[go: up one dir, main page]

UA121028C2 - Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (igf1r) - Google Patents

Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (igf1r) Download PDF

Info

Publication number
UA121028C2
UA121028C2 UAA201610010A UAA201610010A UA121028C2 UA 121028 C2 UA121028 C2 UA 121028C2 UA A201610010 A UAA201610010 A UA A201610010A UA A201610010 A UAA201610010 A UA A201610010A UA 121028 C2 UA121028 C2 UA 121028C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
fragment
antigen
binding fragment
isolated
Prior art date
Application number
UAA201610010A
Other languages
English (en)
Inventor
Даніка Станіміровіч
Даника Станимирович
Крістін Кеммеріч
Кристин Кеммерич
Арсалан С. Хаккані
Арсалан С. Хаккани
Трайан Сулі
Трайан Сули
Меді Арбабі-Гаруді
Меди Арбаби-Гаруди
Бернар Массі
Бернар Масси
Рено Жільбер
Рено Жильбер
Original Assignee
Нешнл Рісеч Каунсіл Оф Канада
Нешнл Рисеч Каунсил Оф Канада
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нешнл Рісеч Каунсіл Оф Канада, Нешнл Рисеч Каунсил Оф Канада filed Critical Нешнл Рісеч Каунсіл Оф Канада
Publication of UA121028C2 publication Critical patent/UA121028C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

Винахід стосується виділеного або очищеного антигензв'язуючого фрагмента антитіла, де антигензв'язуючий фрагмент антитіла є специфічним для рецептора інсуліноподібного фактора росту 1 (IGF1R). Також винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, вектора, композиції, in vitro способу детектування IGF1R у суб'єкта, in vivo способу детектування експресії IGF1R та способу перенесення молекули вантажу через гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ), що включає введення суб’єктові вказаного антигензв'язуючого фрагмента антитіла, зв'язаного з молекулою вантажу, а також способу кількісного визначеним кількості молекул вантажу, що доставляється через ГЕБ суб'єкта.

Description

вантажу, а також способу кількісного визначеним кількості молекул вантажу, що доставляється через ГЕБ суб'єкта. ще Права лапа «а РЕ
Я АСВ. пакет ананін об мкг, пед)
Я ше КоМЕо-Галанім СХ маке, пе «й ЕТ щНаРстананін (500 мок, пед
ТУ 203 ОО юн і. ! ! що
ЖЕ ди ш Я "
З / щ Я й зв. й я гі і - ха і : ія зі х що 70. Дюна -В- ж
ОВ вини щ : : п я і й ель 1 5 но у» квт, й - й
ОО жав вевовеей ши па мн ин пвх З о що що 15 500
Часіхві
Галузь техніки
Винахід відноситься до антитіл, що специфічні до рецептора інсуліноподібного фактору росту 1, їх фрагментами, а також їх застосуванням. Більш конкретно, даний винахід відноситься до антитіл, специфічних до рецептора інсуліноподібного фактору росту 1 і їх фрагментів, які проходять гематоенцефалічний бар'єр, і їх застосуванням.
Рівень техніки
Нейродегенеративні захворювання, такі як хвороба Альцгеймера і хвороба Паркінсона, є зростаючим тягарем на нашому старіючому суспільстві, тому що в даний час немає ефективних способів лікування цих інвалідизуючих станів. Лікування, а також рання діагностика цих та інших захворювань, які виникають в головному мозку, залишаються складним завданням, оскільки більшість відповідних терапевтичних молекул і діагностик не можуть проникнути через щільний і сильно обмежуючий гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) (Аббоїй, 2013). ГЕБ є фізичним бар'єром, який утворений ендотеліальними клітинами головного мозку (ЕКМ), що вистилають кровоносні судини і які з'єднуються один з одним за допомогою щільних контактів (АБррой, 2013). Щільні контакти, утворені між ЕКМ, мають важливе значення для цілісності ГЕБ і запобігання парацеллюлярного переносу молекул розміром більше 500 дальтон (Да). Оскільки ендотеліальні клітини мозку демонструють дуже низький рівень піноцитозу (АБрой, 2013), трансцеллюлярне перенесення великих молекул обмежується високо специфічним рецепторно- опосередкованим трансцитозом (РОТ), і трансцитозом, опосередкованим пасивною адсорбцією на основі заряду (Аррой, 2013; Рагагідде, 2002). Крім того, висока щільність еффлюксних насосів, таких як Р-глікопротеїн або білок множинної медикаментозної резистентності-ї (МОВ- 1), сприяє видаленню небажаних речовин з головного мозку (Арроїй, 2013).
У той час як всі ці характеристики захищають мозок від патогенів і токсинів, вони в рівній мірі запобігають проникненню більшості терапевтичних засобів. Насправді, менше 595 малих терапевтичних молекул і практично ніякі з великих терапевтичних засобів можуть перетинати
ГЕБ в фармакологічно значущих концентраціях (тобто достатніх, щоб вразити мішень в центральній нервовій системі (ЦНС) і викликати фармакологічну/терапевтичну відповідь), якщо вони не є специфічно "переносними", тобто з'єднаними з молекулою переносника. Через відсутність ефективних "переносників" для транспортування молекул через ГЕБ численні
Зо препарати проти нейродегенеративних захворювань були "заморожені" або виключені з подальших розробок, оскільки вони не можуть бути доставлені в мозок в достатній кількості.
Різні підходи до введення великих молекул в мозок були досліджені. Наприклад, цілісність
ГЕБ може бути порушена, що призводить до негерметичности ГЕБ, що в свою чергу допускає необмежене парацеллюлярне введення великих молекул в мозок. Щільні контакти можуть бути успішно послаблені або зруйновані різними підходами. Наприклад, ін'єкція речовин, які викликають осмотичний шок (наприклад маніт, гіпертонічні розчини), в кровотік викликає стиснення і призводить до руйнування щільних контактів, тим самим істотно порушуючи ГЕБ (Сийаште, 2010). Інші модулятори щільних контактів включають алкілгліцерини, брадикинін і кілька його аналогів, а також віруси, які модулюють експресію білків, що беруть участь в підтримці щільних контактів (ЕгаІепргисі еї аї., 2003; Ргевюп еї аї!., 2008; Сап еї а!., 2013). Більш локальне порушення ГЕБ можливо шляхом застосування ультразвуку (Мпап еї аї., 2013). Проте, часових проміжків, під час яких порушується ГЕБ, досить для зміни гомеостазу мозку, що дозволяє шкідливим хімічним речовинам, токсинам і патогенним мікроорганізмам потрапляти в мозок; це може привести до серйозних побічних ефектів, наприклад судом і набряку мозку, інфекції і, можливо, постійних нейропатологічних змін. Як було б очевидно фахівцям в даній галузі техніки, повторні процедури з використанням цих способів при хронічних і дифузних захворюваннях мозку, що впливають на кілька областей мозку, є непрактичними. Більшість з цих способів лікування є дорогими, вимагають госпіталізації, а також деякі підходи вимагають анестезії.
Іншим підходом для обходу ГЕБ є пряме упорскування терапевтичних молекул в спинномозкову рідину (СМР), паренхімальний простір або інші частини мозку. Кілька способів доставки були розроблені, в тому числі: інтрацеребрально (інтрапаренхімальна), інтравентрикулярна і інтратекальна доставка через інфузійний насос або дифузійний насос з посиленою конвекцією (СЕЮБ). Проте, будь-який тип прямої ін'єкції в мозок або нітрацеребрального імплантату є інвазивної і дорогою процедурою, так як вона вимагає госпіталізації, анестезії та часто хірургічного втручання. Крім того, низька швидкість дифузії терапевтичних засобів, особливо великих біологічних препаратів, всередині паренхіми мозку обмежує проникнення терапевтичних засобів тільки невеликими ділянками, що оточують сайт ін'єкції/мплантації. Правильне розміщення ін'єкцій, катетерів і імплантатів є складною задачею, бо при цьому має вирішальне значення для досягнення дифузії лікарського засобу в область-
мішень мозку. Крім того, катетери та імплантати надають сайт для розвитку інфекції і/або імунної відповіді проти чужорідного матеріалу.
В іншій спробі збільшити доставку через ГЕБ ліків для ЦНС були модифіковані з метою збільшення їх захоплення мозком. Такі модифікації можуть включати в себе зміну їх поверхневого заряду, зменшення розміру молекули, а також зміну ліпофільності лікарських засобів. Проте, будь-які зміни для збільшення проникнення в мозок також можуть змінити загальну фармакологію лікарського засобу, в тому числі його бажану активність і/або специфічність. Крім того, ліпофільні молекули більш схильні до виведення з мозку через Р- глікопротеїновий еффлюксний насос.
Нарешті, були розроблені ендогенні механізми транспорту через ГЕБ. Фізіологічні механізми, що дозволяють перенесення великих молекул через ГЕБ, можуть бути розділені на високо специфічний рецепторно-опосередкований трансцитоз (КМТ) і неспецифічний трансцитоз, опосередкований адсорбцією вна основі заряду. Ендоцитоз ініціюється при зв'язуванні специфічного ліганду з його рецептором або при електростатичній взаємодії між катіонних лігандом або лікарським засобом і аніонними функціональними групами на поверхні ендотеліальних клітин мозку (на люмінальному боці), відповідно. Згодом, знову сформовані ендосоми піддаються трансцитозу через клітину до аблюмінального боку для вивільнення вантажу.
Оскільки трансцитоз, опосередкований адсорбції є неспецифічним /зарядо- опосередкованою взаємодією, він відбувається у всіх судинних руслах і органах, що обмежує доступність лікарського засобу для доставки в мозок. Тому використання КМТ шляху залишається єдиним фізіологічним, неінвазивним, при цьому високо рецепторно-специфічним способом доставки в мозок.
В даний час відомі лише деякі рецептори, які піддаються КМТ в ГЕБ і "переносять" через нього свої природні ліганди: добре вивчений рецептор трансферину (ТЕЕК), інсуліновий рецептор (ІК), білки 1 і 2, зв'язані з рецепторами ліпопротеїнів низької щільності (І КР-1 і -2), рецептор дифтерійного токсину і ТМЕМЗОА. Були розроблені пептиди, природні ліганди і антитіла або фрагменти антитіл, які зв'язуються з цими рецепторами (Рагагідде еї аї., 1991; Ми еї аї.,, 2011 року; Мигидапапаат еї аї., 2001; Абиїгоб еї а!., 2005; Оетеше, 2008; 5итрьгіа еї аї.,
Зо 2013), які функціонують в якості переносників лікарських засобів в мозок, використовуючи ендогенні КМТ шляху. Проте, на сьогоднішній день тільки один пептид (Апдіорер АМО1005, таргетуючий І КР-1) був проаналізований на фазі І клінічних досліджень, в той час як інші кандидати вивчаються в лабораторних умовах. КМТ шлях представляється найбільш перспективним шляхом для транспорту лікарського засобу в мозок, але в даний час підходи мають обмеження, включаючи: неселективну експресію рецептора-мішені на ГЕБ, конкуренції між переносником і природними лігандами за рецептор, неефективний трансцитозу рецептора, а також лізосомальну деградацію ендоцитозированих переносників (Хіао апа сип, 2013).
Відсутність високої продуктивності і високої селективності переносників через ГЕБ затримує розробку нових терапевтичних і діагностичних засобів для захворювань, що відбуваються в мозку, в тому числі пухлин мозку і нейродегенеративних захворювань. Існує явна необхідність в неінвазивному способі доставки дрібних і великих терапевтичних і діагностичних молекул в фармакологічно ефективних дозах в мозок без порушення фізіології і гомеостазу ГЕБ.
Короткий опис винаходу
Даний винахід відноситься до антитіл, що специфічні до рецептору інсуліноподібного фактору росту 1 (ІСРІК), і їх застосуванням. Більш конкретно, даний винахід відноситься до антитіл, специфічних до рецептору інсуліноподібного фактору росту 1, і їх фрагментів, які проходять гематоенцефалічний бар'єр, і їх застосуванням.
Даний винахід відноситься до виділених або очищених антитіл або їх фрагментів, що специфічно зв'язуються з епітопом рецептору інсуліноподібного фактору росту 1 (СЕК), де антитіло або його фрагмент, проходить гематоенцефалічний бар'єр, і де епітоп специфічно зв'язується з антитілом з послідовністю ЗЕО ІО МО: 5. Епітоп ІСЕ1К може перебувати у позаклітинному домені ІЕЕ.
Даний винахід відноситься до виділених або очищеним антитілам або їх фрагментів, що містить - послідовність галузі, яка визначає компліментарність (СОК) 1 СОТ У5РТА (ЗЕО ІО МО: 1); - послідовність СОК2 ІТИ (5ЕО ІЮ МО. 2); і - послідовність СОКЗ ААБЗТРЇ ВІРЕЕЗАМТМ (5ЕО ІО МО: 3), де зазначене антитіло або його фрагмент специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібний фактор росту 1 (ІСЕ1К).
Наприклад, не в рамках будь-якого обмеження, виділеним або очищеним антитілом або його фрагментом, специфічним до ІСЕТК, може бути
ХІМХ»І ХзЕЗОаИаСІ МОХАСИО5І ВІ 5СХ5Х65а СТ МЗРТАМОМХВОАРОКХ»вВХ»ЕХ ох ІТ ЗА аттв 500 ХігАЗЗМКХІзАЕТІЗАОХаХ15КМТХ вм ОММ5І Х17ХівЕОТАМУМСААБЗТРІ ВІГРЕЕЗБАУТУМУСОСТХ "МТ М55 (ЗЕО ІЮ МО:4), де Хі є Е або О; Хг є К або 0; Хз є М або Е; Ха є А або Р; Х5 є А або Е; Хе є М або А; Х7 є М або Е; Хв є С або Е; Хе є Ї або Е; Хо є Е або М/; Хі: є С або 5; Хі» є М або У; Хіз
Є 0 або 0; Х:4 є М або 5; Хі5 є А або 5; Хієє І або М; Хі7 є К або Е; Хівє А або 5;іХіо є Ї або, або послідовність, що по суті ідентична їй. У більш конкретних не обмежуючих прикладах виділені або очищені антитіла можуть містити послідовність, обрану з групи, що складається з:
ОУКІГЕЕЗОССИЇ МОАЛССИБІ ВІ БСЕУБасТУ5РТАМОУМЕВОАРОКЕКЕРУСНІТУЗНИатТАМА5З5
МКОВЕТІЗАОЗАКМТУМІ ОММ5І КЗЕОТАМУУСААЗБТРІ ВІ/'РЕЕЗАУТУУСОСТОМТУ55 (5ЕО І
МО:5), зазначається тут як ІЗЕ1ТК-4;
ОМОЇ МЕЗССОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМУВОАРОКаї ЕУУуМанІТУЗВатТвмА5
ЗУКОаВЕТІЗАОМЗКМТУМІ ОММЗІ ВАЕОТАМУУСААЗТРЕІ ВІГРЕЕБАУ ТУ СОСТІ МТУ55 (ЗЕО Ір
МО:6), зазначається тут як ІСЕ1К-4 Не;
ОМОЇ МЕЗО МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМ ЕВОАРОКИаї ЕР УХО2НІТУ БНИаТтТтАМАБ5
УКОаВЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММ5ЗІ ВАЕОТАМУУСААБЗТРНІ ВІ РЕЕБАУТУМУСОСТІ МТУ (5ЕО І
МО;:7), зазначається тут як ІЗЕ1К-4 НЗ;
ОМОЇ МЕЗОСОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМ ЕВОАРОКаЇ ЕР ССНІТУЗНИаИТТАМАБЗ
УКОаВЕТІЗАОЗЗКМТУМІ ОММ5І ВАЕОТАМУУСААЗТНІ ВІ РЕЕБАУТУМУСОСТІ МТМ (5ЕО І
МО:8), зазначається тут як ІСЕ1К-4 На;
ОМОЇ МЕЗО СОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМ ЕВОАРОЕКЕВЕРЕУСНІТУЗВИаИтТвУА5
ЗУКОаВЕТІЗАОЗОЗКМТУМІ ОММ5І ВАЕОТАМУУСААЗТНІ ВІ РЕЕБАУТУМСОСТІ МТУ (ЗЕО Ір
МО:9), зазначається тут як ІСЕТК-4 Н5;і або послідовність, по суті ідентичну їм.
Виділене або очищене антитіло або його фрагмент, як описано вище, може бути однодоменим антитілом (заАбБ); заАр можуть мати верблюже походження.
Виділене або очищене антитіло або його фрагмент в рамках даного винаходу можуть бути
Зо представлені в форматі мультівалентного відображення. У форматі мультівалентного відображення антитіло або його фрагмент можуть бути зв'язані з фрагментом Ес; фрагмент Ес є мишачим Ес2Бб або людським Ес1. Наприклад, не в рамках будь-якого обмеження, виділену чи очищене антитіло або його фрагмент в мультівалентном відображенні можуть містити послідовність 5ЕО ІЮО МО: 10 (зазначену тут як злиття ІЗЕ1Е-4 консенсус-Ес), БЕО І МО: 39 (зазначену тут як злиття Ес-ІСЕ1 8-4 консенсус) або 11 (зазначену тут як злиття ІСЕ1К-4-Ес).
Виділене або очищене антитіло або його фрагмент, як описано в даному документі, можуть проходити через гематоенцефалічний бар'єр.
Даний винахід також відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що кодує виділене чи очищене антитіло або його фрагмент, як описано в цьому документі. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, як описано вище, також запропонований.
Виділене або очищене антитіло або його фрагмент, як описано в цьому документі, можуть бути іммобілізовані на поверхню.
Даний винахід додатково відноситься до виділеного або очищеного антитіла або його фрагменту, як описано в даному документі, зв'язаному з молекулою вантажу; молекула вантажу може мати молекулярну масу в діапазоні від приблизно 1 кДа до приблизно 200 кДа.
Молекулою вантажу, що зв'язана з антитілом або його фрагментом, може бути, агент, що детектується, терапевтичний, лікарський засіб, пептид, фактор росту, цитокіни, пастка рецептора, хімічна сполука, вуглеводний фрагмент, фермент, антитіло або його фрагменти, молекули на основі ДНК, вірусний вектор або цитотоксичний агент; одна або кілька ліпосом або наноносіїв, завантажених детектуючим агентом, терапевтичним, лікарським засобом, пептидом, ферментом, антитілом або його фрагментом, молекулою на основі ДНК, вірусним вектором або цитотоксическим агентом; або одна або кілька наночастинок, нанопроводів, нанотрубок або квантових точок.
Крім того, даний винахід відноситься до композиції, що містить одне або більше ніж одне виділене або очищене антитіло або його фрагмент, як описано в даному документі, і фармацевтично прийнятний носій, розчинник або наповнювач.
Також запропонований спосіб детектування ІСЕ1Е іп міго, причому спосіб включає а) контактування зразка тканини з одним або більше ніж одним виділеним або очищеним антитілом або його фрагментом, як описано в даному документі, зв'язаним з детектуючим 60 агентом; і
Б) детектування детектируючого агента, зв'язаного з антитілом або його фрагментом, зв'язаних з ІСЕ1К, в зразку тканини.
У способі, описаному вище, зразком може бути зразком сироватки, зразком судинної тканини, зразком пухлинної тканини або зразком тканини мозку з людського або тваринного суб'єкта. У способі, описаному вище, стадія детектування (стадія Б)) може бути здійснена за допомогою оптичної візуалізації, імуногістохімії, молекулярної діагностичної візуалізації, ЕГІЗА (імуно-ферментного аналізу), візуалізуючої мас-спектрометрії або іншого відповідного способу.
Нижче наведено спосіб детектування експресії ІЕЕ іп мімо у суб'єкта, причому зазначений спосіб включає: а) введення одного або більше ніж одного виділеного або очищеного антитіла або його фрагменту, як описано в даному документі, зв'язаного з детектуючим агентом, суб'єкту; і
Б) детектування детектируючого агента, зв'язаного з антитілом або його фрагментом, зв'язаним з ІСЕТК.
У способі, описаному вище, стадія детектування (стадія Б)) може бути здійснена з використанням РЕТ (позитронно-емісійної томографії), 5РЕСТ (однофотонної емісійної комп'ютерної томографії), флуоресцентної візуалізації або будь-якого іншого відповідного способу.
Запропонований спосіб перенесення представляє інтерес молекули через гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ), причому спосіб включає: а) введення одного або більше ніж одного виділеного або очищеного антитіла або його фрагменту, як описано в даному документі, зв'язаного з молекулою, що представляє інтерес, суб'єкту, де антитіло або його фрагмент проходить через гематоенцефалічний бар'єр, де одне або більше ніж одне антитіло або його фрагмент переносить молекулу, що представляє інтерес через ГЕБ. У способі, як описано вище, молекула, що представляє інтерес може мати молекулярну масу в діапазоні від приблизно 1 кДа до приблизно 200 кДа; молекулою, що представляє інтерес може бути агент, що детектується, терапевтичний, лікарський засіб, пептид, фактор росту, цитокіни, пастка рецептора, хімічна сполука, вуглеводний фрагмент, фермент, антитіло або його фрагмент, молекула на основі ДНК, вірусний вектор або цитотоксичний агент; одна або кілька ліпосом або наноносіїв, завантажених детектуючим агентом, терапевтичним, лікарським засобом, пептидом, ферментом, антитілом або його фрагментом, молекулою на основі ДНК, вірусним вектором або цитотоксическим агентом; або одна або кілька наночастинок, нанопроводів, нанотрубок або квантових точок. В описаному способі введення може бути внутрішньовенним (ім), підшкірним (5с) або внутрішньом'язовим (іт).
Винахід також охоплює спосіб визначення кількості молекули вантажу, що доставляється через ГЕБ суб'єкта, де молекула вантажу зв'язана з одним або більше ніж одним виділеним або очищеним антитілом або його фрагментом, як описано в даному документі, причому спосіб включає а) збір спинномозкової рідини (СМР) від суб'єкта; і р) використання цільових методів протеоміки для визначення кількості молекули вантажу, зв'язаної з одним або більше ніж одним виділеним або очищеним антитілом або фрагментом, в спинномозковій рідині.
Молекула вантажу може бути будь-якої бажаної молекулою, включаючи молекули вантажу вищезазначеного; антитіло або його фрагмент проходять через ГЕБ; молекула може бути "зв'язана" з антитілом або його фрагментом, як описано раніше. В описаному вище способі СМР беруть у суб'єкта з використанням будь-якого відповідного способу, відомого в даній галузі.
Кількість СМР, необхідне для цільового методу протеоміки на стадії Б), може перебувати в діапазоні від приблизно 1 до 10 мкл. Цільові методи протеоміки, використовувані для визначення кількості одного або більше ніж одного антитіла або його фрагменту, зв'язаного з молекулою вантажу, можуть бути будь-якими відповідними методами, відомим в даній галузі техніки. Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, цільовий метод протеоміки може бути методом масс-спектрометрії, таким як моніторинг множинних реакцій - ізотіпіческі мічені внутрішні стандарти (МЕМ - ІП ІБ).
Погана доставка діагностичних або лікарських засобів через щільний і високо селективний
ГЕБ компрометує розвиток способів лікування захворювань мозку, таких як, але не обмежуючись зазначеним, пухлин мозку і нейродегенеративних захворювань. Відсутність переносників для транспортування молекул через ГЕБ затримує розробку нових терапевтичних і діагностичних засобів для таких захворювань. Як описано в даному документі, був спродукований ІСЕ1ТК-зв'язуючий УНН (варіабельний домен важкого ланцюга верблюжих), який бо забезпечує ефективну транспортну платформу для доставки лікарських засобів, кон'югованих з антитілом, через ГЕБ до їх мішеней в мозку. Описане в даному документі антитіло використовує природний ЕМТ шлях ІСЕТК від люмінальної до аблюмінальної боку ендотеліальних клітин мозку, що утворюють ГЕБ. Після зв'язування антитіла з ІСЕ1К ініціюється КМТ і антитіло разом з кон'югованими молекулами (вантажем) піддається трансцитозу через клітку до аблюмінальної боку, де вони обидва випускаються в мікросередовище мозку. Підтверджено, що анти-ІсЕВ
МНН зв'язується з ІСЕТК (Фіг. З С), поглинається клітинами ГЕБ (Фіг. 4) ії переходить на аблюмінальний бік в моделі ГЕБ іп міїго (Фіг. 6 В). Дослідження доставки лікарського засобу до мозку іп мімо показали також, що ІБК МНН "переносив" кон'югований пептид (Галанін, приблизно З кДа), а також великий злитий білок (приблизно 80 кДа) через ГЕБ (Фіг. 9 А та В;
Фіг. 9 0).
Результати також показують, що анти-І4ЕТ1А МНН може експресуватися в злитті з Ес фрагментом (фрагмент, що кристалізується), щоб пролонгувати циркуляційний період напіввиведення приблизно в 75 рази (приблизно 25 годин в порівнянні з приблизно 20 хв для
МНН окремо). Даний злитий конструкт з високою молекулярною масою (приблизно 80 кДа) також ефективно може транспортуватися через ГЕБ. Тривалий період напіввиведення з плазми значно збільшує СМР вплив кон'югату ІСЕТЕ МнН-тЕс (тЕс - мишачий Ес) в порівнянні тільки з
МНН ії робить його корисним в якості переносників через ГЕБ для лікування хронічних захворювань з мішенями у ЦНС. Кон'югат легко виявляється в паренхімі мозку з використанням імуно-флюоресцентного детектування. Результати показують, що переносник ІЗЕТК МНН може "переносити" великі молекули (аналогічні за розміром: антитіл, ферментів, факторів росту, пептидів, цитокінів, пасток рецепторів) через ГЕБ.
Таким чином, антитіло-опосередкована доставка може бути не тільки корисною для короткострокового лікування (наприклад епілептичного нападу), але також може бути корисна для середньострокового (наприклад раку) і довгострокового (наприклад хвороби Альцгеймера або хвороби Паркінсона) лікування.
Додаткові аспекти та переваги даного винаходу будуть очевидні в світлі наступного опису.
Детальні описи і приклади, які демонструють кращі варіанти здійснення винаходу, даються тільки в якості ілюстрації, оскільки різні зміни і модифікації в межах обсягу даного винаходу стануть очевидними для фахівців в даній галузі техніки в світлі ідей цього винаходу.
Зо Короткий опис креслень
Ці та інші ознаки винаходу будуть тепер описані за допомогою прикладу, з посиланням на прикладені креслення, на яких:
На Фіг. 1 представлена схема рецептору інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСЕ1К). ІСТ знаходиться на поверхні клітини і містить дві субодиниці: альфа-субодиницю і бета- субодиницю. Альфа-субодиниця (містить позаклітинну частину з сайтом зв'язування з инсулиноподобним фактором росту 1) зв'язана дисульфідним зв'язком з бета-субодиницею (містить невеликий позаклітинний домен, трансмембранний участок і внутрішньоклітинну частину). Рецептор ІСЕ1 може утворювати димер. Фрагмент довжиною в 933 амінокислоти, що містить альфа-субодиницю і позаклітинну частину бета-субодиниці, як зазначено в сірому полі, (М1І-Р933, інвентарний Мо Бм/із5Ргої РО8О69, см Фіг. 2) був рекомбінантно продукований і використаний для імунізації лами.
На Фіг. 2 показана послідовність ІЗЕТ1К (інвентарний Мо Зм/із5Ргої РО8О069). Білковий фрагмент довжиною в 933 амінокислоту, використовуваний для імунізації і пеннінга, показаний жирним шрифтом; повний ектодомен на 2 амінокислоти довше. Сайт розщеплення фурином, що розділяє альфа і бета субодиниці, показаний малими літерами курсивом. Сигнальний пептид виділено жирним курсивом.
На Фіг. З А зображено ексклюзіонну хроматограмму ІСЕ1ТК-зв'язуючого МНН ІСЕ1 В-4 і його гуманізованих варіантів (НІ, Н2, НЗ, Н4, Н5, Нб), пропущених через колонку з Зиуирегаех 75.
Профіль передбачає, що всі МНН крім ІСЕТК НІ мономірні і не агреговані. Фіг. З В зображує температуру плавлення (Тт), визначену за допомогою кругового дихроїзму (СО) для ІЗЕ1К-4
МНН і його гуманізованих варіантів (Н2, НЗ, Н4, Н5, Нб). Білки нагрівали до температури вище 90 "С і вимірювання проводили в СО пристрої, щоб визначити криву плавлення (верхня крива) і
Тт. Згодом білки охолоджували до кімнатної температури, нагрівали ще раз і аналізували за допомогою СО (нижня крива для ІЗЕ1ТЕ-4 УНН; лінія або точки приблизно 0 95 рефолдингу для гуманізованих варіантів). Це дозволило визначити частку рефолдингу білка, яка становила нуль для гуманізованих версій і 80 95 для ІЗЕ12-4. Фіг. 3С зображує перекривання сенсограмми поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) для зв'язування 0,1-5 нМ ІСЗЕ1К-4 УНН ії його гуманізованих варіантів (Н2, НЗ, Н4, Н5, Нб) з рекомбінантною позаклітинною частиною фрагменту людського ІЗЕТК. Ці дані добре підходять до моделі 1:1. Фіг. З ОО показує 60 сенсограмми 5РЕ зв'язування ІСЕ1 8-4 МНН з рекомбінантної позаклітинної частиною фрагменту людського ІСЕТК в присутності ІСЕ1. ІЗЕ1 в 100-кратному надлишку не впливає на зв'язування
ІСЕТА-4 МНН, що демонструє, що вони обидва зв'язуються з різними епітопами на рецепторі.
Фіг. ЗЕ зображує, що ІСЕ1К-4 МНН не зв'язується з рекомбінантною позаклітинною частиною людського інсулінового рецептору (ІК), іммобілізованого на 5РЕ поверхні, в той час як він зв'язується з контрольною поверхнею людського СЕК.
На Фіг. 4 зображені результати візуалізації захоплення клітин Су-5.5-міченого ІЗЕ1-4 МНН і контрольного МНН. Суб.5-мічений ІЗЕ1К-4 УНН (або ЕС5 МНН в якості позитивного контроль,
Мигидапапаат еї аї., 2002; Наддапі еї аї!., 2012) інкубували з 5М40 імморталізованних щурячими ендотеліальними клітинами мозку (зхмАКВЕС) при температурі 4 "С (верхні блоки) або при 37 "С (нижні блоки) для оцінки того, чи поглинається ІЗЕ1К-4 пасивно (4 С) або за допомогою активних механізмів (37 С), таких, як рецепторно-опосередкований ендоцито3з. Спільне фарбування агглютинином зародків пшениці і САРІ (4"б-діамідинів-2-феніліндол) проводили для візуалізації поверхні клітини і ядра, відповідно. Верхній блок: при інкубації при 4 "С ІБЕ18-4 і ЕС5 МНН були виявлені поза клітинами (стрілки), зв'язані з клітинною мембраною (солокалізуются з агглютинином зародків пшениці). Нижній блок: при 37 "С і ЕС5 і ІЕ1К-4 УНН накопичувалися всередині клітин в структурах, подібних везикули (стрілки), ймовірно ендосомаїв, що передбачає поглинання за допомогою механізму активного транспорту.
На Фіг 5 А зображено послідовність С-кінцевого злиття ІЗЕ1К-4 УНН з мишачим фрагментом Ес (ІСЕ18-4-тЕс). Схематичне зображення зібраного злитого білка зображено на
Фіг. 5 В. ІСЕ1К-4 УНН зображений чорним кольором і мишачий Ес (СН2 їі СНЗ) зображений сірим кольором на Фіг. ЗА їі В.
На Фіг. 6 А зображено блок-схема, яка узагальнює використання моделі ГЕБ іп міго для оцінки здатності різних МНН долати гематоенцефалічний бар'єр. Еквімолярні кількості (5,6 мкМ або 1,25 мкМ) позитивного (ЕС5) і негативного контролю (А20.1, з Сіовігідіит аййіснце токсин А- зв'язуючий УнН; і Ес2, ЕСЕК (рецептор епідермального фактору росту) - зв'язуючий МНН) МНН і
ІЖЕТА-3 тестували одночасно на їх здатність перетинати щурячу модель ГЕБ. 5У40- імморталізованних ендотеліальні клітини мозку дорослого щура (змАКВЕС) вирощували в моношарі на мембрані вставки в присутності щурячої астроцитарного- кондиційованого середовища в нижній камері і стандартного середовища у верхній камері. Після спільного додавання еквімолярних кількостей різних МНН на люмінальний бік моделі ГЕБ, зразки були взяті з нижньої камери через 15, 30 і 60 хв. Концентрація кожного МнН потім кількісно вимірювалися за допомогою масс-спектрометрії (моніторинг множинних реакцій - ізотіпіческі мічені внутрішні стандарти; МЕМ-1І ІБ) в цих зразках. Значення Рарр(Ог/ОТ - загальна кількість в приймальному відділенні в залежності від часу; А - площа моношару клітин; СО - початкова концентрація дозованого розчину| зазвичай використовується для визначення здатності молекули до перетину гематоенцефалічного бар'єру. На Фіг. 6 В наведені значення Рарр З чотирьох спільно введених УНН. ІСЕ1 В-4 має значно більше значення Рарр, ніж ЕС5, в той час як негативні контролі мають дуже низькі значення Рарр, що вказує на полегшений перенос ЕС5 і
ІСЕТВА-4 УНН в порівнянні з дуже низьким неспецифічним транспортом або парацеллюлярним транспортом контрольних МНН. Результати представляють собою середні значення Рарр, отримані в 5-6 незалежних експериментах. Фіг. б З зображує значення Рарр гуманізованих
ІСЕ18-4 однодоменних антитіл (Н2, НЗ, Н4, Н5, Нб) (чорні стовпчики) в порівнянні з А20.1 МНН (сірі стовпчики), які були протестовані в якості контролю в тій же лунці (середнє значення А20.1 позначається сірої пунктирною лінією). Результат чітко демонструє, що простого зв'язування
ІСЕТК (як це спостерігається для гуманізованого варіанту б (Нб)) недостатньо для запуску проходження через ГЕБ. Фіг. 6 О зображує значення Рарр С-термінального злиття ІЗЕ1К-4 УНН з мишачим с (чорний) в порівнянні з А20.1-мишачий Ес (А20.1тЕс) (сірий), яке було протестовано в тій же ополонці і мало дуже низьке значення Рарр. ІС2Е1В8-4-тЕс має істотно більш високе значення Рарр, ніж ЕС5-тЕс (зазвичай приблизно 180 см/хв, як зображено сірої пунктирною лінією). Інший ІЗЕТЕ-зв'язуючий УНН, І2ЕТВ-1 в злитті з Ес має лише несуттєво більш високе значення Рарр, ніж внутрішній негативний контроль А20.1 МНН. Даний результат також демонструє, що не всі ІЗЕ1К-зв'язуючі антитіла проходять через ГЕБ. Дані далі показують, що ІЗЕТК-4-тЕс має аналогічну високу швидкість транспорту через ГЕБ у порівнянні з моновалентний ІЗЕ1К-4 УНН. Результати представляють собою середні значення Рарр, отримані в 3-6 незалежних експериментах. Середні значення Рарр ЕС5 (МНН) і А2О.1 (УНН) також позначені пунктирними лініями для порівняння.
Фіг. 7 (верхні блоки) зображує зображення всього тіла іп мімо СО-1 мишей, яким вводили внутрішньовенно РВ5 (натрій-фосфатний буфер) (інтактна) або 2,5 мг/кг Су5.5-І2Е1 8-4 МНН або
Суб5.5-А20.1 УНН (схематично введені молекули показані зверху) і сканували на просторово- бо часовому оптичному візуалізаторі еХріоге Оріїх через 30 хв після ін'єкції. Нижні блоки показують ех-мімо зображення мозку тих же тварин, отримані через 1 год. після ін'єкції МНН їі після транскардіальной перфузії для видалення антитіл з крові. Стрілки вказують на високий оптичний сигнал (світло-сірий) флуоресцентного індикатора в голові і в ех-мімо головному мозку у тварині, якій вводили Суб5.5-ІБЕ1В8-4, тоді як у тварині, якій вводили контроль Су5.5-А20.1 (чорний) він не може бути виявлений.
На Фіг. 8 А зображена схема хімічного синтезу кон'югату ІЗЕ1К-4 МнН-Галанін. ІЗЕ18-4 спочатку кон'юговали з групою МН5 сульфо-5МОС (сульфосукцініміділ-4 (М-малеімідометіл) циклогексан-1-карбоксилат) кросс-линкера (1); потім малеімідом-активований ІСЕ1 В-4-сульфо-
ЗМОС кон'юговали з відновленим цистеїном Галаніну (2). На Фіг. 8 В зображений ІСЕ1ТК-4 (доріжка 2), ІСЕ1К-4-5МСС (доріжка 3) і кон'югат ІСЕ1К-4-Галанін (доріжка 4) в 5ХО5-РАСЕ гелі (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію). Характер "смуг" вказує на приєднання 1-2 молекул Галаніну на ІСЕ1К-4. Такі ж способи кон'югування були використані для зв'язування Галаніну з ІСЕ1К-тЕс.
На Фіг. 9 зображена ІСЕ1К-5-опосередкована доставка в мозок хімічно кон'югованого пептиду Галаніна. На Фіг. 9 А представлений графік, що демонструє здатність ІЗЕ1К-4 доставляти фармакологічно ефективні дози анальгетіческого пептиду Галаніну (3,2 кДа) в мозок з використанням больової моделі Харгрівса. У цій моделі локалізований хронічний біль індукують у самців щурів лінії Умієтаг (4-6 тижневого вікуу шляхом введення 100 мкл повного ад'юванта Фройнда (СЕА) в поверхню лівої стопи, викликаючи тим самим протягом декількох годин місцеве запалення. Після ін'єкції в хвостову вену ГЕБ-переносника кон'югату МннН- лікарський засіб або тільки Галаніну, щурів поміщають в плексигласові шафи, встановлені на поверхні скла. Тепловий подразник орієнтований на запалену або контралатеральну лапу за допомогою кутового дзеркала. Затримка між застосуванням подразника і реакцією лапи (облизування або помах лапою) інтерпретується як міра анальгетичного ефекту (пригнічення теплової гіперальгезії). Пептид Галанін сам по собі не може проникати через ГЕБ, про що свідчить відсутність анальгетичного ефекту після системної (в хвостову вену) ін'єкції 1 мг/кг
Галаніну (суцільні чорні трикутники). Системне введення кон'югату ІЗЕ1К-4-Галанін (3 мг/кг) пригнічує теплову гіперальгезію, досягаючи максимального ефекту через 30 хв після введення (суцільні чорні кола); ефект був більш тривалим, ніж ефект, що спостерігається після введення
Зо 6 мг/кг кон'югату ЕС5-Галанін (білі відкриті квадрати). Фіг. 9 В зображує дані результати у вигляді площі під кривою (АШС) відповіді в порівнянні з максимально можливим ефектом (МРЕ, контрольна лапа). На Фіг. 9 С зображено дозозалежне (2 мг/кг і 5 мг/кг) інгібування теплової гіперальгезії в моделі Харгрівса запальної болю за допомогою кон'югату ІСЕ1К-4-тЕс-Галанін, введеного ім. Навпаки, А20.1-тЕс-Галанін (5 мг/кг) не викликав будь-якого пригнічення теплової гіперальгезії. На Фіг. 9 О зображено відсоток інгібування теплової гіперальгезії (Етах) на піку відповіді, досягнутого різними дозами А20.1-тЕс-Галаніна і ІБЕ1К-4-тЕс-Галаніна.
На Фіг. 10 зображені рівні ІСЕ12-4-тЕс в плазмі та СМР і "позитивний" контроль МНН, ЕС5 і "негативний" контроль МНН А 20.1 через 30 хв після системного (в хвостову вену) спільного введення 6 мг/кг кожного антитіла. СМР збирали з мостомозжечкової цистерни. Рівні ІБЕ1К-4,
ЕС5 І А 20.1 в плазмі та СМР визначали за допомогою методу МЕМ-ІІ5, який "відстежує" і кількісно визначає специфічні білкові пептидні сигнатури. Рівні альбуміну в СМР були одночасно визначені МЕМ. Всі зразки СМР, що мають співвідношення плазми/СМР нижче 1500, були виключені як потенційно забруднені кров'ю. Співвідношення плазми/СМР становило 1,2 95 для ІСЕТК-4 в порівнянні з 0,9 95 для ЕС5 і 0,017 95 для А 20.1.
На Фіг. 11 зображено іммунодетектування ІСЕТЕ-4тЕс в секціях мозку через 24 годин після введення в хвостову вену дози 6 мг/кг. Перфузії з РВ5 проводили на щурах і секції мозку (12 мкм) були отримані з використанням вібратома. ІЗЕ1ТК-4тЕс був іммунодетектован з використанням анти-мишачого Ес антитіла (червоний, червоний канал показаний тільки на вставках). Кровоносні судини в секції мозку (дорсальний стріатум, А, лобова кора головного мозку, В) були детектовані з використанням лектина КСАТ1 (агглютинин Кісіпиз Соттипів 1) (зелений). ІСЕ12-4тЕс може бути детектований як в обох судинах, так і поза судинами (тобто в паренхімі головного мозку, перенесений через ГЕБ), як зображено стрілками.
На Фіг. 12 зображено, що ІСЕ1К-4 не перетинається з інсуліновою або ІСЕ1 передачею сигналу через інсуліновий рецептор або ІСЕ1К. Фіг. 12 А являє собою характерну картину
Вестерн блотингу, що демонструє, що ні ІЗЕ1К-4, ні будь-які з інших протестованих анти-ІдтЕ1 в
МНН (СЕ В-1, -3, -5 або -6) не індукують фосфорилювання протеїнкінази В в прямому напрямку окремо при 100 нМ концентрації. Також присутність 100 нМ ІСЕ12-4 або будь-якого з інших анти-ІСЕТА УНН не пригнічує фосфорилювання протеїнкінази В, індуковане 10 мкг/мл інсуліну.
Кількісне визначення щільності смуг Вестерн блотингу з З незалежних експериментів зображено бо на гістограмі (середнє я/- 5О (стандартне відхилення)) під зображенням гелю. На фіг. 12 В представлена характерна картина Вестерн блотингу, що показує, що ні ІЗЕ1К-4, ні будь-які інші протестовані анти-ІЯЕТА УНН (ІСЕ18-3, -5 або -6) при 100 нМ не індукують фосфорилювання протеїнкінази В самі по собі і не пригнічують ІЇСЕ-1 індуковане фосфорилювання протеїнкінази В (тобто передачу сигналу), викликане стимуляцією 200 нг/мл ІСЕ-1. Кількісне визначення щільності смуг Вестерн блот з З незалежних експериментів показано на гістограмі (середнє ж/- 50) під зображенням гелю. Фіг. 12 С зображує Вестерн блотинги фосфорильованих ІСЕ1К.
Клітини інкубували або з 100 нМ або 500 нм ІСЕ1К-4-тЕс, або будь-яким іншим анти-Ід4Е1 в
МнН-тЕс злиттям (ІСБЕ1К-1, -3 або -4 тЕс) окремо або стимулювали 200 нг/мл ІСБЕ-1 в присутності відповідних злитих білків ІЗЕ1К-УнН-тЕс. Вестерн блотинги показують, що жоден з злитих конструктів не інгібував ІЇЗЕ-1 індуковане фосфорилювання ІСЕТЕК і не індукував фосфорилювання рецептора сам по собі.
Детальний опис винаходу
Даний винахід відноситься до антитіл, специфічних до рецептора інсуліноподібного фактору росту 1, їх фрагментам, а також їх застосуванням. Більш конкретно, даний винахід відноситься до антитіл, специфічних до рецептора інсуліноподібного фактору росту 1 і фрагментам, які проходять гематоенцефалічний бар'єр, і їх застосуванням.
Даний винахід відноситься до виділених або очищеним антитіл або їх фрагментів, специфічно зв'язується з епітопом рецептора інсуліноподібного фактору росту 1 (ІСЕ1К), причому антитіло або його фрагмент переноситься через гематоенцефалічний бар'єр, і епітоп специфічно зв'язується з антитілом з послідовністю 5ЕО ІО МО: 5. Епітоп ІСЕТК може перебувати у позаклітинному домені СЕТ.
Даний винахід відноситься до виділених або очищених антитіл або їх фрагментів, що містить - послідовність області, яка визначає компліментарність (СОК) 1 ООТУЗРТА (ЗЕО ІО МО: 1); - послідовність СОК2 ІТИ (5ЕО ІЮ МО.2) ; і - послідовність СОКЗ ААБЗТРЇ ВІРЕЕЗАМТМ (5ЕО І МОЗ), де антитіло або його фрагмент специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактору росту 1 (ІСЕ1К).
Термін "антитіло", також званий в даній галузі "імуноглобулін" (Ід), який використовується в даному документі, відноситься до білка, який було збудовано з спарених важких і легких поліпептидних ланцюгів; існують різні ізотипи Ід, включаючи ІдА, дО, ІДЕ, дО і Ід9М. Коли антитіло складено правильно, кожен ланцюг укладається в деяку кількість окремих глобулярних доменів, з'єднаних більш лінійними поліпептидними послідовностями. Наприклад, легкий ланцюг імуноглобуліну укладається в варіабельний (МІ) і константний (СІ) домен, в той час як важкий ланцюг укладається в варіабельний (МН) і три константних (СН, СН2, СНЗ) домену.
Взаємодія варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга (МН і МІ) призводить до утворення області зв'язування антигену (Ем). Кожен домен має усталену структуру, знайому фахівцям в даній галузі техніки.
Варіабельні області легкого і важкого ланцюга відповідають за зв'язування антигену-мішені і, відтак, можуть демонструвати значну різноманітність послідовностей у різних антитіл.
Константні області демонструють меншу різноманітність послідовностей і відповідають за зв'язування ряду природних білків для виявлення важливих біохімічних подій. Варіабельна область антитіла містить антиген-зв'язуючі детермінанти молекули і, таким чином, визначає специфічність антитіла до його антигену-мішені. Велика частина відмінностей послідовностей зв'язана з шістьма гіперваріабельними областями, по три в варіабельних областях важкого (МН) і легкого (МІ) ланцюга; гіперваріабельні області об'єднуються для формування антиген- зв'язуючого сайту і вносять свій внесок в зв'язування і впізнавання антигенної детермінанти.
Специфічність і аффінність антитіла до його антигену визначається структурою гіперваріабельних областей, а також їх розміром, формою і хімією поверхні, яку вони представляють антигену. Існують різні схеми для ідентифікації областей гіперваріабельності, двома найбільш поширеними з яких є зазначені у Кабаї і Споїпіа апа І е5К. Кабаї еї а! (1991), що визначають "області, що визначають комплементарність" (СОК) на основі варіабельності послідовності в антиген-зв'язуючих областях доменів УН і МІ. Споїпіа і І е5К (1987) визначають "гіперваріабельні петлі" (Н або І) на основі розташування областей структурної петлі в доменах
МН і МІ. Оскільки дані індивідуальні схеми визначають СОК і області гіперваріабельної петлі, які є суміжними або перекриваються, фахівці в даній області техніки, що стосується антитіл, часто використовують терміни "СОК" і "Гіперваріативна петля" взаємозамінні, і вони можуть бути так використані в даному документі. СОК/петлі називаються тут відповідно до більш пізнішою системою нумерації ІМСТ (Іеїгапс, М.-Р. єї аІ., 2003), яка була розроблена для спрощення бо порівняння варіабельних доменів. У цій системі консервативні амінокислоти (такі як Суз23,
Тгр41, Сузх104, Рпе/ЛПІтр118 і гідрофобний залишок в позиції 89) завжди мають ту ж позицію. Крім того, забезпечується стандартизоване розмежування каркасних областей (ЕК: позиції від 1 до 26; ЕК2: від 39 до 55; ЕКЗ: від 66 до 104; і ЕК4: 118 до 129) і СОК (СОКТ: 27 до 38, СОК2: 56 до 65; і СОКЗ: від 105 до 117). "Фрагмент антитіла", згадуваний тут, може включати в себе будь-який відповідний антиген- зв'язуючий фрагмент антитіла, відомий в даній області. Фрагмент антитіла може бути фрагментом природного антитіла або може бути отриманий шляхом обробки природних антитіл або за допомогою рекомбінантних способів. Наприклад, фрагмент антитіла може включати в себе, але не обмежується зазначеним, Ем, одноланцюговий Ем (ЗсСЕм, молекула, що складається з МН і МІ, зв'язаних пептидним лінкером), Раб, Е (ар)2, однодоменне антитіло (заАр; фрагмент, що складається з одного УН або МІ), і мультівалентні презентації будь-якого з них. Фрагменти антитіл, такі як тільки що описані, можуть вимагати лінкерних послідовностей, дисульфідних зв'язків або інший тип ковалентного зв'язку для зв'язування різних частин фрагментів; фахівці в даній галузі техніки знайомі з вимогами різних типів фрагментів і різними підходами до їх побудови.
У необмеженному прикладі фрагмент антитіла може бути 5аАб, отриманим з природних джерел. Важкі ланцюги антитіл верблюжого походження (Натеге-Савіептап еї аї, 1993) не мають легких ланцюгів і, відтак, їх антиген-зв'язуючі сайти складаються з одного домену, званого МНН. задь також спостерігається у акул і називається ММАЕ (Мипйаї! еї аї, 2003). Інша аль може бути сконструйовано на основі важкого і легкого ланцюга людського Ід (Чезрегз5 еї аї, 2004; То еї а), 2005). Використовуваний в даному описі термін "5заАр" включає заАБ, безпосередньо виділені з джерела МН, МНН, МІ, АБО ММАК будь-якого походження за допомогою фагового відображення або інших технологій, заАб, отримані з вищезазначених 5аАБ, рекомбінантні заАб, а також 5аАБ, що генеруються за допомогою подальшої модифікації таких 5адБ гуманізацією, дозріванням аффінності, стабілізацією, солюбілізацією, верблюдізацією або іншими способами інженерії антитіл. Також охоплюються цим винаходом гомологи, похідні або фрагменти, які зберігають антиген-що зв'язує функцію і специфічність вадр. 5аАр володіють необхідними властивостями для молекул антитіл, такими як висока термостабільність, висока стійкість до детергентів, відносно висока стійкість до протеазам (Шитоціїп еї аї, 2002) і високий вихід (Аграрі-сзпангоцаї еї аї, 1997); також можуть бути створені високо афінні зхаАБ виділенням з імунної бібліотеки (Гі еї аі, 2009) або шляхом дозрівання афінності іп мійго (Оаміезє й Кіесптапп, 1996). Подальші модифікації для підвищення стабільності, такі як введення неканонічних дисульфідних зв'язків (Нивзаск еї аї, 2011 року; Кіт еї аї, 2012), також можуть бути застосовані до 5аАБ.
Фахівець у даній галузі техніки повинен бути добре знайомий зі структурою однодоменних антитіл (див, наприклад, ЗОУММТ, 2Р42 в Ргоївіп ЮОайа Вапк). 5БаАБ містить один домен імуноглобуліну, який зберігає характерну для імуноглобуліну укладку ланцюга; в першу чергу, три СОК/гіперваріабельні петлі утворюють антиген-зв'язуючий сайт. Тим не менш, і, як повинно бути зрозуміло фахівцям в даній галузі техніки, не всі СОК можуть знадобитися для зв'язування антигену. Наприклад, і не обмежуючись цим, одна, дві, або три СОК можуть внести свій вклад в зв'язування і розпізнавання антигену за допомогою 5аАБ відповідно до даного винаходу. СОК з 5дАБВ або варіабельного домену згадуються тут як СОКІ, СОК2 ії СОКЗ і пронумеровані, як це визначено у Геїтапс, М.-Р. єї аї. (2003).
Антитіло або його фрагмент відповідно до даного винаходу є специфічним до рецептора інсуліноподібного фактору росту 1 (ІСЕ1К), що знаходиться на поверхні клітин. СЕТ містить альфа-субодиницю, яка включає позаклітинну частину, що має ділянку зв'язування інсуліноподібний фактор росту 1, з'єднану дисульфідним зв'язком з бета-субодиницею, яка містить невеликий позаклітинний домен, трансмембранну ділянку і внутрішньоклітинну частину.
Рецептор ІСЕТ компонується в гомодимер або може утворювати гетеродимер з рецептором інсуліну. Послідовність ІСЕТК може бути, але не обмежується цим, такою, як зображено на
Фіг. 2 (інвентарний Мо Зм/і55Ргої РО8О69; 5ЕО ІЮ МО: 12), або послідовністю, по суті ідентичною їй.
Антитіло або його фрагмент, як описано в даному документі, не повинні заважати передачі сигналів через інсуліновий рецептор (ІК) або ІСЕТК. Зокрема, антитіла або їх фрагменти, описані в даному документі, не повинні пригнічувати фосфорилювання протеїнкінази В, індуковане інсуліном, і вони не повинні індукувати фосфорилювання ІК самостійно або пригнічувати викликану інсуліном передачу сигналу; крім того, антитіла або їх фрагменти, описані в даному документі, не повинні пригнічувати ІЕ-1-індуковане фосфорилювання ІСЕ1К. бо До того ж, вони не повинні зв'язуватися з інсуліновим рецептором.
Як було зазначено вище, антитіло або його фрагмент можуть бути заАб. 5адь може мати верблюже походження або бути отриманим з верблюжих МНН, і, таким чином, можуть бути засновані на верблюжих каркасних областях; В якості альтернативи, СОК, описані вище, можуть бути щеплені на ММАК, МНН, МН АБО Мі каркасні області У ще одному альтернативному варіанті, гіперваріабельні петлі, описані вище, можуть бути щеплені на каркасні області інших типів фрагментів антитіл (Ем, ЗсЕм, ЕБАВ) з будь-якого джерела (наприклад, мишачі) або білки аналогічного розміру і характеру, на які може бути щеплена СОК (наприклад, див. Місаїзе еї аї, 2004)
Даний винахід додатково включає антитіло або фрагмент, який "гуманізований" з використанням будь-якого відповідного способу, відомого в даній галузі техніки, наприклад, але не обмежуючись ними, СОК щепленням і облицюванням. Гуманізація фрагмента антитіла або антитіла містить заміну амінокислоти в послідовності на її людський аналог, який міститься в людській консенсусній послідовності, без втрати антиген-зв'язуючої здатності або специфічності; такий підхід зменшує імуногенність антитіла або його фрагмента при введенні людині. В процесі щеплення СОК, одна або більше ніж одна з СОК, визначених у даному документі, може бути злита або щеплена до варіабельної області людини (МН або МІ), іншому людському антитілу (ІдДА, дО, ЧЕ, Ідс і дм), іншим людським каркасним областям фрагментів антитіл (Ем, 5СЕм, Раб) або інших білків аналогічного розміру і природи, на які можуть бути щеплені СОК (Місаїзе еї аїЇ, 2004). В такому випадку, конформація зазначеної однієї або більше ніж однієї гіперваріабельної петлі ймовірно зберігається і спорідненість і специфічність заАВ до своєї мішені (тобто ІСЕ1К) ймовірно мінімально порушені. СОМК-щеплення відомі в даній галузі техніки і описані щонайменше в наступних документах: патент США Мо 6180370, патент США
Мо 5693761, патент США Мо 6054297, патент США Мо 5859205, і Європейський патент Мо 626390.
Облицювання також згадується в цій галузі як "шліфовка варіабельної області" і включає в себе гуманізацію гідрофільних областей антитіла або фрагмента; таким чином, приховані негуманізованні залишки, які можуть бути важливі для конформації СОР, зберігаються, в той час як потенціал для імунологічної реакції проти гідрофільних областей зведений до мінімуму.
Облицювання відоме в даній галузі техніки і описане щонайменше в наступних документах: в патенті США Мо 5869619, в патенті США Мо 5766886, патент США Мо 5821123, і Європейському
Зо патенті Мо 519596. Фахівці в цій галузі техніки також достатньо знайомі зі способами отримання таких гуманізованих фрагментів антитіл і гуманізації амінокислотних позицій.
Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, виділене чи очищене антитіло або його фрагмент, специфічні до ІСЕТЕ, може мати послідовність
ХІМХ»І ХзЗЕЗИЯ СИ МОХИС5І НІ 5СХ5Ххв5 ас ТМ5РТАМОМХ7ВОАРОКХ»вХ»ЕХоМХ т НІТМУЗВИтт
ВХІгАЗЗУКХІзАЕТІЗАОХаХ5КМТ Хв ОММ5І Х17ХівЕОТАМУМСААБЗТРІ ВІГРЕЕЗАУТУУуСОСТ
Х1і"МТМ55 (ЗЕО ІО МО:4), де Хі являє собою Е или С); Хо являє собою К або 0); Хз являє собою
М або Е; Ха являє собою А або Р; Хо являє собою А або Е; Хв являє собою М або А; Х7 являє собою М або Е; Хв являє собою с або Е; Хо являє собою І або Е; Х:о являє собою Е або МУ; Хі являє собою б або 5; Хіг2 являє собою М або У; Хіз являє собою 0 або 0; Х1і4 являє собою М або 5; Хі5 являє собою А або 5; Х:іє являє собою І або У; Х:і7 являє собою К або Е; Хів являє собою
А або 5; и Хіо являє собою | або О, або по суті ідентичну їй послідовність. В якості альтернативи, виділене чи очищене антитіло може містити послідовність, обрану з групи, що складається з:
ОУКІГЕЕЗОССИЇ МОАЛССИБІ ВІ БСЕУБасТУ5РТАМОУМЕВОАРОКЕКЕРУСНІТУЗНИатТАМА5З5
МКОВЕТІЗАОЗАКМТУМІ ОММ5І КЗЕОТАМУУСААЗБТРІ ВІ/'РЕЕЗАУТУУСОСТОМТУ55 (5ЕО І
МО:5), згадуваної тут як ІСЕ1ТК-4;
ОМОЇ МЕЗСааСІОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМУВОАРОКаї ЕУУМаНІТ УЗВаИаттвмАБ
ЗУКОаВЕТІЗАОМЗКМТУМІ ОММЗІ ВАЕОТАМУУСААЗТРЕІ ВІГРЕЕБАУ ТУ СОСТІ МТУ55 (5ЕО І
МО:6), згадуваної тут як ІСЕ1К-4 Не;
ОМОЇ МЕЗОСОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМ ЕВОАРОКаЇ ЕР ССНІТУЗНИаИТТАМАБЗ
УКОаВЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММ5ЗІ ВАЕОТАМУУСААБЗТРНІ ВІ РЕЕБАУТУМУСОСТІ МТУ (5ЕО І
МО:7), згадуваної тут як ІСЕ1К-4 НЗ;
ОМОЇ МЕЗОСОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМ ЕВОАРОКаЇ ЕР ССНІТУЗНИаИТТАМАБЗ
УКОаВЕТІЗАОЗЗКМТУМІ ОММ5І ВАЕОТАМУУСААЗТНІ ВІ РЕЕБАУТУМСОСТІ МТМ (5ЕО І
МО:8), згадуваної тут як ІСЕ1К-4 На;
ОМОЇ МЕЗО СОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМ ЕВОАРЕКЕВЕєЕУаНІГУЗНИаТТ АХА
ЗУКОаВЕТІЗАОЗОЗКМТУМІ ОММ5І ВАЕОТАМУУСААЗТНІ ВІ РЕЕБАУТУМСОСТІ МТУ55 (5ЕО І
МО:9), згадуваної тут як ІСЕ1К-4 Н5; і/або послідовності, по суті ідентичною ім.
По суті ідентичні послідовності можуть містити одну або кілька консервативних амінокислотних мутацій. Відомо, що одна або кілька консервативних амінокислотних мутацій в референсній послідовності можуть дати мутантний пептид без істотної зміни фізіологічних, хімічних, фізико-хімічних або функціональних властивостей в порівнянні з референсною послідовністю; в такому випадку, референсна і мутантна послідовності будуть вважатися "по суті ідентичними" поліпептидами. Консервативне амінокислотне заміщення визначається тут як заміщення амінокислотного залишку на інший амінокислотний залишок з подібними хімічними властивостями (наприклад, розмір, заряд або полярність). Дані консервативні амінокислотні мутації можуть відбутися в каркасних областях заАб при збереженні послідовностей СОК, перерахованих вище, а також загальної структури СОК антитіла або його фрагмента; таким чином, специфічність і зв'язування антитіла зберігаються.
В якості необмеженого прикладу, консервативна мутація може бути заміщенням амінокислоти. Таке консервативне амінокислотне заміщення може заміщати основну, нейтральну, гідрофобну або кислу амінокислоту на іншу з тієї ж групи. Під терміном "основна амінокислота" маються на увазі гідрофільні амінокислоти, які мають бічний ланцюг із значенням рК більше 7, які, як правило, позитивно заряджені при фізіологічному значенні рН. Основні амінокислоти включають гістидин (Ніх або Н), аргінін (Ага або К) і лізин (ух або К). Під терміном "нейтральна амінокислота" (також "полярна амінокислота") мають на увазі гідрофільні амінокислоти, які мають боковий ланцюг, яка не заряджена при фізіологічному значенні рнН, але яка має принаймні один зв'язок, в якій пара електронів, загальна для двох атомів, знаходиться ближче до одного з атомів. Полярні амінокислоти включають серин (5ег або 5), треонін (Тпг або
Т), цистеїн (Суз або С), тирозин (Туг або У), аспарагін (Азп або М) і глютамін (Сіп або 0). Термін "г?ідрофобна амінокислота" (також "неполярна амінокислота") включає амінокислоти, що проявляють гідрофобність вище нуля відповідно до нормованої консенсусної шкали гідрофобності Айзенберга (1984). Гідрофобні амінокислоти включають пролін (Рго або Р), ізолейцин (Іе або І), фенілаланін (Ріє або Е), валін (Маї або М), лейцин (І еи або І), триптофан (Ттр або М/), метіонін (Меї, або М), аланін (Аїа або А) і гліцин (СіІу або б). "Кисла амінокислота" відноситься до гідрофільних амінокислот, які мають боковий ланцюг із значенням рК менше 7, які, як правило, негативно заряджені при фізіологічному значенні рН. Кислі амінокислоти
Зо включають глутамат (Сім або Е) і аспартат (Азр або 0).
Ідентичність послідовності використовується для оцінки подібності двох послідовностей; вона визначається шляхом обчислення відсотка залишків, які є однаковими, коли дві послідовності вирівнюють для максимальної відповідності між позиціями залишків. Будь-який відомий спосіб може бути використаний для обчислення ідентичності послідовностей; наприклад, існує комп'ютерне програмне забезпечення для розрахунку ідентичності послідовності. Не у рамках будь-яких обмежень, ідентичність послідовності може бути розрахована за допомогою програмного забезпечення, такого як МОВІ ВІ А5Т2, підтримуваного
Швейцарським інститутом біоінформатики (його можна знайти за адресою са.ехразу.огоЛооів/Біазі/), ВІ АБЗТ-Р, Віазі-М або ЕАЗТА-Н, або будь-якого іншого відповідного програмного забезпечення, яке відоме в даній галузі техніки.
По суті ідентичні послідовності відповідно до даного винаходу можуть бути щонайменше на 90 95 ідентичні; в іншому прикладі по суті ідентичні послідовності можуть бути щонайменше на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, або 100 95 ідентичні, або на будь-яке інше значення між зазначеними, на рівні амінокислотної послідовності, описаному в даному документі. Важливим є те, що по суті ідентичні послідовності зберігають активність і специфічність референсної послідовності. У необмеженому втіленні різниця в ідентичності послідовностей може бути через мутації (й) консервативної амінокислоти. В якості необмеженого прикладу, даний винахід може бути направлено на антитіло або його фрагмент, що містить послідовність щонайменше на 95 95, 98 95 або 99 95 ідентичну послідовності антитіл, описаних в даному документі.
Антитіло або його фрагмент відповідно до даного винаходу може також містити додаткові послідовності для допомоги в експресії, детектуванні або очистці рекомбінантного антитіла або його фрагменту. Можуть бути використані будь-які такі послідовності або мітки, відомі фахівцям в даній галузі. Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, антитіло або його фрагмент може включати в себе таргетовану або сигнальну послідовність (наприклад, але не обмежуючись зазначеним, ОтрА), мітку детектування/очищення (наприклад, але не обмежуючись зазначеним, с-Мус, Ніб5 або Нівб), або їх комбінації. В іншому прикладі додаткова послідовність може бути біотіновим сайтом впізнання як, наприклад, описаний Сгопап еї аІ в М/О 95/04069 або
Стопап еї аі в УМУО/2004/076670. Як також відомо фахівцям в цій галузі техніки, лінкерні послідовності можуть бути використані в поєднанні з додатковими послідовностями або бо мітками, або можуть слугувати в якості мітки детектування/очищення.
Антитіло або його фрагмент відповідно до даного винаходу також можуть бути в форматі мультівалентного відображення, так званому тут мультівалентною презентацією.
Мультімерізація може бути досягнута будь-яким підходящим способом, відомим в даній галузі техніки. Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, мультімерізація може бути досягнута за допомогою молекул самозбірки, таких, як описані у 2йпапд еї а (2004а; 20045) їі в
УМО2003/046560, де пентатела отримують шляхом експресії злитого білка, що містить антитіло або його фрагмент відповідно до даного винаходу, і домен пентамерізації В-субодиниці сімейства токсинів АВ5 (Меїгтій 4 Ної, 1995). Мультімер також може бути сформований з використанням доменів мультимерізації описаних у 2Пи еї а). (2010); ця форма, яка називається тут "сотроду" формою, є злиттям антитіла або його фрагмента відповідно до даного винаходу з суперспіральним пептидом, що створює мультимерну молекулу (2пи еї аї., 2010). Інші форми мультивалентної презентації також охоплюються цим винаходом. Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, антитіло або його фрагмент можуть бути представлені у вигляді димеру, тримера або будь-якого іншого відповідного олігомеру. Це може бути досягнуто за допомогою способів, відомих в даній галузі техніки, наприклад, за допомогою з'єднання прямим зв'язуванням (Міеізоп еї аїЇ, 2000), 3-Уип/Бо5 взаємодії (Ктгиїї 5 І одіепрегу, 1996), "Виступи-у-западини" взаємодії (Кідду/ау еї аї, 1996).
Іншим способом, відомим в даній галузі для мультимерізації, є димеризація антитіла або його фрагмента з використанням домену Ес, наприклад, але не обмежуючись зазначеним, людських доменів Ес. Домени Ес можуть бути обрані з різних класів, в тому числі, але не обмежуючись зазначеним, їдсС, ДМ або різних підкласів, включаючи, але не обмежуючись зазначеним, дес, Ідса2 і т.д. При такому підході ген Ес вбудовують у вектор разом з геном 5адБ для створення злитого білка 5адр-Ес (ВеїЇ еї аІЇ, 2010 року; Ідбаї еї аїЇ, 2010); злитий білок рекомбінантно експресують, потім очищують. Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, формати мультивалентного відображення можуть включати в себе химерні формати анти-
ІСЕ18-4 МНН, зв'язаного з доменом Ес, або бі- або три-специфічні злиті антитіла з двома або трьома анти-І4Е1Н-4 МНН, що розпізнають унікальні епітопи. Такі антитіла можна легко спроектувати і отримати, вони можуть значно продовжити період напіввиведення у сироватці 5дАБ і вони можуть бути придатними реагентами для візуалізації пухлин (ВеїЇ єї аї!., 2010).
Зо Домен Ес у мультимерному комплексі, як описано вище, може являти собою будь-який відповідний Ес-фрагмент, відомий у даній галузі техніки. Фрагмент Ес може бути отриманий з будь-якого відповідного джерела. Наприклад, Ес може бути мишачого або людського походження. У конкретному необмеженому прикладі Ес може бути мишачим Ес2ор фрагментом або людським Ес1 фрагментом (ВеїЇ еї аї, 2010 року; Ідваї єї аї, 2010). Фрагмент Ес може бути злитий з М-термінальним або С-термінальних кінцем анти-ІС5Е1Н-4 МНН або гуманізувати варіантів відповідно до даного винаходу. У конкретному необмеженому прикладі мультимерізовані виділені або очищені антитіла або фрагменти, як описано вище, можуть містити послідовність 5ЕО ІЮ МО: 10, 38, або 11.
Кожна субодиниця мультимерів, описаних вище, може містити однакові або різні антитіла або їх фрагменти відповідно до даного винаходу, які можуть мати однакову або різну специфічність. Крім того, домени мультимерізації можуть бути зв'язані з антитілом або фрагментом антитіла з використанням лінкера в міру необхідності; такий лінкер повинен мати достатню довжину і відповідний склад, щоб забезпечити гнучке кріплення двох молекул, але він не повинен заважати антиген-зв'язуючим властивостям антитіла.
Антитіло або його фрагмент, як описано у даному документі, можуть проходити через гематоенцефалічний бар'єр. Мозок відділений від іншої частини тіла за допомогою спеціалізованої ендотеліальної тканини, відомої як гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ).
Ендотеліальні клітини ГЕБ з'єднані щільними контактами і ефективно запобігають потраплянню множини терапевтичних з'єднань у мозок. На додаток до низької швидкості везикулярного транспорту ще однією особливістю ГЕБ є наявність ферментативного бар'єру (ів) та високого рівня (рівнів) експресії АТФ-залежних транспортерів на аблюмінальній (з боку мозку) боці ГЕБ, у тому числі Р-глікопротеїну (соНезтап еї аї., 1993; М/агапабе, 1995), який активно транспортують різні молекули з головного мозку у кровотік (Затиеї5, 1993). Лише невеликі (менше 500 дальтон) і гідрофобні (Рагагдде, 1995) молекули можуть легко проникати через ГЕБ. Таким чином, здатність антитіла або його фрагмента, як описано вище, специфічно зв'язуватися з поверхневим рецептором, поглинатися у ендотеліальних клітинах головного мозку і піддаватися трансцитозу через ГЕБ, ухиляючись від лізосомальної деградації, корисна у галузі неврології.
Даний винахід охоплює також нуклеотидні послідовності, які кодують молекули, як описано у даному документі. З огляду на виродженість генетичного коду, деяке число нуклеотидних бо послідовностей буде мати ефект кодування поліпептиду, що буде зрозуміло фахівцеві у даній галузі техніки. Нуклеотидна послідовність може бути кодон-оптимізована для експресії у різних мікроорганізмах. Даний винахід також відноситься до векторів, що містить нуклеїнові кислоти, описані вище. Крім того, винахід охоплює клітини, що містять нуклеїнову кислоту і/або вектор, описані вище.
Даний винахід додатково відноситься до виділених або очищених антитіл або їх фрагментів, іммобілізованим на поверхню з використанням різних методик; наприклад, не в рамках будь- яких обмежень, антитіло або його фрагмент можуть бути зв'язані або спарені з поверхнею за допомогою Нівб-мітки, біотінового зв'язування, ковалентного зв'язування, адсорбції тощо.
Іммобілізація антитіла або його фрагмента відповідно до даного винаходу може бути корисна у різних застосуваннях для захоплення, очищення або виділення білків. Тверда поверхня може являти собою будь-яку відповідну поверхню, наприклад, але не обмежуючись зазначеним, поверхня лунки мікротитраційного планшету, канали сенсорних чипів поверхневого плазмонного резонансу (ЗРЕ), мембрани, кульки (такі як магнітні або сефарозні кульки або засновані на інших хроматографічних смолах), скло, пластик, нержавіючу сталь, плівку або будь-яку іншу корисну поверхню, таку як наночастки, нанопроводи і поверхні кантільоверу.
Винахід також включає антитіло або його фрагмент, як описано вище, зв'язане з молекулою вантажу. Молекула вантажу може являти собою будь-яку відповідну молекулу, яка поставляється через ГЕБ антитілом або його фрагментом. Молекула вантажу може мати молекулярну масу у діапазоні від приблизно 1 кДа до приблизно 200 кДа; наприклад, молекула вантажу може мати молекулярну масу приблизно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 або 200 кДа, або будь-яку масу у проміжку між зазначеними масами, або будь-який діапазон мас, визначений за допомогою будь-яких двох зазначених вище мас. У конкретних, не обмежуючих прикладах, молекула вантажу може мати молекулярну масу 1 кДа (наприклад, але не обмежуючись зазначеним, мала молекула, така як Суб5.5), 1-10 кДа (наприклад, але не обмежуючись зазначеним, пептид, такий як Галанін, З кДа), приблизно 80 кДа (наприклад, але не обмежуючись зазначеним, фрагмент Ес, фермент, білок, антитіло і т.д.), або приблизно 200 кДа (наприклад, але не обмежуючись зазначеним, моноклональних антитіл).
Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, молекулою вантажу може бути детектуючий
Зо агент, терапевтичний агент, лікарський засіб, пептид, фермент, фактор росту, цитокіни, пастка рецептора, антитіло або його фрагмент (наприклад Ідс, ЗСЕм, Раб, МНН, МН, МІ. і т.д.), хімічна сполука, вуглеводний фрагмент, молекули на основі ДНК (антисмислової олігонуклеотид, мікроРНК, міРНК, плазмида), цитотоксический агент, вірусний вектор (адено-, ленті-, ретро-), одна або більше ліпосом або наноносіїв, завантажених будь-яким з раніше перерахованих типів молекул вантажу, або одна або кілька наночастинок, нанопроводів, нанотрубок або квантових точок. Молекула вантажу, як це описано вище, може бути детектуючим агентом. Наприклад,
ІЖЕТА-специфічне антитіло або його фрагмент може бути зв'язано з радіоактивним ізотопом, парамагнітною міткою, фторофором, флуоресцентним агентом, ближнім інфрачервоним (МІК, наприклад Су5.5) фторохромом або барвником, ехогенним мікропузирів, аффинной міткою, детектуючою молекулою на основі білка, нуклеотидом, квантовими точками, наночасткою, нанопроводи або нанотрубкою або будь-яким іншим відповідним агентом, який може бути виявлений за допомогою способів візуалізації. Антитіло або його фрагмент можуть бути зв'язані з молекулою вантажу з використанням будь-якого способу, відомого в даній галузі (рекомбінантна технології, хімічної кон'югації і т.д.).
Молекула вантажу, як описано в даному документі, може бути зв'язана, що також названо тут "кон'югована", з антитілом або його фрагментом будь-яким підходящим способом, відомим в даній галузі техніки. Наприклад, не в рамках яких-небудь обмежень, молекула вантажу може бути зв'язана з пептидом за допомогою ковалентного зв'язку або іонної взаємодії. Зв'язок може бути досягнутий за допомогою хімічної реакції зшивання або шляхом злиття з використанням методології рекомбінантної ДНК в поєднанні з будь-якою системою експресії пептидів, такий як бактерії, дріжджі або системи, засновані на клітинах ссавців. При кон'югації молекули вантажу з антитілом або його фрагментом може бути використаний відповідний лінкер. Способи зв'язування антитіла або його фрагмента з молекулою вантажу, такою як терапевтичний або агент, що детектується, добре відомі фахівцям в даній галузі техніки.
В одному не обмежуючому прикладі молекулою вантажу може бути детектована мітка, радіоактивний ізотоп, парамагнітна мітка, така як гадоліній або оксид заліза, фторофор, ближній інфрачервоний (МІК) фторохром або барвник, ехогенний мікроміхур, аффінна мітка (наприклад, біотин, авідин і т. д.), ферменти або будь-який інший відповідний агент, який може бути виявлений за допомогою діагностичних способів візуалізації. У конкретно не обмежуючому 60 прикладі анти-ІЩЕ1Н8-4 або його фрагмент може бути зв'язаний з барвником ближньої інфрачервоної флуоресцентної візуалізації (МІРЕ), наприклад, не в рамках будь-яких обмежень,
Су5.5, АІехаб80, ОуїЇїдніЄвО або руїЇїднівОО.
Таким чином, даний винахід додатково передбачає спосіб іп міго детектування ІСЕ1К, що включає контактування зразка тканини з одним або більше ніж одним виділеним або очищеним антитілом або його фрагментом відповідно до даного винаходу, зв'язаним з детектованим агентом. Комплекс ІЗЕ1К-антитіло можна потім виявити за допомогою технологій детектування і/або візуалізації, відомих в даній галузі техніки. Зразок тканини в способі, описаному вище, може являти собою будь-який відповідний зразок тканини, наприклад, але не обмежуючись зазначеним, зразок сироватки, зразок тканини судин, зразок пухлинної тканини або тканини головного мозку; зразок тканини може бути з організму людини або тварини. Стадія контактування здійснюється у відповідних умовах для формування комплексу між антитілом або його фрагментом і ІСЕ1К, відомих фахівцям у цій галузі техніки. Стадія детектування може бути здійснена будь-яким підходящим способом, відомим в даній галузі техніки, наприклад, але не обмежуючись зазначеним, за допомогою оптичної візуалізації, імуногістохімії, молекулярної діагностичної візуалізації, ЕГІЗА (імуно-ферментний аналіз), візуалізуючої мас-спектрометрії або іншим відповідним способом. Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, виділене чи очищене антитіло або його фрагмент, зв'язаний з агентом, що детектує, можуть бути використані в імунологічних дослідженнях (ІА), включаючи, але не обмежуючись зазначеним, ферментативні ІА (ЕІА), ЕГІЗА, "швидке захоплення антигену", "швидкі хроматографічні ІА", і "швидкі ЕІА". (Наприклад, див Ріапспе еї аї, 2008; 5іоап єї аї, 2008; Ниб55тапп еї аї, 2007; Ми5пег егаї, 2007; Тигдеоп еї аї, 2003; Геппег вї аї, 2008).
Даний винахід також описує спосіб детектування експресії ІЗЕТК в суб'єкті іп мімо. Спосіб включає в себе введення одного або більше одного виділеного або очищеного антитіла або його фрагмента, як описано в даному документі, зв'язаного з детектуючим агентом, суб'єкту, потім детектування міченого антитіла або його фрагмента, зв'язаного з ІСЕ1К. Стадія детектування може включати в себе будь-який відповідний спосіб, відомий в даній галузі техніки, наприклад, але не обмежуючись зазначеним, РЕТ, 5РЕСТ або флуоресцентну візуалізацію або будь-який інший відповідний спосіб. Спосіб, як описано вище, може бути корисним при виявленні експресії ІСЕТК в кровоносних судинах або тканинах, наприклад, але
Зо не обмежуючись зазначеним, в пухлинних тканин.
Стадія детектування іп мімо способами, описаними вище, може включати візуалізацію всього тіла для діагностичних цілей або локальну візуалізацію в специфічних сайтах, таких як, але не обмежуючись зазначеним, судини головного мозку або пухлини судин головного мозку, в кількісному вираженні для оцінки прогресування захворювання або відповіді суб'єкта на режим лікування. Стадією детектування способами, описаними вище, може бути імуногістохімія або технологія неінвазивної (молекулярної) діагностичної візуалізації, в тому числі, але не обмежуючись зазначеним: - оптична візуалізація; - позитронно-емісійна томографія (РЕТ), в якій детектуючий агент являє собою ізотопи, такі як 11С, 13М, 150, 18Е, 64Си, 62С), 1241, 76Вг, 82 і 68сСа, причому 18Е є найбільш клінічно використовуваним; - однофотонна емісійна комп'ютерна томографія (5РЕСТ), в якій детектуючий агент являє собою радіоіїндикатор, такий як 99ттс, 1111п, 1231, 201ТІ, 133Хе, в залежності від конкретного застосування; - магнітно-резонансна томографія (МКІ), в якому детектуючим агентом може бути, наприклад, але не обмежуючись зазначеним, гадоліній, наночастини оксиду заліза і наночастини заліза-кобальту, покриті вуглецем, тим самим підвищуючи чутливість МКІ для виявлення бляшок; - контрастна ультразвукова ехографія (СЕО5) або ультразвук, де детектуючим агентом є щонайменше один акустично активний і газонаповнений мікроміхур. Ультразвук є поширеною технологією для скринінгу та раннього виявлення захворювань людини. Це дешевше МК або сцинтиграфії і безпечніше, ніж технології молекулярної візуалізації, такі як радіонуклідна візуалізація, так як не зв'язане з радіацією.
Даний винахід також стосується способу транспортування молекули, що представляє інтерес через гематоенцефалічний бар'єр. Спосіб включає введення молекули, зв'язаної з антитілом або його фрагментом, як описано в цьому документі, суб'єкту; антитіло або його фрагмент проходять гематоенцефалічний бар'єр. Молекула може бути будь-якою бажаною молекулою, в тому числі молекулою вантажу, як було описано раніше; молекула може бути "зв'язана" з антитілом або його фрагментом з використанням будь-якого відповідного способу, 60 включаючи, але не обмежуючись зазначеним, кон'югацію або експресію в злитому білку.
Введення може бути здійснено будь-яким підходящим способом, наприклад за допомогою парентерального введення, включаючи, але не обмежуючись зазначеним, внутрішньовенне (ім), підшкірні (5с) і внутрішньом'язове (іт) введення. У цьому способі антитіло або його фрагмент згідно з винаходом "переносять" молекулу, що представляє інтерес через гематоенцефалічний бар'єр до мішені в мозку.
Даний винахід також відноситься до композиції, що містить одне або більше виділене чи очищене антитіло або його фрагмент, як описано в цьому документі. Композиція може містити одне антитіло або фрагмент, як описано вище, або може являти собою суміш антитіл або їх фрагментів. Крім того, в композиції, що містить суміш антитіл або фрагментів відповідно до даного винаходу, антитіла можуть мати таку ж специфічність або можуть відрізнятися за своєю специфікою; наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, композиція може містити антитіла або їх фрагменти, специфічні до ІЕЕ (той же або інший епітоп).
Композиція може також містити фармацевтично прийнятний розчинник, ексципієнт або носій. Розчинник, ексципієнт або носій може являти собою будь-який відповідний розчинник, ексципієнт або носій, відомий в даній галузі, і повинен бути сумісний з іншими інгредієнтами композиції, зі способом доставки композиції і не бути шкідливим для суб'єкта. Композиція може бути в будь-якої зручної формі; наприклад, композиція може знаходиться в формі суспензії, формі порошку (наприклад, але обмежуючись ліофілізованій або інкапсульованій), в формі капсул або таблеток. Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, коли композиція знаходиться у формі суспензії, носій може містити воду, фізіологічний розчин, відповідний буфер або добавки для поліпшення розчинності і/або стабільності; реконструкція для отримання суспензії здійснюється в буфері при відповідному рН, щоб забезпечити життєздатність антитіла або його фрагмента. Сухі порошки можуть також включати добавки для поліпшення стабільності і/або носії для збільшення маси/об'єм; наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, композиція сухого порошку може містити сахарозу або трегалозу. У конкретно не обмежуючому прикладі композиція може бути сформована таким чином, щоб доставити антитіла або їх фрагменти в шлунково-кишковий тракт суб'єкта. Таким чином, композиція може включати в себе інкапсуляцію, вивільнення з часом або інші відповідні технології для доставки антитіла або його фрагмента. У компетенції фахівця в даній галузі техніки підготувати відповідні композиції, що містять дані сполуки.
Винахід також відноситься до способу кількісного визначення кількості молекули вантажу, що доставляється через ГЕБ суб'єкта, в якому молекула вантажу зв'язана з одним або більше виділеним або очищеним антитілом або його фрагментом, як описано в даному документі, причому спосіб включає стадії: а) збору спинномозкової рідини (СМР) у суб'єкта; і
Юр) використання цільових методів протеоміки для визначення кількості молекули вантажу, зв'язаного з одним або більше антитілом або його фрагментом, в спинномозковій рідині.
Молекула вантажу може являти собою будь-яку бажану молекулу, в тому числі молекули вантажу, описані раніше; виділене чи очищене антитіло або його фрагмент проходить через гематоенцефалічний бар'єр; і молекула може бути "зв'язана" з антитілом або його фрагментом з використанням будь-якого відповідного способу, включаючи, але не обмежуючись зазначеним, кон'югацію або експресію в злитому білку, як описано вище. В описаному вище способі СМР беруть у суб'єкта з використанням будь-якого відповідного способу, відомого в даній галузі.
Кількість СМР, необхідне для цільового методу протеоміки на стадії Б), може перебувати в діапазоні від приблизно 1 до 10 мкл; наприклад, кількість необхідної спинномозкової рідини може становити приблизно 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, або 10 мкл, або будь-яку кількість між цими значеннями, або будь-який діапазон, який визначається тільки що описаними значеннями. Антитіло або його фрагмент, зв'язане з молекулою вантажу, може бути введено суб'єкту до збору спинномозкової рідини. Може знадобитися відповідна затримка між введенням і доставкою антитіла або його фрагмента, зв'язаного з молекулою вантажу, через ГЕБ. Затримка може становити щонайменше 30 хвилин після введення антитіла або фрагмента, зв'язаного з молекулою вантажу; наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, затримка може становити щонайменше 30 хвилин, 1 годину, 1,5 години, 2 години, 2,5 години, З години, 3,5 години, 4 години, 4,5 години, або 5 годин. Цільові методи протеоміки, використовувані для визначення кількості одного або більше антитіла або його фрагмента, зв'язаного з молекулою вантажу, можуть бути будь-якими відповідними методами, відомими в даній галузі техніки. Наприклад, не в рамках будь-яких обмежень, цільовий метод протеоміки може бути методом мас-спектрометрії, таким як, але не обмежуючись зазначеним, моніторинг множинних реакцій з використанням ізото- мічених бо внутрішніх стандартів (МАКМ-ІІ5; см, наприклад, Наддапі єї а!., 2013), Перевага МЕМ полягає в тому, що він дозволяє провести швидку, чутливу і специфічну кількісну оцінку немічених цільових аналітів (наприклад, антитіла або його фрагмента, як описано в даному документі) в біологічному зразку. Можливість мультиплексування аналізу дозволяє кількісно оцінити антитіла або їх фрагменти і молекулу вантажу.
Даний винахід буде проілюстровано на наступних прикладах. Проте, слід розуміти, що дані приклади наведені тільки в ілюстративних цілях і не повинні використовуватися для обмеження обсягу винаходу будь-яким чином.
Приклад 1: Очищення рекомбінантного фрагмента ІСР1К
Рекомбінантний фрагмент позаклітинного домену ІЗЕТ1Е довжиною в 933 амінокислоти (показаний сірою рамкою на Фіг. 1; див. також амінокислоти 1-933 5ЕО ІО МО: 12) був підготовлений. Фрагмент складається з М-термінального 30 амінокислотного сигнального пептиду, повної альфа-субодиниці, сайту фурінового розщеплення (КККК, 5ЕБЕО ІЮ МО: 13; відокремлює альфа і бета субодиниці), а також більшої частини позаклітинної частини бета- субодиниці (Фіг. 1 і 2).
Клонування. Послідовність ІСЕТК ектодомена, що представляє інтерес, ампліфікували за допомогою ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) з використанням наступних праймерів: 5-ссвапАтТоСасСсСАССАТаААатТоТаастосСавада-3" (прямий; ЗЕО ІЮ МО:14) 5Б-астоТтАвпйАТСАСпСААатТТтТСАТАТОСТаттттас-3" (зворотний; ЗЕО ІЮ МО:15) і субклонуровали в сайт Зта! риС19. Послідовність ІЗЕ1ЕУ33 потім субклонуровали в роОмМаА/Мус-Нів (Іпмігодеп), щоб створити р ІЗЕ1К995-Ні5 для експресії Ніз-міченого ектодомена, як описано раніше (Ззатапі еї а. 2004).
Перехідна трансфекція. Частинки лентивірусів, що експресують ІЗЕ1К93-Нібв, були отримані в пакуючій клітинній лінії 2935Е-Расі М, як детально описано раніше (Вгоиззаий еї аї., 2008).
Якщо коротко, клітини були трансфіковані вектором з використанням поліетиленіміну. Свіже середовище (І С-5ЕМ (безсироватковане середовище з низьким кальцієм)), що містить 1 мкг/мл доксицикліну і 10 мкг/мл кумату, додавали до клітин через 5 годин після трансфекції, і супернатант, що містить ЇМ частки, був зібраний після 48-72 годин, його концентрували за допомогою ультрацентрифугування при 100000 д протягом 2 годин при температурі 4 "С на підкладці 20 95 сахарози (Сайеї В еї а). 2007), ресуспендували в /С-5ЕМ середовищі,
Зо доповнене 1 95 ЕВ5 (фетальна бичача сироватка), і зберігали при -70 "С до використання.
Стабільна експресія. Стабільна клітинна лінія, 2935Е-сит2-СВ5-ІС2Е1В8-НІіх, була згенерована трансдукцією клітинних ліній 2935Е-Сцт2 з відповідними лентівірусними частинками з використанням протоколу, описаного раніше (Саїйеї В еї аІ. 2010). Якщо коротко, 0,5-1,0 х 105 29356Е-Сцт2 клітин висівали в 24-лункових планшетах в 200 мкл ІС-5ЕМ середовища без декстрансульфатом. Суспензія І М була отримана змішуванням 200-500 мкл І М з 8 мкг/мл полібрену і інкубуванням протягом 30 хвилин при 37 "С. Свіжоприготовлену суспензію
ЇМ додавали до клітин через 4 години після посіву. Після 24 годин 500 мкл середовища з додаванням декстрансульфату додавали до клітин. Для підвищення рівня експресії клітини були знову трансдуковані до 6 разів з використанням того ж протоколу після 3-4 діб відновлення клітин. Нарешті, клітини були розмножені в 6-ти лункових планшетах і колбах шейкерах.
Великомасштабне виробництво білка і очищення. Клон, ідентифікований як найбільш високопродуктивний, був розмножений у колбах шейкерах або центрифужних колбах.
Продукування білка ініціювали додаванням 1 мкг/мл кумату до свіжої середовищі, після чого 24 год. інкубували при 37 "С і 4-8-діб інкубували при 30 "С. Клітини видаляли центрифугуванням і супернатант фільтрували і концентрували (10х) з використанням систем тангентальної потокової фільтрації (касети ультрафільтрації Реїїїсоп, ЕМО МиійШіроге).
ІСЕТУ33-Нів очищали з використанням колонки НіхРгер (ЗЕ Неаксаге) відповідно до інструкцій виробника. Якщо коротко, концентрований зразок наносили на Ніз-Ргер ЕЕ (16/10) колонку (СЕ Неаїсаге), калібрували і промивали 50 мМ фосфатом натрію, 300 мМ масі, 5 мм імідазолу з рН 7,5 іелюювали 50 мМ фосфатом натрію, 300 мМ Масі, 500 мМ імідазолу, рН 7,5.
Стадію елюювання з 0,1 М цитратом натрію рН 4,5 - рН 2,5 використовували для елюювання білка і збирали пікові фракції. Зміну буфера здійснювали шляхом ультрафільтрації з використанням 50 кДа відтинає мембрани або знесолювальної колонки з буфером, що містить 50 мМ фосфату натрію, 150 мМ Масі і 0,01 95 Тумееп-80, рН 7,2. Чистоту обох білків перевіряли за допомогою 5О5-РАСЕ і зберігали їх при -80 "С до використання (див. наступні приклади).
Приклад 2: Імунізація лами і сироваткова відповідь
Для виділення МНН, націлених на позаклітинний домен ІСЕЇ1К, лама була імунізована рекомбінантним ІСЕ1КО933-Ніх фрагментом, отриманим в Прикладі 1.
Одного самця лами (Гата діата) імунізували шляхом підшкірної ін'єкції І5Е1кКУ933-Нів бо рекомбінантного антигену (Приклад 1) у нижню частину спини. В 1 добу 200 мкг антигену,
розведеного в РВ5З до 1 мл вводили разом з 1 мл повного ад'юванта Фройнда (5ідіта, 51. І оців,
МО). Ще три ін'єкції 100 мкг ІСЕ1КУ33-Нізх антигену з неповним ад'ювантом Фройнда (5Зідта) були виконані на 22, 36 і 50 добу. Остаточну ін'єкцію 100 мкг антигену без ад'юванта проводили на 77 добу. Преїмунізовану кров відбиралась до першої ін'єкції на 1 добу і слугувала в якості негативного контролю. Проби крові (10-15 мл) збирали на 29, 43, 57 і 84 добу. Кров, взята на 84 добу, була оброблена негайно з виділенням мононукліарних клітин периферичної крові (РВМО).
Кров розводили 1:1 з РВ5 і РВМС виділяли з крові за допомогою І утрпоргер Тибе (Ахі5 ЗПіеєїа).
Клітини підраховували і зберігали у вигляді аліквот приблизно 1х107 клітин при температурі - 80 "С для подальшого використання.
Преіїммунізовану і постімунізаційну загальну сироватку аналізували на специфічний відповідь на ІЗЕ1КУз3-Ні5 антиген за допомогою ЕГІ5А на 57 добу. Сироватка лами з 84 діб була фракціонована як описано раніше (Ооуїе еї аї, 2008). Отримані фракції АТ (НСАБ), А2 (НСАБ),
С1 (НСАБ) і 02 (сід) аналізували на специфічне зв'язування з ІЗЕ1КУ33-Ні5 антигеном за допомогою ЕГІ5А. Якщо коротко, 5 мкг ІСЕ1К933-Ніх рекомбінантного антигену, розведеного в
РВ5, інкубували протягом ночі (100 мкл/лунку, 18 ч, 4 "С) в 96-лункових планшетах Махізогр (Маїдепе, Мипс) для покриття планшетів. Планшети блокували бичачим сироватковим альбуміном (ВБА), промивали РВЗ-Ї (РВ5--0,05 95 (об/06) Тмееп-20) і наносили серійні розведення преїіммунізірованной загальної сироватки, постімунізованої загальної сироватки (57 доба) і фракціонованої сироватки (84 добу). Після інкубації при кімнатній температурі протягом 1,5 год. планшети промивали РВ5-Т перед додаванням козячого анти-лама дос (1: 1,000 в РВ5) і інкубацією протягом 1 год. при 377" С. Після промивання РВ5-Ї додавали свинячий анти- козячий дО НЕР (пероксидаза хрону) кон'югат (1:3,000 в РВ5) і планшети інкубували протягом 1 год. при 37 "С. Остаточну РВ5-Ї промивку проводили перед додаванням 100 мкл/лунку субстрату ТМВ (тетраметілбензідіновий субстрат) (КРІ., сайпегериго, МО); субстрат інкубували протягом 10 хв. Реакцію зупиняли за допомогою 100 мкл/лунку 1 М НзРоОх. Оптичну щільність зчитували при довжині хвилі 450 нм.
Приклад 3: Побудова бібліотеки і вибір ІСЕТЕ. зв'язують УНН
Бібліотека МнН гіперімунізованих лами була побудована на основі РНК, виділеної з РВМС в
Прикладі 2.
Побудова бібліотеки і пеннінг проводили по суті як описано раніше (Аграрі-Сснангтоцаї еї аї, 2009а, 20096; Таппа еї аї, 2003). Загальну РНК виділяли з приблизно 107 РВМС, зібраних на 84 добу постімунізації (Приклад 2) за допомогою ОіАатр міні набору для виділення РНК з крові (Оіадеп). Приблизно 5 мкг загальної РНК використовували як матрицю для синтезу першого ланцюга кДНК з оліго а8Т праймерами з використанням набору для синтезу першого ланцюга синтезу КкКДНК (СЕ Неайсаге). кКДНК ампліфікували за допомогою еквімолярної суміші трьох смислових праймерів, специфічних до варіабельної області:
Ма: 5е-асссдасссассАтасссзМКОИОТтасСАаасСстастааАКктСтассавоА-3 (БО І
МО:16) мо2:5-ЯССсСАасСсаасССАтТааСсССАасатААдАласСстааасадстСтасассоА-3 (ЗБЕО (І
МО:17) моз:5-асссАдассасасСсАтаасоСсАааасСстАсватАСсАаасСстаатасАатст-3 (5БЕО І
МО:18), і двох антисмислових СН2-специфічних праймерів:
СНн2г: 5-сСасСссСАТСАДИастТАССАИТтТТад-з (5ЕО О МО:19)
СНарз: 5-СсССсИ)ИОТАССТаТатСАТССАСОСАССАаТсСтТад-зЗ (5ЕО ІЮ МО:20).
Якщо коротко, реакційна суміш ПЛР була створена в загальному обсязі 50 мкл з наступними компонентами: 1-3 мкл кКДНК, 5 пмоль суміші МО1-3 праймерів, 5 пмоль СН2 або СН2ЬЗ праймерів, 5 мкл 10х реакційного буфера, 1 мкл 10 мМ днтФ, 2,5 одиниці Тад ДНК полімерази (Нойтапи-Га Коспе). Протокол ПЛР складався з (І) початковій стадії при 94 "С протягом З хв, (ІЇ) потім 30 циклів при 94 "С протягом 1 хв, 55 "С протягом 30 сек, 72 "С протягом 30 сек і (ІІІ) кінцевої стадії елонгації при 72 "С протягом 7 хв. Ампліфіковані продукти ПЛР проганяли в 2 9о агарозному гелі і спостерігали дві основні смуги: смугу приблизно 850 п.о. (пара основ), що відповідає звичайному ІдсС, і другу смугу приблизно 600 п.о., відповідну МнН-СН2 області важкого ланцюга верблюжого антитіла. Менші смуги вирізали і очищали з використанням набору для гель екстракції ОІіАдціск (Оіадеп) і повторно ампліфікували в другій ПЛР в загальному обсязі 50 мкл з використанням 1 мкл (30 нг) матричної ДНК, 5 пмоль кожного з М.)7 (5- САТтататАасАастоа,асааоССАаоСааССАТОИСОС-3 ЗЕО ІЮ МО: 21) і МуО8 праймерів (5'-
САТОТаТтТАСАТТССТООССООССТООССсТОАОСАСАСОСТОАССТОо -3 5ЕО І МО: 22), 5 мкл 10х реакційного буфера, 1 мкл 10 мМ дНТФ, 2,5 одиниці Тад ДНК полімерази. Протокол бо ПЛР складався з (І) початковій стадії при 94 "С протягом З хв, (Ії) 30 циклів при 94 "С протягом
30 сек, 57 "С протягом 30 сек і 72 "С протягом 1 хв ії (ІІ) кінцевої стадії елонгації при 727 протягом 7 хв. Ампліфіковані продукти ПЛР в діапазоні від 340 п.о. до 420 п.о., відповідні МНН фрагментами важкого ланцюга антитіла, очищали з використанням набору для очищення ПЛР
ОіадепоОІАдиіск (Сіадеп), розщеплювали рестриктазой ЗЛ (Мем/ Епдіапа Віоіаре) ії знову очищали з використанням такого ж набору. 80 мкг фагмідного вектора рМЕЮО1 (Аграрі-зпапгоцчаі еї аі, 20095) розщеплювали за допомогою 5ІЇ протягом ночі при 50 "С. Для того, щоб звести до мінімуму самолігірування, додавали 20 одиниць рестриктаз ХпоЇ і Рей, щоб відсікти вирізані фрагменти, і реакцію розщеплення інкубували протягом ще 2 год. при 37 "С. 60 мкг розщепленої фагмідной ДНК лігували з б мкг розщеплених (5ЛІ протягом 5 год. при 50 С) МНН фрагментів (мольне співвідношення 1:1) протягом З год. при кімнатній температурі з використанням системи швидкого ДНК лігірування ГідаБаві (Рготеда) відповідно до інструкції виробника. Лігіровані плазміди очищали з використанням набору для очищення ПЛР ОіІАдиісК (Оіадеп), елюювали в кінцевому обсязі 100 мкл і трансформували в електрокомпетентні ТО1 БЕ.соїї (5ігагадепе), використовуючи 5 мкл аліквоти лігірованої ДНК на реакцію трансформації, як описано раніше (Агбарі-Спангоицаі еї аї, 20095). Розмір бібліотеки було визначено як 5х107, як описано в Аграрбі-
Спапгоцаї єї аї, 20090. 20 клонів були секвеніровані і містили всі унікальні послідовності УнН.
Е.соїї, що містять бібліотеку, культивували протягом 2-3 г при 37 "С, 250 оборотів в хвилину в присутності 2 95 (маса/об'єм) глюкози. Потім бактерії осаджували, знову суспендували в 2ХиАтр/СіІи (2хуТ середовище (екстракт дріжджів ї- триптон) з 100 мкг/мл ампіциліну ії 2 95 (маса/об'єм) глюкози) з 35 95 (0б/об) гліцерину і зберігали при - 80 "С в невеликих аліквотах.
Пеннінг експерименти по суті проводили як описано у Аграбі еї аїЇ, 1997. Два мілілітра бібліотеки (2,0х1010 бактерій) розморожували на льоду і вирощували в 2хуТ/Атр/сіІи протягом приблизно 2 годин при 37 "С (АбОО-0, 4-0,5). Е.соїї були згодом інфіковані 20х надлишком
М13КО7 хелпер-фага (Мем/ Епдіапа Віоїар5) протягом 1 год. при 37 "С. Потім культуру центрифугировали при 4 "С ії гранули інфікованих бактерій повторно суспендували в 200 мл 2ХхИ/Атр з 50 мкг/мл канаміцину і інкубували при 37 "С і 250 оборотах в хвилину. Частинки фага в супернатанті культури інкубували з 1/5 об'єму 20 95 ПЕГ (поліетиленгліколь) 8000/2,5М масі на льоду протягом 1 год. і центрифугували при 10000 оборотах на хвилину протягом 15 хв.
Зо Гранули фага повторно суспендували в 1,5 мл стерильному РВ5, титровали і використовували в якості вхідного фага для пеннінга. Для раунду пеннінга 1 9б-лункові планшети Махізогр м покривали 10 мкг рекомбінантного ІЗЕ1К933-Ніє на лунку в 100 мкл РВ5 протягом ночі при температурі 4 "С. Лунки промивали РВ5 і блокували РВ5 з 1 95 (маса/об'єм) казеїном протягом 2 годин при температурі 37"СРВЗ5 і блокували РВЗ5 з 1 95 (маса/об'єм) казеїном протягом 2 годин при температурі 37 "С. Приблизно 1072 фагів були додані в лунки після блокування і інкубовані протягом 2 год. при 37 "С. Після 10-кратного промивання РВБЗ/О,1 95 (06/06) Ту'ееп-20 зв'язані фаги елюювали за допомогою 0,1 М триетиламіну, нейтралізували (50 мкл 1М Тріс-НСІ, рн 7,4) і змішували з експоненціально зростаючою ТО1 Е.соїї. Проводили титрування елюїрованого фага і інфіковані бактерії повторно інфікували М13КО7 і вирощували протягом ночі при 37 "с.
Очищений фаг вирощеної протягом ночі культури використовували в якості вхідного для наступного раунду пеннінга. Пеннінг продовжували ще протягом трьох раундів.
Використовували той же самий протокол, як описано вище, за винятком того, що кількість рекомбінантного антигену, використаного для покриття чашок, було зменшено до 7 мкг, 5 мкгі 5 мкг для другого, третього і четвертого раундів пеннінга відповідно.
Окремі колонії ТО1, отримані після четвертого раунду пеннінга, були піддані фаговому
ЕГІЗА скринінгу, по суті як описано в іншому документі (Осуїе еї аї, 2008), за винятком того, що
Бмкг/мл ІСЕ1К933-Ніє рекомбінантного антигену, що використовували для покриття мікротитраційних планшетів. Всі позитивні клони були спрямовані на секвенування ДНК.
Унікальні клони, які давали високі фагові ЕГІ5ЗА сигнали, були обрані для великомасштабної експресії і очищення з використанням відомих методів (Приклад 4). Клон з дубльованим ІСЕТЕ-
З був ідентифікований для подальшого вивчення; його послідовність показана нижче.
ОУКІГЕЕЗОССИЇ МОАЛССИБІ ВІ БСЕУБасТУ5РТАМОУМЕВОАРОКЕКЕРУСНІТУЗНИатТАМА5З5
МКОВЕТІЗАОЗАКМТУМІ ОММ5І КЗЕОТАМУУСААЗБТРІ ВІ/'РЕЕЗАУТУУСОСТОМТУ55 (5ЕО І
МО:5)
Приклад 4: Гуманізація ІСЕ1НК-4
Для того щоб уникнути потенційної імуногенності ІЗЕ1К-4, отриманого від лами, при застосуванні в якості переносника терапевтичних агентів через ГЕБ, отримані від верблюда 5аАБВ були "гуманізовани" мутацією "верблюжих" залишків в МНН. Слід зазначити, що з метою гуманізації нумерацію за Кабаї (Кабраї еї аІї, 1991) використовували для ідентифікації СОК бо залишків.
ЗО-моделювання структури верблюжих УнН. Матричні структури, аналогічні ЗЕ1К-4 УНН, були ідентифіковані за допомогою пошуку ВГАЗТ в Ргоївіп ЮОаїа Вапк (РОВ). 30 структура
ІСЖЕТА-4 була аппроксимована за допомогою моделювання гомології, заснованого на АККРІ|В (код РОВ | ІО ланцюга) в якості основної матриці, з додатковими даними від 4ЕНВІО. Структура
ІСЖЕТА-4 МНН була потім побудована шляхом введення мутації основної структури матриці послідовності ІСЕ1К-4; це включало 35 мутації в різних позиціях. Модель ІБЕ1К-4 МНН була потім вдосконалена шляхом енергетичної мінімізації за допомогою АМВЕК силового поля і ступеневої звільнення обмежень, починаючи від СОК петель, які були послаблені в першу чергу, і до важких атомів основного ланцюга каркасної області, яка була повністю розслаблена лише на останній стадії. СОБК-НЗ петля моделі МНН потім була доопрацьована шляхом конформаційної вибірки Монте-Карло-мінімізації (МСМ), в якій двогранні кути в СОБ-НЗ області відбиралися з подальшою мінімізацією енергії.
Вибір каркасу людських важких ланцюгів для верблюжої СОК. Каркас людського важкого ланцюга був обраний стандартним порівнянням гомології послідовностей в базах даних зародкової лінії людини (УВАЗЕ), в порівнянні з іншими базами даних послідовностей (СепВапк і Зу/55Рго)), а також в порівнянні з консенсусними людськими каркасними послідовностями.
Пошуки ВІ А5бТ були проведені, щоб отримати збіги послідовностей з найвищою гомологією тільки в каркасній області (тобто, виключаючи СОК), з зіставленням довжини СОК. Найближчі людські каркаси, певні для ІЗЕ1К-4 МНН, відповідали людській МН-3 підгрупі. Кілька людських зародкових каркасних МН-3 послідовностей, які найбільш близькі до І(ЗЕ18-4 УНН, також були збережені на додаток до людській МН-3 консенсусної послідовності. У ІЗЕ1К-4 МНН каркасних послідовностях 18 мутацій необхідно для того, щоб прийти до людській МН-3 консенсусної послідовності для 100 95 гуманізації каркасу.
Визначення каркасних залишків для зворотних мутацій. Модель ІЗЕ1К-4 МНН і її повністю гуманізований аналог характеризувалися для оцінки індексу людяності, індексу схильності до контакту з антигеном, для визначення СОК, канонічних залишків, незвичайних каркасних залишків, потенційних сайтів глікозилювання, прихованих залишків, залишків зони верньєри, а також близькості до СОМ. Аналіз цих даних дозволив сконструювати кілька гуманізованих варіантів для анти-ІСЕТА УНН, причому кожен варіант мав різну кількість зворотних мутацій до
Зо батьківських верблюжих залишків в різних позиціях. 6 гуманізованих варіантів були розроблені для ІСЕ1К-4 УНН ПсЕ18-4 НІ-ІСЕТВ8-4 НО), де варіанти містять до 10 зворотних мутацій. Деякі з цих верблюжих залишків із зворотними мутаціями були приховані всередині ядра домену МнН і, отже, не індукували імунну відповідь.
Приклад 5: Експресія і очищення обраних конструктів УНН
ІСЕТА-4, визначені в Прикладі 3, і гуманізовані варіанти, сконструйовані в Прикладі 4 (спільно іменовані тут "МНН конструкти") субклонували в експресуючі плазміди для білкової експресії і очищення.
Очищали р фагмідний вектор, що містить ДНК УНН ІСЕ1 8-4 клону, з використанням набору
Міпіргер (Оіадеп). ІСЕ1А-зв'язуючий МНН ІСЕ1ІН-4 був ампліфікований шляхом ПЛР з фагмідного вектора РМЕО1 з додаванням М-термінального сайту розщеплення ВБр5і і сайту розщеплення Ватні на С-кінці, з використанням праймерів: 5-ТАТаААаАСАССАсСассСсАаатТААласСтасАацАатст-3" (прямий; ЗЕО ІЮ МО:23) 5У-паттСбаадтостадааАдаАСастаАдссСта-3" (зворотній; зЗЕО ІЮ МО:24)
ПЛР-фрагмент і експресійний вектор рБОУБ2Н розщеплювали рестриктазами Вр5ї ї Ватні (МЕВ) у відповідності з інструкцією виробника. Після розщеплення кожен розщеплений ІСЕ1К-4
МНН фрагмент лігували з розщепленим експресійним вектором реуУг2нН з використанням способів, аналогічних тим, які описані у Аграрі-зпангоцаї еї аї. (20095); Продукти лігування були потім трансформовані в електрокомпетентні ТО1 Е.соїї. Клони були відібрані на І В-чашках з агаром «т 100 мкг/мл ампіциліну і верифіковані секвенуванням ДНК.
Гуманізовані клони були синтезовані і безпосередньо клоновані в реуг2Н аналогічно тому, як описано вище, і потім трансформовані в ТО1 Е.соїї і відібрані, як описано вище.
Експресія білка. Всі конструкти ІСЕ1К-4 УНН експресували в ТО1 Е.соїї. Отриману протягом ночі культуру в ГВ/Атр/СІи середовищі (ІВ середовищі з додаванням 100 мкг/мл ампіциліну і 1 95 глюкози) пересівали при розведенні 1:100 в 1 л | В/Атр/сЗін. Експресію білка індукували при
ОЮвоо (оптична щільність) 0,8-0,9 додаванням ІРТО (ізопропілтіогалактозид) до кінцевої концентрації 0,2 мМ. Культуру вирощували при 220 оборотів в хвилину протягом ночі при температурі 37 "С. Бактерії гранулювали центріфугуванням при 6000 обертах на хвилину протягом 12 хв; гранули повторно суспендували в 35 мл холодного буфера ТЕЗ (0,2 М Тріс-СІ рН 8,0, 20 95 сахарози, 0,5 мМ ЕДТА (етилендіамінтетраоцтової кислоти)). Суспензію інкубували бо на льоду і струшували через кожні 10 хв протягом 1 години. Потім додавали 45 мл холодного
ТЕЗ (1/8 обсягу від загального обсягу) і негайно струшували протягом 1 хвилини і протягом 15 секунд кожні 10 хв після цього протягом 1 години для вилучення білка з періплазми. Отриманий супернатант, що містить УнН, фільтрували через 0,22 мкм мембрану і діалізували протягом ночі за допомогою буфера А імобілізаційної метал-афінної хроматографії (ІМАС) (10 мМ НЕРЕЗ(4- (2-гідроксиетил)піперазин-1-етансульфоновая кислота) рН 7,0, 500 мм Масі). Білок очищали з використанням колонки НіТгтар СПеїайпуд НР (СЕ Неакйсаге), як описано раніше (Аграбі- свпангоцаї 20095). Елюїровані білкові фракції аналізували за допомогою 505-РАСЕ і вестерн- блот, перш ніж діалізували проти РВ5, як описано раніше (Аграрі-спапгочаї 20095). Очищені білкові фракції об'єднували і діалізували проти РВ5-З3 мМ ЕДТА, і визначали концентрацію білка.
Приклад 6: Біофізична характеристика анти-ІСЕ1 В УНН ІСЕ1 8-4
Анти-ІЯЕТА МНН 12БЕ1А8-4 конструкти, експресовані і очищені в Прикладі 4, були охарактеризовані за допомогою ексклюзійної хроматографії (ЗЕС), аналізу температури плавлення і поверхневого плазмонного резонансу.
Ексклюзійна хроматографія: ексклюзійна хроматографія з використанням зирегдех "м 75 (СЕ
Неапйсаге) була проведена для усунення будь-яких можливих агрегатів до початку аналізу поверхневого плазмонного резонансу (5РК). В якості робочого буфера використовували 10 мМ
НЕРЕЗХЗ, рН 7,4, що містить 150 мМ Масі, З мМ ЕДТА і 0,005 95 Р20. Ексклюзійна хроматографія: ексклюзійна хроматографія з використанням Зирегаех "м 75 (СЕ Неакрсаге) була проведена для усунення будь-яких можливих агрегатів до початку аналізу поверхневого плазмоного резонансу (ЗРК). В якості робочого буфера використовували 10 мМ НЕРЕЗ5, рн 7,4, що містить 150 мМ масі, З мМ ЕДТА їі 0,005 95 Р20. Концентрації фракцій, використовуваних для 5РК аналізу, визначали шляхом вимірювання оптичної щільності при довжині хвилі 280 нм. За результатом аналізу ЗЕС все ІБЕТК-4 МНН конструкти крім НІ були мономірними в розрахунку на елюїруючий обсяг у порівнянні зі стандартами (Фіг. З А). ІЗЕ1К-4 НІ був виключений з подальших оцінок.
Температура плавлення: Термічну стабільність ІСЕ1К-4 МНН їі гуманізованих конструктів оцінювали з використанням вимірювання температури плавлення (Тт) за допомогою СО- спектроскопії. Спектрополяриметр абсо .)-815, оснащений термоелектричною системою
Зо контролю температури типу РеШег (абсо, Еазіоп, МО, О5А), був використаний для проведення експериментів. Використовувалася СЮО-кювету з довжиною шляху 1 мм. Спектри реєстрували в діапазоні довжин хвиль від 180 до 260 нм зі швидкістю сканування 50 нм/хв, цифровий час інтегрування (0ІТ) 4 сек, ширина смуги 1 нм, крок даних 1 нм їі час інтегрування 1 сек. Для вимірювання температури плавлення або Тт (Сгеепієії9, 200ба; 20065) спектри СО були записані в температурному діапазоні від 30 С до 96 "С. Всі спектри СО були відняті з бланкового значення, відповідного спектрами буфера. Виміри проводилися з концентрацією 50 мкг/мл МНН в 100 мМ натрій-фосфатному буфері, рН 7,4. Денатурацію білка, викликану нагріванням, контролювали при 210 нм для всіх варіантів. Фракція фолдинга (Я) була отримана за формулою, описаною в (Сгеепієїй, 200ба; 20066); т-се-(еї|ю/(еїв-(е|м) формула де (Ф|г є молярною еліптичністю при будь-якій температурі, (Ф| Е являє собою молярну еліптичність повністю укладеного білка при температурі 30 "С і (Ф|0 є молярна еліптичність розгорнутого білка при 90 "С. Температуру плавлення (Тт) отримували в середній точці кривої розгортання (фракція фолдинга (її) в залежності від температури) за допомогою підбору кривої нелінійної регресії (сигмовидне рівняння Больцмана) з використанням графічного програмного забезпечення СгарпРаай Ргізт (версія 4.02 для М/іпаом/5). Температури плавлення (Тт) МнН були визначені на основі даних еліптичності, які передбачають два стану системи, що знаходиться у відповідності з кривими денатурації, що спостерігаються, відповідними до різкого переходу до денатурації. Значення Тт були взяті в середній точці сигмоїдальних кривих денатурації фракції фолдінга (її) в залежності від температури.
Результати показані на Фіг. З В. Температури плавлення гуманізованих УнН НЗ, НА ї Н5 були покращені (підвищені) в порівнянні з ІЗЕ1К-4 МНН, що передбачає поліпшені біофізичні властивості. Гуманізовані конструкти Н2 і Нб мали нижчу температуру плавлення в порівнянні з
ІСЕТВ8-4 УНН. На відміну від ІЗЕ1К-4 УНН жоден з гуманізованих УНН не зазнавав рефолдінгу після теплового впливу.
Поверхневий плазмонний резонанс (РК): Зв'язування мономірних ІЗЕ1К-4 МНН конструктів з іммобілізованим рекомбінантним людським ІСЕТК (Приклад 1) визначали за допомогою 5РЕ з використанням ВІАСОКЕ 3000 (СЕ Неакйсаге). Приблизно 3000 резонансних одиниць (КИ) рекомбінантного людського ІЗЕТК іммобілізували на сенсорному чіпі СМ5. Іммобілізацію бо проводили при концентрації 10 мкг/мл в 10 мМ ацетат при рН 4,0 з використанням набору для зв'язування аміну, що поставляється виробником. Решта сайтів зв'язування блокували за допомогою 1 М етаноламіну з рН 8,5. Блокована етаноламіном поверхня була використана в якості референсної поверхні. Для досліджень зв'язування аналізи проводилися при 25 "С в 10 ММ НЕРЕ5, рН 7,4, що містить 150 мМ Масі, З мМ ЕДТА ї 0,005 95 поверхнево-активна речовина Р20 (поліоксиетіленсорбітан; СЕ Неайсаге). Різні концентрації ІЗЕ12К-4 МНН вводили через іммобілізований людський ІСЕТК і референсні поверхні при швидкості потоку 20 мкл/хв.
Поверхню регенерували 10 мМ гліцином, рН 2,0, з часом контакту 24 секунди. Дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення ВіАемаЇчайоп 4.1 (ЗЕ Неайсаге).
Сенсограмми на Фіг ЗС показують, що дані співвідносяться з моделлю 1:1, що дає КО і "швидкості дисоціації", показані в Таблиці 1. Це вказує на те, що ІСЕТЕ-4 і гуманізовані варіанти є високоаффінними однодоменними антитілами, які зв'язуються з позаклітинним доменом людського ІСЕТЕ.
Таблиця 1
Афінність ІСЕТК-4 конструктів до людського ІСЕТК, визначена за допомогою ЗРК нин СТ я ПО оз по
Аналізи 5РЕ були в подальшому використаний для демонстрації того, що ІЗЕ12-4 МНН не зв'язується з тим же епітопом на рецепторі що і природний ліганд ІСЕ-1 (Фіг. 30). Експеримент планували, проводили і аналізували, як описано вище. Зв'язування з поверхнею свіжоїммобілізованного людського ІСЕ1К вивчалося шляхом ін'єкції людського ліганда ІСЕ1 при концентрації 25хКо з подальшої спільної ін'єкцією ІСЗЕ1К-4 при концентраціях 25хКо при швидкості потоку 20 мкл/хв і часом ін'єкції 5 хвилин. Поверхні регенерували промиванням робочим буфером. Природний ліганд ІСЕ1 зв'язував рецептор з насиченням, що досягає 70КИ;
ІСЕТВА-4 УНН зв'язувався з комплексом ІСЕ1К-ІСН1 з очікуваним -265ЕК) (в відносних одиницях; насичення зв'язування). Одночасне зв'язування ІСЕ1К-4 МНН і ІСЕ1 з рецептором показує, що вони обидва зв'язуються з різними епітопами.
Перехресну реактивність зв'язування ІЗЕ1К-4 з людським інсуліновим рецептором також оцінювали за допомогою ЗРК. Експеримент планували, проводили і аналізували, як описано вище. Якщо коротко, крім людського ІЗЕТКЕ, приблизно 4000 резонансних одиниць (КШ) рекомбінантного людського інсулінового рецептора (К 85 О Зувієтв) іммобілізували на окремій клітці на сенсорному чіпі СМ5. Поверхні обробляли різними концентраціями ІСЕ1К-4 (0,5-5О0НМ).
Зо У той час як зв'язування з ІЗЕ1ЇК можливо було спостерігати вже при 0,5н8М ІСЕТК-4, зв'язування з поверхнею інсулінового рецептора не спостерігалося навіть при 50 нМ (Фіг. З Е), що передбачає, що ІСЕ1К-4 не може зв'язуватися з інсуліновим рецептором.
Приклад 7: Поглинання ІСЕ1К-4 ендотеліальними клітинами головного мозку
Для того, щоб визначити, поглинається чи ІСЕ1Е-4 клітинами, клітини ххАКВЕС інкубували з
Суб-5-міченим ІСЕТРЕ-4.
ІСЖЕТА-4 МНН мітили МНЗ-Су5.5. Мічення проводилося через стійкий амінний зв'язок між первинними амінами (на М-кінці і/або на лізінових бічних ланцюгах білка) і МН5 складного ефіру.
Як правило, 10 95 об/о0б6 1М карбонатного/бікарбонатного буфера (759 мМ бікарбонату, 258 ММ карбонату) рН 9,3 додавали в 4 мг УнН, приготованого в РВ5 (1,06 мМ КНеРО», 154 мМ Масі, 5,6 мМ МагНРО»), рН 7,4, і доводили до кінцевої концентрації 4 мг/мл. МН5З-Су5.5, розчинений в рМ5О (диметилсульфоксид) при 10 мг/мл, додавали при 2Х мольному співвідношенні барвника до білка. Суміш інкубували при кімнатній температурі протягом 2 год. з декількома інверсіями в 1,5 мл мікроцентріфужній трубці. Після інкубації незв'язаний барвник і бі-продукти реакції фільтрували за допомогою знесолювальних колонок для центрифугування 2ера, 7ИК МУУСО (Ріегсе) і вимірювали за допомогою спектрофотометра Весктап 0530 (компанії ВесКтап
Соццег). Суб.5-мічені І(ЗЕ12-4 або ЕС5 як позитивний контроль (1 мг/мл) інкубували з 5У40 імморталізованних ендотеліальними клітинами мозку щура (5хАКВЕС) при 4 "С (Фіг. 4, верхні блоки), що дозволяло протікати тільки пасивному, неспецифічному транспортному механізму, або при температурі 37 "С (Фіг. 4, нижні блоки) для протікання активного транспорту, такого як рецепторно-опосередкований ендоцитоз. Спільне фарбування агглютинином зародків пшениці і
БАРІ проводили для візуалізації поверхні клітини і ядра відповідно. Клітини спостерігали під флуоресцентним мікроскопом і отримували зображення.
У разі інкубації при 4 "С ІСЕ12К-4 був виявлений поза клітинами, спільно локалізується з клітинної мембраною, пофарбованої агглютинином зародків пшениці. На противагу цьому, при інкубації при 37 "С ІСЕ1ТК-4 накопичувався в везикулах всередині клітин, ймовірно ендосомах, що передбачає, що поглинання антитіл клітинами відбувається шляхом активного транспортного механізму. Подібна поведінка спостерігалося і для ЕС5, для якого раніше було показано, що він потрапляє в клітини за допомогою енергозалежного ендоцитозу за допомогою везикул з клатріновим покриттям (Абиїгобр ує аіІ.2005).
Приклад 8: Отримання ІСЕ1К-4-тЕс конструкту
Конструкти, які містять ІЗЕ1ТК-4 УНН, злиті з кристалізуємим фрагментом мишачого антитіла (Ес; тЕс2р), отримували, експресували і виділяли. Послідовність ІЗЕТК-4-тптЕс конструкту показана на Фіг. 5А, схема молекули показана на Фіг. 5В. Злитий білок також містив М- термінальний сигнальний пептид (МЕБСЇЗУУМРІ МА КОМОС; 5ЕБЕО ІЮО МО: 37), який не показаний в послідовності на Фіг. 5А.
ІСЕТВА-4 кДНК клонували в експресійний вектор ссавців рТТ5 (ЮОигоспег, 2002), що містить мишачий фрагмент Ес2б. Поліплекси отриманого вектора були попередньо отримані змішуванням 25 мл розчину плазмідної ДНК, що містить 187,5 мкг рТТ5-ІК5тЕс26, 56,25 мкг ртгтТт-АКтТай (активоване мутант протеїнкінази В), 18,75 мкг рІТо-сОЕР (для контролю ефективності трансфекції) і 112,5 мкг ДНК яєчок лосося (5ідта-А|агісп); і 25 мл розчину РЕЇ (поліетиленімін), що містить 1,125 мг РЕЇІргоТМ (РоїуРіи5 Тгапетесійоп), обидва зроблені в Е17 середовищі. Суміш інкубували протягом 10 хвилин перед додаванням до культури клітин. 450 мл культури клітин СНО, стабільно експресують усічений білок ЕВМА1 (СНО-ЗЕ7), вирощених в середовищі Е17 (Іпмігодеп), трансфіковані з 50 мл поліплексів. Через двадцять чотири години після трансфекції в культуру додавали 12,5 мл 40 95 (маса/об'єм) розчину триптону М1 (Огдапоїесппіє) і 1,25 мл 200 мМ розчину вальпроєвої кислоти. Культуру збирали через 8 діб після трансфекції і очищали центрифугуванням. Очищену середу фільтрували через 0,22 мкм мембрану перед нанесенням на колонку, заповнену 5 мл смоли протеїну-А Марзеїесі
Зо ЗИиКе (СЕ Неайсаге). Після завантаження колонку промивали 5 об'ємами натрій-фосфатного буфера рН 71 (РВБ) і антитіла елюївали 100 мМ буфером з цитратом натрію рН 3,0. Фракції, що містять елюїровані антитіла, об'єднували і зміну буфера здійснювали шляхом завантаження на знесолювальних колонку Есопо-Рас (ВіоКаєд), калібровану в РВ5. Знесолені антитіла потім стерильно фільтрували при пропущенні через Мійех СР (Мійїроге) фільтр (0,22 мкм) її аліквотували.
Приклад 9: Транспорт ІСЕ1К-4 через модель гематоенцефалічного бар'єру іп міго
Для того, щоб оцінити, чи проходить ІЗЕ1ТЕ-4 УНН, його гуманізовані версії (Н2-Нб) і ІСЕ1ТК- 4-тЕс (Приклад 8) через гематоенцефалічний бар'єр, було проведено аналіз іп міго, як описано нижче. Блок-схема експерименту показана на Фіг. бА.
ЗУ40-імморталізовані ендотеліальні клітини мозку дорослого щура (5м-АКВЕС) були використані для створення моделі гематоенцефалічного бар'єру (ГЕБ) іп міго, як описано раніше (Сагбего еї аї., 2005; Наддапі еї аі., 2012). Зм-АКВЕС (80000 клітин/мембрану) висівали на 0,1 мг/мл вставки культури тканини, покриті кологеном типу І хвоста щурів (розмір пір - 1 мкм; площа поверхні 0,9 см, РаЇІсоп) в 1 мл середовища росту. Нижня камера вузла вставки містила 2 мл середовища росту, доповненої кондиціонованим середовищем імморталізованних неонатальних щурячих астроцитів в співвідношенні 1:1 (06/06). Еквімолярні кількості (5,6 мкм) позитивних (ЕС5) або негативних контролів (А20.1, Сіовігідішт айісне токсин А що зв'язуючих
МинН; і Еб2, ЕСЕ звязуючих МНН), ІСЕ1 8-4 УНН, гуманізувувані версії (Н2-Нб) або ІСЕ1К-4-тЕс тестували на їх здатність проникати через цю щурячу модель ГЕБ іп міїго. Після експозиції еквімолярних кількостей 5аАБ на люмінальному боці ГЕБ, через 15, 30 і 60 хв з аблюмінального боку були взяті зразки. Вміст ЗаАб в кожному зразку потім кількісно оцінювали за допомогою мас-спектрометрії (МАМ-ІІ5), як описано у Наддапі еї а1. (2012)) (див. опис методу нижче).
Визначення коефіцієнту ефективної проникливості: кількісні значення можуть бути безпосередньо нанесені або значення Рарр (коефіцієнт ефективної проникності) можуть бути визначені за заданою формулою (Фіг. б А) і нанесені на графік. Значення Рарр зазвичай використовується для визначення здатності молекули до проходження гематоенцефалічного бар'єру. (Ог/дї - загальна сума в приймальному відділенні в залежності від часу; А - площа моношару клітин; СО - початкова концентрація дозованого розчину), значення Рарр є мірою питомої проникності зв'язування через ендотеліальний моношар мозку.
Результати показані на Фіг. 6 В-О0. Наведені результати є середніми значеннями Рарр, отриманими з декількох незалежних експериментів. Обидва негативних контролю мають дуже низьке значення Рарр, вказуючи, що неспецифічний транспорт або парацеллюлярне перенесення цих УнН через модель ГЕБ мінімальні. (ЗЕ1К-4 МНН має високе значення Рарр, ЩО вказує на високу швидкість перенесення в іп міго моделі ГЕБ. Рарр для ІСЕ12-4 МНН був в 4 рази вище, ніж у позитивного контролю - ГЕБ-проникного МНН ЕС5 (ММО02/057445). Результати показують, що ІСЕТК-4 піддається полегшеному міжклітинному транспорту через ендотеліальні клітини мозку іп міго і може мати аналогічні властивості іп мімо. Гуманізовані ІЗЕТК-4 Унн варіанти НЗ, НА ї Н5 показали схожі (НЗ) або злегка знижені значення Реарр в порівнянні з ІЗЕ1Е- 4 МНН; Н2 варіант демонстрував значне зниження здатності проходити ГЕБ модель іп міїго, тоді як НЄ варіанти повністю втратили цю здатність, демонструючи значення Рарр як у внутрішнього контролю МНН А20.1 (Фіг. 6 С), і були виключені з подальших досліджень. Значення Рарр для
ІСЕ1В8-4тЕс (Фіг. 6 О) було схоже зі зниженим в 6 разів значенням ІСЕ12-4 МНН (Фіг. 6 В), бо свідчить про те, що ІЗЕ1К-4 може переносити великі (розміром з антитіло) молекули через ГЕБ.
Значення Рарр позитивного контролю ЕСб5тЕс було в З рази нижче, ніж значення для ІСЕ1К-4 тес. Варто відзначити, що конструкти, які містять (ЗЕ1К-5 або гуманізовану версію, зв'язані з молекулою вантажу (молекулярна маса - 110 кДа або 180 кДа), також перетинали гематоенцефалічний бар'єр (дані не показані).
Абсолютна визначення кількості МНН з використанням способу МЕМ-ІГІ5. Дані способи описані у Наддапі єї аї. (2012). Якщо коротко, для проведення 5КМ (моніторингу селективних реакцій, також відомого як моніторинг множинних реакцій (МАЕМ)) аналізу МНН кожен МНН спочатку аналізували за допомогою папоЇ С-М5/М5 з використанням залежного від даних збору для ідентифікації всіх іонізуючих пептидів. Для кожного пептиду були обрані від З до 5 найбільш інтенсивних іонних фрагментів. Початковий аналіз 5КМ проводили для моніторингу цих фрагментів в аттомольних кількостях розщеплення (приблизно 100-300 Амол). Фрагменти, які показали співвідношення інтенсивності при низьких кількостях (тобто мали г220,95 по Пірсону в порівнянні з більш високими кількостями), вважалися стабільними і були обрані для кінцевого аналізу ЗЕМ. Для подальшої оптимізації аналізу час елюювання для кожного пептиду було також включено, причому пептиди, які мали близькі Іт/7 (відношення маси до заряду) і час
Зо елюювання не вибирали.
Типовий мультиплексований аналіз ЗЕМ МнН в клітинних середовищах або біологічних рідинах (сироватці або спинномозкової рідини (СМР)) включав в себе впорскування відомої кількості ІІ5 (ін'єкція інсуліну лізпро) (0,1-10 нМ) з наступною ін'єкцією 100-400 нг СМР або білків культурального середовища (0,3-1 мкл) або приблизно 50-100 нг сироваткових білків (1-3 нанолітра) в систему папоЇ С-М5. Попередник іт/7 кожного цільового пептидного іона був обраний з іонної пастки (а решта незв'язані іони були відкинуті) у вказане для мішені час елюювання, з подальшою індукованої зіткненнями дисоціацією (СІЮ) фрагментацією і вибором тільки потрібних іонних фрагментів в іонної пастці для моніторингу за допомогою детектора.
Для кількісного аналізу необроблені файли, створені ГТО (Тпегторвізхпег), перетворювали встандартний формат даних мас-спектрометрії таХМіІ. і інтенсивності витягували за допомогою програмного забезпечення О-МАМ (Опцапійайме-МЕМ; 5зее Наддапі еї аїЇ. 2012), яке є модифікованою версією програмного забезпечення МаїспКх. Для кожного МНН витягнуті іонні хроматограми генерували для кожного з його іонних фрагментів, які складалися з об'єднаних інтенсивностей в межах 0,25 Да фрагмента тп/7 протягом всього часу елюювання. Для того, щоб отримати остаточне значення інтенсивності для кожного фрагмента, були підсумовані всі інтенсивності протягом 0,5 хв очікуваного часу утримування. МНН був визначений як виявляється в зразку, якщо фрагменти щонайменше одного з його пептидів показали очікувані співвідношення інтенсивності, тобто кінцеві значення інтенсивності показали сильну кореляцію
Пірсона г20.95 і р менше 0,05 у порівнянні з кінцевими значеннями інтенсивностей відповідного чистого УНН.
Зразки, що містять суміші МНН (середа, сироватка, СМР) відновлювали, алкілірували і розщеплювали трипсином, як описано раніше (Наддапі еї аїЇ.,, 2012; Сегщдом еї аї., 2003).
Продукти розщеплення (триптичні пептиди) підкислюють оцтовою кислотою (кінцева концентрація 595) і аналізували на зворотно-фазовому папоАсдийу ОРІС (надефективну рідинний хроматограф) (Маїег5, Мійога, МА) в поєднанні з мас-спектрометром ГТО ХІ ЕТО або
ТО Опбітар ЕТО (ТнептоРізнег, УМайпат, МА). Потрібні аліквоти зразка ін'єктували і завантажували в 300 мкм І.О0. "0,5 мм З мкм РерМар5 С18 пастку (ТПепторРізПпег), потім елюївали на 100 мкм 1.0. х 10 см 1:07 мкм ВЕНІТЗОС18 папо! С колонці (УМагег5) з використанням градієнта 0 Фо - 20 95 ацетонітрилу (в 0,1 96 форміат) протягом 1 хвилини, 20 95 - 46 Фо в 16 хв, і бо 46 95 - 95 до протягом 1 хв при швидкості потоку 400 нл/хв. Елюїровані пептиди іонізували в мас-
спектрометрі з іонізацією електророзпиленням (Е5І) для М5/М5 і БЕКМ аналізів з використанням
СІО для фрагментації пептидних іонів. СІЮ проводили з гелієм в якості газу зіткнення при нормованій енергії зіткнення 35 95 і 30 мс часом активації. Час іонної ін'єкції в лінійну іонну пастки було скориговано за допомогою інструменту з цільовим значенням автоматичного контролю посилення (АС) 6 х 103 і максимальним часом акумуляції 200 мс.
Дані МнН-специфічні пептиди, які використовуються для детектування та кількісного визначення кожного УнН в мультиплексному аналізі, наведені в Таблиці 2.
Таблиця 2
Пептиди, що використовуються при папоЇ С-5КМ детектуванні ЕС5, ЕС5-І 5, ЕС2, Аг20.1, ІСЕ- 18-5 і альбуміну. (А) в різних описаних дослідженнях аналізи були мультиплексовані в різних комбінаціях для одночасного спостереження в одному і тому ж зразку; (В) важко-мічений пептид; (С) межі детектування та кількісного визначення 5КМ для кожного пептиду становили 1,5-2,5 нг/мл. 1 нг/мл відповідає приблизно 60-70 пМ МНН. Аг0-1, як описано у іп Низзаск еї аї, 2011 Б;
ЕсС2 як описано у Ідваї еї аї, 2010 року. теттвідоко 0 бищащри 000 вдів Мне: Ункаль ний
ГЗСЕУБООТУВЕ ГАМОМКВ шк и ши шо: СМ Пс вся пасом ноУю Сак п КК ГІ ша Так , ЕЕУДАСВЗТОМ же Так ко ТЕВМОРМАЖМЕВ зо Так
ПЕЖАИВОСТОУТУВЗОАООСЗКОК Шотак
ЕІ КЕБОСсСюЮВУЮАВОЗ З Так
ММУУСОММБІКРЕОТАУУТСАУМВАВТВРА ОМВК ст"Дльсумін ВРООБІРНУВААК пишна лиш:
Приклад 10: й мімо і ех-мімо оптична візуалізація
Для визначення того, чи накопичується ІЗЕ1К-4 МНН в мозку після внутрішньовенного (ім) введення, ІЗЕТК-4 МНН і негативний контроль А20.1 МНН кон'юговані з флуоресцентним індикатором ближньої інфрачервоної області Су5.5 і очищали як описано в Прикладі 7. 2,5 мг/кг
ІСЕТА-Су5.5 або А2О.1 Суб.5 (в 150 мкл обсязі) вводили в хвостову вену СО-1 голих мишей, і живих тварин досліджували в положенні лежачи на преклінічному візуалізаторі еХріоге Оріїх
МХа (Адмапсей Незвєагсп Тесппоїодіеє5, ОС) через 30 хв після ін'єкції. Через годину після ін'єкцій тварини були анестезовані 2 95 ізофлураном (Вахіег Сапада, Міз55іззацда, ОМ, Сапада), була проведена серцева пункція і 10 мл фізіологічного розчину (Вахіег Сапада, Міх55іззацда, ОМ,
Сапада), доповненого 1 ЄШ/мл гепарину (Огдапоп, Тогопіо, ОМ, Сапада) перфузували з тієї ж голки зі швидкістю 2 мл/хв для видалення крові (що було встановлено появою рідини, вільної від крові, на місці розрізу правого шлуночка). Мозок після перфузії видаляли і візуалізували ех- мімо з використанням ехріоге Оріїх. Протоколи візуалізації докладно описані в Ідвраї еї аї., 2011 року.
Результати показані на Фіг 7. миші, яким вводили Су5.5-ІС2Е18-4, показали підвищений оптичний сигнал в області голови іп мімо (верхні блоки, стрілка) і ех-мімо в мозку після перфузії (нижні блоки, стрілки), в той час як Су5.5-А20.1-інекцування миші показали тільки низький фоновий сигнал. Ці дані свідчать про те, що ІЗЕ1К-4 УнН може доставляти візуалізуючий засіб (Су5.5, 1 кДа) через гематоенцефалічний бар'єр іп мімо.
Приклад 11: Кон'югація ІСЕ1К-4 з галаніном
Зо Для того, щоб визначити, чи здатний ІСЕ12-4 МНН перетинати гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) в іп мімо і "переносити через ГЕБ молекулу, яка не може перетнути ГЕБ самостійно, нейропептид Галанін був хімічно кон'югованими з ІЗЕ1К-4 МНН або з ІСЕ18-4-тЕс і системно введений. Галанін є нейроактивним пептидом, який виробляє знеболюючу дію шляхом зв'язування саїкК1 і заІК2, що експресуються в тканини головного мозку. При периферійному введенні Галанін не має знеболювальної дії, оскільки він не може перетнути ГЕБ сам по собі (Норетгізоп сеї а!., 2011).
ІСЖЕТА-4 МНН був кон'югованих з фрагментом щурячого Галаніну (СаЇ) з модифікованим цистеамідом С-кінцем (Віотаїіс) (ЗУУТІ МЗАСМІ І ЗРНАІЮОМНАЗЕЗОКНОЇ Т-цистеамід, ЗЕО ІЮ
МО: 36). Схема кон'югації зображена на Фіг. А.
Якщо коротко, 5 мг ІЗЕ1К-4 МНН (Приклад 4) в 0,5Х РВ5, 2,5 мМ ЕДТА при (2 мг/мл змішували з 436,4 мкл 2,5 мг/мл сульфосукцинімідил-4- (М-малеіїмідометил) циклогексан-1- карбоксилату (сульфо-5МОС) (7,5х надлишкове мольне відношення). Потім суміш продували газоподібним азотом і інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі (КТ) для реагування ефірного МН залишку сульфо-ЗМСС з аміногрупами МнН. Згодом, непрореагувавший сульфо-5ЗМОСС був видалений з активованого малеіїмідом ІЗЕ1К-4 МНН з використанням 10 мл колонки 7К 7ебра (Ріегсе). До завантаження зразка колонку промивали З рази 5 мл РВ5 і центрифугували при 1000 у протягом 2 хв. Після завантаження зразка колонку заповнювали 200 мкл РВ5 і центрифугували протягом 2 хв при 1000 д. Що стосується конструктів ІСЕТК-Ес, 5 мг піддавали взаємодії з -ї 68 мкл сульфо-«ЗМОС (6,5х надлишкове мольне відношення) таким же чином, як описано вище.
Окремо і одночасно, Галанін з модифікованим цистеамідом С-кінцем (СаІ-суа) отримували шляхом розчинення 10 мг порошку в 10 мл води без ендотоксинів, щоб отримати 1 мг/мл матковий розчин (порошок Са|1І-суа містив невелику кількість ОТТ (дітіотріетол) для запобігання утворення дисульфідних містків під час очищення). Нарешті, додавали 100 мкл 0,5 М ЕДТА (кінцева концентрація 5мММ).
Очищені активовані малеїмідом ІЗЕ1К-4 УНН і ІСЕ1К-4-Ес конструкти (2,6 мл) розбавляли до 5 мл 0,5Х РВ5, 2,5 мМ ЕДТА, а потім 5 мл або 1 мл сСаїЇ!-суа, відповідно, був доданий під час вортексування. Зразки продували азотом, герметизували і інкубували протягом ночі при температурі 4 "С. На наступний день, непрореагований СаІ-суа був вилучений за допомогою колонок Атісоп-15 1ОК і ЗОК (МійПіроге) відповідно. Зразок додавали в колонку і центрифугували при 4000 д протягом 7 хвилин до тих пір, поки об'єм не був зменшений до 5 мл. 5 мл 0,5Х РВ5, 2,5 ММ ЕДТА додавали до решти 5 мл зразка у вставці колонки і центрифугували знову, поки обсяг зразка не був зменшений до 4 мл. Потім кон'юговані зразки додавали в 10 мл колонку 7К
Зо 2гера (Ріегсе), приготовлену, як описано вище, а потім центрифугували протягом 2 хв при 1000 9.
Кон'юговані зразки ІЗЕ1К-4-заї і ІЗЕ12-4-Ро-Са! потім проганяли в 16 95 або 10 95 505-
РАСЕ гелі, не відновлюються та фарбували сріблом, щоб підтвердити зміни молекулярної маси після кон'югації. Реакцію титровали до досягнення співвідношення -- від 1 до 2 молекул Галаніну на МНН або ІСЕ1Б-Ес конструкти. Результати підтверджували приєднання Галаніну до ІЗЕ1К-4
МАН (див. Фіг. 8 В).
Видалення ендотоксину і визначення рівнів ендотоксину: ендотоксини були видалені за допомогою Атісоп ШОйга колонок для центрифугування з целюлозної мембраною (МійШіроге), відсікаючих молекулярну масу (ММУСО). В першу чергу 15 мл зразка МНН пропускали через колонку Атісоп-15-50К МУУСО центрифугуванням при 4000 д протягом 10 хвилин; елюювали і збирали. Даний продукт елюювання потім додавали в колонку Атісоп-15-10К МУУСО і центрифугували при 4000 д 7-10 хвилин, що призводило до зменшення обсягу супернатанта з 15 мл до 7,5 мл. Обсяг супернатанта в колонці регулювали зворотно до 15 мл, додаючи РВ5.
Колонку центрифугували знову, як описано вище. Супернатант збирали і рівні ендотоксину вимірювали системою Епдозаїе-РТ5 з використанням картриджів з діапазоном чутливості 10- 0,1 Ей/мл (одиниць ендотоксину на одиницю) (СпПагіе5 Кімег І арогайгіє5 Іп(егпайопаї). 25 мкл зразка завантажували в кожну з 4 лунок на картриджі і розбавляли при необхідності. Тільки зразки з МЮ менше 1 на 1 мг були використані для досліджень на тваринах.
Приклад 12: Транспорт ІСЕ1 В-4-саї з використанням моделі Харгрівса
Для того, щоб оцінити, чи переноситься ІСЕ1К-4-За! або ІСЕ1К-4-тЕс-са! (Приклад 11) через гематоенцефалічний бар'єр, був використаний раніше описаний в міжнародну патентну публікації М/О2011/127580 аналіз іп мімо.
Була використана щуряча модель запальної гіперальгезії, схожа з описаною у Нагодгеамез еї аі. (1988). Тварин утримували в групах по три (модель Харгрівса) в поліпропіленовій клітці і надавали вільний доступ до їжі і води. Експерименти проводилися в 12 г світло-темному циклі при температурі 24 "С і відносній вологості 5025 95. Всі процедури на тварин були схвалені
Комітетом з догляду за тваринами і знаходилися відповідно до посібників Канадської ради з догляду за тваринами.
У цій моделі самцям щурів лінії УМіпоїаг 6-8 тижневого віку (діапазон ваги 230-250 г) вводили 60 невеликі обсяги (100 мкл голкою 30-го калібру) ад'юванта Фройнда (СЕА, убиті нагріванням М.
їмрегсціо5і5 (Зідта), суспендовані в емульсії масло: фізіологічний розчин 1:1) в праву задню лапу під неглибокої ізофлурановою анестезією (3 95). СЕРА індукував вивільнення прозапальних речовин, які активували ноцірецептори і створювали стан хронічного болю і гіперальгезію (підвищена чутливість до шкідливого тепла). Затримку відсмикування лапи вимірювали за допомогою застосування теплового подразника на плантарній поверхні обох задніх лап (запалена і незапалений контрольна лапа), використовуючи плантарний пристрій
Анальгезіометр для стимуляції лапи (ТС Моаде! Ж 3360 І їе Зсіепсе, Іпс.). Час, витрачений тваринам на відповідь облизування або струшування лапи, було інтерпретовано як позитивну відповідь (Затримка відсмикування лапи). Інтенсивність світла лампи була скоригована, щоб виявити базові затримки відсмикування лапи від 17 до 20 с в обох задніх лапах перед введенням СЕА. Якщо відповідь не відбувався протягом 20 секунд, світловий промінь автоматично вимикався щоб уникнути пошкодження тканин і лапі присвоювався максимальний бал.
Через два дні після ін'єкції СЕРА і до введення сполук, тварин аккліматизували в пристрої анальгезіометра протягом щонайменше 60 хв з метою зменшення стресу і запобігання помилкових позитивних відповідей. Базові умови були виміряні в обох лапах, щоб перевірити розвинений біль (теплова гіперальгезія); незапалена лапа була використана в якості контролю в порівнянні з ін'єктгованою лапою. Тварини з затримкою відсмикування лапи більш ніж б с для "запаленої лапи" і менш ніж 17 с для "нормальної лапи", були виключені з експерименту.
Для того, щоб визначити, чи переноситься ІБЕ12-4-сза! через гематоенцефалічний бар'єр і чи може зв'язуватися з рецепторами-мішенями (саїК! і 2) в паренхімі головного мозку, щури отримували одну ін'єкцію в хвостову вену ІСЕ1Е-4-Галаніну (Змг/кг) або ІЗЕ1К-4-тЕс-Галаніну (2 мг/кг або 5 мг/кг) або контрольного з'єднання через три дні після ін'єкції СЕА. Затримку відсмикування лапи (РУ/.) тестували для кожної задньої лапи (запалених і незапалених) кожні 15 хв протягом 3-х годин. Збільшення затримки відсмикування лапи вказувало на успішну індукцію аналгезії яка може бути досягнута тільки шляхом успішної доставки Галаніну в паренхіму головного мозку за допомогою ІСЕ1К-4. Галанін може викликати анальгезию, тільки коли присутній в паренхімі головного мозку і сам по собі не може перетнути неушкоджений ГЕБ (Норетгізоп сеї а!., 2011).
Зо Результати були проаналізовані як тимчасові динаміки затримок відсмикування лапи (РУ, сек) в залежності від часу (хв або г) (Фіг. 9А і С). Фіг. 9В зображує ті ж результати у вигляді площі під кривою (АС) і порівнює їх з 96 від максимально можливого ефекту (96 МРЕ). Фіг. 90 зображує результати у вигляді відсотка інгібування (теплової гіперальгезії) на піку відповіді (Етах).
Результати показують, що внутрішньовенне введення Галаніну не зменшувало біль у порівнянні з РВ5. На відміну від цього, одна ін'єкція ЕС5-саіІ або ІСЕ1К4-Са| виробляло вимірний аналгетичний ефект, даючи підставу вважати, що МНН переносив Галанін через ГЕБ для створення анальгетичного впливу шляхом зв'язування з заїІК1 і/або 2 в паренхімі головного мозку. Ефект ІСЕ1К-4-Галаніну залежить від його дози і значно більш вираженим, ніж ефект, індукований ЕС5-Саї, що дає підставу вважати, що рецептор ІСЕТК має більш високу швидкість
ГЕБ транспорту, ніж передбачуваний ЕС5 рецептор. Результати показують, що ІЗЕ18-3 МНН може "переносити" молекули щонайменше 3000 Да через ГЕБ з використанням шляху рецепторно-опосередкованого трансцитозу (комбінована МУУ кон'югату антитіло-пептид становить приблизно 18 кДа). Активний рецепторно-опосередкований транспорт необхідний, так як відомо, що ГЕБ запобігає проходженню всіх гідрофільних молекул більше 0,5 кДа.
Аналогічно, ІЗЕ124-тЕс-Галанін виробляє дозозалежне придушення теплової гіперальгезіх, тоді як А20.1-тЕс-Галанін є неефективним. Це дає підставу вважати, що ІЗЕ1К-4 УНН може переносити молекули, схожі за розміром з антитілами (приблизно 80 кДа) через ГЕБ. ІСЕ1К4- тЕс-Галанін був приблизно в 5 разів активніший в придушенні теплової гіперальгезиї, ніж
ІСЕТА4-Галанін, що вказує на те, що бівалентності відображення і збільшений період напіввиведення з плазми призводять до поліпшеної ефективності доставки в мозок.
Приклад 13. Рівні ІСЕ1К-4 в спинномозковій рідині і плазмі
Аналіз іп мімо проводили, щоб визначити, чи здатний ІЗЕ1К-4-птіЕс проходити в мозок і зокрема в спинномозкову рідину (СМР), а також для кількісного визначення присутності в спинномозковій рідині та сироватці.
Тварин утримували поодинці в поліпропіленових клітинах і давали вільний доступ до їжі і води. Експерименти проводилися в 12 годинному світло-темному циклі при температурі 24 "Сі відносній вологості 5025 95. Всі процедури на тварин були схвалені Комітетом з догляду за тваринами і знаходилися відповідно до посібників Канадської ради з догляду за тваринами.
Використовували самців щурів лінії ММізтаг 8-10-тижневого віку (діапазон ваги 230-250 г). Для отримання зразка СМР хутро в області шиї і голови тварин виголювали і потім їх поміщали в камеру з плексигласу і помірно анестезували З 95 ізофлураном; СМР була зібрана по суті як описано у Мігоді еї а! (2009). Анестезованих щурів поміщали в установку з металевим каркасом (люб'язно надану доктором Міпісіо Сгападо5-5оїо; СІММЕБТАМ, Мексика) і іммобілізували з використанням ручок для вух. Положення голови тварини підтримували нахиленим під кутом приблизно 457". Поверхня у вигляді ромба між потиличним бугром і шийним хребцем була зроблена видимої шляхом протирання ватою, просоченою етанолом (75 95) з цієї поверхні. 2705 голка, покрита ПЕ-10 трубкою (Весіоп бісКіпзоп, Міх55іззацда, ОМ, Сапада) 10 см в довжину і поєднана зі 100 см3 інсуліновим шприцом, була вставлена горизонтально і по центру в мостомозжечкового цистерну для збору СМР без надрізу. Дві точки опору (клацання) уздовж шляху голки можна легко відчути через розрив шкіри і розпушення атланто-потиличної мембрани. Коли голка проходила другу точку опору, СМР збирали (40-100 мкл) через голку, застосовуючи обережне всмоктування інсуліновим шприцом. Після відбору зразків спинномозкової рідини відповідну кров збирали пункцією серця після торакотомії і поміщали в вакуумні контейнери-пробірки (Весіоп ОісКіпзоп, Мібх5іззацда, ОМ, Сапада) з активатором згустків і гелем, а потім центрифугували при 3,000 д протягом 15 хв. Сироватка була видалена за допомогою мікропіпетки і зразок швидко заморожували до -80 "С до подальшого аналізу.
Зразки сироватки та зразки спинномозкової рідини аналізували за допомогою мас- спектрометрії і на основі кількісної оцінки папоЇ С-5КМ, як описано в Прикладі 9.
Збір СМР є делікатною процедурою, під час якої СМР може легко забруднитися кров'ю. Так як кількості УнН, як очікується, будуть значно менше в спинномозковій рідині (менше 0,1 95), ніж в крові, навіть незначне забруднення кров'ю може поставити під загрозу цінність окремого зразка спинномозковій рідині. У зв'язку з цим необхідно було розробити суворі критерії виключення зразків спинномозкової рідини, забруднених кров'ю. Для оцінки співвідношення альбуміну в крові-спинномозкову рідину метод папоЇ С-5КМ був розроблений для кількісного визначення рівня альбуміну в плазмі крові і спинномозкової рідини. Пептид альбумін
АРОМ5ТРТІМЕААК (ЗЕО ІО МО: 37) був обраний на підставі свого унікального часу утримування і значення т 7 (Мої Рпагт) для досягнення мінімальної інтерференції з іншими
Зо піками пептидів в мультиплексному аналізі. Інтенсивність пептиду визначали кількісно в обох зразках спинномозкової рідини і плазми з використанням 5КМ аналізу, як описано вище.
Співвідношення альбуміну розраховувалося в такий спосіб для кожної щури:
Співвідношення Альбуміну - Інтенсивність на нл проаналізованої плазми/
Інтенсивність на нл проаналізованої СМР
Співвідношення 1500 і нижче розглядалося як забруднення кров'ю.
Результати зображені на Фіг. 10. Тваринам одночасно вводили 6 мг/кг кожного з ІЗЕ1К-4,
ЕС5 або А20.1, та СМР і сироватку збирали через 30 хв після ін'єкції. На фігурі зображено, що співвідношення СМР/сироватка для ІСЕТК-4 становить 1,2 95 в порівнянні з 0,98 95 для ЕС5 і 0,017 956 для А20.1, що дає підставу вважати, що обидва ІСЕ1К-4 і ЕС5 мають вищу проникнення в спинномозковій рідині та вплив на мозок в порівняні з спільно введеним контрольним антитілом А20.1.
Приклад 14: Іммунодетектування ІСЕ1К-4-тЕс
Для того, щоб переконатися, що високі рівні ІЗЕ1К-4-тЕс, виявлені в спинномозковій рідині після периферичного введення, відбуваються щонайменше частково з позаклітинного простору паренхіми, іншими словами, що неушкоджений конструкт перетинає ГЕБ, була проведена імунодетекції ІЗЕТК-4-тЕс в мозку щура.
Якщо коротко, мозок тварин збирали відразу після перфузії тварин РВ5 через 24 годин після введення 6 мг/кг в хвостову вену ІБЕ12-4-тЕс або А20.ТтЕс. Мозок заморожували і розрізали на кріотомі на 12 мкм секції. Секції витримували протягом 10 хв при КТ в 100 95 метанолі, відмивали З рази в РВЗ і інкубували протягом 1 год. в 10 95 нормальної козячої сироватці (МОБ), що містить 0,3 95 Тритон Х-100 в їх РВ5. Козій анти-М-Ідсї Есу-СУЗ (Саї Ж 115-165-071,
Уаскзоп Іттипо Кеазеагсі, Ії Ж 106360) 1: 200 в 5 95 МО5, що містить 0,3 96 Тритон Х-100 в їх
РВ5, інкубували протягом ночі при 4 "С. Секції промивали три рази в їх РВ5, потім додавали лектин для фарбування судинної системи КСАЇ (Саї Ж РІ -1081, Месіоїг) 1: 500 в їЇхХРВ5 протягом 10 хв. Після промивання тричі ї1хРВ5 секції покривали покривним склом у флуоресцентному закріплюючому середовищі бако (Саї Ж 53023, Бако) і до них додавали 2 мкг/мл Ноеспвзі (Саї ж
НЗ570, Іпмігодеп) для фарбування ядер. Фотографії робили за допомогою флуоресцентного мікроскопа ОїІутриФє 1 х 81 з використанням 10Х і бОХ об'єктивів і каналів, як показано в Таблиці
З. (510)
Таблиця З
Об'єктиви та канали, використані під флуоресцентної мікроскопії
КСАвСсУДиННИ С «95 5ів
НоесвеЗ3342-ядра / Ноеспа ЗО «в
Віск МИ ХІН с: КОН ПИ
Результати показані на Фіг. 11. імунодетекції мишачого Ес показала сильне фарбування судин головного мозку в різних ділянках головного мозку, а також фарбування периваскулярной паренхіми мозку, що вказує на те, що ІЗЕ1К-4-тЕс накопичувався в судинах головного мозку, а також переносився через ГЕБ в навколишню паренхіму мозку. Навпаки, тЕс-специфічне забарвлення не було виявлено у А20.1тЕс ін'єксгованих тварин. Отримані результати підтверджують твердження, що підвищені рівні ЗЕ1К-4-пЕс в спинномозковій рідині свідчать про проходження конструкту через ГЕБ. Це додатково істотно підтверджується спостереженням, що Галанін, зв'язаний з ІСЗЕ1К-4, індукував фармакологічну реакцію (аналгезія) на паренхімальних СЗаїшК1 і саІК2 рецепторах. В сукупності, результати проходження через ГЕБ іп міго, результати фармакокінетики іп мімо (рівні в сироватці/сМР) і результати фармакодинамики (модель Харгрівса) показують, що ІСЗЕ1К-4 УНН переноситься через неушкоджений ГЕБ значно вищими темпами, ніж інші МНН шляхом активного рецепторно- опосредованного трансцитозу, викликаного його зв'язуванням з епітопами ІСЕ1К, і що він може "переносити" нездатні в іншому випадку проникати через ГЕБ молекули (1-80 кДа).
Приклад 15: Вплив ІСЕ1ТК-4 на "фізіологічну" функцію ІЗЕТК
З точки зору безпеки важливо показати, що антитіло відповідно до винаходу не заважають фізіологічної функції рецептора - тобто передачі сигналу, індукованої його природним лігандом,
ІШЕ-1 при зв'язуванні його рецептора для доставки лікарських засобів за допомогою рецепторно-опосередкованого трансцитозу. З огляду на це, важливо продемонструвати, що
ІСЕТА-4 УнН або ІСЕТК-4-тЕс не заважають фізіологічній передачі сигналів через ІСЕТК або інсуліновий рецептор (ІК), індукованої їх природними лігандами.
Для того, щоб визначити, індукує чи ІЗЕ1К-4 передачу сигналу через ІСЕ1К або ІК окремо, або заважає передачі сигналу, що стимулюється природними лігандами рецептора, ІСЕ-1 або інсуліном, було визначено їх вплив на фосфорилювання самих рецепторів або рецептор- стимульованої прямий кінази, протеїнкінази В, в ЗМ-АВВЕС клітинах.
ЗМ-АКВЕС клітини вирощували для злиття в основному середовищі М199, доповненому пептоном, Ю-глюкозою, ВМЕ (основне живильне середовище Голка), амінокислотами, ВМЕ вітамінами, розчином антибіотика/антимікотика і фетальної бичачої сироваткою відповідно до
Зо відомих способів. Клітини переносили в безсироваткове середовище за 18 год. до обробки.
ІСЕ18-4 МНН або ІСЕ1К-4-Рс злиття (100 нМ або 500 нМ) додавали до клітин за 1 год. до додавання 200 нг/мл ІСЕ-1, 10 мкл/мл інсуліну або носія. Клітини інкубували з лігандами або носієм протягом 20 хвилин, а потім двічі промивали в збалансованому сольовому розчині
Хенка. Потім клітини лізували з використанням буфера їх КІРА (буфер для радіоїммунопреципітації) (Се! 5ідпайпуд Тесппоіоду), доповненого 195 Тритоном-Х 100 і інгібіторами протеаз (Зідта). Клітини піддавали 2х20 з імпульсам в водяній бані ультразвуковому і лизати очищали центрифугуванням при 14,000 об/хв протягом 10 хвилин.
Концентрацію білка визначали за допомогою системи аналізу білка ОС (Віо-Най І арогайогієв5).
Рівні по мкм зразки білка розділяли в 4-20 95 градієнтному 5О5 поліакриламідному гелі при 125
В і переносили на РМОЕ (полівініліден фторид) мембрану. Фосфо-протеїн В (Зег 473) визначали за допомогою інкубації протягом ночі при розведенні 1:1000 первинного антитіла проти даної мішені (технологія клітинної передачі сигналу), з подальшою інкубацією з вторинним козячим антитілом проти кролячого ІДС-НКР, з подальшим взаємодією з ЕСІ Ріи5 реагентом і візуалізацією на авторадіографічній плівці Значення денсітиометрії були визначені з використанням програмного забезпечення Оп-5сап-і т (51ЇЇК Зсіепійїс Іпс.).
Результати зображені на Фіг. 12. Вестерн-блот фосфорилювання протеїнкінази В показав, що ІСЕ1К-4 не пригнічує фосфорилювання протеїнкінази В, індуковане 10 мкг/мл інсуліну або 200 нг/мл ІСБЕ-1 при спільному застосуванні з 100 нМ ІСЕ1К-4 або ІСЕ18К-4-тЕс або 500 нм
ІСЕТА-4-тЕс. УнН або Ес злиття теж індукували самі по собі передачу сигналу протеїнкіназою В (Фіг. 12А, 128 і 12С, з написом "-4"). Результати показують, що навіть в бівалентному відображенні в форматі Ес злиття ІСЕ1К-4 не викликає димерізацію рецептора і пряму передачу сигналу, і, отже, не порушує функцію рецептора в присутності природного ліганда. Дана особливість ІСЕ12-4 ("мовчазне зв'язування") має важливе значення для його застосування в якості переносника терапевтичних агентів через ГЕБ, тому, що вона забезпечує сприятливий профіль безпеки.
Варіанти здійснення і приклади, описані тут, є ілюстративними і не призначені для обмеження обсягу винаходу, як заявлено. Варіації вищеописаних варіантів здійснення, включаючи альтернативи, модифікації та еквіваленти, охоплюються за наміром авторів винаходу формулою винаходу. Крім того, описана сукупність ознак може не бути необхідною для винахідницької рішення.
Посилання
Всі патенти, патентні заявки і публікації, згадані в цьому документі і у всій заявці, включені в даний опис як посилання.
Арроїй Му (2013) Віоод-ьгаїп Багієг вігосіцгте апа їпсіоп апа Ше спаПепде5 їТогї СМ5 апа деїїмегу. У Іппетії Меїаб рів. 36(3):437-49.
Ариїть А, бргапу Н, Мап Вегдеп єп Непедошймеп Р, 5іапітігоміс Ю (2005) Тне Біосд-Ьгаїп
Батег ігапотідгайтпа 5іпдіє дотаїп апіроду: теспапібтв5 ої ШМапзроп апа апіідепіс еріорез іп
Ппитап бБгаїп епаоїпеїаї! сеїІ5. У Мештоспет. 2005 Мом;95(4):1201-14.
Аграрі-Сспантоцаї, М. Оезтуїег А, Мупз І, Натегз В., апа Миуідептапв 5 (1997) 5еЇІвсійоп апа ідепійісайоп ої зіпдіє дотаїп апіїбоду адтепів тот сатеї! пеаму-снаїп апіїродієз, ЕЕВ5 І ей 414, 521-526
Аграрі-Сспангтоцаї, М., То, В., Сацадене, М., Нігата, Т., Оіпа, МУ., МасКепіє, В., апа Тапга, 3. (2009а) Ргоївіп Епд. Оеєв. з5еї. 22, 59-66.
Аграрі-Спангоцаї, М., МасКепгіє, В., апа Тапга, у. (20096) Меїнодз Мої. Віої. 525, 187-216.
Веїї, А., УУапо, 2.9., Атбарі-стпангоцаї, М., Спапо, Т.А., Оигоснег, М., Теоіданп, |., Ваагазпев, ч.,
Уагатійо, М.Г., 1 ї, 5., Вага!ї, Т.М., О'боппог-МеСоци, М., МасКепгіє, В., апа 7Напо, 9. (2010)
Сапсег І ейї. 289, 81-90.
Вгоиззаи, 5., Чдарроиг, М., І аспареїІе, Сї., Оитоснег, У., Тот, В., Тгапвіїдигасіоп, у., Сірет, В. апа Маззіє, В. (2008) Мо! Тпег 16, 500-507.
Споїпіа, С, апа І е5К, А.М. (1987) 9. Мої. Віої. 196, 901-917.
Рамієз 9., апа Г. Віесптапп, Айіппу ітргометепі ої віпдіє апііроду МН дотаїпв: гезідиез іп аї!
Шгее пурегуагтіаріє гедіопзо апесі апіїдеп ріпаіпд. Іттипоїесппоіоду 2 (1996) 169-179
Ое Кгиїї, у., апа І одієпрего, Т. (1996) 9. Віо!. Спет. 271, 7630-7634.
Оетешіе, М.; Ситіє, У. С.; Вепгапа, М.; Спе, С.; Мацуеп, Т.; Ведіпа, А.; Сабаїйшег", В.;
Савіаіднпе, у. Р.; Веїмеаи, В. Іпмоїметепі ої пе Іом/-депвіу Іроргоївіп гесеріог-геїаїей ргоївїп іп Те їгапзсуїовів ої Пе Бгаїп аєїїмегу месіог апдіорер-2, У. Мештоспет. 2008, 106, 1534-1544.
Битоціїй, М., Сопгаї, К., Мап МеїгНаідне, А., Меегзтап, Е., Негетапв, К., ЕгепКеп, І..С.,
МиуїЇдетгтапв, 5., Мупв, І.., апа Маїасдпе, А. (2002) Ргоївїп 5сі 11, 500-515.
Оигоспег, УМ., 5. Реїтеї, еї аї. (2002). "Нідн-ІємеІ апа Ппідн-(тоцднриї гесотбіпапі ргоїєїп ргодисіоп бу ігапвівпі ігапетесіюп ої зизрепвіоп-дгоміпд питап 293-ЕВМАТ сеїЇІв." Мисієїс Асідв5
Вез 30(2): Е9. роуїє, Р.у., Аграбі-СсНнантоцаї, М., Сацдейе, М., Риг2ег, С., Замага, М.Е., Сієдаїйе, 5., Мсі еап,
М.0О., МасКеп?іє, С.В., апа Наї, 9.0. (2008) Мої. Іттипої. 45, 3703-3713.
Еізепбего, 0., Зспулаг7, Е., Котаготу, М., апа УМаї!, В. (1984) 9. Мої. Віої. 179, 125-142
Егаієеєпогисий В, Аїїрошг М, ЕгісКкег с, Міїег О5, Кидієг МУ, БЕЇБІ Н, ГаКотек М (2003) АїІКуїдіусегої орепіпу ої Ше Біоса-бгаїп Батієг о 5таї! апа Іагде Яогезсепсе таїгкКегз5 іп поттаї апа Сб аіота- реапйпа гаї: апа ізоїатеа гаї бБгаїп саріПатев. Вг У Рпапттасої. 140(7): 1201-10.
Ееппег, Г.., М/ідтетг, А.Р., Ссоу, Сх., Видіп, 5., апа Егеї, В. (2008) 9. Сіїп. Містобіо!. 46, 328-330.
Саїеї, В., Сірет, В., Вгоиззаи, 5., Ріюне, А., МаІептапі, Е., МиїїсК, А., Сатіеєг", А., апа Маввіє,
В. (2010) Віотесппої Віоеєпад 106, 203-215.
Сап У, діпд 2, 5іейНег ВА, Сао с (2013) Сепе аеїїмегу м/йй міка! месіог5 Тог сегергомазсшаг дісвазев. Егопі Віозсі (ЕїІШе Ед). 5:188-203. Немієм/.
Сагрега, Р.; Ваї!, М.; Вога, М.; СесенНеїїї, В.; Репагї, Г..; Нигві, В. 0.; І іпататж, Т.; Маропа?о, А.;
Міїв5оп, 9. Е.; Вашб, Т. у.; Єапітігоміс, О.; Тегазакі, Т.; Орега, 9. О.; Ов5іетбега, Т. Іп міго тодвів тог Ше Біоса-Бгаїп Батіег, Тохісої. п Міо 2005, 19, 299-334.
Сегдом, М.; Оіапрега, 1І.; Миогі, Е. Зітийапеои5 5сгеєепіпд їог 238 агпов іп Бріосй бу Іїдціа спготаїодгарпу-іоп 5ргау їапдет табз5 вресіготейу їй тиПріе-геасіоп топіоппд, 9.
Спготаг!одг. В Апа/|уї. ТесНпої. Віотед. І Те сі. 2003, 795, 41-53.
Сайеї В, Сіїреп В, Атліапі В, Ссийрацйй С, Садошгу С, Сагоп АМУ, МиїйскК А, Сатіеєг А, Мазвіє В 60 (2007) Нідн-Іеме! гесотбіпапі ргоївіп ргодисіюп іп СНО сеї ивзіпд ап адепоміга! месіог апа Ше ситаїге депе-5у/йсп. Віоїесппо! Ргод9. Чап-23(1):200-9
СонНезтап евї аї., Апп. Вем. Віоспет., 62, 385-427 (1993)
Натег!в-Сазіеттанп, С., Агагппоиси, Т., МиуІдептапв, 5., Вобіпзоп, Са., Натегз, С., Бопда, Е.В.,
Вепааптанп, М., апа Натегз, НВ. (1993) Маїшге 363, 446-448.
Наддапі А5, Сагат-бЗаіаз М, Оіпд МУ, Вгппеце Е, Оєсіапеу СЕ, Вайтапп Е, Воїйеац Е,
Зіапітігоміс ОЮ (2012) Мийіріехейд емаїмчайоп ої зегит апа С5Е рпаптасокіпеїйсв5 ої Бгаіпіагдеїйпд віпдіе-дотаїп апіїбодієз ивіпда а Мапої С-5АМ-ШІ5 теїйпод. Мої Рпапт. 2013 Мау 6; 10(5): 1542- 56.
Нагогеамез КМ, Тгошіовз Е5, Оіоппе ІВА, 5сптіаї ЕА, 5спагтег 5С, догіз У. (1988) Вгадукіпіп ів іпстеазейд дигіпд асше апа спгопіс іппаттаїйіоп: ІШНегарешцшіїс ітріїсайоп5. Сіп РНаптасо! Тег. 44(6):613-21.
Ниапа У, задо А, Зипезоп А, Напв5оп НА (1995) А пем/ арргоасі ог тийіріє затріїпу ої сівїегтпа! сегергозріпаї! їшід іп годепів м/п тіпіта! Машта апа іп'аттайцйоп. ) Мешговсі Метод. 63(1-2): 13-22.
Низзаск, а., Нігата, Т., Оіпу, МУ., МасКеп?гіє, В., апа Тапга, у. (2011) РГо5 ОМЕ 6, е28218.
Низзаск С, Аграрі-спангоцаї М, мап Рааззеп Н, Бопдег Ус, Му КК, МасКепгіє В, Тапна У (20116) Мецшігаїїгайноп ої Сіовігідіит аїйісіе юхіп А м/йп 5іпдів-дотаїп апііродієв їагдеїїпд їпе сеї! гесеріог Біпаіпд дотаїп. / Віої Спет. 286(11): 8961-76.
Ідба! 00. Абшкор А. 5іапітігоміс Ю В (2011) Іпіведгаїєд ріаногт ог Бгаїп ітадіпа апа ач деїїмегу асго55 Ше ріоса-бгаїп Браїтієг. Меїпод» Мої. Віої!. 686, 465-481.
Ідба!, 0., ТкоданНи, Ц., АІраанаадвдії, Н., 7Напо, 9., О'Соппог, М., 5іапітігоміс, Ю., Тотапек, В., зЗйїПпепапа, а, апа Ариїгоб, А. (2010) Вг. У. Рпагтасої. 160, 1016-1028.
Уезрегв, Г.., Зспоп, О., Гатт, К., апа М/іпієг, СК. (2004) Маї. Віоїесппої!. 22, 1161-1165.
Кабраї ЕА, Ми ТТ. Ідепіїса! М гедіоп атіпо асід зедоепсе5 апа зедтепів ої 5зедиепсев іп апібодіеє5 ої ашегепі 5ресійсціев5. Неїайме сопібшіоп5 ої МН апа Мі депе5, тіпідепе5, апа сотріетепіатпу-деїептіпіпо гтедіопе 10 Ббіпаійпд ої апібоду-сотбріпіпа 5йеб5. У Іттипої. 1991;147:1709-19.
Кіт, О.У., Кападаїанй, Н., Оіпо, М/., Вуап, 5., мап Раззеп, Н., Нігата, Т., Еооїе, 5.)., МасКеп?ів,
В., апа Тапгна, 4. (2012) РЕО5 адмапсе ассевв А!йдизві 30, 2012, 1-9.
Коо) КотпПибег МЕ, Котпибег У, Сітпіак 0 (1986) А теїйоос Гог гереаїєд С5Е 5атріїпу іп Пе їтееіу томіпа гаї. У Мешгозсі Меїпоавзв. 17(1):63-8.
Ї еіттапс, М.-Р. ета). (2003) Оєу. Сотр. Іттипої., 27, 55-77.
Її 5, 2пепд МУ, Киосїєе В, Нігата Т, Непгу М, МаКмапаї-Меїаад 5, Рзайтап Т, Спеп МУ, 2Напа у.
Репіароду-тедіатей апіїдеп аеїїмегу іпдисев5 апіїдеп-5ресіїс тисова! іттипе гезропбе. Мої
Іттипої! 2009:46:1718-26.
Меттін, Е.А., апа Ної, М/.сх. (1995) Сит. Оріп. Бігисі. Віо!. 5, 165-171.
Мигидапапаат А, Тапна У, Магапа 5, егапітігоміс О (2001) ЗеїІєсііоп ої рнаде-аізріауєд Пата зіпаіє-дотаїп апіїбодієз іІНаї ігапотідгаїеє асго55 питап Біоса-бгаїп Батівег епаоїпеїйшт. ЕАБЕВ У. 2002 Бер;16(2):240-2.
Мигпнетг, О.М., Мапнав, А., Уаїп, Р., Мийа, Е., Мадаг, А., І одап, М., Магіпо, В., Стамів5, Е.А. (2007) 9. Сііп. Містобіо!. 45, 2737-2739.
Мнап Т, Вигдезз А, Сно ЕЕ, 5іегапоміс В, Где І, Нупупеп К.(2013) Опа авеїїмегу ю Не Бгаїп ру тосизей ипгазошпа іпдисейд Біоса-ргаїп Братієг аівгиріп: Оцапійайме емаїйайоп ої еппапсей рептєабіїйу ої сегерга! мазсцайштге ивіпа гмо-рпоюп тісгозсору. / Сопігої! ВеіІєазе. 172(1):274-280.
Місаїве М, Маїеїо-І еріпієс М, Міпага Р, Оезтаснії М. (2004) Аніпіу ігапеїег бу СОВ агайіпд оп а попіттиподіориїїп всаноїа. Ргоївїп Зсі. 13(7): 1882-1891.
Мієївеп, 0.В., Адатв, Са.Р., МУеіпег, Г.М., апа МаїкКз, 9.0. (2000) Сапсег Вев. 60, 6434-6440.
Мігоді, АВ.; КапаїКеге, М.; Мидідопаа, К.; Внугарипепі, С.; Мидаапа, М.; Загаїіауа, В.; Вепаде, У. (2009) А вітріє апа гарій теїйой ю соїІесі Ше сегергозріпаї! Пий ої гаїв апа її арріїсайоп ог Те аззезвтенпі ої агид репеїгайоп іпіо Ше сепіга! пегуоив зувіет, У, Мешговсі. Меїпоав, 178, 116-119.
Микнаї!, 5.0., Киівппап, 0.М., боцдну, Г., Реагзоп, К., Вуап, М.Т., Ноодепгаай, М.9., Нанцажі,
М., Саптіснаєі, .А., Ігиіпо, В.А., апа Ниазоп, Р... (2003) Єигк. у. Віоспет. 270, 3543-3554.
Рагагідоає, М/. М.; Висіак, 9. І; Егдеп, Р. М. Беїесіїме ігапзрогі ої ап апії-ігапеїетіп гесеріоюог апіроду Іпгоцдп Не Біоса-нгаїп Батіг іп мімо, у). Рнаптасої. Ехр. Тег. 1991, 259, 66-70.
Рагагідде, М/.М., Адм. Ога Оеєїїмегу Неміємув, 15, 5-36 (1995)
Рагагідде, М. М. Огид апа депе аеїїмегу ю Ше Бгаїп: Те мазсшаг гоше, Мешйгоп. 2002, 36, 555- 558.
Ріапесне, Т., Адпаїги, А., Ноїїїтанп, В., Віїєу, Р., РоІопіескі, у., Вгеаїнпасн, А., апа Киі5ппа,
З. (2008) І апсеї Іптесі. Рів. 8, 777-784. (510) Ргезюп Е, 5іїпп У, МіпоКоигом І, еїапітікоміс О. (2008) Стадей гемегзіріє орепіпд ої пе гаї
Зо
Біоса-Ббгаїп Батієг Бу іпігасагоїйа іпгивіоп ої зодіит саргаїе. ) Мецговсі Меїпоа5. 168(2):443-9.
Відауау, У.В., Ргезіа, І.С, апа Сапег, Р. (1996) Ргоївіп Епод. 9, 617-621.
Ворегізоп СЕ, Ріупп 5Р, М/ніе Н5, Вшиа) Сх (2011) Апіісопуцізапі пеигорерійдез аз агид Ієаде
Тог пеигоіодіса! дізеазев. Маї Ргод Нер. 28(4):741-62.
Вивз5тапп, Н., Рапінеї, К., Вадег, А.С., Зсптій, С., апа 5спаштапп, В. (2007) Єиг. 9. Сіїп.
Місгорбіо!. Іптесі. Оів. 26, 115-119. зЗатапі, А.А., Спемеї, Е., РаПамої На, І., Саїїреаи, 9., апа Вгодії, Р. (2004) Сапсег Везеагсні 64, 3380-3385.
Зативі!в В.І.., У. Сііп. Рнаптасої. ТНег., 54, 421-429 (1993)
Зіоап, І.М., ЮигевКо, В.)., (зивіаївоп, О.В., апа ВКозепбіай, У.Е. (2008) 9. Сіїп. Містобріої. 46, 1996-2001. зитбііа ВАК, 2йои ОН, Ниї ЕК, Ги 927, Воадо Ву), Рагагідде М/М.(2013) Рнаптасокіпеїїсв5 апа
Бгаїп иріаКе ої ап ІДО-ТМЕ десоу гесеріог Тивіоп ргоїєїп оїІом/пу іпігахепоицв, іпігарегпіюпеаї, апа зирсшапеоив айтіпівігайоп іп тісе. Мої Рпагт. 10(4): 1425-31.
Тапгна, 9., Мигидапапаат, А., апа Єапітігоміс, Ю. (2003) Меїнодз Мої. Мед. 89, 435-449.
То, В., Нігата, Т., Аграрі-Снангоцаї, М., МасКеп?іє, В., Мапо, Р., Хи, Р., Мі, Е., апа Тапна, 9. (2005) 9. Віої. Спет. 280, 41395-41403.
Тигдеоп, О.К., Моміскі, Т.9У., ОцісК, у., Сапвоп, Ї., МійПег, Р., Шпевв, В., Сепі, А., АвпПієу, В.,
І атгоп, А., Соуїе, М., Іітаує, А.Р., Соокзоп, В.Т., апа ЕгїзсНне, Т.А. (2003) У. Сіїп. Місгобіо!. 41, 667-670.
МУазапабе, Т., Аста Опсої., 34, 235-241 (1995)
Хіао с, Сап І 52013) Весеріог-теадіаїей епадосуїювзіє апа бБгаїп аеїїмегу ої Шегарешіс
Біоіодієв. Іпії У Сеї! Віої, дої: 10.1155/2013/703545. Ериб 2013 дип Н.Маквп ТІ, Ацау ТА (1976)
Спгопіс саїНеїегігайоп ої Ше 5ріпа! зибагаснпоїа зрасе. Рпувзіо! ВеНам. 17(6): 1031-6.
Ми, М. уУ.; 7папод, М.; КепгіскК, М.; Ріоуїє, К.; ик, МУ. и, М. Агмаї, у.; ЕПой, у. М.; Ргабни, 5.;
Майв, В. 9.; Оеппів, М. 5. Воозіїпд Бгаїп иріаке ої а ІНегареціїс апіїроду бу гедисіпа їз айіпійу їога ігапзсуїовзів їагуєї, осі. Тгапві. Мед. 2011, 3, в4гад4. папа, 9., Ії, О., Монуєп, Т.-О., Ттетбріау, Т.-Ї., опе, Е., То, В., КеїЇу, у., апа МасКепгіє, С.В. (2004а) 9. Мої. Віої!. 341, 161-169. 7папо, у., Тапна, 4., Нігата, Т., Кпієму, М.Н., То, В., Топа-беміпс, Н., 5іопе, Е., Вгіззоп, У.В., апа МасКепгіє, С.В. (20045) 9. Мо!. Віої. 335, 49-56. 7пи еї а!., Іттипоіоду апа Сеї! Віоіоду (2010) 88:667-675.
Європейський патент Мо 519596
Європейський патент Мо 626390
Патент США Мо 5693761
Патент США Мо 5766886
Патент США Мо 5821123
Патент США Мо 5859205
Патент США Мо 5869619
Патент США Мо 6054297 патент США Мо 6180370
МО 02/057445
МО 2011/1127580
МО 95/04069
МО/2004/076670
МмО2003/046560
ІМ-39335 - РСТ-СА?О14-о09861- ЦК
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ках НЕШНЛ РІСЕЧУЧ КАУНСІЛ Оф КАНАДА
СТАНІМІРОВІЧ, Даніка
КЕММЕРІЧ, Крістін
СУДІ, Трайан
АРБАБІ-ГАРУДІ, Мед.
ХАККАНІ, Врсалан С.
ЖІЛЬБЕР, Рено
МАССІ, Бернар «1205 АНТИТІЛА, СПЕЦИФІЧНІ ДО РЕЦЕПТОРА ЕНСУЛІНОПОДІБНОГО ФАКТОРА РОСТУ 1, Т ЇХ
ЗАСТОСУВАННЯ й «ї30х 125995-98. «150» 51/948,818 «151» 2914-83-06 «їБа» 18 «1705 Версія РабелтІй 3.5 «2105 1 «2115 8 «тах ПТ «213» Штучна послідовність «290» «2235 тТОоБРін-4а СорК «4005 1 зіу віу Тк Уаї бек рго Те АТа
Її 5 «ах 2 «ЙТЕх 8 «21 ПЕТ «їз Штучна послідовність «2285 «423» таБіК-4 СОдО хаОйх 2
Лів те Тер бек Аев ау ТАРОТНе 1 5 рРаве 1 їн-39335 - РСТ-СА?О14- 9958561 А «кг1ах З «211» 17 казах пет «213» Штучна послідовність «22ах «223» І6Б18-4 СОНЗ «4005 З діа діа чек Тег вНе цей дгрої1є ем Рго бім бій бег дів Туг тТаг ї 5 тв 15
Туг «210» 4 «алі 124 «212» ПРІ «2135 Штучна послідовність «2205 «2233 ІОЕЗК-а4 консенсус 2228 «2755 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «вах (1.41) «2735 Хав є 51 або 5Іп хай» «22352 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2225 (3).:13) «223» Хав є Суз або суп «22» «2235 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «22й» (53.,(5) «223» Хаа є Мві або 51 кайах «7215 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2о2у (143... 143 «2235 Хваа є Аїа або Рго «720х «2215 ОБЛАСТЬ ТНТЕРЕСУ «2925 (233..423) «2232 Хаз є Аза або 619
Раре 2
Ін-39335 - РОСТ-СА2О14-090861- ВА «22дУ с27ії» ОБЛАСТЬ ТИТЕРЕСУ «2225 (24). (24) «2232 Хва є маі або діа «720» «и21х ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «522з (37У.,.537) «2233 Хна є Уаї або Ре «25 «2215 ОБЛАСТЬ ЕНТЕРЕСУ «2223 с(а4)у.. (АХ) «223» Хаа є біу або б1ц «22 «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «22» (а5у..(45)3 «223 Хав'є їео або АгеЕ «габ0У «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «222» (87) 47) «223» Хав є Рпе або Тгр «2205 «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «322 (43)..188) «2235 Хай є 5Іу або бек «220» «2215 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «27225 (5658..(68) «223» Хза є Уаї збо тус «Дах «23415 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «222х (55)..(663 «223» Хаа є Азр або 5ІуУ «720 «721 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2225 (74у,:(74) «2235 Ха є АБ або бек «9205 «921 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ: «дйтУ 753,75) «2235 Хаа є АІа або бер к228х «241» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ
Раде 3 їМ-39335 - РСТ-сА?Оо1т3-080551- ПА «232у 47953,..(793 «2235 Хазв є їв) збо Маї «228» «2215 ОБЛАСТЬ ТНТЕРЕСУ «222» 87)..87) «223» Хза є іїув або дсЕ «328» «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «22525 (8835..1883 «2235 Хва є А13 або 5ег «8285 «271їУ ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2225 (1193. 11193 «223У Хва є зви або бій «35ах 4
Хаав Уаї Хав Сей Хва зі бек б51у бі 51у сен Маї бій Хаа 5іу ау 1 5 18 15 бес. Се Аге гей звроСує Хав Хва бек біу біу Тр оМаї бег бро Те 29 25 зо
Ата меж сіу Тер Хай Агв о о1п А1в Рго Б1у бує Хаа Хав біг Хав Уві 48 45
Хаа ніє ТТе тТве Трр о Беє Аср обі Те То АРЕ Хва Дів бе б5ес Уа 5а Ба 56
Суз Хаа Агро РНє Тк ї1е Зегодге АвроХва Хаз Гу Абло оті Хаа Туг 65 7 75 І515,
Сеч чіп Меї Депо зер оїец хХаа Хаав зіц дер Таг о АЇТа Уді тТук Ту Су й 85 ща 98
Аза Аїа баг Те Рне еп АгЕ тів Цец Рго їм 615 58 Аа Ту ТНе 196 185 118
Тук ТРо біу бІп біу Те Хаа Уаї Те Уві бек 5ег 115 420
Раве 4 їМ-з5335: - РСТ-СА?О34-909861- ПА «2185 5 «211ї5 154 «-2122 ПРІ «213» Штучна послідовність «22ах «2235 ІСРІК-4 УНН «4885 5 атй у уз Ме бій біч Зевс біу 51у БІу Сем Уаї біп ліа б1у 51у ї 5 18 15
Зег беп АгЕ їец бек Суз біц Маї беб біу б1у Твг Маї 5ег рго ТЬг 28 25 за
Аїз Меї оту Тер оРве Ар обіп АТа Рго Ту сСу5 б1й Аг 510 Ре маї 35 40 45
Зіу Ні ї1е Тіг о їгробеє Ага о б1у Таб їБгоАкв Ууаї Аїа бегобег Ууаї
БО 55 Ба куб Азр.Агд Ре Тб о Т1і6 бег ДК А бег Аїв Гу дп ОТВе Уві Туг 78 75 ва і8ви ій Меж о Абй бегоіївєй Гу Зег бій А5ротвг АТа Уаї Туб Туг Суз 85 за 95
АТїа А1із заг тп Бе (ец о Аеф Ї1е рей Рго біц. бій 5ес АТа тує ТАС 180 185 це тТуг Тероаіу бів оіу ти о б104 Уві Те о Маї бег о беє 115 126 «Т02 56 «211» 1274 «2123 Пет «213» Штучна послідовність «их «2235 ІСБІ18-4. НІ «дай» б
Раве 5.
ІМ-39335 - РСТсСАгатА-а0О851- А біп Маї бІп Меб УМа1 013 5евєб 01у 01у 01у Гец маї біп Рго сіу 1у 1 5 10 15 чек без Агро оГеу 5егоСує дів Маі бег бІ1у б1у Тве Ма! бЗег Рго Тве 2 25 за
Аїа Мет б1у Тер Мві АгЕ біпод1ів Рго о1у дух бІХу вм біш Тер Уві 48 45 біу Ні 116 Тіт тТерозег Або бЗ1у тв Івг дев тує йіа 5ег о бег Маї за 55 са їу5 5іу дея о Рие Те ї16 Зекб одбБ Авродбй бБеб Гу Ап оте уа1ї тує 85 7а 75 а
Кеш аїп МекоАбп 5ег гер Аге Аїв Бій Ар Тс Аї1з Уві Туг Тугв Су» 85 90 з5
Ата діа бек Таг Ре бен Акв І116 ес вро 010 бід бег діа Тук Тае 1952 195 1185
Туг ТРр Бі бів біу Тпрогбец уві Тис уаії беє бек 715 120 «2102 7 «211» 124 «212ю ПРІ «2135 Штучна послідевність «220» «223» ТОоБІів-4 НІ «пвайх 7 сіл маі бів чем Маї бій бегобіу 01у біу їв Мі піп Рго біу 1у 1 5 та 75
Зек о ієц дгЕ їси 5ес Су діа Уаії 5ег б1у біу Те Уаї 5ег о Рго Те 28 25 за
А1їа Меє біу Тер Ре Асв сів діа ргро б1у уз 0іу се біз не Уві 35 де 45
Равре 5 тїх-3а335.- рРСТ-СА2014-909853- ША біу Ні ї18 тТОе Тер об5ег Агро біу Те Тк дев о Туб Аза бег бег Маї зе 55 ба цу б1у Ага Ре ТИг о т1іе Бегодев дер оАЗи 5еб фу деп тк о маї Тує 55 70 75 ща меш біп Меї Аєпобегоіен Агв АТа б1іц Авротиг о Аіїа Маї Тугс Туг Суб 85 за 95
АТа Аїа бе Тіт РПпе ей АгеЕ Ії Гец Рго б1ц 0їм бе Аїа Туб Тве та 105 119
Тук Тер б1у бів біу Тигореч Маї Таб Маї 5ег о 5ег 115 128 «230» 8 «2115 124 «2125 Пр «2133 Штучна послідовність «га» «аа3ЗУ Тшвін-А А «вро» 5
Чіп Уві бій сец Уві бІ0 5ербіу 61у біу гей Маї бів Рго б1х Я1у 1 5 310 15 бе їеи Дгвоїец 5ег Суб Аїа маії зЗек б1у біу Тиг Маї Бек Рро те 25 Зо
Атїа Мет сту тер рйе др озів Аза Рко б1іу їу5 6б1у ем бі Ре Узі ла 45 сім нів Ї1їе ТвгоТеробеє дев обіу Те Те оАбЕ Ту Аза Зегобеє Уаї 5а 55 ба
Гу« п1у АгвоРМе ТИ І16 бер Агр Ар бег бегоГу5 Ай ТВгоуві тує 655 78 75 зо
Раре 7
18-39335 - РСТ-СА»ВІ4-609861- ук іїев бій Меї Абп бек Бец Аге Аза 5Щ0 Ар о ТвВе Аза маї Туб Тує Суз 85 98 35
Аїа Аїа баг Те РВе гей дрв 112 сво Рго 015 бі бек Аза Тугб тТВе 1960 185 а
Туб ТрробБіу біп сЬу Ти о їеп уаії ТнгоМаї 5ег бек 115 129 «5305 9 «етїію ра «212 ПРТ «213» Штучна послідовність кедх «2235 ІбЕ18-4 Н5 кава» 5 іп маї бій сей маї ої бег біу біу 3у їв Уаі йбп Рго біу бі 1 5 18 15 баг мед дев їеч бег Сух Аїа Маї бег біу біу Твг Маі бессвга те 20 25 0 діа меж біу Тер.орБе Аг біп Діа Рго Бі їу5 біз дер біо ре уві ай де б1у Ні5 І1е ТР Тер обег Асв о біу Те Тбе Абе Туг Аїа Зеб о 5есоуді
БО 55 ва бух бБ1у АсЕ не ТИМ І1ї8 Зег АгЕ А5р о бес ов Гуз йзп твсомаї тує
Б 7а 75 за
Сев бій Меї деп бек БецшоАре АТа бій А5ротвг о АтТа Уві Туг Тугсо сСух 85 9е 95
Аїв Аїа бег Те Ре фен дея Те без Рго біз бій бек Аза Тує ТВ 188 105 зло тує тер обу біп біу тв бе Маї ТБ Уаї хеговег 115 120
Раве 8
І1М-39335 5. РСТ-СА?гОТ4-000861- ЧА «21ї1аз 19 «211 378 «2125 ПРТ «2135 Втучна послідовність «229» «223» ТОБ -Я консенсує-Ес злиття «205 «21 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2227 (2),.() «223» Хав є 013 або бій «гах «291 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ кагах (331.,53) «29735 Хаа є ух або б1п «27» «221» ОБЛАСТЬ ТНТЕРЕСУ «2929 (53,45) «2235 Хава є Уаї або 530 «2205 «2215 ОБЛАСТЬ ТИТЕРЕСУ «2225 (143. (14) «233» Хва є діа або Рго «22дх «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2225 (233..(233 «223х Хаа є Діа 8бо 510 «2205 «2215 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2325 (34).:(283 «2235 Хаа Уаї мили дів ката «2315 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «22235 (373.37) «29233 Хаа є Маі або Рпе «228» «221» ОБЛАСТЬ ТНТЕРЕСУ «222х (А4),..(84) «223» Хва є Біу або 01ц «290
Баре 9 їн-39335 - вРСтесСАгО14-0009615 МА «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «й29 (45)..145)3 «2323» Хаа є зе або АКЕ «?еах «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «вах (47)..147) «77235 Хаа є вне або тго «20» «2215 ОБЛАСТЬ.
ІНТЕРЕСУ «227» (8935..49) «223» Хав є а1у або 5ег «ай: кг» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «222» (88),.158) «223» Ха є Маі або Туг «220 «8215 ОБЛАСТЕ ТЯТЕРЕСУ х2225 (65).-(66) «273» Хаа є Ар або біду «Рай» «231» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «й» (7У4),.(74) «223» Хаа є Азп або 5ег «2» «32їх ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2293 (753..0753 «2235 Хва є Аї8 або 5ег «220» «а2їз ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «222у (793.78) «23» Хав є Сец абосув1 «22» «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «222» (873.87) «323» Хава є Гуз або Аг «205 «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ ка22» (883..(88) «2235 Хва є Аїз або бек «2205 «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «222» (1193,.(119) гаве 30 тм-39335 - РСТ-СА2014-000861- ЦА «223» Хва є Гец або 12 й «ца» 15
Хаз Маї Хва сен оХаа 1 5ег о біу 6І1у 631у їєй Уаї бій Хаа біу 51у 1 5 тю 15 сек іви Аг о їебобек Сух Хаа Хав бег с1у Б1у Тйг о Уаї бе Ре тТВг 28 25 за
Аїа Ммеб біу ТР Хаз Аге біп Аіз Рго Ру ух Хав Хай біб Хва Уаї 49 45
Хаз Ні 116 Тлг Тер 5абсАев біу Те таб Абе Хав Аїа зебр 5ег маї за 55 бо
Туз Ха Аги РНе ТНгоЇТе 5его Дер Аврохва Хаа Гуз Ази ТВгб о Хаа Туг 7а 75 о
Сен бій Меї Ай бек їв) Хаз Хаа біб А5р о Тве Аїа маї Туг Туг о Сух 85 ча 95 дІа АтТа бег о Трг Ре мем Агдоїі1і6 бен Рго біц 51 бег Аїв Туг ТС 189 105 116
Туг Тер б1у іп б1іу тТйг Хва уаї Ти? Маї бек обег Меї ТНеомаї Ар 115 129 125 іїух ім5 бе сій Бко бек бі Рео Ті баб ТВг 118 А5порго Су5 Рго 13а 135 їла
Рго Су Гуз бін Сух Ні цу Су Рео дів Рго Азпобез бій б1у біу 145 ї50 1558 ї6о
Рго чего уві! Бне ІЗ РВесрго РРО АБ І1е їу5 Ар уаї Сен Меб Тіе 165 179 15
Зег їви тТВе РКО бух Узі ТВеоСує маї Уді Уаї А5ро Ма! бек бі А5р 150 185 1939
Раве 11
ІМ-39335 - РСТ-СА29145-08086- А
Ар Рго Аєромаї бів 1185 Зеб Тер Ре уаії боб о д5п маї бі Уві Ні 195. 290 205
Те Азїа б1й тТигобіп Те Ні Абе бі А5р Туг Азп бек ТпроїТе Аге 218 515 258
Уаі Маї Бек Те Сез рго Ще їй Ні біп о дяр Тер о Меї бек Зіу Ту 228 2389 235 40 бі РИ вуз Сух цує уаї А5подбл о їух Др сец ргОо баг Рго Т16 1
АБ 258 жа
Аге Тс І1е бег оіїух 1Ї1е 1уз біу Мей маї Аг АЗїа Рго бій Ма1ї Тук 25а 265 270 ї1є Гей Рго вро Рго дів бі біл бе бек дра гу Аб5роуаї 5ег Гей 275 «ва 285
Тве Су тей Уаї Маї б1у Вп Аби Рсо Ту Дер ів бе омаї бій Тер 298 235 зав
Тае Бер Аби сіу НЕ5 Тис БРи 33 Аби Тугб фуз дер ТК АївоРго Уві 3285 319 315 328 сез А5р бек АЗробІ1у бег Туг РБе ї3е. Туг бев їуз Сем Ал Мет уч 325 з3а 335
Тпгобес ув Тер о біц Гуз ТвйбоАзробеє Ре озеб Суб дп о Уді АгвоНіє з4о 345 359 бій шу 18 гу Ап тує Тук Бен оїу5 у Тис ТІ баб дра боб рго 355 зей 365 1у Сух 370 «2105 їі «г11у 37 «81235 ТТ ка13» Шуучна послідовність
Рава 12
ІмМ-39335 - Дст-сА2а14-06085- МД «28» 23» ТОаБ1-4-рс злиття «звох 1 іп уаі губ 'їєн 510 біз берсояіу з1у Біу ей Уві біл Аїв біу 61у ії 5 19 415
Бег бец АгРЕ їец о бег Суз 51 Маї 5ег 51у 5І1у ТВгоМаі бек о рко сте 28 25 за
А1їа Мет б01у трроРвВе дгЕ біб АТа Бго б1іу уз бі» Агв вів Ре Маї 438 45 ату Ні І1їв ТНК оОтТеРр бек дгв о сіу ТК Таб Ар Уві АтТа бег 5ег Уві за 55 50 їу5 Ар Аге РЕ Тпг о ї1е бевє Аве Авробеє діа вуз Авп Те Уаї Тує 65 79 75 а
Пец сб1їа Меб дсп бек бей у5 5ег сій дер ТийгоАїа Маї Тує Туб осСує 85 за 95 аїа Аїа бег таб Ре Сез Ага їі Гей гро біз бр бек АТа Ту ТВе ї1ра 1985 118 тує Тер Б1у бій біу Те об)п Маї Те ув) бек бек Ме тТиБ Уаї Азе 115 128 ї25 їУу5 Гу (ен біц Рго зеє бБіу Рго ї1е бег Таб о 112 А5поРго Суз Рго ї3а 135 140 ге Суз іуз Бій Суз Ні5 Гуз Су5 Рео діа Рго Азп ів бів б1у о1у 135. І150 155 160
Бго 5ег омаї Ре ТІіе Рпе Рго Рга Аби їТе Гу5 Або МУаї ім мет 112 ї65 178 175 б5ег тез ТАК Рго ж Маї Те оСузх Маї уаї Маї А5р Ма) бег 516 А5й 182 185 196
Раве 13 їМ-39335 - РСТ-СА?Ооїа-Вво861- ВА
Ар го Дер омаї б1іп Ті 5ег Тир Ре Уаі Ахп Аби уаї 01у Узі Ні 195 298 225
Тве АТа бій Тео б1п Твг Ні АгБ бі А5р о Туб Ай 5ег Тг Тів АгЕ 718 215 29а уаї Ма1і бек ТвгогГей Рго І1е з5іпоніх 618 А5р їбр Меї 5ег б1у ух 225 238 235 248 510 Ре єу5 Сує ту Уаії Аби Депо їу5 А5робей вго бер го Те 51 245 250 255
Агв те їїе бек уз І18 фу З1іу Ген Маї Агро Аіа Рго їй Маї тує 758 655 279
ІТе гей РРО Рго Рео Аїа бій біп Гез бе Абе вуб Ар Маї бек ем 275 288 285
Таб Су без Маї Уві с1у Ре Аєп Рго б1у дер Тіє Зег Уві б Тео 290 295 за
ТВгобег о двп біу Ніє ТИ біц бій А5п оту бує АвроТВг о АТа Рго Уаї 395 316 315 329
Сем Ар 5ег Ар біу бек Туг Ре І1е Туг зег о1у5 еп Ап Мет Гу 325 за За
Лвгозаг о гує терії рух ТК оАзр бек вва бек Суб дз Уаї Аг НІ за за5: 358 біз біу ви губ АБи Ту Тус сви Гуз гу5 Тк 116 5ес дев зек бко 359 60 зЗо05 сіу ух 378 «2ї1йаж 17 2115. 1367
Баве 14
18-39355 - РСтТ-САбО14-а098БІ- ПА «212 ПТ «2135 Штучна послідовність «2282 «вазу ІБР «айву 15
Мей йуз бег біу Зег біж біу біу Бег Рго ТВг обег без ТгробІу Ге ї 5 18 15
Кен оРне їей бе Аза Аїа Сей бек рей ТгроБгОо Те бек біу 515 Ті1е 28 25 30
Су бБіу Рго біу І1їє Д5р І116 Аг оАд5п др оТуб бів біп рем ву5 Аев да 45
Сем бІм Ап о Сує Тиб Маї ї11е бій 5Ііу тує беу Ні5 Те їв бей ї16 58 55 во б5ег Гу АтТа віч АброТує Агро 5еб Туб Абе Ре рРго Гуз Бей Тиг о Уаї б5 78 5 а т1е тТве бі Тук Гей веб бен Ре ага Маї Аза біу Бе біц 5ег ей 85 за з5 сІ1У А5р ів) Ре Рго Аля їец Тир о маї ІТе Агро обіу ТрРр Гу ви Роє 1009 125 118
Ту Да Туг дж їец Маї Ше Рке бій Меї Типг Аа Гей Гуз Ар Т16 115 138 25 бІіу цей Туг А5погеу АРЕ Абп о ї16 Тпб оАев о 51у А1а ТТ АбЕ Т1е біб 139 135 148
Гу АЗп о Аза Азр о Беп Суб Туг ій бер їпе маі А5ротвробеб їву 116 145 150 155 360 їец А5р о АтТа уаї бег йзп о Аби Туг ІТе ма1 б1у А5п о їу5 Рсо Рео Гу 165 178 175
Раве 15
ІМ-39335 - РСТ-СА?О14-006861- ЦА зі0 Су 61у Аз іеч Суб Рго б1у Те Мет бі0 бій бу5 Рго о Мех сСух 1860 185 150 бій уз таб Тиб ЇТе Аа Ахо біо Тук Ави Туг Агв Суб Тер Тв Тебе 195 зай 205 депо Аг Суб біп уз Меї Су5 Рго Бек Тс Су 51уУ Туз Аг Аїа Су 218 215 229
Те бій Авп Аби бій Су5 Сух Ні Рго бій Сух Ге» біу Зев Сух бесг 225 238 255 240
А1а Рг Ар Ап Ар отТве А1їа Сує Ма1і Аа Суб дев оНів Туб тує Туг 245 250 255
АТїа 5іу Маї Суб Уаї Рго діа Суз Рг Рго Ап Таб о Туб Аге Рпе 01)
І 2656 265 270 біу Тер Аг Су5 Маї Азр Абе дер Рпе Суз АЇВа Абп Т16 се бег діа 75 288 285 сін бег б5ег Абр 5ег бі 61 ле Маї Т1е Ні Ар б1у бій Суб Мех 299 255 зоа І сів бій Су5 вБго бег о біу РМае І12е дге деп бІу бе біп бек меж Тут за5 310 315 32е
Су Пе Рго Сух 51 БУ Рго Сує Рго Му5 Ма1ї Суб б1ц бі 610 ув 325 зза 335
СУу5 ТигоСух ТВб Тіе Авробег Маі Те бег АЗа бів Меї Гез бій оту 346 345 з5а
Суз Тігої1е Рйє цуз біу зп іви іо І12 Ап ої1в дев Аг б1у деп за 3655 я
Ап 1126 АТа заг бів Сец бій Або Рйе мес 5ІТу їв ІТ бів Маї Уа 370 375 зї8а рРаве 16
ЇМ-39355 - РСТ-СА2О14-800861- НА
Ти біу Туг маї Суз Тіе Агро Ні бе Ні АїВ8 фер Маї Зег ем бег 385 зай 395 490
Рис ієп ух А5п о Сеу АбЕ ей Те Без б1у б)іц 633 бій Меч біз щ1у а5 4193 чі
АБп Туг бек Рре тує Уаї це Ар Ази 01 А5п Се вій бій Гец Тер 20 425 зе
Ар о ТгроАбр Ні5 Абе Аблогей ТИР Оїіє Бу Аіа біу їує Меж Тут Рне 435 ада 445
ЯАїа Ре Ап бро бує сей Суб Маї бег бій її Тук йге Меї бін біч аа 455 зва
Уаї Те б1У Тео ує б1у ГЕ біп бегогу5 біу дер Ті АзпоОТВе АгЕ 455 470 475 482 дп Ахп бі біз Агв о Аіїа бев бух б10 бег о йхр о маї бер Ні Ре Тнг 485 98 вн зас Те Тве отвг Бек офуз дей Аг І) Її 18 Те Тер Ні Аге тує вав 595 зі1й
Агв Рго Рго А5роТує Агя Ар Гец 11е бег Реве Тв Ма Туєб Туг Су5 515 5 525
Аза рго Ре Су Азпоуаї Те сій Туб Азропбіу бій Азр діа Суб 538. 535 | зда
О1у бБег Азп Бе Тер дбп Меї Уаї Азр Маї А5р ен го го сАза був 545 55а 58 зо
Ар уУаї бі Рго ПТУ 116 бец Гей Нія біу Гей бух Бо Теротне біп 655 ва 575
Туг Аїа Уаї Туб Маї Куб Аїв чаї Ти бе) ТАЄ оМежк маї 610 АБ А5р 58 Зи5 590
Раре 17
Т1М-39335: - РСТ-СА2О14-090851- ПА
Ні Хе ке с1у АТа Куб 5ег бій Іїе Геу Тує Пе дгЕ ТР Аби Аїа 5З5 50 5о5 ек Ууді Ро 5ес Ге бро Гео Азр Узі Сех бек ліз баг оАбп о З6г зе 618 615 в2а бег бів (ен 112 Уз3і Суб Тер деп ого Рго бегобев о вго деп біу деп 625 653 635 646
Сеч бек Тук Туг І1їв маї Агв Тер бій Аквоаїй рРго бій Ар обіу тує вад 65 055
Меи тус Аге Нія Абп о Тук Су 5егоЇїу5 дер туз Т1е Рго Ті дДгв Гуз 6Ба 5655 Б/в їує АТа Азр о б1у ТВе ТТе Азр о ї1е тб бти МаЗ3 те бій да Рго був 6575 БО 585
Те біс уаї Суз б1іу біу бій Куб біу Рго Суз Суб дів Суб РгО Гуз 699 5955 7
Те б1ч Аїа 031: їуб5 біл Аза бій ух ОБ 01: АТа 0105 Тут Аге Гуз 785 710 715 720 май Ре бій А5пП РНЄ зей нів деп бег ІТ Рпе Уаії Рго АгРв о Рго бій 725 730 735
АгЕ Суб Ага Агро Ар маї Меї іп Маї Аїа А5по т? ТИг о Меї бер бег тав 75 758
Агв о Зег Аг Ап тн таб о АТа Аїа д5р їй Туг дев ІТе Тпг дер рго 755 758 785 вів бів без би тТйб бів Туб бго Рв Ве бін 5еб ги Уаї до Ап 779 775 759 їу5 бін Агв Те омаї 116 бек Ап Гей Дев о Рго Рле Те бе Туг Аге 785 798 795 ве
Раре 18
ЇМ-39335 - РСТ-СА2014-080851- ЧА
І1е А5р тів НІ бек о сСує Ап Ніз 015 дів бі фу5 ев б1у Су5 баг 05 чІй 815
А1а бег о Аб5п Рпе Маї Рвє Аза Абе Те оМеж Рго АТа 015 Ту АТа Авр 828 825 яза
А5р о ї1е Рго біу Рго Уві Те о Тгроб)ін Рго АбЕ Ксо 530 Ап Зєвк Це 835 вай 845
Рпе веб їу5 тв о Бко 510 Рго б1ц А5в Рго Або б5іу їву Т1е бе Мет 850 855 85 тус біо їіе цуз Туг біу бек біп Маї бій Азр біп Агво б)ш Су Уаї 865 878 875 830 бе Аг оіп біч Туб АР Сує Туг ту 51у їз їу5 Гео дев АР Гей 585 ва 855 деп оРго біу йзп Туг Те А1іа др Т1іє 610 АТа ТВсе бер осеш бегб 61У зва зеа5 939
Ап оБІУу Бег Ткр Тег оАб5рорго Уаї Рбе Рбе тук уаї б1іп дів Суб Те че 928 525 51У Туг біз деп РНе 112 Ні5 сей ї3е Т1е АТа Гец Рго Узі Аїа Уві 930 535 зда іен Сец їі маї біу біу цей Уа1 Т1е Меб беш Туг маї Р Ні Агр з45 95а а55 зве фух Аг А5п о А5п о бег АгЕ без Ту Аби біу уУаї їео Тув АЇз Зак маї 965 975 375
Ах РРО бтШ Туг Ре 5ег оАтіа Аза А5р уві Тук Маї Рго дер бій Тер ва 985 зва 5іш Маі Аїа Ага бій Гуз Т1е Твко Мебсобег дер об) зей біу бій б; 95 това 905
Раре 9
ІМ-30335 - РСт-сА2О14-о00551- ПА б5ае о РНЄ пІу Меж Уа! Тус біц біу Маї лів їу5 оту маї Уаї Ку 1919 1915 1928
АБр бін. Рго бім Твб Абе Маї АТа ї1іе ув ТР оМаї БП ом Аза 1825 1830 1835 діа б5ег Меб Агробіз Аев Т16е6 бід Ре зєв Дер бін Аза бек уді 1846 18545 1059
Меж уз біш врйе Аби Сух Нія Ні5 Мвї Маї АгЕ ї6и бен сі1у Уаї 1055 1859 1965
Маї бБег бій біу бій Рео Тео Гез УВ1 Т)е Меї 53й фен МЕеЕХ ТАе 1876 ТВ 1080
Агв о б1у Бр ієемоїу5 бек Ту Сец Акв 5ек ее) дер Рго бі Меї 19855 1990 1095
С10 Авпо АБпоРго Маї сей Аїа Рго Рго бер ГеЦ 5ег Гуз Меї Ще 1100 1105 1316 біє Мет діа б1у біш т1Те Аіїа Ар біу Мей Аза Тук (еу А«и діа 1315 1126 1125 депо цуз Рпе маї НІі5 Аєв дер еш Аза Аїз Ав ап о Су Меї Уві т1І3а 1135 1348
А1їа бід др обйе те Маї бує Ї3їе біу Ар Рйе оту Меї Тс Аге 1145 1156 1155
Авр Гі Тукобіш таб д5ротує туго Агн о Сує Я1у бі Суб біу 12
Мвбо 1165 1178 уеш Рго Уаї Аев Тер Мес бек рго бій хегоієу ух Азр б1у Уві 3175 ї189 1155
Ве Те о тТАг тує зегоАвроуаї Теробег о Рве б1у Маї Уві ен тгр 13938 ітаУ 1209
Раре а
ІМ-39535 5 РСТ-Сдоб14-06а861- ЦА біз ї1е Аїа Таб сен Аза біб бій Рео Тує бій О1у ев 5ег Ап 1295 1210 1715 січ бій мМаї Генсдер Ре уаї Мек сій б5іу 5З1у іви фен Ар у 1228 1225 1230
Ро дер о АБЗп о Суч Рго Ар Мек ей Ре бій тей Мек Абе Меї Су» 1235 124й 1245
Твр о біп о тує деп Рго Су Меї Агев Рго 5ег Рпе Сей б) ї1е Т16 1250 1255 12650 тег Бего їі їу5 біЧ Бі Меї біц Рго біу РБе Агро біч Ма! 5ек 1265 1276 1275 вла Тук тук Зег Бім Бім Абй Суз Сец бго 14 Ро б31и бі ем 192858 1285 1290
Азо Бей бій Рео біч Дей Меї 01 Зав о уаЇ рго Бе о дер рго бе 1295 1505 1385
Аїз бег 5ег 5ег бЗег бе бго Сец Рго Або Аге Ні Бег б3іу Ні 1315 1315 1329
Му Аїа іш Ахп о біу Рго 61у Рго біу Маї Кей омаї без Ас Аїа 1325 1330 1335 бег Ре Ар о біц Аге бій Рео Туг Аза Ні Меб Аби біу Біу дер 1340. 1345 359
Су Аби 138 дер Аза зез Бео беч Ргообій Заб бек ТАг Суб 1355 1350 13655 «23а» ТЗ «ех» 4 «2123 ПРІ «3» Штучна послідовність «2205 «223з Сайт розщеплення фурином
Раке 21
Ї18ч-39335 - РСТ-СА?О14-000861- ША «два» 13
Агв Гуз Ася АгЕ ї «ла» ЛА «82115 33 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «2295 «223У Прямий праймер «обу а севнатссвс сассесєвави ТсСівЕСтссв Ба ЗА «2105 15 «2115 34 «232х ДНК «213» Штучна послідовність «229У «97235 Зворотній праймер хаайх ТУ всуставаєс аваавсйїйс абсвіссівЕЕ стрЕ за «-3102» 15 2115 45 «йИах «ДК «2132 Штучна послідовність «иа «923 МІ праймер «аа» 16 всссарссвв ссатвиєсямМ КЕсрсаксів шіввактств врЕва «5 «21а» 17 «211» 45 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність 49205 «223» МО2 праймер «щОх 17 ксесарссве ссатввесса ветааавсів рарвавтств вра 45
Раре 27
15-39335 - РОТ-СА?ОаТ14-во0851- ОА «210» 18 й «117 45 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» М33 праймер «1оах 18 всссавссвв ссаїриссса вистсарята савсіввівв антсї 45 «21945 19 «211 21 «2127 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» : «223» СНІ праймер «аб: 19 сЕссатсаве віассавтов а 21 «2105 20 «2113 78 42125 ДНК «2135 Штучна послідовність «20У «223 СН2ЬЗ праймер «й» 20 вБЕВТасств тсасссвсвв абсансєра 29 «31935 1 «її» 34 «2125 ДНЕ «9135 Штучна послідовність «220» «2235 М27 праймер «4085 31 саєвтвтана сісесеврссс звссввссат ЕВсс за «72105. 57 «2115 47
Раке 23
1й-39355 - РСТ-САгО15-в0а561- МА «2123 ДНК «2135 Штучна послідовність «2289» . «2235. МО8 праймер «абз 22 саєксекана СЕсСсСтвессв ЕССТрЕССТв арравасвес насссев 47 «2Авх 23 «211» 38 х2125 ДНК «5135 Штучна послідовність «2205 «й23У Прямий праймер «40ах 23 тахказраса ссавресссав рсааавстреЕ арравтсї 38 «їж 24 «211» 38 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «тих «2235 Зворотній праймер «дод 24
ТСвЕсЕсвраї сстваврара свесрасств за «2105 25 «2511» 18 «212» ПРІ «7135 Штучна послідовність «22» «223» І5Е38-4 пептид «аа» 25
Бі: пе уа1 53у Ні Се Те Тер беб Аре 1 5 16 «81» 26 «2ї1іх 19 х2ій» ПР «21325 Штучна послідовність
Раке 24
ЇМ-39335 - РСТ-СА2О14-90е861- А «223У ТбБ1А-Я пептид «3065 26
Без беб Суз 510 Уаї бек біу Ту Тео маї бе Рго Тс діа Мех о1у 1 в; 18 15
Тер Ре Асе «818у 27 «її» 15 «213» ПРІ «233» Штучна: послідовність «220» «23 ЕСе Я вС5-Т15 пептид хаВах 27 ї1їе Те Тер о б1у бу А5р Ав Те рпе тує 5ег Ап о хеє маї Гу 1 5 1а 15 «30 -23195 9 «2125» ПЕТ х2135 Штучна послідовність «2205 «2235 дра. пептид «абз 28
Те оте о Туб Тук Ата А5б о 5ег Уві губ 1 У «з18х 29 «2135 11 «Фа125 ПРТ «2135 Штучна паслідовність «га» «тйи3» АгВа.1 пептид «ва» 29
Риде 25
ІМ-393855 - РСТАСАбаза-вовве1- ЧА біб Ре Уві Аїа Аїа бІу бег бек тТиг 01у Аге 1 5 16 «га» 30 «211 ї1 «2125 ВР «213» Штучна послідовність «2» «223» Ага.1 пептид «двах За
Тигогве Зег Меж Ар Рго Ме Аза Трр. Ре Агр 1 5 18 киїй» зї «21125 25 хат2г» пет «2135 Штучна послідовність «ЩеВУ «2235 да пептид «1005 зі
Азробіш Ту Аа тує Тер обіу бій біу Те бБіп уаї Те уаї 5его5ве 1 В 18 15 бІіу бій діа б1у б1й біу Бек біч бій су о 755 «21а» 32 «21їх 1 «212Уу ПРТ «213» Штучна послідовність «2285 «223» б? пептид «0» 32 дер Ре чек Азр Тук Уаї Меж біу Тгр Ре дге ї 5 10 «2105 33 «2115 15
Раре 26 їМ-за335 5 РСтУсдІа-роа8е1- уд «125 ПР с2135 Штузна послідовність «ех «2235 Кб2 пептид «цща0» з3
Тен біз 5310 Хек біу а1у біу еп Уві біп дід б01у Ар 5ег Геи АгеЕ ї ь та 15 «2165 34 «21412 32 «еї2з ПВ «213» Штучна послідовність «2205 «2935 62 пептид «вах з4
Депо Мет Уа) Тук іец о б1іп Меє А5п о бег їец вух Рго біб А5р о Тпг А1а 1 5 10 15
Ууаі Туг Тук Су АІв Маї А5зп бег АТа б1у Тк Тук маї 5век Рго Арк за «2105 35 «2її2 їй «2123 ПРІ «213» Штучна послідовність «т2ах к»235 Пептид альбуміна «4а8а» 35 їв Рео бій Узі 5еє Те о рго ТР ово мМаї біш Аїа АТ деЕ 1 5 їй «2185 35 «2і» 29 «2323 ПР «213» Штучна послідовність «220» «223» Галанін-цистеамід
Равве 27
ІмМ-39335:- РСТАСА?ОТА-009861- МА «400» 36 сту тер тпг гей Авп о бег дів Біу тТуг беи ме піу Рго Ні Аїа 118 ї 5 18 15
ДероАзп Ні дер о Зег Ре бек Ар оБух ні 51у Сей Те 28 5 «2105 37 «2ії5 19 «2125 ПРТ «з13х Штучна послідовність «2205 «2й53з Сигнальний пептид «400» 37
Мех бій Рне б1іу цей бе Трр Маї Рне Гец Уа1 АтТа зів беч уз с1у 1 5 18 15 чаї віл Суб «2194» ЗВ «231» 371 «йі25 ПРТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Ес-І5Е1К-4 консенсус злиття «2205 ка21у ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2225 (2481..10483 «223» Хай є зі) вбо аїп «225 «2215: ОБЛАСТЬ ТНТЕРЕСУ «282 2583..(2508)3 «2235 Хаа є Гу5 вбо бів х22О» «и2їз ОБЛАСТІ: ТНТЕРЕСУ «2225 (253у..(257) «223» Хва є Ма! вбо бід
Баре 28
1У-За3а5 - РСТ-СА?а14-620851- ПА «2245 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2722 (2613..(261) «223» Хаа є Аїа або Рго «2205 «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2923 (3783..1778) «223» ЖХаа є Аїа або б1ц «2203 «и2їз ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «22235 (571): -(271) «223» Кай є Маї або АТа «22» «2215» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2225 (9843..(2841 «2535 Хаз є Уві збо РВе «220 «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2225 ч2913)..(95) «2235 Хав є Б1у або 51и ках «2215 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2225 (292)..і12921 «223» Хаа є Цен або Аг 220» «2215 ОБЛАСТЬ. ІНТЕРЕСУ : «2222 (2543,.4204) «72235 Хаз є Рлйе або тер «220 «2915 ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2223 (2963..(296) «723» Хаз є біу або зег «720» «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2223 (3073..(397) «2235 Хвда є Маї або Тус «2205 «221» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «222» (3133..(3133 «223» Хаа є Ар або б1у «игах «2215 ОБЛАСТЬ: ІНТЕРЕСУ
Раве 28 бо
Іщ-39335 - РСТ-СА2б14-рО0861- А «2225 (321)..(321) -2235 Хаа є Азп або. 5ес «2285 х22їх ОБЛаСТВ ІМТЕРЕСУ «222» (392).,(322) «и285 Хва є Аіз або 5ег «г2йх «віх ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «222У (3963,..(326) «223» Хва є Геусабо Уа «225 «дух ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ ет» (334).,(334) «223» Хав є Туз або АгЕ «2785 «821» ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «222» (335)..4355) «223» Хав є АКа або 5ег «228 «диїу ОБЛАСТЬ ІНТЕРЕСУ «2225 (3653, 36565) «223У Хва є ву або віп «аа» ЗА сін Рго его біу рРго Іі 5ег Те тів А5п рго Сує Рго Ргб о Сук Ку и 5 19 15 бІм Сув Нія Гуз Суб Вга Аїа Рео Абпоїез бів б1іу б1у Бго бек Маї га 25 зо вна Т1е Ре реко Бго Ап Тіе бу5 А5р Уві без Меб ТТ 5ег Гей т 35 ла 45.
Бго Муз маї Те Су5 маії Ма! Маж А5р Уаї бе бій дер Ар РгО Ар 5а 55 Ба
Уві З1й Т1е 5еб Тер Ре Маї А5подзапомаї біз Уві Ні Тибг діа бій 655 7а 75 во
Тит бів Тис нів дер бій АвроТуб Абп бек тТайс І131е Аев о Маї Уа1ї 5ег 99 зЗ5
І Раде 30
ІМ-39335 - рРСТ-СА2а14-0900861- уд
Хйг Бей РгО Іт11в бій Ні біл Ар Тер Мек обер б1у бує бі РМйе Су 180 185 ї18
Суб їМу5 Уаї Ап Ап Гсує Ар оГен ро 5ег Рго Те біц Аг Твг Те 115 128 125 бе" ух Т1е Су 5Б1у їй маї Агев о А1а Рго бій Уа1і Ту 116 Бе рКо 138 135 т4о
Рго Рго А13 біз о1й Тец 5ег Аг уз Азр Уві зЗегоГец Те Су Геу 145 158 155 160 чаї маї шіу Рре Аби Рго біу Ар тів бек Маї біо Тер Те о5ес Ав 165 179 175 біу ніх тк бій 1) Аа Ту фух Ар от ОАТа Рго Маї Гей Азр бек 188 ї85 158
Ар б1у 5Зег Туг Рпе Т1е Туг бер бує Бей Ап оМеї зуб Те обек губ 195 299 795
Тер бій Су5 Твс о Азрозес Ре бег Су Ай Маї Аебв Ні біо біу бев 210 215 238
Гух деп Тут Туп без їує Гує ТНК от1іе бек Ав о бег Рго боту бІ1у о1у 225 236 зу ре о1у бег біу біу біу б1у 5ег Хаа УаїЇ Хва сеч Хаз б1и 5ег 01у 01у . 245. 250 255 б1іу Се Маї 51п Хаа Сі1у бІу чЗег Гей Ар се 5ег оСуз Хаваа Хва 5ег 250 255 дув сіу Ту Те Уаї бек Рго ТБ оА1а Меї біу Тер о Хва Абе їй АЇа Рго 275 289 285 б1У БСуз Хаз Хаа б1й Хаз Маі Хаз Ні5 ї1е Те Тер бек дев обіу Твг з2за 295 зад
Раве зі
ЇМ-39335 - РСТ-СА2бтА-в008615 ПА
Ти АгвоХаа А1їа бегобек Уві (уз Хав Агро Рпйє Таб оЇ31е бек др Азо 305 310 315 328
Хаа Хаз уз Абп о Тиб Хад Тує гєц БІВ МЕС АбБи бе обер Хаа Хва 61: 325 330 335
Ар Ти" А1а Уві Тук Тує Суб Аїа А1а 5ег Тйб рбе їв дев 11 Гей зав за5 350 реб шт ові бег Ата Тув Ти Тук Тер Я1у бій біу ТигоХаа Маї те 355 зев 365 чаї 5звг бе 378
Раше 32

Claims (20)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла, що містить послідовність області, яка визначає комплементарність (СОК) 1 СОТМ5РТА (ЗЕО ІЮО МО: 1), послідовність СОР ІПМУЗКОТТ (ЗЕО ІО МО: 2) і послідовність СОКЗ ААЗТРЇ КІ/РЕЕЗАМТУ (ЗЕО ІО МО: 3),
де антигензв'язуючий фрагмент антитіла є специфічним для рецептора інсуліноподібного фактора росту 1 (ІСЕ1К).
2. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за п. 1, що містить послідовність 00 ХІМХ»І ХзЕЗССИІ МОХИ И5І ВІ 5СХ5ХвЗаастуЗРТАМОМУХ7ВОАРаКХ»вХ»ЕХ ох НІТУЗНИтт ВХІгАЗЗУКХІзАЕТІЗАОХаХ5КМТ Хв ОММ5І Х17ХівЕОТАМУМСААБЗТРІ ВІГРЕЕЗАУТУУуСОСТ Хі"МТМ55 (ЗЕО І МО: 4), деХі є Еабо О; Ха є К або ОО; Хз є М або Е; Ха є А або Р; Хо є А або Е; Хе є М або А; Х7 є М або Е; Хв є С або Е; Хе є І або Е; Хо є Е або МУ; Хі: є С або 5; Х:і2 є М або У; Хізє О або 0; Ха є М або 5; Хі5 є А або 5; Хієє І або М; Хі7 Є К або Е; Хів є А або 5; і Хо є І або о.
3. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за п. 1 або п. 2, що містить послідовність, вибрану з групи, що складається з: ОУКІГЕЕЗССИЇ МОАЛССИБІ ВІ БСЕУБасйТУ5РТАМОУМЕВОАРОКЕКЕРУСНІТУЗНИатТтАМАЗЗУК ОВЕТІЗВОЗАКМТУМІ ОММ5І КЗЕОТАМУУСААЗТРНЇІ ВІ РЕЕБАУТУМ СИОСТОМТМУ55 (ЗЕО ІЮ МО: 5), ОМОГ МЕЗССІОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМУВОАРОКаї ЕУуУанітУуУЗватТАМА5БМ КавеЕтІЗВОМ5КМТУМІ ОММ5І ВАЕОТАУУУСААЗТРІ ВІГРЕЕБАУТУМУСОСТІ МТМ (5ЕБЕО І МО: 6), ОМОЇ МЕЗО СОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБССТУЗРТАМОМ ЕВОАРОКаї ЕР ССОНІТУЗНИаИтТТАМАЗЗУК САЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММ5ЗІ ВАЕОТАМУУСААЗТРНЇ ВІ РЕЕБАУТУМ ПОСТІ МТУ55 (ЗЕО І МО: 7), ОМОЇ МЕЗО СОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБОСТУЗРТАМОМ ЕВОАРОКИаї ЕР УХО2НІТУ БНИА ТТ АМАЗБЗУК САЕТІЗВОЗЗКМТУМІ ОММ5І ВАЕОТАМУМСААЗТРІ ВІГРЕЕЗБАУТУУУСОСТІ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО: 8), ОМОЇ МЕЗО СОЇ МОРОСБІ ВІ БСАУБОСТУЗРТАМОМ ЕВОАРЕКЕВЕєЕУСНІТУЗВИатТАМАБЗУК САЕТІЗВОЗЗКМТУМІ ОММ5І ВАЕОТАМУМСААЗТРІ ВІГРЕЕЗБАУТУУУСОСТІ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО: 9), або послідовність, на 90 95 їм ідентичну.
4. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за будь-яким з пп. 1-3, який Зо відрізняється тим, що антигензв'язуючий фрагмент антитіла є однодоменним антитілом (вадб).
5. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за п. 4, який відрізняється тим, що заАВ має верблюже походження.
б. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що антигензв'язуючий фрагмент антитіла знаходиться в форматі мультивалентного відображення.
7. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за п. 6, який відрізняється тим, що антигензв'язуючий фрагмент антитіла зв'язаний з фрагментом Ес.
8. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує виділений чи очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за будь-яким з пп. 1-7.
9. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 8.
10. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за будь-яким з пп. 1-7, де антигензв'язуючий фрагмент антитіла іммобілізований на поверхню.
11. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за будь-яким з пп. 1-7, де антигензв'язуючий фрагмент антитіла зв'язаний з молекулою вантажу.
12. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за п. 11, який відрізняється тим, що молекула вантажу має молекулярну масу в діапазоні від приблизно 1 до приблизно 200 кДа.
13. Виділений або очищений антигензв'язуючий фрагмент антитіла за п. 11 або п. 12, який відрізняється тим, що молекула вантажу є детектованим агентом, терапевтичним агентом, лікарським засобом, пептидом, фактором росту, цитокіном, пасткою рецептора, хімічною сполукою, вуглеводним фрагментом, ферментом, антитілом або його фрагментом, молекулою на основі ДНК, вірусним вектором або цитотоксичним агентом, однією або кількома ліпосомами або наноносієм, завантаженими детектуючим агентом, терапевтичним агентом, лікарським засобом, пептидом, ферментом, антитілом або його фрагментом, молекулою на основі ДНК, вірусним вектором або цитотоксичним агентом, або однією або більше наночастинкою, нанопроводом, нанотрубкою або квантовими точками.
14. Композиція, що містить один або більше ніж один антигензв'язуючий фрагмент антитіла за будь-яким з пп. 1-7 і 10-13 ії фармацевтично прийнятний носій, розчинник або ексципієнт. 60 15. /п міо спосіб детектування ІСЕ1К, що включає:
а) контактування зразка тканини з одним або більше ніж одним виділеним або очищеним антигензв'язуючим фрагментом антитіла за будь-яким з пп. 1-7, зв'язаним з детектованим агентом, і Б) детектування детектуючого агента, зв'язаного з антигензв'язуючим фрагментом антитіла, зв'язаним з ІСЕК, в зразку тканини.
16. /п мімо спосіб детектування експресії ІСЕТК у суб'єкта, що включає: а) введення одного або більше ніж одного виділеного або очищеного антигензв'язуючого фрагмента антитіла за будь-яким з пп. 1-7, зв'язаного з детектуючим агентом, суб'єкту; і Б) детектування детектуючого агента, зв'язаного з антигензв'язуючим фрагментом антитіла, зв'язаним з ІСЕТК.
17. Спосіб перенесення молекули вантажу через гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ), що включає: а) введення одного або більше ніж одного виділеного або очищеного антигензв'язуючого фрагмента антитіла за п. 1, зв'язаного з молекулою вантажу, суб'єкту, де один або більше ніж один антигензв'язуючий фрагмент антитіла переносить молекулу вантажу через ГЕБ.
18. Спосіб за п. 17, де молекула вантажу має молекулярну масу в діапазоні від приблизно 1 до приблизно 200 кДа.
19. Спосіб за п. 17 або п. 18, де молекула вантажу є детектуючим агентом, терапевтичним агентом, лікарським засобом, пептидом, фактором росту, цитокіном, пасткою рецептора, хімічною сполукою, вуглеводним фрагментом, ферментом, антитілом або його фрагментом, молекулою на основі ДНК, вірусним вектором або цитотоксичним агентом, однією або кількома ліпосомами або наноносіями, завантаженими детектуючим агентом, терапевтичним агентом, лікарським засобом, пептидом, ферментом, антитілом або його фрагментом, молекулою на основі ДНК, вірусним вектором або цитотоксичним агентом, або однією або більше наночастинкою, нанопроводкою, нанотрубкою або квантовими точками.
20. Спосіб кількісного визначення кількості молекули вантажу, що доставляється через ГЕБ суб'єкта, де молекула вантажу зв'язана з одним або більше ніж одним виділеним або очищеним антигензв'язуючим фрагментом антитіла за п. 1, причому спосіб включає: Зо а) збір спинномозкової рідини (СМР) у суб'єкта, і Б) використання цільових методів протеоміки для визначення кількості молекули вантажу, зв'язаної з одним або більше ніж одним виділеним або очищеним антигензв'язуючим фрагментом антитіла, в спинномозковій рідині. шк ще з субобиниця позшкливинной домен Її траземенбранний регідн ПЕ Ян В Всубодиноме «гнивиланьсклининноюй йомОон
ФІГ. 1 невовеЕ синок дано шІсомнвІвВ ноток етно Ьи о хІрлІшКАаннї пижнкРютТУ ІТЕЖж РН АоеяБОВК вМОтетНшнНК пеумтНЕІЖ 120 внтвІкОоусь знианІтвоя СИ ВиНАВОС ТО ОВНОСІ пОХУВННИХУ сникрРоКНОво За дРОшОтТасов синтттацУє Уувасеонтук тЕсннсУую вознІш лава ОВО ОтО Зоо СЕСНОБСРЕЄ РІБНЕЗОВМХ СІРСЕОРСРК УСЕЕКИКТКТ ХРЕУТаВОМЬ ООСТІККОЮ. ЗО пІнхннОннх зяжьЕНКНОЬ ЕТО УКІ Вияв ноя ІКНІ ьо ВНОБИоНчЕХ 430 тУмконооо онононнне: ІЕЗОКНЖКах мриостТЯвІЖ МЮНЕНУТОТКО ЖОШКОРІКТи 48 нноквАнснИ поснРТятТТтТ ШЕНВУтІТНЕ нтВеРОоХшИ. ХНКТУТХККА ВеКНУуТЕТОЄ 540 овлссевени место ерРих Отнеот:оВО пкгнитТотАУу касти нонІЖсАКЕЕ Ов мплІвтиасУ ву вОвов внаВяОБІУК негеЕгном пдуттУвнОов огРОВоМжн во нУсакокІвІ ВКЧТАВОТІВІ БЕСТВНРЕТЕ УСОСКНОрВОС ВегктТКАЄКО ЗиКиБАантВХ 720 ТТЕНТІНКЯІ БУБНРИХКІЮ ПТНОТАНТІМ шЕВовмНтека ОТУМІТОРЕЕ ОНТЕТеВРЕЕ 780 кеУрнкЕнтТох ян.веетТьтТи ХрРІНЕСННЕВ ЕКООСВАЯНЕ УтАНІМРаАнО ЗООТРОРтТН Во шенеинЕІв. КНСЕРЕНРНО БІЦНЖКІКНО БосКоовиеУ ВВОКтннОс аюенноою оо жТАВІОВНО, БОМОЗНІЮРУ ЖЕХУСАКТЕ ВМІНЬ ВУАУСЄЬКУЦЕ ВБУХМОХЧЕНИ ЗО КЕМКОМНІЛНО УБУЛЕУНРЕХ РЕААОУЖУРО ЕНЖУВВЕКІТ МЕВЖОООСЕР СМУУБОУАНО 1029 тУукокретнс АуктТоУшкале ЖЧКВІЖКОМЕ длУМИВРНСЯ НИ ЛлеУУя сОбортвутни оце титТисцоркаУ СИНБи?ЕМЕМ МРЕУБАтеШІЯ КМІОНАСНІА ПОМАУСНАНК КкУнИВІВАНЯ 3140 ЄсМУуМнОРТик поПБОМенОІ УКТрУтнКОЄ КСоовУнуча вБашьКОСУЮТ тУушпеУНЦЕОЮ 1500 чт атьаи орУосьсмво сон умеос поеоневом бееонвнеМо умекмееяве 1280 кІХВОВІЖЖЕМ ХРОБВНУВКУ УБЕЕНКЬРЕе НЕООБЕКИНМ КВОУВБОрОВя БЕБОБВОЖЯ 1320 вснкаимово веУБувнАаве беВОвУанМиМх сОБХНЕнАЄ» РОБ 1357
ФІГ. 2 вв
МЕНА яз й у Зх т чо 1 ; 1 З ЗЕ КЕ Ко ї ї Е ще ЕН ї КУН : Ї - | ї ! Ш мі ї Ї Її й Н Кя г ї в ния ник нн г У З Е З ї2 г ще ко км ев а сус кчимовання т ВІК НЯ БЕ вна ні ще На. : ВХ ; ї КЯ ї зу хдиі її | 5 Ше і ши ї Ж . У Ї і й щи й й ва | я |. ті Е НЕ др ання нкннкнкдннккнкнннннняя, р рніннніннн в онук, зе з З Я зе ж З поко Уві Хан н уувимкки шен юЕНЯ Не о» аж » хИ г. Зак тя» | 7 і ШЕ ОО В ї | до . У Її Ї і НЕ і : КЗ Хе секкннме - наш: с х за КЗ КЗ КЗ з з ж Оки виюювани нн КАВУ оман (ВКА ща не ЯМ ЕНЯ серзлу ання 8 ке -к і пек ЖД - МУ ді ї ще ! о с" Ик 7Е Й 5 ї ї ! Я ще м Я і Фо І пс МЕ Ах шк КА КОЖ я понти Мне фін с х шЕннях кан З " БІ за с М ЗМ М У З грек алююевнмя й СВЕБІ вен
ФІГ. ЗА ни нишщшишшши шини я 3Зжхх нення Заря дек м нин зн за йод Са х ах х т. зх Ще ,; а леву х те « Прес і Тв ТЕ ж 23 х ТАМ К хх х | вк А КУ В А. як ї і у ж 2 ї х - хау Вр | ши г Й Уч з від їтожий о ІЗ ен ма кое ак вв т нн АННИ і по вк ти ВИ : -8ам Мо в ; В ї К, 5 ЄС р перчик ртя й «Вдоуткнкюужнккюу кн уник пк в КК ВЕ ВКМ гу ровами и й вало дала ваш си і й В т і і ї і нин житя ж о оо їб щу Зб ою с нн мо зів УНН й че я, ж Ти, г. Ж дки Ж щ Е зах ее х : сх сі ам Ки нео сумка вини З хх На я я Я ся 3 Ум ща я У са Кол З Те зружеемейа ко таза ю де ! тт вив ї ші зн в | в і Що й а Я хк 1 ві х я зе дня р х и Кк ни а ФУ сучеяю одіж су вн 1 и у меди ння «2 З, веж х х пови оон ван А у Номис ом н нв п лин «5 ком вний лан ан чучачачнркнкчкуну попрчтчтерення ЕЕ З М З ЗУ шок мо ово а З й щі Я МВ Температура
ФІГ. З В
ЩО вб'єзування МЕНА УВА РсНЕЕІУ о ЛО Зв'язування ІШРІНЯНІ У ВашЕТЕ ВН 53 вх й ше МИ ме я ше ям зе с от й - ще І дин, щі ЖЕ ях Веон пен ха шт вч ще Щ-Х дк ша їй які х ня Зк ес «м ре як й деко Шия хо т ху ох сс ве Ма ех -к є, СА квююяу шо - ра дж о НИЙ ін ТТ, деки декану прання «Ве ф Мр р еванфеєеєфттєдк оферта ять пот маками я: ок ря яки од рамена Чак Е чає є КІ : деко щи й укл кве ее я ков ек ї - з сек до їх З х ї се тех 3. ія с 5; Зв'язування ШЕЇКЯНХ з НАС ді Зв'язування ШЕННЯ з ваше Ба ЗТ ва Я совно Що с щі "я ж де оо що з оди й ин НИ ях є й Шия б ДИ ок жен ск СВК Ж КУ є З кА б ккд, в» Ів я ре Ши й Фа їх шк пох пткжеу ях я еко ЖК ; ра 7 Жх ж «х. я Й Б Ей я не ве їд й ей ви АННИ я ой й ни й ЩО С ся фен и з Са КА сн зврни Я Мом ї ее к а ; зако пом СУ хо й м НОЯ ОУН Як і й сок МЕТО Онех я їх й ос сом не ПИ КО сх п нн нан ВННННВ я. Х оджтянчжнжетин і ут уже екю сх «В х ав ие нок зак мань ник ин не нин аонв хор рено М ем пн анонс н Я х я Ек тА ЗКУ Му УКАЗИ ХЕ сх Кв Кох дид Я В ВО КО о Ж ще б Б ОВ М КЕ «ОВО БО ХЕ ДЮ КО КК ОВ Ка є і ще У ве т ТЕ що КУ у зккх. чу Я ЕКх ву вх о з ; ей з вве и: за'нзування ТЗ НИ з вч аа Зв'язування Кіна назива й зі " - хх КУ х -ЕЕ
Б. сан ще пкт що со чи 3 ра май да гр: яке вк й жна ; і я зав8х ж ее х ше. ї с і Кк ше Поекжу й й що 3 рин М ра ка с са токкжн Б шкі я ек скл . шк А й Ши в Я : я вки «к Кс я ня сх до Й кни «ВЗ Кя с еежлеклокх ех ЦЕ с КК Ук Й зх й Я есе осн сов ме й ще ак оф о ом ве В ни нн НН КО окон пн Бі ук Ша нення Вон З ка ростречннчррсвтетс огереедесніктотрежнфння Ех ь з озкнкстфреете фено дження б Ом оо РОК же ОМ БОЮ що 55 жо я м КО ОБО ях а МО БЯ ЯК ї ль є чає ге Чах їх
ФІГ. З щи так ІСТ КА почувся тина ТТ Я фдврчняя нн фен кттв нтстрня прявтчнвня др 2708ву че нище в току : о 506 Ко 0 що яю ях а час г Поверхня інехпінового рецептора Поверхня КРТ до ННЯ МО АБО яй юна олнм ді в що ме: : ОВ й: в: ее
Е 5. й р тя тд т Кол жи они дит 5 ї . «а же З 8 ОО м Б о ж ЗМ В В С М ХЕ ВВ СЮ Чає є І Ге
Суха ОБУ РІ Су, щі Б о я й . І І те Е дес ШЕ І щих ; ши нн у в ш ши ши ши е Е й : ж ож шко ШИЯ 2 З ИН Я рас БИЛИНИ не БОБ ВОВНИ БК з76 це дея Ж с й в. й | | Б Що Е
ФІГ. 4 УКБС УМАСОВ ВЕС УВО УРА МОВО АРОКЕВЕ УСНІ УВО НУ УКОКЕ ТЕН ОАКУТУ ПОМ КЕ ТАУУ САЛАТ ННИ РЕЕАУ ТУ СОС УМ КЕДРОВІ МИР СВеСКЕСНЕСИАРМСОСРУУККВРМ КО УСИК У ТУ ТУ ВУ ЕОВОРОУ ОБУ У ВУС УКЮТАСТИТ НАС УМО ПЕТРІ НОСЧУМОСКЕРКСОКУ ВИКО РОРІ НТК КОСУ ВАРСУКРРААКО УВК СУ УСЕ РОВУ УТ ОНТЕЕМУКОТАРУ ПОрОВУ БК КЕ ОК УК ТОК СМУННЕ СЬКУ КЕРІВН РОК
ФІГ. ВА
ІБР18-4 0 1бР18-4 тес
ФІГ. 5 В
Комбінація ЗЯАВ (еквімолярна! щ ГЕБ ря | (54-АВВЕС) зразок їз вхідної і нижньої камери через 15, 30, 80 хе Мультиплексний папоіс-МЕМ Оля вхідних конструкторів Рон -ЧОг/ає в АХСО ФІГ, БА
UAA201610010A 2014-03-06 2014-12-04 Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (igf1r) UA121028C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461948818P 2014-03-06 2014-03-06
PCT/CA2014/000861 WO2015131257A1 (en) 2014-03-06 2014-12-04 Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA121028C2 true UA121028C2 (uk) 2020-03-25

Family

ID=54054287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201610010A UA121028C2 (uk) 2014-03-06 2014-12-04 Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (igf1r)

Country Status (16)

Country Link
US (1) US10112998B2 (uk)
EP (1) EP3114141B1 (uk)
JP (1) JP6541237B2 (uk)
KR (1) KR102355310B1 (uk)
CN (1) CN106559993B (uk)
AU (1) AU2014385800B2 (uk)
CA (1) CA2942154C (uk)
DK (1) DK3114141T3 (uk)
EA (1) EA035480B1 (uk)
IL (1) IL247606B (uk)
MX (1) MX2016011561A (uk)
NZ (1) NZ724868A (uk)
PE (1) PE20161311A1 (uk)
UA (1) UA121028C2 (uk)
WO (1) WO2015131257A1 (uk)
ZA (1) ZA201606211B (uk)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8164343B2 (en) 2003-09-05 2012-04-24 Midtronics, Inc. Method and apparatus for measuring a parameter of a vehicle electrical system
GB2443373B (en) 2005-08-29 2009-12-09 Midtronics Ltd Automotive vehicle electrical system diagnostic device
EP3095457B1 (en) * 2009-11-05 2018-05-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Quantitation of insulin-like growth factor-i with high-resolution mass spectrometry
EA035517B1 (ru) 2014-03-06 2020-06-29 Нэшнл Рисеч Каунсил Оф Канада Антитела, специфические к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1, и их применения
CN106559993B (zh) 2014-03-06 2020-12-15 加拿大国家研究委员会 胰岛素样生长因子1受体特异性抗体及其用途
MX377421B (es) 2014-03-06 2025-03-10 Nat Res Council Canada Anticuerpos especificos para el receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 y usos de los mismos.
EA039807B1 (ru) 2017-01-06 2022-03-16 ЭйБиЭл БИО ИНК. Антитело к -синуклеину и его применение
WO2018138709A1 (en) * 2017-01-30 2018-08-02 National Research Council Of Canada Blood-brain barrier transmigrating compounds and uses thereof
BR112020001970A2 (pt) 2017-08-02 2020-08-04 Stressmarq Biosciences Inc. anticorpo que se liga à alfa-sinucleína ativa
EP3725806A4 (en) * 2017-12-14 2022-03-30 ABL Bio Inc. BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST A-SYN/IGF1R AND ASSOCIATED USE
EP3784701A4 (en) 2018-04-24 2022-06-08 National Research Council of Canada THERAPEUTIC COMPOUNDS CROSSING THE BLOOD-BRAIN BARRIER AND THEIR USES
KR102692543B1 (ko) * 2018-10-26 2024-08-07 재단법인 목암생명과학연구소 Ids를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
KR102444797B1 (ko) * 2019-06-14 2022-09-20 에이비엘바이오 주식회사 α-SYN/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도
WO2021136772A1 (en) 2020-01-02 2021-07-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for determining the amount of a therapeutic antibody in the brain
KR102302965B1 (ko) * 2020-04-14 2021-09-27 머티어리얼사이언스 주식회사 유기 화합물 및 이를 포함하는 유기전계발광소자
US20250281641A1 (en) * 2020-12-18 2025-09-11 Usmedigene Inc. Vectors for delivery of human growth hormone gene and multiple therapeutic genes into central nervous system by crossing blood brain barrier
IL318499A (en) 2022-07-30 2025-03-01 Pinetree Therapeutics Inc Compounds for targeted lysosomal degradation and methods of using them

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
ATE249840T1 (de) 1991-12-13 2003-10-15 Xoma Corp Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
WO1995004069A1 (en) 1993-07-30 1995-02-09 Affymax Technologies N.V. Biotinylation of proteins
WO2001007084A1 (en) * 1999-07-23 2001-02-01 Regents Of The University Of California Anti-growth factor receptor avidin fusion proteins as universal vectors for drug delivery
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US20030190598A1 (en) * 2000-05-26 2003-10-09 Jasmid Tanha Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
CN100335900C (zh) 2001-11-30 2007-09-05 加拿大国家研究局 新的自组装分子
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
US20050142141A1 (en) * 2002-11-27 2005-06-30 Pardridge William M. Delivery of enzymes to the brain
EP1452601A1 (en) 2003-02-28 2004-09-01 Roche Diagnostics GmbH Enhanced expression of fusion polypeptides with a biotinylation tag
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
US20090047300A1 (en) 2005-09-27 2009-02-19 Abedelnasser Abulrob Blood-brain barrier epitopes and uses thereof
US20090252681A1 (en) * 2005-10-11 2009-10-08 Ablynx N.V. Nanobodies and Polypeptides Against EGFR and IGF-IR
CN101321784A (zh) * 2005-10-11 2008-12-10 埃博灵克斯股份有限公司 针对egfr和igf－ir的纳米抗体tm和多肽
US7744879B2 (en) 2006-06-07 2010-06-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting antibodies
US7981417B2 (en) 2006-06-07 2011-07-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting anti-bodies
WO2008022349A2 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Armagen Technologies, Inc. Agents for blood-brain barrier delivery
JP2010538012A (ja) 2007-08-28 2010-12-09 バイオジェン アイデック マサチューセッツ インコーポレイテッド Ｉｇｆ−１ｒの複数のエピトープに結合する組成物
US8444976B2 (en) * 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
EP2485761B1 (en) * 2009-10-09 2019-02-27 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the cns
US8444982B2 (en) 2009-12-04 2013-05-21 The University Of Hong Kong Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
EP2558503B1 (en) 2010-04-14 2015-12-09 National Research Council of Canada Compositions and methods for brain delivery of analgesic peptides
CA2800744C (en) * 2010-05-27 2018-09-04 Centocor Ortho Biotech Inc. Insulin-like growth factor 1 receptor binding peptides
KR102188544B1 (ko) * 2010-11-30 2020-12-08 제넨테크, 인크. 저친화도 혈액-뇌 장벽 수용체 항체 및 그의 용도
WO2013106577A2 (en) * 2012-01-10 2013-07-18 Biogen Idec Ma Inc. Enhancement of transport of therapeutic molecules across the blood brain barrier
US20150353639A1 (en) * 2012-05-21 2015-12-10 Genentech, Inc. Methods for improving safety of blood-brain barrier transport
CN106559993B (zh) 2014-03-06 2020-12-15 加拿大国家研究委员会 胰岛素样生长因子1受体特异性抗体及其用途
EA035517B1 (ru) 2014-03-06 2020-06-29 Нэшнл Рисеч Каунсил Оф Канада Антитела, специфические к рецептору инсулиноподобного фактора роста 1, и их применения
MX377421B (es) 2014-03-06 2025-03-10 Nat Res Council Canada Anticuerpos especificos para el receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 y usos de los mismos.

Also Published As

Publication number Publication date
CN106559993A (zh) 2017-04-05
AU2014385800A1 (en) 2016-10-20
KR102355310B1 (ko) 2022-01-24
US10112998B2 (en) 2018-10-30
MX2016011561A (es) 2017-04-13
CA2942154A1 (en) 2015-09-11
NZ724868A (en) 2022-07-01
EP3114141B1 (en) 2020-05-06
PE20161311A1 (es) 2016-11-25
ZA201606211B (en) 2019-01-30
DK3114141T3 (da) 2020-08-10
US20170022277A1 (en) 2017-01-26
IL247606B (en) 2020-04-30
IL247606A0 (en) 2016-11-30
AU2014385800B2 (en) 2020-10-22
CA2942154C (en) 2023-06-27
JP2017512464A (ja) 2017-05-25
EA035480B1 (ru) 2020-06-23
EP3114141A1 (en) 2017-01-11
EA201691780A1 (ru) 2017-01-30
CN106559993B (zh) 2020-12-15
EP3114141A4 (en) 2017-08-16
KR20160130435A (ko) 2016-11-11
JP6541237B2 (ja) 2019-07-10
BR112016020628A2 (pt) 2018-01-23
WO2015131257A1 (en) 2015-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA121028C2 (uk) Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (igf1r)
US10106614B2 (en) Insulin-like growth factor 1 receptor-specific antibodies and uses thereof
US10100117B2 (en) Insulin-like growth factor 1 receptor-specific antibodies and uses thereof
AU2017293450A1 (en) Humanized antibodies transmigrating the blood-brain barrier and uses thereof
JP7710371B2 (ja) 標的特異的細胞外小胞
BR112016020628B1 (pt) Anticorpos específicos para receptor de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e uso dos mesmos
BR112016020613B1 (pt) Anticorpos específicos para receptor de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e uso dos mesmos
HK1231906B (en) Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof
HK1233271B (en) Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof
HK1233271A1 (en) Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof
HK1233272A1 (en) Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof
HK1233272B (en) Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof