[go: up one dir, main page]

UA121881C2 - Кон'югат антитіло-уреаза для терапевтичних цілей - Google Patents

Кон'югат антитіло-уреаза для терапевтичних цілей Download PDF

Info

Publication number
UA121881C2
UA121881C2 UAA201708582A UAA201708582A UA121881C2 UA 121881 C2 UA121881 C2 UA 121881C2 UA A201708582 A UAA201708582 A UA A201708582A UA A201708582 A UAA201708582 A UA A201708582A UA 121881 C2 UA121881 C2 UA 121881C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
urease
antibody
conjugate
domain antibody
aspects
Prior art date
Application number
UAA201708582A
Other languages
English (en)
Inventor
Еман Чао
Ва Яу Вонґ
Ва Яу ВОНГ
Баомінь Тянь
Баоминь ТЯНЬ
Кімберлі Джейн Ґаспар
Кимберли Джейн ГАСПАР
Правін Кумар
Правин КУМАР
Original Assignee
Гелікс Байофарма Корп.
Геликс Байофарма Корп.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Гелікс Байофарма Корп., Геликс Байофарма Корп. filed Critical Гелікс Байофарма Корп.
Publication of UA121881C2 publication Critical patent/UA121881C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01005—Urease (3.5.1.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується кон'югату антитіло-уреаза, який можна використовувати в терапії. Більш конкретно, винахід стосується терапевтичних кон'югатів, які одержують шляхом кон'югування одного або декількох антитіл з уреазою, а також їхнього застосування в способах діагностики і лікування захворювань.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується кон'югату антитіло-уреаза, який можна використовувати в терапії. Більш конкретно, винахід стосується терапевтичних кон'югатів, які одержують шляхом кон'югування одного або декількох антитіл з уреазою, а також їхнього застосування в способах діагностики і лікування захворювань.
Дана заявка заявляє пріоритет на підставі дати подачі попередньої заявки США Мо 62/107210, поданої 23 січня 2015 року. Зазначена заявка включена в даний опис шляхом посилання.
Список послідовностей
Дана заявка містить список послідовностей, представлений в електронному вигляді у форматі АЗСІЇ, який повністю включений у даний опис шляхом посилання. Зазначена копія
А5СІЇ, створена 14 січня 2016 року, називається 105013-1610 51. і має розмір 11000 байт.
Галузь винаходу
Даний винахід надає кон'югати антитіло-уреаза, які можна використовувати в терапії. Більш конкретно, винахід стосується терапевтичних кон'югатів, які містять одне або кілька антитіл, кон'югованих з уреазою, композицій, які їх містять, а також способів їхнього застосування й одержання.
Рівень техніки
Уреаза являє собою фермент, який каталізує гідроліз сечовини з утворенням діоксиду вуглецю й аміаку. Більш конкретно, уреаза каталізує гідроліз сечовини з утворенням аміаку і карбамату, а зазначений карбамат розкладається в результаті спонтанного гідролізу з утворенням іншої молекули аміаку і карбонової кислоти. У даному зв'язку активність уреази сприяє підвищенню рН місцевого середовища в результаті утворення аміаку, що являє собою основну молекулу, яка має загальну токсичність.
Концепція застосування антитіл, специфічних до пухлиноасоційованих антигенів, для лікуванні раку перевірялася протягом деякого часу (Непуп еї аї!., (1980) Сапсег Кезеагсп 40, 717). Уреаза забезпечує токсичний компонент, яким є лужне середовище, що утворюється в результаті ферментативної деградації сечовини, крім того, використовують фрагменти антитіл, які мають високу спорідненість.
Суть винаходу
Технологія даного винаходу спрямована на кон'югат антитіло-уреаза. Даний винахід надає фармацевтичну композицію, що містить фармацевтично прийнятний водний розчин, що підходить для внутрішньовенного введення, і кон'югат антитіло-уреаза, що практично не містить уреазу, некон'юговане антитіло і/або неводні розчинники, використовувані для ВЕРХ.
У деяких аспектах кон'югат характеризується коефіцієнтом кон'югації, який складає 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів антитіла на фрагмент уреази. У деяких аспектах кон'югат характеризується коефіцієнтом кон'югації, що складає приблизно б або більше фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах кон'югат характеризується коефіцієнтом кон'югації, що складає 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів антитіла на фрагмент уреази. У деяких аспектах кон'югат характеризується коефіцієнтом кон'югації, що складає 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах кон'югат характеризується середнім коефіцієнтом кон'югації, що складає приблизно 6 або більше фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах кон'югат характеризується середнім коефіцієнтом кон'югації що складає приблизно 8-11 фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах уреаза являє собою уреазу бобових.
У деяких аспектах антитіло являє собою гуманізоване або нелюдське антитіло. У деяких аспектах молекулярна маса антитіла складає приблизно від 5 кДа до 200 кДа. У деяких аспектах молекулярна маса антитіла складає приблизно від 5 кДа до 50 кДа. У деяких аспектах антитіло являє собою однодоменне антитіло. У деяких аспектах розмір однодоменного антитіла складає не більше 110 амінокислотних залишків, або приблизно від 90 до 130 амінокислотних залишків. У деяких аспектах молекулярна маса однодоменного антитіла складає приблизно від 10 кДа до 50 кДа. У деяких аспектах молекулярна маса однодоменного антитіла складає приблизно від 12 кДа до 15 кДа. У деяких аспектах антитіло має специфічність до антигену пухлинної клітини. У деяких аспектах антитіло має специфічність до пухлинного антигену, який експресується клітинами недрібноклітинної карциноми легені. У деяких аспектах антитіло має специфічність до СЕАСАМб.
У деяких аспектах антитіло має спорідненість до СЕАСАМб, що характеризується значенням Ка, яке не перевищує приблизно 1х106 М. У деяких аспектах кон'югат має спорідненість до СЕАСАМ6б, що характеризується значенням Ка, яке не перевищує приблизно 1х108 М. У деяких аспектах кон'югат має спорідненість до СЕАСАМб, що характеризується значенням Ка, яке не перевищує приблизно 1х1079 М. У деяких аспектах кон'югат має спорідненість до СЕАСАМБб, що характеризується значенням ІСхо, що не перевищує приблизно 5 НМ. У деяких аспектах значення ІСзхо складає приблизно від З нМ до 5 нМ. У деяких аспектах значення ІСсо складає приблизно 3,22 нМ. У деяких аспектах кон'югат зв'язує СЕАСАМЄБб зі 60 значенням ІСво приблизно від 10 мкг/мл до 30 мкг/мл. У деяких аспектах кон'югат зв'язує
СЕАСАМЄВ зі значенням ІСзо приблизно 20 мкг/мл.
У деяких аспектах антитіло містить поліпептид, який має амінокислотну послідовність зХЕО
ІО МО. 1. У деяких аспектах антитіло містить поліпептид, амінокислотна послідовність якого містить щонайменше одну зміну в порівнянні з ХЕ ІО МО. 1.
Технологія даного винаходу надає спосіб лікування раку в індивідуума, який потребує цього, що включає введення індивідууму терапевтично ефективної кількості описаної тут композиції, що забезпечує лікування раку в індивідуума.
У деяких аспектах рак являє собою одне або кілька захворювань, вибраних з недрібноклітинної карциноми легені, раку молочної залози, підшлункової залози, яєчника, легені, товстої кишки, або їхнього сполучення. У деяких аспектах рак являє собою недрібноклітинну карциному легені. У деяких аспектах індивідуум являє собою людину.
Технологія даного винаходу надає спосіб одержання композиції, що містить кон'югат антитіло-уреаза і по суті не містить уреазу, причому цей спосіб включає об'єднання активованого антитіла й уреази у водному буфері, що має рН приблизно 6,0-7,0, наприклад приблизно 6,5, доведення рН до 8,0-9,0, наприклад приблизно до 8,3, з одержанням кон'югата антитіло-уреаза й очищення кон'югата антитіло-уреаза, де спосіб не включає стадію хроматографічного очищення, такий як широко використовувані хроматографічні способи очищення білків, наприклад гель-хроматографія (ЗЕС), іонообмінна хроматографія, афінна хроматографія, афінна хроматографія з використанням іммобілізованих металів, імуноафінна хроматографія, хроматографія з адсорбцією рідини на твердій речовині, хроматографія з гідрофобною взаємодією (НІС), хроматографія на зворотній фазі (КРОС), високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) і т. д. У деяких аспектах кон'югат антитіло-уреаза очищають ультрадіафільтрацією.
У деяких аспектах кон'югат антитіло-уреаза характеризується коефіцієнтом кон'югації 8-11 фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах буфер, що має рН приблизно 6,5, являє собою натрій-ацетатний буфер. У деяких аспектах рН доводять приблизно до 8,3 шляхом додавання розчину борату натрію.
Технологія даного винаходу надає спосіб підвищення спорідненості антитіла до пухлинного антигена, що включає кон'югування декількох молекул антитіл з молекулою уреази з
Зо утворенням кон'югата антитіло-уреаза, де спорідненість кон'югата до пухлинного антигена щонайменше приблизно в 100 разів перевищує спорідненість некон'югованого антитіла.
У деяких аспектах антитіло являє собою гуманізоване або нелюдське антитіло. У деяких аспектах антитіло являє собою однодоменне антитіло. У деяких аспектах пухлинний антиген експресується клітинами недрібноклітинної карциноми легені. У деяких аспектах антитіло має специфічність до СЕАСАМб.
Технологія даного винаходу також надає набір, що містить описану тут композицію й інструкції з застосування композиції.
Ці й інші аспекти винаходу більш детально описані нижче.
Короткий опис креслень
На фіг. 1А-В зображені результати досліджень зв'язування і цитотоксичності І! -00547 на лініях ракових клітин. (А) Безпосереднє зв'язування І-00547 з п'ятьма лініями ракових клітин:
ВХхРО-3, Сарап-ї, 2728-75-30, 15174Т і МОА-МВ231. Сигнал, що свідчить про наявність зв'язування, являв собою кількість аміаку, який утворюється при інкубації з 20 мМ сечовиною. І - роБа7 добре зв'язується з клітинами ВхРОС-3 (ее), Сарап-1ї (Ж) ії 2К-75-30 (9), помірно зв'язується з клітинами І 5174Т (А) і не зв'язується з клітинами МОА-МВ231 (ш). Крім того, відсутнє зв'язування відповідних клітинних ліній з некон'югованим контролем 0О547 (дані не показані), дозволяючи припустити, що зв'язування Ї/-0О0547 є специфічним і зумовлюється фрагментом антитіла. (В) І-00547 індукує цитотоксичний ефект у лініях ракових клітин після додавання 20 ммоль сечовини. У клітинах МОА-МВ231 ніякі ефекти не спостерігаються (ш), ЩО узгоджується з результатами дослідження зв'язування. ВхРС-3 (ее) і 2К-75-30 (9) є дуже чутливими до Г-00547, тоді як у клітинах Сарап-1 (Ж) і 15174Т (А) виявлені лише помірні ефекти.
На фіг. 2А-В показані результати аналізу безпосереднього і конкурентного зв'язування |І- робза47, 00547 і антитіла АРАЇКІ2 із клітинами ВхРО-3. (А) Зв'язування міченого рутенієм І-
МроОБ547, антитіла АБАЇКІ2 і некон'югованого 0О547 із клітинами ВхРСОС-3. За допомогою електрохемілюмінесцентного аналізу можна безпосередньо вимірити зв'язування І-00547 і антитіла АРАЇКІ 2 із клітинами ВхРС-3. Антитіло АРАЇКІ 2 дає слабкий сигнал зв'язування (А), тоді як /-00547 індукує набагато більш сильний сигнал зв'язування (е) внаслідок авідності декількох антитіл АБАЇКІ2, що входять до складу кон'югата. Зв'язування з негативним бо контролем 0О547 відсутнє (. (В) І-00547-мітка конкурує за зв'язування з клітинами ВхРО-3 з
І-00547, антитілом АРАЇКІ2 або БО547. Уявну спорідненість !-00547 і антитіла АЕРАЇКІ 2 можна порівняти за допомогою ІСво (кількість конкуруючої сполуки, необхідна для зменшення зв'язування на 50 95) тестованих сполук. Визначають значення ІСхо для І-00547 (е) і антитіла
АЕАЇКІ 2 (А), що складають 2 і 20 мкг/мл (або 3,22 нМ і 1,55 мкМ) відповідно, свідчачи про те, що спорідненість І-00547 приблизно в 500 разів перевищує спорідненість антитіла АЕРАЇКІ 2.
Негативний контроль 00547 не викликає інгібування (5). Результати представлені у вигляді середнього значення від декількох (п-3) типових експериментів.
На фіг. З А-С зображені результати, які ілюструють підвищену експресію і нокдаун гена
СЕАСАМБб. (А) Зв'язування І-00547 з СЕАСАМб-трансфікованими клітинами Н23. Популяцію збагачують трансфікованою клітинною лінією (А) шляхом сортування клітин методом ЕАС5 поряд із застосуванням підвищеної кількості антибіотика, використовуваного для селекції.
Профіль зв'язування в порівнянні з нативними клітинами Н2З (0) і клітинами А5б49 (р) демонструє, що СЕАСАМ6б експресується в трансфікованих клітинах на більш низькому рівні, ніж у клітинах А549. (В) Аналіз цитотоксичності Ї-00547 відносно клітин Н23, трансфікованих
СЕАСАМб. Надекспресія СЕАСАМб у клітинах Н2З (А) значно підвищує їхню чутливість до цитотоксичності І -00547 у порівнянні з ВХРО-3 (ее), АБ549 (р) і нативними клітинами Н2З (0).
Цікаво, що трансфіковані клітини Н2З3 є більш чутливими до цитотоксичності Ї-00О547, ніж клітини А549 і ВХРО-3, незважаючи на більш слабке зв'язування І-00547, виявлене в (А). (С)
Зв'язування І -00547 із клітинами ВхРОС-3, що несуть нокдаун гена СЕАСАМБб. Інтенсивний сигнал зв'язування спостерігається в нативних (є) і контрольних (НОБН-ТАЗ А) клітинах ВхРО- 3. Однак зв'язування І-00547 зменшується після сайленсингу гена СЕАСАМБ6б під дією кшРнНкК (НОБНЯЄ ж ії НОЗНЯ7 р), свідчачи про те, що СЕАСАМб є поверхневим антигеном, розпізнаваним кон'югатом, що містить антитіла. Результати представлені у вигляді середнього значення від декількох (п-3) типових експериментів. Стандартне відхилення (50) складає менше 10 95 для всіх значень.
На фіг. 4 зображені результати імуногістохімічного фарбування аденокарциноми товстої кишки і легень людини з використанням І-00547. Позитивне фарбування відзначене темним кольором.
На фіг. 5 зображена амінокислотна послідовність антитіла АРАЇКІ 2 (5ЕО ІЮ МО: 1).
На фіг. 6 показаний синтез кон'югата І -00547 шляхом двостадійної реакції. На стадії 1 здійснюють активацію антитіла з використанням 5ІАВ, а на стадії 2 здійснюють кон'югацію активованого антитіла з ферментом уреазою з утворенням біокон'югата І -20547.
На фіг. 7 показані результати гель-хроматографії порожньої композиції, АРЕАЇКІ2, високочистої уреази (НР)) ії кон'югата І -00547. Дуже маленький пік димера спостерігається для кожного компонента перед піками відповідних мономерів. Порожня композиція містить 10
ММ гістидин, 1 95 сахарози, 0,2 мМ ЕДТА, рН 6,8.
На фіг. 8 показані результати іонообмінної хроматографії порожньої композиції (А), композиції І-00547 (В) і композиції І -00547, що містить 2,4 95 (С), 4,8 95 (0) і 7,2 95 (Е) уреази
НР (НРУ). Порожня композиція містить 10 мМ гістидин, 1 95 (мас./об.) сахарози, 0,2 мМ ЕДТА, рн 6,8.
На фіг. 9 зображений ілюстративний знімок вікна Ехрегоп 505. Панель 1: накладання електрофореграм смуг 2 і 4. Панель 2: смуга 1, шкала молекулярних мас (ММ); смуги 1,2, 7 і 8:
І-00547, отриманий з використанням активованого АЕАЇКІ2, додатково очищеного методом
ІЕС; смуги 3-6: І -00547, отриманий з використанням АРАЇКІ2, що не піддався додатковому очищенню методом ІЕС; смуги 9 і 10, НРИ. На панелі 1 номери 2-14 по осі х являють собою номера піків, які присутні на електроферограмі смуги 1; 3" позначає пік маркера з найменшою молекулярною масою, а 147 позначає пік маркера з найвищою МУУ, які використовуються як внутрішні стандарти МУМ.
На фіг. 10 зображена електрофореграма І -00547 (смуга 2 на фіг. 9), на якій можна бачити окремі піки субодиниць уреази, зв'язаних з 0-4 молекулами антитіла. Номера 1-11 по осі х являють собою номери піків; 3" позначає пік маркера з найменшою молекулярною масою, а 117 позначає пік маркера з найвищою ММУУ, які використовуються як внутрішні стандарти МУМ.
На фіг. 11 показаний вплив коефіцієнта кон'югації на зв'язувальну активність І-00547.
Одержують І/-00547 з різними коефіцієнтами кон'югації з антитілами (від 1,8 до 12).
Визначають безпосереднє зв'язування зразків /-00547 з іммобілізованими молекулами
СЕАСАМБ-А.
На фіг. 12 зображені результати аналізу АРАЇКІ2, уреази і 1-00547 методом вестерн- блотингу. Ліва панель: гель-електрофорез І-00547, уреази і АЕРАЇКІ2 (фарбування кумасі синім). Середня панель: вестерн-блотинг АРЕАЇКІ 2, уреази і І-00547 (стандартне навантаження бо і 5-кратне перевантаження) з використанням як зонда антитіла проти АРАЇКІ 2. Права панель:
вестерн-блотинг АРАЇКІ2, уреази і 1-00547 (стандартне навантаження і 5-кратне перевантаження) з використанням як зонда антитіла проти уреази. Вставка: концентрація І - роза4і7.
На фіг. 13 показані результати аналізу триптичного гідролізату АРАЇКІ 2-Сув-РЇ. методом ЗФф-
ВЕРХ при 420 нм. Ідентифіковані кон'юговані пептиди і їхні маси відзначені на відповідних піках
ВЕРХ.
На фіг. 14 показані результати аналізу безпосереднього зв'язування Ї-00О547 з лініями ракових клітин ВХРО-3, А549 і МСЕ7. Сигнал, що свідчить про наявність зв'язування, являє собою кількість аміаку, що утворюється при інкубації з 20 мМ сечовиною. І-00547 зв'язується з клітинами ВхРО-3 (е) на підвищеному рівні, із клітинами А549 (А) на середньому рівні, а з клітинами МСЕ? (ж) не зв'язується. Крім того, зв'язування некон'югованого контролю 0О547 з відповідними клітинними лініями (0, А, У) відсутнє, свідчачи про те, що І-00547 специфічно зв'язується з клітинами ВХРО-3 і А549.
На фіг. 15 показані результати аналізу І-0О0547-індукованої цитотоксичності на клітинах
ВХхРО-3 і А549 після додавання 20 ммоль сечовини. У клітинах МСЕ7 ніякі ефекти не спостерігаються (Ж). Клітини ВХРО-3 (е) є дуже чутливими до І-00547, тоді як у клітинах Аб549 спостерігаються лише помірні ефекти (А). Крім того, зв'язування некон'югованого контролю
ЩроО547 з відповідними лініями клітин (О, Д, У) відсутнє. Результати наведені у вигляді середнього значення від декількох (п-3) типових експериментів. Стандартне відхилення (50) складає менше 10 95 для всіх значень.
Детальний опис
Варто розуміти, що даний опис не обмежується конкретними описаними аспектами або варіантами здійснення, які, зрозуміло, можуть варіювати. Варто також розуміти, що використовувана тут термінологія призначена тільки для опису конкретних аспектів або варіантів здійснення і не призначена для обмеження, оскільки обсяг даного розкриття обмежується лише прикладеною формулою винаходу.
Детальний опис даного винаходу розділений на кілька розділів тільки для зручності читача, оскільки опис, який присутній в одному розділі, може бути об'єднаний з описом, який присутній в іншому розділі. Якщо не зазначено інакше, усі використовувані тут технічні і наукові терміни мають традиційне значення, відоме рядовим фахівцям в галузі техніки, до якої належить даний винахід.
Визначення
Слід зазначити, що в даному описі й у прикладеній формулі винаходу форма однини містить у собі посилання на форму множини, якщо контекст явно не вказує інше. Так, наприклад, термін "сполука" містить у собі множину сполук.
У даному описі термін "приблизно", використовуваний перед числовими значеннями, наприклад, температури, часу, кількості, концентрації і т.д., що включають діапазони значень, указує, що значення можуть варіювати убік (ж) або (-) у межах 10 95, 5 95 або 1 95 від величини зазначеного значення.
У даному описі термін "уведення" може стосуватися введення однієї дози безперервно або періодично, або до введення декількох частин дози, що у сукупності складають однократну дозу. Дозування можна проводити протягом усього курсу лікування. Способи визначення найбільш ефективних способів введення і доз, що вводяться, відомі фахівцям у даній галузі і можуть варіювати залежно від типу композиції, використовуваної для лікування, мети лікування, виду клітин, на які спрямоване лікування, і індивідуума, що підлягає лікуванню. Однократне або багаторазове введення можна проводити з використанням рівнів доз і схем уведення, вибраних лікуючим лікарем. Прийнятні лікарські форми і способи введення лікарських засобів відомі в даній галузі. Також можна визначити спосіб уведення, причому метод визначення найбільш ефективного способу уведення відомий фахівцям у даній галузі і може варіювати залежно від композиції, використовуваної для лікування, мети лікування, стану здоров'я або стадії захворювання підлягаючого лікуванню індивідуума, а також від виду клітини- або тканини- мішені. Необмежувальні приклади способу уведення включають пероральне введення, вагінальне введення, назальне введення, ін'єкцію, місцеве застосування, під'язичне введення, легеневе введення і введення за допомогою супозиторіїв.
Використовуваний тут термін "спорідненість" стосується міцності зв'язування рецепторів з їх лігандами, наприклад, антитіла з його антигеном. Термін "Ка" або "константа дисоціації" характеризує спорідненість антитіла до антигену, тобто міцність зв'язування антитіла з конкретним антигеном. Термін "ІСво" або "концентрація напівмаксимального інгібування" являє собою кількість конкуруючої сполуки, необхідну для зменшення зв'язування тестованих сполук бо на 50 б.
Використовуваний тут термін "амінокислота" стосується І -амінокислоти або О-амінокислоті або їхньої суміші, включаючи як природну амінокислоту, так і синтетичну амінокислоту і т.п., за умови, що поліпептид зберігає бажану функціональну властивість. МНо на початку пептидної послідовності являє собою вільну аміногрупу, що знаходиться на амінокінці (або М-кінці) поліпептиду. СООН в кінці пептидної послідовності являє собою вільну карбоксильну групу, що знаходиться на карбоксильному кінці (або С-кінці) поліпептиду. Амінокислотні залишки, що входять до складу поліпептидів, мають наступні стандартні скорочені позначення: А (Аа або аланін); С (Су або цистеїн); О (Ар або аспарагінова кислота); Е (Сім або глутамінова кислота);
Е (Ріє або фенілаланін); с (су або гліцин); Н (Ні або гістидин); І (Пе або ізолейцин); К (І ух або лізин); Ї (еи або лейцин); М (Меї або метіонін); М (Авп або аспарагін); Р (Рго або пролін); О (Сп або глутамін); ЕК (Аго або аргінін); 5 (Зег або серин); Т (Тпг або треонін); М (мМаї або валін); М/ (Тгтр або триптофан); Х (Хаа або невідомий або ін.); М (Туг або тирозин); 7 (Сіх/СсІп/сІш або глутамінова кислота/глутамін) і Орг (2,3-діамінопропіонова кислота). Усі послідовності амінокислотних залишків описуються тут формулами в орієнтації зліва направо, у традиційному напрямку від амінокінця до карбоксикінця. Риска на початку або кінці послідовності амінокислотних залишків позначає пептидний зв'язок з іншою послідовністю, що складається з одного або декількох амінокислотних залишків, або ковалентний зв'язок з амінокінцневою групою, такою як МН» або ацетил, або з карбоксикінцевою групою, такою як СООН.
Використовуваний тут термін "який містить" або "містить" означає, що композиції і способи містять у собі згадані елементи, але не виключають наявності інших. Термін "що складається, в основному, 3", що застосовується для опису композицій і способів, означає виключення інших елементів, що мають яке-небудь істотне значення для сполучення, використовуваного з зазначеною метою. Таким чином, не виключається присутність у композиціях або способах, що складаються, в основному, із зазначених тут елементів, інших матеріалів або стадій, які не чинять істотного впливу на основні і нові характеристики винаходу. Термін "складається з" означає відсутність елементів або інших інгредієнтів у кількостях, які перевищують слідові, і істотних стадій способу. Варіанти здійснення, визначені кожним із зазначених перехідних термінів, входять в обсяг даного винаходу.
У даному описі терміни "активний засіб", "лікарський засіб" і "фармакологічно активний
Зо засіб" використовуються як взаємозамінні для позначення хімічної речовини або сполуки, що при введенні індивідууму викликає бажаний фармакологічний ефект, і охоплюють терапевтичні засоби, включаючи радіонукліди, лікарські засоби, протиракові засоби, токсини і т.п. Прикладом активного засобу є кон'югат антитіла з уреазою.
У даному описі термін "антитіло" стосується пептиду, поліпептиду або білка, що має спорідненість з антигеном. Структурний елемент типового антитіла являє собою тетрамер.
Кожен тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара містить одну "легкий" ланцюг і один "важкий" ланцюг. На М-кінці кожного ланцюга знаходиться варіабельна ділянка, яка складається з 100-110 або більше амінокислот, в основному, що відповідають за розпізнавання антигену. Терміни "варіабельний легкий ланцюг" (М) ії "варіабельний важкий ланцюг" (МН) стосуються зазначених легких і важких ланцюгів, відповідно. Антитіла існують у вигляді інтактних імуноглобулінів, або у вигляді фрагментів, таких як Е(абу?», димер Бар, що являє собою легкий ланцюг, з'єднаний з МН-СНІ дисульфідним зв'язком, або мономер Раб", що може утворитися в результаті руйнування дисульфідного зв'язку в шарнірній ділянці. Мономер Рар' являє собою, по суті, бар з частиною шарнірної ділянки (більш детальний опис інших фрагментів антитіл можна знайти в ГЕипдатепіаї! Іпттипоїіоду, МУ. Е.
Раші, єд., Камеп Ргез5, М.У. (1993)). Фрагменти антитіл можна одержати шляхом розщеплення інтактного антитіла, наприклад, під дією різних пептидаз, синтезу де помо з використанням хімічних методів, або технології рекомбінантних ДНК. Таким чином, у даному описі термін "антитіло" також включає фрагменти антитіл, отримані шляхом модифікації антитіл або синтезу де помо з використанням технології рекомбінантних ДНК. Антитіла містять у собі одноланцюжкові антитіла, такі як одноланцюжкові антитіла Ем (5Ем), у яких МН і МІ. з'єднуються (безпосередньо або через пептидний лінкер) з утворенням одного поліпептиду.
Використовуваний тут термін "однодоменне антитіло" (зхаАБ або "МНН") стосується одного варіабельного домена важкого ланцюга антитіла, що у деяких випадках можна знайти в ссавців сімейства верблюжих, у яких у природі відсутні легкі ланцюги. У деяких аспектах однодоменне антитіло може бути отримане з ділянки МН, ділянки МНН або ділянки МІ. У деяких аспектах однодоменне антитіло має людське походження. У деяких аспектах людське однодоменне антитіло містить послідовності важких або легких ланцюгів, розкриті в УМО2006/099747,
УМО2009/079793 і М/О2012/100343, включених у даний опис шляхом посилання у всій їхній 60 повноті. В одному аспекті людське однодоменне антитіло містить послідовності важких або легких ланцюгів з дисульфідними зв'язками в каркасній ділянці, як описано в ЛО 02012/100343.
Використовуваний тут термін "фрагмент антитіла" також містить у собі будь-який синтетичний або сконструйований методом генної інженерії білок, що діє подібно до антитіла шляхом зв'язування специфічного антигену з утворенням комплексу.
Використовуваний тут термін "кон'югат" стосується двох або більше молекул, ковалентно зв'язаних з утворенням більш великої конструкції. В одному аспекті дві молекули з'єднують прямим зв'язком, що утворюється в результаті взаємодії реакційноздатної функціональної групи уреази з комплементарною реакційноздатною функціональною групою антитіла, наприклад, шляхом взаємодії функціональної аміногрупи лізину з функціональною карбоксигрупою аспарагінової або глутамінової кислоти. Варто розуміти, що для таких реакцій може знадобитися традиційна модифікація карбоксильної групи, що підвищує її реакційноздатність. В іншому аспекті дві молекули з'єднують через лінкерний фрагмент.
У даному описі терміни "білок", "поліпептид" або "пептид" використовуються як взаємозамінні. Білок має первинну структуру, представлену послідовністю його субодиниць, і може мати вторинні спіральні або складчасті структури, а також загальну тривимірну структуру.
Хоча термін "білок" звичайно стосується відносно великого поліпептиду, наприклад, що містить 100 або більше амінокислот, а термін "пептид" стосується більш дрібного поліпептиду, терміни використовуються тут як взаємозамінні. Тобто термін "білок" може стосуватися більш великого поліпептиду, а також більш дрібного пептиду, і навпаки.
Використовуваний тут термін "напрямний фрагмент" стосується молекули, здатної зв'язуватися з визначеною популяцією клітин або вибраним типом клітин. Напрямний фрагмент може зв'язуватися з рецептором, олігонуклеотидом, субстратом ферменту, антигенною детермінантою або іншою зв'язувальною ділянкою, яка присутня на або в клітині-мішені або цільовій клітинній популяції. Типовим напрямним фрагментом є антитіло. Фрагменти антитіл і невеликі пептидні послідовності, здатні розпізнавати експресовані антигени, також можна використовувати як напрямні фрагменти.
Використовувані тут терміни "лікувати", "лікування" або "терапія" містять у собі полегшення, ослаблення або поліпшення захворювання або стану або одного або декількох симптомів, запобігання появи інших симптомів, поліпшення або запобігання метаболічним причинам
Зо симптомів, інгібування захворювання або стану, наприклад, припинення або придушення розвитку захворювання або стану, полегшення захворювання або стану, індукцію регресії захворювання або стану, полегшення стану, викликаного захворюванням або станом, або придушення симптомів захворювання або стану, і крім того, зазначені терміни стосуються профілактики. Ці терміни також містять у собі полегшення хвороби або стану, наприклад, індукцію регресії клінічних симптомів. Терміни також включають досягнення терапевтичного поліпшення і/або профілактичного поліпшення. Під терапевтичним поліпшенням мається на увазі усунення або поліпшення основного розладу, що підлягає лікуванню. Крім того, терапевтичне поліпшення досягається при усуненні або поліпшенні одного або декількох фізіологічних симптомів, пов'язаних з основним розладом, так що поліпшення спостерігається в індивідуума, незважаючи на те, що індивідуум як і раніше страждає на основний розлад.
Терміни "індивід", "індивідуум" і "пацієнт" використовуються тут як взаємозамінні і стосуються будь-якої мішені лікування. Крім того, технологія даного винаходу включає спосіб лікування пухлинних клітин іп 5йи або в їхньому звичайному положенні або місцезнаходженні, наприклад, неопластичних клітин пухлин молочної залози або простати. Зазначені пухлини іп 5йи можуть знаходитися усередині множини хазяїнів, або на множині хазяїнів, таких як люди- хазяїни, хазяїни сімейства собачих, хазяїни сімейства котячих, хазяїни сімейства кінських, хазяїни сімейства бичачих, хазяїни сімейства свиноподібних і т.п. Будь-який хазяїн, в організмі якого знаходяться пухлина або пухлинні клітини, може піддаватися лікуванню відповідно до технології даного винаходу. Таким чином, індивідуум включає хребетну тварину, переважно ссавця, більш переважно людину.
Використовуваний тут термін "по суті не містить" частинок, означає, що частинки втрачені повністю або майже повністю, причому при цьому спостерігається такий же ефект, як у випадку повної втрати частинок. Іншими словами, композиція, що "по суті не містить" або інгредієнт елемент, у дійсності може як і раніше містити такий елемент, за умови відсутності вимірного ефекту. Термін "по суті", якщо не зазначене інше, означає більше ніж приблизно 90 95, більше ніж приблизно 9595, більше ніж приблизно 96 95, більше ніж приблизно 97 95, більше ніж приблизно 98 95 або більше ніж приблизно 99 95. У деяких варіантах здійснення композиція, що містить кон'югати антитіло-уреаза, по суті не містить некон'югованої уреази, тобто композиція містить більше ніж приблизно 90 95 кон'югатів антитіло-уреаза, більше ніж приблизно 95 95 60 кон'югатів антитіло-уреаза, більше ніж приблизно 96 95 кон'югатів антитіло-уреаза, більше ніж приблизно 97 95 кон'югатів антитіло-уреаза, більше ніж приблизно 98 95 кон'югатів антитіло- уреаза або більше ніж приблизно 99 95 кон'югатів антитіло-уреаза. Іншими словами, композиція містить менше ніж приблизно 0,195 некон'югованої уреази, менше ніж приблизно 0,595 некон'югованої уреази, менше ніж приблизно 1 95 некон'югованої уреази, менше ніж приблизно 296 некон'югованої уреази, менше ніж приблизно З 95 некон'югованої уреази, менше ніж приблизно 4 95 некон'югованої уреази, менше ніж приблизно 595 некон'югованої уреази, або менше ніж приблизно 10 95 некон'югованої уреази. Термін "некон'югована уреаза" стосується уреази, не кон'югованої з антитілом.
Використовуваний тут термін "уреаза" стосується ферменту, що має ферментативну активність карбамід-амідогідролази (Е.С. 3.5.1.5), або природного, або отриманого, наприклад, за допомогою методів рекомбінантних нуклеїнових кислот і/або хімічного синтезу. Уреаза також включає гібридні білки, що містять повнорозмірну уреазу, її субодиниці або фрагменти, і/або уреазу, що містить амінокислотні заміни, делеції або додавання, яка зберігає карбамід- амідогідролазну активність поліпептиду.
Використовуваний тут термін "00547" стосується очищеної уреази.
Кон'югація антитіло-уреаза
Технологія даного винаходу спрямована на кон'югат антитіло-уреаза. Технологія даного винаходу надає фармацевтичну композицію, що містить фармацевтично прийнятний водний розчин, що підходить для внутрішньовенної ін'єкції, і кон'югат антитіло-уреаза, що по суті не містить уреазу, некон'юговане антитіло і неводні розчинники, використовувані для ВЕРХ.
Неводні розчинники, використовувані для ВЕРХ, включають органічні розчинники, звичайно використовувані для проведення препаративної ВЕРХ або очищення методом ВЕРХ, такі як метанол, ацетонітрил, трифтороцтова кислота і т.д. У деяких аспектах кон'югат антитіло-уреаза по суті не містить фосфат з фосфатного буфера. У деяких аспектах для очищення методом
ЗЕС використовують фосфатний буфер, що містить 10 мМ фосфат, 50 мМ Масі, рН 7,0. У деяких аспектах при промисловому одержанні кон'югата антитіло-уреаза очищення методом
ВЕРХ не проводять.
У деяких аспектах кон'югат має коефіцієнт кон'югації, що складає приблизно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 антитіл на уреазний фрагмент. У деяких аспектах кон'югат має коефіцієнт кон'югації, що складає приблизно 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів антитіл на уреазний фрагмент. У деяких аспектах кон'югат має коефіцієнт кон'югації, що складає приблизно 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів антитіл на уреазний фрагмент. У деяких аспектах кон'югат має середній коефіцієнт кон'югації, що складає приблизно б або більше фрагментів антитіл на уреазний фрагмент. У деяких аспектах кон'югат має середній коефіцієнт кон'югації, що складає приблизно 8, 9, 10 або 11 фрагментів антитіл на уреазний фрагмент.
У деяких аспектах зв'язок являє собою ковалентний зв'язок або прямий зв'язок, утворений у результаті взаємодії реакційноздатної функціональної групи уреази з комплементарною реакційноздатною функціональною групою антитіла, наприклад, у результаті взаємодії функціональної аміногрупи (МНг), наприклад, лізину, з функціональною карбоксигрупою (СООН), наприклад, аспарагінової або глутамінової кислоти, або сульфгідрильною групою (ЗН) цистеїну. Варто розуміти, що для таких реакцій може знадобитися традиційна модифікація карбоксильної групи, що підвищує її реакційноздатність.
Реакційноздатні функціональні групи можуть являти собою функціональні групи щавлевої кислоти, бурштинової кислоти і т.п., або можуть являти собою ортогональні функціональні групи, такі як аміногрупа (яка перетворюється в МН після кон'югації) і карбоксигрупа (яка перетворюється в СО або СОО після кон'югації). Альтернативне антитіло і/або уреазу можна дериватизувати, щоб експонувати або приєднати додаткові реакційноздатні функціональні групи. Дериватизація може включати приєднання однієї з лінкерних молекул, таких як молекули, що поставляються Ріегсе СпетісаІ Сотрапу, Косктога ПІ. "Лінкер", відповідно до даного опису, являє собою молекулу, яку можна використовувати для приєднання напрямного фрагмента до активного засобу, наприклад, для приєднання антитіла до уреази. Лінкер здатний утворювати ковалентні зв'язки як з напрямним фрагментом, так і з активним засобом. Прийнятні лінкери добре відомі фахівцям у даній галузі і включають, без обмеження, вуглецеві лінкери з прямим або розгалуженим ланцюгом, гетероциклічні вуглецеві лінкери або пептидні лінкери. Якщо напрямний фрагмент і молекула активного засобу являють собою поліпептиди, лінкери можна приєднати до амінокислот, які входять до їхнього складу, через бічні групи (наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку з цистеїном). В одному переважному аспекті лінкери приєднують до альфа-вуглецевих аміногруп і карбоксильних груп кінцевих амінокислот. У деяких аспектах з'єднання здійснюють через лінкер, 60 що містить дві або більше функціональних груп, таких як карбоксигрупа або аміногрупа, що дозволяють йому взаємодіяти як з уреазою, так і з антитілом. Лінкери добре відомі в даній галузі і звичайно містять від 1 до 20 атомів, включаючи атоми вуглецю, азоту, водню, кисню, сірки і т.п.
Для одержання цільового імунокон'югата можна використовувати біфункціональний лінкер, одна функціональна група якого взаємодіє з функціональною групою уреази, а інша група взаємодіє з антитілом. Альтернативно можна провести дериватизацію шляхом хімічної обробки напрямного фрагмента, наприклад сгліколеве відщеплення цукрового фрагмента глікопротеїнового антитіла під дією перйодату з утворенням вільних альдегідних груп. Вільні альдегідні групи на антитілі можна піддати взаємодії з вільними аміногрупами або гідразиновими групами, які присутні на активному засобі, щоб приєднати вказаний засіб (див. патент США Мо 4671958). Також відомі способи одержання вільних сульфгідрильних груп на поліпептиді, такому як антитіло або фрагмент антитіл (див. патент США Мо4659839).
Інші лінкерні молекули і способи їхнього застосування включають описані, наприклад, у
Європейській патентній заявці Мо 188256; патентах США МоМо 4671958, 4659839, 4414148, 4699784; 4680338; 4569789; і 4589071; а також у Вогпіпдпаиз еї а!. (1987) Сапсег Кез. 47:4071- 4075).
У деяких аспектах зв'язок розщеплюється в цільовій ділянці або поблизу неї й уреаза відділяється від напрямного фрагмента, коли молекула кон'югата досягає цільової ділянки.
Розщеплення зв'язку з відділенням уреази від напрямного фрагмента може відбуватися під дією ферментативної активності або умов, яким кон'югат піддається або усередині клітини-мішені, або поблизу цільової ділянки. У деяких аспектах можна використовувати лінкер, що розщеплюється в умовах, які присутні у ділянці пухлини (наприклад, при впливі пухлино- асоційованих ферментів або кислих значень рН).
Розщеплювані лінкери містять у собі лінкери, описані, наприклад, у патентах США МоМо 4618492; 4542225 і 4625014. Механізми відділення активного засобу від зазначених лінкерних груп включають, наприклад, опромінення фотолабільного зв'язку і кислотно-каталізований гідроліз. Наприклад, у патенті США Мо 4671958 описані імунокон'югати, що містять лінкери, які розщеплюються в цільовій ділянці іп мімо під дією протеолітичних ферментів системи комплементу пацієнта. У деяких аспектах прийнятний лінкер являє собою залишок
Ко) амінокислоти або пептидний спейсер, який складається з двох або більше амінокислот.
У деяких аспектах прийнятний лінкер являє собою В'-І -В2, де КЕ" і В? позначають однакові або різні функціональні групи, одна з яких зв'язується з антитілом, а інша зв'язується з уреазою.
В'ї К2 можуть бути незалежно вибрані, без обмеження, з -МН-, -СО-, -СО0О-, -О-, -5-, -МНМН-, -
ММ-, -М-МН- і т.д. Ї. може позначати прямий або розгалужений вуглеводневий ланцюг, такий як алкільний ланцюг, де один або кілька атомів вуглецю необов'язково заміщені киснем, азотом, амідом, сіркою, сульфоксидом, сульфоном, циклоалкілом, гетероциклоалкілом, арилом, гетероарилом і т.д. У деяких аспектах лінкер може являти собою амінокислотний залишок або пептид. У деяких випадках лінкер розщеплюється в результаті дії ферменту або зміни рН у цільовій ділянці або поблизу неї. Деякі лінкери і способи, що підходять для одержання кон'югатів, описані в патентах США МоМо Мо 4414148, 4545985, 4569789, 4671958, 4659839, 4680338, 4699784, 4894443 і 6521431. У деяких аспектах лінкер являє собою о
ЕФ) Ка ри 7 де чл і ----- позначають точки приєднання антитіла або уреази. В окремому аспекті -ллг позначає точку з'єднання з аміногрупою антитіла, а ----- позначає точку з'єднання з атомом 5 тіогрупи уреази. Цей лінкер являє собою залишок зв'язувального засобу ЗІАВ (М- сукцинімідил(4-йодацетил)амінобензоат), використовуваного для кон'югації антитіла з уреазою.
У деяких аспектах ультраочищення являє собою метод розділення, що підходить для способу кон'югації з використанням 5ІАВ як зв'язувального засобу.
У деяких аспектах лінкер являє собою залишок зв'язувального засобу формули:
о
М ри Х ке -ж о з де Х позначає бром або йод, а Ї позначає лінкер, описаний у даному документі.
У деяких аспектах зв'язувальний засіб являє собою 5ВАР (сукцинімідил-3-
ІОромацетаміно|пропіонат) або 5ІА (М-сукцинімідилиодацетат), які можна використовувати для кон'югації в таких же умовах (наприклад, у яких не потрібне хроматографічне очищення методом ВЕРХ і може знадобитися тільки ультрафільтрація), що і 5ІАВ. У деяких аспектах довжина зв'язувального фрагмента 5ІАВ (10,6 ангстрем) є більш прийнятною/активізованою, ніж довжина 5ВАР (6,2 А) і 5ІА (1,5 А). У деяких аспектах зв'язувальний засіб являє собою 5РОР (сукцинімідил-3-(піридилдитіо)пропіонат), ЗМРТ (сукцинімідилоксикарбонілметил-(2- піриддитіо)утолуол) або ЗМСОС (сукцинімідил-4-(М-малеїмідометил)циклогексанкарбоксилат), які можна використовувати для кон'югації, однак у цьому випадку для відділення уреази, яка не прореагувала, від реакційного розчину може знадобитися кілька способів розділення, наприклад, ІЕС і фракціонування етанолом, що може привести до більш низького виходу.
Крім того, для додаткового посилення терапевтичного ефекту до антитіл можна приєднати інші компоненти, що включають, без обмеження, терапевтичні засоби, такі як протиракові засоби.
Уреаза
За допомогою численних досліджень була отримана детальна інформація про генетику уреаз з ряду еволюційно різних бактерій, рослин, грибів і вірусів (Мобіеєу, Н. Г. Т. еї аїІ. (1995)
Місторіо!. Нем. 59:451-480; Єик 9. Віоспет., 175, 151-165 (1988); І абідпе, А. (1990) Міжнародна публікація Мо М/О 90/04030; СіІауюп, С. Ї. еї аї. (1990) Мисіевїс Асіа Ке5. 18, 362; і патенти США
МоМо 6248330 і 5298399, де кожен із зазначених документів включений у даний опис шляхом посилання). Особливий інтерес представляє уреаза, виявлена в рослин (5ігко, А. апа Вгоа?ік,
А. (2000) Асіа Віоспіт Ро! 47 (4): 1189-95). Одним із прикладів рослинних уреаз є уреаза бобових. Послідовності інших практично використовуваних уреаз можна знайти в загальнодоступних базах даних, наприклад у Епіге (побрі.піт.пій.дом/Епіге?).
У деяких аспектах уреаза являє собою уреазу з канавалії мечоподібної. Уреаза канавалії мечоподібної має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО. 2, наведену нижче:
МКІ ЗРВАЕМЕКІ СІ НМАСМІ АДОКАВГАВСУВІ МУТЕАМАПІАЗОІМЕМАВОСЕКТМУАОЇ МОГ СОН.
Зо САВОМІ РАУРНІ І. МАМОМЕАТЕРраткІ МУТУНОРІЗАЕМСЕЇГ ОБАГРаБІИЇ РУРБІ ОКЕАЕТКЕОМВІ
РОБ СЕОЕСІ ТІ МІСАКАМІ КУТЗЕКИО АРІОМЕЗНУНЕІЕММРМУЇ ТЕОВАКАМО МА МІААИТАМАЕЕ
РИаЮСК5ОМУТІ МБІЄОМКМІНССМАІАВСС РУМЕТМ ЕААМНАУВЗКИаРаТНЕЕЕКОАЗЕСЕТКЕОРМОСРЕ
МТРІНАВКЕМАМКМОаРТТОаОКІВІ ОТМІ ГГ АЄЕІЕКОМАЇ МОВЕСУєСсОЯваКкМІНОЯМОИОСОНРРАЇБІ О
ТМІТМАМІ ОМ ТаПпкАВІСІКраИапАБІСКАСМРОЇММОаМЕЗММИСАМТЕМАСЕСТ ІМТАСАІЮСНУНМІС
РОГ УУЕАІЗЗИаІ ТІ МаСОСТаРААСТВАТТСТРОРТОМВАІ МІГ ОЗТООІ РІ МЕСЕТакКОаЗОЗекКРОЕЇ Н
ЕПКАСАМОІ КІ НЕОМ/ЯЗТРААІЮМСІ ТІАЕННОІОЇМІНТОТІ МЕАС ЕМЕНОІААЕКаВТІНТУНЗЕСАС сСОаНАРОПКУСИІКММІ РОЗТМРТАРІТЗМТІОЕНІГОМІ МУСННІ ОВ ЕІРЕВІ АБАНЗАІВККТІААЕОМ
ГЕМОІСАІЗІЗ5ОБОАМавМуаЕМІЗА ТМУОТАОКМКАОТаТРІ КСОЗЗОМОМЕВІВ ВЕМІАКУТІМРАЇТАМИа Є зОУУавзмЕМакКІ АВ УМУКРУОЕРаТтТКкКРЕММІКОСММУАУМАВІСОРМАБІРТРЕРУКМАРМУСТІ ОКА асАЇ БІАРУЗКААІ ВОВУММІ МОЇ МКАМЕАМЗМУВКІ ТК ОМКІМОАСРЕІТМОРЕБЗУТУКАРСОКІИ І С
М5ЕАТТУРІ БАМУНІЕ (ЗЕО ІО Мо. 2)
Послідовності практично використовуваних уреаз можна знайти в загальнодоступних базах даних, наприклад Епіге? (НЕер:/Лимлми. пері. піт.пій.дом/Епіге?). Крім того, праймери, що підходять для ампліфікації уреаз із широкого ряду організмів, можна використовувати за способом, описаним Вакег, К. М. апа СойЦіег, У. г. (пер/Ллумлу.зсіеєпсе. тій. еди/дерагітепів/Віоїоду/Кас/МЕМЕВ уебраде/абзігасів.піті), або з використанням СООЕНОР (СОпзепзи5-ОЕдепегаїе Нурбгійа ОїІїдописіеоїіде Ргітег), як описано в
Возе, еї а. (1998) Мисі. Асідв5 Нев. 26:1628.
Уреаза може перетворювати субстрат-сечовину в аміак і карбамат. У результаті такої ферментативної активності може підвищуватися рН, роблячи навколишнє середовище більш основною. Середовище, що оточує ракову клітину, звичайно є кислим (Уербр, 5.0., еї аї. (2001)
Момапів Еоипа бутр 240:169-81). Отже, підвищення рН позаклітинного середовища в результаті зазначеної активності приводить до інгібування росту ракових клітин. Відповідно, додавання кон'югатів антитіло-уреаза в деяких аспектах технології даного винаходу приводить до підвищення рН інтерстиціальної рідини приблизно на 0,1 одиниці рН, наприклад на 0,1-0,5 одиниць рН або більше.
Уреаза, що підходить для застосування в технології даного винаходу, містить у собі природні форми уреази, а також їх функціонально активні варіанти. Існують два загальні типи варіантів амінокислотних послідовностей. Варіанти амінокислотної послідовності являють собою послідовності, що містять заміни однієї або декількох конкретних амінокислот, що не придушують активність уреази. Ці варіанти включають варіанти, що мовчать, і консервативно модифіковані варіанти, які по суті гомологічні і функціонально еквівалентні нативним білкам.
Варіант нативного білка "по суті гомологічний" нативному білку, якщо його амінокислотна послідовність щонайменше приблизно на 80 95, більш переважно щонайменше приблизно на 90 95, ще більш переважно щонайменше приблизно на 95 95, навіть ще більш переважно на 9895 і найбільше переважно щонайменше приблизно на 9995 ідентична амінокислотній послідовності нативного білка. Варіант може відрізнятися тільки на 1 амінокислоту, або на кілька амінокислот, до 10 або більше.
Другий тип варіантів включає варіанти уреази по розміру, що являють собою виділені активні фрагменти уреази. Варіанти по розміру можна одержати, наприклад, шляхом фрагментації уреази в результаті хімічної модифікації розщеплення протеолітичним ферментом або їхнього сполучення. Крім того, для одержання варіантів по розміру можна використовувати методи генної інженерії, а також методи синтезу поліпептидів безпосередньо з амінокислотних залишків.
Під терміном "функціонально еквівалентний" мається на увазі, що послідовність варіанта визначає ланцюг, який продукує білок, що має, по суті, таку ж біологічну активність, що і нативна уреаза. Такі функціонально еквівалентні варіанти, що містять істотні варіації послідовності, також охоплюються технологією даного винаходу. Таким чином, функціонально еквівалентний варіант білка нативної уреази має біологічну активність, достатню для терапевтичного застосування. У даній галузі техніки існують способи визначення функціональної еквівалентності. Біологічну активність можна виміряти за допомогою аналізів, спеціально розроблених для вимірювання активності білка нативної уреази. Крім того, антитіла, отримані проти біологічно активного нативного білка, можна тестувати на здатність зв'язуватися з
Зо функціонально еквівалентним варіантом, причому ефективне зв'язування свідчить про те, що білок має конформацію, подібну до конформації нативного білка.
Білкові послідовності уреази, що підходять для застосування в технології даного винаходу, включаючи консервативно заміщені послідовності, можуть бути частиною більш великих поліпептидних послідовностей, наприклад, утворених шляхом додавання одного або декількох доменів, що полегшують очищення білка (таких як сегменти полі-Ні5, сегменти маркера ЕГ АС і т.д.), де додаткові функціональні домени впливають, або взагалі не впливають на активність уреазного білкового фрагмента, або де додаткові домени можна видалити на стадіях постсинтетичної обробки, такої як обробка протеазою.
Додавання однієї або декількох нуклеїнових кислот або нуклеотидних послідовностей, які не змінюють кодуючу активність молекули нуклеїнової кислоти, що підходить для застосування в технології даного винаходу, наприклад, додавання нефункціональної послідовності, являє собою консервативну модифікацію основної молекули нуклеїнової кислоти, а додавання одного або декількох амінокислотних залишків, що не змінюють активність поліпептиду, що підходить для застосування в технології даного винаходу, являє собою консервативну модифікацію основного поліпептиду. Додавання обох зазначених типів є ознаками технології даного винаходу. Для фахівця в даній галузі техніки повинно бути очевидно, що багато консервативних модифікацій розкритих конструкцій нуклеїнових кислот дають функціонально ідентичні конструкції.
Можна використовувати ряд способів визначення взаємовідношень послідовностей, включаючи ручне вирівнювання, а також вирівнювання й аналіз послідовностей за допомогою комп'ютера. Останній спосіб є переважним у технології даного винаходу завдяки підвищеній пропускній здатності, забезпечуваній комп'ютерними методами. Для вирівнювання послідовностей можна використовувати ряд існуючих комп'ютерних програм або програми, створені фахівцями.
Як відзначено вище, послідовності нуклеїнових кислот і поліпептидів (а також їхні фрагменти), використовувані в технології даного винаходу, не обов'язково повинні бути ідентичними, але можуть бути по суті ідентичними (або по суті подібними) відповідній послідовності поліпептиду або молекули нуклеїнової кислоти уреази (або її фрагменту), використовуваної в технології даного винаходу, або спорідненій молекулі. Наприклад, 60 поліпептиди можна піддавати різним змінам, таким як одна або кілька вставок, делецій і замін амінокислот або нуклеїнових кислот, консервативним або неконсервативним, включаючи зміни, що можуть забезпечити визначені переваги при їхньому застосуванні, наприклад, при терапевтичному застосуванні або в адміністративному додатку.
Напрямні фрагменти
Напрямні фрагменти являють собою хімічні об'єкти, які підходять для застосування в технології даного винаходу, і мають здатність зв'язуватися з визначеним, вибраним типом клітин, або з популяцією клітин-мішеней, таких як ракові клітини. Прийнятні напрямні фрагменти включають антитіла і фрагменти антитіл, пептиди і гормони. Як напрямні фрагменти також можна використовувати білки, що відповідають відомим рецепторам клітинної поверхні (такі як ліпопротеїни низької щільності, трансферин і інсулін), фібринолітичні ферменти, білки, що зв'язуються з тромбоцитами, такі як анексини, і модифікатори біологічної відповіді (такі як інтерлейкін, інтерферон, еритропоетин і колонієстимулюючий фактор). Крім того, у технології даного винаходу як напрямні фрагменти можна використовувати олігонуклеотиди, наприклад, антисмислові олігонуклеотиди, комплементарні фрагменту нуклеїнової кислоти клітини-мішені.
Напрямні фрагменти можуть являти собою олігонуклеотиди, що зв'язуються з поверхнею клітини-мішені. Як напрямні фрагменти також можна використовувати аналоги перерахованих вище напрямних фрагментів, що зберігають здатність зв'язуватися з певною популяцією клітин- мішеней.
У технології даного винаходу як напрямні фрагменти також можна використовувати функціональні еквіваленти вищезгаданих напрямних фрагментів. Прикладом функціонального еквівалента цільового фрагмента є органічна хімічна конструкція, що імітує конфігурацію і/або орієнтацію, що забезпечує зв'язування напрямного фрагмента з клітиною-мішенню. Іншим прикладом функціонального еквівалента цільового фрагмента є короткий поліпептид, який має спорідненість до фрагмента-мішені.
У деяких аспектах напрямні фрагменти даного винаходу являють собою антитіла, пептиди, олігонуклеотиди і т.п., здатні взаємодіяти з антигеном, присутнім на поверхні мішені. Можна використовувати як поліклональні, так і моноклональні антитіла, комерційно доступні або описані в літературі Антитіла можуть являти собою цілі антитіла або їхні фрагменти.
Моноклональні антитіла і їхні фрагменти можна одержати за допомогою традиційних методів, таких як гібридомний синтез, методи рекомбінантних ДНК і білковий синтез. Прийнятні для застосування моноклональні антитіла і їхні фрагменти можна одержати з будь-яких видів (включаючи людей), або їх можна одержати у вигляді химерних білків, що містять послідовності більше ніж з одного виду.
У деяких аспектах напрямний фрагмент являє собою гуманізоване або нелюдське антитіло.
У деяких аспектах напрямний фрагмент являє собою однодоменне антитіло. У деяких аспектах однодоменне антитіло (заАБ) або "МНН" являє собою один варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що належить до типу, який може зустрічатися в ссавців сімейства верблюжих, яке в природі не містить легких ланцюгів. У деяких аспектах однодоменне антитіло можна сконструювати з ділянки МН, ділянки МНН або ділянки МІ. У деяких аспектах однодоменне антитіло має людське походження. У деяких аспектах людське однодоменне антитіло містить послідовності важких або легких ланцюгів, розкриті в УМО 2006/099747 і
МО2009/079793 ії ММО2012/100343, включених у даний документ шляхом посилання у всій їхній повноті. В одному аспекті людське однодоменне антитіло містить послідовності важких або легких ланцюгів, з'єднані дисульфідними зв'язками в каркасних ділянках, як описано в М/О 02012/100343.
У деяких аспектах напрямний фрагмент (такий як антитіло) має специфічність до пухлинного антигену, який експресується карциномами, лейкозами, лімфомами і саркомами. Карциноми можуть являти собою карциноми ануса, жовчного тракту, сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, прямої кишки, легень, ротоглотки, гіпофаринкса, стравоходу, шлунка, підшлункової залози, печінки, нирок, жовчного міхура і жовчних проток, тонкого кишечнику, сечових шляхів, яєчників, дрібноклітинну карциному легень, карциному статевих шляхів, карциному ендокринної залози, карциному щитовидної залози і шкіри. У деяких аспектах напрямний фрагмент (такий як антитіло) має специфічність до пухлинного антигену, який експресується карциноїдними пухлинами, такими як стромальні пухлини шлунково-кишкового тракту, пухлини голови і шиї, первинні пухлини, гемангіоми, меланоми, злоякісна мезотеліома, множинна мієлома і пухлини головного мозку, нервів, очей і оболонок головного мозку. У деяких аспектах напрямний Фрагмент (наприклад, антитіло) має специфічність до пухлинного антигену, який експресується карциномою, раком молочної залози, підшлункової залози, яєчників, легень і товстої кишки. У деяких аспектах напрямний Фрагмент (такий як антитіло) має специфічність бо до пухлинного антигену, який експресується недрібноклітинною карциномою легені.
У деяких аспектах антитіло має специфічність до пухлинного антигену, який експресується недрібноклітинною карциномою легені. У деяких аспектах пухлинний антиген, який експресується недрібноклітинною карциномою легені, являє собою СЕАКАМб (молекулу 6 клітинної адгезії, споріднену з карциноембріональним антигеном), а антитіло має специфічність до СЕАКАМб. СЕАСАМб, також відомий як неспецифічний перехресно-реагуючий антиген (МСА) або СОббс, являє собою добре охарактеризований раковий антиген (11, 12). Його послідовність у високому ступені гомологічна послідовностям інших / людських карциноембріональних антигенів, таких як СЕАСАМІ, СЕАСАМ?7 і СЕАСАМВ. Він являє собою зв'язаний із глікозилфосфоінозитолом (ОРІ) клітинний поверхневий білок, що не містить відомий цитоплазматичний домен. Експресія СЕАСАМб значно підвищена в тканинах раку молочної залози, підшлункової залози, яєчників, легень і товстої кишки. Його підвищена експресія свідчить про інвазивний і метастатичний характер пухлинних клітин (13). У деяких аспектах антитіло має спорідненість до СЕАСАМб, що характеризується значенням Ка, вищим ніж приблизно 1х105 М. У деяких аспектах кон'югат має спорідненість до СЕАСАМб, що характеризується значенням Ка, яке не перевищує приблизно 1х1098 М, 1х109 М, 1х1079 М або 1х1020 М. У деяких аспектах антитіло являє собою фрагмент однодоменного антитіла верблюжих (АБАЇКІ2, ЗЕО ІО МО: 1), що розпізнає СЕАСАМ6б на клітинах аденокарциноми легень. У деяких аспектах антитіло містить поліпептид, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО. 1, показану на фігурі 5. У деяких аспектах антитіло містить поліпептид, що несе щонайменше одну модифікацію амінокислотної послідовності зХЕО ІЮ МО. 1. У деяких аспектах антитіло містить поліпептид, послідовність якого щонайменше на 80 95, 85 95, 90 9, 95 Фо, 98 95 і 99 95 гомологічна амінокислотній послідовності 52ЕО ІЮ МО. 1.
У деяких аспектах антитіло СЕАСАМб являє собою антитіло проти СЕАСАМб (9Аб): 5б- 59899, що поставляється Запіа Сти7 Віоїесп. Антитіло проти СЕАСАМ6б (9Аб) являють собою мишачий моноклональний Ід01, наданий у концентрації 200 мкг/мл, що одержують проти
СЕАСАМб-експресуючих ліній пухлинних клітин людського походження. Його рекомендують використовувати для детекції СЕАСАМ6б людського походження.
У деяких аспектах антитіло проти СЕАСАМб являє собою антитіло проти СЕАСАМб (ар56234), що поставляється арбеат. Антитіло проти СЕАСАМ6б (ар56234) являє собою кроляче
Зо поліклональне антитіло проти СЕАСАМб. Його одержують проти ділянки синтетичного пептиду (ПОМРАБАМА5 ОРМТІММІ Ма РОСРТІЗРУОК АМУМАРОСОЕМІМ І ЗСНААЗМРР (ЗЕО ІО МО: 3)), що відповідає внутрішнім амінокислотам 217-266 послідовності людського СЕАСАМб.
У деяких аспектах антитіло проти СЕАСАМ6б являє собою антитіло проти СЕАСАМ-6/СО6бс, що поставляється Моми5 Віоіодісаїє, що являє собою кроляче поліклональне антитіло проти
СЕАСАМ6б, перевірене методами вестерн-блотингу і імуногістохімії-Р. Його одержують проти синтетичного пептиду (Е!ЮМРАБАМАЗО (5ЕО ІЮ МО: 4)), спрямованого проти середньої ділянки людського СЕАСАМб (МР. 002474).
У деяких аспектах антитіло проти СЕАСАМб являє собою антитіло проти СЕАСАМб
ЕРК4403, що поставляється Огібепе, моноклональне кроляче антитіло проти СЕАСАМ6б (клон
ЕРРВБ4403). Його одержують проти синтетичного пептиду, що відповідає залишкам людського
СЕАСАМБб. Воно здатне взаємодіяти з мишачим, щурячим і людським СЕАСАМб.
У деяких аспектах кон'югат має спорідненість до СЕАСАМб, що характеризується значенням
ІСво, що не перевищує приблизно 10 нМ. У деяких аспектах кон'югат має спорідненість до
СЕАСАМБб, що характеризується значенням ІСво, що не перевищує приблизно 5 нМ. У деяких аспектах кон'югат має спорідненість до СЕАСАМ6б, що характеризується значенням ІСво, що не перевищує приблизно 4 нМ. У деяких аспектах значення ІСв5о складає приблизно 3,22 НМ. У деяких аспектах кон'югат зв'язується з СЕАСАМЄ зі значенням ІСзхо приблизно 10-30 мкг/мл. У деяких аспектах кон'югат зв'язується з СЕАСАМб зі значенням ІСво приблизно 20 мкг/мл.
Спорідненість антитіла або кон'югата до цільового антигену можна визначити за допомогою способів, описаних тут або відомих у даній галузі. У деяких аспектах технологія даного винаходу описує кон'югат антитіло проти СЕАСАМб-уреаза (1-00547). У деяких аспектах технологія даного винаходу описує кон'югат антитіло-уреаза, наприклад, АРЕАЇКІ2-уреазу. Фагову бібліотеку, отриману з набору важких ланцюгів антитіл лами, використовують для ідентифікації однодоменного антитіла (заАБ) шляхом пенінгу проти недрібноклітинної аденокарциноми легені
А549. БаАр позначають як АРАЇ. Генну послідовність АБАЇ оптимізують з метою кон'югації і перейменовують як АЕРАЇКІ2. У деяких аспектах антитіло АРАЇКІ 2 клонують і експресують у системі Е. соїї ВІ 21 (СЕЗ) рТ7-7.
Гуманізовані напрямні фрагменти здатні зменшувати імунореактивність антитіла або поліпептиду в організмі хазяїна-реципієнта, що дозволяє збільшити період напіввиведення і бо зменшити несприятливі імунні реакції. Мишачі моноклональні антитіла можна гуманізувати,
наприклад, шляхом генетичної рекомбінації нуклеотидної послідовності, що кодує мишачу ділянку Ем, або її гіперваріабельні ділянки, і нуклеотидної послідовності, що кодує ділянку людського константного домена і ділянки Ес. Мишачі залишки також можна зберегти в каркасних доменах людської варіабельної ділянки, щоб гарантувати належні характеристики зв'язування з мішенню. Антитіла, сконструйовані методами генної інженерії для доставки різних активних засобів до ракових клітин, описані в Воаеу, В. (2001) Ехрегі Оріп Віої. Тег. 1(4): 603- 17.
У деяких аспектах напрямний фрагмент являє собою ліганд, здатний взаємодіяти з рецептором на поверхні клітини-мішені. Таким чином, напрямний фрагмент може містити в собі, без обмеження, гормони, які мають спорідненість до клітинного зв'язувального компонента, будь-яку молекулу, що містить вуглеводний фрагмент, розпізнаваний клітинним зв'язувальним компонентом, а також лікарські засоби або невеликі молекули, здатні зв'язуватися з клітинним зв'язувальним компонентом. Фраза "зв'язувальний компонент" стосується як рецепторних, так і акцепторних молекул. Переважно зв'язувальний компонент є клітинним поверхневим зв'язувальним компонентом. В одному аспекті напрямний фрагмент являє собою природний білок, такий як інсулін, здатний зв'язуватися з ділянкою-мішенню. Як специфічні напрямні фрагменти також можна використовувати цитокіни, що включають у себе інтерлейкіни і фактори, такі як гранулоцитарно-макрофагальний колонієсєтимулюючий фактор (ЗМ-С5БЕ) і фактор некрозу пухлини (ТЕ), які, як відомо, зв'язуються з певними клітинами, які експресують високі рівні їхніх рецепторів (Тепікомувкі, 5У (2002) ТохісоІоду 174(3):143-152).
Щоб зменшити вплив уреази або іншого активного засобу на клітини або тканини, які не є мішенями, напрямні фрагменти можна піддати скринінгу, щоб ідентифікувати фрагменти, які виявляють мінімальну реакційноздатність відносно об'єктів, які не є мішенями, зберігаючи при цьому специфічність і реакційноздатність відносно мішеней. Завдяки зменшенню впливу на немішені (і несприятливій локалізації і/або токсичності поза мішенями) можна вводити підвищені дози уреази або іншого активного засобу. Це дозволяє вводити максимально можливу концентрацію уреази або іншого терапевтичного засобу, що забезпечує максимальний вплив на клітині-мішені, не перевищуючи поріг неприйнятної токсичності відносно клітин-немішеней.
У деяких аспектах використовують два або більше кон'югати активний засіб-напрямний
Зо фрагмент, при цьому всі кон'югати містять різні напрямні фрагменти, наприклад, антитіла різних видів. Кожний з використовуваних напрямних фрагментів зв'язується з іншою ділянкою- мішенню, яка може асоціюватися з такою ж або іншою ділянкою-мішенню. Компоненти активного засобу, які містяться в кон'югатах, які вводяться, можуть бути однаковими або різними. Див., наприклад, патенти США МоМо 4867962 і 5976535, кожний з яких включений у даний документ шляхом посилання. У деяких аспектах поліпшується нагромадження кон'югата, що містить активний засіб, у ділянці-мішені, оскільки кожен напрямний фрагмент, наприклад, антитіло конкретного виду, розпізнає іншу ділянку-мішень (тобто епітоп). Такий підхід з використанням альтернативних ділянок-мішеней забезпечує більше потенційних точок зв'язування ділянки-мішені з активним засобом. Отже, можна уникнути фактичного або ефективного насичення ділянки-мішені, наприклад, у результаті епітопного насичення і/або стеричного утруднення. У такий спосіб можна досягти додаткового нагромадження активного засобу, наприклад уреази. Альтернативно, або разом з тим, як активні засоби можна використовувати інші уреаза-специфічні генні продукти, наприклад, здатні утворювати каталітично активний голофермент у ділянці-мішені. Типовий апофермент уреази містить гамма-, бета- і альфа-субодиниці, які кодуються бактеріальними генами игеАВС (Вигпе, Е.А. і
СНнеп, У.М. (2000) Місторез апа Інтесіоп 2: 533-542).
Можна проаналізувати здатність моноклональних антитіл, спрямованих проти конкретної ділянки-мішені, до перехресної взаємодії, щоб ідентифікувати ряд із двох або більше мішень- специфічних моноклональних антитіл з неперекривною перехресною реакційноздатністю для застосування в терапії. Фраза "неперекривна перехресна реакційноздатність" означає, що тканини-немішені, які зв'язуються антитілом одного виду, істотно відрізняються від тканин- немішеней, що зв'язуються антитілом іншого виду. Типи перехресної реакційноздатності відрізняються по ступеню пропорційного зменшення впливу активного засобу при терапевтичному застосуванні. Переважною є пара антитіл (або набір з більшого числа антитіл), що характеризується мінімальним перекриванням.
Скринінг антитіл можна проводити різними способами. Для визначення реакційноздатності відносно тканини-мішені і перехресної реакційноздатності відносно тканини-немішені можна використовувати імуногістохімічний аналіз. Тканини, з якими зв'язуються антитіла, можна ідентифікувати шляхом піддавання тканини впливу антитіла; промивання тканини з метою 60 видалення незв'язаного антитіла; і детекції присутності зв'язаного антитіла. Гістохімічні методи іп міго відомі в даній галузі. Див., наприклад, Запспез-іІвіа5, Е. апа І еєоп-ОїІєа, М. (2001) Мійс
Охіде 5(4):302-16.
Якщо напрямний фрагмент є відносно коротким, його можна синтезувати за допомогою стандартних методів хімічного синтезу пептидів. В одному аспекті способу хімічного синтезу поліпептидів можна використовувати твердофазний синтез, у якому С-кінцеву амінокислоту послідовності приєднують до нерозчинного носія з наступним послідовним додаванням інших амінокислот послідовності. Методи твердофазного синтезу описані в Вагапу апа Меггіїеїа, Зоїїа-
Ріазе Реріїде бЗупіпезів; рр. 3-284 іп Те Реріійдев: Апаїувзіз, Зупіпезів, Віоіоду. Мої. 2: Зресіаї
Меїносдз іп Реріїде Зупіпезів, Рай А., Меттітеїа, єї а!. У. Ат. Спет. 5ос., 85: 2149-2156 (1963), і еІеман еї аї., Зої Рпазе Реріїде зупіпевів, 2па ей. Ріетсе Спет. Со., Воскгога, ПІ. (1984).
ДНК, яка кодує антитіло або уреазу, можна одержати будь-яким прийнятним способом, що включає, наприклад, клонування і рестрикцію відповідних послідовностей, або прямий хімічний синтез з використанням, наприклад, фосфотриефірного методу, описаного Магапод еї аї. (1979)
Позначок. Епгутої. 68: 90-99; фосфодіефірного методу, описаного Вгом/п еї аї. (1979) Позначок.
Епгутої. 68: 109-151; діетилфосфорамідитного методу, описаного Веацйсаде еї аї. (1981) Тегга.
Ї ей, 22: 1859-1862; і твердофазного методу, описаного в патенті США Мо 4458066.
За допомогою хімічного синтезу можна одержати одноланцюжковий олігонуклеотид. Його можна перетворити в дволанцюжкову ДНК шляхом гібридизації з комплементарною послідовністю або шляхом полімеризації під дією ДНК-полімерази з використанням одного ланцюга як матриці. Фахівцям у даній галузі відомо, що, хоча хімічний синтез ДНК обмежений послідовностями, що містять приблизно 100 основ, більш довгі послідовності можна одержати шляхом лігування більш коротких послідовностей.
Альтернативно можна клонувати підпослідовності з наступним розщепленням відповідних підпослідовностей за допомогою прийнятних рестрикційних ферментів. Потім фрагменти можна лігувати з одержанням бажаної послідовності ДНК.
Способи одержання кон'югатів антитіло-уреаза
Технологія даного винаходу надає спосіб одержання композиції, яка містить кон'югат антитіло-уреаза і практично не містить некон'юговану уреазу, наприклад, що містить не більше ніж приблизно 5 95, 4 9, З Уо, 2 У або 1 95 уреази відносно маси кон'югата антитіло-уреаза, де
Зо зазначений спосіб включає (1) об'єднання активованого антитіла й уреази в розчиннику, у якому активоване антитіло й уреаза практично не взаємодіють, наприклад, протікає не більше 10 95, 5 95 або 1 95 реакції на годину, з одержанням реакційної суміші, що містить активоване антитіло й уреазу, рівномірно розподілені в розчиннику, і (2) зміна параметра суміші (1), що забезпечує легку взаємодію активованого антитіла з уреазою з утворенням кон'югата антитіло-уреаза. У деяких аспектах параметр суміші (1) являє собою значення рН. У деяких аспектах зміна параметра суміші (1) включає підвищення рН до значення, при якому активоване антитіло легко взаємодіє з уреазою з утворенням кон'югата антитіло-уреаза. У деяких аспектах на стадії (2) активоване антитіло легко взаємодіє з уреазою, наприклад, у реакцію вступає щонайменше 90 956 або щонайменше 95 95 активованого антитіла, зі швидкістю, яка забезпечує фактичну відсутність некон'югованої уреази в суміші приблизно через 6 годин, приблизно через 5 годин, приблизно через 4 години, приблизно через З години, приблизно через 2 години або приблизно через 1 годину після зміни параметра суміші.
У деяких аспектах спосіб включає об'єднання активованого антитіла й уреази в кислому водяному буфері, що має рН приблизно 6,0-7,0, наприклад, приблизно 6,5, зміну значення рн до основного, що складає приблизно 8,0-9,0, наприклад, приблизно 8,3, з одержанням кон'югата антитіло-уреаза й очищення кон'югата антитіло-уреаза методом ультрадіафільтрації, причому цей спосіб не включає стадію хроматографічного очищення. У деяких аспектах водний буфер має рН приблизно від 5 до 8. У деяких аспектах активоване антитіло й уреазу об'єднують у кислому водному буфері. У деяких аспектах відношення активованого антитіла до уреази складає приблизно від З до 12. У деяких аспектах кон'югат антитіло-уреаза має коефіцієнт кон'югації 6-15 антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах кон'югат антитіло-уреаза має коефіцієнт кон'югації 8-11 фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах засіб, використовуваний для регуляції рН, являє собою буферний засіб або буферний розчин. У деяких аспектах засіб, використовуваний для регуляції рН, містить одну або кілька сполук, вибраних із соляної кислоти, сірчаної кислоти, азотної кислоти, борної кислоти, вугільної кислоти, бікарбонової кислоти, глюконової кислоти, гідроксиду натрію, гідроксиду калію, водного розчину аміаку, лимонної кислоти, моноетаноламіну, молочної кислоти, оцтової кислоти, бурштинової кислоти, фумарової кислоти, малеїнової кислоти, фосфорної кислоти, метансульфонової кислоти, яблучної кислоти, пропіонової кислоти, трифтороцтової кислоти, 60 їхніх солей або сполучень. У деяких аспектах буферний засіб містить одну або кілька сполук,
вибраних із гліцину, оцтової кислоти, лимонної кислоти, борної кислоти, фталевої кислоти, фосфорної кислоти, бурштинової кислоти, молочної кислоти, винної кислоти, вугільної кислоти, соляної кислоти, гідроксиду натрію, їхніх солей або сполучень. У деяких аспектах буферний розчин містить один або кілька буферів, вибраних з гідрохлориду гліцину, ацетатного буфера, цитратного буфера, лактатного буфера, фосфатного буфера, лимонна кислота-фосфатного буфера, фосфат-ацетат-боратного буфера, фталатного буфера або їхніх поєднань. У деяких аспектах буфер не є фосфатним буфером. У деяких аспектах кислий буфер являє собою натрій-ацетатний буфер. У деяких аспектах значення рН доводять до основного шляхом додавання водного розчину основи, такої як розчин борату натрію (наприклад, 0,1-5 М або 1 М).
Не бажаючи бути зв'язаними з теорією, автори вважають, що натрій-ацетатний буфер, який має низьку буферну ємність, підходить для доведення рН до 8,3, а за допомогою 1 М боратного буфера можна довести рН до 8,5. У деяких аспектах для доведення рН суміші до 8-9, наприклад до 8,3, використовують буфер Ттгі5-НСІ (наприклад, 1М Ттгі5-НОСЇ).
У деяких аспектах значення часу реакції і відношення антитіло/уреаза залишають постійними. У деяких аспектах молярне відношення антитіло/уреаза в реакційній суміші складає приблизно 25, або приблизно 21, або від 1,8 до 12 антитіл/уреазу. У деяких аспектах молярне відношення антитіло/уреаза регулюють у діапазоні від 4 до 25. У деяких аспектах молярне відношення антитіло/уреаза складає не менше 6.
У деяких аспектах після очищення, наприклад методом ультрадіафільтрації, у суміші присутньо не більше 1 95 або 2 95 антитіла, яке не прореагувало. У деяких аспектах можна використовувати інші способи очищення, відмінні від ВЕРХ. Наприклад, для очищення з більш низьким виходом можна використовувати кристалізацію з етанолу/фракціонування в етанолі. У деяких аспектах молекулярна маса антитіла складає не більше 50 кДа, наприклад приблизно 10-20 кДа або приблизно 13 кДа, а очищення здійснюють методом ультрадіафільтрації. У деяких аспектах спосіб дозволяє одержати кон'югат антитіло-уреаза з виходом, що складає щонайменше приблизно 60 95 відносно загального білка по масі, приблизно 70 95 відносно загального білка по масі, приблизно 80 95 відносно загального білка по масі, або щонайменше 90 95 відносно загального білка по масі. Загальний білок являє собою спільну кількість (по масі) уреази й антитіла АРБАЇКІ2. У деяких аспектах перед очищенням у реакційній суміші
Зо залишається не більше 10-20 95 (відносно маси загального білка) некон'югованого антитіла.
Технологія даного винаходу надає стабільну композицію, що містить активоване антитіло й уреазу в кислому водному розчиннику (як описано вище) і по суті не містить кон'югат антитіло- уреаза, наприклад, вона містить не більше ніж приблизно 5 95, 4 95, З Уо, 2 Уо або 1 95 кон'югата антитіло-уреаза в перерахуванні на масу уреази. Технологія даного винаходу також надає композицію, що містить кон'югат антитіло-уреаза і по суті не містить некон'юговану уреазу, наприклад, вона містить не більше ніж приблизно 595, 495, З в, 295 або 195 уреази в перерахуванні на масу кон'югат антитіло-уреаза у водяному розчиннику, де водний розчинник має рН приблизно 8-9, наприклад, 8,3 (як описане вище). У деяких аспектах композиція, що містить кон'югат антитіло-уреаза, також містить не більше 40-60 95 некон'югованого антитіла в перерахуванні на загальне антитіло (активоване антитіло і антитіло, яке не прореагувало). У деяких аспектах композиція, що містить кон'югат антитіло-уреаза, також містить не більше 10- 20 95 некон'югованого антитіла в перерахуванні на загальний білок.
Оскільки уреаза викликає вивільнення аміаку іп мімо, що виявляє загальну токсичність і сам не є специфічним до пухлин, присутність некон'югованої уреази підвищує ризик присутності уреази і прояву токсичності в нормальних тканинах. Однак через розмір і інші характеристики уреази кон'югація антитіл з уреазою не приводить до одержання продукту, розмір або інші характеристики якого не відрізняються від відповідних характеристик уреази в достатньому ступені, щоб забезпечити легке розділення кон'югата антитіло-уреаза і некон'югованої уреази методами хроматографічного очищення, особливо у великому масштабі.
Несподівано було виявлено, що технологія даного винаходу дозволяє досягти практично повної кон'югації уреази з антитілами, так що отриманий продукт по суті не містить некон'югованої уреази при відсутності якого-небудь хроматографічного очищення. Завдяки практично повній відсутності уреази описані тут композиції забезпечують доставку по суті усіх фрагментів уреази, що містяться в композиції, у цільову ділянку після системного введення.
Спрямована доставка уреази в цільову ділянку зменшує або усуває загальну токсичність аміаку, що продукується уреазою, і зменшує кількість уреази, необхідну для досягнення терапевтичного ефекту. Технологія даного винаходу особливо підходить для одержання у великих масштабах, таких як щонайменше приблизно 1 г, 10 г, 100 г або 1 кг, кон'югата антитіло-уреаза, що по суті не містить уреазу і може використовуватися для клінічних застосувань, зокрема для лікування 60 метастатичних пухлин, які важко або неможливо лікувати шляхом місцевого введення уреази.
Технологія даного винаходу також надає спосіб збільшення спорідненості антитіла до пухлинного антигену, що включає кон'югування декількох молекул антитіла з молекулою уреази з одержанням кон'югата антитіло-уреаза, де кон'югат має спорідненість до пухлинного антигену, приблизно в 100 разів, наприклад, приблизно в 200 разів, приблизно в 300 разів, приблизно в 400 разів і приблизно в 500 разів перевищує спорідненість некон'югованого антитіла. У деяких аспектах аналіз конкурентного зв'язування показує, що спорідненість кон'югата антитіло-уреаза приблизно в 100 разів, приблизно в 200 разів, приблизно в 300 разів, приблизно в 400 разів і приблизно в 500 разів перевищує спорідненість нативного однодоменного антитіла внаслідок підвищеної авідності. У деяких аспектах кон'югат має коефіцієнт кон'югації, що складає 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів антитіл на уреазний фрагмент. У деяких аспектах кон'югат має коефіцієнт кон'югації, що складає приблизно б або більше фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах кон'югат має коефіцієнт кон'югації, що складає 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах кон'югат має коефіцієнт кон'югації, що складає 8, 9, 10 або 11 фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах кон'югат має середній коефіцієнт кон'югації, що складає приблизно 8, 9, 10 або 11 фрагментів антитіл на фрагмент уреази. У деяких аспектах уреаза являє собою уреазу бобових. У деяких аспектах антитіло являє собою гуманізоване або нелюдське антитіло. У деяких аспектах антитіло являє собою однодоменне антитіло. У деяких аспектах пухлинний антиген експресується недрібноклітинною карциномою легені. У деяких аспектах антитіло має специфічність до
СЕАСАМБб. У деяких аспектах антитіло має спорідненість до СЕАСАМ6б, що характеризується значенням Ка, що перевищує приблизно 1х105 М. У деяких аспектах кон'югат зв'язується з
СЕАСАМЄб зі значенням Ка, яке не перевищує приблизно 1х10-9 М. У деяких аспектах кон'югат зв'язується з СЕАСАМб зі значенням Ка, яке не перевищує приблизно 1їх1079 М. У деяких аспектах кон'югат зв'язується з СЕАСАМЄ зі значенням ІСво, що не перевищує приблизно 5 нМ.
У деяких аспектах значення ІСво складає приблизно 3,22 нМ. У деяких аспектах кон'югат зв'язується з СЕАСАМ6 зі значенням ІСзо, що складає приблизно 20 мкг/мл. СЕАСАМБб, також відомий як неспецифічний перехресно-реагуючий антиген (МСА) або СОббс, являє собою добре охарактеризований раковий антиген. Його послідовність у високому ступені гомологічна послідовностям інших людських карциноембріональних антигенів, таких як СЕАСАМІ,
Зо СЕАСАМ? і СЕАСАМВ. Він являє собою зв'язаний із глікозилфосфоінозитолом (ОРІ) клітинний поверхневий білок, що не містить відомий цитоплазматичний домен. Експресія СЕАСАМб значно підвищена в тканинах раку молочної залози, підшлункової залози, яєчників, легень і товстої кишки.
Композиційні склади
Композиції технології даного винаходу містять кон'югат антитіло-уреаза, практично не містять уреазу і необов'язково не містять неводні розчинники, використовувані для ВЕРХ. У деяких аспектах композиція являє собою фармацевтично прийнятну композицію. Композиція може додатково містити біосумісні фармацевтичні носії, допоміжні засоби або наповнювачі. У деяких аспектах композиція знаходиться у вигляді твердої форми. У деяких аспектах композиція знаходиться у вигляді водного розчину, що містить приблизно 0,1-10 мг/мл, приблизно 0,5-5 мг/мл, приблизно 1-5 мг/мл, або приблизно 1,5-2,0 мг/мл кон'югата. У деяких аспектах водний розчин додатково містить допоміжну речовину, наприклад, одну або кілька сполук, вибраних з гістидину, сахарози і ЕДТА. У деяких аспектах водний розчин містить приблизно 1-20 мМ, наприклад 10 мМ гістидин, приблизно 0,1-5 мас./об. 95, наприклад 1 мас./об. 95 сахарози, приблизно 0,1-0,5 мМ, наприклад 0,2 мМ ЕДТА. У деяких аспектах водний розчин має рН, що складає приблизно 6,5-7, наприклад приблизно 6,8. У деяких аспектах водний розчин не містить фосфат. У деяких аспектах композиція являє собою тверду форму, отриману шляхом ліофілізації водного розчину. У деяких аспектах тверда форма не містить фосфат.
Композиція також може містити інші нуклеотидні послідовності, поліпептиди, лікарські засоби або гормони, змішані з наповнювачем (наповнювачами) або іншими фармацевтично прийнятними носіями. Композиції, відмінні від фармацевтичних композицій, необов'язково містять рідину, тобто воду або рідину на водяній основі.
Фармацевтично прийнятні наповнювачі, які додаються до фармацевтичних композицій, також добре відомі фахівцям у даній галузі і легко доступні. Вибір наповнювача почасти залежить від конкретного способу введення продукту. Відповідно, існує широкий спектр композицій, що підходять для застосування в контексті даної технології.
Способи одержання і уведення фармацевтичних композицій, які можна знайти в Кептіпдоп'є
Ріпаптасешііса! бсіеєпсез, 19 Ей., 19 Еа., М/Шіатв»в 8. УМіКіп5, 1995, добре відомі фахівцям у даній галузі. Вибір наповнювача почасти залежить від конкретного способу введення продукту 60 відповідно до технології даного винаходу. Відповідно, існує широкий спектр композицій, що підходять для застосування в контексті даної технології. Нижченаведені способи і наповнювачі є тільки ілюстративними, але ніяким чином не обмежувальними.
Фармацевтичні композиції відповідно до технології даного винаходу можна виробляти з використанням будь-якого традиційного способу, що включає, наприклад, процеси змішування, розчинення, гранулювання, розтирання в порошок, емульгування, інкапсулювання, уловлювання, охолодження розплаву на обертовому диску, сушіння розпиленням або ліофілізації. Однак оптимальний тип фармацевтичної композиції визначається фахівцем у даній галузі залежно від способу введення і бажаного дозування. Такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стабільність, швидкість вивільнення введеного засобу іп мімо і швидкість кліренсу введеного засобу іп мімо.
Фармацевтичні композиції складені так, щоб вони містили прийнятні фармацевтично прийнятних носіїв і можуть необов'язково містити наповнювачі і допоміжні речовини, що полегшують обробку активних сполук у препарати, які можна використовувати у фармацевтичних цілях. Спосіб уведення звичайно визначає природу носія. Наприклад, композиції для парентерального введення можуть містити водні розчини активних сполук у водорозчинній формі. Носії, що підходять для парентерального введення, можуть бути вибрані з фізіологічного розчину, забуференого фізіологічного розчину, розчину декстрози, води й інших фізіологічно сумісних розчинів. Переважними носіями для парентерального введення є фізіологічно сумісні буфери, такі як розчин Хенкса, розчини Рінгера або забуферений фізіологічний розчин. Композиції, призначені для тканинного або клітинного введення, можуть містити пенетранти, що відповідають конкретному бар'єру, який повинен бути подоланий. Такі пенетранти широко відомі в даній галузі. У випадку препаратів, що містять білки, композиція може містити стабілізуючі засоби, такі як поліоли (наприклад, сахароза), і/або поверхнево- активні речовини (наприклад, неіонні поверхнево-активні речовини) і т.п.
Альтернативно композиції для парентерального застосування можуть містити суспензії активних сполук, приготовлених у вигляді прийнятних масляних суспензій для ін'єкцій.
Прийнятні ліпофільні розчинники або носії включають жирні олії, такі як кунжутна олія і синтетичні ефіри жирних кислот, такі як етилолеат або тригліцериди, або ліпосоми. Водні суспензії для ін'єкцій можуть містити речовини, що підвищують в'язкість суспензії, такі як
Зо карбоксиметилцелюлоза натрію, сорбіт або декстран. Необов'язково суспензія може також містити прийнятні стабілізатори або засоби, що підвищують розчинність сполук, щоб забезпечити одержання висококонцентрованих розчинів. Також можна використовувати емульсії, наприклад дисперсії "масло-у-воді" і "вода-в-маслі", необов'язково стабілізовані емульгатором або диспергатором (поверхнево-активні речовини). Як описано вище, для парентерального введення також можна використовувати ліпосоми, що містять активний засіб.
Альтернативно можна одержати фармацевтичні композиції, які містять засіб у дозах, що підходять для перорального введення, з використанням фармацевтично прийнятних носіїв, добре відомих у даній галузі. Препарати, призначені для перорального введення, можуть знаходитися у вигляді таблеток, пігулок, капсул, облаток, коржів, рідин, гелів, сиропів, зависів, суспензій або порошків. Наприклад, фармацевтичні композиції для перорального введення можна одержати шляхом об'єднання активних сполук із твердим наповнювачем, необов'язково шляхом подрібнювання отриманої суміші й обробки суміші гранул після додавання прийнятних допоміжних речовин, якщо бажано, з одержанням таблеток. Пероральні композиції можуть містити рідкі носії, подібні до описаних для парентерального застосування, наприклад, забуферені водні розчини, суспензії і т.п.
Зазначені препарати можуть містити один або декілька наповнювачів, що включають, без обмеження: а) розріджувачі, такі як цукри, що включають лактозу, декстрозу, сахарозу, маніт або сорбіт; Б) зв'язувальні засоби, такі як силікат магнію алюмінію, крохмаль з кукурудзи, пшениці, рису, картоплі і т.д.; с) целюлозовмісні речовини, такі як метилцелюлоза, гідроксипропінелцелюлоза і карбоксиметилцелюлоза натрію, полівінілпіролідон, камеді, такі як гуміарабік і трагакант, і білки, такі як желатин і колаген; 4) дезінтегрируючі або солюбілізуючі засоби, такі як зшитий полівінілпіролідон, крохмалі, агар, альгінова кислота або її сіль, така як альгінат натрію; або шипучі композиції; е) мастильні засоби, такі як діоксид кремнію, тальк, стеаринова кислота, або її магнієва або кальцієва сіль, і поліетиленгліколь; Її) ароматизатори і підсолоджувачі; 9) барвники або пігменти, використовувані, наприклад для ідентифікації продукту або для характеристики кількості (дози) активного засобу; і М) інші інгредієнти, такі як консерванти, стабілізатори, засоби, що сприяють набряканню, емульгатори, засоби, що сприяють розчиненню, солі для регуляції осмотичного тиску і буфери.
Фармацевтична композиція може бути надана у вигляді солі активного засобу, що може бути 60 утворена багатьма кислотами, що включають, без обмеження, соляну, сірчану, оцтову,
молочну, винну, яблучну, бурштинову й ін. Солі, як правило, краще розчиняються у водних або інших протонних розчинниках, ніж відповідні вільні основи.
Характеристики самого кон'югата і композиції, що містить кон'югат, можуть впливати на фізичний стан, стабільність, швидкість вивільнення іп мімо і швидкість кліренсу іп мімо кон'югата, що вводиться. Таку інформацію про фармакокінетичні ії фармакодинамічні параметри можна одержати в ході доклінічних досліджень іп міо і іп мімо, і потім підтвердити за допомогою клінічних випробувань на людях. Посібник із проведення клінічних випробувань на людях на основі результатів випробувань на тваринах іп мімо можна знайти в ряді джерел, таких, як, наприклад, пЕер:/Лумли.сіІїпісайгіа!5.дом. Таким чином, терапевтично ефективну дозу будь-якої сполуки, використовуваної в способі технології даного винаходу для введення ссавцям, зокрема людям, можна початково визначити за допомогою біохімічних і/або клітинних аналізів. Потім дозування можна скоригувати на тваринних моделях, щоб досягти бажаного діапазону концентрацій у кровотоці, який модулює активність кон'югата. Дослідження на людях подають додаткову інформацію відносно відповідних рівнів дозування і тривалості лікування різних захворювань і станів.
Токсичність і терапевтичну ефективність кон'югата можна оцінити за допомогою стандартних фармацевтичних аналізів, проведених на культурах клітин або на експериментальних тваринах, наприклад, шляхом визначення ІЮОзо (доза, летальна для 50 95 популяції) і ЕОхо (доза, терапевтично ефективна для 50 95 популяції).
Додаткові активні засоби
До складу композиції, що підходить для застосування в технології даного винаходу, також можуть входити інші активні засоби. Інші активні засоби, такі як протипухлинний засіб (засіб, активність якого спрямована проти проліферуючих клітин), можна використовувати в композиції до, одночасно або після приведення клітин у контакт із першим активним засобом. Наприклад, уреаза після доставки до пухлинних клітин може мати здатність модулювати або регулювати зовнішнє середовище пухлини, наприклад, шляхом зміни рн. Після цього активні засоби, такі як протипухлинні засоби, які сприяють утворенню основного середовища, є більш ефективними.
У деяких аспектах як активні засоби використовують субстрати, на які спрямована ферментативна активність уреази. У деяких аспектах активний засіб являє собою субстрат,
Зо який уреаза може використовувати для утворення іонів амонію, такий як сечовина.
Приклади протипухлинних засобів включають цитокіни й інші сполуки, такі як інтерлейкіни (наприклад, 1/-2, 1/-4, 11 -6, 1/-12 ї т.п.), трансформуючий фактор росту бета, лімфотоксин, фактор некрозу пухлини, інтерферони (наприклад, гамма-інтерферон), колонієстимулюючі фактори (наприклад, СЗМ-С5Е, М-СБЕ і т.п), фактор судинної проникності, лектинові стимулятори запальної відповіді (селектини), такі як І-селектин, Е-селектин, Р-селектин, і білкові сполуки, такі як рецепторні білки С1д і МК. Інші прийнятні протипухлинні засоби включають сполуки, що інгібують ангіогенез і, як наслідок, метастазування. Приклади таких засобів включають протамінмедроксипрогестерон, полісульфат пентозану, сурамін, таксол, талідомід, ангіостатин, інтерферон-альфа, інгібітори металопротеїнази, тромбоцитарний фактор 4, соматостатин, тромбоспондин. Інші ілюстративні і необмежувальні приклади активних засобів, що підходять для застосування в технології даного винаходу, включають вінкристин, вінбластин, віндезин, бусульфан, хлорамбуцил, спіроплатин, цисплатин, карбоплатин, метотрексат, адріаміцин, мітоміцин, блеоміцин, цитозину арабінозид, арабінозиладенін, меркаптопурин, мітотан, прокарбазин, дактиноміцин (антиноміцин 0), даунорубіцин, доксорубіцину гідрохлорид, таксол, пліксаміцин, аміноглютетимід, естрамустин, флутамід, лейпролід, мегестролу ацетат, тамоксифен, тестолактон, трилостан, амсакрин (т-АМ5А), аспарагіназа (І -аспарагіназа) етопозид, продукти крові, такі як гематопорфірини, або похідні перерахованих вище сполук. Інші приклади активних засобів включають генетичний матеріал, такий як нуклеїнові кислоти, РНК і ДНК природного або синтетичного походження, у тому числі рекомбінантні РНК і ДНК. ДНК, які кодують визначені білки, можна використовувати для лікування численних захворювань різних типів. Наприклад, гени фактора некрозу пухлини або інтерлейкіну-2 можна використовувати для лікування запущених злоякісних пухлин; гени тимідинкінази можна використовувати для лікування раку яєчників або пухлин головного мозку; а гени інтерлейкіну-2 можна використовувати для лікування нейробластоми, злоякісної меланоми або раку нирок. Інші активні засоби, що підходять для застосування в технології даного винаходу, описані в патенті США Мо 6261537, який включений у даний опис шляхом посилання у всій повноті. Протипухлинні засоби і способи скринінгу для детекції таких засобів описані в Мопда, М. апа 5аизміПе, Е.А. (2002) ГеикКетіа 16(4):520-6.
У деяких аспектах активний засіб являє собою слабкоосновну протипухлинну сполуку, бо ефективність якої зменшується в умовах градієнта, що включає більш високі внутрішньоклітинні/більш низькі позаклітинні значення рН, які присутні у солідній пухлині.
Прикладами слабкоосновної протипухлинної сполуки є доксорубіцин, даунорубіцин, мітоксантрон, епірубіцин, мітоміцин, блеоміцин, алкалоїди барвінку, такі як вінбластин і вінкристин, алкілуючі засоби, такі як циклофосфамід і мехлоретаміну гідрохлорид, а також протипухлинні похідні пуринів і піримідинів.
У деяких аспектах композиція містить уреазу і практично не містить цитокіни, такі як фактор некрозу пухлини і/або інтерферони. У цьому аспекті уреаза сама по собі, або разом з активними засобами, відмінними від цитокінів, у сполученні з низькомолекулярними протипухлинними засобами ефективно інгібує ріст ракових клітин. Таким чином, у цьому аспекті композиція може необов'язково діяти разом з ендогенними або нативними цитокінами, які присутні в організмі підлягаючого лікуванню індивідуума, але композиція, що вводиться, не містить інші, екзогенні цитокіни.
У деяких аспектах додатковий активний засіб не є пеметрекседом і/або карбоплатином. У деяких аспектах додатковий активний засіб не є фолатним антиметаболітом і/або платиновмісним засобом.
Способи доставки і введення
Композицію, яка містить кон'югат антитіло-уреаза, можна доставляти до ракових клітин за допомогою ряду способів, відомих у даній галузі. При терапевтичному застосуванні композицію вводять пацієнту, що несе ракові клітини, у кількості, достатній для інгібування росту ракових клітин. Впливи фармацевтичних композицій на ракові клітини можна досягти шляхом уведення різними способами, що включають, без обмеження, парентеральне введення, ентеральне введення, трансепітеліальне введення, трансмукозальне введення, трансдермальне введення і/або введення хірургічним способом.
Способи парентерального введення містять у собі, наприклад, внутрішньовенні, внутрішньоартеріальні, внутрішньоочеревинні, інтрамедулярні, внутрішньом'язові, внутрішньосуглобові, інтратекальні і внутрішньошлуночкові ін'єкції, підшкірні, внутрішньогонадні або внутрішньопухлинні голкові болюсні ін'єкції, або тривалі безперервні, періодичні або плановані перфузії або мікроінфузії з використанням відповідної насосної технології. Способи ентерального уведення включають, наприклад, пероральне (у тому числі букальне і
Зо сублінгвальне) і ректальне введення. Способи трансепителіального уведення включають, наприклад, уведення через слизову оболонку і черезшкірне введення. Трансмукозальне уведення включає, наприклад, ентеральне введення, назальне введення, уведення шляхом інгаляції, а також і глибоке легеневе введення, вагінальне введення і ректальне введення.
Трансдермальне уведення включає пасивні або активні способи трансдермального або черезшкірного введення, що включають, наприклад, застосування пластирів і пристроїв для іонтофорезу, а також місцеве застосування паст, кремів або мазей. Хірургічні способи включають імплантацію депо (резервуарних), осмотичних насосів і т.п.
Можна здійснювати однократне або багаторазове введення активного засобу, залежно від дозування і частоти, у міру необхідності і переносимості індивідуумом. У будь-якому випадку композиція повинна забезпечувати кількість активного засобу, достатню для ефективного лікування індивідуума.
У деяких аспектах технологія даного винаходу включає застосування везикул, таких як ліпосоми і/або нанокапсули, як хімічних засобів для доставки фармацевтичної композиції, що містить кон'югат антитіло-уреаза, до ракових клітин. Такі препарати можуть переважно використовуватися для введення описаних тут фармацевтично прийнятних композицій поліпептидів, фармацевтичних засобів і/або антитіл. Способи одержання і застосування ліпосом широко відомі фахівцям у даній галузі. (Див., наприклад, ВасКег, М.М., еї аїІ. (2002) Віосопійд
Спет 13(3):462-7). У переважному аспекті розкрита композиція може бути поміщена в ліпосому.
Як правило, нанокапсули уловлюють сполуки в стабільній і відтвореній манері (У/пеїап, 5. (2001) Огид Оівсом Тодау 6 (23): 1183-84). Щоб уникнути побічних ефектів, обумовлених високим вмістом полімерів усередині клітини, такі надмалі частинки (розміром приблизно 0,1 мкм) можна виготовити 3 полімерів, здатних деградувати іп мімо. Біорозкладані наночастинки з поліізобутилціаноакрилату, що відповідають зазначеним вимогам, підходять для застосування в технології даного винаходу, причому такі частинки можна легко одержати за способом, описаним, наприклад, у І атрбегі, ., еї аї. (2001) Іпї У Ріагт 214 (1-2): 13-6. Способи одержання і застосування поліалкілціаноакрилатних наночастинок, що містять біологічно активні речовини, описані в патентах США МоМо 4329332, 4489055 і 4913908. Нанокапсули можна придбати на комерційній основі, наприклад, у Сарзцїшіоп, Іпс. (м/мли.сарзи!шіоп.сот).
Фармацевтичні композиції, які містять нанокапсули, що забезпечують доставку композицій, 60 описані в патентах США Мо МоМо 5500224, 5620708 і 6514481. У патенті США 5500224 описана фармацевтична композиція у вигляді колоїдної суспензії нанокапсул, що містить масляну фазу, яка складається в основному з масла, що містить розчинену в ньому поверхнево-активну речовину, і суспендованої в ньому множини нанокапсул, що мають діаметр менший 500 нанометрів. У патенті США Мо 5620708 описані композиції і способи введення лікарських засобів і інших активних засобів. Композиції містять частинки носія активного засобу, приєднані до зв'язувального фрагмента, що специфічно зв'язується з молекулою-мішенню, яка присутня на поверхні ентероцита ссавців. Зв'язувальний фрагмент зв'язується з молекулою-мішенню зі спорідненістю або авідністю, достатньою для ініціації ендоцитозу або фагоцитозу частинок носія активного засобу, у результаті якого носій поглинається ентероцитом. Потім активний засіб вивільняється з носія в системний кровотік хазяїна. З використанням такого способу можна уникнути деградації в кишечнику чутливих до деградації ліків, таких як поліпептиди, і досягти збільшення абсорбції білків і поліпептидів з кишкового тракту. Альтернативно технологія даного винаходу забезпечує вивільнення активного засобу в середовище, що оточує клітину-«мішень. Наприклад, в одному аспекті кон'югати антитіло-уреаза вивільняються з нанокапсул після зв'язування напрямного фрагмента з клітиною-мішенню, у результаті чого уреаза вивільняється в мікросередовище, що оточує клітину-мішень, наприклад пухлинну клітину. У патентах США МоМо 6379683 і 6303150, що включені в даний опис шляхом посилання, описані способи одержання і застосування нанокапсул.
Використовувану фармацевтичну композицію вводять індивідууму в ефективній кількості. Як правило, ефективна кількість являє собою кількість, ефективну для (1) зниження симптомів захворювання, що підлягає лікуванню; або (2) індукції фармакологічної зміни, що має відношення до лікування захворювання, що підлягає лікуванню. У випадку раку ефективна кількість може являти собою кількість, ефективну для: зменшення розміру пухлини; уповільнення росту пухлини; запобігання або інгібування метастаз; або збільшення тривалості життя ураженого індивідуума. Приведення в контакт містить у собі додавання до клітин кон'югата, що містить напрямний фрагмент, і перший спіралеутворюючий пептид, що характеризується вибраним зарядом і здатністю взаємодіяти з другим, протилежно зарядженим спіралеутворюючим пептидом з утворенням стабільного а-спірального гетеродимера, що має біспіральну структуру. Потім до клітин додають ліпосому. Ліпосома має зовнішню поверхню і
Зо внутрішній відсік; активний засіб, наприклад уреаза, знаходиться у внутрішньому відсіку ліпосоми; і сукупність других пептидів, причому кожен другий пептид з'єднаний із зовнішньою поверхнею ліпосоми.
У деяких аспектах приведення в контакт включає додавання ліпосом до клітин, де ліпосоми містять активний засіб, наприклад кон'югати антитіло-уреаза, у внутрішньому відсіку, а зовнішні поверхні ліпосоми містять елемент, спрямований на клітини, здатний специфічно зв'язуватися з поверхнею-мішенню, і гідрофільне полімерне покриття, що забезпечує ефективний захист цільового фрагмента від взаємодії з поверхнею-мішенню. Гідрофільне полімерне покриття може складатися з полімерних ланцюгів, ковалентно зв'язаних з ліпідними компонентами поверхонь ліпосом за допомогою зв'язків, що піддаються руйнуванню. У деяких аспектах до пухлинних клітин додають вивільнювальний засіб у кількості, що забезпечує руйнування значної частини зв'язків у доданих ліпосомах, тим самим створюючи можливість для взаємодії напрямного фрагмента з поверхнею-мішенню. Зв'язки, що руйнуються, можуть являти собою відновлювані хімічні зв'язки, такі як дисульфідні, складноефірні і пептидні зв'язки.
У деяких аспектах винахід надає спосіб лікування індивідуума-ссавця з використанням ліпосом. Спосіб містить у собі системне введення індивідууму, наприклад внутрішньовенне введення, ліпосом, що містять зв'язаний з поверхнею напрямний фрагмент і гідрофільне полімерне покриття. Гідрофільне полімерне покриття, що складається з полімерних ланцюгів, з'єднаних зв'язками, що руйнуються, ефективно захищає напрямний Фрагмент від взаємодії з його мішенню. Уведеним ліпосомам дозволяють циркулювати в кровотоці до досягнення бажаного біорозподілу. Вивільнювальний засіб вводять індивідууму в кількості, ефективній для розщеплення значної частини, наприклад, більше ніж приблизно 50 95, переважно більше ніж приблизно 70 95 і більш переважно більше ніж приблизно 90 95 руйнованих зв'язків у введених ліпосомах. Після вивільнення ланцюгів гідрофільного полімеру напрямний фрагмент експонується для взаємодії з мішенню.
У деяких аспектах ліпосоми використовують для лікування солідної пухлини. Ліпосоми містять у внутрішньому відсіку кон'югат антитіло-уреаза і необов'язково інший активний засіб, наприклад протипухлинний лікарський засіб, і спрямовуються до ділянки пухлини за допомогою напрямного фрагмента, здатного специфічно зв'язуватися з пухлиноспецифічним антигеном. В ілюстративному способі ліпосоми спрямовують до клітин ендотелію судин пухлин шляхом бо включення в ліпосоми ліганда МЕСЕ, що забезпечує селективне приєднання до рецепторів РІК-
1,2, які експресуються в ендотеліальних клітинах проліферуючих пухлин (Міведептап, Т.М., еї аї. (2002) Ргос Маї! Асєдй 5сі 99 (10): 7009-14).
У деяких аспектах ліпосоми мають розмір у діапазоні приблизно 30-400 нм. Показано, що ліпосоми, які відповідають зазначеному діапазону розмірів, можуть проникати в пухлини через "щілини", які присутні у ендотеліальних клітинах, що вистилають судинну мережу пухлини (Магоуата, К, єї а. (1999) Адм Огид Овїїм Нем 40 (1-2): 89-102).
Через проміжок часу після введення ліпосом, наприклад внутрішньовенного введення, достатній для розподілу ліпосом в організмі індивідуума і зв'язування з пухлиною, індивідууму вводять вивільнювальний засіб, щоб видалити гідрофільне поверхневе покриття ліпосом.
Видалення поверхневого покриття приводить до експонування напрямного фрагмента, що забезпечує зв'язування ліпосом із клітинами-мішенями. В одному аспекті гідрофільне поверхневе покриття приєднується до ліпосом за допомогою рН-чутивих зв'язків. Зв'язки руйнуються після зв'язування ліпосом з пухлиною.
У будь-якому з описаних вище аспектів ліпосоми можуть необов'язково містити один або декілька протипухлинних засобів або візуалізуючих засобів, або ті й інші. Ліпосоми можна додати і залишити їх розподілятися, після чого можна увести вивільнювальний засіб, щоб видалити гідрофільне поверхневе покриття, експонувати приєднаний напрямний фрагмент і ініціювати зв'язування. Для одержання і введення ліпосом можна використовувати способи, описані в патенті США Мо 6043094, що включений у даний опис шляхом посилання.
У технології даного винаходу можна використовувати й інші засоби доставки, такі як невеликі одношарові везикули (ЗМ), описані в патенті США Мо 6180114, що включений у даний опис шляхом посилання у всій своїй повноті.
Фахівцям у даній галузі техніки відомо, що існують деякі ділянки, які характеризуються поганою васкуляризацією, або які захищені клітинами, з'єднаними міцними зв'язками, і/або активними механізмами транспорту, що зменшують або запобігають проникненню макромолекул у кровотік. Так, наприклад, системне введення терапевтичних засобів для лікування гліом або інших видів раку мозку може обмежуватися гематоенцефалічним бар'єром, що перешкоджає проникненню макромолекул у субарахноїдальний простір. При лікуванні таких типів пухлин терапевтичну композицію переважно вводити безпосередньо в ділянку пухлини.
Зо Так, наприклад, пухлини головного мозку можна лікувати шляхом уведення терапевтичної композиції безпосередньо в ділянку пухлини, наприклад, за допомогою болюсної ін'єкції, мікроінфузії або катетера, імплантованого хірургічним шляхом.
Дозування
У способі технології даного винаходу можна використовувати будь-який ефективний режим, що визначає час і послідовність уведення доз. Типові рівні доз, що підходять для введення індивідууму-людині, залежать від способу введення, стадії (розміру і поширення) пухлини, маси пацієнта і відповіді пацієнта на лікування раку за допомогою уреази.
При введенні композиції, що містить кон'югат антитіло-уреаза, наприклад, шляхом ін'єкції безпосередньо в пухлину, типова доза складає приблизно від 0,1 до 100010 мкг/кг маси тіла, наприклад, приблизно від 0,2 до 5 мкг/кг, або приблизно від 0,5 до 2 мкг/кг. Положення ін'єкційної голки можна контролювати за допомогою традиційних методів візуалізаційного контролю, наприклад, за допомогою флюороскопії, що дозволяє лікарю бачити положення голки відносно тканини-мішені. Такі інструменти контролю можуть включати ультразвук, флюороскопію, КТ або МРТ.
У деяких аспектах ефективність або розподіл дози, що вводиться, кон'югатів антитіло- уреаза можна контролювати під час або після введення кон'югата антитіло-уреаза в пухлину шляхом моніторингу пухлинної тканини за допомогою інструмента, що дозволяє знайти зміну рН у ділянці ракової тканини індивідуума. Такі інструменти можуть включати рН-зонд, що може бути впроваджений безпосередньо в пухлину, або інструмент візуалізації, такий як магнітно- резонансна томографія (МРТ), комп'ютерна томографія (КТ) або флюороскопія. МРТ- обстеження можна проводити за відсутністю додаткових засобів візуалізації, грунтуючись тільки на розходженнях у магнітних властивостях тканини залежно від рН. Для проведення КТ або флюороскопічної візуалізації може знадобитися застосування додаткового рН-чутливого засобу візуалізації, прозорість якого залежить від рН тканинного середовища. Такі засоби добре відомі фахівцям у даній галузі.
Перед будь-яким уведенням кон'югата антитіло-уреаза пухлинну тканину можна візуалізувати по більш низькому значенню рН, ніж у оточуючій нормальній тканині. Так, нормальна тканина може мати нормальне значення рнН, що складає приблизно 7,2, тоді як рН пухлинної тканини може бути на 0,1-0,4 або більше одиниць нижче. Тобто, перед будь-яким бо уведенням кон'югата антитіло-уреаза розмір пухлинної тканини можна визначити по більш низькому значенню рН. Після введення уреази рН ділянки пухлини, що містить уреазу, почне рости, причому збільшення рН можна визначити шляхом порівняння отриманих зображень із зображеннями, отриманими раніше до введення.
За допомогою такого аналізу тканини можна контролювати ступінь зміни рН і розмір ураженої тканини. На основі результатів зазначеного аналізу лікар може ввести іншу композицію в ділянку пухлини, і/або він може ввести композицію в інші сегменти пухлинної ділянки. Цю процедуру можна повторювати доти, поки не буде досягнутий бажаний ступінь зміни рН, наприклад від 0,2 до 0,4 одиниці рн, по всій ділянці солідної пухлини.
Уведення, наприклад шляхом прямої ін'єкції, можна повторювати через прийнятні інтервали часу, наприклад, щотижня або два рази на тиждень, доти, поки не буде досягнутий бажаний результат, переважно істотна або повна регресія пухлинної маси. Ефективність лікування можна контролювати, як зазначено вище, шляхом візуалізації змін рН обробленої тканини в ході лікування. Таким чином, перед кожною додатковою ін'єкцією рН тканини можна візуалізувати для визначення існуючого об'єму пухлини, після чого зміну рН тканини можна використовувати для контролю введення в тканину нової дози композиції антитіло-уреаза.
Якщо композицію антитіло-уреаза вводять парентерально способом, відмінним від прямої ін'єкції, зразкова доза композиції антитіло-уреаза складає 100-100000 міжнародних одиниць/кг активності уреази/кг маси тіла індивідуума. Як відзначено в даному документі, композиція антитіло-уреаза в цьому способі містить антитіло для націлювання уреази на ракові клітини, наприклад на ділянку солідної пухлини, або для секвестрування уреази, наприклад, у ліпосомальній формі, селективно в ділянці пухлини.
Технології візуалізації, чутливі до змін рН тканини, можна використовувати для контролю ефективності дози, що вводиться. Оскільки досягнення мішені може зайняти кілька годин або більше, спосіб може містити в собі визначення рН пухлини, як зазначено вище, перед уведенням композиції антитіло-уреаза і через кілька годин після введення, наприклад, через 12- 24 годин, для підтвердження того, що в ділянку пухлини була введена достатня доза, про що свідчить підвищення рН у ділянці пухлини. Залежно від результатів цього аналізу спосіб може містити в собі додаткове введення до досягнення бажаного збільшення рн, наприклад, на 0,2- 0,4 одиниці рН. Після визначення дози пацієнт може регулярно одержувати подібну дозу уреаза-вмісної композиції, наприклад, один або два рази на тиждень, доти, поки не буде досягнута зміна розміру або стану пухлини.
Кінцевий режим дозування визначає лікуючий лікар з урахуванням успішної медичної практики, залежно від різних факторів, що впливають на дію лікарських засобів, таких як питома активність засобу, тяжкість хворобливого стану, сприйнятливість пацієнта, вік, стан, маса тіла, стать і раціон пацієнта, тяжкість якої-небудь інфекції і т.п. Інші фактори, які можна взяти до уваги, включають час і частоту введення, поєднання лікарських засобів, чутливість реакції і толерантність до терапії/відповідь на терапію. Подальше уточнення дози, що підходить для лікування з використанням однієї зі згаданих тут композицій, проводить традиційним способом фахівець-практик, переважно з урахуванням інформації про дози і результати описаних тут аналізів, а також фармакокінетичних даних, отриманих у клінічних випробуваннях. Прийнятні дози можна установити за допомогою аналізів, розроблених для визначення концентрації засобу в рідині організму, або в іншому зразку, поряд з даними про залежність між дозою й ефектом.
Частота введення дози залежить від фармакокінетичних параметрів засобу і способу введення. Дозування і введення регулюють, щоб забезпечити достатній рівень активного засобу або підтримувати бажаний ефект. Відповідно, фармацевтичні композиції можна вводити у вигляді однократної дози, декількох дискретних доз, безперервної інфузії, депо з уповільненим вивільненням або їхніх поєднань, залежно від того, яка схема введення забезпечує підтримку бажаного мінімального рівня засобу.
Фармацевтичні композиції короткочасної дії (тобто з коротким періодом напіввиведення) можна вводити один раз на день або частіше, ніж один раз на день (наприклад, два, три або чотири рази на день). Фармацевтичні композиції тривалої дії можна вводити кожні 3-4 дні, щотижня, або раз на два тижні. Можна використовувати насоси, такі як підшкірні, внутрішньоочеревинні або субдуральні насоси для безперервної інфузії.
Композиції, які містять кон'югат у фармацевтично прийнятному носії, після одержання можна помістити у відповідний контейнер і маркувати для лікування зазначеного стану. Стани, зазначені на етикетці, можуть включати, без обмеження, різні типи раку. Винахід також пропонує описані нижче набори, що містять лікарську форму фармацевтичної композиції і вкладиш в упаковку, що містить інструкції з застосування композиції для лікування медичного (516) стану.
Як правило, кон'югат-вмісні композиції вводять індивідууму в ефективній кількості.
Ефективна кількість звичайно являє собою кількість, ефективну для (1) зменшення симптомів захворювання, що підлягає лікуванню; або (2) індукції фармакологічної зміни, пов'язаної з лікуванням захворювання, що підлягає лікуванню. У випадку раку ефективна кількість може являти собою кількість ефективну для: зменшення розміру пухлини; уповільнення росту пухлини; запобігання або інгібування метастазуванню; або збільшення тривалості життя ураженого індивідуума.
Спосіб лікування
Технологія даного винаходу надає спосіб лікування раку в індивідуума, що включає введення індивідууму терапевтично ефективної кількості описаної тут композиції, що забезпечує лікування раку в індивідуума. Ракові захворювання, що підходять для лікування за допомогою описаних тут способів, містять у собі, як правило, карциноми, лейкози, лімфоми і саркоми. Карциноми можуть являти собою карциноми ануса, жовчного тракту, сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, прямої кишки, легень, ротоглотки, гіпофаринкса, стравоходу, шлунка, підшлункової залози, печінки, нирок, жовчного міхура і жовчних проток, тонкого кишечнику, сечовивідних шляхів, яєчників, товстої кишки, недрібноклітинну карциному легень, карциноми статевих шляхів, ендокринних залоз, щитовидної залози і шкіри. Інші прийнятні види раку включають карциноїдні пухлини, стромальні пухлини шлунково-кишкового тракту, пухлини голови і шиї, первинні пухлини, гемангіоми, меланоми, злоякісну мезотеліому, множинну мієлому, а також пухлини головного мозку, нервів, очей і оболонок мозку.
У деяких аспектах ракові захворювання, що підлягають лікуванню, утворюють солідні пухлини, такі як карциноми, саркоми, меланоми і лімфоми. У деяких аспектах рак являє собою одне або кілька захворювань, вибраних з недрібноклітинної карциноми легені, раку молочної залози, підшлункової залози, яєчників, легень, товстої кишки або їхніх поєднань. У деяких аспектах рак являє собою недрібноклітинну карциному легені. У деяких аспектах індивідуум являє собою людину.
Терапевтично ефективну дозу можна визначити за допомогою способів, добре відомих у даній галузі. Тваринні моделі раку, такі як імунокомпетентні миші з мишачими пухлинами або імунокомпромісні миші (наприклад голі миші), що несуть ксенотрансплантати пухлин людини,
Зо добре відомі в даній галузі і широко описані в багатьох публікаціях, включених у даний опис шляхом посилання. Таку інформацію використовують у сполученні з результатами досліджень безпеки на щурах, собаках і/або приматів, які не є людьми, для визначення безпечних і потенційно корисних для людей вихідних доз. Додаткову інформацію для визначення дози, що підходить для введення організмам, може одержати за допомогою клінічних випробувань реального раку людини.
У деяких аспектах спосіб лікування раку призначається для лікування, а також поліпшення щонайменше одного симптому раку. Вважається, що лікування ракових хворих проходить успішно, якщо пацієнт виліковується від раку, спостерігається ремісія раку, подовжується виживаність у статистично значущій манері, статистично значущо збільшується час до розвитку пухлини, спостерігається зменшення навантаження лімфоцитарної або гематопоетичної пухлини, що визначається на підставі стандартних критеріїв, установлених для кожного типу лімфоцитарного або гемопоетичного злоякісного захворювання, або зменшення маси солідної пухлини, що визначається на підставі критеріїв оцінки відповіді солідних пухлин (КЕСІЗТ 1.0 або
ВЕСІБТ 1.1, Тнегаззе еї аї. ) Маї). Сапсег Іпві. 92(3):205-216, 2000 апа Еізепнацег сеї аї. Єишг. 9.
Сапсег 45:228-247, 2009). Використовуваний тут термін "ремісія" стосується відсутності зростаючих ракових клітин у пацієнта, що раніше мав симптоми раку. Так, якщо раковий пацієнт знаходиться в стані ремісії, це означає, що або він вилікуваний від раку, або рак присутній, але важко діагностується. Наприклад, рак може знаходитися в стані ремісії, якщо пухлина не може збільшуватися або метастазувати. Повна ремісія, відповідно до даного опису, включає відсутність захворювання за даними діагностичних методів, таких як візуалізація, наприклад, за допомогою рентгену, МРТ, КТ і РЕТ, або біопсія крові або кісткового мозку. Якщо раковий пацієнт переходить у стан ремісії за цим може піти рецидив, при якому рак знову відновлюється.
У деяких аспектах лікування не проводять у сполученні з застосуванням пеметрексу і/або карбоплатину. У деяких аспектах лікування не проводять у сполученні з застосуванням фолатного антиметаболіту і/або платиновмісного засобу.
Набори
У деяких аспектах технологія даного винаходу надає набори для інгібування росту пухлинних клітин за допомогою описаних тут способів. До складу наборів входить контейнер, 60 що містить один або кілька активних засобів. Набори можуть додатково містити будь-який з описаних тут інших компонентів, що підходять для здійснення способів технології даного винаходу.
До складу наборів можуть необов'язково входити інструкції, що містять посібники (тобто протоколи) по застосуванню активних засобів для інгібування росту пухлинних клітин. Таким чином, в одному аспекті до складу набору входять фармацевтична композиція, що містить активний засіб, переважно фермент уреазу, і інструкції з уведення композиції індивідууму з метою лікування раку в індивідуума. В одному аспекті інструкція навчає введенню уреаза- вмісної композиції індивідууму в кількості, що залежить від розміру пухлини і складає від 0,1 до 100 міжнародних одиниць уреазної активності на мм? пухлини, якщо композицію вводять за допомогою прямої ін'єкції в пухлину, і в кількості від 100 до 100000 міжнародних одиниць уреазної активності/кг маси тіла, якщо композицію вводять індивідууму парентеральним способом, відмінним від прямої ін'єкції в пухлину.
В іншому аспекті інструкція навчає введенню уреазавмісної композиції індивідууму, який також одержує слабкоосновну протипухлинну сполуку, ефективність якої знижується в умовах градієнта більш високе значення внутрішньоклітинного рН/більш низьке значення позаклітинного рН, що спостерігається в солідній пухлині, де уреаза присутня у кількості, ефективній для зменшення або усунення градієнта більш високе значення внутрішньоклітинного рН/більш низьке значення позаклітинного рН, що спостерігається в солідній пухлині.
Альтернативно інструкція навчає введенню уреазавмісної композиції індивідууму, що має, або ймовірно має солідну пухлину, в умовах, ефективних для локалізації уреази в солідній пухлині індивідуума, обстеженню індивідуума за допомогою діагностичного інструмента, що дозволяє знайти зміну позаклітинного рнН у тканині індивідуума, і ідентифікації ділянки тканини індивідуума, у якій спостерігається підвищення позаклітинного рН після зазначеного введення.
Хоча інструкції звичайно містять письмові або друковані матеріали, вони не обмежуються такими. Будь-які носії інформації, здатні зберігати такі інструкції і надавати їх кінцевому користувачу, входять в обсяг технології даного винаходу. Такі носії містять у собі, без обмеження, електронні носії (наприклад, магнітні диски, касети, картриджі, чипи), оптичні носії (наприклад, СО-КОМ) і т.п. Зазначені носії можуть містити посилання на інтернет-сайти, що
Зо надають такі інструкції.
Приклади
Нижченаведені приклади наведені для ілюстрації різних аспектів винаходу. Вони не призначені для обмеження винаходу яким-небудь чином. Для фахівця в даній галузі буде очевидно, що з використанням даного опису можна досягти зазначених цілей, результатів і переваг, а також будь-яких цілей, результатів і переваг, властивих даному винаходу. Наведені приклади (поряд з описаними тут способами) представляють переважні аспекти. Вони є ілюстративними і не призначені для обмеження обсягу винаходу. Варіації й інші способи застосування, що входять в обсяг винаходу, що визначається формулою винаходу, будуть очевидні для фахівців у даній галузі.
Приклад 1: /-00547: Кон'югат антитіло-уреаза, спрямований на СЕАСАМб-експресуючі пухлини
Мікросередовище в пухлинах часто є кислим в порівнянні з нормальною тканиною.
Безпосередньою причиною, імовірно, є нагромадження лактату в результаті анаеробного гліколізу у відповідь на місцеву гіпоксію, обумовлену аберантною судинною мережею (1, 2).
Однак ракові клітини продовжують метаболізувати глюкозу анаеробно навіть у присутності кисню (3). Це дозволяє припустити, що конвертований метаболічний фенотип і кисле середовище, що утворилося, можуть дати раковим клітинам перевага в рості (4).
Показано, що уреаза бобових, котра перетворює сечовину в аміак і підвищує рН розчину, є цитотоксичною для ракових клітин (8). Внутрішньопухлинна ін'єкція ферменту мишам, що несуть ксенотрансплантати молочної залози і легень людини, також значно сповільнює ріст пухлин (8). Однак внутрішньопухлинну доставку протиракового терапевтичного засобу в клінічних умовах важко здійснити. Для пацієнтів із запущеним і в значній мірі метастатичним захворюванням внутрішньопухлинна ін'єкція не є життєво важливою процедурою. Більш практичний підхід полягає в доставці ферменту шляхом внутрішньовенної ін'єкції. Однак уреаза не містить напрямний домен і системна доставка ферменту може привести до прояву токсичності поза мішенню. Кон'югат антитіло-фермент, що є специфічним до пухлини, використовують для доставки уреази в ділянку ракової пухлини. Антитіло, що входить до складу кон'югата, специфічно розпізнає СЕАСАМЄб у пацієнтів з недрібноклітинним раком легені.
Фрагмент однодоменного верблюжого антитіла (АРАЇКІ2, 5ЕО ІЮ МО.1), що розпізнає бо СЕАСАМБ6б на клітинах аденокарциноми легень (17), використовують для кон'югації з уреазою бобових (00547) з одержанням протиракового терапевтичного засобу. Технологія даного винаходу описує деякі з відповідних доклінічних досліджень кон'югата антитіло проти
СЕАСАМб-уреаза (І-00547), який у даний час знаходиться у фазі І клінічного випробування на людях.
Протипухлинну активність уреази бобових об'єднують зі специфічністю однодоменного антитіла проти СЕКАКАМЄ6 у вигляді кон'югата антитіло-уреаза (І-00547). І -00547 специфічно зв'язується до СЕАСАМб-експресуючими лініями ракових клітин і має сильний цитотоксичний ефект. Аналіз конкурентного зв'язування демонструє, що спорідненість Ї-00547 приблизно в 500 разів вищу, ніж спорідненість нативного однодоменного антитіла внаслідок підвищеної авідності. Цитотоксичність І-00547 залежить від наявності сечовини іп 5йи і чутливості клітин- мішеней до токсичності аміаку. Клітини ВхРОС-3 захищені від ефектів Ї-00547 унаслідок сайленсингу гена СЕАСАМб, тоді як підвищена експресія СЕАСАМб6 додає трансфікованим клітинам Н2З чутливість до цитотоксичності І-00547. Імунохімічне фарбування нормальної і ракової тканин людини демонструє, що Ї-0О0547 зв'язується переважно з аденокарциномою легень, а також з аденокарциномою товстої кишки і підшлункової залози з позитивним, але більш слабким фарбуванням. Дослідження метастазів клітин аденокарциноми легень А5б49 у мишей також демонструє, що І -00547 у концентрації 10 мкг/мл ефективно зменшує кількість ракових клітин у легенях.
Матеріали. Уреазу бобових (Сапамаїїйа епзігтоптів) одержують від ВіомМесіга Іпс. (РЕЇ, Канада) і потім очищають шляхом осадження в присутності кислоти, фракціонування в спирті і іонообмінної хроматографії. Чистота ферменту складає »97 96 за даними 505-РАСЕ, ВЕРХ і мас-спектрометрії. Одну одиницю уреази визначають як кількість ферменту, що продукує 1 мкмоль/хв аміаку при 25 "Сі рн 7,6.
Фагову бібліотеку, отриману з набору важких ланцюгів антитіл лами, використовують для ідентифікації однодоменного антитіла (з3дАБ) шляхом пенінгу проти клітин недрібноклітинної аденокарциноми легені А5б49. 5дАр позначають як АБАЇ (17). Генну послідовність АЕАЇ оптимізують з метою кон'югації і перейменовують у АЕАЇКІ 2. Потім антитіло АЕРАЇКІ 2 клонують і експресують у системі Е. соїї ВІ 21 (СЕЗ) рТ7-7. Антитіло очищають від тіл включення методом іонообмінної хроматографії. Кон'югування антитіла з уреазою здійснюють з використанням
Зо гетеробірункціонального зшивального засобу М-сукцинімідил (4-йодацетил)амінобензоату (ЗІАВ). Антитіло АРАЇКІ 2 спочатку активують за допомогою МНЗ-складноефірного фрагмента лінкера ЗІАВ через первинні аміногрупи. Активоване антитіло приєднують до уреази через йодацетильну групу зшивального засобу за допомогою вільних сульфгідрильних груп, які присутні на ферменті. Бажаний коефіцієнт кон'югації (від 1:6 до 1:10, відношення уреази до антитіла) досягають шляхом змішування високочистої уреази з активованим антитілом у масовому співвідношенні 2:11. Кон'югат антитіло-уреаза очищають ультрафільтрацією.
Сечовину, трипсин (зі ступенем чистоти, що підходить для культивування тканин), етосульфат феназину (РЕ5), нітропрусид натрію, розчин гіпохлориту натрію, фенол, Масі,
КНегРО», Ма5О», МанНсоз і глутаральдегід купують у 5ідта Спетіса! Со. (Сент-Луїс, Міссурі). 3- (4,5-диметилтіазол-2-іл)-5-(3-карбоксиметоксифеніл)-2-(4-сульфофеніл)-2Н-тетразолій (МТС) і трипсин (для застосування в аналізі що включає в себе фрагментацію пептидів і мас- спектрометрію) купують у Рготеда Согр. (Медісон, ВИ). Перекис водню (30 9с), ЗІАВ, КСІ, 0- глюкозу, НСІ, МагНРО» і МагРОз купують у Ріхпег Зсіепіййс (ОНаула, ОМ). Фракцію М бичачого сироваткового альбуміну (ВБА) купують у Коспе (Іпаіапароїї5, ІМ). Хлорид амонію (0,100 М) купують у Кісса Спетісаї! (Агііпоїоп, ТХ). Кон'югат антитіло АРАЇКІ 2-пероксидаза одержують у
КосКіапа Іттипоспетісаї5 ((зірегізмійе, РА). Середовище для культивування клітин (КРМІ), фетальну бичачу сироватку й антибіотики одержують від Ге ТесппоЇодієз (Випіпоїоп, ОМ).
Самиць голих мишей СтгТас:МСт-Еохпі"ч" одержують від Тасопіс (Ниазоп, МУ). В експериментах використовують модифікований буфер Кребса-Рінгера (ККВ), що містить Масі (98,3 мМ), КСІ (4,73 мМ), КНе2РО» (1,19 мМ), Мо9505х (1,19 мМ), О-глюкозу (11,7 мМ), МагНРО» (11,1 мМ) і
МагРО» (2,77 мМ), рН 7.2.
Індофенольний аналіз
Кількість аміаку, яка продукується в процесі ферментативної реакції уреази, визначають за допомогою модифікованого індофенольного аналізу (18). Коротко говорячи, свіжий розчин А одержують шляхом розчинення 165 мг фенолу і 132 мг гранул Масн у 10 мл води з наступним додаванням 66 мкл розчину нітропрусиду натрію (10 мг/мл). Розчин В одержують шляхом додавання 40 мкл гіпохлориту натрію до 5 мл води. Розчини зразків (30 мкл кожного) з аналізу зв'язування цілих клітин (див. нижче) переносять у новий 96-ямковий планшет, що містить 50 мкл/ямку 5М Маон:нео (3,3:46,7) і 20 мкл/ямку води. Додають розчин А (50 мкл/ямку) і розчин В бо (50 мкл/ямку), після чого планшети переносять у рідер для мікропланшетів і дають розвиватися фарбуванню при 37 "С протягом 30 хвилин. ОЮ вимірюють при 630 нм. Кількість аміаку, який утворюється в ямках, розраховують по каліброваній кривій з використанням хлориду аміаку як стандарту (у концентрації від О до 150 мкм).
Аналіз зв'язування І -00547 з цілими клітинами
Клітинні моношари одержують шляхом висівання 100 мкл/ямку пухлинних клітин (4х107 клітин/ямку) у 96-ямкові культуральні планшети з наступною інкубацією протягом ночі при 37 "С.
З планшетів видаляють середовище, а моношари клітин фіксують за допомогою 100 мкл/ямку 0,05 95 глутаральдегіду (у забуференому фосфатом фізіологічному розчині, РВ5) протягом 10 хвилин при кімнатній температурі (КТ). Потім планшети промивають РВ5, додають 120 мкл/ямку розчину гліцину (50 мм) і інкубують при 37 "С протягом 20 хвилин. Після інкубації планшети блокують за допомогою 120 мкг/ямку 1 96 ВЗА/РВ5З при 37 "С протягом 30 хвилин. Потім планшети промивають З рази буфером А (0,05 95 ВБ5А у РВ5), додають 80 мкл/ямку розведених розчинів Ї-00547 або рО547 і інкубують при 37 "С протягом 1,5 годин. Сигнал зв'язування генерують за допомогою способів, що включають застосування або сечовини, або антитіла: (1)
У способі, що включає застосування сечовини, планшети промивають 4 рази буфером А, додають 80 мкл/ямку з 20 мм розчину сечовини (у 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,6) і інкубують при 37 "С протягом 30 хвилин. Після інкубації для зупинки реакції додають 40 мкл/ямку 1М НОСІ.
Кількість аміаку, що утворився в кожній ямці, визначають за допомогою індофенольного аналізу. (2) У способі, що включає застосування антитіл, спочатку гасять ендогенну пероксидазу з використанням 100 мкл/ямку 0,3 906 перекису водню протягом 30 хвилин, до початку стадії блокування. Після інкубації з тестованими сполуками планшети промивають РВ5 і готують розведення кон'югата антитіло проти АРЕАЇКІ 2-пероксидаза (1:8000) у буфері А, що містить 0,05 95 твін-20 і 0,1 96 сухого молока. Планшети промивають З рази буфером А і додають кон'югат антитіло-пероксидаза в кількості 100 мкл/ямку. Після інкубації при 37 "С протягом 1 години планшети промивають З рази буфером А. Додають 1 мМ розчин субстрату пероксидази в натрій-цитратному буфері, що містить 0,03 95 НгО», у кількості 100 мкл/ямку і інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Планшети переносять у ридер для мікропланшетів і вимірюють ОО при 405 нм.
Аналіз цитотоксичності І -00547
Зо Моношари клітин одержують шляхом висівання 100 мкл/ямку пухлинних клітин (4х10 клітин/ямку) у 96-ямкові культуральні планшети і інкубують протягом ночі при 37 "С. З кожної ямки видаляють середовище і додають 80 мкл/ямку або /-00547, або БО547, після чого додатково інкубують при 37 "С протягом 2 годин. Після інкубації планшети промивають З рази буфером А. Потім до планшетів додають 100 мкл/ямку сечовини (20 мМ) у КЕВ і інкубують при
З37"С протягом ночі. Середовище заміняють на середовище, що не містить тестовані компоненти, у кількості 100 мкл/ямку. Життєздатність клітин визначають за допомогою аналізу життєздатності клітин МТ5, у якому готують суміш розчинів МТ5/РЕЗ (20:1 об./06., МТ5, 2 мг/мл,
РЕЗ5, 1 мг/мл) і потім у планшети додають 20 мкл/ямку суміші. Планшети інкубують при 37 "С протягом 1-2 годин і вимірюють ОО при 630 нм і для порівняння при 490 нм.
Електрохемолюмінесцентний аналіз зв'язування з використанням клітин (ЕС)
І-00547, АРАЇКІ2 ії 00547 мітять рутені-МНО-складним ефіром (ЗйиМо-Тад, Мезо 5саїе
Рівсомегу М5О, КосКмійе, МО) відповідно до інструкцій виробника. Зазначені мічені рутенієм білки дозволяють безпосередньо вимірювати зв'язування /-00547 і АБГАЇКІ2 з цільовим антигеном. Для аналізу безпосереднього зв'язування одержують моношар клітин ВхРО-3 на 96- ямковому планшеті ЗЕСТОК РЕ Нідп-Віпа (М50). Після фіксації і блокування додають різні кількості мічених І -00547 або АРАЇКІ 2. Планшет інкубують при 37 "С протягом 1,5 годин. Після інкубації планшет промивають два рази і заповнюють буфером для прочитування (М50О). Потім прочитують сигнал ЕСІ за допомогою рідера ЗЕСТОК РК-100 (М50). Для конкурентного аналізу зв'язування використовують І-00547 або антитіло АЕАЇКІ 2, які інгібують зв'язування міченого І-00547 із клітинами ВхРО-3. Мічений І-00547 використовують для зв'язування з клітинами ВхРО-3 у концентрації 1 мкг/мл. Використовують різні концентрації сполук (І-00547 або АРГАЇКІ2), що конкурують за зв'язування з міченим І/-0О0547. Після інкубації планшет промивають два рази і заповнюють буфером для прочитування. Потім планшет відразу прочитують за допомогою рідера БЕСТОК РЕ-100.
Нокдаун гена СЕАСАМб у клітинах ВхРО-3
Щоб підтвердити, що СЕАСАМб є специфічним антигеном, розпізнаваним 1-00547, здійснюють сайленсинг гена СЕАСАМ6б у позитивній клітинній лінії ВХРО-3 з використанням клонів Ни5Н-29, що забезпечують експресію шпилькових конструкцій і поставляються Огібсепе (КосКміШе, МО). Зазначені плазміди забезпечують транскрипцію послідовностей коротких бо шпилькових РНК (кшРНК), які блокують транскрипцію гена-мішені за допомогою РНК-
інтерференції. Клітини ВхРО-3 трансфікують плазмідами НизН, після чого стабільно трансфіковані клітини відбирають з використанням пуроміцину. У результаті трансфекції НиЗНб6 (АдааСаАААасА,а ТававАТайсСААСА,ТОСТА (ЗЕО ІО МО: 5)), Ни5н7 (ААБДАССААССОСАСАСТТОССАТОТАТАС (ЗЕО ІЮ МО: 6)) і контрольної плазміди НиЗН-ТН5 одержують різні клони. Дві позитивні стабільні клітинні лінії (НОЗНЯЄ і НОБНЯ?7) і контролевмісні клітини (НОЗН-ТК5) відбирають з використанням антибіотиків. Потім зазначені клони перевіряють на здатність зв'язуватися з І -00547, використовуючи аналізу зв'язування з цілими клітинами. Після інкубації з Ї-00547 планшети промивають З рази буфером А і додають 80 мкл/ямку 20 мМ розчину сечовини (у 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,6). Планшети інкубують при 37"С протягом 30 хвилин. Ферментативну реакцію зупиняють шляхом додавання 40 мкл/ямку 1М НС. Кількість продукованого аміаку визначають з використанням індофенольного аналізу.
Трансфекція гена СЕАСАМБВ у клітини Н2З
Вектор, який забезпечує експресію в клітинах ссавців і містить селектований маркер 5418, клонують разом з генами РМР-СЕР (плазматичний мембранний білок-зелений флуоресцентний білок) і СЕАСАМб. Для трансфекції експресуючого вектора в клітини Н2З3 використовують реагент целфектин ((їе Тесппоіодіе5). Коротко говорячи, клітини Н2З у кількості 2х106 клітин/ямку в 2 мл повні середовища КЕРМІ (що містить 10 95 фетальної бичачої сироватки, 50 од./мл пеніциліну і 50 мкг/мл стрептоміцину) висівають у б6-ямковий культуральний планшет і інкубують при 37 "С протягом ночі. Реагент целфектин (10 мкл) і ДНК (1-2 мкл) розводять 100 мкл середовища КРМІ, що не містить сироватку, відповідно. Потім два розведені розчини об'єднують, обережно перемішують і інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.
Планшети двічі промивають 1,5 мл середовища КРМІ, яке не містить сироватку. Об'єднаний розчин розводять 0,8 мл середовища КРМІ, яке не містить сироватку, обережно перемішують і додають до клітин. Клітини інкубують при 37 "С в СО»-інкубаторі протягом ночі. Наступного дня середовище заміняють на 2 мл повного середовища КРМІ. Трансфіковані клітини спільно експресують СЕР з тієї ж мРНК, що і СЕАСАМб. Трансфіковані клітини відбирають шляхом інкубації в середовищі, що містить 400 мкг/мл антибіотика 5418. Клітини сортують відразу після інкубації з використанням су5.5-міченого Ї-00547, що свідчить про наявність поверхневої
Зо експресії СЕАСАМб.
Імунохімічне фарбування пухлинних тканин людини з використанням І-00547
Піддають скринінгу всього 400 зразків тканини, що представляють 42 ракові і нормальні тканини (Ахе! М/еПШтапп, Опімегейу Нозрійа!І Ааспеп, КУУТН Ааспеп Сегптапу). Зрізи спочатку інкубують у сушильній шафі при 62 "С протягом 1 години у вертикальному положенні, щоб видалити парафін. Потім зрізи депарафінізують у ксилолі всього 5х4 хвилин. Зрізи гідратують у 100 9», 95 95 і 75 95 етанолі протягом 2х3 хвилин кожен, після чого їх занурюють у водопровідну воду на 5 хвилин. Ендогенну пероксидазу гасять 0,3 95 Нг2Ог протягом 30 хвилин. Для детекції зв'язування /-00О547 зі зрізами використовують набір Месіавіаійп ЕІШе АВС (Месіог Іабрв,
Вигіїпотоп, ОМ). Коротко говорячи, після промивання РВ5 протягом 3х5 хвилин зрізи інкубують у блокувальній сироватці при 4 "С протягом ночі. Потім зрізи інкубують у розчині І-00547 (20 мкг/мл у буфері А) при 37 "С протягом 1,5 годин. Після промивання РВ5 зрізи інкубують з мишачим антитілом проти уреази (Зідта, 1:1500) при 37 "С протягом 1 години. Після промивання РВЗ зрізи інкубують з розчином біотинільованого вторинного антитіла (Месіог І абз) протягом 30 хвилин. Після промивання РВ5 зрізи інкубують з реагентом Месіавіаіп ЕІШе АВС протягом 30 хвилин. Після промивання РВ5 зрізи інкубують у свіжій суміші, що містить розчин субстрату пероксидази АВ (3,3'-діамінобензидин) (Месіог І аре) при кімнатній температурі протягом 2 хвилин. Реакцію зупиняють промиванням водопровідною водою протягом 5 хвилин.
Потім зрізи піддають контрастному фарбуванню гематоксиліном Мейера протягом 10 секунд.
Зрізи дегідратують у 75, 80, 95 і 100 95 етанолі. Після очищення в ксилолі зрізи вміщують у гістологічне середовище Сіагіоп.
Дослідження метастазування А5б49
Пухлинні клітини А5б49 (5х106) висівають і вирощують у чашках з низьким зв'язуванням.
Після досягнення достатнього числа клітин їх збирають і ресуспендують у культуральному середовищі в концентрації 5х109 клітин/мл. Потім клітини вміщують у б-ямкові планшети для культивування тканин з низьким зв'язуванням у кількості 1 мл/ямку. Потім у кожну ямку додають
І-00547 (1 мл) до кінцевої концентрації 10 або 15 мкг/мл. Ізотипічний контроль обробляють кон'югатом М21-00547 (кон'югат антитіло-уреаза, спрямований на рецептор фактора росту ендотелия судин (МЕСЕ)) у концентрації 10 мкг/мл. Клітини інкубують при 37 "С протягом 4 годин. Після інкубації клітини центрифугують, три рази промивають стерильним РВ:З і бо ресуспендують у 1х107 клітин/мл у стерильному РВ5. Потім кожна миша однократно одержує
1х106 оброблених клітин. У цьому дослідженні бере участь 4 групи самиць мишей СгТас:МеОг-
Еохпі"ч (необроблені, що одержують ізотипічний контроль і Ї-00547 (10 і 15 мкг/мл)). У цілому сорока мишам (10 у кожній групі) інокулюють внутрішньовенно через хвостову вену пухлинні клітини А549.
П'ять тварин з кожної групи піддають евтаназії на 22-й день (3 тижні), а інших тварин тримають до 71 дня (10 тижнів). Після умертвіння тваринам внутрішньотрахеально вводять китайську туш (Саїмегі І арх, ОІурпапі, РА); потім легені виділяють і фіксують їх у розчині Фекете (Саїмеп Гарех). Вплив випробуваної сполуки на метастазування пухлини визначають шляхом підрахунку кількості метастатичних пухлин (вогнищ) у кожній легені за допомогою препарувальної лупи. Фотографують легені, типові для кожної групи.
Зв'язування І -00547 з різними лініями ракових клітин
Різні профілі зв'язування І-00547 спостерігають серед п'яти ліній пухлинних клітин - ВХРО-
З, Сарап-1, 278-75-30, 15174Т і МОА-МВ231 (фіг. 1А). Результати демонструють, що І-00547 добре зв'язується з двома лініями клітин підшлункової залози (ВхРО-3 і Сарап-1) і з лінією клітин молочної залози (242-75-30), свідчачи про те, що антиген СЕАСАМб експресується на клітинній поверхні. Також спостерігається помірна здатність до зв'язування лінії клітин товстої кишки І 5174Т, тоді як зв'язування з лінією клітин молочної залози МОА-МВ231 (негативний контроль) не виявлений. Антитіло АРАЇКІ 2, кон'юговане з ферментом уреазою, забезпечує специфічність відносно клітин, які експресують СЕАСАМб. Це підтверджує відсутність сигналу зв'язування в клітинах, оброблених 0О547 (дані не показані).
Цитотоксичність І-00547
На фігурі 18 показано, що і ВхРСО-3, ії 2К-75-30 чутливі до цитотоксичності І -00547. У цих двох клітинних лініях спостерігається швидке зниження виживаності клітин, оброблених І -
ЩроБ547 у концентрації менше 1 мкг/мл. Помірні ефекти спостерігаються в клітинах Сарап-1 і
І 5174Т. 1-00547 не чинить ніякого впливу на клітинну лінію МОА-МВ231, використовувану як негативний контроль. Результати аналізів зв'язування і цитотоксичності інших клітинних ліній показані в таблиці 1. Цитотоксичність Ї-00547 безпосередньо залежить від здатності Ї-00547 зв'язуватися з відповідними клітинними лініями. Більш слабка цитотоксична відповідь А5Б49 і
Сарап-1 зумовлена підвищеною толерантністю цих двох клітинних ліній до токсичності аміаку
Зо (дані не показані). З іншого боку, клітини Н23 мають високу чутливість до аміаку (дані не показані). Незважаючи на відсутність антигену СЕАСАМЄ на клітинній поверхні, клітини Н2З усе- таки дають деяку слабку цитотоксичну відповідь на І -0О547, імовірно, унаслідок присутності в ямках неспецифічно зв'язаного І -00547.
Таблиця 1
Результати різних аналізів зв'язування і цитотоксичності І -20547, отримані на дев'ятьох лініях пухлинних клітин людини.
СОСНИ чинній ПИННЕНННЯ НО ОН залози
ОМСЕ-7 0 Карциномамолочнотзалози | -:(/ - | 9 (/- 9 залози кишки наз 00000 (Аденокарциномалеєеніо/ | 777-777 Ї111111111яссСс21С залози
Аденокарцинома підшлункової залози
Де: т позначає позитивну відповідь (число ж указує на величину активності); - позначає негативну відповідь
У п'ятьох клітинних лініях (ВХРО-3, Сарап-1, 728-75-30, 151741 і А549) з чотирьох тканин людини спостерігається сильне зв'язування І-00547 і висока чутливість до цитотоксичності І - роза47 (за винятком А549), як показано в таблиці 1. Цитотоксичні ефекти І -00547 у більшому або меншому ступені залежать від відносної сили зв'язування з раковими клітинами. Наведені на графіках результати являють собою середнє значення від декількох (п-3) типових експериментів. Стандартне відхилення (50) складає менше 10 95 для всіх значень.
Пряме і конкурентне зв'язування І-00547 із клітинами ВХРО-3
Клітинний електрохемілюмінесцентний аналіз зв'язування дозволяє безпосередньо знайти зв'язаний з пухлинними клітинами кон'югат, що містить мічене рутенієм антитіло. На фіг. 2А показано, що і мічений рутенієм І-00547, і антитіло АРАЇКІ 2 зв'язуються з клітинами ВхРО-3, тоді як мічений рутенієм БО547 діє як негативний контроль. Ї-00547 має набагато більш високу спорідненість, ніж антитіло АРАЇКІ2, унаслідок більш високої авідності антитіл (6-10 антитіл), що входять до складу І -00547. Результати додатково підтверджують з використанням
І-00547 і антитіла АРАЇКІ 2 як конкурентні сполуки, здатні інгібувати зв'язування клітин ВХРО-3 з міченим рутенієм І-00547 (фіг. 28). І І-00547, і антитіло АРАЇКІ2 інгібують зв'язування міченого рутенієм І-00547 з ВхРО-3, і, як і очікувалося, Ї-00О547 має більш високу спорідненість і, отже, сильніше інгібує зв'язування міченого рутенієм І-00547 з ВхРО-3, ніж антитіло АБАЇКІ2. Величини позірної спорідненості /-00547 і антитіла АЕБАЇКІ2 можна порівняти з використанням ІСво (кількість конкурентної сполуки, необхідна для зменшення зв'язування на 50 95) тестованих сполук. Значення ІСво І -20547 і антитіла АРАЇКІ2 складають 2 і 20 мкг/мл, відповідно; або 3,22 нМ для І -00547 (МВ-622К при коефіцієнті кон'югації 6 антитіл на 1 уреазу) і 1,55 мкМ для АЕАЇКІ 2 (МУУ-12,9К). Отримані результати дозволяють припустити, що спорідненість І-00547 приблизно в 500 перевищує спорідненість антитіла АЕГАЇКІ 2.
Підвищена експресія трансфікованого гена СЕАСАМБВ у клітинах Н2З
Після трансфекції геном СЕАСАМб ідентифікують позитивний клон Н23-ССбЖ7У. Клони з рівнем СЕАСАМб, близьким до рівня, який присутній у клітинах Аб549, одержують шляхом повторного сортингу клону Н23-ССбЖУ з використанням І-00547-су5.5. Наступна інкубація клону в присутності підвищеної кількості антибіотика 5418 (800 мкг/мл) дозволяє вибрати клон з більш високим рівнем експресії СЕАСАМб. Хоча Н23-ССб6Ж7 експресує менше СЕАСАМб на поверхні, ніж клітини А549 і ВХРО-3, цей СЕАСАМб-трансфікований клон є більш чутливим до
Зо цитотоксичності І-00547, ніж клітини ВХРО-3 (фіг. ЗВ), унаслідок його високої чутливості до токсичності аміаку (дані не показані).
Нокдаун гена СЕАСАМб у клітинах ВхРО-3
І-00547 зв'язується з двома клонами з нокдауном СЕАСАМб (НОЗНЯЄ і НОЗНЯ?) значно гірше, ніж з нативними клітинами ВхРОС-3 і контрольним клоном (НОБЗН-ТКЗ) (фіг. ЗО).
Експеримент чітко демонструє, що присутність СЕАСАМб на поверхні клітини має важливе значення для зв'язування І -20547. Сайленсинг гена значно зменшує зв'язування І -20547.
Імунохімічне фарбування пухлинних тканин людини з використанням І -00547
Скринінг нормальних і ракових тканин демонструє, що І -00547 розпізнає майже винятково підтип аденокарциноми (таблиця 2). Серед більше 400 зразків тканин, що представляють 42 групи, які складаються з різних ракових і відповідних нормальних тканин, значне фарбування спостерігається в тканинах аденокарциноми легень, причому розпізнається більше 80 95 клітин.
Нормальні легеневі тканини, отримані у відповідній віковій групі, є негативними з відтінком фокального фарбування в декількох активованих пневмоцитах. Інші тканини, у яких спостерігається позитивне, але слабке фарбування, включають аденокарциному товстої кишки і підшлункової залози. На фігурі 4 показане імунохімічне фарбування аденокарциноми товстої кишки і легені з використанням І -00547.
Таблиця 2
Скринінг нормальних і ракових тканин людини на здатність зв'язувати І -20547 оон кон тканина з
Пухлинна тканина . нн й
Зразки відповідної вікової
Карцдиномапочки.д/ 77777771 1ала | гла
Аденомапаращитовидноїзалози. | р/р 77717171 | данівідсутні
Міофібробластнапухлинаї 77/71 |, данівідсутні (Карциномапростатиї //-/-::7711Ї111111111111111 1111144 | 44 (Карцинома щитовидноїзалози.ї /-:/ | 777777777777111Ї11112г/2|11122 . . 7/57 спабке 8/57 (Нейроендокринніпухлини. | |7717171199 | данівідсутні оЯєчка-тератомаісемномаї 7/7 1111331 (Пухлинанавколовушноїзалози.д /-/-://|Ї 77777771 Їли (Плоскоклітиннакарцинома шийки матки. / | | 2/2 | пащі
Лимомаїд////7777777111111111111111111111Ї11111111111171111122|1пащ
Сдснмарцинома товстої кишки 002021 О1лЯ слабке 10150201 : : 2454/24 о-метастазивлімфатичнівузли.ї ЇЇ 77777771
Сдснмарцинома Молочно яю 2022 «ЛЗ 352-688 - - 13/13 о-метастазивлімфатичнівузлиїд ЇЇ 7777/1122 (Лейоміома -метастазивлегені | //////р/ю/юЮСЮ|7717171С7Л1111 |, данівідсутні
Карциномаяєчникад/ 77777771 4/4 | данівідсутні (Карциномасечовогоміхура.д 77717171 1111420 о-метастазивлімфатичнівузли | лб/Лсильне | | 36/36 дення Го карциноми
Легни дроноктмнна карцинома 202021едее В аденокарцинома. 77777777 | 5/бсильне | -:/ (
Аденокарциномашлунка.д 77777111 1111331
Карциномапечінки.д/ 77777711 1111144 | 440
Пухлиним'якихтканин.//////77777777111111Ї1111111111111111111133 |71711спасщ
Меланома 5 :-- - А ---- - - 5 - .(ь556-т5 88
Сметастай 33333111. 18Л8 1.
Імуногістохімічне фарбування аденокарциноми товстої кишки і легені людини з використанням І -00547 здійснюють, як показано на фіг. 4.
Дослідження метастазування Аб549
Через З тижні в мишей, що одержувала клітини А549, оброблені 10 ії 15 мкг/мл І-00547, спостерігається значне зменшення кількості пухлин легень (р «0,05 у порівнянні з необробленою контрольною групою (таблиця 3). Однак через 10 тижнів значуще зменшення середнього числа пухлинних клітин не спостерігається. Через З і 10 тижнів після введення 10 мкг/мл І/-00547 спостерігається узгоджуване, хоча і статистично не значуще, зменшення кількості пухлинних клітин у порівнянні з необробленою контрольною групою (таблиця 3).
Цікаво, що ізотипічний контроль (М21-00547) також впливає і зменшує число пухлин у легенях.
Таким чином, обробка клітин А549 за допомогою І-00547 у концентрації 10 мкг/мл зменшує середню кількість пухлин легень через З тижні після введення, однак цей ефект є тимчасовим, оскільки через 10 тижнів після введення не спостерігається значне зниження середнього числа пухлин.
Зо
Таблиця З
Середнє число пухлин легень, підраховане в дослідженні метастазів А549
Кінцева Середнє число пухлин Середнє число пухлин
Група Обробка клітин концентрація ред я ухлих легень? через 10 легень?" через З тижні й (мкг/мл) тижнів 1 |Відсутнстьобробми| //////- | лозвя300 | пббаБОю "Середнє значення:зхет; "р «0,05 в порівнянні з необробленою контрольною групою.
Як показано в таблиці 3, клітини аденокарциноми легені людини А549 обробляють І -00547 або ізотипічним контролем (М21-00547) іп міго. Після інкубації при 37 "С протягом 4 годин клітини тричі промивають РВЗ і ресуспендують у РВ5 у концентрації 1х107 клітин/мл. Потім кожній миші однократно вводять 1х105 оброблених клітин. П'ять тварин у кожній групі піддають евтаназії через З тижні і 10 тижнів після ін'єкції. Вплив тестованої сполуки на метастазування пухлини визначають шляхом підрахунку числа метастатичних пухлин у кожній легені за допомогою препарувальної лупи. Ріст метастатичної пухлини в групі, обробленій І-00547, і в необробленій контрольній групі порівнюють за допомогою непарного і-тесту. Спільна ін'єкція І - роза47 через З тижні після введення значно зменшує кількість пухлин.
Описане застосування уреази як потенційного протиракового терапевтичного засобу, дія якого основана на опосередкованому ферментом утворенні аміаку і місцевому підвищенні рн (8). Однак відсутність селективності ферменту відносно пухлинних клітин у порівнянні з нормальними клітинами обмежує його застосування як протиракового терапевтичного засобу.
Застосування кон'югата антитіл-лікарський засіб (АБС) або, більш конкретно, антитіло- спрямованої ферментної пролікарської терапії (АОЕРТ) у рамках описаної технології дозволяє обійти це обмеження. У цьому прикладі одержують конкретну форму кон'югата антитіло-уреаза (І-00547) шляхом кон'югування СЕАСАМб-специфічного однодоменного антитіла лами (АРАЇКІ 2) з уреазою (00547). Кон'юговані антитіла АРАЇКІ2 забезпечують специфічність і, отже, підвищують ефективність ферменту уреази відносно СЕАСАМб-експресуючих пухлин.
Специфічність І-00547 відносно ракових клітин, які експресують СЕАСАМб на поверхні, визначають за допомогою аналізів зв'язування іп міго (фіг. 1 і 2). Результати цих аналізів демонструють, що І -00547 зв'язується з клітинними лініями, які експресують СЕАСАМб (ВхРО-
З, Сарап-1, 278-75-30 і 1 5174Т), але не з клітинними лініями, що не експресують СЕАСАМб (МОА-МВ231). Крім того, функціональну роль СЕАСАМб підтверджують експериментами з нокдауном і підвищеною експресією СЕАСАМЄб у ракових клітинах (фіг. 3). Підвищену експресію
СЕАСАМ6б досягають шляхом трансфекції СЕАСАМб-кодуючої плазміди в клітини Н2З, тоді як нокдаун гена здійснюють шляхом опосередкованого короткою шпильковою РНК виснаження
Зо клітин ВХхРО-3 по СЕАСАМб. Аналізи зв'язування демонструють, що І-00547 зв'язується з високою спорідненістю з нативними клітинами ВхРОС-3, але не з клітинами ВхХРО-3, у яких проведений нокдаун гена СЕАСАМ6б (фіг. 3С). І навпаки, підвищена експресія СЕАСАМбЄ у клітинах Н2З робить клітини здатними до зв'язування І -00О547 і чутливими до цитотоксичності
І-00547 (фіг. ЗА і 3В). Отримані результати демонструють, що специфічне зв'язування І- роБза7 з антигеном СЕАСАМб відіграє важливу роль в індукції антитіловмісним кон'югатом протипухлинної цитотоксичності. Іншою перевагою кон'югата антитіл з уреазою у порівнянні з індивідуальним антитілом є загальне збільшення авідності. Аналізи зв'язування методом ЕСІ. демонструють, що Ї/-00547 з молярним коефіцієнтом кон'югації 6-10 антитіл на 1 молекулу уреази зв'язується з клітинами ВхРО-3 у 500 разів краще, ніж окреме антитіло (фіг. 2В). Інші аналізи зв'язування кон'югата дозволяють припустити, що співвідношення антитіл до ферменту, що перевищує 6:1, є оптимальним для зв'язування І -00547 з СЕАСАМЄ6 (дані не показані).
Механізм дії досліджують за допомогою аналізів іп міго і іп мімо. Уреаза є активним компонентом Г-00547, причому попередні дослідження продемонстрували, що уреаза є цитотоксичною для пухлинних клітин людини іп міїго (8). Внутрішньопухлинне введення уреази в пухлини А549 (пухлина легені) і МСЕ-7 (пухлина молочної залози) у голих мишей приводить до значного інгібування росту пухлини (8). Однак цитотоксична ефективність уреази або І-00547 також залежить від чутливості ліній пухлинних клітин до аміаку. Наприклад, на фігурі ТА показано, що І-00547 майже однаково добре зв'язується з ВХРО-3, 288-75-30 і Сарап-1, однак
Сарап-1 дає помірну цитотоксичну відповідь у порівнянні з двома іншими клітинними лініями (фіг. 18). Лінія Сарап-1 менш чутлива до цитотоксичного ефекту аміаку, ніж ВХРО-3 ї 2К-75-30 (дані не показані). Подібним чином, клітини аденокарциноми легені людини Н2З чутливі до присутності аміаку; після трансфекції геном СЕАСАМб клітинна лінія стає чутливою до цитотоксичності І -00547 (фіг. ЗВ), незважаючи на те, що на поверхні клітин присутня менше антигенів СЕАСАМЄВб, ніж на клітинах ВхРО-3 (дані не показані) і А549 (фіг. ЗА). На закінчення необхідно відзначити, що для прояву цитотоксичного ефекту /-00О547 відносно пухлини потрібно наявність двох важливих факторів, експресії СЕАСАМЄб на поверхні клітини і чутливості до аміаку.
Скринінг ракових тканин людини за допомогою імуногістохімічного аналізу демонструє, що
І-00547 специфічно до аденокарцином легень, товстої кишки і підшлункової залози (таблиця 2), але не до відповідних нормальних тканин. Кон'югація декількох антитіл на поверхні уреази значно підвищує специфічність до антигену СЕАСАМб (фіг. ТА і 2) і зменшує здатність ферменту до неспецифічного зв'язування (дані не показані). Дослідження іп мімо також підтверджують ефективність І-00547 проти пухлинного ксенотрансплантата. Інгібування росту пухлини спостерігається в дослідженні пухлинного ксенотрансплантата і метастаз аденокарциноми легені А549 (таблиця 3) після в/в уведення Ї-00О547 голим мишам (дані не показані). Значне зменшення легеневих вогнищ спостерігається при використанні клітин А5Б49, оброблених 10 або 15 мкг/мл І -00547, через З тижні після ін'єкції (таблиця 3). Однак через 10 тижнів істотні розходження відсутні, можливо, унаслідок виведення І/-0О0547 з організму тварини. Ізотипічний контроль (М21-00547, кон'югат антитіло проти МЕСЕК2-0О547) також викликає деяке зменшення легеневих вогнищ, незважаючи на те, що клітини А5бБ49 не експресують МЕСЕК2 у нормальному стані. Опул"ада еї а! (19) описують, що функціональні властивості МЕСЕК індукуються в клітинах А5б49 після впливу 50 мМ Неї. Знижену проліферацію хворих клітин Аб549 можна відновити шляхом екзогенного введення МЕСБЕ, а додавання нейтралізуючих антитіл проти МЕСЕКІ1 і проти МЕСЕК2 знову придушує клітинну проліферацію. Однак ні МЕСРЕ, ні антитіло проти МЕСЕК не впливають на контрольні клітини. Не бажаючи бути зв'язаними з теорією, автори вважають, що функціональні властивості МЕСЕК2 у
Зо клітинах Аб549 можуть індукуватися в процесі одержання клітин у зазначеному дослідженні метастазування. Це пояснює зменшення числа клітин, що спостерігається в ізотипічній контрольній групі. Результати досліджень іп міїго і іп ммо демонструють, що кон'югація антитіл на уреазі забезпечує специфічну спрямованість антитіловмісного кон'югата на СЕАСАМб- експресуючі пухлини з гарною селективністю й ефективністю, що підтверджує концепцію клінічної розробки І-00547.
Приклад 2. Дослідження впливу підвищуваних доз /-00547 на рецидивуючий або метастатичний неплоскоклітинний М5СІ С (недрібноклітинний рак легені).
Основною метою цього дослідження є оцінка безпеки, переносимості й ефективності діапазону доз І -0О0547, що застосовується в сполученні зі стандартною дублетною терапією пеметрексед/карбоплатин, у пацієнтів з рецидивуючим або метастатичним неплоскоклітинним недрібноклітинним раком легені ІМ стадії (ТММ М'а і М15Б).
Основні результати наведені нижче. Кількість пацієнтів з несприятливими явищами, як показник безпеки і переносимості Ї-00547, використовуваного в сполученні з лікуванням пеметрекседом/карбоплатином, стосується учасників, за якими спостерігають протягом 12 тижнів. Його характеризують як проблему безпеки. Період дослідження АЕ починається з 1 дня 1 циклу і триває до останнього в дослідженні візиту. Вторинні результати полягають у наступному. Час цільової відповіді в пацієнтів, що одержують сумісне лікування відповідно до
ЕЕСІЗТ 1.1, складає не більше 12 тижнів і не розглядається як проблема безпеки. Цільову пухлинну відповідь оцінюють відповідно до КЕСІЗТ версії 1.1 у пацієнтів, що завершили щонайменше 2 цикли дослідження, і в яких є щонайменше 1 оцінка захворювання після лікування. Кількість пацієнтів, які мають стійке клінічне поліпшення, визначають протягом 12 тижнів, причому воно не вважається проблемою безпеки. Визначають відсоток пацієнтів, у яких після сумісного лікування І-00547--пеметрексед/карбоплатин спостерігається повна відповідь, часткова відповідь і стабільне захворювання. Максимальну концентрацію Ї-00547 у плазмі (Стах) після введення в сполученні з лікуванням пеметрекседом/карбоплатином реєструють протягом періоду до 12 тижнів і не вважають проблемою безпеки. Фармакокінетичні параметри
І-00547 визначають з використанням зразків плазми, зібраних у всіх пацієнтів, що одержують
І-00547. Час досягнення максимальної спостережуваної концентрації І -00547 у плазмі (Ттах) після введення в сполученні з лікуванням пеметрекседом/карбоплатином реєструють протягом 60 періоду до 12 тижнів і не вважають проблемою безпеки. Фармакокінетичні параметри І -00547 визначають з використанням зразків плазми, зібраних у всіх пацієнтів, що одержують І -00547.
Площу під кривою залежності концентрації І-00О547 від часу (АС) після введення в сполученні з лікуванням пеметрекседом/карбоплатином реєструють протягом періоду до 12 тижнів і не вважають проблемою безпеки. Фармакокінетичні параметри І1-00547 визначають з використанням зразків плазми, зібраних у всіх пацієнтів, що одержують І-00547. Кінцевий період напіввиведення 1-0О0547 після введення в сполученні з лікуванням пеметрекседом/карбоплатином реєструють протягом періоду до 12 тижнів і не вважають проблемою безпеки. Фармакокінетичні параметри І -00547 визначають з використанням зразків плазми, зібраних у всіх пацієнтів, що одержують І-00547. Наявність антитіл проти І-00547 у пацієнтів, що одержують І-00О547 у сполученні з лікуванням пеметрекседом/карбоплатином, реєструють протягом періоду до 12 тижнів і не вважають проблемою безпеки. Зразки сироватки збирають у всіх пацієнтів, що одержують І -00547, і аналізують.
Проводять експерименти з використанням пеметрекседу і карбоплатину плюс 1І-00547.
Пацієнтів розподіляють у групи, які одержують збільшувані дози І-00547, причому кожна група складається мінімум з З і максимум з 6 пацієнтів. Початкова доза І -00547 складає 0,59 мкг/кг; у дослідженні також використовують дози, що складають 0,78, 1,04, 1,38 і 1,84 мкг/кг. Стандарт використовуваних для лікування доз пеметрекседу |500 мг/м7| і карбоплатину (АОСбІ, відповідно, що підлягає введенню в сполученні з Ї-0О0547, залишається незмінним у всіх групах. Цикл лікування складає 21 день, при цьому пацієнти одержують І -00547 на 1, 8 і 15 дні, а пеметрексед/карбоплатин у 1 день кожного циклу лікування. Передбачається, що пацієнти одержують 4 цикли сумісного лікування з використанням І-00547 --пеметрексед/карбоплатин.
Пацієнти, у яких захворювання не прогресує після 4 циклів сумісного лікування і не виявляється неприйнятна токсичність, одержують можливість продовжувати лікування І-00547 доти, поки спостерігається клінічне поліпшення і доза добре переноситься на думку дослідника, до прогресування захворювання. Пацієнти, які не можуть завершити 4 цикли лікування сполученням ІГ-00547 -пеметрексед/карбоплатин унаслідок токсичності пеметрекседу/карбоплатину, одержують можливість продовжувати лікування І-00547 після припинення введення пеметрекседу/карбоплатину доти, поки спостерігається клінічне поліпшення і доза добре переноситься на думку дослідника, до прогресування захворювання.
Приклад 3. Фаза ІЛІ відкритого, нерандомізованого дослідження з підвищенням дози імунокон'югата І -00547, використовуваного для лікування недрібноклітинного раку легень
Основною метою дослідження є визначення безпеки, переносимості й ефективності діапазону доз Ї-00О547 у пацієнтів з неплоскоклітинним недрібноклітинним раком легені при введенні як монотерапії.
Основні результати описані нижче. Зустрічальність і тяжкість пов'язаних з лікарським засобом побічних явищ як міру безпеки і переносимості І -00547 реєструють протягом періоду до 12 тижнів і відносять до проблем безпеки. Їх оцінюють протягом періоду опису АЕ, що починається в 1 день 1 циклу і триває до останнього в дослідженні візиту.
Вторинні результати полягають у наступному. Токсичність, пов'язана з І! -00547, триває перші 2 години після введення і вважається проблемою безпеки. Її оцінюють по зустрічальності і тяжкості АЕ і 5АЕ і змінам життєво важливих ознак. Зустрічальність і тяжкість всіх зареєстрованих несприятливих явищ і серйозних несприятливих явищ стосуються часової рамки, що включає в себе 12 тижнів спостереження за учасниками і 30 днів періоду наступного спостереження. Зазначені показники позначають як проблеми безпеки й оцінюють протягом періоду опису АЕ, що починається в 1 день 1 циклу і триває до останнього в дослідженні візиту.
Зміни в порівнянні з вихідним рівнем додаткових параметрів безпеки (клінічні лабораторні аналізи, життєво важливі показники, тяжкість, потреба в кисні і ЕКГ їз 12 відведеннями) визначають у часовій рамці, що складає до 12 тижнів, і позначають як проблеми безпеки.
Параметри безпеки включають клінічні лабораторні аналізи, життєво важливі показники, тяжкість, потребу в кисні і ЕКГ із 12 відведеннями. Рівень антитіл проти І -0О0547 визначають з часом у період до 12 тижнів і позначають як проблему безпеки. Зразки сироватки збирають у всіх пацієнтів, що одержують І -0О547, і аналізують.
Інші результати полягають у наступному. Максимальну концентрацію І-00547 у плазмі (Стах) для кожного рівня дози реєструють протягом періоду до 12 тижнів і не вважають проблемою безпеки. Фармакокінетичні параметри І -00547 визначають з використанням зразків плазми, зібраних у всіх пацієнтів, що одержують І-0О0547. Час досягнення максимальної спостережуваної концентрації І -00547 у плазмі (Птах) для кожного рівня дози реєструють протягом періоду до 12 тижнів і не вважають проблемою безпеки. Фармакокінетичні параметри
І-00547 визначають з використанням зразків плазми, зібраних у всіх пацієнтів, що одержують бо І-00547. Площу під кривою залежності концентрації Г-00547 від часу (АОС) для кожного рівня дози реєструють протягом періоду до 12 тижнів і не вважають проблемою безпеки.
Фармакокінетичні параметри І-00547 визначають з використанням зразків плазми, зібраних у всіх пацієнтів, що одержують І-00547. Кінцевий період напіввиведення І-00547 для кожного рівня дози реєструють протягом періоду до 12 тижнів і не вважають проблемою безпеки.
Фармакокінетичні параметри І -00547 визначають з використанням зразків плазми, зібраних у всіх пацієнтів, що одержують І - 00547. Пацієнтів розподіляють у групи, що одержують І -00547 зі збільшенням дози, причому кожна група складається мінімум з З і максимум з 6 пацієнтів.
Початкова доза І/-00547 складає 0,12 мкг/кг; у дослідженні також використовують дози, що складають 0,21, 0,33, 0,46, 0,59, 0,78, 1,04, 1,38, 1,84, 2,45, 3,26 і 4,33 мкг/кг. Цикл лікування складає 21 день, при цьому пацієнти одержують І -00547 на 1 і 8 дні циклу.
Пацієнтів розподіляють у групи, причому кожна група складається мінімум з З і максимум з 6 пацієнтів. Усі пацієнти, що одержують певний рівень дози, повинні завершити 1 цикл (3- тижневий період), після чого може продовжуватися підвищення дози в наступних пацієнтів.
Рішення про підвищення дози до наступного рівня приймають після того, як комітет, що координує дослідження (ТС), перегляне дані по безпеці і доступних фармакокінетичних (ПК) параметрах. Підвищення дози І -00547 продовжують до досягнення максимально переносимої дози (МІО). Після визначення МТО І/-00547 у фазі | використовують до 20 пацієнтів (які пройшли фазу І), щоб оцінити попередню ефективність І-00547 (тобто швидкість відповіді з використанням критеріїв оцінки відповіді у твердих пухлинах ІКЕСІЗТІ версія 1.1, прогресування захворювання і виживання); моніторинг містить у собі радіологічні аналізи в кожному другому циклі. Крім того, оцінюють безпеку і переносимість Ї-00547. Збирають інформацію про фармакокінетичні параметри, а також здійснюють відповідні спостереження за активністю І - роза4і7.
Лікування всіх пацієнтів з використанням І-00547 продовжують доти, поки в пацієнта не припиниться прогресування захворювання, або не буде спостерігатися неприйнятна токсичність, або пацієнт більше не буде давати згоду, або якщо пацієнт після завершення чотирьох циклів не захоче продовжувати лікування за участю в додаткових циклах, залежно від того, що відбудеться раніше. Після чотирьох циклів пацієнти можуть продовжувати одержувати
І-00547 доти, поки, на думку дослідника, є стійке клінічне поліпшення, і поки Ї-00547 добре
Зо переноситься.
Приклад 4: Одержання і характеристика кон'югата однодоменне верблюже антитіло- фермент уреаза для лікування недрібноклітинного раку легені (МЗС С)
Ефективність найбільше часто використовуваних протиракових хіміотерапевтичних засобів обмежена їх вузькими терапевтичними індексами і низькою селективністю відносно пухлинних клітин. Спрямовувана антитілом ферментна пролікарська терапія (АОЕРТ) характеризується підвищеною селективністю завдяки доставці кон'югатів антитіло-фермент у ділянки пухлин, де вони зв'язуються 3 пухлино-асоційованими антигенами, а кон'югати, які залишилася незв'язаними, видаляються з кровотоку (20). Після накопичення кон'югатів антитіло-фермент уводять проліки, що у ділянці пухлини перетворюється в активну цитотоксичну форму під дією ферментного фрагмента кон'югата антитіло-фермент, тим самим досягаючи селективної загибелі пухлинних клітин. Концепція АОЕРТ описана Вадзпамже у 1987 році (20-22, а інші дослідники використовують варіації цієї концепції для розробки більш активних і специфічних протиракових лікарських засобів. (22-24). Розроблені різні покоління галактозидних проліків і кон'югатів антитіло-галактозидаза, що забезпечують зменшення системної токсичності при збільшенні цитотоксичності активованого лікарського засобу |25Ї. Мутовані форми пуриннуклеозидфосфорилази людини були спроектовані для підвищення специфічності проліків на основі аденозину як субстрату (26). Крім того, розроблені різні типи імуноферментних, що підходять для інфузії, білків, що характеризуються підвищеною ферментативною активністю і авідностю антитіл (27-21.
Описані способи одержання і характеристики І -00547, який являє собою хімічний кон'югат однодоменного рекомбінантного антитіла й уреази бобових з коефіцієнтом кон'югацією приблизно 10 антитіл на молекулу нативної уреази. При застосуванні імунокон'югата І-00547 як проліків, що забезпечує продукцію аміаку, використовують сечовину, яка у природі присутня в пухлинних тканинах у великій кількості. Селективне зв'язування антитіла АЕАЇКІ2 з пухлина- асоційованим антигеном СЕАСАМб (|33| на пухлинних клітинах-мішенях приводить до нагромадження уреази і наступного гідролізу позаклітинної сечовини з утворенням аміаку, який має цитотоксичну дію і створює лужне середовище, несприятливе для ракових клітин І|З4).
Унаслідок складної структури і розміру кон'югата, що може мати молекулярну масу до 680 кДа, розробляють процедури кон'югаційної хімії, реакції і розділення, що дозволяють вирішити бо проблеми великомасштабного виробництва. Оскільки уреаза містить кілька ділянок, по яких можна здійснити кон'югацію з вибраним антитілом, за допомогою мікроканальної системи гель- електрофорезу Ехрегіоп 505 ІЗ1,32| визначають коефіцієнт кон'югації Ї-00О547, що має важливе значення для ефективності лікарського засобу. Чистоту кон'югата І -00547 визначають методом гель-хроматографії. Хімічну ідентичність Ї/-00547 характеризують за допомогою методів пептидного картування з використанням мас-спектрометрії і вестерн-блотингу. Оскільки первинний амін (К32) присутній на ділянці СОКЗ однодоменного антитіла, розподіл ділянок кон'югації на молекулі антитіла визначають методами ЗФ-ВЕРХ і мас-спектрометрії МА! 01.
Ділянки кон'югації як на антитілі, так і на уреазі також характеризують методом мас- спектрометрії Е5І. Вплив коефіцієнта кон'югації на спорідненість І-00547 до СЕАСАМб оцінюють методом ЕГІ5БА. Щоб підтвердити здатність І-0О0547 зв'язуватися з СЕАСАМб- експресуючими лініями ракових клітин і викликати цитотоксичність, проводять дослідження іп міїго.
Імунокон'югат (І-00547) розробляють і характеризують як терапевтичний засіб проти пухлин, які експресують СЕАСАМб. Однодоменне антитіло АРАЇКІ2, специфічне до СЕАСАМб, експресують у системі Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) рТ7-7. Уреазу високої чистоти (НРУ) екстрагують з розмелених бобів і очищають. АБЕАЇКІ2 активують, використовуючи М-сукцинімідилід4- йодацетиліамінобензоат (ЗІАВ) як зшивальний засіб, потім кон'югують з уреазою. Реакції активації і кон'югації контролюють по зміні рН. У цих умовах співвідношення вихідних речовин дозволяє досягти коефіцієнта кон'югації 8-11 антитіл на молекулу уреази, вміст вільної уреази, яка залишилася, є практично незначним («2 95), а високочистий (295 95) кон'югат І-00547 можна одержати за допомогою тільки ультрадіафільтрації, що дозволяє видалити антитіло, яке не прореагувало, і гідролізований зшивальний засіб. Ї-00547 характеризують за допомогою ряду аналітичних методів, що включають у себе 5ЕС, ІЕС, вестерн-блотинг, ЕГІ5А і пептидне картування І С-М5Є. В міру збільшення коефіцієнта кон'югації антитіло-уреаза спостерігається більш інтенсивний сигнал зв'язування. Однак ефект є менш вираженим при коефіцієнті кон'югації, що перевищує б антитіл на молекулу уреази. Специфічність і цитотоксичність І - 0оО547 підтверджують шляхом скринінгу на трьох клітинних лініях (ВХРО-3, А549 і МСЕ7).
Виявлено, що ВхРО-3, СЕАСАМб-експресуюча клітинна лінія, є найбільш чутливою до І -0О547.
ІЇ-00547 проходить випробування у фазі | клінічних досліджень на людях як потенційний
Зо терапевтичний засіб для лікування недрібноклітинного раку легені (МЗС С).
Високочисту уреазу як проміжну сполуку (яка далі називається сирою уреазою або 00547) одержують від ВіоМмесіга Іпс. (Спагпонеїмулт, РЕ Сапада). Перед використанням у кон'югації сиру уреазу очищають, щоб видалити білки бобових, присутні у вигляді домішок, такі як канавалін і конканавалін А. Сиру уреазу розчиняють у високочистій воді, доводять рН до 5,15 за допомогою 10 мМ оцтової кислоти і 0,2 мМ ЕДТА (буфер, що містить ацетат-ЕОТА), потім фільтрують у вакуумі, використовуючи суспензію целіту 503. Осад промивають 10 мм ацетатом натрію, 1 мМ
ЕОТА, рН 5,15, і сушать у вакуумі. Уреазовмісний фільтрат охолоджують до 0-47 і фракціонують шляхом додавання охолодженого етанолу до кінцевої концентрації 25 95 (06./06.).
Суміш перемішують протягом 15 хвилин, потім фільтрують у вакуумі з використанням промитого целіту 503. Осад промивають буфером ацетат-ЕОТА, що містить 25 95 (об./о6.) етанолу і сушать у вакуумі.
Кек ресуспендують у буфері ацетат-ЕДТА, суспензію фільтрують у вакуумі через целії і збирають фільтрат. Отриманий кек промивають буфером ацетат-ЕДТА і сушать у вакуумі. Змив і вихідний фільтрат фільтрують через капсулу 0,65 мкм. Отриманий після фракціонування етанолом уреазовмісний фільтрат концентрують -2х з використанням двох поліефірсульфонових мембран МУМСО Запогіих бЗапйосоп 100000 Да з наступною заміною буфера на ацетат-ЕОТА.
Імідазол і ТСЕР (тріс(2-карбоксіетилуфосфіну гідрохлорид) додають до отриманої уреази середнього ступеня чистоти в кінцевих концентраціях 20 мМ і 1 мМ відповідно, після чого рн доводять до 6,5. Білковий розчин завантажують у швидкопротокову колонку з ОЕАЕ-сефарозою, попередньо урівноважену 20 мМ імідазолом, 1 мМ ТСЕР, рн 6,5 (буфер імідазол-ТСЕР). Усі стадії проводять при швидкості потоку 500 мл/хв. Колонку промивають буфером імідазол-ТСЕР і потім буфером імідазол-ТСЕР, що містить 80 мМ Масі, щоб видалити незв'язані домішки.
Уреазу елююють буфером імідазол-ТСЕР, що містить 180 мМ Масі. Фракції з Агво 20,1 і чистотою за даними 5ЕС від 90 до 97 95, об'єднують.
Об'єднані фракції концентрують до концентрації цільового білка 6-8 мг/мл з використанням двох мембран ММ/СО РЕЗИ 5езіогіои5 Загосоп 100000 Да, потім піддають діафільтрації проти буфера ацетат-ЕОТА, що містить 10 мМ ацетат натрію, 1 мМ ЕОТА, рн 6,5. Вихід на цій стадії звичайно складає »55 95 від вихідної активності. Способи експресії й очищення проміжного бо лікарського засобу АРГАЇКІ 2 і амінокислотна послідовність антитіла АРАЇКІ 2 показані на фіг. 5
(ЗЕО ІО МО: 1).
Ген антитіла експресують у системі Е. соїї В 21 (ОЕЗ3) рТ7-7. Один флакон отриманих з банку вихідних клітин в асептичних умовах інокулюють за допомогою трьох стадій висівання в
Їипа Німед (20 г/л) об'ємом 350 л, що містить 50 мг/л канаміцину, 1 г/л церелози, 0,02 г/л
Мазох, і 0,01 95 протиспінювального реагенту Віозхритех, у ферментері об'ємом 500 л. Процес контролюють, підтримуючи вміст розчиненого кисню 220 95, температуру на рівні 37 "С-2 с, зворотний тиск від 5 до 20 фунтів на квадратний дюйм, рН 7,0--0,2, ОЮОвоо у діапазоні 0,5-40 і концентрацію глюкози 1-3 г/л. Після того, як ООвоо у культурі досягає значення в діапазоні 7-10, індукують експресію антитіла шляхом додавання ІРТО до кінцевої концентрації 1 мМ і продовжують інкубацію протягом 6-8 годин. Клітини збирають центрифугуванням, промивають і лізують для вивільнення тіл включення, потім ресуспендують у 10 об'ємах 50 мМ імідазолу, рН 6,8. Клітинну суспензію гомогенізують партіями, гомогенат пропускають спочатку через санітарно-технічне сито з нержавіючої сталі 75 мкм, потім через мікрорідинний фільтр при мінімальному тиску 10000 фунтів на квадратний дюйм із треома пасажами, підтримуючи температуру нижче 10 "С. Клітинний лізат центрифугують, нерозчинні речовини об'єднують, осад ресуспендують шляхом гомогенізації в 10 об'ємах 1 95 тритона Х-100, що містить 5 мМ
ОТТ. Промитий осад збирають центрифугуванням. Таке промивання повторюють, потім промивають 25 мМ ацетатом натрію, рН 4,0, що містить 5 мМ ОТТ, щоб видалити залишковий тритон Х-100 і забуферить осад до рН 4.
Осад, що містить промиті тільця включення, ресуспендують у буфері, що містить 8М сечовину, 25 мМ ОТТ, 125 мМ ацетат натрію, рН 4,0, потім солюбілізують по черзі гомогенізатором Росса і вертикальною мішалкою доти, поки зовнішній вигляд не перестане змінюватися, а потім перемішують за допомогою тільки вертикальної мішалки протягом у цілому
З годин. Солюбілізовані тільця включення центрифугують і прояснений супернатант завантажують зі швидкістю 550 мл/хв на колонку 5Р-Зерпагозе Хі, попередньо урівноважену 8М розчином сечовини в 125 мМ ацетаті натрію, рН 4,0 (урівноважувальний буфер 5Р). Після завантаження проясненого супернатанта колонку промивають урівноважувальним буфером доти, поки Агво елюату не опуститься нижче 0,05, а потім 8М розчином сечовини в ацетаті натрію, рН 4,0, що містить 50 мМ Мас! доти, поки Агво елюату не опуститься нижче 0,05.
Зо Швидкість насоса зменшують до 275 мл/хв, після чого на колонку наносять З см буфера, що містить 8М сечовину, 25 мМ ацетат натрію, 180 мМ Масі, рН 4,0, щоб елюювати АГРГАЇКІ2.
Фракції, у яких Агво 20,4, а відношення Агво/Агво 21,5 об'єднують і аналізують на чистоту і вміст білка. Вихід на цій стадії звичайно складає 35-45595. Об'єднані фракції розбавляють урівноважувальним буфером 5Р до концентрації «2,5 г/л, рН доводять до 8,0 за допомогою 2М
Тиів-СІ, рН 8,0, додають ОТТ до 2,5 мМ, після чого кондиціоновану суміш перемішують протягом 60 хвилин, щоб повністю відновити денатурований білок. Потім розчин денатурованого білка розбавляють до кінцевої концентрації менше 0,1 мг/мл у буфері для рефолдингу, що містить 25
ММ Тріс-СІ, рН 8,5. Рефолдинг проводять при 2-87 і відслідковують за допомогою аналізу
Еллмана і рідинної хроматографії на оберненій фазі С18 доти, поки рівень вільних сульфгідрильних груп не стане «0,75 мкМ і можна буде знайти тільки повністю окиснений білок.
Після рефолдингау розчин білка завантажують на колонку О-Зерпагобзе ХІ, попередньо урівноважену 25 мМ розчином імідазолу, рН 6,8, після чого колонку промивають урівноважувальним буфером доти, поки Агво не стане «0,05, а потім 25 мМ розчином імідазолу, рН 6,8, що містить 50 мМ Масі, доти, поки Агво не стане «0,01. Потім білок елююють 25 мМ розчином імідазолу, рН 6,8, що містить 150 мМ Масі, і збирають фракції доти, поки А280 не стане «0,3. Фракції об'єднують з одержанням цільового пулу з чистотою не менше 97 95 і виходом не менше 45 95. Потім пул концентрують до 3-5 г/л за допомогою системи ШЕ/ОЕ, використовуючи картриджі Нуагозагі, що містять регенеровану целюлозу 5000 МУУСО, після чого буфер замінюють на 10 мМ фосфатний буфер, рн 7,0, і ліофілізують.
Кон'югаційна хімія
Кон'югацію проводять у дві стадії (фіг. 6). На першій стадії первинні аміногрупи АЕАЇКІ 2 активують шляхом взаємодії з МНЗ-складноефірним фрагментом 5ІАВ. На другій стадії активоване АЕРАЇК2 приєднують до тіольних груп уреази через йодацетамідний фрагмент ЗІАВ.
Як показано на фіг. 6, синтез кон'югата І-00547 являє собою двостадійну реакцію. На стадії 1 проводять активацію антитіла з використанням 5ІАВ, а на стадії 2 здійснюють кон'югацію активованого антитіла з ферментом уреазою з одержанням біокон'югата І -00547.
Активація антитіла АРАЇКІ 2. Ліофілізоване АЕАЇКІ2 (25 г) розчиняють у воді для ін'єкцій (МУР). ЗІАВ (2,00 г) розчиняють у безводному ДМФ і додають до розчину АРАЇКІ2 трьома однаковими порціями з 60-хвилинним перемішуванням після кожного додавання. Через годину бо після останнього додавання 5ІАВ усі що залишилися МНо5-групи, які не прореагували, гасять додаванням 10-кратного молярного надлишку гліцину в порівнянні з вихідною кількістю доданого 5ІАВ. Щоб видалити гідролізований і гашений гліцином 5ІАВ, реакційний розчин концентрують до 10 мг/мл АЕАЇКІ2 за допомогою Загогіоиє Ззапйосоп МУУСО 5000 Да й потім буфер заміняють на 10 мМ ацетат натрію, рН 6,5, 1 мМ ЕОТА.
Кон'югація активованого антитіла з уреазою. Уреазу високої чистоти (50 г) змішували з активованим АГЕАЇКІ 2 у 10 мМ ацетаті натрію, рН 6,5, 1 мМ ЕДТА. Потім рН доводили до 8,3 шляхом додавання 1 М борату натрію, рН 8,5, що дозволяє йодацетильній групі активованого антитіла реагувати з доступними залишками цистеїну на уреазі. Реакційну суміш залишали на 90 хв. при перемішуванні. Йодацетильні групи, які не прореагували, потім гасили додаванням 10-кратного молярного надлишку цистеїну в порівнянні з вихідною кількістю доданого 5ІАВ і розчин перемішували протягом 60 хвилин. Для видалення некон'югованого АЕАЇКІ2 І-00547 концентрували до мішені б мг/мл, використовуючи 100000 Да МУУСО Запогіоиє Запосоп з наступним буферним обміном на 10 мм /-гістидину з рН 6,8, 0,2 мМ ЕОТА. Сахарозу додавали до кінцевої концентрації 1 95 мас./об. І І-00547 розбавляли до цільової концентрації 1,8 г/л за допомогою 10 мМ Г-гістидину з рН 6,8, 0,2 мМ ЕДТА.
Гель-хроматографія (ЕС) для визначення чистоти. Використовують систему ВЕРХ Умаїегв5 2695 з 996 РАБ і програмне забезпечення Етроугег 2 для збору й обробки даних. Хроматограми реєструють у діапазоні 210-40024 нм, дістаючи для обробки сигнал при 280 нм. розділення здійснюють на колонці із суперозою 6 100/300 С (СЕ). Білюи елююють буфером, що містить 10
ММ фосфат, 50 мМ масі, 0,2 мМ ЕДТА, рн 7,2. Розділення здійснюють у ізократичному потоці зі швидкістю 0,5 мл/хв після введення 100 мкл чистих зразків. Колонку тримають при кімнатній температурі, а температуру зразка контролюють при 5:22 76.
Іонообмінна хроматографія (ІЕС) для визначення залишкової уреази. Використовують систему ВЕРХ УМаїег5 2695 з 996 РАЮ і програмне забезпечення Етромжег. Хроматограми реєструють у діапазоні 210-400-4 нм, дістаючи для обробки сигнал при 280 нм. Колонку (Мопо-
О 5/50 С, СЕ) використовують при кімнатній температурі, а температуру зразка тримають при 5ж2 "С. Буфери для елюювання містять 50 мМ ацетат, 0,025 95 полісорбату 80 (суперчистий,
НХ2, МОЄ Согрогаїйоп, ТоКуо) у присутності (буфер В) або за відсутністю (буфер А) 0,70 М Масі, рН 5,50. Колонку врівноважують сумішшю, що містить 15 95 буфера В і 85 95 буфера А, протягом
Зо 6 хв при швидкості потоку 1 мл/хв (б СМ), до введення зразків. Після циклу промивання (15 95 буфера В при 1,0 мл/хв протягом 6 хв) білки елююють у градієнті 15-60 95 буфера В протягом 20 хвилин зі швидкістю потоку 0,5 мл/хв. Після очищення 100 95 буфером В протягом 6 хвилин при 1,0 мл/хв, колонку повторно врівноважують 15 95 буфером В перед уведенням наступного зразка. Чисті зразки І -00547 об'ємом 800 мкл маркують високочистою уреазою як зразком для порівняння з кінцевим вмістом 0-89 мас/мас і вводять 50 мкл/зразок. Висоту піка використовують для розрахунку вмісту залишкової уреази з додаванням стандарту як методу калібрування.
Для визначення коефіцієнта кон'югації використовують мікроканальний гель-електрофорез
Ехрегіоп 505. Для аналізу коефіцієнтів кон'югації І-00547 використовують автоматизовану систему для електрофорезу ВіоКаа Ехрегіоп і набір для гель-електрофорезу Віокаа 505 (набір
Рго260). Зразки розводять буфером Тріс-НСІ (10 мМ, 0,2 мМ ЕДТА, рН 7,0) до концентрації цільового білка 0,5 мг/мл, потім 4 мкл розведені зразки або стандарта молекулярної маси змішують з 2 мкл буфера для зразків і швидко центрифугують. Зразки нагрівають при 70 С протягом 10 хвилин і потім завантажують у мікроканальний чип після заповнення системи і каналів гелеоподібним, що містить барвник розчином. Електрофореграми автоматично реєструють за допомогою програмного забезпечення Ехрегіоп.
Вестерн-блотинг для характеристики ідентичності. Тестовані зразки І-00547 і контрольні зразки АРАЇКІ2/НРИ розділяють методом гель-електрофорезу 5О5-РАСЕ, потім переносять на нітроцелюлозну мембрану за допомогою системи Іпмігодеп іВіої. Дублюючі плями одержують з паралельних гелів. Для підтвердження ідентичності АБЕАЇКЇ2 проводять детекцію з використанням кролячого ІдсС проти АРЕАЇКІ2 (КосКіапа) як первинного антитіла і кон'югат козячого антитіла проти кролячих ДО з лужною фосфатазою (АР) (Зідта) як вторинного антитіла. Для підтвердження ідентичності уреази проводять детекцію з використанням кролячого ДС проти уреази (КосКіапа) як первинного антитіла і кон'югат козячого антитіла проти кролячих ДС з АР (бЗідта) як вторинного антитіла. Для детекції з використанням до проти АРАЇКІ 2 зразки І-00547 розбавляють до 0,002 мг/мл 1хТВ5, що містить 0,1 мг/мл ВЗА, потім змішують 1:1 з буфером для завантаження білків на гель, нагрівають при 70 "С протягом 10 хвилин і 0,01 мкг І-00547 завантажують на смугу. Для детекції з використанням дО проти уреази зразки Ї-00547 розбавляють до 0,02 мг/мл 1хТВ5, що містить 0,1 мг/мл ВЗА, потім бо змішують 1:11 з буфером для завантаження білків на гель, нагрівають при 70 "С протягом 10 хвилин і 0,1 мкг І-00547 завантажують на смугу. Кінцеву обробку вестерн-блотів проводять за допомогою буфера АР, що містить МВТ/ВСІР.
Аналіз І -00547 з різними коефіцієнтами кон'югації методом ЕГІЗА
Щоб досліджувати вплив коефіцієнта кон'югації на спорідненість І-00547 до його антигену- мішені СЕАСАМб, одержують кон'югати /-00547 з різними коефіцієнтами кон'югації в лабораторному масштабі шляхом варіювання молярного відношення АРАЇКІ2/НРИ у процесі кон'югації. Коефіцієнти кон'югації отриманих кон'югатів визначають за допомогою 505-Ехрегіоп, а концентрацію білка визначають за допомогою мікрометоду Лоурі з використанням набору для визначення загального білка (Зідта, ТРО200). Мікротитрувальні планшети покривають 100 мкл/'ямку СЕАСАМБ6Б-А, доменом А повнорозмірного антигену СЕАСАМб (2,5 мкг/мл у РВ5Б) і інкубують при кімнатній температурі протягом 6 годин. Планшети двічі промивають буфером А (0,05 95 ВЗА у РВ5), блокують 150 мкл/ямку З 95 ВЗА/РВ5З при 4 "С протягом ночі, після чого двічі промивають буфером А. Усі наступні стадії проводять при кімнатній температурі з обережним струшуванням. Додають І -00О547 (100 мкл/ямку) і інкубують протягом 2 годин, потім планшети промивають З рази буфером А, додають 100 мкл/ямку ДО проти уреази (1:12000,
ВосКіапа) і інкубують протягом 1 години. Після трьох промивань буфером А додають 100 мкл/ямку кон'югата цапине антитіло проти кролячих ІдО-АР (1:6000, Зідта) і інкубують протягом 1 години. Після трьох промивань буфером А додають 100 мкл/ямку розчину субстрату АР і інкубують протягом 25 хв. Поглинання детектують при 405 нм.
Визначення ділянок активації на антитілі АРАЇКІ 2
Щоб одержати мічений флуоресцеїном цистеїн (Су5з-РЇ), надлишок цистеїну піддають взаємодії з МН5О-складноефірними групами флюоресцеїну (Ріегсе) у 1М бораті, рН 8,0 протягом 60 хвилин при кімнатній температурі. Реакційний розчин розділяють методом ЗФ-ВЕРХ на колонці С8. Фракцію, що відповідає піку Суб5-РЇ, ідентифікують методом мас-спектрометрії
МАГ ОЇ, а його концентрацію визначають методом спектрометрії відповідно до коефіцієнта екстинкції при 493 нм і рН 7. Аліквоти пікової фракції ліофілізують і зберігають у темряві при - 20 С. Спочатку антитіло АРАЇКІ 2 активують зшивальним реагентом ЗІАВ у лабораторному масштабі, а потім гідролізований 5ІАВ видаляють за допомогою знесолювальної колонки 525 власного виробництва. Активованому антитілу дають взаємодіяти з міченим флуоресцеїном
Зо цистеїном (Субз-РІ) у 100 мМ боратному буфері з рН 8,3 протягом 90 хвилин при кімнатній температурі. Реакційний розчин піддають заміні буфера на 30 мМ гідрокарбонат амонію за допомогою знесолювальної колонки 525, після чого отриманий АЕАЇКІ 2-Суз-РЇ. розбавляють до 0,5-0,Ф8 мг/мл 30 мМ розчином гідрокарбонату амонію, що містить 20 95 ацетонітрилу.
Додають трипсин (Рготеда) з кінцевим відношенням білка до трипсину 20:1 і здійснюють розщеплення при 37 "С протягом 36 годин. Отриманий триптичний гідролізат відновлюють додаванням 0,1 М ТСЕР до кінцевої концентрації 2 мМ, потім розділлють методом ВЕРХ на зворотній фазі (система Адіїепі 1100 з колонкою 2орах 30058-С18, 5 мкм, 4,6х150 мм, градієнт від О до 45 95 ацетонітрилу, 0,025 95 ТЕА протягом 55 хвилин) і реєструють поглинання при 420 нм. Оскільки ЗІАВ-активований лізин на АЕАЇКІ 2 зв'язаний з міченим флуоресцеїном цистеїном, він навряд чи є доступним трипсину, отже, може утворитися пептид (ХаиКХт)-Сув-РЇ. Збирають пікові фракції, що містять модифіковані флуоресцеїном пептиди, і аналізують їх методом мас- спектрометрії МАГОЇ у режимі КеПесігоп (Місготав55 Тої 2е). Площі піків ВЕРХ відповідних пептидів використовують для розрахунку відсотка розподілу кожної ділянки активації.
Картування пептидів і ідентифікацію кон'югованих пептидів проводять методом мас- спектрометрії Е5БІ. Використовують мас-спектрометр Умаїег5 Хемо 52 ОТОЕ і систему Асдийу
ОРІ.С класу Н з колонкою ВЕНЗОО С18 (1,7 мкм, 2,1х150 мм). Кожен зразок І -00547 (1,5-2,0 мг/мл, 50,0 мкл) змішують з 0,063-0,003 г гуанідин-НСІ. Після повного розчинення солі додають 1,50 мкм 0,7 М ОТ і розчин інкубують при 60 "С протягом 30 хвилин. Додають 0,20 М йодацетамід (ІАА) і рН доводять до 8,0-8,5 насиченим розчином тріс-основи. Зразок інкубують при 37 "С протягом 60 хвилин. 50,0 мкл кожного алкілованого зразка змішують з 15,0 мкл 0,1 М
Сасі» і 80,0 мкл Тріс-буфера (50 мМ Тріс-НСЇ, рН 8,0), потім додають 3,00 мкг 0,5 мг/мл розчину трипсину. Розщеплення трипсином проводять при 37"С протягом 20-24 годин. Після розщеплення трипсином 50,0 мкл гідролізату змішують з 0,50 мкл чистої мурашиної кислоти для аналізу методом РХ-МС. Температуру колонки встановлюють при 60 "С, для розділення методом ОРІ С використовують розчинник А (0,075 95 об./06. розчин мурашиної кислоти у воді) і розчинник В (0,075 95 розчин мурашиної кислоти в ацетонітрилі). ОРІ С проводять зі швидкістю потоку 0,15 мл/хв у градієнті від 0 до 55 95 розчинника В протягом 80 хвилин.
Аналіз І С-М5 контролюється програмним забезпеченням Маз5іупх М4.1. Збір даних І С-М5Е
ТІС (загальний рахунок іонів) проводять у діапазоні М/2 50-2000 Да у режимі розділення зі бо швидкістю сканування 0,3/с, напругою на капілярі 3,0 кВ, напругою 25 В, напругою на конусі для зразків 4,0 кВ. Збір даних ТІС при фрагментації, індукованій високоенергетичним зіткненням, проводять у режимі зростання енергії зіткнення з 20 до 40 В. Температуру джерела іонів установлюють при 100 "С, а температуру десольватації встановлюють при 300 "С. Швидкість потоку газу при десольватації складає 600 л/година. Ряд вихідних даних ТІС при фіксації маси в режимі реального часу (скан/20 с) одержують з використанням 100 фмоль/мкл Сі-Бі В при швидкості потоку 3,0 мкл/хв.
Мас-спектрометричні вихідні дані обробляють за допомогою ВіоРіагтаїупх (м1.2) у режимі відображення пептидів з розділенням 20000. Фіксовану масу 785,8426 Да використовують для калібрування маси в режимі реального часу. Поріг інтенсивності іонів низької енергії М5 установлюють при 3000 імпульсів, а поріг інтенсивності іонів високої енергії МБУ установлюють при 300 імпульсів. Допуски для відповідності мас установлюють рівними 15 м. ч. для наборів даних як М5, так і МОЄ. Амінокислотні послідовності АРАЇКІ2 і уреази вводять у бібліотеку послідовностей для пошуку збігу//дентифікації пептидів. Змінні модифікатори, що включають дезамідування М, дезамідування сукциніміду М, окиснення М, окиснення 2ХхМ, «-К, «Ма і фіксований модифікатор карбамідометил С (для алкілованого цистеїну) використовують для аналізу пептидної карти. Щоб ідентифікувати пептиди, які беруть участь у кон'югації, з боку
АРГАЇКІ2, одержують пептиди, що містять цистеїнвмісні ділянки уреази і ділянку зв'язування зшивального засобу 5ІАВ (СеН?7О2гМ, 161,0477 Да) як змінні модифікатори і включають їх у бібліотеку змінних модифікаторів. У цьому випадку карбамідометил С використовують як змінний модифікатор. Щоб ідентифікувати пептиди, які беруть участь у кон'югації, з боку уреази, одержують пептиди АЕАЇКІ2 з лізином у середині ХоКХт, які містять ділянку зв'язування 5ІАВ, що використовують як змінні модифікатори і включають їх у бібліотеку змінних модифікаторів.
Аналіз зв'язування І -00547 з цілими клітинами
Клітинні моношари одержують шляхом висівання 100 мкл/ямку клітин МСЕ-7, ВХхРО-3 і А549 (дх107 клітин/ямку) у 96-ямкові планшети для культивування і інкубують протягом ночі при 37 "С.
Потім із планшетів видаляють середовище і моношари клітин фіксують 100 мкл/ямку 0,05 Фо розчину глутаральдегіду в РВЗ5 протягом 10 хв при кімнатній температурі (КТ). Потім планшети промивають РВ5З і додають 120 мкл 50 мМ гліцину. Після інкубації при 37 "С протягом 20 хв планшети блокують 120 мкл/ямку 1 95 ВЗА/РВ5З при 37 "С протягом 30 хв. Потім планшети
Зо промивають З рази буфером А (0,05 95 ВЗА у РВ5) і додають 80 мкл/ямку розведеного І-00547 або 00547 і інкубують при 37 "С протягом 1,5 годин. Планшети промивають 4 рази буферомА і додають 80 мкл/ямку 20 мм розчину сечовини в 0,1 М РВ5, рН 7,6, після чого інкубують при 37 "С протягом 30 хв. Після інкубації для зупинки реакції додають 40 мкл/ямку 1М НОЇ. Кількість аміаку, отриманого в кожній ямці, визначають за допомогою модифікованого індофенольного аналізу. Коротко говорячи, одержують свіжий розчин А шляхом розчинення 165 мг фенолу і 132 мг Маон у 10 мл води з наступним додаванням 66 мкл розчину нітропрусиду натрію (10 мг/мл).
Розчин В одержують шляхом додавання 40 мкг гіпохлориту натрію до 5 мл води. Зразки розчинів (30 мкл кожного) з аналізу зв'язування цілих клітин переносять у новий 96-ямковий планшет, що містить 50 мкл/ямку 5М Маон:нео (3,3:46,7) і 20 мкл/ямку води. Додають розчин А (50 мкл/ямку) і розчин В (50 мкл/ямку), після чого планшети переносять у рідер для мікропланшетів, де відбувається розвиток фарбування при 37 "С протягом 30 хвилин. ОЮ вимірюють при 630 нм. Кількість аміаку, що утворився в ямках, розраховують по каліброваній кривій, використовуючи як стандарти 0-150 мм розчини хлориду амонію.
Аналіз цитотоксичності /-00547. Клітинні моношари одержують шляхом висівання 100 мкл/ямку клітин МСЕ-7, ВхРО-3 і А549 (4х107 клітин/'ямку) у 96б-ямкові планшети для культивування і інкубують протягом ночі при 37 "С. Потім із планшетів видаляють середовище і додають 80 мкл/ямку розведеного І-00547 або 0О547 і додатково інкубують при 37" протягом 2 годин. Після інкубації планшети промивають З рази буфером КЕ-1/0,05 95 В5А і додають 100 мкл/ямку 20 мм розчину сечовини. Планшети інкубують при 37 "С протягом ночі, потім середовище видаляють і заміняють 100 мкл/ямку середовища, що не містить тестованих компонентів. Життєздатність клітин визначають за допомогою аналізу життєздатності клітин
МТ5, для проведення якого в планшети додають 20 мкл/ямку суміші 21:11 об./06б. розчинів
МТ5/РЕЗ (2 мг/мл МТ5, 1 мг/мл РЕ5). Потім планшети інкубують при 37 "С протягом 1 години і вимірювали ОО при 630 нм у порівнянні з 490 нм.
Уреаза бобових являє собою гексамерний фермент, що складається із шести ідентичних субодиниць, кожна приблизно по 91 кДа, що містить 15 незв'язаних залишків цистеїну на субодиницю. Антитіло АРАЇКІ2 містить сім первинних аміногруп і дисульфідний зв'язок.
Первинні аміногрупи антитіла і залишки цистеїну уреази використовують для хімічної кон'югації за допомогою гетеробіфункціонального зшивального засобу. Однак молекулярний розмір 60 кон'югата і природа двох білків створюють проблеми при масштабуванні способів одержання,
очищення і характеристики кон'югата. Імунокон'югат, що підходить для застосування як парентеральний лікарський засіб, повинен бути розчинним і стабільним у водних середовищах при значеннях рН, близьких до фізіологічного; отже, для одержання потрібної ізоелектричної точки (рі) потрібно ретельне конструювання послідовності рекомбінантного антитіла, оскільки уреазу екстрагують з рослинного джерела і її рі (що спостерігається рі 4,8-5,1) не може бути змінений. Оптимізація, що дозволяє гарантувати однорідність реакції, а також видалення залишкових реагентів і побічних продуктів, має важливе значення для кон'югаційної хімії. Хоча кілька зшивальних засобів (24, 30), широко використовуваних для кон'югації білків, були піддані скринінгу під час розробки, для одержання кон'югата І-00547 вибраний М-сукцинімідилі(і4- йодацетил|амінобензоат (5ІАВ) завдяки різним оптимальним значенням рН для двох реакцій зшивання. У процесі одержання антитіло активують зшивальним реагентом при рН 7,0, потім заміняють буфер на рН 6,5 і змішують з уреазою. Потім антитіло приєднують до уреази, збільшуючи рН реакційного середовища до 8,3. Оскільки швидкість реакції приєднання активованого АРАЇКІ2 до уреази дуже низького при рН 6,5, однорідність матеріалу у великій реакційній посудині забезпечують шляхом попереднього перемішування при рН 6,5. Отже, розподіл залишкової вільної уреази і різновидів кон'югата уреаза-(АБ)х визначається винятково імовірністю і молярними співвідношеннями вихідних речовин. При коефіцієнтах кон'югації 8-11 антитіл/'уреазу вміст залишкової уреази теоретично незначно, а кон'югат Ї-00547 можна очистити, використовуючи ультрадіафильтрацію для видалення антитіла, яке не прореагувало, і гідролізованого зшивального засобу. Гель-хроматограми кон'югата І -00547, вільного АЕАЇКІ 2 і вільної уреази показані на фігурі 7.
Кон'югат І-00547 елююється через «24,6 хв., димер (можливо, зв'язаний дисульфідним зв'язком або молекулою АЕАЇКІ2, активованою двома 5ЗІАВ) елюється у вигляді невеликого нерозрізненого піка через 20,5 хв., а полімер елюється у вигляді залишкового піка з порожнім об'ємом колонки («15 хвилин). Залишковий пік, який елююється через «40 хвилин, відповідає компонентам буфера. Ширина піка кон'югата І-00547 дещо більша, ніж ширина піка вільної уреази, але порівнянна з нею, що дозволяє припустити рівномірний розподіл реакції кон'югації.
Вільне антитіло елюється через 37 хвилин. Невеликий недозволений пік перед піком антитіла відповідає димеру, утвореному нековалентними зв'язками. У виробничих партіях звичайно
Зо присутнє антитіло високого ступеня чистоти (295 95) з низьким вмістом, що не перевищує 5 95, високомолекулярних домішок, що включають димери. НРО звичайно елюється у вигляді основного піка через «26,9 хв, невеликого піка димера через 24 хвилини і слідового піка полімеру через 15 хвилин. Шляхом очищення сирої уреази одержують НРИ, що містить «97 Фо мономера і не більше З 95 димера і полімера в сумі. Ступінь чистоти І-00547 більше 95 95 звичайно досягають шляхом простого очищення з використанням тільки ультрадіафільтрації.
Оскільки ЗЕС проводять у природних умовах, вона може зумовлювати зміну ефективної молекулярної маси внаслідок деградації і дисоціації четвертинної структури білка; тому цей метод також використовують для аналізу стабільності І -00547. Присутність залишкової вільної уреази в І-00547 визначають методом іонообмінної хроматографії (фіг. 8).
Залишкова вільна уреаза елюється через 15,33 хвилин, дуже близько до піка маркованої уреази (15,42 хвилини). Пік НРО досить добре відділений від великого піка І -00547 (Ве 1,48).
Як показано на вставці фіг. 8, стандартний метод додавання (І -00547, що містить 2,4 95, 4,8 9б і 7,2 95 мас/мас НРУ), використовуваний для визначення вмісту залишкової уреази, демонструє гарну лінійність (К2 0,9995). Розрахований вміст залишкової уреази в цьому зразку складає 0,72 956, причому вміст залишкової уреази не перевищує 295 у всіх виробничих партіях, отриманих дотепер, що свідчить про те, що вміст залишкової уреази практично незначно в цих умовах і виробничий процес не вимагає додаткової стадії для розділення кон'югата І -0О547 і некон'югованої уреази.
У процесі промислового одержання І -00547 кожну із шести мономерних субодиниць уреази можна кон'югувати з нулем, однію, двома, трьома або чотирма молекулами АРАЇКІ2; отже, у денатуруючих умовах аналіз І -00547 методом 505-Ехрегіоп дає кілька дискретних піків/смуг від -90 до 155 кДа. Крім того, у процесі реакції активації антитіла невелика частина молекул антитіла може довільно активуватися двома ЗІАВ на молекулу антитіла (АРАЇКІ 2-(БІАВ)г), що приводить до кон'югації кожної з таких молекул антитіл із двома субодиницями уреази. Отже, одне антитіло-дві субодиниці дають менший другий набір слабко розділених піків/смуг у діапазоні 200-260 кДа.
На фігурі 9, панель 2, наведене дане зображення гелю, а на панелі 1 - накладення електрофореграм смуг 1 і 4. Експериментальний зразок І -00547, який писутній у смугах 1-2 і 7- 8, одержують з використанням активованого АБАЇКІ2, очищеного іонообмінною бо хроматографією перед другою реакцією кон'югації. Оскільки молекули АРАЇКІ 2-(БІАВ)»
видалені, отриманий кон'югат не містить зв'язаних між собою субодиниць і спостерігається тільки один набір піків/смуг. Для одержання зразка І -00547, який присутній на смугах 3-6,
АРАЇКІ2 використовують безпосередньо в реакції кон'югації після стадії активації без додаткового очищення і, отже, присутній невеликий другий набір піків/смуг. Смуги 9 і 10 перевантажені зразком НРИ.
Площі піків (фіг. 9, панель 1) і інтенсивності смуг (фіг. 9, панель 2) залежать від відносного вмісту субодиниць уреази, зв'язаних з відповідним числом молекул антитіл. Площі піків інтегруються програмним забезпеченням після корекції по вихідному рівні, а коефіцієнт кон'югації І-00547 (СК) розраховують по наступній формулі (див. фігуру 10, на якій наведена смуга 2 з гелю, показаного на фігурі 9):
СвА-бРКІ"0О-РК21 РКаз"2--РКА"З-РКВЯ)ДРК:І-А-РК2АРКзаРКА-РК»), де РК; (І-1-5) позначає площу піка субодиниці уреази, зв'язаної з і-і1 молекулами антитіла.
Оскільки активоване антитіло не піддають очищенню методом іонообмінної хроматографії в процесі великомасштабного виробництва /-00547, на електрофореграмах цих зразків присутній другий набір піків з поганим розділенням. Однак два набори піків приблизно мають однакові картини інтенсивності, оскільки розподіл ділянок активації визначається імовірністю і молярним відношенням антитіла до 5ІАВ. Отже, зазначений другий набір піків не використовують для розрахунку коефіцієнтів кон'югації, оскільки смуги мають погане розділення і перекриваються з маркером молекулярної маси 260 кДа. Хоча молекули АЕАЇКІ 2-(ЗІАВ)» теоретично можуть утворювати димерні або полімерні кон'югати, зв'язуючись з двома субодиницями з різних молекул нативної уреази, мінімальні рівні (менше З 95) об'єднаних площ піків димерів і полімерів, що спостерігаються на гель-хроматограмі зразка І!-00547 (фіг. 7), свідчать про те, що більшість молекул АРАЇКІ2-(ЗІАВ)» сприяють зв'язуванню між субодиницями однієї молекули нативної уреази з одержанням мономера І-0О0547, а не утворенню міжмолекулярних зв'язків з одержанням димерних і полімерних кон'югатів. Крім того, присутність зазначених піків димера і полімеру в хроматограмах 5ЕС можна логічно пояснити наявністю дисульфідних зв'язків, оскільки аналогічні піки також присутні в гель-хроматограмах уреази НР. Тому другий набір піків у електрофореграмах не використовують як параметр контролю якості.
Зо Коефіцієнт кон'югації І-00547 дуже впливає на спорідненість до СЕАСАМ6б, пухлинного антигена, на який спрямоване антитіло. І -00О547 з різними коефіцієнтами кон'югації (від 1,8 до 12 АРАЇїЇК на уреазу) одержують шляхом варіювання молярних співвідношень АЕАЇКІ 2/уреази
НР для оцінки впливу коефіцієнта кон'югації на спорідненість. Виявлено, що спорідненість І - роза47 до іммобілізованого СЕАСАМ6-А прямо пропорційно числу антитіл, кон'югованих з уреазою (фігура 11). Чим більше приєднано антитіл, тим вищий сигнал зв'язування. Однак цей ефект є менш вираженим при коефіцієнті кон'югації 6 або більше.
Аналіз І-00547 методом подвійного вестерн-блотинга (фіг. 12) підтверджує картину смуг, що спостерігається при проведенні 505-Ехрегіоп. На вставці показане збільшення поміеної в рамку ділянки основної плями, у якій позначені уреаза і кон'юговані молекули (М1-М4, що відповідають уреазі, кон'югованій з 1-4 молекулами АЕАЇКІ2). Після обробки антитілом проти уреази найбільш сильно візуалізується смуга уреази, що відповідає 91 кДа, а інтенсивність смуг, що відповідають більш високій молекулярній масі (тобто молекулам з більш високим ступенем кон'югації) зменшується. І навпаки, після обробки антитілом проти АРАЇКІ 2 смуга, що відповідає 91 кДа, ледь помітна, а наступні дві смуги, що відповідають більш високій молекулярній масі, є найбільш інтенсивними (МІ! і М2). Це пов'язане з тим, що вони є домінуючими смугами в кон'югаті. Здатність Ї-00547 візуалізуватися як антитілом проти АЕАЇКІ 2, так і антитілом проти уреази, свідчить про присутність обох молекул у кон'югаті, а специфічність антитіл підтверджується тим фактом, що антитіло проти АЕАЇКІ 2 не зв'язується з уреазою, а антитіло проти уреази не зв'язується з АЕРАЇКІ 2.
Оскільки Г-00547 являє собою хімічний кон'югат АБАЇКІ 2 і уреази, у триптичному гідролізаті кон'югата можна знайти пептиди, які являють собою фрагменти як антитіла, так і ферменту уреази, а також ковалентно зв'язані фрагменти обох білків. Для характеристики кон'югата здійснюють пептидне картування ЕБІ І С-М5Є. Як показано у відповідному розділі, пептиди з АЕРАЇКІ 2 можна знайти в спектрі Ї-00О547, але не в спектрі уреази НР. Пептиди, які присутні у триптичному гідролізаті І! -00547, на 100 95 охоплюють амінокислотні послідовності як АЕАЇКІ 2, так і уреази з типовою масовою помилкою меншою 6 м. ч., причому кожний з пептидів підтверджується наявністю іонів високої енергії М5/М5 Б/у з масовими помилками меншими «15 м. ч.
Щоб ідентифікувати ділянки активації АРАЇКІ2 і визначити розподіл кожної ділянки бо кон'югації, АЕАЇКІ 2 активують за допомогою 5ІАВ і потім кон'югують з міченим флуоресцеїном цистеїном (Су5-РІ). Після розщеплення трипсином отриманого АРАЇКІ 2-Сувз-РЇ і розділення методом ЗФ-ВЕРХ збирають пікові Фракції і піддають їх аналізу МАГ 0І-М5, щоб ідентифікувати утворені в результаті триптичного гідролізу пептиди, зв'язані з Суб5-ЕЇ. Оскільки тільки БІАВ- активовані ділянки можуть бути зв'язані з Сузх-флюоресцеїном, максимальна довжина хвилі поглинання якого в 0,025 956 ТЕА складає 420 нм, при 420 нм можна знайти піки тільки активованих пептидів. Наприклад, якщо лізин 32 АЕАЇКІ 2 активувати за допомогою 5ІАВ, він може зв'язуватися з Суб5-БЇ, і ця ділянка розщеплення трипсином буде пропущена під час триптичного гідролізу; отже, можна спостерігати пік з молекулярною масою 2768,113 Да, якому відповідає Су5-РЇ,, зв'язаному з лізинім у середині пептиду (Г5СААНОРІРОКз2МІ МОаМУсі)-Сув-РІ. (ЗЕБЕО ІО МО: 7), що позначається як І2Кз2-Субз-БЇ. Хроматограма 3ЗФ-ВЕРХ триптичного гідролізату АЕАЇКІ 2-Сув-РЇ. показана на фігурі 13.
Ідентифіковані кон'юговані пептиди з визначеними значеннями маси також позначають на відповідних піках ВЕРХ на фіг. 13. Відповідно до амінокислотної послідовності антитіла, первинні аміногрупи шести залишків лізину і М-кінцева аміногрупа теоретично доступні для реакції активації. Однак на практиці тільки чотири з них активуються в істотному ступені. Це, швидше за все, пов'язане з третинною структурою антитіла, що зумовлює експонування чотирьох зазначених первинних аміногруп на поверхні і заглиблення інших усередині нативної структури. Розподіл кожної ділянки активації (таблиця 4) розраховують відповідно до площі піка і суми площ всіх ідентифікованих піків ВЕРХ, показаних на фігурі 13.
Таблиця 4
Площі піків ВЕРХ і відсоток розподілу кожної ділянки активації на АЕРАЇКІ 2
Як показано в таблиці 4, найбільш активною ділянкою антитіла для зшивального засобу є 2Ков, потім І 2М: і І 2Каа. І 2Кз2 необхідна для зв'язування антитіла і також є найменш активною ділянкою, але усе-таки вносить вклад до -18 95 у загальну реакційну здатність. Для одержання
І-00547 проводять ковалентне приєднання активованого зшивальним засобом АЕАЇКІ2 до залишків цистеїну, експонованих на поверхні четвертинної структури уреази. Отже, ковалентно зшиті пептиди можна знайти в спектрі пептидів триптичного гідролізату І -00547.
Щоб ідентифікувати зазначені ковалентно зшиті пептиди, вихідні дані Е5І І С-М5Е триптичних гідролізатів зразків Ї-00547 обробляють за допомогою Віорпаптаї упх, але
Зо проводять пошук у бібліотеці варіабельних модифікаторів, що містить набір модифікаторів, створений користувачами для всіх 15 цистеїнових залишків на фрагменті уреази. Відповідно до розподілу активації, наведеному у таблиці 4, зазначені модифікатори, створені користувачем, являють собою три пептиди, що містять лізин у середині, а також зв'язувальний фрагмент 5ІАВ (СеНьО»М, 159,0320 так) (їх позначають І 2К»;в, І 2Ках і І2Кзг) і М-кінцевий метіонін плюс зв'язок (позначають І2Мі). Результати (детально описані у відповідному розділі) демонструють, що серед 15 залишків цистеїну кожної субодиниці уреази тільки б активно беруть участь у кон'югації. Найбільш доступним залишком цистеїну є ШОСвога., потім у порядку зменшення доступності йдуть ОСввз, ОСво, ОСго7, ОСзго і ОСгвв. Залишок цистеїну Субвог, який необхідний для прояву ферментної активності уреази, практично не бере участь у кон'югації. Чотири ділянки АЕРАЇКІ 2, активовані зшивальним засобом також мають різну відносну доступність для кожного із шести залишків цистеїну, які присутні на фрагменті уреази. Наприклад, ОСзго Є доступним тільки для Г2М:і. Зазначені ділянки практичної кон'югації також підтверджують профілями фрагментів М5/М5. Наприклад, кон'югований пептид 12Кз2ОСвєєз, що має послідовність (| ЗСААНОРІЄЮОКМІ МОУУСК (ЗЕО ІЮО МО: 8))-зв'язок(СО5БЗОМОМЕВ (ЗЕО ІЮ МО: 9)) і масу 3517,4873, ідентифікують з помилкою збігу маси 2,1 м. ч. шляхом пошуку його як пептиду уреази СО5БОМОМЕК (5ЕБЕО ІО МО: 9), модифікованого (/ЗСААНОРІБЄЮОКМІС МОУ (ЗЕО ІО МО: 8))-зв'язок (2346,0674 Да) з боку АРАЇКІ 2 як модифікатора. Той же пептид також ідентифікують з помилкою збігу маси 2,1 м. ч. шляхом пошуку його як пептиду АЕАЇКІ2
І ЗСААНОРІБОКМІ МОУ (ЗЕО ІЮ МО: 8), модифікованого зв'язок-(СО5БЗОМОМЕВ (ЗЕО Ір
МО: 9)) (1330,4520 Да) з боку сечовини як модифікатора. Індукований високоенергетичними зіткненнями М5/М5-спектр зазначеного кон'югованого пептиду картують з використанням 9 іонів фрагментів Б/у з боку уреази шляхом пошуку його як пептиду уреази, модифікованого модифікатором з боку АЕРАЇКІ 2. Той же спектр був також картують з використанням 14 іонів Б/у з боку АРАЇІКІ 2 шляхом пошуку його як пептиду АЕРАЇКІ 2 з модифікатором з боку уреази.
Різні профілі зв'язування І-00547 спостерігаються відносно клітинних ліній ВХРО-3, А549 і
МСЕ7 (фігура 14). Результати демонструють, що /-00547 добре зв'язується з лінією клітин підшлункової залози ВхРО-3, свідчачи про те, що антиген СЕАСАМб експресується на поверхні клітини. Помірне зв'язування спостерігається з лінією клітин легень А549, однак зв'язування з лінією клітин молочної залози МСЕ7 не було виявлено. Антитіло АРАЇКІ2, кон'юговане з ферментом уреазою (00547), забезпечує специфічну спрямованість на клітини, які експресують СЕАСАМб. Це підтверджується відсутністю сигналу зв'язування в трьох клітинних лініях, оброблених некон'югованим контролем 0О547.
Клітини ВхРО-3 є дуже чутливими до цитотоксичності І-00547 (фіг. 15), про що свідчить швидке зниження виживаності клітин, яке спостерігається при обробці клітин І -00547 у дозі меншій 1 мкг/мл. Помірна цитотоксичність спостерігається відносно клітин А5б49, тоді як відносно МСЕ? ніякі ефекти не спостерігаються, що узгоджується з результатами дослідження зв'язування. Крім того, негативний контроль 0О547 не чинить цитотоксичного впливу на жодну з клітинних ліній.
Процедури, розроблені для кон'югації і очищення імунокон'югата І-00547, можна успішно використати в великомасштабному виробництві. З використанням розроблених хімії кон'югації і умов реакції досягають хорошої однорідності шляхом попереднього перемішування активованого зшивальним засобом антитіла з уреазою НР, яка використовується як проміжна сполука, з подальшим коректуванням рН для активації реакції кон'югації. При коефіцієнтах кон'югації, що знаходяться в діапазоні 8-11 антитіл на молекулу уреази, вміст залишкової уреази є практично незначним, отже, кон'югат І -00547 можна очистити за допомогою тільки ультрадіафільтрації, що дозволяє видалити антитіло, яке не прореагувало, і гідролізований зшивальний засіб, і складну стадію відділення залишкової уреази від отриманого імунокон'югата можна уникнути. За допомогою цієї процедури отримують високочистий І-00547 (595 95), в якому вміст вільної уреази складає менше 2 95. Спорідненість Ї-00547 до імобілізованого
СЕАСАМб6-А за даними аналізу ЕГІЗА, прямо пропорційна числу антитіл, кон'югованих з уреазою, і досягає граничного значення, коли коефіцієнт кон'югації перевищує 6. Коеффіциєнти кон'югації варіюють від 9 до 11 антитіл на молекулу уреази у всіх великомасштабний партіях,
Зо демонструючи, що в цих умовах досягається оптимальне кон'югування. Хімічну ідентичність кон'югата підтверджують методом вестерн-блотингу з використанням подвійного антитіла.
Аналіз шляхом пептидного картування методом Е5БІ ГС-М5БЕ дозволяє досягнути 100 95 охоплення послідовностей як антитіла, так і уреази, що входять до складу імунокон'югата І - роза. Пептидні послідовності, які містять більше трьох амінокислотних залишків, які включають С-кінцеві і М-кінцеві послідовності як АРГАЇКІ 2, так і уреази, підтверджують картами фрагментів відповідних пептидів, отриманими методом М5/М5 р/у. Ефективні ділянки кон'югації (4 з боку АРАЇКІ2 і 6 з боку уреази) ідентифікують шляхом пептидного картування зразків І - рОоБз47 методом Е5І І С-М5Е. Вказані зшиті пептиди підтверджують за допомогою карт фрагментів відповідних пептидів як з боку антитіла, так і з боку уреази, методом М5/М5 Б/у.
Специфічність Г-00547 відносно двох СЕАСАМб-експресуючих клітинних ліній ВхРО-3 і
А549 ілюструють відсутністю зв'язування і цитотоксичної активності 0О547 в порівнянні з антитіло-кон'югованим І-00547. Серед трьох тестованих клітинних ліній найбільш інтенсивний сигнал зв'язування спостерігається у ВХРО-3, тоді як зв'язування А549 відбувається тільки в помірній мірі. Сигнал зв'язування ВхРО-3 приблизно в п'ять разів перевищує сигнал зв'язування
АБ549. Отримані результати узгоджуються з результатами аналізів цитотоксичності. І-00547 надає на ВхРО-3 набагато більш сильний цитотоксичний ефект, ніж на А549. У МСБ-7 цитотоксична відповідь не спостерігається внаслідок відсутності зв'язування І -00547. І -00547 бере участь в фазі І клінічних досліджень на людях як потенційний терапевтичний засіб проти недрібноклітинного раку легені.
Потрібно розуміти, що, хоча даний винахід описується з використанням вищезазначених аспектів, наведені вище опис і приклади призначені для ілюстрації, але не для обмеження об'єму даного винаходу. Інші аспекти, переваги і модифікації що входять в об'єм даного винаходу, будуть очевидні для фахівців в галузі, до якої належить даний винахід.
Об'єм даного винаходу не повинен обмежуватися конкретними описаними аспектами, призначеними тільки для ілюстрації окремих положень даного винаходу, причому будь-які функціонально еквівалентні композиції або способи входять в об'єм даного винаходу. Для фахівців в даній галузі техніки повинно бути очевидно, що можна здійснити різні модифікації і варіації способів і композицій даного винаходу, не відступаючи від суті або об'єму винаходу.
Отже, передбачається, що даний винахід охоплює модифікації і варіації при умові, що вони бо входять в об'єм прикладеної формули винаходу і її еквівалентів.
Всі публікації і патентні заявки, згадані в даному описі, включені в даний документ за допомогою посилання в тій мірі, як якби кожна окрема публікація або патентна заявка була спеціально і індивідуально вказана для включення як посилання.
Джерела інформації: 1. Фирр5 М, МезНеепу РМУ, Сптінйнвь В, єї а. Саибзез5 апа сопзедоепсевз ої Штог асіайу апа ітріїсайопв ог їеаїтепі. Мої Мей Тодау 2000; 6:15-9. 2. Вадпипапа М, СіПев НУ. рН апа СпетоїНегару. Іп: Сооде ЧА, Спадміск 0, еав. Те Шштог тістоєпмігоптепі: сайзе5 апа сопзедиепсез ої Нурохіа апа асіайу. Спіспевзівг: допп У/Пеу в оп а. 2001; 199-211. 3. Зепогпаск РА, СіШіе5 НУ. Сопігршііоп5 ої сеї! теїароїїзт апа НУайивіоп о пе асідіс рН ої їштогв. Меоріазіа 2003; 5:135-45. 4. НеІтіїіпдег С, ЗекКеї! А, ОеїПап М, єї а)ї. Асіа ргодисійп іп аіусоїувзіз-ітраіїгед штогв ргоміде5 пему іпвіднів іпіо їштог теїароїївт. Сіїп Сапсег Нез 2002; 8:11284-91. 5. Ігиті Н, Тогідоє Т, ІвНідиспі Н, єї аї. Сеїїшак рН геашіаюгв: роїепійіапйу рготівіпу тоїесшаг
Тагдеїв5 Тог сапсег спетоїПегару 2003; 29:541-9. б. НКореу ІР, Ваддей ВК, КікЖраїнскК МО, еї аї. Вісагбопаїе іпстеазе5 їШтог рН апа іппівіїє зропіапеои5 теїазіазев5. Сапсег Ве5 2009:69:2260-8. 7. Мапопеу ВР, Надпипапа М, Вадуєй В, єї а). Титог асіайу, іоп арріпада апа спетоїПегарешісв5 І. Асій рН айесів Ше аїівіБшіоп ої спетоїПпегарешіс адепів іп міго. Віоспет
Рпапгтасої 2003; 66:11207-18. 8. Мопу МУ, ОеГиса СІ, Тіап В, еї а). Огеазе-іпдисей аїКаїїпігайоп ої ехігасеїІшміаг рН апа їїб апішитог асіїмйу іп питап Бгеавзі апа Ішпд сапсегв. ) Ехр Тег Опсої 2005; 5:93-9. 9. Теіснег ВА, СНагі ВХМ)). Апіїроду сопіндаїе Іегарешіісв: СНаПеподез апа роїепіа!. Сіїп Сапсег
Вез 2011; 17:6389-97. 10. Хи С, Мсі еса НІ. бігагедієз тог епгуте/ргодгид сапсег ІНегару. Сіїп Сапсег Вез 2001; 7:3314-24. 11. Киезреп КТ, Ріїв 5, Найск СА. СЕАСАМ:: ІНеїг гоїє іп рпузіоіоду апа райорнНузіоіоаду. Ситт
Оріп Сеї! Віо! 2006; 18:565-71. 12. Раміороціои А, Зсогпіаз А. А сотргепепвзіме рНуіодепеїйс апа зігисіига! апаїузів ої Ше
Зо сагсіпоетбгуопіс апіїдеп (СЕА) депе Тату. СЧепоте Віо! Емо! 2014; 6:1314-26. 13. Віштепійа! ВО, Напзеп НУ, Сюоідепрегу ОМ. Іппірйіоп ої адпезіоп, іпмазіоп, апа теїавзіавів ру апііродієз їагдеїіпд СЕАСАМб (МСА-90) апа СЕАСАМ5 (сагсіпоетьгуопіс апіїдеп). Сапсег Ве 2005; 65:8809-17. 14. Вага! ТМ, Мигай М, Мдиуєп ТО, еї аї. Івоїайоп ої Тпсійопаї! віпдіє дотаїп апіїбоду Бу мпоїе сеї іттипігайоп: ітріісайопв5 ог сапсег ігеаїтенпі. У Іттипо! Метйоаз 2011; 371:70-80. 15. Зніскіапа ГА, НВо55 У, МУШіатве 5, єї аї. Ргесіїпіса! емаІйайоп ої сагсіпоетьгуопіс сеї адневзіоп тоїесціє (СЕАСАМ) 6 аз роїепійа! Інегару їагаєї їог рапсгєаїй адепосагсіпота. .) Раїної 2009; 218:380-390. 16. Ббихригу М5, Маїгоз Е, По Н, єї а). Зузієтіс зівМА-тедіаїей депе зіїєпсіпд: А пем/ арргоасі о їагдеїес ІНегару ої сапсег. Аппаїв ої Зигдегу 2004; 240:667-76. 17. 7папад У, (Її О, Модмуєп ТО, єї аї. А репіамаіепі взіпдіє-дотаїп апіїбоду арргоасп ю їштог апіїдеп дізсомегу апа пе демеІортенпі ої поме! ргоїеєотісв геадепів. У Мої Віої! 2004; 341161 -9. 18. М/еаїетбитт ММУ. Рпепо!І-пуросНпіопіе геасійїоп ог деїептіпайоп ої аттопіа. Апа! Снет 1967; 39:971-4. 19. Опмада А, Хознпіока У, Імарисні К, єї ам. МЕСЕ гедшіатез їйе ргоїїегайоп ої асід-ехрозейд амеоїаг Іпіпу еріїпеїаї! сеїїів. Трогах 2003; 58:328-32. 20. Маріє, М. Р. еї аї., (2000) Апііроду-дігесівєй Епгуте Ргодгид Тпегару: ЕпПісасу апа
Меспапівт ої Асійп іп Соіогесіа! Сагсіпота!. Сіїіпіса! Сапсег Везвєагспі 6, 765-772. 21. Вадзпауме, К. 0. (1987) Апііроду адігесієд епгутез геміме апії-сапсег ргодгид5 сопсері. Вг.
У. Сапсег 56, 531-532. 22. Вадзпаме К.О. (2006) Апііроду-адігесієд епгуте ргодгид Іпегару (АОЕРТ) ої сапсег. Ехреп
Вем Апіїсапсег ТНег 6, 1421-1431. 23. Тівїге, І. Р. апа Рецегзівіп, Т. (2003) Епгуте апа Ргоїоп-Асіїмаїєд Ргодгидв ог а 5еІесіїме
Сапсег ТНегару. Сит. РНнагт. Рез. 9, 2155-2175. 24. Оеппу, МУ. А. (2004) Титог-асіїмаїейд Ргодгид5-А Мем Арргоасі о Сапсег ТПегару. Сапсег
Іпуезі. 22, 604-619. 25. Раздиено М.М., МесесНіа, І., Соміпі, О., Рідійо, В., апа соці, б., (2011) Тагдеїєй Ота
Оевїїмегу Овіпд Іттипосопіцдаїев: Ргіпсіріє5 апа Арріїсайопв Уситгпаї ої Іттипоїнег 34, 611-628. 26. Тівїго, .Р., апа Ктемег, В. (2009) Апіїроду-дітесівєй епгуте ргодгид Шегару: а ротівіпд 60 арргоасі ог а зеїесіїме ігєаїтепі ої сапсег разейд оп ргодгид5 апа топосіопа! апіїбодіе5. Снет
Віо! Огид Оез 74, 205-211. 27. АізНаг, 5., Аваї. Т., апа Моїтізоп, 5.1 (2009)Нитапігей АОЕРТ Соптрігїізей ої ап Епдіпеегейд
Нитап Ригіпе Мисіеозіде Рпозрпогуіазе апа а Титог Тагоєїпа Рерійе ог Тгєаїтепі ої Сапсег.
Мої Сапсег Тнег 2009, 8 1-9. 28. АївНаг, 5., ОІаївеп, Т., Ми А.М., апа Могтізоп, 5.І.., (2009) Спагасієгігайоп ої ап епаіпеетгейд питап ригіпе писієозіде рпо5рпогуїазе їизедй іо ап апіі-пег2/пеи віпдіє спаіп Ем тог изе іп АОЕРТ.
У Ехр Сіїп Сапсег Вез 28:147. 29. АІдегзоп В.А., Токі, В.е., Вобегде, М., Сепо, МУ., Вавзієг, у., Спіп, А., Пи, А., Оєда, В.,
Нодаез, О., Евсапдоп, Е., Спеп, Т., Капамагіоїї, Т., ВаБре, Ї., Зепіег, Р.О., Рох, 9.А.,
БсеНеПепрегоег, У., (2006) СНагасієгігайоп ої а СС49-Вазейд 5біпаіе-СНнаіп Егадтепі-а-І асіатавзе
Еивіоп Ргоївіп ог Апіїбоду-Оігесієд Епгуте Ргодгшд Тпегару (АОЕРТ). Віосопійдаїє Спет, 17, 410-418. 30. пир:/Лимли.ріегсепеї.сот/теїпод/сто55іїпКкіпа-арріїсайопо5
З1. Кіт, У.Н., Кіт, М-МУ., Кіт, І-М/., Рак, О.б., Кіт, ММ/., ее, К-Н., дапо, С.К., АНп, МУ/.5., (2013) Ідепійісайоп ої сапаідаїе Біота!Кег5 ивіпд Те Ехрепоп'м ашотаїєейа еІесторпогевів зубвівт іп зегит затрієв їгтот омаїап сапсег раїіепів. Іпіегпайопаї! дошитаї ої Опсоіоду 42940, 1257-1262.
З2. Спап, О.Т.М., апа Негоїд, О.А., (2009) Спір Еіесігорпогевзі5 аз а Меїнод ог Оцапійуїпу
Тога! Аіритіп іп Сегербгозріпаї! Ріцід. дошигаї ої пе Аззосіаїйоп ог І арогаїогу Ашотаїіоп 14, 6-11. 33. 7Напа, ч., Гі, О., Модиуєп, Т.0., Ттетбріау, Т-І., 5іопе, Е., То, В., КеїПу, у., апа МасКеп?ів,
С.В., (2004) А репіамайепі віпдіе-дотаїп апіїбоду арргоаси їо Штог апіїдеп дізсомегу апа їйе демеІортетпі ої помеї! ргоїеотісв геадепів. У Мої! Віої! 41 161-1699. 34. Мопо, МУ.У., Ов! иса, С.І., Тіап, В., ММіївоп, І., Моїшпа, 5., Маїтіаг, М., Соміпдап, М.У., Зеда,
І0., апа Снао, Н., (2005) Огеазе-іпдисеад аїКаїїпігавноп ої ехігасеїІшіаг рН апа її5 апійштог асіїміу іп питап бБгеєазі апа Ішпд сапсегв. У Ехр ТНег Опсо! 5, 93-9.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 НЕБІХ ВІОРНАВМА СОБР. «1205 КОН'ЮГАТИ АНТИТІЛО-УРЕАЗА ДЛЯ ТЕРАПЕВТИЧНИХ ЦІЛЕЙ «1305 105013-1610 «1405 «1415 «1505 62/107,210 «1515 2015-01-23 «1605 З «1705 РасепсІп уегзіоп 3.5 «2105 1 «2115 122 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «4005 1
Меє Авр Уаї сіп Гец сіп Аїа бет сіу сі1у сбіу Уаї Уаі сбіп Рго 01Уу 1 5 10 15
СсСіу бБег Гец Агд Гей бег Сув Аза Аїа Нів Авр Рго І1е Рібе Авр Гуз 20 25 о)
Авп о Гец Месє с1у Тгр с1у Акд сіп Аїа Рго сбіу ув біп Агд біц Туг 35 40 45 уаї Аїа ТПтІ Іїе бБет сіу бБет сіу сбі1у ТПх Авп Тут Аїа бет бет Уаї 50 55 бо бі б1у Акуд Рбпе ТПтІ Іїе бБет Акд Авр Авп Аза гуз пув ТПт Уаї Туг 65 70 75 80
Тецш сіп Месб Авп Авр Гецп пув Рго сій Авр ТПт Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95
Авп обБехт Аїа Рпе Аїа І1е Ткр сС1у Сіп б1у ТПт біп Уаі ТПт Уаї 5ег 1600 195 110 бек бі1у б1у б1у біш біп Авр Авр О1У Гув 115 120 «2105 2 «2115 840 «212» Білок 0) «213» Сапауаі1їііїа епвітбогтів «4005 2
Меє ув теп бег Рго Атд біц Уа1ї сі Пув Тец С1у їец Нів Азп Аї1а 1 5 10 15
З5 сіу Ту Гец Аїа сіп Гув Акд Ге Аїа Агд Сбіу Уаії Агд їец Авп Тут 20 25 30 40
ТПкх сі Аїа Уаї Аїа їеп Іїе Аза бек біп Іїе Меє сій Туг Аїа Агд 45 Авр сб1у сіц пув ТПг Уа1ї Аї1а сСі1іп їец Мес Сув Тїец С1у сСіп Нів Гец бо
Пец с1у Агд Агд Сіп Уаї Гец Рго Аїа Уаї Рго Нівз їец Іїєц Азп Аї1а 50 65 70 75 80 уаї б1іп Маії сіц Аїа ТПтІ РпПе Рго Авр біу ТПтІ пув Гец Уаі1! ТПт Уаї 85 Зо 95 55
Ніз Авр Рго І1е бБег Агд б1іц Авп сС1у б1іц їєц С1іп бі АТїа Ієц РБГе 100 105 110 сіу бек Гей Гей Рго Маі! Рго бБет Гец Авр Гуз Рпе Аїа бій ТПБг Гуз 115 120 125 січ Авр Авп Агуд ч1І1е Рго сіу сіц І1е Гей Сув біц Авр сіц Сув Гец 130 135 140
ТПЕ Ггец Авп І1е с1у Акд Гуз Аїа Уа1і Іїе їец пув Уаі1! ТПтІ 5бБет Гуз 145 150 155 160 сС1у Авр Агуд Рго І1е сіп Уа1 с1у бек Нів Тук Нів Робе І1е сі Уаї1 165 170 175
Авп оРгто Тут Ге ТПтІ Рпе Авр Агуд Агуд Гуз Аза Тут Сіу Меє Аг9д Іец 180 185 190
Авп о І1їе Аїа Аза сіу ТПтІ Аїа Уаі Агуд Рпе сбіц Рго с1у Авр Сув Гувг 195 200 205
Ззек Уа1і ТПїх Ггецп Уа1! бек Іїе біц с1у Авп Гуз Уаі І1е Акуд сС1у Шу 210 215 220
Зо
Авп Аїа І1е Аза Авр сіу Рко Уа1і Авп бій ТПгІ Авп Гец сі Аїа А1а 225 230 235 240
Меє Нів А1ї1а Уа1 Агд бБег їув с1у Рпе сСі1іу Нів с1іц бі сі Гув Авр 245 250 255
А1їа бБехт біц с1і1у Рпе ТБПх пув бій Авр Рго Авп Сув Рго Рпе Авп оТПг 260 265 270
Рпе І1їе Нів Агд пув біцш Тут АТїа Авп Гуз Тут біу Рго ТПг ТПтг 01У 275 280 285
Авр гув Іїе Акд Гец с1у Авр ТПІ Авп гей їец Аїа сбіц Іїе с1цЧ Гуз 290 295 300
Авр Тут Аїа Гец Тут с1у Авр сі Сузвз Уаі Рпе сіу сбіу с1у Ппув Уаї 305 310 315 320
І1е Агд Авр сСіу Меє СсСіу сіп Бех Сув СсС1у Нів Рго Рго А1ї1а І1е 5бег 325 330 335 теп Авр ТПтІ Уаї І1ї1е ТБПх Авп Аза Уа1і! Іїе Іїе Авр Тут ТПк с1у Ше 340 345 350
Іїе гув Аза Авр І1ї1е сі1у Іїе ув Авр сСіу еп Іїе Аїа Бех І1е ШУ 355 360 365
Туз Аїа с1у Авп Рго Авр Іїе Меє Авп сіу Маії Рпе 5егт Авп Меє Пе 370 375 380
І1їе б1у Аза Авп ТПтІ сі Уаі Ії1е Аза сС1у біц сбіу їец Іїе Уаї ТПг 385 390 395 400
А1їа сі1у Аїа Іїе Авр Сув Нів Уа1ї Нів Тут І1їе Сув Ркго Ссіп Ієц Уаї1 405 410 415
Тут січ Аїа І1е бет бек б1у Іїе ТПх ТПт Іїевц Уаі с1у с1у с1у ТЕПкК 420 425 430 с1у Рго Аїа Аїа сСіу ТПтІ Агуд Аза ТПг ТпПг о Сув ТПкг Рго Бек Рго ТПг 435 440 445 біп Месє Агд Гей Мес Гец сіп бет ТПтІ Авр Авр Гей Рго Гей Авп РІе
Зо 450 455 460 сіу Рпе ТПтІ сСіу Ппув С1іу бек бет бБет Кпув Рго Авр Сі їец Нів Сс1ци 465 470 475 480
З5
І1е І1ї1е пув Аїа с1у Аїа Мес с1у Гец Пув Тед Нів б1ц Авр Тгр 01У 485 490 495 бек ТПг Рго Аїа Аїа І1їе Авр Азп Сувз їєц ТПт І1їе Аїа СсС1іц Ніз Нів 500 505 510
Авр І1е сСіп ч1І1е Авп І1е Нів ТБПтг Авр ТПт Тїец Авп бі Аза СсС1у РІе 515 520 525 уаї біц Ніз бБехг І1їе АТїа Аїа Ріє Кпувз С1у Агд ТПтІ І1їІе Нів ТіПг Туг 530 535 540
Ніз бек біц б1у Аїа сСіу сі1у сС1у Нів Аїа Рго Авзр І1е І1їе Гуз Уаї 545 5Б5О 555 5б6О
Сув сі1у І1е пув Авп Уаії Гей Рго бек бет ТПІ Авп Рго ТПг Агд Рго 565 570 575
Пец ТПт бек Авп ТІ Іїе Авр Сіц Нів Гей Авр Меє Гец Меє Уаї Суз 580 585 5ЗО
Нів Нів їец Авр Акд Сі І1е Рго сі Авр їец Аї1а Робе А1а Ніз 5бег 595 бо 605
Атуд чІїе Агуд Гув Гпув ТПт І1ї1е Аї1а Аїа бі Авр Уаії їец Авп Авр І1е 610 615 620 сіу Аїа Іїе бБег Іїе Іїе бБет бБет Авр бБет сіп А1ї1а Месє С1у Аг9д Уаї 625 630 635 640 сіу бі Маії Іїе бБегт Акуд ТПтІ Ткр сіп ТПї Аза Авр пуз Меє Тув А1а 645 650 655 біп ТП сб1у Рго Гец Гпув Сув Авр бБет бек Авр Авп Авр Авп Ропе Агд бо 665 670
Іїе Агд Агуд Тут Іїе Аза Гуз Тук ТПг Іїе Авп Рго Аїа І1е Аїа Авп 675 680 685 с1іу Рпе бБет біп Тук Уаії сіу бек Уаі сі Маї со1у Гув Гец Аї1а Авгр
Зо 690 695 700 теп Уаї Меє Ткр Гуз Рго бек Рпе Рпе Сс1іу ТПтї пув Рго сі Меє Уаї 705 710 715 720
З5
І1їе гув сіу сіу Меє Уаі Аїа Тгр Аїа Авр Іїе с1у Авр Рго Ап А1а 725 730 735 бек І1е Рго ТПх Рго бі Рго Уа1і! Гув Мес Агуд Рго Меє Тухк с1у ТЕПк 740 745 75О
Теш с1у пув Аїа сіу сб1у Аїа їец Бех Іїе Аїа РПпе Уаї бБетг Кпувз Аїа 755 760 765
А1їа гей Авр сіп Акд Уаії Азп Уаії Гей Тухк біу Гец Авп Гув Агд Уаї 770 775 780 бі Аїа Маї бБег Авп Уаі Агд пув Гецп ТПт Гув Гей Авр Меє Гув Іец 785 790 795 800
Авп о Авр Аїа Гец Ркго сіц І1е ТПї Уа1і Авр Рго біц бет Тут ТПт Уаї 805 810 815
Туз Аї1а Авр с1у пуз Гей гец Сув Уа1 бек біц Аїа ТПтї ТПхг Уаї1ї Рго 820 825 830 теп Бек Агд Авп Тут РпПе Гецп РПе 835 840 «2105 З «2115 50 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «4005 З
І1їе біп Авп Рго Аїа бБет А1ї1а Авп Агд бек Авр Рго Уаі1і ТПтІ Іец Авп 1 5 10 15 уаї гей Тук с1у Рго Авр сіу Рко ТПІї І1ї1е бБет Рго бБет пув Аїа Авп 20 25 30
Тут Агд Рго с1іу С1ц Авп теп Азп їец бБет Сув Ніз Аїа Аїа 5бет Авзп 35 до 45
Рго Рго 50 «2105 4 «2115 12 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 4 бі Іїе біп Авп Рго Аїа 5егт Аза Авп Агуд бБет Авр 1 5 10 «2105 5 «2115 29 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігонуклеотид «4005 5 ааддсчааач адсддаєсддс аасадеЕста «2105 6 «2115 29 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігонуклеотид «4005 6 аачдаадсаас сддасадессс саєсдсаєсас 29 «2105 7 «2115 19 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 7
Пец бек Сув Аза АТа Нів Авр Рго Іїе Робе Азр Гуз Авп їєц Меє О1У 1 5 10 15
ТЕр 1Уу Сув «2105 8 «2115 19 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 8
Пец бек Сув Аза АТа Нів Авр Рго Іїе Робе Азр Гуз Авп їєцш Меє О1У 1 5 10 15
ТЕр о1Уу Акгд «2105 9 «2115 10 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 9
Сув Авр бБет бБет Авр Авп Авр Авп Ропе Агд

Claims (46)

1 5 10 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Фармацевтична композиція, яка містить фармацевтично прийнятний водний розчин, що придатний для внутрішньовенної ін'єкції, і ефективну кількість кон'югата однодоменне антитіло- уреаза, при цьому однодоменне антитіло має специфічність до пухлинного антигену СЕАСАМб, де кон'югат має коефіцієнт кон'югації, що становить 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів однодоменних антитіл на фрагмент уреази, і вказана композиція містить менше ніж 5 95 мас./мас. некон'югованої уреази.
2. Фармацевтична композиція за п. 1, яка не містить неводних розчинників, які використовуються для ВЕРХ (високоефективної рідинної хроматографії).
3. Фармацевтична композиція за п. 1, де рН становить 6,5-7,0 або 6,8.
4. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-3, де кон'югат має коефіцієнт кон'югації, який становить 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів однодоменних антитіл на фрагмент уреази.
5. Фармацевтична композиція за п. 4, у якій кон'югат має коефіцієнт кон'югації, який становить 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів однодоменних антитіл на фрагмент уреази.
6. Фармацевтична композиція за п. 1, де кон'югат має середній коефіцієнт кон'югації, який становить приблизно 6 або більше фрагментів однодоменних антитіл на фрагмент уреази.
7. Фармацевтична композиція за п. 1, де кон'югат має середній коефіцієнт кон'югації, який становить 8-11 фрагментів однодоменних антитіл на фрагмент уреази.
8. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-7, де уреаза являє собою уреазу бобових.
9. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 1-8, де однодоменне антитіло являє собою гуманізоване або нелюдське антитіло.
10. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-9, де пухлинний антиген СЕАСАМб експресується недрібноклітинною карциномою легені, раком молочної залози, раком підшлункової залози, раком яєчника, раком легені, раком товстої кишки або їх поєднанням.
11. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 1-9, де однодоменне антитіло має спорідненість до вказаного пухлинного антигену СЕАСАМБб, що характеризується значенням Ка, яке перевищує 1х105 М.
12. Фармацевтична композиція за п. 11, де кон'югат має спорідненість до вказаного пухлинного антигену СЕАСАМЄ6б, що характеризується значенням Ка, яке не перевищує 1х109 М.
13. Фармацевтична композиція за п. 12, де кон'югат має спорідненість до вказаного пухлинного антигену СЕАСАМБб, що характеризується значенням Ка, яке не перевищує 1х1079 М.
14. Фармацевтична композиція за п. 1, де кон'югат має спорідненість до вказаного пухлинного антигену СЕАСАМб, що характеризується значенням ІСвхо, яке не перевищує 5 НМ.
15. Фармацевтична композиція за п. 14, де значення ІСво становить 3,22 НМ.
16. Фармацевтична композиція за п. 14 або 15, де кон'югат зв'язується з вказаним пухлинним антигеном СЕАСАМЄВ зі значенням ІС50, що становить 20 мкг/мл.
17. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 1-16, де однодоменне антитіло містить поліпептид, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 1.
18. Фармацевтична композиція за п. 1, де однодоменне антитіло містить поліпептид, який містить щонайменше одну модифікацію амінокислотної послідовності 5Е0 ІЮО МО: 1, де вказана модифікація амінокислотної послідовності зберігає функціональну властивість вказаного поліпептиду.
19. Застосування терапевтично ефективної кількості композиції за будь-яким із пп. 1-18 для виготовлення лікарського засобу, що використовується для лікування раку, який експресує пухлинний антиген СЕАСАМЄБ, у індивідуума.
20. Застосування за п. 19, де рак являє собою одне або більше з недрібноклітинної карциноми легені, раку молочної залози, підшлункової залози, яєчника, легені, товстої кишки або їх поєднань.
21. Застосування за п. 20, де рак являє собою недрібноклітинну карциному легені. 60
22. Застосування за п. 21, де індивідуум є людиною.
23. Спосіб одержання композиції, що містить кон'югат однодоменне антитіло-уреаза, де кон'югат має коефіцієнт кон'югації, що становить 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 фрагментів однодоменних антитіл на фрагмент уреази, при цьому однодоменне антитіло має специфічність до пухлинного антигену СЕАСАМЄБ, і вказана композиція містить не більше ніж 5 9о мас./мас. некон'югованої уреази відносно маси кон'югата однодоменне антитіло-уреаза, який включає: (1) об'єднання активованого однодоменного антитіла, специфічного до пухлинного антигену СЕАСАМЄБ, і уреази в розчиннику, у якому активоване однодоменне антитіло і уреаза по суті не взаємодіють з утворенням реакційної суміші, де активоване однодоменне антитіло і уреаза рівномірно розподілені в розчиннику, і (2) збільшення рН суміші, отриманої на стадії (1), у результаті чого активоване однодоменне антитіло легко взаємодіє з уреазою з утворенням кон'югата однодоменне антитіло-уреаза.
24. Спосіб за п. 23, де спосіб додатково містить очищення кон'югата однодоменне антитіло- уреаза стадією очищення, де спосіб не включає стадію хроматографічного очищення.
25. Спосіб за п. 24, де стадію очищення проводять методом ультрадіафільтрації.
26. Спосіб за будь-яким з пп. 23-25, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза має коефіцієнт кон'югації, який становить 8-11 фрагментів антитіл на фрагмент уреази.
27. Спосіб за п. 26, де розчинник, використовуваний на стадії (1), являє собою кислий водний буфер, що має рн 6,0-7,0, такий як натрій-ацетатний буфер.
28. Спосіб за п. 23, де підвищення рН на стадії (2) включає додавання основного буфера, такого як розчин борату натрію, з доведенням рН до 8-9.
29. Спосіб за будь-яким з пп. 23-28, де композиція до стадії очищення містить 10-20 95 некон'югованого антитіла відносно маси загального білка.
30. Спосіб за п. 29, де композиція після стадії очищення містить менше 1 95 некон'югованого антитіла відносно маси загального білка.
31. Спосіб підвищення спорідненості антитіла до пухлинного антигсена СЕАСАМб, що включає кон'югування декількох молекул однодоменного антитіла з молекулою уреази з утворенням кон'югата однодоменне антитіло-уреаза, що має коефіцієнт кон'югації, що становить 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 молекул однодоменних антитіл на молекулу уреази, причому однодоменне антитіло має специфічність до вказаного пухлинного антигену СЕАСАМб, і де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза має спорідненість до пухлинного антигену СЕАСАМБб, яка щонайменше приблизно в 100 разів перевищує спорідненість некон'югованого антитіла.
32. Спосіб за п. 31, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза має коефіцієнт кон'югації, який становить 3, 4, 5 або 6 молекул однодоменних антитіл на молекулу уреази.
33. Спосіб за п. 31, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза має коефіцієнт кон'югації, який становить 6 або більше молекул однодоменних антитіл на молекулу уреази.
34. Спосіб за п. 31, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза має коефіцієнт кон'югації, який становить 6 молекул однодоменних антитіл на молекулу уреази.
35. Спосіб за п. 31, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза має коефіцієнт кон'югації, який становить 8, 9, 10 або 11 молекул однодоменних антитіл на молекулу уреази.
36. Спосіб за п. 31, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза має середній коефіцієнт кон'югації, який становить 8-11 молекул однодоменних антитіл на молекулу уреази.
37. Спосіб за будь-яким із пп. 31-36, де уреаза являє собою уреазу бобових.
38. Спосіб за будь-яким з пп. 31-37, де однодоменне антитіло являє собою гуманізоване або нелюдське антитіло.
39. Спосіб за будь-яким із пп. 31-38, де пухлинний антиген СЕАСАМб експресується недрібноклітинною карциномою легені, раком молочної залози, раком підшлункової залози, раком яєчника, раком легені, раком товстої кишки або їх поєднанням.
40. Спосіб за будь-яким з пп. 31-39, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза має спорідненість до вказаного пухлинного антигену СЕАСАМб, що характеризується значенням Ка, яке перевищує 1х 105 М.
41. Спосіб за п. 40, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза зв'язується з вказаним пухлинним антигеном СЕАСАМЄВ зі значенням Ка, яке не перевищує 1х103 М.
42. Спосіб за п. 40, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза зв'язується з вказаним пухлинним антигеном СЕАСАМЄВ зі значенням Ка, яке не перевищує 1х1079 М.
43. Спосіб за будь-яким з пп. 31-42, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза зв'язується з вказаним пухлинним антигеном СЕАСАМЄ зі значенням ІСзхо, яке не перевищує 5 НМ.
44. Спосіб за п. 43, де значення ІСво становить 3,22 НМ.
45. Спосіб за п. 43 або 44, де кон'югат однодоменне антитіло-уреаза зв'язується з вказаним пухлинним антигеном СЕАСАМЄ зі значенням ІСво, що становить 20 мкг/мл. бо
46. Набір, який містить композицію за будь-яким з пп. 1-18 і інструкції з застосування композиції.
ЗЮОч й г щей о ех «ее Уе Ве ДМ щ 5. козі Кн ниви нні он по вд ще 15 Ка ; р й бек 100547 мкг/мл 8 ї | Є Щ й с ах "фени нишн ся ШЕ пн їх Ї х і ал кжюжоокд 5. ! Ко в а В ЕЗ) ї я М 4 5 В ї В А0ООБЯ мкг/мл
Фіг.
о Шу Кс ще ст режи З ня : Дане й льох Кошеня 5 З 18 З . М ЗІ ; в в ляції Я ж я ш стоки Й Я ВІН ї с | їх За 3 ї з Пн о плАжАьАК Кі ДАК УК Ют УК ов п хна хх шия ші й ЕЗ КЕ 5 зв Ж ГРУ еені нове ОК вер Я ск Коня щ фен є шк і в що | сх я ше ї | Є ше х їі З Її Й рай Ж І З шк У х ї З ях о, я Й з ШК КЯ я ЗХ Що Яннінкнжни оооедос ово отот тт АННА КК КК В Ко З З ва ва з Пеожкуривча шпвлУКИ мееля
Фіг. 2
. З де Шини ин Що тЙ динею тня ники н МК ся ЩІ М на а и с ЕЕ хх хи
З і. Я
Е . невнаквоніковннненннни КЗ с кинь с КБ | аплннестюсввккюестнн ва З іх й фун М о по св зво, Зі іх й; і а і за пай зви зак зав зв в; о вар ват й и їв в ї ПО ств ПОВОВИЛ кума «ІВ ніфь. рон хх й ОНКО меня М Я ; х кю п Нд о х в "ки, -к Го г хх мк оо Гоа ЮК ши Б й З те а й В ! З і. й пек, Ех З х Б х ке у х. м ще З х с НН І Б я і Ба со Звуження дя З хо Ве «З м ї- КЗ З дво, Ж ; пеню ака шк НУ: БВОБЛ мітуми я С днтнтнівкенннк Й і МЕ скан нка ї дення - сни з В евесвн , й . ДН сненннй І КК о Шан ЧЕ ї КоЯй ре ще - хана Й лан -ї ! Меху же що - | | долнекноомвжннкюі сан ососнки вен ВК й 5 та ЕКЗ 2 Ї ек у пек ІЗ Я звук І-ПОБАЛ мкм
Фіг.З ї Ве о ооо о с шо. ж ши. ее. жк і ОБО ОО СС. СОУ НЕ: ше . ж нс о х КОМ КК КО З ЕК жо щі с с і Бо ї БОМ КО с СХ в. ! о: В» с Е ху З В ОО М В М А ще Е шу ! шу яке 550 5 з Я ї МО ПК о Зк СУК і ШІ ШЕ о. «в З п. 33 3 Й ЕЯ ОО ж далеко кине КЕН КН. АЕВОБаННВВОМма лем фіг.4 В кн кв кн кн ко о о кн а в ково о в ик ко в ва о о Я Я БИеат; пий БУ Ту ОВЕС у. ЩІ ї КАН КОСКА ЕЕ Ше ЕШНЕ: ї МО Ох смів М ВВ В ІН ВИ іі Мей, за ЖИ 3
Оу. МАО хе Долота ЕН М Е і ік; жил КН; км іх ПОСТ о ТЯ ДА ВА ВІ ЕВ ТЛА НИХ 5 ШЕ мли Б А в То ЕН КЕ аг АВ / диня Кр; Щи о, ВА і З : ; ЕЕ п ЕН А Пе ил ПЕ йщХ іа ЗБ НМ ІЗ І і і хе ї їх Ї Ї В Янош НЕ ЗМ Ко. ооооютвжкрооровов ово сорока опо опо сКосоооорт ооо ово Око ооопого поко ророоороопопогопокопосотс Здлишки, виділені червоним, являшть сорпю шередоЗчуУВИНІ ДІЛЯНКИ присднанНняЯ до тресази . :
фіг.» ; залі 2 2 яв, . і сш чу Мч З ок : : Ге б3; ня МР ко щі хх й х синжевю он ря і З і Ка и жк Клим: ЧИННЕ Я В хх й гі х 7 ї Й Ж Кі х ехо вмою ОКХ ї : Ше Кі У АРАЖКОАМН Ох Е жи ї Бі Я Б : : У 5 я : АВ МЧАВевитивоване АВМ У і : х й Я | М воша : ї Уднкнкжнн дже - я шо ж хх щі х ї Е Еш шк М Шк ни В и НТ : її АЕАДЖІ зи Анні Ден пи нн чн х Я ОТ Ох АДМ - ат : : їх з С с щі Ж дружу сів зухі м КЗ та АБ активоване АКА Я Хуве не трав о :
Фіг. 6 пененеек ДрУрОВНВ МЕНЯ і - Н : Н шт В фрежчяях МТВ АКА й мав Н що саду Не Н її Зп фон КОМИ ВК НКУ : Н ! її і Ще Й Халат тт ттттнт ння ТР ЩЕ Ї Іі І ш З 11 Не ЩО 8» с. : ог РЕ НЕ: 1 М Е Ше с» МИ Бі і се й й їх м ї : х ше й з вче : ми і вени нен нище Б иуняя х чини : 1 див АРАКО щі х кі фо роя й : Е ї Ткеаоер МК? іч ОК. НЕ: ; й не х Кз Не Що пеегнгеенніктввіононтом х чн я й : їх х ра і 1 ча, х ; Р Кі ! ше чи я Х є ек их х -Й х : г скік с о СИ ОД Со окуні ре ессюу У рон пістнтя днк нд укр туіє Маю куки чі же Кк й а че са З Е, а за Кх ої КО ЗУ У ти ух У КУН ХК ИЛИНУІ
Фіг.7 рн ттлннннякннн ВООБаМ. ення Як КАДІВХ ї ; : і : су яма що кож док ши и ШЕ ї КО 0 узаювдожезюма их і у у ї іо Кх зо д ТАКА і інн КО ВеФЯВНРШ і ! ний кое К 4 : стол слу В і КИ ще 1 ше 2 ШИ з зв. й мли змі с ї й : Бен й ЕОМ : дове ї ; ЗК й І і Баня і ШЕ к ЕВ г: 3 пани ; Гея Н Ка : і З В зав я с Е А Ка вдова; і. и: в я з хи Кз х К Б (Я й Ї ; 5 1 З 55855 ЖЕ - сих ? Об й дО КН Е З Ея ЕЙ 5 ї 5 3 НЯ хе КАШУ БЕ ЕХ х ий я Ка МИК-ОВХ і НІ ЖЕ Н п - х сх хи океан пев осв ково Осно щі Еш КЕ ше ни и и ше її 5 3 в АК: ; щ Шк ЄЮ В Ж її ї Її Ка ї ву мідних ще ще ;
С. кОм , и чи ех ШК ВЕДЕ я р ШЕ ви РОДИ вв в а ЩЕ сно ДИН сни тя о зе її до 7 есе слов нв овваввааан Х я боса ЗАДАТИ ех ння ї ї о чіпеовзІ одн оно нення й ши 5 їа ї5 да ок і ЗЕ я Уфесухркнуквна МЕНІ Ффіг.6 те хи ї Кома. 1Мале: НЯ ДАЛІ АК ААААЛАЖАЛАААААААКУКАМААААКААААХА АКА АКАААААААТНАТАМ но зни НИ діє спін пнів ннн вн Я Н 1 і Я Н А бю Я ОЇ у їх Е Н ренні, зежгН ії мен Вута : у ! ї Е Е і і ; ; З Е Н дладдлкнилалидлннкА АНТ Каре во іо дове нинртттций. Я Н сен ТТ оту ві її Н КЕ Н Я: КІ і асуєхї і : Н Е Н З, : Кі ІЗ : Я НЕ: І Н г : їі (Ще і х І І МА жЕ сан ен ефе вн кос км Як інн кої Н КОКО - я і - КУ Н їх Е і 7 : зані І КЕ хі і КО Її ва 000001 ' Я х ї зада й кої Н ь МО рда ; декан В Й х Ї З : М її бвюдюююх: окон ИННИ Н , Я ї З змі 0 лкккі Ох сани В х в КЕ 15 Н ЕЕ верфі Хколачнки кю ДВК Жди В її. ОТО ТІ ! ЩЕ В п Кк пе ЕН: ЩЕ: Н АХ М х хх Ь кам ї хх ї ь К М ЕН они ШІ хх: : Б і т : ЗУ сні У : кН : жа То дам і Н ї Її г су мох Е . ок И Е з М Н кола М 5 Н хо? і А й ре : і вісі сх Я нн» КО рн ти ! Баня х й фут " пу феоог вн ЗдоВК ел фоні паля УВв ВВ ВОНО звввв ян, КАХ х ж с вся тк: ; ї ї ска щі чх ПУ и ке дих ка ро Ех -З Е кт М ї уні й : 15 ун кни Якккк іжккк кла как кан ік нки К КкнЖК ння; ек и В я КС А НИ КЕ ДН: 5 : г ех г г У Н О жа о щ НИ 1 і Час ї з ши и и и и и Чех екю р: ВИ З ВИ ВО
Фіг. З Тож я пні о НЖКВЯ доли ААКААМАК УА КАНАЛ АКА МАА КАМ КАКАЖК КАК КУ АМАМА КАХ КАХ АКА МАЛА КАХ АААААХ МАКУХА АКААААААЛАААА АВ А КА АКАААА МАКИ ААХАКАЯ ї ій іу х снення Кер ВЕ Я не сеї ї маже Те ка Же ї і ї-а ІЗ х т ї М М В х ї ЕН т КЕ ссеюемокюккюкінй І КТК УКУ МТВ КУКИ МКК МН КАН ЗІ АКТИ яв ЕКЯ я І3у УАкАААААДАААК А, СУМКИ М УММКАВ ЯК ОМОКТХКМИ Х КИМ ИМИМТ ИТИТОК 1 з Ь З З » м : ї ї х их. В ие АК суч скктеии ткож июня ке гя ї Ї дує. М ККМКККУ У ІМК ВКМ УНІВ Х рРМУНТ МНВК З т З ро ! й й ту ї и : От и Ковка хх ша г ке к М КО ве м Кв куЇКоНвкщя духи, ве мнотна о духа мет ю зак т І ї Ух ХХ З ша ї й : каже м х щЕ ї щ т У Н пек пік й І ї Ек 1: її хОдОВ ККУ, вуФОММВхХ КукУцк мне тич я пром м вет г НЕ х: ТІ г х а ОТ ї т о ч х ; : 2 я З З З
. В: кї Що ї пенкннн КИ ЗК БЕК: я Ой ка : Миакер МО СВ З ї ТІ гії ОБ Ітї ре х їх С ГУ ВТ І ТУ КУ х ГЕ КУ її а ее хх х шує очі Хот Н Ду уми З доля ум Ку у ую : 1 ї Кк її Х ї и ї - її х т ве й ї І ху « Х. М х Ш и хх ке ї ж вк р че соя ва . х Х РК А їх ї З ї яд. чу до ях ку ще і З і «І З 5 тіше ірекуминії фіг.10 жи АЖ ї . ї ; днів, Її нн МЕЖ ! пани ин се З ди ня їх В. Ж їв ох коза оон я х дж М ЖИЖЕ ях оо ан се З и рони ес Де ан З Ша сан Весененй ї Кози нь Ин й Ж ке х под ой ОД и нн ї Пд их -- дич нн ї Кей хо я ї з. Мк ї ГО - ен ІТЖХ х ї Кк Ї - ще - Її кх с ї Н ЯК Ше - Я ЬЗЯВ : ї ВХ Є ке Ше 1. сезой ТУ ож ке деки чЕДНОуНнИ ї Ж МОНУ Я пен і І 3 С; ке пи ї їй і о у - пунк Її кат Її ІЗ ЕЕ Ки День їж щп 1 : я й дню ВК В ї м А фр ЖК ах х С й КІ що г я Хй ней тег і у мя дя Я хх її ЖЖ ше Кіма. ях СК Ток па В ї Жкхжююююььхкий т ї ї сподої ОК нн за нкнмнаа Задні вн снн нннннно гоекнчннту т КЗ х хх я їй БУ 3 х а З с ї ц ог «іх ПКУ В
Фіг.11
ТЗ сгит ки н невдале кукі ІВ ВІТ Песвонесювик з зармуюоєним АНУ Ж КЗ
З С. . Кя У . Ж КО КЕ ьхЯ М хх хх 7 хх ще х їх «Її с г г я х й НУ Х ще ппсийиииинииин. нки я ї ОО - ЩщЩ - Я КУ ях х хх ХУ хк Би ї ПИТИ ТТ тт ї ря ж ж М ХХ і: зе уже ШЕ З Ми ЖОДНИМ или 3 нн в В п В В ЕВ КОСЕЕЕЕ Енн ШЕННЯ хЯШен ; НН В ди ї ОПП о а КИШЛИТ МИХ ПИЙИИИО ПИВО ОТИИИ, мит ож ї ПИПЦНННННН Б ПИННННИННННН КЕНЕ онов - ПО ое вооом Й ро РО до ПЕН Ше ПЕКИ ВК КЕ ши Її мхх : я ЗОН КОНИК и ПИШНЕ ВІК К ПЕК сгох сокий о М ТЕЖ КМ Б ПОШТИ КО ПИИМИМ : п КВ Ще ЩООСлМШННМНЕИ Мі ЕМ Н ШИПІЛИТИМММИ В шо " ВКОках од ПИ Ок х ПКЕЕ дк ня ПИ ІИЛИШТИИИИ ще и ї КЗ Пиши тики тикттім і їх ї ППППИИИИИИ НИК ІКОН і ШИПИ п ДИКИМ поп ПИ кюоуююуит ХМ ї ПШИЛИИЛИЙИШИ ЛИНЕ ї т ПП ВИНИ СУК Плою ию нання ня КН я Кк я юки няню ВПІ уШЖ З ЖИ пли їх т ПЕКИ ИН ФІ кіт ТО ВШИТИ ен ї : Ко Я КОЛИ ПИ В В хю ТК х . тет. ЕК ПІКИ шо МОУ ЕНН я век ШІШИКИЛИПИТИ ТІ х Й ТІ ние копи пиинии їх ї Жокікк «ж Й рев з. МУщІ ЖЖсумім ниві іх сет есктиї ву Холі онютьнІ ТЕУНКлеванья аижнима ее ДАНА ЧІМ шах Жтукккі ЕІ куки
Фіг.12 С в ЩО РУ що - Хол ШУ ІМ У В ї Нд оюаня, МВВ РУ В УА ск ДЕ п : ї- думіх мук ЕЕ : й ЩЕ Ока соня Ії ї ТЕ За Ку : ЩЕ зе НН синкеежеєююя В Н - НКУ її пд ко м холу зх : істини те ВД 1 Ода ую тЬ. ЗАКО ї АХКОЕвн СО О МВ Щ КО луку у У ЖУК Ух ї ДЕК ТКУ ую Щ ЧЕ : Н ЩО, 11: Ї к «А 1: : се Мо ЗУ 1: «о ї Я х Це ШІ ПО алюююр о ів, ПВА оо МВ Щ ше ке ко х с; 7 Щ її ї ХЕ ХО ШЕ її: ї ОК їх Б її. ї хЖО х З ЕЕ Ок Ной Щ І 1 ї ЕК кди ке кт хе Й в и Щ І Ох на нн з и У КЕ х М ЩЕ ТЕ ЩЕ ОХ умо кю г її - В РЕЖ її» І їх КУ Ж Ії БО ОО. КЕ Ії 1: І РОКОМ ку те х Ії Ії її БІО що 0 ВЕЗІННЯ. Ії в ТА мМ Зее її ії ТЕ їй ї СУ щ Я їх :ї ке 115 ї З В Я о й БО ОТ ї КУ хх мо Кї У БУ ТІВ 1 КЗ з КІ Ії ТЕ ЗІ її Кк - КА що НН І ЩЕ Х1т ще пе Ві ЕЕ т ЩО ЯлткоюОЕ ХХ ро т їх 1 ЩЕ 11 ОЇ її Мох щі с її її «х ВЕНЕ МЕ ШЕ ЩЕ КЕ Кк г 1 ХО г: : хх ще п ; с їх ОПЕ хх пі ї її хх Соя її її БУ НІ її її пом ЕЕ її їх Ел: хх її їх Е Х х т 1 Щ т ЗВ УНК ЧИЯ її: У Ь І ї її хм її Ж їз От ї Я ГУ М Її З г їх її х:5 хх Ї ря Ох ОЩЕ 7. хх хо Ух х я їх ПЕ Кч ї УДЕНЬ У ТОК М Хо жку Ще тич ел ШДмЕюи Тк жують мМ У ню хх он Мен Щ ММ в У ке хЕ Ке ах со 5 ВХ З Ся МО 11 г х зх Є кексу: ОМасіханлн
Фіг. 13 зви З сей щщЮ 3 рей ; Ка У кт - в ка « ВК ря У Е я ок, я й х с «о є Я Я ок со вн нс нн З: Б ; пе їде За ще їй 10 ОБ яю ОО мимп ! ою Б 3 МЕМВ ї ООН ва ; г
Фіг.14
Жх : 5. ше мин в ЩІ с М: я хо: НН с пк ЛАН Одккоовв З й он сто МКС интсня оосхкчкксчкю, о це Я 5 с ш хі ос І ; ШЕ: ою теме Шо НН ж ї хх З ще м А Ух Ж : хе ХХ аа КК КК Акт стюсюнко В Е З й а м Я НИ кт НИ ОБ же КООВАЛ меми Фіг 15
UAA201708582A 2015-01-23 2016-01-22 Кон'югат антитіло-уреаза для терапевтичних цілей UA121881C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562107210P 2015-01-23 2015-01-23
PCT/IB2016/050342 WO2016116907A1 (en) 2015-01-23 2016-01-22 Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA121881C2 true UA121881C2 (uk) 2020-08-10

Family

ID=56416507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201708582A UA121881C2 (uk) 2015-01-23 2016-01-22 Кон'югат антитіло-уреаза для терапевтичних цілей

Country Status (18)

Country Link
US (2) US11931422B2 (uk)
EP (1) EP3261678B8 (uk)
JP (2) JP6876618B2 (uk)
KR (1) KR102318994B1 (uk)
CN (2) CN107206103A (uk)
AU (1) AU2016210551B2 (uk)
BR (1) BR112017015582A2 (uk)
CA (1) CA2973538C (uk)
ES (1) ES2852001T3 (uk)
IL (1) IL253549B (uk)
MX (1) MX382911B (uk)
NZ (1) NZ733669A (uk)
PL (1) PL238187B1 (uk)
RU (1) RU2689689C2 (uk)
SG (1) SG11201705982PA (uk)
UA (1) UA121881C2 (uk)
WO (1) WO2016116907A1 (uk)
ZA (1) ZA201704709B (uk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201705982PA (en) 2015-01-23 2017-08-30 Helix Biopharma Corp Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes
CA3045327A1 (en) 2016-09-24 2018-03-29 Helix Biopharma Corp. Restoring function of tumour acidified t cells
CN110382540A (zh) * 2017-01-05 2019-10-25 赫利克斯生物药品公司 Vegfr-2抗体
WO2018126315A1 (en) * 2017-01-05 2018-07-12 Helix Biopharma Corporation Anti-vegfr-2 urease conjugates
JP6899560B2 (ja) * 2017-05-23 2021-07-07 株式会社島津製作所 質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラム
KR20210029158A (ko) 2018-06-03 2021-03-15 람카프 바이오 베타 엘티디. Ceacam5 및 cd47에 대한 이중특이성 항체
KR102260478B1 (ko) 2019-08-19 2021-06-02 연세대학교 산학협력단 일나트륨 요소화물 결정 용해용 조성물
WO2021053587A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Klaus Strein Bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
EP0007895B1 (fr) 1978-07-19 1983-06-22 Patrick Couvreur Nanoparticules biodégradables, compositions pharmaceutiques les contenant et procédé pour leur préparation
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2523445A1 (fr) * 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
NZ237688A (en) 1990-04-19 1993-01-27 Res Dev Foundation Antibody-cytotoxic immunoconjugate-containing compositions and cancer treatment
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
MX9401351A (es) 1993-02-22 1994-08-31 Alza Corp Composiciones para suministro oral para agentes activos.
JPH08509873A (ja) 1993-05-19 1996-10-22 アンスティテュ・パストゥール ヘリコバクター感染に対する免疫組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列
CA2130072C (en) 1994-08-12 2003-02-18 John W. Cherwonogrodzky Method of detecting a pathogen using a virus
AU7468196A (en) 1995-10-27 1997-05-15 Merck & Co., Inc. Conjugates of gonadotropin releasing hormone
EP0824019B1 (en) * 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
JP2001503396A (ja) 1996-10-11 2001-03-13 アルザ コーポレイション 治療用リポソーム組成物および方法
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
AU4305101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Research Foundation Of The State University Of New York, The Magnetic nanoparticles for selective therapy
EP1530482B9 (en) * 2002-07-18 2014-04-16 Helix Biopharma Corp. Use of urease for inhibiting cancer cell growth
EP1694845B8 (en) * 2003-11-28 2017-12-20 National Research Council of Canada Anticarcinoma antibodies and uses thereof
EP1793868B1 (en) * 2004-09-23 2010-12-29 Guerbet Liposomal contrast agents for cest imaging
CA2868867A1 (en) 2005-03-25 2006-09-28 National Research Council Of Canada Method of isolation of soluble polypeptides
CA2708074A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 National Research Council Of Canada Non-aggregating human vh domains
KR20120004994A (ko) * 2009-03-18 2012-01-13 에이씨 이뮨 에스.에이. 치료적 이용 방법
JP2014501721A (ja) * 2010-11-16 2014-01-23 オクタファルマ・アーゲー ＦＸＩおよびＦＸＩａを、これら凝固因子を含む溶液から減少させるおよび／または除去するための方法
CN103619875B (zh) 2011-01-28 2017-03-08 加拿大国家研究委员会 免疫球蛋白结构域的工程改造
US9296819B2 (en) 2012-06-12 2016-03-29 Promis Neurosciences Inc. Antibodies and conjugates that target misfolded prion protein
AU2014252666B2 (en) 2013-04-08 2017-02-02 Helix Biopharma Corp. Use of antibody-urease conjugates for diagnostic and therapeutic purposes
SG11201705982PA (en) 2015-01-23 2017-08-30 Helix Biopharma Corp Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes

Also Published As

Publication number Publication date
EP3261678A4 (en) 2018-12-05
JP2020143084A (ja) 2020-09-10
RU2689689C2 (ru) 2019-05-28
SG11201705982PA (en) 2017-08-30
PL238187B1 (pl) 2021-07-19
US11931422B2 (en) 2024-03-19
EP3261678B8 (en) 2021-03-17
MX382911B (es) 2025-03-13
RU2017129729A (ru) 2019-02-25
CN107206103A (zh) 2017-09-26
CN118873680A (zh) 2024-11-01
AU2016210551B2 (en) 2019-03-07
CA2973538C (en) 2021-01-12
ES2852001T3 (es) 2021-09-10
EP3261678B1 (en) 2020-11-11
US20240277863A1 (en) 2024-08-22
BR112017015582A2 (pt) 2018-03-13
EP3261678A1 (en) 2018-01-03
NZ733669A (en) 2019-03-29
RU2017129729A3 (uk) 2019-02-25
WO2016116907A1 (en) 2016-07-28
ZA201704709B (en) 2019-11-27
CA2973538A1 (en) 2016-07-28
IL253549B (en) 2021-07-29
US20180000963A1 (en) 2018-01-04
JP6876618B2 (ja) 2021-06-02
AU2016210551A1 (en) 2017-07-27
PL423259A1 (pl) 2018-03-26
JP2018506581A (ja) 2018-03-08
MX2017009537A (es) 2018-04-10
KR102318994B1 (ko) 2021-10-29
KR20170131365A (ko) 2017-11-29
IL253549A (en) 2019-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA121881C2 (uk) Кон'югат антитіло-уреаза для терапевтичних цілей
CA3236754A1 (en) Specific conjugation for an antibody-drug conjugate
JP2021063124A (ja) 生物学的物質及びその使用
JP2022518924A (ja) 二重リガンド薬物コンジュゲート及びその使用
KR20210038904A (ko) 항체-약물 콘쥬게이트의 효과적인 제조 방법
ES2656168T3 (es) Anticuerpo anti cadherina marcado con un metal radioactivo
US9757473B2 (en) Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same
US8541378B2 (en) Recombinant albumins fused with poly-cysteine peptide and the methods for preparing the same
US11826399B2 (en) Chlorotoxin agents and uses thereof
JP2024523524A (ja) リガンド薬物コンジュゲート及びその応用
JP7226803B2 (ja) 腫瘍の診断及び治療におけるｆｓｈホルモン受容体のリガンド
WO2024005123A1 (ja) 癌の治療及び／又は予防用医薬組成物
EP3601341A1 (en) Antibodies against the human fshr extracellular domain
KR20210099660A (ko) 절단가능 링커를 포함하는 화합물 및 이의 용도
EP4201431A1 (en) Intermediate for preparing antibody-drug conjugate (adc), preparation method therefor, and use thereof
KR20240051956A (ko) 암의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물
US9782494B2 (en) Methods of using multilayer magnetic micelle compositions
US20250228951A1 (en) Novel-peptide-based anticancer immunotherapeutic agent
KR20240099391A (ko) 폴리에틸렌이민 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 표적화된 선형의 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 다중복합체
HK1238557A1 (en) Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes
BR112018010535B1 (pt) Compostos peptídicos e conjugados peptídicos para o tratamento de câncer por quimioterapia com mediação por um receptor