОСТ, що комплементарні до ділянки олігонуклеотиду 80-тег ВСК-АВІ., - ТСА ТСО ТСС АСТ САО ССА СТО САТ ТТА ДОС АбСА СТТ САА АдДАО ССС ТТ ДОС СОС САС ТАС САТ СТО АСТ ТТОо АОС СТС АС, філадельфійської хромосоми та золотих наночастинок, поверхня яких вкрита олігонуклеотидами 5Н-ОР - 5Н-(СН»)6-ТТТ ТТ ТТ СОС ТОМА СТО САС САТ СА, що комплементарні до іншої ділянки того ж олігонуклеотиду філадельфійської хромосоми, саму золоту пластину під'єднують до приладу на основі поверхневого плазмонного резонансу для детекції рівня гібридизаційної взаємодії.