UA127516C2 - Виділене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з f-білком рсв людини - Google Patents

Abstract

Винахід стосується виділеного антитіла, або його антигензв’язувального фрагменту, що зв'язується з F-білком РСВ людини. Винахід також стосується експресійного вектора і клітини-хазяїна. Крім того, винахід стосується фармацевтичної композиції, способу одержання антитіла, способу профілактики або лікування РСВ-інфекцій, способу профілактики або лікування пов'язаних з трансплантацією РСВ-інфекцій та застосування антитіла або фармацевтичної композиції в одержанні лікарського засобу для лікування або профілактики РСВ-інфекції.

Description

Зв'язування Форми 1- «до злиття» Е-білка ! --025 о пт «М Синагіс 3- Ж вві 8 1 у 4 й як шк 0. ен ти р р тт -Е т : ен тт уч тити ооо оо 010 00001 901 і 100

Концентрація антитіла (мкг/мл)

Фіг. 1А

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД

Даний винахід стосується людських моноклональних антитіл, що мають високі титри при нейтралізації РСВ, а також застосування цих антитіл як пасивного імунотерапевтичного засобу для дітей і людей похилого віку.

ПЕРЕДУМОВИ ДО СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ

Параміксовіруси являють собою оболонкові віруси, що містять негативну РНК, які є небезпечними патогенами людини і тварин. Респіраторно-синцитіальний вірус людини (ЛлРСВ,

РСВ) належить до сімейства Рагатухомігідає, підродини Рпештомігіпае. Ідентифіковано два підтипи вірусу, тип А і тип В, які є основною причиною важких, і іноді навіть смертельних, респіраторних інфекцій у дітей у віці молодше б місяців. Дорослі люди з первинними захворюваннями, такими як ХОЗЛ, астма, рак, зі станом імунодефіциту, включаючи ВІЛ- інфекцію або стан після трансплантації, також мають ризик розвитку важкої РОВ-інфекції. РСВ є причиною 15 95 щорічних госпіталізацій дорослих людей у віці старше 50 років через гостру респіраторну інфекцію. У США РСВ є причиною більше 100000 госпіталізацій щорічно й, по оцінках, щорічно приводить приблизно до 160000 смертельних випадків в усьому світі. На даний час не існує вакцини проти РСВ, і випробування з використанням інактивованого формаліном вірусу було пов'язане зі зростанням тяжкості захворювання у дітей після інфікування РСВ. Інші представники сімейства, включаючи метапневмовірус людини (лЛМПВ) і вірус парагрипу людини (лІГВ), також викликають гострі респіраторні захворювання, аналогічно лРСВ.

Геном лРСВ являє собою одноланцюжкову негативно-полярну молекулу РНК розміром приблизно 15 т.н., яка кодує 11 білків. Два із цих білків є основними поверхневими глікопротеїнами віріона. Вони являють собою: (ї) білок прикріплення (С), який опосередковує прикріплення вірусу до клітин, і (ії) білок злиття (Р), який стимулює як злиття вірусної і клітинної мембран на початкових стадіях інфекційного циклу, так і злиття мембран інфікованих клітин з мембранами сусідніх клітин, з утворенням характерного синцитію. («з-білок прикріплення зв'язується з рецепторами клітинної поверхні і взаємодіє з Е-білюком. Ця взаємодія запускає процес конформаційної зміни Е-білка, індукуючий злиття мембран, у результаті чого вірусний рибонуклеїновий комплекс вивільняється в цитоплазму клітини-хазяїна.

Показано, що моноклональні антитіла до Е-білка або С-білка виявляють нейтралізуючий

Зо ефект іп міїго ії профілактичну дію іп мімо. Див., наприклад, Вееїег апа Соеїїпоп 1989, 9. Мігої. 63:2941-50; Сагсіа-Ваттепо вї аї., 1989, 9. Міго!ї. 63:925-32; Тауїог єї а!., 1984, Іттипоіоду, 52:137- 142; Маївн сеї а!., 1984, Іптесіоп апа Іттипіу 43:756-758, і патенти США МеоМо 5842307 і 6818216.

Епітопи для нейтралізуючих антитіл на Е-глікопротеїні початково були картовані шляхом ідентифікації амінокислот, які були змінені у варіантах, не підданих дії антитіл, а також шляхом оцінки зв'язування антитіл з пептидами, одержаними з Е-білка РСВ. Ці дослідження показали, що нейтралізуючі антитіла часто спрямовані на два різні лінійні епітопи. Див. сгапбат еї аї., 2015, бит Оріп Іттипої, 35:30-38, для огляду антигенних сайтів форм "до злиття" і "після злиття" Е-білка. Антигенний сайт ІЇ (також називаний сайтом А) містить залишки 255-275 і є мішенню для палівізумабу (синагісФ, Абвігалепеса). Було передбачено, що цей епітоп є залежним від конформації, і структура більш ефективного похідного палівізумабу в комплексі із цим епітопом дозволила встановити, що лінійний епітоп приймає конформацію типу спіраль- петля-спіраль. Антигенний сайт ІМ (також називаний сайтом С) містить залишки 422-438 ії є мішенню антитіл мАт 19 і 101Р. Даний епітоп є С-кінцевим відносно багатої цистеїном області і є частиною домену Її, який у гомологічних Е-глікопротеїнах параміксовірусів має незмінну структуру в конформаціях до і після злиття. Антитіла 5С4, АМ22 і 025 дозволили визначити границі епітопа, позначеного "сайт 0", який є присутнім тільки у формі "до злиття" Е-білка, і були в 50 разів більш ефективними, ніж палівізумаб. Див. Ме! еПап еї аї., 2013, сіепсе, 340:1113- 1117; міжнародну патентну заявку Мо УМО 2008/147196 і патент США Мо 8568726. Інші антитіла проти лРСОВ описані в міжнародних патентних заявках МоМо УМО 94/06448 і УМО 92/04381 і патенті США Мо 8221759.

Вакцина проти РСВ для активної імунізації, у випадку її наявності, не може бути використана для лікування новонароджених дітей з незрілою імунною системою або пацієнтів, імунна система який пригнічена. Для пацієнтів, яким необхідна профілактична пасивна імунотерапія внаслідок більш хронічної форми захворювання, сучасний метод лікування полягає в періодичних внутрішньовенних введеннях людських ДС, одержаних з об'єднаної плазми. При такій терапії, через низькі титри нейтралізуючих анти-РСВ антитіл, необхідне введення великої кількості глобуліну (наприклад, 0,75 г на кг маси тіла) і постійно потрібне внутрішньовенне введення в умовах клініки або лікарні що продовжується тривалий час (2-4 години), яке виконують щомісяця в періоди високого ризику (осінь, зима і рання весна). 60 СУТЬ ВИНАХОДУ

Винахід стосується антитіл до Е-білка РСВ і їх антигензв'язувальних фрагментів, що мають структурні і функціональні ознаки, описані нижче.

В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, що зв'язується з Е-білююм РСВ людини, яке містить: СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 3. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 9. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, необов'язково, має щонайменше одну з наступних характеристик: (ї) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РОВ людини з величиною Ка від приблизно 1х1079 М до приблизно 1х10-72 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕЛТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х105 М до приблизно 1х109 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮО МО: 23.

В іншому варіанті здійснення винахід стосується антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, що зв'язується з Е-білююм РСВ людини, яке містить: СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮО МО: 6. У конкретних варіантах здійснення легкий ланцюг або варіабельна область легкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 8. У конкретних варіантах здійснення легкий ланцюг не зв'язаний з важким ланцюгом, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБЕО ІЮ МО: 9. У конкретних варіантах здійснення легкий ланцюг зв'язаний з важким ланцюгом, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 7. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, необов'язково, має щонайменше одну з наступних характеристик: (ї) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РОВ людини з величиною Ка від приблизно 1х1079 М до приблизно 1 х1072 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕЛТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х10-! М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). У конкретних варіантах здійснення легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮО МО: 25.

В іншому варіанті здійснення винахід стосується антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, що зв'язується з Е-білюом РСВ людини, яке містить: () СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1; (ї) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 2; і (її) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮО МО: 3. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, необов'язково, має щонайменше одну з наступних характеристик: (ї) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РОВ людини з величиною Ка від приблизно 1х1079 М до приблизно 1 х10-2 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕЛТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х10-! М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮО МО: 23.

В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, містить: (і)

СОКІ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ

МО: 4; (її) СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність

ЗЕО ІЮО МО: 5; ії (її) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 6. У конкретних варіантах здійснення легкий ланцюг або варіабельна область легкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8. У конкретних варіантах здійснення легкий ланцюг не зв'язаний з важким ланцюгом, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 9. У конкретних варіантах здійснення легкий ланцюг зв'язаний з важким ланцюгом, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7. В одному варіанті здійснення антитіло, або його фрагмент, необов'язково, має щонайменше одну з наступних бо характеристик: (ї) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х1079 М до приблизно 1 х10-2 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕЛТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х10-! М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). У конкретних варіантах здійснення легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 25.

В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, містить: (Її)

СОКІ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ

МО: 1; (і) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІЮ МО: 2; (ії) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 3; (м) СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО: 4; (м) СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕСО І МО: 6. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 9. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, необов'язково, має щонайменше одну з наступних характеристик: (ї) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РСОВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х10-72 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕЛТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х10-! М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 25.

В іншому варіанті здійснення винахід стосується антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, що зв'язується з Е-білюом РСВ людини, яке містить: () СОКІ1 варіабельної області

Зо важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1; (ї) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2; (ії) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 3; (м) СОКІ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зХЕО

ІЮ МО: 4; (м СОК? варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6; при цьому антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, містить варіабельну область важкого ланцюга, що має щонайменше 90 95, 95 95, 9695, 97 95, 9895 або 9995 ідентичності з варіабельною областю важкого ланцюга, що складається з 5БЕО ІО МО: 7, і варіабельну область легкого ланцюга, що має щонайменше 90 95, 95 95, 96 96, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичності з варіабельною областю легкого ланцюга, що складається з БЕО ІЮО МО: 8. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО: 9. У цих вищезгаданих варіантах здійснення варіації послідовності мають місце в каркасних областях. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, необов'язково, має щонайменше одну з наступних характеристик: (ї) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка

РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х1072 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОРЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка

РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х10-7! М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності «ЕО ІЮ МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності

ЗЕО І МО: 25.

В іншому варіанті здійснення винахід також стосується антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, що зв'язується із РСВ людини, яке містить: () СОК!1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 1; (ії) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ

МО: 2; (ії) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 60 ЗЕБЕО ІЮ МО: 3; (м) СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 4; (м) СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 9. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, має 1, 2 або З амінокислотні заміни в областях СОК важкого ланцюга (ЗЕО ІЮ МО5: 1-3) і/або в областях СОК легкого ланцюга (ЗЕО ІЮ МО5: 4-6).

Послідовність МН 5ЕО ІЮ МО: 7 містить області СО 5ЕО ІЮО МО: 1-3; і послідовність МІ. 5ЕО ІЮ

МО: 8 містить області СОМ 5ЕО ІО МО: 4-6. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, необов'язково, має щонайменше одну з наступних характеристик: (ї) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РОВ людини з величиною Ка від приблизно 1х1079 М до приблизно 1 х10-2 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕЛТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х10-! М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮ МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 25.

В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, яке містить: варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 7, і/або варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8, при цьому антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, зв'язується з Е-білюом РСВ людини. В іншому варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, містить важкий ланцюг, що містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІО МО: 23, і легкий ланцюг, що містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 25, при цьому антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, зв'язується з Е-білюм РСВ людини. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, необов'язково,

Зо має щонайменше одну з наступних характеристик: (ї) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка

РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х1072 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОРЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка

РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х10-! М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ).

В іншому варіанті здійснення винахід стосується антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, яке зв'язується з тим же епітопом Е-білка РСВ людини, що і антитіло, яке містить важкий ланцюг 5ЕО ІЮО МО: 23 і легкий ланцюг ЗЕО ІЮ МО: 25, при цьому антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, має щонайменше одну з наступних характеристик: (їі) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х1072 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х10

М до приблизно 1х10-7 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). В одному варіанті здійснення антитіло має щонайменше 80 95, 85 95, 90 У, 95 95, 96 9, 97 У, 98 96 або 99 95 ідентичності послідовності з варіабельною областю важкого ланцюга і/або варіабельною областю легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 7 і 8, відповідно. В іншому варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, має 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 амінокислотних замін у варіабельній області важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 7 і/або варіабельній області легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 8. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 9.

В іншому варіанті здійснення винахід стосується антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, яке перехресно блокує зв'язування (або є конкурентом) антитіла, що містить важкий ланцюг ЗЕО ІЮО МО: 23 і легкий ланцюг 5ЕО ІЮ МО: 25, із РСВ людини, при цьому антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, має щонайменше одну з наступних характеристик: (Її) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М 60 до приблизно 1х1072 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу

(наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х10

М до приблизно 1х1077 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, має щонайменше 80 95, 8596, 9095, 9595, 9695, 97 95, 9895 або 9995 ідентичності послідовності з варіабельною областю важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 7 або варіабельною областю легкого ланцюга 5ЕО ІЮ

МО: 8. В іншому варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, має 1, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 амінокислотних замін у варіабельній області важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 7 або варіабельній області легсого ланцюга ЗЕО ІО МО: 8. В іншому варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, має 1, 2 або З амінокислотні заміни в областях СОК важкого ланцюга (ЗЕО ІЮ МО5: 1-3) і/або в областях СОМ легкого ланцюга (5ЕО ІЮ МО5: 4-6). У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 9.

В одному варіанті здійснення винахід стосується виділеного антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, що зв'язується з Е-білюом РСВ людини, яке містить: важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7 або її варіант, що має аж до 30 амінокислотних замін, і/або легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 8, що має аж до 12 амінокислотних замін. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 9.

У конкретних варіантах здійснення винахід стосується виділеного антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, що зв'язується з Е-білююм РСОВ людини, при цьому антитіло зв'язується з Е-білком РСВ людини за рахунок однієї або більше з наступних взаємодій, або всіх з наступних взаємодій: 1) петля СОКЗ легкого ланцюга через залишки Ред і Г ен92 взаємодіє з бічним ланцюгом

Ага429 Е-білла РСВ людини шляхом утворення двох водневих зв'язків між атомами кисню карбонільних груп Рпе?З1 і І ен92 у петлі СОКЗ і атомами азоту гуанідинових груп Аг9429 Е-білка

РСВ людини;

Зо 2) петля СОК2 легкого ланцюга через залишки Азр5О0 і Сій55 утворює водневі зв'язки з

Аз5п426 і І уз445 Е-білка РСВ людини; 3) петля СОКЗ важкого ланцюга через залишки Туг104 і Туг110 утворює поверхню для вандерваальсових взаємодій з Пе432 на Е-білку РСОВ людини; 4) петля СОКЗ важкого ланцюга через Азп107 утворює водневий зв'язок з І уз433 Е-білка

РСВ людини; і 5) легкий ланцюг укладається напроти СіІш161 і 5ег182 сусіднього мономера тримера "до злиття" РСВ.

У конкретних аспектах будь-якого з вищевказаних варіантів здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, є виділеним.

У конкретних аспектах будь-якого з вищевказаних варіантів здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, являє собою рекомбінантне антитіло.

У конкретних аспектах будь-якого з вищевказаних варіантів здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, являє собою повнорозмірне антитіло.

У конкретних аспектах будь-якого з вищевказаних варіантів здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом може містити варіабельну область важкого ланцюга, що складається з: (а) будь-якої з варіабельних областей важкого ланцюга, описаних вище, ії (Б) лідерного пептиду (наприклад, лідерного пептиду ЗЕО ІЮО МО: 10). У конкретних аспектах будь-якого з вищевказаних варіантів здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом може містити варіабельну область легкого ланцюга, що складається з: (а) будь-якої з варіабельних областей, описаних вище, і (Б) лідерного пептиду (наприклад, лідерного пептиду ЗЕО ІЮ МО: 10).

У конкретних аспектах будь-якого з вищевказаних варіантів здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом являє собою антитіло, що містить будь-яку з варіабельних областей важкого ланцюга, описаних вище, і будь-який константний домен важкого ланцюга антитіла людини. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом належить до ізотипу дос і містить константний домен важкого ланцюга Ідс1, Ідс2, ІдсЗ або Ідб54 людини. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом містить константний домен важкого ланцюга ІдДО1 людини, при цьому константний домен Ідс1 є афукозилованим. бо У конкретних аспектах будь-якого з вищевказаних варіантів здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом може містити будь-яку з варіабельних областей легкого ланцюга, описаних вище, і константний домен легкого ланцюга антитіла людини. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом містить константний домен легкого ланцюга каппа антитіла людини або його варіант, при цьому варіант має до 20, 10, 5, 3, 2 або 1 амінокислотної заміни. В іншому варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом містить константний домен легкого ланцюга лямбда антитіла людини або його варіант, при цьому варіант має до 20, 10, 5, 3, 2 або 1 амінокислотної заміни. В одному варіанті здійснення антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом містить константний домен легкого ланцюга каппа антитіла людини, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 14.

В одному варіанті здійснення антитіло до Е-білка лРСВ за винаходом має повну тетрамерну структуру із двома легкими ланцюгами і двома важкими ланцюгами, при цьому кожний легкий ланцюг містить: варіабельну область, що містить ЗЕО ІЮО МО: 8, і константний домен легкого ланцюга каппа антитіла людини (ЗЕО ІЮ МО: 14); і кожний важкий ланцюг містить: варіабельну область, що містить ЗЕО ІЮ МО: 7, і константний домен ІдДс1 людини (ЗЕО ІЮ МО: 13).

У конкретних аспектах будь-якого з вищевказаних варіантів здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, до Е-біль»а лРСВ за винаходом може бути кон'юговане з щонайменше одним профілактичним або терапевтичним засобом. В одному варіанті здійснення терапевтичний засіб являє собою друге антитіло або його фрагмент, імуномодулятор, гормон, цитотоксичний засіб, фермент, радіоактивний ізотоп, друге антитіло, кон'юговане із щонайменше одним імуномодулятором, ферментом, радіоактивною міткою, гормоном, антисмисловим олігонуклеотидом або цитотоксичним засобом, або їх сполучення.

Винахід також стосується виділених поліпептидів, які містять будь-яку амінокислотну послідовність із 5ЕО 10 МО5: 1-8, 23 або 25 або фрагмент будь-якої із зазначених послідовностей. У конкретних варіантах здійснення поліпептиди, які містять амінокислотні послідовності важкого ланцюга, не містять амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 9.

Винахід також стосується виділених нуклеїнових кислот, кодуючих будь-яке з антитіл, або антигензв'язувальних фрагментів, до Е-білка лРСВ за винаходом. В одному варіанті здійснення винахід стосується виділених нуклеїнових кислот, кодуючих будь-який з поліпептидів 562 ІЮ

МО: 1-8, 23 або 25, при цьому зазначені поліпептиди можуть, необов'язково, містити лідерну послідовність. У конкретних варіантах здійснення поліпептиди, які містять амінокислотні послідовності важкого ланцюга, не містять амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 9. Винахід також стосується експресійних векторів, які містять нуклеїнову кислоту, кодуючу будь-який з поліпептидів ЗЕО 10 МО5: 1-8, 23 або 25 (при цьому зазначені поліпептиди можуть, необов'язково, містити лідерну послідовність). У конкретних варіантах здійснення поліпептиди, які містять амінокислотні послідовності важкого ланцюга, не містять амінокислотну послідовність хЕО ІО МО: 9. Ці виділені нуклеїнові кислоти і експресійні вектори, що їх містять, можуть бути використані для експресії антитіл за винаходом, або їх антигензв'язувальних фрагментів, у рекомбінантних клітинах-хазяїнах. Таким чином, винахід також стосується клітин- хазяїнів, які містять виділені нуклеїнові кислоти, кодуючі будь-який з поліпептидів зХЕО ІЮ МО5: 1-8, 23 або 25 (при цьому зазначені поліпептиди можуть, необов'язково, містити лідерну послідовність). У конкретних варіантах здійснення поліпептиди, які містять амінокислотні послідовності важкого ланцюга, не містять амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 9. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн являє собою клітину яєчника китайського хом'яка. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн являє собою дріжджову клітину, наприклад клітину Ріспіа або клітину-хазяїна Ріспіа разіогів.

Винахід також стосується фармацевтичних композицій, які містять антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом і фармацевтично прийнятний носій або розріджувач. В одному варіанті здійснення фармацевтично прийнятний носій або розріджувач являє собою іІ-гістидин. В одному аспекті даного варіанта здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, сформульоване в розчині 10 мМ І-гістидину, 7 95 (мас./об.) сахарози і 0,02 95 (мас./о0б.) полісорбату-80, рН 6,0. Антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, як правило, присутнє у такому препараті в концентрації приблизно 100 мг/мл.

В одному варіанті здійснення даний винахід стосується композицій, які містять антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом і містять додатковий профілактичний або терапевтичний засіб. В одному варіанті здійснення додатковий профілактичний або терапевтичний засіб вибирають із групи, що складається з: другого анти-лРСОВ антитіла або його антигензв'язувального фрагмента. В одному варіанті здійснення друге анти-лРСВ антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом містить: () СОР1 варіабельної області 60 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1; (ї) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2; (ії) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 3; (м) СОКІ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ХЕО

ІЮ МО: 4; (м СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 6. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність «ФЕО ІЮ МО: 9.

Винахід також стосується ємності або ін'єкційного пристрою, що містить будь-яке з антитіл, або антигензв'язувальних фрагментів, до Е-більа лРСВ за винаходом. В одному варіанті здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білюа лРСВ за винаходом містить: () СОМ! варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 1; (її) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 2; (ії) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3; (ім) СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЖЕО ІЮ МО: 4; (м) СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 562 ІЮ МО: 6. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності «ЕО ІЮ МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності

ЗЕО І МО: 25.

Винахід також стосується способу одержання антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, до Е-білка лРСОВ за винаходом, який включає: культивування клітини-хазяїна, що містить полінуклеотид, кодуючий важкий ланцюг і/або легкий ланцюг антитіла за винаходом (або його антигензв'язувальний фрагмент), в умовах, сприятливих для експресії полінуклеотиду; і, необов'язково, витягання антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, із клітини-хазяїна іМабо культурального середовища. В одному варіанті здійснення полінуклеотид, кодуючий важкий ланцюг, і полінуклеотид, кодуючий легкий ланцюг, знаходяться в одному векторі. В іншому варіанті здійснення полінуклеотид, кодуючий важкий ланцюг, і полінуклеотид, кодуючий легкий ланцюг, знаходяться у різних векторах. В одному варіанті здійснення полінуклеотид, кодуючий важкий ланцюг, і полінуклеотид, кодуючий легкий ланцюг, кодують антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, яке містить: () СОК1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1; (ії) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 2; (ії) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3; (їм) СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 4; (м) СОНК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зХЕО

ІО МО: 6. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність ЗЕБЕО ІО МО: 9. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності «ФЕО ІЮО МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮО МО: 25.

Винахід також стосується способу профілактики або лікування лРСВ-інфекції у пацієнта, який включає введення пацієнту ефективної кількості антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, до Е-більюа лРСВ за винаходом, необов'язково, у комбінації з додатковим профілактичним або терапевтичним засобом або терапевтичною процедурою. В одному варіанті здійснення пацієнт, що одержує лікування, є людиною. В одному варіанті здійснення додатковий профілактичний або терапевтичний засіб вибирають із групи, що складається з: другого анти-лРСВ антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, нуклеїнової кислоти, кодуючої антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білка РСВ, або кон'югата антитіла.

В одному варіанті здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білка лРСВ за винаходом містить: () СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 1; (її) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 2; (ії) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3; (ім) СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 4; (м) СОК2 варіабельної області 60 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 562 ІЮ МО: 6. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності «ЕО ІЮ МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності

ЗЕО І МО: 25.

Винахід також стосується способу запобігання або лікування лРСВ-інфекції у пацієнта, який включає введення пацієнту ефективної кількості антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, до Е-більюа лРСВ за винаходом, необов'язково, у комбінації з додатковим профілактичним або терапевтичним засобом або терапевтичною процедурою. В одному варіанті здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білька лРСВ за винаходом містить: () СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 1; (її) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 2; (ії) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3; (ім) СОК1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 4; (м) СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності «ЕО ІЮО МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності

ЗЕО І МО: 25.

Винахід також стосується вакцини, або імуногенної композиції, яка містить антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом. В одному варіанті здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білка лРСВ за винаходом містить: () СОК1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1; (ї) СОВ2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 2; (ії СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО

Зо ІЮ МО: 3; (м) СОКІ! варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 4; (м) СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 9. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності ФЕО ІЮ

МО: 25.

В одному варіанті здійснення вакцина, або імуногенна композиція, додатково містить антиген, вибраний з Е-білка РСВ і с-білка РСВ, а також їх фрагментів.

Винахід також стосується способу виявлення присутності РОСВ у зразку (шляхом виявлення

Е-білка або його фрагмента), який включає створення контакту зразка з антитілом, або його антигензв'язувальним фрагментом, за винаходом і виявлення присутності комплексу між антитілом, або фрагментом, і пептидом; при цьому виявлення комплексу вказує на присутність

Е-білка РСВ. В одному варіанті здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом містить: () СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 1; (її) СОК2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 2; (ії) СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3; (м) СОКІ1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 4; (м) СОК2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 5; і (м) СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 6. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності «ЕО ІЮ МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності

ЗЕО І МО: 25.

Винахід також стосується способу підвищення анти-лРСВ активності антитіла до Е-білка

ЛРСВ, який включає: одержання вихідного антитіла до Е-білка лРСОВ і посилення ефекторної бо функції вихідного антитіла до Е-білка лРСВ; при цьому активність одержаного антитіла до Е-

білка лРСВ підвищена в порівнянні з активністю вихідного антитіла до Е-білка лРСВ.

Використовуваний у даному описі термін "вихідне антитіло" стосується антитіла, що має Ес- область дикого типу і/або глікозилування дикого типу (тобто патерн глікозилування, що виникає в результаті експресії поліпептиду в генетично не модифікованій клітині-хазяїні ссавця).

Ефекторна функція вихідного антитіла може бути посилена за рахунок мутацій його Ес-області або за рахунок зміни його патерна глікозилування, наприклад, шляхом створення афукозилованого антитіла (як описано більш докладно нижче). В одному варіанті здійснення ефекторну функцію вихідного антитіла до Е-білка лЛРСОВ підсилюють шляхом введення мутацій в

Ес-область вихідного антитіла до Е-білла лРСВ. В іншому варіанті здійснення ефекторну функцію вихідного антитіла до Е-білка лРСВ підсилюють за рахунок видалення залишків фукози з антитіла, або за рахунок експресії антитіла в клітині-хазяїні, генетично модифікованій для усунення активності ферменту, що забезпечує додавання залишків фукози в глікопротеїни.

КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

На Фігурах 1А-В представлені криві зв'язування (аналіз ЕГІЗА) антитіл проти РСВ людини: рг5, палівізумабу і КВ1 з формами "до злиття" (А) і "після злиття" (В) Е-білка РСВ людини.

На Фігурах 2А-В представлені криві нейтралізації для антитіл проти РСВ людини у випадку

РСВ А штаму Г опа (А) і РСВ В штаму Умазпіпоаоп (В).

На Фігурах ЗА-В показане картування епітопа для КВІ методом аланін-скануючого мутагенезу Е-білка злиття (А) і залишки картованого епітопа на кристалічній структурі форми "до злиття" Е-білка (В).

На Фігурах 4А-О показана ефективність КВІ у порівнянні з 025 у легенях бавовняного хом'яка в моделі зараження РСВ А залежно від концентрацій антитіла (А) і в моделі зараження

РСОСВ В залежно від концентрацій антитіла (В), або кількість вірусних частинок (БУО/г), присутніх у тканинах, залежно від дози антитіла при зараженні РСВ А (С) і зараженні РСВ В (0).

На Фігурах 5А-О показана ефективність КВІ1 у порівнянні з 025 у носі бавовняного хом'яка в моделі зараження РСВ А залежно від концентрацій антитіла (А) і в моделі зараження РСВ В залежно від концентрацій антитіла (В), або кількість вірусних частинок (БУО/г), присутніх у тканинах, залежно від дози антитіла при зараженні РСВ А (С) і зараженні РСВ В (0).

На Фігурі 6 наведена крива зв'язування (аналіз ЕГІ5А) антитіла КВ1-УТЕ проти РСВ людини

Зо з Е-білком РСВ А людини.

На Фігурі 7 показані фармакокінетичні властивості у макак-резусів антитіла КВ1-МТЕ (КВ1-УТЕ) у порівнянні з мотавізумабом, що має набір мутацій УТЕ.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Скорочення

У тексті докладного опису і прикладів винаходу використані наступні скорочення:

АОС - антитілозалежна клітинна цитотоксичність,

Сорос - комплементзалежна цитотоксичність,

СОВ - область, що визначає комплементарність, у варіабельних областях імуноглобуліну, визначена з використанням системи нумерації Кабаї,

СНО - яєчник китайського хом'яка,

ЕПЗА - твердофазний імуноферментний аналіз,

ЕВ - каркасна область антитіла: варіабельні області імуноглобуліну за винятком областей

Сов,

НАР - пероксидаза хрону,

ІСво - концентрація, що приводить до 50 95 інгібування,

Іда - імуноглобулін 0,

Каваї - система вирівнювання і нумерації залишків імуноглобулінів, уперше запропонована

Еміп А. Кабаї ((1991) бЗедиєпсев5 ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, 5" Ейд., Рибіїс Неайн

Зегмісе, Майопаї Іпвійшевз ої Неайн, ВеїшШйезаа, Ма.),

БО мАт або Мат, або МАт - моноклональне антитіло,

М-область - сегмент ланцюгів Ідс, послідовність якого варіює у різних антитіл; він продовжується до залишку 109 у легкому ланцюзі і залишку 113 у важкому ланцюзі по системі

Кабаї,

МН - варіабельна область важкого ланцюга імуноглобуліну,

МК - варіабельна область легкого ланцюга каппа імуноглобуліну.

Визначення

Для полегшення розуміння винаходу нижче наведене роз'яснення деяких технічних і наукових термінів. Якщо в даному описі спеціально не зазначене інше, усі інші технічні і наукові терміни, використовувані в даному описі, мають те значення, яке їм звичайно надають фахівці в 60 галузі, до якої належить цей винахід.

При використанні в даному описі, включаючи прикладену формулу винаходу, терміни в однині включають відповідні терміни в множині, якщо з контексту чітко не випливає інше.

Терміни "введення" і "вплив" застосовно до тварини, людини, експериментального пацієнта, клітини, тканини, органа або біологічної рідини означають створення контакту екзогенного фармацевтичного, терапевтичного, діагностичного засобу або композиції із твариною, людиною, пацієнтом, клітиною, тканиною, органом або біологічною рідиною. Вплив на клітину включає створення контакту реагенту із клітиною, а також створення контакту реагенту з рідиною, коли рідина знаходиться в контакті із клітиною. Терміни "введення" і "вплив" також означають іп міїго і ех мімо вплив, наприклад на клітину, реагентом, діагностичною, зв'язуючою сполукою або іншою клітиною. "РСВ-захворювання" означає будь-яке захворювання, що викликається, прямо або побічно, інфікуванням респіраторно-синцитіальним вірусом (РСВ), а також захворювання або стани, які роблять схильними пацієнта до інфікування РСВ. Приклади захворювань, що входять у зазначену категорію, включають пневмонію і бронхіоліт. Захворювання і стани в зазначеній категорії (тобто ті, які є причиною виникнення ризику важкої РСВ-інфекції у пацієнта) включають кістозний фіброз, уроджене захворювання серця, рак, вікову імуносупресію, одержання трансплантата й, загалом, будь-який стан, що викликає імуносупресію або зниження функції імунної системи, такий як стан після операції по трансплантації органа або передчасних пологів.

Термін "лікувати" або "лікування" означає введення терапевтичного засобу, такого як композиція, яка містить будь-яке з антитіл, або антигензв'язувальних фрагментів, за даним винаходом, внутрішнім або зовнішнім шляхом введення особі або пацієнту, що має один або більше симптомів захворювання, або передбачувано має захворювання, відносно якого засіб має терапевтичну активність. Як правило, засіб вводять у кількості, ефективній для ослаблення одного або більше симптомів захворювання у пацієнта, що одержує лікування, або групи пацієнтів, за рахунок або викликання регресії, або інгібування прогресування такого симптому(ів) до якого-небудь клінічно вимірного ступеня. Кількість терапевтичного засобу, яка ефективна для ослаблення якого-небудь конкретного симптому захворювання, може варіюватися залежно від таких факторів як стан захворювання, вік і маса тіла пацієнта, а також здатність лікарського засобу викликати бажану відповідь у пацієнта. Чи відбулося ослаблення

Зо симптому, можна оцінювати шляхом вимірювань будь-яких клінічних показників, як правило, використовуваних лікарями або іншим кваліфікованим медичним персоналом для оцінки ступеня тяжкості або стану прогресування симптому. Лікування анти-РСВ антитілами також можна поєднувати з іншими видами втручання (використанням антитіл, нуклеїнових кислот, вакцин і низькомолекулярних сполук) для лікування респіраторних захворювань, що викликаються патогенами.

Термін "запобігати" або "запобігання" означає введення профілактичного засобу, такого як композиція, яка містить будь-яке з антитіл, або антигензв'язувальних фрагментів, за даним винаходом, внутрішнім або зовнішнім шляхом введення пацієнту або пацієнту, що має ризик інфікування лРСВ, відносно якого засіб має профілактичну активність. Запобігання включає зменшення ймовірності або ступеня тяжкості подальшої РСВ-інфекції, полегшення симптомів, пов'язаних з інфекцією нижніх дихальних шляхів (ІНДШ), при інфікуванні РСВ, а також викликання імунітету для захисту від РСВ-інфекції. Як правило, засіб вводять у кількості, ефективній для нейтралізації РСВ у легенях і/або в носі з метою блокування інфекції. Кількість профілактичного засобу, яка ефективна для ослаблення якого-небудь конкретного симптому захворювання, може варіюватися залежно від таких факторів як вік і маса тіла пацієнта, а також здатність засобу викликати бажану відповідь у пацієнта. Чи відбулося ослаблення симптому захворювання, можна оцінювати шляхом вимірювань будь-яких клінічних показників, як правило, використовуваних лікарями або іншим кваліфікованим медичним персоналом для оцінки ступеня тяжкості або стану прогресування симптому, або, у деяких випадках, на основі зменшення необхідності в госпіталізації.

Е-білок лРСОВ

Е-білок РСОВ людини синтезується у вигляді метастабільного тримерного попередника (БО), який протеолітично розщеплюється на ковалентно зв'язані субодиниці Е1 і Е2. Атомні структури тримерів Е-білка у формі "до злиття" були визначені для представників ПГВ-5 і РСОВ сімейства параміксовірусів. Див. Мсі еПап еї аї., 2011, 9. Міго!. 85:7788-7796 (РСВ), і УмеїЇсп еї а!., 2012, Ргос.

Май. Асад. 5сі, 109:16672-16677 (ПГВ). Форма "до злиття" Е-білка має короткий С-кінцевий цитоплазматичний фрагмент, один трансмембранний домен, спіральне стебло і кулеподібний головний домен. Атомні структури Е-білків ВБН, лПГВ-3 і РСВ у формі "після злиття" показали, що відбувається велика подія рефолдингу для перетворення форми "до злиття" у форму "після бо злиття" Е-білка, при якому відбувається перегрупування частини кулеподібного головного домену, з утворенням шестиспірального пучка. Ці структури, поряд з даними по пептидному інгібуванню, дозволили створити модель опосередкованого Е-білком злиття мембран, у якій при активації відбувається перегрупування Е1/Р2, із введенням гідрофобного пептиду злиття з М- кінця Е1 у мембрану клітини-мішені, що приводить до утворення попередньої шпилькової проміжної структури. Ця відносно витягнута структура зв'язує вірус із клітинною мембраною і руйнується, утворюючи стабільний шестиспіральний пучок структури "після злиття". Перехід від метастабільної форми "до злиття" до попередньої шпилькової проміжної структури, а потім до конформації "після злиття" відбувається в напрямку зменшення вільної енергії, при цьому форма "після злиття" є найбільш стабільним станом, і енергія, що вивільняється в процесі рефолдингу Е-білка, витрачається на злиття мембран.

Термін "Е-білок лРСОВ" включає Е-білок РОВ людини, а також його фрагменти, такі як його зрілий фрагмент без сигнального пептиду. В одному з варіантів здійснення винаходу амінокислотна послідовність Е-білка РОСВ людини являє собою амінокислотну послідовність, наведену в Сепрапк під реєстраційним номером ААК14266 (лРСВ В штаму 9320).

Анти-ЛРСВ антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти

Даний винахід стосується антитіл, або їх антигензв'язувальних фрагментів, які зв'язують Е- білок РСОВ людини, переважно, із РСВ як А, так і В штамів, які зв'язують як форму "до злиття" Е- білка, так і форму "після злиття" Е-білка, і варіантів застосування таких антитіл або фрагментів.

У деяких варіантах здійснення антитіла до Е-білка РСВ є виділеними. Антитіла, описані в даному документі, зв'язуються з епітопом у сайті ІМ Е-білка. У будь-якому з конкретних варіантів здійснення винаходу, описаних у даному документі, важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 9 і/або легкий ланцюг або варіабельна область легкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність «ФЕО ІЮО МО: 8. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО: 23 і легкий ланцюг містить, складається по суті з або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 25.

У переважних варіантах здійснення антитіла до Е-білка РСВ є повністю людськими. Основна перевага моноклональних антитіл за винаходом є наслідком того факту, що вони містять послідовності СОКЗ антитіла людини і у деяких варіантах здійснення можуть являти собою повністю людські моноклональні антитіла. Таким чином, іп мімо застосування повністю людських моноклональних антитіл за винаходом для імунопрофілактики і імунотерапії РСОВ-захворювання сильно зменшує проблему імунної відповіді хазяїна на пасивно введені антитіла. Така проблема звичайно має місце при використанні моноклональних антитіл попереднього рівня техніки, що мають ксеногенне або химерне походження. Другим важливим аспектом даної переваги є потенційна безпека даних людських моноклональних антитіл для генно-терапевтичних варіантів застосування, у яких експресія ксеногенних або химерних білків, які містять послідовності, що не належать людині, не може бути припинена.

Використовуваний у даному описі термін "антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білка РСВ" означає антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке специфічно зв'язується з Е-білююм РСВ людини. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке "специфічно зв'язується з РСВ людини" являє собою антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке зв'язується з формою "до злиття" або формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка приблизно 1 нМ або з більш високою афінністю (наприклад, 1 нМ - 2 пМ, 1 нМ, 100 пМ, 10 пМ або 2 пМ), але не зв'язується з іншими білками, позбавленими послідовностей Е-більюа РСВ. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом, яке специфічно зв'язується з Е-білююм РСВ людини, також перехресно реагує з БЕ- білюом РСВ великої рогатої худоби. Використовуваний у даному описі термін "перехресна реактивність" означає здатність антитіла взаємодіяти з гомологічним білком з інших біологічних видів. Чи зв'язується антитіло специфічно з Е-білюм РСВ людини, можна визначати з використанням будь-якого аналізу, відомого в даній галузі. Приклади аналізів, відомих у даній галузі, для визначення афінності зв'язування включають аналіз методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ).

Даний винахід включає антитіла до Е-білюьа лРСВ і способи їх застосування.

Використовуваний у даному описі термін "антитіло" стосується будь-якої форми антитіла, що має бажану біологічну активність. Таким чином, він використовується в найбільш широкому розумінні й, зокрема, включає, але не обмежується ними, моноклональні антитіла (у тому числі повнорозмірні моноклональні антитіла, що містять два легкі ланцюги і два важкі ланцюги), поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), 60 гуманізовані антитіла, повністю людські антитіла і химерні антитіла.

Даний винахід включає антигензв'язувальні фрагменти до Е-білка лРСВ і способи їх застосування. При використанні в даному описі, якщо немає інших вказівок, термін "фрагмент антитіла" або "антигензв'язувальний фрагмент" означає антигензв'язувальні фрагменти антитіл, тобто фрагменти антитіл, що зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном, який зв'язує повнорозмірне антитіло, наприклад фрагменти, які зберігають одну або більше областей

СОК. Приклади антигензв'язувальних фрагментів включають, але не обмежуються ними, Рарб-,

Раб-, К(іабр)»- ії ЕРм-фрагменти; діатіла; лінійні антитіла; одноланцюжкові молекули антитіл, наприклад 5сЕм; а також мультиспецифічні антитіла, утворені із фрагментів антитіл.

Даний винахід включає Баб-фрагменти до Е-білка РСВ і способи їх застосування. "Рар- фрагмент" складається з одного легкого ланцюга, а також СНІ і варіабельних областей одного важкого ланцюга. Важкий ланцюг молекули Бар не може утворювати дисульфідний зв'язок з іншою молекулою важкого ланцюга. "бєар-фрагмент" може являти собою продукт розщеплення антитіла папаїном.

Даний винахід включає антитіла до Е-білка РСВ і їх антигензв'язувальні фрагменти, що містять Ес-область, а також способи їх застосування. "Ес-область" містить два фрагменти важкого ланцюга, що містять СНІ1- і СН2-домени антитіла. Два фрагменти важкого ланцюга утримуються разом двома або більше дисульфідними зв'язками і гідрофобними взаємодіями

СНЗ-доменів.

Даний винахід включає Рар'-фрагменти до Е-білка РСВ і способи їх застосування. "Бар'- фрагмент" містить один легкий ланцюг і частину або фрагмент одного важкого ланцюга, що містить МН-домен і СНІ1-домен, а також область між СНІ1- і СН2-доменами, так, що може бути утворений міжланцюжковий дисульфідний зв'язок між двома важкими ланцюгами двох Еабр'- фрагментів, з утворенням молекули Е(абр')».

Даний винахід включає Е(аб)2-фрагменти до Е-білка РСВ і способи їх застосування. "Е(аб)»- фрагмент" містить два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, що містять частину константної області між СНІ1- і СН2-доменами, так, що утворюється міжланцюжковий дисульфідний зв'язок між двома важкими ланцюгами. Таким чином, Е(ар')»:-фрагмент складається із двох Еар'- фрагментів, які утримуються разом дисульфідним зв'язком між двома важкими ланцюгами. "Каб)г-фрагмент" може бути продуктом розщеплення антитіла пепсином.

Зо Даний винахід включає Ем-фрагменти до Е-білка РСВ і способи їх застосування. "Гму- область" містить варіабельні області як важких, так і легких ланцюгів, але не містить константні області.

Даний винахід включає зсЕм-фрагменти до Е-білка РСВ і способи їх застосування. Термін "одноланцюжкові Ем", або "5сЕу", антитіла означає фрагменти антитіла, що містять МН- і МІ- домени антитіла, причому ці домени знаходяться на одному поліпептидному ланцюзі. Як правило, поліпептид Ем додатково містить поліпептидний лінкер між УН- і МІ -доменами, який дозволяє 5сЕм утворювати структуру, необхідну для зв'язування антигену. Для огляду, що стосується 5сЕм, див. РійсКкійип (1994), Тпе РІіаптасоїоду ої Мопосіопа! Апіїрбодієв5, мої. 113,

Возепригу апа Мооге ев. бргіпдег-Мепйад, Мем МОЖ, рр. 269-315. Див. також публікацію міжнародної патентної заявки Мо УМО 88/01649 і патенти США МоМо 4946778 і 5260203.

Даний винахід включає доменні антитіла до Е-більа РСВ і способи їх застосування. "Доменне антитіло" являє собою імунологічно функціональний фрагмент імуноглобуліну, що містить тільки варіабельну область важкого ланцюга або варіабельну область легкого ланцюга.

У деяких випадках дві або більше МН-областей ковалентно зв'язані пептидним лінкером, утворюючи двовалентне доменне антитіло. Дві МН-області двовалентного доменного антитіла можуть бути націлені на однакові або різні антигени.

Даний винахід включає двовалентні антитіла до Е-білка РСВ і способи їх застосування. "Двовалентне антитіло" містить два антигензв'язувальні сайти. У деяких випадках два зв'язувальні сайти мають одну і ту ж антигенну специфічність. Однак двовалентні антитіла можуть бути біспецифічними (див. нижче).

Даний винахід включає діатіла до Е-білка РСВ і способи їх застосування. Використовуваний у даному описі термін "діатіла" означає невеликі фрагменти антитіл із двома антигензв'язувальними сайтами, при цьому фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (МН), зв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (МІ) в одному і тому ж поліпептидному ланцюзі (МН-МІ. або МІ-МН). У результаті використання лінкера, який є занадто коротким, щоб допустити спарювання між двома доменами на одному і тому ж ланцюзі, домени вимушено утворюють пари з комплементарними доменами іншого ланцюга, з утворенням двох антигензв'язувальних сайтів. Діатіла описані більш докладно, наприклад, в ЕР 404097, УМО 93/11161 і Ноїїдег еї аЇ. (1993), Ргос. Майн. Асай. 5сі. ОБА, 90:6444-6448. Для огляду, що бо стосується рекомбінантних варіантів антитіл, в основному, див. Ноїїдег апа Ниазоп (2005), Маї.

Віотесппої. 23:1126-1136.

Як правило, антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом, яке деяким чином модифіковане, зберігає щонайменше 1095 від його активності зв'язування (у порівнянні з вихідним антитілом), у молярному вираженні. Переважно, антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом зберігає щонайменше 20 95, 50 б, 70 Зо, 80 Фо, 90 У», 95 95 або 100 95, або більше афінності зв'язування для Е-білка РСВ від афінності вихідного антитіла. Також передбачено, що антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом може мати консервативні або неконсервативні амінокислотні заміни (такі варіанти називають "консервативні варіанти" або "функціонально консервативні варіанти" антитіла), які суттєво не змінюють його біологічну активність.

Даний винахід включає виділені антитіла до Е-білка лРСВ і їх антигензв'язувальні фрагменти, а також способи їх застосування. "Виділені" антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, є щонайменше частково вільними від інших біологічних молекул із клітин або клітинних культур, у яких вони продукуються. Такі біологічні молекули включають нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди, вуглеводи або інший матеріал, такий як клітинний детрит і ростове середовище. Крім того, виділене антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, може бути щонайменше частково вільним від компонентів системи експресії, таких як біологічні молекули з їх клітини-хазяїна або ростове середовище. Як правило, термін "виділені" не повинен означати повну відсутність таких біологічних молекул або відсутність води, буферів або солей, або компонентів фармацевтичного препарату, що містить антитіла або фрагменти.

Даний винахід включає моноклональні антитіла до Е-білка лРСВ і їх антигензв'язувальні фрагменти, а також композиції моноклональних антитіл, що містять декілька виділених моноклональних антитіл. Використовуваний у даному описі термін "моноклональне антитіло" стосується популяції практично гомогенних антитіл, тобто молекули антитіла, що складають популяцію, є ідентичними по амінокислотній послідовності за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутні у незначних кількостях. Навпаки, звичайні (поліклональні) препарати антитіл, як правило, містять множину різних антитіл, що мають різні амінокислотні послідовності в їх варіабельних доменах, зокрема їх областях СОР, які часто бувають специфічними для різних епітопів. Визначення "моноклональне" указує на характер антитіла, як

Зо одержаного із практично гомогенної популяції антитіл, ії не повинно передбачати необхідність одержання антитіла конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, використовувані відповідно до даного винаходу, можуть бути одержані методами рекомбінантних ДНК (див., наприклад, патент США Мо 4816567).

Як правило, структурна одиниця основного (або "повнорозмірного") антитіла являє собою тетрамер. Кожний тетрамер містить дві ідентичні пари поліпептидних ланцюгів, кожна пара містить один "легкий" (приблизно 25 кДа) і один "важкий" (приблизно 50-70 кДа) ланцюг.

Амінокінцева частина кожного ланцюга містить варіабельну область, або домен, із приблизно 100-110 або більше амінокислот, що відіграє основну роль в упізнаванні антигену.

Карбоксикінцева частина важкого ланцюга може містити константну область, або домен, що відіграє основну роль в ефекторній функції. Як правило, легкі ланцюги антитіла людини класифікують як легкі ланцюги каппа і лямбда. Крім того, важкі ланцюги антитіла людини, як правило, класифікують як ланцюги мю, дельта, гамма, альфа або епсилон, і вони визначають ізотип антитіла як ЗМ, 90, Ідс, ІА і ІДЕ, відповідно. У складі легких і важких ланцюгів варіабельні і константні області зв'язані ")"-областю із приблизно 12 або більше амінокислот, при цьому важкий ланцюг також містить "ЮО"-область ще із приблизно 10 амінокислот. Див., в основному, Еипдатепіа! Іттипоюду Сп. 7 (Раці УМ. ед., 24 Еа., Камеп Ргев55, М.У. (1989). У контексті антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, терміни "домен" і "область" можуть бути використані взаємозамінно, коли це доцільно.

Варіабельні області кожної пари легкого/'важкого ланцюгів утворюють зв'язувальний сайт антитіла. Таким чином, як правило, інтактне антитіло має два зв'язувальні сайти. За винятком біфункціональних або біспецифічних антитіл, два зв'язувальні сайти є, як правило, однаковими.

Як правило, варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів містять три гіперваріабельні області, також називані областями, що визначають комплементарність (СОК), які знаходяться серед відносно консервативних каркасних областей (ЕК). Області СОЖК, як правило, розташовані в ряд з каркасними областями, що створює можливість для зв'язування конкретного епітопа. Як правило, від М-кінця до С-кінця варіабельні домени як легкого, так і важкого ланцюга містять ЕК!, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ і ЕК4. Звичайно амінокислоти відносять до кожного домену відповідно до визначень, наведених у публікаціях Зедциепсев5 ої

Ргоївіпо ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Кабаї еї а!.; Маїопаї! Іпзійшев ої Неай, Веїпезаа, ма.; 5" Еа.; бо МІН Рибі. Мо. 91-3242 (1991); Караї, 1978, Аду. Ргої. Спет. 32:1-75; Кабаї єї аї., 1977, у. Віої.

Спет. 252:6609-6616; Споїтіа еї аї!., 1987, У. Мої. ВіоІ. 196:901-917, або Споїйіа еї аї., 1989,

Маїшиге, 342:878-883.

Використовуваний у даному описі термін "гіперваріабельна область" означає амінокислотні залишки антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, які відповідають за зв'язування антигену. Гіперваріабельна область містить амінокислотні залишки з "області, що визначає комплементарність" або "СОК" (тобто СОКІ1, СОКІ2 ії СОНРІ З у варіабельному домені легкого ланцюга і СОКНІ, СОКНа2 їі СОКНЗ у варіабельному домені важкого ланцюга). Див. Кабаї еї а). (1991), бедиепсев ої Ргоївїп5 ої Іттипо/іодіса! Іпіегев5і, 5' Ей., Рибіїс Неайй 5бегуісе, Маїйопаї

Іпоіїйшез ої Неайй, Веїпезаа, Ма. (визначення областей СОК антитіла на основі послідовності); див. також Споїйіа апа І е5К, 1987, 9. Мої. ВіоїІ. 196:901-917 (визначення областей СОР. антитіла на основі структури). Використовуваний у даному описі термін "каркасні" або "ЕК"-залишки означає залишки варіабельного домену, відмінні від залишків гіперваріабельних областей, визначених у даному описі як залишки СОК.

Термін "виділена молекула нуклеїнової кислоти" або "виділений полінуклеотид" означає полінуклеотид ДНК або РНК геномного, мРНК, кДНК або синтетичного походження, або деякі їх комбінації, який не зв'язаний з повнорозмірним, або частковим, полінуклеотидом, у якому виділений полінуклеотид зустрічається в природі, або зв'язаний з полінуклеотидом, з яким він не зв'язаний у природі. Для цілей цього винаходу слід розуміти, що термін "молекула нуклеїнової кислоти, яка містить" конкретну нуклеотидну послідовність, не охоплює інтактні хромосоми. Виділені молекули нуклеїнової кислоти, "які містять" конкретні нуклеотидні послідовності, можуть містити, на доповнення до зазначених послідовностей, кодуючі послідовності до десяти або навіть до двадцяти або більше інших білків, або їх частин або фрагментів, або можуть містити функціонально зв'язані регуляторні послідовності, контролюючі експресію кодуючої області зазначених нуклеотидних послідовностей, і/або можуть містити векторні послідовності.

Термін "послідовності контролю" стосується послідовностей ДНК, необхідних для експресії функціонально зв'язаної кодуючої послідовності в конкретному організмі-хазяїні. Послідовності контролю, які є придатними для прокаріот, наприклад, включають послідовність промотору, необов'язково, оператора і сайт зв'язування рибосоми. Відомо, що в еукаріотичних клітинах

Зо використовуються промотори, сигнали поліаденілювання і енхансери.

Нуклеїнова кислота, або полінуклеотид, є "функціонально зв'язаною", коли вона знаходиться у функціональному зв'язку з іншою нуклеотидною послідовністю. Наприклад, ДНК для передпослідовності або секреторної лідерної послідовності функціонально зв'язана з ДНК для поліпептиду, якщо вона експресується у вигляді пребілка, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він розташований так, щоб сприяти трансляції. Як правило, але не завжди, термін "функціонально зв'язані" означає, що зв'язані послідовності ДНК є суміжними, і, у випадку секреторної лідерної послідовності, є суміжними і у фазі зчитування.

Однак енхансери не обов'язково повинні бути суміжними. Зв'язування здійснюють шляхом лігування в зручні сайти рестрикції. Якщо такі сайти відсутні, використовують синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери відповідно до загальноприйнятої практики.

Використовувані в даному описі терміни "клітина", "лінія клітин" і "культура клітин" використовують взаємозамінно, і всі такі визначення включають клітинне потомство. Таким чином, терміни ""рансформанти" і ""рансформовані клітини" включають первинну зазначену клітину і культури, одержані з неї, без урахування кількості пересівань. Слід також розуміти, що не всі потомки будуть мати абсолютно ідентичну ДНК внаслідок навмисних або ненавмисних мутацій. Мутантне потомство, що має таку ж функцію або біологічну активність, на яку був проведений скринінг вихідної трансформованої клітини, охоплене даними термінами. Там, де передбачаються чіткі позначення, це буде ясно з контексту.

Використовуваний у даному описі термін "послідовність зародкової лінії" стосується послідовності неперегрупованих послідовностей ДНК імуноглобуліну. Можна використовувати будь-яке придатне джерело неперегрупованих послідовностей імуноглобуліну. Послідовності зародкової лінії більів людини можна одержувати, наприклад, з баз даних послідовностей зародкової лінії "ОІМЗОЇ МЕК на веб-сайті Національного інституту артриту і скелетно-м'язових і шкірних хвороб Національних інститутів здоров'я США. Послідовності зародкової лінії білків миші можна одержувати, наприклад, як описано в статті сіцаїсеїї еї аї., 2005, Мисівїс Асіа5 Кев. 33:0256-0261.

Фізичні і функціональні властивості ілюстративних антитіл до Е-білка РСВ бо Даний винахід стосується антитіл до Е-білка лРСВ і їх антигензв'язувальних фрагментів, що мають зазначені структурні і функціональні властивості, а також способів застосування антитіл, або їх антигензв'язувальних фрагментів, у лікуванні або запобіганні захворюванням/станам, пов'язаним із РСВ-інфекцією. "Антитіло до Е-білка РСВ, або його антигензв'язувальний фрагмент, за даним винаходом" включає: будь-яке антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, описане в даному документі (наприклад, КВ1), або його варіант (наприклад, з варіантною послідовністю або функціональний варіант); будь-яке антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, що містить будь-яку одну або більше із областей СОР, наведених у Таблиці 7; будь-яке антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, яке зв'язується з тим же епітопом в Е-білку РСВ людини, що і антитіла, описані в даному документі (наприклад, КВ1); і будь-яке антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, яке перехресно блокує (частково або повністю) антитіло або перехресно блокується (частково або повністю) антитілом, описаним у даному документі (наприклад, КВ), при зв'язуванні із РСВ.

Перехресно блокуючі антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти можуть бути ідентифіковані на основі їх здатності перехресно конкурувати з антитілом за винаходом в стандартних аналізах зв'язування (таких як ВІіАСоге, ЕГІ5ЗА, проточна цитометрія). Наприклад, можна використовувати стандартні аналізи ЕГІ5БА, у яких рекомбінантний Е-білок РСВ іммобілізують на планшеті, одне з антитіл флуоресцентно мітять і оцінюють здатність неміченого антитіла конкурувати за зв'язування з міченим антитілом. Додатково або альтернативно, можна використовувати аналіз ВІіІАСоге для оцінки здатності антитіла перехресно конкурувати. Здатність тестованого антитіла інгібувати зв'язування іншого антитіла (наприклад, антитіла Ю025) з Е-білююом РСВ показує, що тестоване антитіло може конкурувати з іншим антитілом (наприклад, 025) за зв'язування з Е-білююм РСОСВ і, таким чином, у деяких випадках може зв'язувати той же епітоп на Е-білку РСВ, що і антитіло 025, або епітоп, що перекривається.

Як зазначено вище, антитіла і їх фрагменти, які зв'язуються з тим же епітопом, що і будь-яке з антитіл, або їх антигензв'язувальних фрагментів, до Е-білка РОВ за даним винаходом, також є частиною даного винаходу. Крім того, у конкретних варіантах здійснення антитіла, які зв'язуються з епітопом, який перекривається з епітопом, що зв'язуються будь-яким з антитіл до

Е-білька РСВ за винаходом, також є частиною даного винаходу. Відомо декілька методів картування епітопів антитіла на антигенах-мішенях, включаючи ВДО мас-спектрометрію, рентгенівську кристалографію, аналіз рерзсап і сайт-спрямований мутагенез. Наприклад, ВДО (воднево-дейтерієвий обмін) у комбінації із протеолізом і мас-спектрометрією можна використовувати для визначення епітопів антитіла на специфічному антигені У. Метод ВДО-МС оснований на точному вимірюванні і порівнянні ступеня включення дейтерію антигеном при інкубації в О2О за відсутності і у присутності антитіла до нього через різні часові інтервали.

Дейтерій обмінюється з воднем на амідному каркасі білків у відкритих областях, у той час як області зв'язування антигену з антитілом будуть захищені і будуть демонструвати менший ступінь або відсутність обміну після аналізу методом РХ-МС/МС протеолітичних фрагментів.

Приклади імуноглобулінових ланцюгів антитіл до Е-білюка РСВ за винаходом, а також їх областей СОК, включають, але не обмежуються ними, ті, які наведені в Таблиці 7 (ЗЕО ІЮ МО5: 1-8, 23 ії 25). Даний винахід включає будь-який поліпептид, який містить, складається по суті з або складається з амінокислотних послідовностей 5ЕО ІЮО МО5: 1-8, 23 і 25, а також рекомбінантні нуклеотиди, кодуючі такі поліпептиди.

В обсяг даного винаходу входять виділені антитіла до Е-білка лРСВ і їх антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіант імуноглобулінового ланцюга, наведеного в даному описі, наприклад будь-який з ЗЕО ІЮ МО5: 7, 8; при цьому варіант проявляє одну або більше із наступних властивостей: (ї) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РСВ людини з величиною

Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х1072 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОРЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ); або (ії) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х107! М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО: 9.

У конкретних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, яке зв'язує Е-білок РОСВ людини і містить Мі-домени і МНн- домени, що мають щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичності послідовності з зЗЕО ІЮ МО5: 8 (МІ) і 7 (МН); при цьому варіант проявляє бажане бо зв'язування і властивості, наприклад (ії) зв'язується з формою "до злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х10-72 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ); або (її) зв'язується з формою "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ка від приблизно 1х107 М до приблизно 1х10-! М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 9.

Термін "консервативно модифіковані варіанти" або "консервативна заміна" стосується замін амінокислот у білку іншими амінокислотами, що мають аналогічні характеристики (наприклад, заряд, розмір бічного ланцюга, гідрофобність/гідрофільність, конформацію і жорсткість каркаса і так далі), так що зміни часто можуть бути здійснені без зміни біологічної активності білка.

Фахівці в даній галузі розуміють, що, як правило, одиночні амінокислотні заміни в несуттєвих областях поліпептиду не приводять до значних змін біологічної активності (див., наприклад,

Маїзоп еї аї. (1987), Моїесшіаг Віоіоду ої Ше Сепе, Те Вепіатіп/Ситтіпд5 Риб. Со., р. 224 (Ап

Е4.)). Крім того, заміни на структурно або функціонально аналогічні амінокислоти з меншою ймовірністю приводять до порушення біологічної активності. Ілюстративні консервативні заміни наведені в Таблиці 1.

Таблиця 1

Ілюстративні консервативні амінокислотні заміни пед 77771111 0(бешМма,//////////

Функціонально консервативні варіанти антитіл за винаходом також передбачені за даним винаходом. Використовуваний у даному описі термін "функціонально консервативні варіанти" стосується антитіл, або їх фрагментів, у яких один або більше амінокислотних залишків були замінені без зміни бажаної властивості, такої як афінність і/або специфічність відносно антигену. Такі варіанти включають, але не обмежуються ними, варіанти із заміною амінокислоти на амінокислоту, що має аналогічні властивості, наприклад варіанти з консервативними амінокислотними замінами, наведеними в Таблиці 1. Також запропоновані виділені поліпептиди, що містять Мі -домени антитіл до Е-білюка лРСОВ за винаходом (наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 8), Її виділені поліпептиди, що містять МН-домени (наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 7) антитіл до Е-білка лРСВ за винаходом, що маютьаждо 0,1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

Зо 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 або більше амінокислотних замін, які можуть мати місце виключно в каркасній області або з яких одна або більше можуть знаходитися в одній або більше із областей СОК. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 9.

В іншому варіанті здійснення запропоноване антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке зв'язує Е-білок лРСВ і містить Мі -домени і МН-домени, що мають щонайменше 99 95, 98 95, 97 Зо, 96 Зо, 95 95, 90 95, 85 95, 80 95 або 75 95 ідентичності послідовності 3 одним або більше із Мі-доменів або МН-доменів, описаних у даному документі, і демонструє специфічне зв'язування з Е-білюом лРСВ. В іншому варіанті здійснення зв'язувальне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за даним винаходом містить Мі- і МН-домени (із сигнальною послідовністю або без неї), що мають аждо0,1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 або більше амінокислотних замін, які можуть мати місце виключно в каркасній області або з яких одна або більше можуть знаходитися в одній або більше із областей СОК, і демонструє специфічне зв'язування з Е- білююом лРСВ. У конкретних варіантах здійснення важкий ланцюг або варіабельна область важкого ланцюга не містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 9.

Полінуклеотиди і поліпептиди

Даний винахід також стосується полінуклеотидів, кодуючих будь-які з поліпептидів або імуноглобулінових ланцюгів антитіл, або їх антигензв'язувальних фрагментів, до Е-білка лРСВ за винаходом. В одному варіанті здійснення виділений полінуклеотид кодує антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить щонайменше один зрілий варіабельний домен легкого ланцюга імуноглобуліну (МІ) за винаходом і/або щонайменше один зрілий варіабельний домен важкого ланцюга імуноглобуліну (МН) за винаходом. У деяких варіантах здійснення виділений полінуклеотид кодує як легкий ланцюг, так і важкий ланцюг на одній полінуклеотидній молекулі, і в інших варіантах здійснення легкий і важкий ланцюги закодовані на окремих полінуклеотидних молекулах. В іншому варіанті здійснення полінуклеотид також кодує сигнальну послідовність. Наприклад, даний винахід включає полінуклеотиди, кодуючі амінокислотні послідовності ЗЕ 10 МО5: 1-8, 23 і 25, а також полінуклеотиди, які гібридизуються з ними, і, крім того, будь-який поліпептид, закодований таким полінуклеотидом, що гібридизується. В одному варіанті здійснення винахід стосується нуклеотидної послідовності, що містить, складається по суті з або складається з ЗЕО ІЮО МО: 15 (варіабельна область важкого ланцюга) або 5ЕО ІЮ МО: 16 (варіабельна область легкого ланцюга). У конкретних варіантах здійснення можна використовувати кодон-оптимізацію для посилення

Зо властивостей нуклеїнової кислоти, наприклад експресії в певному хазяїні. В одному варіанті здійснення винахід стосується нуклеотидної послідовності, що містить, складається по суті з або складається з ЗЕО ІЮ МО: 17 (кодон-оптимізована варіабельна область важкого ланцюга) або 5ЕО ІО МО: 18 (кодон-оптимізована варіабельна область легкого ланцюга). У конкретних варіантах здійснення можна використовувати лідерну послідовність. В одному варіанті здійснення винахід стосується нуклеотидної послідовності, що містить, складається по суті з або складається з ЗЕО ІЮ МО: 19 (лідерна послідовність і важкий ланцюг) або 5ЕО ІЮ МО: 20 (лідерна послідовність і легкий ланцюг), зв'язаних з важким ланцюгом або легким ланцюгом, з утворенням 5ЕО ІЮ МО: 21 або 5ЕО ІО МО: 22, відповідно.

Як правило, полінуклеотиди гібридизуються в умовах низької, середньої або високої строгості і кодують антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, які зберігають здатність до зв'язування Е-біль»а лРСВ. Перша полінуклеотидна молекула є "гібридизованою" із другою полінуклеотидною молекулою, якщо одноланцюжкова форма першої полінуклеотидної молекули може відпалюватися з другою полінуклеотидною молекулою у відповідних умовах температури і іонної сили розчину (див. ЗзатбгоокК еї аіЇ., вище). Температура і іонна сила визначають "строгість" умов гібридизації. Типові умови гібридизації низької строгості включають 5520, 5х 5552, 0,1 95 505 і відсутність формаміду; або 30 95 формаміду, 5х З5С, 0,5 96 505 при 42 б. Типові умови гібридизації середньої строгості включають 40 95 формаміду з 5х або бх

С і 0,1 95 505 при 42 С. Умови гібридизації високої строгості включають 50 95 формаміду, 5х або бх 55С при 42 "С або, необов'язково, при більш високій температурі (наприклад, 57 20, 59

БО 20,60 20,62 б, 63 б, 65 "С або 68 С). Як правило, 55С2 являє собою розчин 0,15 М Масі і 0,015 М Ма-цитрату. Для гібридизації необхідно, щоб два полінуклеотиди містили комплементарні послідовності, хоча, залежно від строгості умов гібридизації, можливі невідповідності між основами. Придатна строгість умов для полінуклеотидів, що гібридизуються, залежить від довжини полінуклеотидів і ступеня комплементарності, змінних величин, добре відомих у даній галузі. Чим більше ступінь подібності або гомології між двома нуклеотидними послідовностями, тим вище строгість умов, при яких нуклеїнові кислоти можуть гібридизуватися.

Для гібридів довжиною більше 100 нуклеотидів були розроблені формули для розрахунків температури плавлення (див. Затьгоок еї аї., вище, 9.50-9.51). У випадку гібридизації з більш короткими полінуклеотидами, наприклад олігонуклеотидами, кількість невідповідних положень бо стає більш важливою, і довжина олігонуклеотиду визначає його специфічність (див. Затьгоок еї аІ., вище, 11.7-11.8).

В одному варіанті здійснення винахід стосується виділеного полінуклеотиду, кодуючого варіабельний домен важкого ланцюга (МН) антитіла, або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить СОБ-НІ (ЗЕО 10 МО: 1), СОВ-Н2 (ЗЕО ІО МО: 2) і СОБ-НЗ (5ЕО ІО МО: 3).

В одному варіанті здійснення винахід стосується виділеного полінуклеотиду, кодуючого варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла, або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить СОК-Ї 1 (ЗЕО І МО: 4), СОВ-І2 (ЗЕО ІЮ МО: 5) і СОК-АІ З (5ЕО І МО: 6).

В одному варіанті здійснення винахід стосується виділеного полінуклеотиду, кодуючого варіабельний домен важкого ланцюга (МН) антитіла 5ЕО ІЮ МО: 7 або важкий ланцюг 5ЕО ІЮ

МО: 23.

В одному варіанті здійснення винахід стосується виділеного полінуклеотиду, кодуючого варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла 5ЕО ІО МО: 8 або легкий ланцюг 5ЕО ІЮО МО: 25.

Даний винахід також стосується векторів, наприклад експресійних векторів, таких як плазміди, які містять виділені полінуклеотиди за винаходом, при цьому полінуклеотид функціонально зв'язаний з послідовностями контролю, які упізнаються клітиною-хазяїном, коли клітину-хазяїна трансфікують вектором. Також запропоновані клітини-хазяїни, які містять вектор за даним винаходом, і способи одержання антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, або поліпептиду, розкритих у даному описі, які включають культивування клітини-хазяїна, що містить експресійний вектор або нуклеїнову кислоту, кодуючу імуноглобулінові ланцюги антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, у культуральному середовищі, і виділення антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, із клітини-хазяїна або культурального середовища.

Даний винахід також включає поліпептиди, наприклад поліпептиди імуноглобуліну, які містять амінокислотні послідовності, які щонайменше приблизно на 7595 ідентичні, 80 95 ідентичні, більш переважно щонайменше приблизно на 90 95 ідентичні і найбільш переважно щонайменше приблизно на 95 95 ідентичні (наприклад, 95 9», 96 Фо, 97 ФУ, 98 95, 99 95, 100 95) з амінокислотними послідовностями антитіл, наведеними в даному описі, при порівнянні з використанням алгоритму ВІГА5БТ, коли параметри алгоритму вибрані для досягнення найбільшої відповідності між відповідними послідовностями по всій довжині відповідних еталонних послідовностей (наприклад, поріг очікування: 10; розмір слова: З; максимальна кількість збігів у діапазоні запиту: 0; матриця ВОБИМ 62; штрафи за делецію: внесення 11, продовження 1; умовне композиційне коректування матриці замін). "Ідентичність послідовностей" означає ступінь, у якому амінокислоти двох поліпептидів є однаковими в еквівалентних положеннях при оптимальному вирівнюванні двох послідовностей.

Наступні літературні джерела стосуються опису алгоритмів ВІ А5Т, часто використовуваних для аналізу послідовностей: ВІ АЗТ А СОКІТНМ5: Айвбспиі еї аї. (2005), РЕВ5 у. 272(20):5101- 5109; Авспи! 5.Р. еї аї. (1990), У. Мої. Віої. 215:403-410; (зів МУ. еї аї. (1993), Маїцге Сіепеї. 3:266-272; Мадаєп Т.Ї. єї а. (1996), Меїй. Еплутої. 266:131-141; АйбсНи! 5.Е. єї аї. (1997),

Мисівєїс Асіаз Ве5. 25:3389-3402; 7Напа ». єї а. (1997), сепоте Вев. 7:649-656; М/ооцоп .).С. єї аї. (1993), Сотриї. Спет. 17:149-163; Напсоск у.М. еї а. (1994), Сотриї. Аррі. Віовсі. 10:67-70;

АПОММЕМТ 5СОВІМО 5У5ТЕМО: Оаупої М.О. еї аї. "А тоавї! ої емоІшіопагу спапде іп ргоївіпв", іп: АШаз ої Ргоївіп Зедиепсе апа Зітгисішге (1978), мої. 5, виррі. 3. М.О. Рауноїй (єд.), рр. 345-352,

Май. Віотейд. Нев. Рошцпа., УМазпіпдіюоп, ОС; Зспуап: В.М. еї аї. "Майсев ог аеїесіїпа аївїапі геіанйопепірв", іп: Айав ої Ргоївіп Зедиепсе апа 5ігисіиге (1978), мої. 5, зиррі. 3. М.О. баупоїї (ед.), рр. 353-358, Май). Віотед. Нев. Рошипа., УМазпіпоїоп, ОС; Айвспи! 5.Р. (1991), У. Мої. Віої. 219:555- 565; Зіагез 0... єї аї. (1991), Меїйодв 3: 66-70; Непікої 5. еї а. (1992), Ргос. Маї). Асад. 5сі. О5А, 89:10915-10919; Айбспи! 5.Р. єї аї. (1993), 9). Мої. Емої. 36:290-300; АПОММЕМТ 5ТАТІБЗТІСО:

Капіп 5. еї аї. (1990), Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА, 87:2264-2268; Капіп 5. еї а!. (1993), Ргос. Май).

Асай. бсі. ОБА, 90:5873-5877; ЮОетрбо А. єї аї. (1994), Апп. Ргоб. 22:2022-2039; і Айбспці 5.Р. "Емаїчайпуд Ше віаїївіїса! взідпіїйсапсе ої тийріе аївіпсі оса! аїїдптепів", іп: ТНеогеїїса! апа

Сотршиіайопа! Меїносв іп сепоте Незеагсй (5. ЗиПаї, єд.) (1997), рр. 1-14, Ріепит, Мем/ Моїк.

Афінність зв'язування

Як приклад, але не обмеження, антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі, можуть зв'язувати форму "до злиття" Е-білка або форму "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ко щонайменше приблизно 1х109 М (тобто величиною Ко 1х109 М або нижче) при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). В одному варіанті здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі, можуть зв'язувати форму "до 60 злиття" Е-білка або форму "після злиття" Е-білка РСВ людини з величиною Ко щонайменше від приблизно 1х1079 М до приблизно 1х10-2 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОРЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). В одному варіанті здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі, можуть зв'язувати форму "до злиття" Е-білка або форму "після злиття" Е-білка РСОВ людини з величиною Ко від приблизно 1х109 М до приблизно 1х1077 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад, КіпЕха або ОСТЕТ). В одному варіанті здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі, можуть зв'язувати форму "до злиття" Е-білка або форму "після злиття" Е-білька РСВ людини з величиною Ко щонайменше приблизно 100 пМ (тобто величиною Ко приблизно 100 пМ або нижче) при визначенні методом ВІАСОКЕ або аналогічним методом. В одному варіанті здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі, можуть зв'язувати форму "до злиття" Е-білка або форму "після злиття" Е-білка

РСВ людини з величиною Ко щонайменше приблизно 10 пМ (тобто величиною Ко приблизно 10

ПМ або нижче) при визначенні методом ВІАСОКЕ або аналогічним методом. В одному варіанті здійснення антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі, можуть зв'язувати форму "до злиття" Е-білка або форму "після злиття" Е-білюяа РСВ людини з величиною Ко від приблизно 1 пМ до приблизно 100 пМ при визначенні методом ВІАСОКЕ або аналогічним методом.

Способи одержання антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів

Даний винахід стосується способів одержання антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, до Е-білка лРСОВ за даним винаходом, які включають культивування лінії клітин, експресуючих антитіло, або фрагмент, в умовах, сприятливих для такої експресії, і, необов'язково, виділення антитіла, або фрагмента, із клітин і/або ростового середовища (наприклад, середовища для культивування клітин).

Антитіла до БЕ-білюа лРСВ, розкриті в даному описі, також можна одержувати рекомбінантними методами (наприклад, в експресійній системі Е. сої/17, експресійній системі клітин ссавців або експресійній системі нижчих еукаріот). У даному варіанті здійснення нуклеїнові кислоти, кодуючі молекули антитіла за винаходом (наприклад, МН або МІ), можуть бути вставлені в плазміду на основі рЕТ і експресовані в системі Е. соїЇ/17. Наприклад, даний

Зо винахід включає способи експресії антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, або його імуноглобулінового ланцюга у клітині-хазяїні (наприклад, бактеріальній клітині-хазяїні, такій як Е. соїї, наприклад ВІ 21 або ВІ 210ЕЗ), які включають експресію Т7 РНК-полімерази в клітині, яка також містить полінуклеотид, кодуючий імуноглобуліновий ланцюг, який функціонально зв'язаний із промотором 17. Наприклад, в одному з варіантів здійснення винаходу бактеріальна клітина-хазяїн, така як Е. ссоїї, містить полінуклеотид, кодуючий 17 РНК-полімеразу, функціонально зв'язаний з Іас-промотором, і експресія полімерази і ланцюга індукується шляхом інкубації клітини-хазяїна з ІРТО (ізопропіл-бета-О-тіогалактопіранозид).

У даній галузі відомо декілька методів одержання рекомбінантних антитіл. Один приклад методу одержання рекомбінантних антитіл наведений у патенті США Мо 4816567.

Трансформацію можна виконувати будь-яким відомим методом введення полінуклеотидів у клітину-хазяїна. Методи введення гетерологічних полінуклеотидів у клітини ссавців добре відомі в даній галузі і включають опосередковану декстраном трансфекцію, осадження фосфатом кальцію, опосередковану полібреном трансфекцію, злиття протопластів, електропорацію, інкапсуляцію полінуклеотиду(ів) у ліпосоми, біолістичну ін'єкцію і пряму мікроін'єкцію ДНК у ядро. Крім того, молекули нуклеїнової кислоти можна вводити в клітини ссавців за допомогою вірусних векторів. Способи трансформації клітин добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, патенти США МоМо 4399216, 4912040, 4740461 і 4959455.

Таким чином, даний винахід включає рекомбінантні способи одержання анти-лРСВ антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, або його імуноглобулінового ланцюга за даним винаходом, які включають введення полінуклеотиду, кодуючого один або більше імуноглобулінових ланцюгів антитіла, або фрагмента (наприклад, важкий і/або легкий імуноглобуліновий ланцюг); культивування клітини-хазяїна (наприклад, СНО або Ріспіа, або

Ріспіа равхіогі5) в умовах, сприятливих для такої експресії, і, необов'язково, виділення антитіла, або фрагмента, або ланцюга із клітини-хазяїна і/або середовища, у якому росте клітина-хазяїн.

Антитіла до Е-біль»а лРСВ також можна синтезувати будь-яким з методів, викладених у патенті США Мо 6331415.

Еукаріотичні і прокаріотичні клітини-хазяїни, включаючи клітини ссавців, як хазяїни для експресії антитіл, або фрагментів, або імуноглобулінових ланцюгів, розкритих у даному описі, добре відомі в даній галузі і включають багато які імморталізовані лінії клітин, доступні від бо Американської колекції типових культур (АТСС). До них належать, зокрема, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), клітини МО, клітини 5Р2, клітини Неїа, клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК), клітини нирки мавпи (СО5), клітини печінковоклітинної карциноми людини (наприклад, Нерсг), клітини А549, клітини ЗТ3, клітини НЕК-293 і цілий ряд інших ліній клітин. Клітини-хазяїни ссавців включають клітини людини, миші, щура, собаки, мавпи, свині, кози, бика, коня і хом'яка. Особливо переважні лінії клітин вибирають, визначаючи лінії клітин з високими рівнями експресії. Інші лінії клітин, які можна використовувати, включають лінії клітин комах, такі як клітини 519, клітини амфібій, клітини бактерій, клітини рослин і клітини грибів. Клітини грибів включають клітини дріжджів і клітини нитчастих грибів, у тому числі, наприклад, Ріспіа рабвіогі5, Ріспіа Япіапаіса, Ріспіа ігепаіорпйа, Ріспіа Косіатає, Ріспіа тетрбгапаєїасіеп5, Рісніа тіпша (Одаїаєа тіпиїа, Рісніа Іпапегі), Ріспіа орипідає, Рісніа

ІШептої!оїегапв, Рісніа заїїсіапа, Ріспіа доегсиит, Рісніа ріїреті, Рісніа віїрії5, Ріспіа теїпапоїса,

Рісніа 5р., Засспаготусез сегемівіає, Засспаготусез 5р., Напзепшіа роїутогрНа, Кіпулегтотусев 5р., Кінуухеготусез Іасіїз, Сапаїда аїрісапе, Азрегоійие підціапе, Азрегодійи5 підег, Аврегойш5 огулає, Пісподепта геезеі, Спгузоврогішт ІшсКпожепзе, Еивзагішт в5р., Еизагшт дгатіпеит,

Еивзагйшт мепепаїйт, РНПузсоптійейа раїєпе і Меигозрога осгазза, Ріспіа 5р., будь-які зЗасспаготусез 5р., Напзепшціа роїутогрна, будь-які Кіпулеготусез 5р., Сапаїда аІрісапв, будь-які

АзрегаїПив5 5р., Пісподетта геезеї, Спгузозрогішт ІссКпомжепзе, будь-які Ризагішт з5р., Матом/іа

Іроїуїса і Меигозрога сгазза. Коли рекомбінантні експресійні вектори, кодуючі важкий ланцюг, або його антигензв'язувальну частину, або фрагмент, легкий ланцюг і/або його антигензв'язувальний фрагмент, вводять у клітини-хазяїни ссавців, антитіла продукуються при культивуванні клітин-хазяїнів протягом періоду часу, достатнього для експресії антитіла або фрагмента, або ланцюга в клітинах-хазяїнах або секреції їх у культуральне середовище, у якому ростуть клітини-хазяїни.

Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти і імуноглобулінові ланцюги можна витягати з культурального середовища з використанням стандартних методів очищення білків. Крім того, експресію антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів і імуноглобулінових ланцюгів за винаходом (або інших їх фрагментів) у лінії клітин-продуцентів можна підвищувати з використанням ряду відомих методів. Наприклад, використання експресійної системи гена глутамінсинтетази (система 55) є загальноприйнятим підходом для підвищення експресії в

Зо певних умовах. Система 55 описана повністю або частково в Європейських патентах МоМо 0 216 846, 0 256 055 і 0 323 997, і Європейській патентній заявці Мо 89303964.4. Таким чином, в одному з варіантів здійснення винаходу клітини-хазяїни ссавців (наприклад, СНО) позбавлені гена глутамінсинтетази і ростуть за відсутності глутаміну в середовищі, однак при цьому полінуклеотид, кодуючий імуноглобуліновий ланцюг, містить ген глутамінсинтетази, який заповнює відсутність гена в клітині-хазяїні.

Даний винахід включає способи очищення анти-лРСВ, або його антигензв'язувального фрагмента, за даним винаходом, які включають нанесення зразка, що містить антитіло, або фрагмент, на середовище для очищення (наприклад, середовище для катіонообмінного очищення, середовище для аніонообмінного очищення, середовище для гідрофобного очищення, середовище для афінного очищення (наприклад, білок-А, білок-С, білок-А/5, білок-

І) ї або збирання очищеного антитіла або фрагмента в проточній фракції зазначеного зразка, яка не зв'язується з середовищем; або відкидання проточної фракції і елюцію антитіла, або фрагмента, що зв'язалося, із середовища і збирання елюату. В одному з варіантів здійснення винаходу середовище знаходиться в колонці, на яку наносять зразок. В одному з варіантів здійснення винаходу метод очищення застосовують після рекомбінантної експресії антитіла, або фрагмента, в клітині-хазяїні, наприклад, при цьому клітину-хазяїна спочатку лізують і, необов'язково, лізат очищають від нерозчинних матеріалів перед очищенням на середовищі.

Як правило, глікопротеїни, продуковані в конкретній лінії клітин або трансгенній тварині, будуть мати патерн глікозилування, характерний для глікопротеїнів, продукованих у лінії клітин або трансгенній тварині. Таким чином, конкретний патерн глікозилування антитіла буде залежати від конкретної лінії клітин або трансгенної тварини, яку використовують для продукування антитіла. Однак усі антитіла, які закодовані молекулами нуклеїнової кислоти, запропонованими в даному описі, або містять амінокислотні послідовності, запропоновані в даному описі, включені в даний винахід, незалежно від патерна глікозилування, який антитіла можуть мати. Аналогічно, у конкретних варіантах здійснення антитіла з патерном глікозилування, що включає тільки нефукозиловані М-глікани, можуть бути переважними, оскільки показано, що такі антитіла, як правило, є більш ефективними, ніж їх фукозиловані аналоги, як іп міїго, так і іп мімо (див., наприклад, ЗпіпКаума 6ї аї., 9. Віої. Спет. 278:3466-3473 (2003); патенти США Мо 6946292 і 7214775). Дані антитіла з нефукозилованими М-гліканами 60 навряд чи будуть імуногенними, оскільки їх вуглеводні структури є звичайним компонентом популяції, що існує в Ї4 людської сироватки.

Даний винахід включає біспецифічні і біфункціональні антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, що мають специфічність зв'язування для Е-білка лРСВ і іншого антигену, такого як, наприклад, С-білок лРСВ, а також способи їх застосування. Біспецифічне або біфункціональне антитіло являє собою штучне гібридне антитіло, що має дві різні пари важкий/легкий ланцюг і два різні сайти зв'язування. Біспецифичні антитіла можна одержувати різними способами, включаючи злиття гібридом або зв'язування Раб'-фрагментів. Див., наприклад, Зоподбіміїаї еї аї. (1990), Сііп. Ехр. Іттипої!. 79:315-321, КовівіІпу вї а!. (1992), У Іттипої. 148:1547-1553. Крім того, біспецифічні антитіла можуть бути одержані у вигляді "діатіл" (Ноїїдег еї а. (1993), РМАБ ОА, 90:6444-6448) або у вигляді "янусинів" (ТтаипесКег еї аіІ. (1991), ЕМВО 3. 10:3655-3659, і

Тгашпескег еї а. (1992), Іпі. У. Сапсег Зи,ррі. 7:51-52).

Даний винахід також включає антигензв'язувальні фрагменти до Е-білка лРСОВ анти-лРСОВ антитіл, розкритих у даному описі. Фрагменти антитіла включають Е(ар)г2-фрагменти, які можуть бути одержані шляхом ферментативного розщеплення Ідс, наприклад, пепсином. Рар- фрагменти можуть бути одержані, наприклад, шляхом відновлення Е(аб)г2 дитіотреїтолом або меркаптоетиламіном.

Імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів залежно від амінокислотних послідовностей константного домену їх важких ланцюгів. Існують щонайменше п'ять основних класів імуноглобулінів: ІЧА, дО, ЧЕ, дос і ІдМ, і деякі з них можуть бути додатково розділені на підкласи (ізотипи), наприклад Ідс1, Ід2, ІдОЗ і Ід04; ІДА1 їі ІДА2. Винахід включає антитіла і антигензв'язувальні фрагменти будь-якого із цих класів або підкласів антитіл.

В одному варіанті здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, містить константну область важкого ланцюга, наприклад людську константну область, таку як людська константна область важкого ланцюга уї, у2, уЗ або у4, або її варіант. В іншому варіанті здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, містить константну область легкого ланцюга, наприклад людську константну область легкого ланцюга, таку як людська константна область легкого ланцюга лямбда або каппа, або її варіант. Як приклад, але не обмеження, людська константна область важкого ланцюга може являти собою у4, і людська константна область легкого ланцюга може являти собою каппа. В альтернативному варіанті здійснення Ес-

Зо область антитіла являє собою у4 з мутацією 5ег228Рго (Зспииптап .). еї. аІ. 2001, Мої. Іттипо). 38:1-8).

В одному варіанті здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, має константну область важкого ланцюга підтипу Ідс1.

У деяких варіантах здійснення різні константні домени можуть бути додані до Мі- і МН- областей, утворених з областями СОК, запропонованими в даному описі. Наприклад, якщо конкретне заплановане застосування антитіла (або фрагмента) за даним винаходом вимагає зміни ефекторних функцій, то може бути використаний константний домен важкого ланцюга, відмінний від ЇД1 людини, або може бути використаний гібрид І(дДсо1/Лдоа4.

Хоча Ід051 антитіла людини відрізняються тривалим часом напівжиття і наявністю ефекторних функцій, таких як активація комплементу і антитілозалежна клітинна цитотоксичність, такі активності можуть бути небажаними для деяких варіантів використання антитіла. У таких випадках, наприклад, можна використовувати константний домен ді людини. Даний винахід включає антитіла до Е-білка лРСВ і їх антигензв'язувальні фрагменти, які містять константний домен Ідс4, наприклад антагоністичні гуманізовані антитіла до Е-білка

ЛРСВ і фрагменти, а також способи їх застосування. В одному варіанті здійснення константний домен Ідс4 може відрізнятися від природного константного домену ІдД04 людини (Зм/і55-Ргої реєстраційний Мо РО1861.1) у положенні, відповідному положенню 228 по системі ЄО і положенню 241 по системі Кабваї, де природний залишок 5ег108 замінений Рго для запобігання потенційному утворенню міжланцюжкового дисульфідного зв'язку між Суб5106 і Суз109 (відповідними положенням Суз226 і Суз229 по системі БЮ і положенням Суз239 і Субз242 по системі Кара), що може перешкоджати утворенню правильного міжланцюжкового дисульфідного зв'язку. Див. Апааї еї аї. (1993), Мої. Ітипої. 30:105. В інших випадках може бути використаний модифікований константний домен Ідс1, який був модифікований для збільшення часу напівжиття або ослаблення ефекторної функції.

Конструювання антитіла

Антитіла за винаходом можна піддавати мутаціям у каркасній області для поліпшення властивостей антитіл. Одна така модифікація каркасної області включає мутацію одного або більше залишків у каркасній області, або навіть в одній або більше областях СОК, для видалення Т-клітинних епітопів з метою зменшення потенційної імуногенності антитіла. Такий 60 підхід також називають "позбавленням імуногенності", він описаний більш докладно в патенті

США Мо 7125689.

У конкретних варіантах здійснення буде бажаною заміна деяких амінокислот, що містять експоновані бічні ланцюги, на інший амінокислотний залишок для забезпечення більшої хімічної стабільності кінцевого антитіла, щоб уникнути дезамідування або ізомеризації. Дезамідування залишку аспарагіну може відбуватися в послідовностях МО, ОС, МО, М, МА, МТ, 00 або О5 і приводити до створення залишку ізоаспарагінової кислоти, який вносить вигин у поліпептидний ланцюг і зменшує його стабільність (ефект ізоаспарагінової кислоти). Ізомеризація може відбуватися в послідовностях ОО, О5, БА або ОТ. У конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом не містять сайтів дезамідування або аспарагінової ізомеризації.

Наприклад, залишок аспарагіну (Азп) може бути замінений на Сіп або Аіа для зменшення ймовірності утворення ізоаспартату в будь-яких послідовностях Абп-СІу, особливо в СОК.

Аналогічна проблема може виникати в послідовності А5зр-Сіу (Веїззпег апа Авмай (2003), СеїЇ.

Мої. Ше Зсі. 60:1281). Утворення ізоаспартату може приводити до ослаблення або повного зникнення зв'язування антитіла з його цільовим антигеном. Див., Ргевіа (2005), 9У. АПегау Сіїп.

Іттипої. 116:731-734. В одному варіанті здійснення залишок аспарагіну заміняють на залишок глутаміну (бІп). Також може бути бажаною заміна амінокислоти, сусідньої із залишком аспарагіну (А5п) або глутаміну (Сіп), для зменшення ймовірності дезамідування, яке відбувається більш часто, коли невеликі амінокислоти знаходяться поруч із залишком аспарагіну або глутаміну. Див., Віхспоїї 8. Коїре (1994), У. Спготаїйоад. 662:261. Крім того, будь-які залишки метіоніну (як правило, експоновані для розчинника залишки Ме) в областях СОМ можна заміняти на Гуз, Геи, АІа або Ріє, або інші амінокислоти для зменшення ймовірності того, що сірка метіоніну буде окислятися, що може приводити до зменшення афінності зв'язування антигену й, крім того, додавати внесок у молекулярну гетерогенність у кінцевому препараті антитіла, те ж посилання. Крім того, для запобігання або зведення до мінімуму потенційно розщеплюваних пептидних зв'язків Абєп-Рго може бути бажаною зміна будь-яких комбінацій А5п-Рго, виявлених в СОЖК, на СіІп-Рго, Аіа-Рго або Авбп-АЇа. Антитіла з такими замінами надалі піддають скринінгу для підтвердження того, що заміни не привели до зменшення афінності або специфічності антитіла для Е-білка лРСВ, або іншої бажаної біологічної активності, до неприйнятних рівнів.

Таблиця 2

Ілюстративні стабілізуючі варіанти СО

М-а О-С), (А-С) або (М-А р-а Е-С), (А-С) або (0-А

М (Ю, (У, (А) або (Р)

М (0) або (А)

М-Р О-Р), (А-Р) або (М-А

Модифікація Ес-області антитіла

Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВ), також можуть бути генетично модифіковані для внесення змін в Ес-область, як правило для зміни однієї або більше властивостей антитіла, таких як час напівжиття в сироватці, фіксація комплементу, зв'язування Ес-рецептора і/або ефекторна функція (наприклад, антигензалежна клітинна цитотоксичність). Крім того, антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВІ), можуть бути хімічно модифіковані (наприклад, один або більше хімічних фрагментів можуть бути приєднані до антитіла) або бути модифіковані для зміни патерна глікозилування, знов-таки, для зміни однієї або більше властивостей антитіла або фрагмента. Кожний з таких варіантів здійснення описаний більш докладно нижче. Нумерація залишків в Ес-області відповідає ЕО-індексу Кабраї.

Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВ), також включають антитіла і фрагменти з Ес-областями, модифікованими (або блокованими) для зміни ефекторних функцій. Див., наприклад, патент США Ме 5624821, МО 2003/086310, УМО

2005/120571, МО 2006/0057702. Такі модифікації можна використовувати для посилення або пригнічення різних реакцій імунної системи, з можливими корисними ефектами в діагностиці і терапії. Зміни Ес-області включають амінокислотні зміни (заміни, делеції і вставки), глікозилування або деглікозилування, а також додавання декількох Ес-областей. Зміни Ес також можуть приводити до зміни часу напівжиття антитіл у випадку терапевтичних антитіл, що дозволяє зменшувати частоту дозування й, таким чином, підвищувати зручність і скорочувати кількість використовуваного матеріалу. Див. Ргезіа, 2005, У. АПегду Сіїп. Іттипої. 116:731, 734-

З5.

В одному варіанті здійснення винаходу шарнірна область СНІ модифікована так, що число залишків цистеїну в шарнірній області збільшене або зменшене. Такий підхід докладно описаний у патенті США Мо 5677425. Число залишків цистеїну в шарнірній області СНІ1 змінюють, наприклад, для полегшення складання легкого і важкого ланцюгів або для збільшення або зменшення стабільності антитіла.

В іншому варіанті здійснення антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом (наприклад, КВ1) модифікують для збільшення його біологічного часу напівжиття. Можливі різні підходи. Наприклад, можна вносити одну з наступних мутацій: Т252І, Т2545, Т256Е, як описано в патенті США Мо 6277375. Альтернативно, для збільшення біологічного часу напівжиття антитіло може бути змінене в СНІ1- або Сі -області для вміщення епітопа, що зв'язує рецептор реутилізації, узятого із двох петель СН2-домену Ес-області (дО, як описано в патентах США

МоМо 5869046 і 6121022. В одному варіанті здійснення вводять мутацію М252у/52541/1256Е (УТЕ). Див., наприклад, Одапезуап еї аї., Мої. Ітптипої. 2009, 46:1750.

В інших варіантах здійснення Ес-область змінюють шляхом заміни щонайменше одного амінокислотного залишку іншим амінокислотним залишком для зміни ефекторної функцій) антитіла або антигензв'язувального фрагмента. Наприклад, одну або більше амінокислот, вибраних з амінокислотних залишків 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 і 322, можна заміняти іншим амінокислотним залишком таким чином, що змінюється афінність антитіла для ефекторного ліганду і зберігається антигензв'язувальна здатність вихідного антитіла.

Ефекторний ліганд, афінність до якого змінюється, може являти собою, наприклад, Ес-рецептор або компонент С1 комплементу. Такий підхід описаний більш докладно в патентах США МоМо

Зо 5624821 і 5648260.

В іншому прикладі одна або більше амінокислот, вибраних з амінокислотних залишків 329, 331 і 322, можуть бути замінені іншим амінокислотним залишком таким чином, що змінюється зв'язування антитіла з Сід і/або зменшується або усувається комплементзалежна цитотоксичність (СОС). Такий підхід описаний більш докладно в патенті США Мо 6194551.

В іншому прикладі один або більше амінокислотних залишків в амінокислотних положеннях 231 і 239 змінюють, щоб таким чином змінити здатність антитіла фіксувати комплемент. Такий підхід більш докладно описаний у публікації міжнародної патентної заявки Мо УМО 94/29351.

В іншому прикладі Ес-область модифікують для зменшення здатності антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, за винаходом (наприклад, КВ1) опосередковувати антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС) і/або для зменшення афінності антитіла, або фрагмента, для Есу-рецептора за рахунок зміни однієї або більше амінокислот у наступних положеннях: 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 або 439. Даний підхід більш докладно описаний у публікації міжнародної патентної заявки Мо МУУО 00/42072. Крім того, сайти зв'язування на дс1 людини для ЕсукКіІ, ЕсСуКіІ, ЕСуКП ї РсКп були картовані, і були описані варіанти, які відрізняються більш сильним зв'язуванням (див. опієїа5 еї аї. (2001), 9. ВіоІ. Спет. 276:6591-6604).

В одному варіанті здійснення винаходу Ес-область модифікують для зменшення здатності антитіла за винаходом (наприклад, КВІ) опосередковувати ефекторну функцію і/або для посилення протизапальних властивостей за рахунок модифікації залишків 243 і 264. В одному варіанті здійснення Ес-область антитіла або фрагмента модифікують шляхом зміни залишків у положеннях 243 і 264 на аланін. В одному варіанті здійснення Ес-область модифікують для зменшення здатності антитіла або фрагмента опосередковувати ефекторну функцію і/або для посилення протизапальних властивостей за рахунок модифікації залишків 243, 264, 267 і 328.

Посилення ефекторної функції

У деяких варіантах здійснення Ес-область анти-лРСВ антитіла модифікують для збільшення здатності антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, опосередковувати ефекторну бо функцію і/або для посилення його зв'язування з Есу-рецепторами (ЕсСуК).

Використовуваний у даному описі термін "ефекторна функція" стосується одного або більше із: антитілозалежної клітинно-опосередкованої цитотоксичної активності (АОС), комплементопосередкованої цитотоксичної активності (СОС), Ес-опосередкованого фагоцитозу або антитілозалежного клітинного фагоцитозу (АОСР), а також рециркуляції антитіла через

ЕсАп-рецептор.

Вважається, що взаємодія між константною областю антигензв'язувального білка і різними

Ес-рецепторами (ЕсСК), включаючи ЕсукіІ (СО64), Есукі! (2032) і ЕсуКІ (СО16), опосередковує ефекторні функції, такі як АДСС ії СОС, антигензв'язувального білка. Ес-рецептор також важливий для перехресного зв'язування антитіла, що може бути важливо для протипухлинного імунітету.

Ефекторну функцію можна вимірювати різними способами, у тому числі, наприклад, за допомогою зв'язування ЕсуНІІІ із клітинами-природними кілерами або за допомогою зв'язування

ЕсСуУКІ з моноцитами/макрофагами для вимірювання ефекторної функції АОСС. Наприклад, антигензв'язувальний білок за даним винаходом можна оцінювати на ефекторну функцію АЮСС в аналізі із клітинами-природними кілерами. Приклади таких аналізів можна знайти в публікаціях зЗпівєїа5 єї аї., 2001, 9. Віої. Спет., Мої. 276, р. 6591-6604; Спарреї еї аї., 1993, 9. Віої. Спет. 268:25124-25131; І алаг єї а!., 2006, Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 103:4005-4010.

Властивості АОСС або СОС антитіл за даним винаходом, або їх здатність до перехресного зв'язування, можна підвищувати різними способами.

Показано, що константні області 91 людини, що мають певні мутації або змінене глікозилування на залишку Авбп297, відрізняються більш сильним зв'язуванням 3 Ес- рецепторами. Також показано, що в деяких випадках дані мутації приводять до посилення

АрсСеС і СОС (І агаг еї аї., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 2006, 103:4005-4010; ЗПпівїа5 єї аї., У. Віо!.

Спет. 2001, 276:6591-6604; МеспапзкКу еї а!., Мої. Іттипої!., 2007, 44:1815-1817).

В одному варіанті здійснення даного винаходу такі мутації мають місце в одному або більше із положень, вибраних з 239, 332 і 330 (901), або в еквівалентних положеннях в дО інших ізотипів. Прикладами відповідних мутацій є 52390, ІЗ32Е і АЗЗОЇ.. В одному варіанті здійснення антигензв'язувальний білок за винаходом, описаний у даному документі, має мутації в положеннях 239 і 332, наприклад 52390 і І332Е, або в наступному варіанті здійснення має

Зо мутації в трьох або більше положеннях, вибраних з 239, 332 і 330, наприклад 52390, 1332Е і

АЗЗОЇ. (Нумерація по ЕО-індексу).

В альтернативному варіанті здійснення даного винаходу запропоноване антитіло, що містить константну область важкого ланцюга зі зміненим профілем глікозилування, у результаті чого антигензв'язувальний білок має посилену ефекторну функцію. Наприклад, при цьому антитіло має посилену АЮОСС або посилену СОС, або при цьому воно має обидві посилені ефекторні функції, як АОСС, так і СОС. Приклади відповідних методологій для одержання антигензв'язувальних білків зі зміненим профілем глікозилування описані в публікаціях міжнародних патентних заявок МоМо ММО 2003011878 ії УМО 2006014679 і Європейській патентній заявці Мо ЕР 1229125.

У наступному аспекті даний винахід стосується "нефукозилованих" або "афукозилованих" антитіл. Нефукозиловані антитіла містять в Ес-області структуру триманозного ядра М-гліканів складного типу без залишків фукози. Такі антитіла з модифікованим патерном глікозилування, позбавлені залишку фукози в ядрі М-гліканів Ес-області, можуть проявляти більш сильну АОСС, ніж фукозиловані аналоги, через посилення здатності до зв'язування ЕсукПа.

Даний винахід також стосується способу одержання антитіла за винаходом, який включає етапи: а) культивування рекомбінантної клітини-хазяїна, яка містить експресійний вектор, що містить виділену нуклеїнову кислоту, описану у даному документі, при цьому рекомбінантна клітина-хазяїн не містить альфа-1,6-фукозилтрансферазу; і 5) витягання антигензв'язувального білка. Рекомбінантна клітина-хазяїн може початково не містити ген, кодуючий альфа-1,6- фукозилтрансферазу (наприклад, дріжджові клітини-хазяїни, такі як Ріспіа 5р.), або може бути генетично модифікована для інактивації гена альфа-1,6-фукозилтрансферази. Рекомбінантні клітини-хазяїни, генетично модифіковані для інактивації гена РОТ8, кодуючого альфа-1,6- фукозилтрансферазу, доступні. Див., наприклад, технологічну систему РОТЕ ГІСЕМТМ, що постачається компанією ВіоУма, Іпс. (Ргіпсеїоп, М.).), у якій клітини СНОКІ15МУ, позбавлені функціональної копії гена РОТ8, продукують моноклональні антитіла, що мають підвищену антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичну (АОСС) активність, яка збільшена відносно активності ідентичного моноклонального антитіла, продукованого в клітині з функціональним геном ЕШТ8. Аспекти технологічної системи РОТЕГ ГІСЕМТ"М описані в патентах США МоМо 7214775, 6946292 і міжнародних патентних заявках МоМо УМО 0061739 і УМО 60 0231240. Фахівцям у даній галузі відомі і інші відповідні системи.

Фахівці в даній галузі розуміють, що такі модифікації можуть бути використані не тільки окремо, але можуть бути використані і у комбінації з будь-якими іншими модифікаціями для додаткового посилення ефекторної функції.

Одержання антитіл з модифікованим глікозилуванням

В іншому варіанті здійснення антитіла, або антигензв'язувальні фрагменти, за винаходом (наприклад, КВІТ) мають конкретний патерн глікозилування. Наприклад, може бути одержане афукозиловане або аглікозиловане антитіло, або фрагмент (тобто антитіло, позбавлене фукози або глікозилування, відповідно). Патерн глікозилування антитіла, або фрагмента, може бути змінений, наприклад, для підвищення афінності або авідності антитіла, або фрагмента, відносно антигену Е-білка лРСВ. Такі модифікації можна здійснювати, наприклад, шляхом зміни одного або більше сайтів глікозилування в послідовності антитіла, або фрагмента. Наприклад, можна здійснювати одну або більше амінокислотних замін, які приводять до видалення одного або більше сайтів глікозилування каркаса варіабельної області, щоб усунути глікозилування в цьому сайті. Таке аглікозилування може приводити до підвищення афінності або авідності антитіла, або фрагмента, для антигену. Див., наприклад, патенти США МоМо 5714350 і 6350861.

Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВІ), можуть також включати ті, які одержані в клітинах-хазяїнах нижчих еукаріот, зокрема клітинах-хазяїнах грибів, таких як дріжджі і нитчасті гриби, які були генетично модифіковані для продукування глікопротеїнів, що мають патерни глікозилування, характерні для ссавців або людини (див., наприклад, Спої еї аї. (2003), Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА, 100:5022-5027; Натійоп еї аї. (2003),

Зсіепсе, 301:1244-1246; Натіїюп еї аї. (2006), бсіеєпсе, 313:1441-1443; Мей еї аї. (2011), Увєаві, 28(3):237-52; Натійоп єї аї. (2007), Сип Оріп Віоїесйпої. Осі; 18(5):387-92). Ці генетично модифіковані клітини-хазяїни мають здатність контролювати профіль глікозилування глікопротеїнів, які продукуються в клітинах, у результаті чого можуть бути одержані композиції глікопротеїнів, у яких переважає конкретна структура М-гліканів (див., наприклад, патент США

Мо 7029872 і патент США Мо 7449308). Такі генетично модифіковані клітини-хазяїни були використані для продукування антитіл, у яких переважають конкретні структури М-гліканів (див., наприклад, Гі еї а. (2006), Маї. Віотесппої. 24:210-215).

У конкретних варіантах здійснення антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВІТ), додатково включають ті, які одержані в клітинах-хазяїнах нижчих еукаріот і які містять фукозиловані і нефукозиловані гібридні і складні М-глікани, у тому числі бісектні і поліантенні різновиди, включаючи, але без обмеження, такі М-глікани як СІСМАсі1- з МапзаісМАсг; Са -обІсМАси-оМапзасМАсг; МАМА -обацЦі-ой1ІсМАси-оМапзаіІсМАс».

У конкретних варіантах здійснення антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, запропоновані в даному описі (наприклад, КВ), можуть включати антитіла, або фрагменти, що мають щонайменше один гібридний М-глікан, вибраний із групи, що складається з сісМАсМапьсісМАсг; СаісісМАсМапосісМАс» і МАМАСаїЇсісСМАсМапьсісМАсг. У конкретних аспектах гібридний М-глікан є переважним видом М-гліканів у композиції.

У конкретних варіантах здійснення антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, запропоновані в даному описі (наприклад, КВІ), включають антитіла і фрагменти, що мають щонайменше один складний М-глікан, вибраний із групи, що складається з СІСМАсМапзасМАсе;

СаідісМАсМапзаісМАс»; МАМАСзаісМАсМапзаісМАсе; СісСМАсгМапзасМАсг;

СаідісМАсгМапзаісМАсе; СагСісМАс»МапзаісМАс»; МАМАСсіа»гСісМАс»гМапзасІсМАсг і

МАМА»СтіаігаісСМАсаМапзасМАс». У конкретних аспектах складний М-глікан є переважним видом

М-гліканів у композиції. У наступних аспектах складний М-глікан являє собою певний вид М- глікану, що становить приблизно 30 95, 40 95, 50 Зо, 60 Ус, 70 95, 80 Ус, 90 У, 95 о, 97 Ус, 98 Об, 99 95 або 100 95 від складних М-гліканів у композиції. В одному варіанті здійснення антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, запропоновані в даному описі, містять складні М-глікани, при цьому щонайменше 50 9», 60 90, 70 95, 80 90, 90 Фо, 95 95, 97 9Уо, 98 95, 99 95 або 100 95 складних

М-гліканів містять структуру МАМА»Сар?гсісМАс»аМапзсаісМАсг, причому така структура є афукозилованою. Такі структури можуть бути одержані, наприклад, у рекомбінантних клітинах- хазяїнах Ріспіа равіогів.

У конкретних варіантах здійснення М-глікан є фукозилованим. Як правило, фукоза знаходиться у а1,3-зв'язку з СІСМАс на відновлювальному кінці М-глікану, «1,6-зв'язку з СІСМАсС на відновлювальному кінці М-глікану, а1,2-зв'язку з Са! на невідновлювальному кінці М-глікану, а1,3-связку з СІСМАс на невідновлювальному кінці М-глікану або са1,4-связку з СІСМАс на невідновлювальному кінці М-глікану.

Таким чином, у конкретних аспектах вищевказаних композицій глікопротеїнів глікоформа включає а1,3-зв'язану або а1,6-зв'язану фукозу, з утворенням глікоформи, вибраної із групи, що 60 складається З МапоасісМАсг(Рис), сісмМАсМапьсїіІсМАса(Рис), МапзасиеМАсг(Рис),

сісМАсМапзаісМАсг(Рис), сісМАсгМапзаїсМАса(Рис), СаідісМАс»аМапзаісМАса(РЕис),

СаігСісМАс»МапзаісМАс»(Еис), МАМАСтіага|сМАс»МапзаісМАсг(Еис) і

МАМА»СтіагасМАс»МапзасМАсг(Бис); са1,3-зв'язану або с1,4-зв'язану фукозу, з утворенням глікоформи, вибраної із групи, що складається з /СІСсСМАс(Рис)Мапо5асіІсМАсг, аісМАс(Рис)МапзаісМАс», сісМАса(Рисі-2)МапзаісМАсе, СаійісМАсг(Рисі-2)МапзасМАсе,

СаігсісМАсг(Рис11-2)МапзаісМАсе, МАМАСІаігаІсМАсг(Рисі-2г)МапзаІсМАсе» і

МАМА»СтавгсісМАсг(Рисі-2)МапзіісМАсг; або а1,2-зв'язану фукозу, з утворенням глікоформи, вибраної із групи, що складається з Са(«Рис)сІісСМАсоаМапзсісМАсг, / СаїЇг(Еисз- 2)сІсМАсгМапзасМАс, МАМАСаї»г«(Рис:і-2)сІсСМАсгаМапзасМАсг2 і МАМА»Саїг(Рисзі- 2)2ІсСМАсоМапзаісМАс».

У наступних аспектах антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, містять високоманозні

М-глікани, включаючи, але без обмеження, МапвсісМАс», Мап;СісМАсг, МапесісМАсг,

МапвасісМАс», МапасісМАсг, або М-глікани, що складаються з М-гліканової структури

МапзаісМАс».

У наступних аспектах вищеописані складні М-глікани додатково включають фукозиловані і нефукозиловані бісектні і поліантенні різновиди.

У даному описі терміни "М-глікан"' ії "глікоформа" використовуються взаємозамінно і стосуються М-зв'язаного олігосахариду, наприклад, приєднаного за допомогою аспарагін-М- ацетилглюкозамінового зв'язку до залишку аспарагіну поліпептиду. М-зв'язані глікопротеїни містять залишок М-ацетилглюкозаміну, зв'язаний з атомом азоту амідної групи залишку аспарагіну в білку. Переважними цукрами на глікопротеїнах є глюкоза, галактоза, маноза, фукоза, М-ацетилгалактозамін (саіМАс), М-ацетилглюкозамін ((СІСМАс) і сіалова кислота (наприклад, М-ацетилнейрамінова кислота (МАМА)). Процесинг цукрових груп відбувається котрансляційно в просвіті ЕР і продовжується посттрансляційно в апараті Гольджі у випадку М- зв'язаних глікопротеїнів.

М-глікани мають загальне пентасахаридне ядро з МапзасІсМАсг ("Мап" означає манозу; "Сіс" означає глюкозу і "МАс" означає М-ацетил; СІСМАс означає М-ацетилглюкозамін). Як правило, М- гліканові структури представляють з невідновлювальним кінцем зліва і відновлювальним кінцем справа. Відновлювальний кінець М-глікану являє собою кінець, який приєднаний до залишку

Зо Азп, що входить у сайт глікозилування на білку. М-глікани відрізняються залежно від числа гілок (антен), що містять периферичні цукри (наприклад, СІСМАс, галактозу, фукозу і сіалову кислоту), які доповнюють структуру ядра з МапзаїсМАсг ("Мап3"), також називану ""триманозним ядром", "пентасахаридним ядром" або "пауциманозним ядром". М-глікани класифікують по їх розгалужених компонентах (наприклад, високоманозні, складні або гібридні). М-глікан "високоманозного" типу має п'ять або більше залишків манози. М-глікан "складного" типу, як правило, має щонайменше один сіІсСМАс, приєднаний до 1,3-манозного плеча, і щонайменше один СІСМАс, приєднаний до 1,6-манозного плеча "триманозного" ядра. Складні М-глікани також можуть містити залишки галактози ("Са") або М-ацетилгалактозаміну ("ЗаїЇМАс"), які, необов'язково, модифіковані сіаловою кислотою або похідними (наприклад, "МАМА" або "МецАс", де "Меи" означає нейрамінову кислоту і "Ас" означає ацетил). Складні М-глікани також можуть мати внутрішньоланцюжкові заміни, що включають "бісектний" сІСМАс і фукозу ядра

СРис"). Складні М-глікани також можуть мати декілька антен на "т"триманозному ядрі", їх часто називають "поліантенні глікани". "Гібридний" М-глікан містить щонайменше один сіІсСМАс на кінці 1,3-манозного плеча триманозного ядра і нуль або більше залишків манози на 1,6-манозному плечі триманозного ядра. Різні М-глікани також називають "глікоформами".

Застосовно до складних М-гліканів терміни "5-2", "(-1", "050", "51", "052", "АТ" ії "А?" означають наступне. "5-2" означає М-гліканову структуру, яка може бути охарактеризована як

МапзаїісМАс»г; термін "5-1" означає М-гліканову структуру, яка може бути охарактеризована як сісСМАсМапзсісМАсг; термін "50" означає М-гліканову структуру, яка може бути охарактеризована як СІСМАсаМапзаіІсМАсг; термін "1" означає М-гліканову структуру, яка може бути охарактеризована як саібісМАс»2МапзаісМАс»; термін "52" означає М-гліканову структуру, яка може бути охарактеризована як сЗаіїгсісМАс»аМапзаісМАсг; термін "АТ" означає М-гліканову структуру, яка може бути охарактеризована як МАМАсСа!|«-СісМАс»аМапзаісМАс»2г; і термін "Аг" означає М-гліканову структуру, яка може бути охарактеризована як

МАМА»СіаігсІсСМАсгМапзаІсМАсг2. Якщо немає інших вказівок, терміни "5-2", "(3-17 "0", "17, "52", "АТ" ії "А?" означають види М-гліканів, які позбавлені залишків фукози, приєднаних до залишку СІСМАс на відновлювальному кінці М-глікану. Якщо термін включає "Е", то "Е" указує на те, що вид М-глікану містить залишок фукози на залишку СІСМАс на відновлювальному кінці М- глікану. Наприклад, усі з позначень ОБ, СТЕ, с2Е, АТЕ і А2Е указують на те, що М-глікан 60 додатково містить залишок фукози, приєднаний до залишку СІСМАс на відновлювальному кінці

М-глікану. Нижчі еукаріоти, такі як дріжджі і нитчасті гриби, звичайно не продукуються М-глікани, що містять фукозу.

У випадку поліантенних М-гліканів термін "поліантенний М-глікан" означає М-глікани, які додатково містять залишок СІСМАс на залишку манози, що входить у невідновлювальний кінець 1,6-плеча або 1,3-плеча М-глікану, або залишок СІСМАс на кожному із залишків манози, що входять у невідновлювальний кінець 1,6-плеча або 1,3-плеча М-глікану. Таким чином, поліантенні М-глікани можуть мати формули сСІСМАсог-оМапзасІсМАс2, Сац-оС1ІсМАсі(»- зМапзаісМАсг або МАМА(1-обаЦі-заІсМАсо-оМапзаісМАс». Термін "1-4" означає 1, 2, З або 4 залишки.

У випадку бісектних М-гліканів термін "бісектний М-глікан" означає М-глікани, у яких залишок

СІСМАс зв'язаний з залишком манози на відновлювальному кінці М-глікану. Бісектний М-глікан може мати формулу сСІсСМАсзМапзсісМАсг, де кожний залишок манози зв'язаний на невідновлювальному кінці з залишком (ІСМАс. Навпаки, якщо поліантенний М-глікан має формулу СІСМАсзМапзасісМАсг, формула вказує на те, що два залишки СІСМАс зв'язані з залишком манози на невідновлювальному кінці одного з двох плечей М-гліканів і один залишок

СІСМАс зв'язаний з залишком манози на невідновлювальному кінці другого плеча М-глікану.

Фізичні властивості антитіл

Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВ), можуть додатково містити один або більше сайтів глікозилування у варіабельній області або легкого, або важкого ланцюга імуноглобуліну. Деякі сайти глікозилування можуть приводити до зниження імуногенності антитіла, або фрагмента, або зміни рК антитіла внаслідок зміни зв'язування антигену (МагзпПаї! еї аї!., 1972, Аппи. Веу. Віоспет. 41:673-702; Саїа апа Могтізоп, 2004, У. Іттипої. 172:5489-94; УаїїсК еї а!., 1988, У. Ехр. Мед. 168:1099-109; бріюо, 2002,

Спіусобріоіоду, 12:438-568; Рагекн єї аї., 1985, Маїиге, 316:452-7; Мітига еї а!., 2000, Мої. ІттипоЇ. 37:697-706). Відомо, що глікозилування має місце на фрагментах, що містять послідовність М-Х- 5/7.

Кожне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент (наприклад, КВІ1) буде мати унікальну ізоелектричну точку (рі), яка, як правило, входить в діапазон рнН від 6 до 9,5. Значення рі для

ІДО1 антитіла, як правило, входить в діапазон рН 7-9,5 і значення рі для Ідс4 антитіла, як правило, входить в діапазон рН 6-8.

Кожне антитіло або антигензв'язувальний фрагмент (наприклад, КВІТ) буде мати характерну температуру плавлення, при цьому більш висока температура плавлення свідчить про більш високу загальну стабільність іп мімо (Кгізппатипну А. апа Маппіпд М.С. (2002), Си. РНагт.

ВіоїесНнпої. 3:361-71). Як правило, Тмі (температура початкового розгортання) може бути більше 60 "С, більше 65 "С або більше 70 "С. Температуру плавлення антитіла або фрагмента можна вимірювати методом диференціальної скануючої калориметрії (Спеп еї аї. (2003), Рпапт. Нев. 20:1952-60; СПпіпапао еї аї. (1999), Іттипої. І ей. 68:47-52) або кругового дихроїзму (Миггау еї аї. (2002), 9. Спготацоаг. сі. 40:343-9).

У наступному варіанті здійснення вибирають антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти (наприклад, КВІТ), які не розпадаються швидко. Розпад антитіла, або фрагмента, можна вимірювати методом капілярного електрофорезу (КЕ) і МАЛДІ-МС (АІехапаег А.3. апа Нидпез

О.Е. (1995), Апаї. Снет. 67:3626-32).

У наступному варіанті здійснення вибирають антитіла (наприклад, КВІ) і їх антигензв'язувальні фрагменти, що мають мінімальні ефекти агрегації, яка може приводити до ініціації небажаної імунної відповіді або змінених або несприятливих фармакокінетичних властивостей. Як правило, прийнятними є антитіла і фрагменти з агрегацією 25 95 або менше, 2095 або менше, 15 95 або менше, 10 956 або менше або 5 95 або менше. Агрегацію можна визначати декількома методами, включаючи ексклюзійну хроматографію (ЕХ) на колонці, високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) і розсіювання світла.

Кон'югати антитіл

Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти до Е-білка лРСВ, розкриті в даному описі (наприклад, КВІ), також можуть бути кон'юговані з хімічним фрагментом. Хімічний фрагмент може являти собою, зокрема, полімер, радіоактивний ізотоп або цитотоксичний фактор. У конкретних варіантах здійснення хімічний фрагмент являє собою полімер, який збільшує час напівжиття антитіла або фрагмента в організмі пацієнта. Придатні полімери включають, без обмеження, гідрофільні полімери, які включають, але не обмежуються ними, полієтиленгліколь (ПЕГ) (наприклад, ПЕГ з молекулярною масою 2 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 12 кДа, 20 кДа, 30 кДа або 40 кДа), декстран і монометоксиполієтиленгліколь (мПЕГ). У публікації І ее еї аї. (1999) (Віосопі.

Спет. 10:973-981) описані кон'юговані з ПЕГ одноланцюжкові антитіла. У публікації Умеп еї аї. бо (2001) (Віосопі). Спет. 12:545-553) описана кон'югація антитіл з ПЕГ, який зв'язаний з хелатором радіоактивних металів (діетилентриамінпентаоцтовою кислотою (ДТПК)).

Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВ), також можуть бути кон'юговані з мітками, такими як Тс, зом, пн, З2р, 140, 125|, ЗН, 1911, 710, 50, 1ЗМ, 18Е, 355, 510, 57То, 226Да, 60(о, 59Ев, 5756, 1522, 67, 21761, 211 Ді, ггрр, 1756, 109ру, 234ТН і Кк, 157 (за, Мп, 22Тг і 56Ев.

Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВІ), також можуть бути пегильовані, наприклад, для збільшення їх біологічного часу напівжиття (наприклад, у сироватці). Для пегилювання антитіла, або фрагмента, як правило, проводять реакцію антитіла, або фрагмента, з реакційноздатною формою поліетиленгліколю (ПЕГ), такою як реакційноздатне складноефірне або альдегідне похідне ПЕГ, в умовах, у яких одна або більше груп ПЕГ приєднуються до антитіла, або фрагмента антитіла. У конкретних варіантах здійснення пегилювання здійснюють шляхом реакції адилювання або реакції алкілування з реакційноздатною молекулою ПЕГ (або аналогічним реакційноздатним водорозчинним полімером). Використовуваний у даному описі термін "поліетиленгліколь" охоплює будь-які форми ПЕГ, які використовують для дериватизації інших білків, наприклад моно(С1-Сто)алкокси- або арилоксиполіетиленгліколь або поліеєтиленглікольмалеіїмід. У конкретних варіантах здійснення антитіло, або фрагмент, яке пегилюють, являє собою аглікозиловане антитіло, або фрагмент. Методи пегилювання білків відомі в даній галузі і можуть бути застосовані до антитіл за винаходом. Див., наприклад, Європейські патентні заявки МоМо ЕР 0 154 31611ЕР 0 401 384.

Антитіла і антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВІ), також можуть бути кон'юговані з флуоресцентними або хемілюмінесцентними мітками, включаючи флуорофори, наприклад хелати рідкісноземельних елементів, флуоресцеїн і його похідні, родамін і його похідні, ізотіоціанат, фікоеритрин, фікоціанін, алофікоціанін, о-фталевий альдегід, флуорескамін, 7-Еи, дансил, умбеліферон, люциферин, люмінальні мітки, ізолюмінальні мітки, мітки у вигляді ароматичного складного ефіру акридинію, імідазольні мітки, мітки у вигляді солі акридинію, оксалатні складноефірні мітки, екворинові мітки, 2,3-дигідрофталазиндіони, біотин/авідин, спінові мітки і стабільні вільні радикали.

Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти за винаходом (наприклад, КВ1) також можуть бути кон'юговані із цитотоксичним фактором, таким як дифтерійний токсин, А-ланцюг

Зо екзотоксину Рзхейдотопах аегидіпоза, А-ланцюг рицину, А-ланцюг абрину, А-ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки і сполуки (наприклад, жирні кислоти) Аїепгігез Тогаїї, діантинові білки, білки

РАРІ, РАРІЇ ії РАР-5 РПуйоїіасса атегісапа, інгібітор з Мотогаїса спагапійа, курцин, кротин, інгібітор з Заропагіа ойісіпаїї5, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин і еноміцин.

Можна використовувати будь-який метод, відомий у даній галузі, для кон'югації антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів за винаходом (наприклад, КВІ) з різними фрагментами, включаючи методи, описані в публікаціях Нипіег еї аї., 1962, Маїшиге, 144:945; рамуїа еї аї., 1974,

Віоспетівігу, 13:1014; Раїп еї аї!., 1981, 9. Іпттипої. Мей. 40:219, і Мудгеп, 1982, Нізоспет. апа

Суюспет. 30:407. Методи кон'югації антитіл і фрагментів є звичайними і дуже добре відомі в даній галузі.

Профілактичне і терапевтичне застосування анти-лРСВ антитіл

Також запропоновані способи запобігання, лікування або ослаблення симптому РСВ- інфекції у пацієнтів, включаючи пацієнтів-людей, які потребують такого запобігання, лікування або ослаблення, з використанням виділених антитіл, або їх антигензв'язувальних Фрагментів, розкритих у даному описі (наприклад, КВ1). В одному варіанті здійснення винаходу такий пацієнт страждає від РСВ-інфекції. В одному варіанті здійснення винаходу такий пацієнт має ризик виникнення РСВ-інфекції.

У конкретному варіанті здійснення ссавцю, переважно людині, вводять профілактичну, терапевтичну або фармацевтичну композицію, яка містить одне або більше антитіл, або їх фрагментів, за даним винаходом для лікування, запобігання або ослаблення одного або більше симптомів, пов'язаних із РСВ-інфекцією, у кількості, ефективній для зниження титрів РСВ.

Відповідно до такого варіанта здійснення ефективна кількість антитіл, або фрагментів антитіл, приводить до зниження титрів РСВ у легенях, що визначають, наприклад, по концентрації РСВ у зразках мокротиння або в змивах з легенів ссавця. В іншому варіанті здійснення ссавцю, переважно людині, вводять профілактичну, терапевтичну або фармацевтичну композицію, яка містить одне або більше антитіл, або їх фрагментів, за даним винаходом для лікування, запобігання або ослаблення симптомів, пов'язаних із РСВ-інфекцією, у кількості, ефективній для нейтралізації РСВ і/або для блокування РСВ-інфекції у ссавця.

Моноклональні антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, також можуть бути використані як імунотерапія для захворювань, що викликаються РСВ, як у людей, так і у інших бо тварин. Термін "імунотерапевтично" або "імунотерапія", використовуваний в даному описі у зв'язку з моноклональними антитілами, або їх антигензв'язувальними фрагментами за винаходом, означає профілактичне і терапевтичне введення, пасивну імунізацію значною мірою очищеними поліпептидними продуктами, а також генну терапію шляхом перенесення полінуклеотидних послідовностей, кодуючих продукт або його частину. Пасивна імунізація включає перенесення активного гуморального імунітету або введення антитіл пацієнту, який потребує цього. Відповідно, у конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується способів перенесення активного гуморального імунітету і способів введення анти-РСВ антитіл, або їх антигензв'язувальних фрагментів, наприклад ІдсС антитіл, пацієнту, що має ризик виникнення РСВ-їінфекції. Таким чином, моноклональні антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, можна вводити пацієнтам, що мають високий ступінь ризику, для зменшення ймовірності і/або ступеня тяжкості захворювання, що викликається РСВ, або вводити пацієнтам, що вже мають ознаки активної РСВ-інфекції.

Даний винахід також стосується способу модулювання або лікування щонайменше одного пов'язаного із РСВ захворювання у дорослих або дітей, у клітині, тканині, органі, у тварини або пацієнта, включаючи, але без обмеження, інфекції нижніх дихальних шляхів, пневмонію, трахеобронхіт, бронхіоліт, бронхіт, а також будь-які пов'язані інфекції або запальні захворювання, наприклад, але без обмеження, щонайменше одне із захворювань, або щонайменше одне запалення, пов'язане із захворюваннями, такими як синдром системної запальної відповіді септичний синдром, грампозитивний сепсис, грамнегативний сепсис, культурально-негативний сепсис, грибковий сепсис, нейтропенічна пропасниця, уросепсис, менінгококемія, респіраторний дистрес-синдром дорослих, алергічний риніт, цілорічний риніт, астма, системна анафілаксія, реакції рецепторної гіперчутливості, хронічне обструктивне захворювання легенів (ХОЗЛ), пневмонія гіперчутливості, гранульоми через внутрішньоклітинні мікроорганізми, чутливість до медикаментів, кахексія, кістозний фіброз, неонатальна хронічна хвороба легенів; щонайменше одне інфекційне захворювання в клітині, тканині, органі, у тварини або пацієнта, включаючи, але без обмеження, щонайменше одне з: гострої або хронічної бактеріальної інфекції, гострих і хронічних паразитарних або інфекційних процесів, включаючи бактеріальні, вірусні і грибкові інфекції, ВІЛ-інфекції, ВІЛ-невропатії, менінгіту, гепатиту (А, В або С, або тому подібного), септичного артриту, перитоніту, пневмонії, епіглотиту,

Зо Е. соїї 0157:17, гемолітико-уремічного синдрому, тромболітичної тромбоцитопенічної пурпури, малярії, геморагічної пропасниці денге, лейшманіозу, лепри, синдрому токсичного шоку, стрептококового міозиту, газової гангрени, мікобактеріального туберкульозу, інфекції МАЇ, пневмоцистної пневмонії, запального захворювання органів малого таза, орхіту, епідидиміту, легіонельозної пневмонії, хвороби Лайма, грипу А, вірусу Епштейна-Барр, гемофагоцитарного синдрому, що загрожує життю, енцефаліту, що загрожує життю, асептичного менінгіту і тому подібного. Такий спосіб може, необов'язково, включати введення ефективної кількості композиції або фармацевтичної композиції, яка містить щонайменше одне анти-РСВ антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, у клітину, тканину, орган, тварині або пацієнту, який потребує такої модуляції, лікування або терапії.

В одному варіанті здійснення профілактичні, терапевтичні або фармацевтичні композиції, які містять антитіла, або їх фрагменти, за винаходом, вводять ссавцю, переважно людині, для лікування, запобігання або ослаблення одного або більше симптомів, пов'язаних із РСВ- інфекцією. В іншому варіанті здійснення профілактичні, терапевтичні або фармацевтичні композиції, які містять антитіла, або їх фрагменти, за винаходом, вводять людині, що страждає кістозним фіброзом, бронхолегеневою дисплазією, уродженим захворюванням серця, уродженим імунодефіцитом або набутим імунодефіцитом, або людині, яка одержала трансплантат (наприклад, після трансплантації кісткового мозку, легені або трансплантації гемопоетичних стовбурних клітин (ТГСК)), для лікування, запобігання або ослаблення одного або більше симптомів, пов'язаних з РСВ-інфекцією.

В іншому варіанті здійснення профілактичні, терапевтичні або фармацевтичні композиції, які містять антитіла, або їх фрагменти, за винаходом, вводять дитині, переважно недоношеній дитині або дитині, що має ризик госпіталізації внаслідок РСВ-інфекції, для лікування, запобігання або ослаблення одного або більше симптомів, пов'язаних із РСВ-інфекцією. В іншому варіанті здійснення профілактичні, терапевтичні або фармацевтичні композиції, які містять антитіла, або їх фрагменти, за винаходом, вводять людям похилого віку або людям у місцях спільного проживання (наприклад, у будинках для людей похилого віку або реабілітаційних центрах), або людям з імунною недостатністю.

Переважно використовувати високоафінні і/або ефективні іп мімо інгібуючі антитіла і/або нейтралізуючі антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з бо антигеном РСВ, як для запобігання РСВ-інфекції, так і для лікування РСВ-інфекції. Також переважно використовувати полінуклеотиди, кодуючі високоафінні і/або ефективні іп мімо інгібуючі антитіла і/або нейтралізуючі антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з антигеном РСВ, як для запобігання РСВ-інфекції, так і для лікування

РСВ-інфекції. Такі антитіла, або їх фрагменти, переважно будуть мати афінність відносно Е- глікопротеїну і/або фрагментів Е-глікопротеїну РСВ.

Антитіла і функціональні еквіваленти (такі як їх антигензв'язувальні фрагменти) за даним винаходом упізнають епітоп у складі Е-білка РСВ. Антитіла, або їх функціональні еквіваленти, які специфічно упізнають зазначений епітоп, можна комбінувати із вже відомими РСОВ- специфічними антитілами, які зв'язуються з іншим епітопом, такими як палівізумаб, 025, АМ14,

АМ'16 і АМ23. При комбінуванні антитіла, або функціонального еквівалента, за винаходом, що специфічно упізнає зазначений епітоп, з відомим РСВ-специфічним антитілом, два або більше різних епітопів РСВ упізнаються в процесі однієї і тієї ж терапії. У цьому випадку може бути досягнута більш сильна імунна відповідь на РСВ і/або більш висока специфічність антитіл відносно РСВ. За рахунок більш сильної імунної відповіді і більш високої специфічності відносно

РСВ така комбінація може приводити до більш ефективного лікування і/або запобігання пов'язаного із РСВ захворювання.

Одне або більше антитіл за даним винаходом, або їх фрагментів, що специфічно зв'язуються з одним або більше антигенами РСВ, можна вводити в організм локально або системно як профілактику. Антитіла за даним винаходом, або їх фрагменти, також можна вигідно використовувати в комбінації з іншими моноклональними або химерними антитілами, або з лімфокінами або гемопоетичними факторами росту (такими як, наприклад, ІІ -2, ІІ -3, 1-7

І/-15), які, наприклад, служать для збільшення числа або активності ефекторних клітин, взаємодіючих з антитілами. Антитіла за даним винаходом, або їх фрагменти, також можна вигідно використовувати в комбінації з іншими моноклональними або химерними антитілами, або з лімфокінами або гемопоетичними факторами росту (такими як, наприклад, ЇЇ -2, ІІ -3 і 11 -7), які, наприклад, служать для посилення імунної відповіді. Антитіла за даним винаходом, або їх фрагменти, також можна вигідно використовувати в комбінації з одним або більше лікарськими засобами, використовуваними для лікування РСВ-інфекції, такими як, наприклад, противірусні засоби.

Зо Антитіла за винаходом, або фрагменти, можна використовувати в комбінації з одним або більше із перерахованих лікарських засобів: МІН-351 (Сетіпі ТесппоЇІодієв), рекомбінантна вакцина проти РСВ (Амігоп), РСВІГ-2 (Іпігасе!), Е-50042 (Рієїте ЕРабге), Т-786 (Тиітегів), МР-36676 (МігоРпагпта), АРІ-641 (Атегісап Ноте Ргодисів), МР-14637 (МіюРНапта), РЕР-1 ї РЕР-2 (Атегісап Ноте Ргодисів), вакцина проти РСВ (Амапі Іттипоїпегарешііс5) і Е-50077 (Рієїте

Еабгє).

Антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, за винаходом можна вводити окремо або в комбінації з іншими видами терапії (наприклад, гормональною терапією, імунотерапією і терапією протизапальними засобами). Як правило, переважним є введення продуктів, які походять з того ж біологічного виду або реакційноздатні (у випадку антитіл) відносно того ж біологічного виду, що і біологічний вид пацієнта. Таким чином, у переважному варіанті здійснення людські або гуманізовані антитіла, фрагменти, похідні, аналоги або нуклеїнові кислоти вводять пацієнту-людині для терапії або профілактики. "Пацієнт" може бути ссавцем, таким як людина, собака, кішка, кінь, корова, миша, щур, мавпа (наприклад, яванський макак, наприклад Масаса Газсісціагіє) або кролик. У переважних варіантах здійснення винаходу пацієнт є людиною.

У конкретних варіантах здійснення антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВІ), можуть бути використані окремо або в комбінації з противірусною терапією.

У конкретних варіантах здійснення антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВІ1), можуть бути використані окремо або в комбінації з іншими анти-РСВ моноклональними антитілами.

У конкретних варіантах здійснення антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВ1), можуть бути використані окремо або в комбінації з іншою анти-РСВ вакциною.

Вираз "у комбінації з" указує на те, що компоненти, які вводяться в способі за даним винаходом (наприклад, анти-лРСВ антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент (наприклад, КВ1) разом з, наприклад, палівізумабом), можуть бути сформульовані в одній композиції для одночасної доставки або сформульовані роздільно у двох або більше композиціях (наприклад, у наборі). Кожний компонент можна вводити пацієнту в інший час, ніж 60 час введення іншого компонента; наприклад, кожне введення можна виконувати не одночасно

Зо

(наприклад, роздільно або послідовно) з деякими інтервалами протягом конкретного періоду часу. Крім того, окремі компоненти можна вводити пацієнту одним і тим же або різними шляхами введення.

Експериментальні і діагностичні варіанти застосування

Антитіла до Е-білка лРСВ і їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВІ1), можна використовувати як афінні засоби для очищення. У даному способі антитіла до Е-білка лРСВ і їх антигензв'язувальні фрагменти іммобілізують на твердій фазі, такій як ЗерпадехФ, скло, агарозна смола або фільтрувальний папір, методами, добре відомими в даній галузі. Іммобілізоване антитіло, або фрагмент, контактує зі зразком, що містить Е-білок лРСВ (або його фрагмент), який потрібно буде очищати, потім підкладку промивають відповідним розчинником, який буде видаляти практично весь матеріал у зразку, за винятком Е-білка лРСВ, зв'язаного з іммобілізованим антитілом або фрагментом. На завершення, підкладку промивають розчинником, який елюює зв'язаний Е-білок лРСВ (наприклад, білком А). Такі іммобілізовані антитіла і фрагменти є частиною даного винаходу.

Запропоновані також антигени для одержання вторинних антитіл, корисних, наприклад, для проведення вестерн-блот-аналізів і інших імуноаналізів, описаних у даному документі. Зокрема, розкриті поліпептиди, які містять послідовності варіабельних областей і/або областей СО терапевтичного антитіла, описаного в даному документі (наприклад, КВІ1), які можуть бути використані для одержання антиідіотипічних антитіл, використовуваних для специфічного виявлення присутності антитіла, наприклад, у терапевтичному контексті.

Антитіла до Е-білка лРСВ і їх антигензв'язувальні фрагменти також можуть бути корисні в діагностичних аналізах на Е-білок лРСВ, наприклад для виявлення його експресії в певних клітинах, тканинах або сироватці. Такі діагностичні методи можуть бути корисні в діагностиці різних захворювань.

Даний винахід включає аналіз ЕГІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз), у якому використовують антитіло до Е-білка лРСВ, або його антигензв'язувальний фрагмент, розкрите в даному описі (наприклад, КВ).

Наприклад, такий спосіб включає наступні етапи: (а) покривання субстрату (наприклад, поверхні ямки планшета для мікротитрування, наприклад пластикового планшета) антитілом до Е-білка лРСВ, або його антигензв'язувальним фрагментом; (р) нанесення зразка, тестованого на присутність Е-білка РСВ, на субстрат; (с) промивання планшета, при цьому незв'язаний матеріал у зразку видаляється; (4) нанесення мічених детектованою міткою антитіл (наприклад, зв'язаних з ферментом антитіл), які також специфічні відносно антигену Е-білка РСВ; (є) промивання субстрату, при цьому незв'язані мічені антитіла видаляються; (Ї) якщо мічені антитіла зв'язані з ферментом, наносять хімічний реагент, який при взаємодії з ферментом генерує флуоресцентний сигнал; і (9) виявлення присутності міченого антитіла.

Виявлення мітки, зв'язаної із субстратом, указує на присутність Е-білка лРСВ.

У наступному варіанті здійснення мічене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, містить як мітку пероксидазу, яка взаємодіє з АВТЗ (наприклад, 2,2'-азинобіс(3- етилбензтіазолін-6-сульфоновою кислотою)) або 3,3',5,5'-т-етраметилбензидином, при цьому відбувається зміна забарвлення, що піддається виявленню. Альтернативно, мічене антитіло, або фрагмент, містить як мітку детектований радіоізотоп (наприклад, ЗН), який можна виявляти в сцинтиляційному лічильнику в присутності сцинтилятора.

Антитіло до БЕ-білка лРСВ, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом (наприклад, КВІТ) можна використовувати в методі вестерн-блотингу або імунного виявлення білка на блоті. Такий метод є частиною даного винаходу і включає, наприклад, наступні етапи. (1) Необов'язково, перенесення білків зі зразка, тестованого на присутність Е-білка лРСВ (наприклад, після електрофоретичного розділення білків зразка в ПААГ або 505-ПААГ),, на мембрану або інший твердий субстрат методом, відомим у даній галузі (наприклад, напівсухим блотингом або блотингом у резервуарі); створення контакту мембрани або іншого твердого субстрату, тестованого на присутність зв'язаного Е-білка лРСВ, або його фрагмента, з анти-

ЛРСВ антитілом, або його антигензв'язувальним фрагментом, за винаходом.

Така мембрана може являти собою нітроцелюлозну або вінілову (наприклад, з полівініліденфториду (ПВДФ)) мембрану, на яку були перенесені білки, тестовані на присутність

ЛРСВ, після неденатуруючого електрофорезу в ПААГ (електрофорезу в поліакриламідному гелі) або електрофорезу в 50О5-ПААГ (електрофорезу в поліакриламідному гелі з бо додецилсульфатом натрію) (наприклад, після електрофоретичного розділення в гелі). Перед контактуванням мембрани з анти-лРСВ антитілом, або фрагментом, мембрану, необов'язково, блокують, наприклад розчином знежиреного сухого молока або тому подібного, для блокування сайтів неспецифічного зв'язування білків на мембрані. (2) Промивання мембрани один або більше разів для видалення незв'язаного антитіла, або фрагмента, до Е-білка лРСВ, а також інших незв'язаних речовин. (3) Виявлення зв'язаного антитіла, або фрагмента, до Е-білка лРСВ.

Виявлення зв'язаного антитіла, або фрагмента, указує на те, що білок лРСОВ присутній на мембрані або субстраті і у зразку. Виявляти зв'язане антитіло, або фрагмент, можна шляхом зв'язування антитіла, або фрагмента, із вторинним антитілом (антитілом проти імуноглобулінів), міченим детектованою міткою, з наступним виявленням присутності вторинного антитіла.

Антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти до Е-білка лРСВ, розкриті в даному описі (наприклад, КВІ), також можна використовувати для імуногістохімічного аналізу. Такий спосіб є частиною даного винаходу і включає, наприклад: (1) створення контакту клітини, тестованої на присутність Е-білка лРСВ, з антитілом до Б- білка лРСВ, або його антигензв'язувальним фрагментом, за винаходом; і (2) виявлення антитіла або фрагмента на, або в, клітині.

Якщо антитіло, або фрагмент, саме мічене детектованою міткою, його можна виявляти безпосередньо. Альтернативно, антитіло, або фрагмент, може бути зв'язане міченим детектованою міткою вторинним антитілом, яке виявляють.

Фармацевтичні композиції і введення

Для одержання фармацевтичних або стерильних композицій антитіл і антигензв'язувальних фрагментів до Е-білюьа лРСВ за винаходом (наприклад, КВІ1) антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, змішують із фармацевтично прийнятним носієм або ексципієнтом. Див., наприклад, Кетіпдіоп'є РІаптасешіса! Зсіепсе5 і 0.5. РВПаптасореїа:

Маїйопа! Роптиїагу, Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Еазіоп, РА (1984).

Препарати терапевтичних і діагностичних засобів можна одержувати шляхом змішування з прийнятними носіями, ексципієнтами або стабілізаторами, наприклад, у формі ліофілізованих порошків, густих суспензій, водних розчинів або суспензій (див., наприклад, Нагатап еї аї. (2001), аоодтап апа Сіїтап'є Те Рпаптасоіодіса! Вазі5 ої Тнегарешісв, МесаСтгам/-НІЇЇ, Мем мок,

МУ; Сеппаго (2000), Ветіпдіоп: Те 5сієпсе апа Ргасіїсе ої Рпагтасу, Гірріпсой, М/Патв, апа

ММИКіп5, Мем Мо, ММ; Амі5 еї аїЇ. (єд5.) (1993), РпаптасешісаиІ Розаде Еоптв5: Рагепівгаї!

Меадісайоп5, Магсе! ЮОекКег, МУ; Перептап еї аї. (єдв5.) (1990), Рпаптасешіса! Розаде Еоптв:

Табієїв5, Магсеє! ОеккКег, МУ; Гіерегтап есеї аї. (едв5.) (1990), Рпаптасешііса! Созаде Еоптв: Оізрегзе

Зувівт5, Магсе! ЮОекКег, МУ; М/еїпег апа Коїков5Кіє (2000), Ехсірієпі Тохісйу апа Заїеїу, Магсеї реккКег, Іпс., Мем/у МогкК, МУ). В одному варіанті здійснення антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, за даним винаходом розводять до відповідної концентрації в 1-20 мм гістидиновому буфері, рН 5-7, і, необов'язково, додають Масі або сахарозу (наприклад, 2-15 95 (мас./об.)) для тонічності. Для підвищення стабільності можна додавати додаткові засоби, такі як полісорбат 20 або полісорбат 80, у концентрації 0,01-0,10 95 (мас./об.). Репрезентативний препарат містить 10

ММ І-гістидин, 7 95 (мас./об6.) сахарози і 0,02 95 (мас./о6.) полісорбату-80, рН 6,0.

Токсичність і терапевтичну ефективність антитіл, або їх антигензв'язувальних фрагментів, за винаходом, що вводяться окремо або в комбінації з іншим терапевтичним засобом, можна визначати стандартними фармацевтичними методами з використанням клітинних культур або експериментальних тварин, наприклад, для визначення іЮ»5о (дози, летальної для 50 95 популяції) ії ЕЮво (дози, терапевтично ефективної для 50 95 популяції). Відношення доз для токсичного і терапевтичного ефектів називають терапевтичним індексом (ГО50/ЕЮОзо). Дані, одержані із цих аналізів клітинних культур і досліджень на тваринах, можна використовувати для визначення діапазону доз, використовуваних для людини. Доза таких сполук переважно знаходиться у діапазоні циркулюючих концентрацій, які включають ЕЮО»5о з невеликою токсичністю або без неї. У цьому діапазоні дози можуть варіюватися залежно від використовуваної лікарської форми і шляху введення.

Спосіб введення може варіюватися. Шляхи введення включають пероральний, ректальний, трансмукозальний, кишковий, парентеральний; внутрішньом'язовий, підшкірний, внутрішньошкірний, інтрамедулярний, інтратекальний, прямий інтравентрикулярний, внутрішньовенний, внутрішньоочеревинний, інтраназальний, внутрішньоочний, інгаляцію, інсуфляцію, топічний, шкірний, черезшкірний або внутрішньоартеріальний. Переважними способами введення є внутрішньом'язовий, внутрішньовенний і інтраназальний.

У конкретних варіантах здійснення антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, до БЕ- білка лРСОВ за винаходом (наприклад, КВ1) можна вводити інвазивним шляхом, наприклад 60 ін'єкцією. У наступних варіантах здійснення винаходу антитіло до Е-більюа лРСВ, або його антигензв'язувальний фрагмент, або його фармацевтичну композицію вводять внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньом'язово, внутрішньоартеріально, усередину пухлини або шляхом інгаляції, аерозольної доставки. Введення неінвазивними шляхами (наприклад, перорально; наприклад, у вигляді пігулки, капсули або таблетки) також входить в обсяг даного винаходу.

Даний винахід стосується посудини (наприклад, пластикового або скляного флакона, наприклад із кришкою, або хроматографічної колонки, порожнистої голки або циліндра шприца), що містить будь-яке з антитіл, або антигензв'язувальних фрагментів, за винаходом (наприклад,

КВІ) або його фармацевтичну композицію. Даний винахід також стосується ін'єкційного пристрою, що містить будь-яке з антитіл, або антигензв'язувальних фрагментів, за винаходом (наприклад, КВІ) або його фармацевтичну композицію. ін'єкційний пристрій являє собою пристрій, який вводить речовину в тіло пацієнта парентеральним шляхом введення, наприклад внутрішньом'язовим, підшкірним або внутрішньовенним. Наприклад, ін'єкційний пристрій може являти собою шприц (наприклад, попередньо заповнений фармацевтичною композицією, такий як автоматичний медичний шприц), який, наприклад, включає циліндр або корпус для вміщення ін'єктованої рідини (наприклад, антитіла, або фрагмента, або його фармацевтичної композиції), голку для проколювання шкіри і/або кровоносних судин для ін'єкції рідини і поршень для виштовхування рідини із циліндра через отвір голки. В одному з варіантів здійснення винаходу ін'єкційний пристрій, що містить антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за даним винаходом або його фармацевтичну композицію, являє собою ін'єкційний пристрій для внутрішньовенного (в/в) введення. Такий пристрій містить антитіло, або фрагмент, або його фармацевтичну композицію у канюлі або троакарі/голці, яка може бути з'єднана із трубкою, що може бути з'єднана з мішком або резервуаром для вміщення рідини (наприклад, сольового розчину або розчину Рінгера лактату, що містить Масі, натрію лактат, КСІ, Сасі» і, необов'язково, містить глюкозу), що вводиться в тіло пацієнта через канюлю або троакар/голку.

Антитіло, або фрагмент, або його фармацевтичну композицію в одному з варіантів здійснення винаходу можна вводити в пристрій після того, як троакар і канюля введені у вену пацієнта і троакар видалений з введеної канюлі. Пристрій для в/в введення можна, наприклад, вводити в периферичну вену (наприклад, у передпліччі або плечі); верхню порожнисту вену або нижню

Зо порожнисту вену, або в праве передсердя серця (наприклад, у центральну вену), або в підключичну, внутрішню яремну або стегнову вену й, наприклад, просувати в напрямку серця, поки він не досягне верхньої порожнистої вени або правого передсердя (наприклад, центральної венозної лінії). В одному з варіантів здійснення винаходу ін'єкційний пристрій являє собою автоматичний медичний шприц, безголюовий шприц або зовнішній інфузійний насос. У безголковому шприці використовується вузький струмінь рідини під високим тиском, що проникає в епідерміс, доставляючи антитіло, або фрагмент, або його фармацевтичну композицію в тіло пацієнта. Зовнішні інфузійні насоси являють собою медичні пристрої, що доставляють антитіло, або фрагмент, або його фармацевтичну композицію в тіло пацієнта в контрольованих кількостях. Зовнішні інфузійні насоси можуть бути електричними або механічними. Різні насоси діють по-різному, наприклад, шприцевий насос утримує рідину в резервуарі шприца, а рухомий поршневий елемент контролює доставку рідини, еластомерний насос утримує рідину в розтяжному кулеподібному резервуарі, і тиск від еластичних стінок кулі забезпечує доставку рідини. У перистальтичному насосі ролики, прокочуючись по гнучкій трубці, здавлюють її, проштовхуючи рідину вперед. У багатоканальному насосі рідини можуть доставлятися з декількох резервуарів з різними швидкостями.

Фармацевтичні композиції, розкриті в даному описі, також можна вводити безголковим пристроєм для підшкірних ін'єкцій, таким, як пристрої, описані в патентах США МоМо 6620135, 6096002, 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 або 4596556. Такі безголкові пристрої що містять фармацевтичну композицію, також є частиною даного винаходу.

Фармацевтичні композиції, розкриті в даному описі, також можна вводити шляхом інфузії.

Приклади добре відомих імплантатів і модулів для введення фармацевтичних композицій включають ті, які описані в: патенті США Мо 4487603, у якому описаний імплантований мікроіїнфузійний насос для введення медикаментів з контрольованою швидкістю; патенті США

Мо 4447233, у якому описаний інфузійний насос для доставки медикаментів з точною швидкістю інфузії; патенті США Мо 4447224, у якому описаний імплантований інфузійний апарат змінного потоку для тривалої доставки лікарського засобу; патенті США Мо 4439196, у якому описана осмотична система доставки лікарського засобу, що має багатокамерну будову. Множина інших таких імплантатів, систем і модулів для доставки добре відома фахівцям у даній галузі, і ті, які містять фармацевтичні композиції за даним винаходом, входять в обсяг даного винаходу. 60 Режим введення залежить від декількох факторів, включаючи швидкість обороту терапевтичного антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, у сироватці або тканині, рівень симптомів, імуногенність профілактичного/терапевтичного антитіла і доступність клітин-мішеней у біологічному матриксі. Переважно, режим введення забезпечує доставку достатньої кількості терапевтичного антитіла, або фрагмента, для полегшення захворювання, що піддається лікуванню, при цьому з мінімальними небажаними побічними ефектами. Відповідно, кількість біологічного засобу, що доставляється, частково залежить від конкретного профілактичного/терапевтичного антитіла і ступеня тяжкості стану, що піддається лікуванню.

Посібник з вибору відповідних доз терапевтичних антитіл, або фрагментів, доступний (див., наприклад, Умам/глупсгак, (1996) Апірбоду ТПпегару, Віо5 Зсіепійіс Риб. М, Охіогавпіге, ОК;

Ктезіпа (ед.) (1991), Мопосіопа! Апііродієз, СуїюКіпе5 апа АйнНійіфв, Магсе! ОекКег, Мем Моїк, МУ;

Васі (єд.) (1993), Мопосіопа! Апіїбодіез апа Рерііде ТНнегару іп Ашоіїттипе Оібзеазев5, Магсеї реккКег, Мем Хогк, МУ; Ваєт!і евї аї!., 2003, Мем Епа)ї. У. Мед. 348:601-608; Міїдгот еї а!., 1999, Мем/

Епої. У. Мед. 341:1966-1973; 5іатоп еї а!., 2001, Мем Епаї. У. Мед. 344:783-792; Вепіатіпомії? єї а!., 2000, Мем Епа)ї. У. Мед. 342:613-619; С1повН єї аї!., 2003, Мем Епаї. у). Мей. 348:24-32; І ір5Ку єї а!., 2000, Мем Епа)і. У. Мед. 343:1594-1602).

Відповідну дозу визначає клініцист, наприклад, з використанням параметрів або факторів, відомих або передбачуваних у даній галузі для цілей запобігання або лікування захворювання.

Як правило, дозування починають із кількості, яка небагато менше оптимальної дози, а потім дозу збільшують з невеликими приростами до досягнення бажаного або оптимального ефекту відносно будь-яких негативних побічних ефектів. Важливі діагностичні заходи включають визначення симптомів, наприклад запалення або рівня продукування запальних цитокінів. Як правило, бажано, щоб використовуваний біологічний засіб мав походження від того ж біологічного виду, що і тварина, яку потрібно буде лікувати, у цьому випадку зводиться до мінімуму будь-яка імунна відповідь на реагент. У випадку пацієнтів-людей, наприклад, може бути бажаним використовувати гуманізовані і повністю людські антитіла.

Антитіла, або їх антигензв'язувальні фрагменти, розкриті в даному описі (наприклад, КВ), можна вводити безперервною інфузією або дозами, вводячи, наприклад, один раз на день, 1-7 разів на тиждень, раз на тиждень, раз на два тижні, раз на місяць, раз на два місяці, раз на квартал, раз на півроку, раз на рік і так далі. Дози можна вводити, наприклад, внутрішньовенно,

Зо підшкірно, топічно, перорально, назально, ректально, внутрішньом'язово, інтрацеребрально, інтраспінально або шляхом інгаляції. Загальна тижнева доза, як правило, становить щонайменше 0,05 мкг/кг маси тіла, частіше щонайменше 0,2 мкг/кг, 0,5 мкг/кг, 1 мкг/кг, 10 мкг/кг, 100 мкг/кг, 0,25 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 10 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг або більше (див., наприклад, Уапод еї аї., 2003, Мем Епої. У. Мей. 349:427-434; Негоїд, еї а!І., 2002, Мем Епої. у.

Меа. 346:1692-1698; Пи єї аї!., 1999, У. Мешгої!. Меигозиг9. Рвусп. 67:451-456; Ропіеє||і, еї аї., 2003,

Сапсег Іттипо)ї. ІттипоїНег. 52:151-144). Також можна вводити дози, що дозволяють досягати попередньо визначеної цільової концентрації анти-лРСОВ антитіла в сироватці пацієнта, наприклад 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 мкг/мл або більше. В інших варіантах здійснення анти-

ЛРСВ антитіло за даним винаходом вводять, наприклад, підшкірно або внутрішньовенно, раз на тиждень, раз на два тижні, раз на 4 тижні, раз на місяць, раз на два місяці або раз на квартал у дозі 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 або 2500 мг/пацієнта.

Використовуваний у даному описі термін "ефективна кількість" означає кількість анти-лРСВ антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за винаходом (наприклад, КВ), яка, при введенні окремо або в комбінації з додатковим терапевтичним/профілактичним засобом у клітину, тканину або в тіло пацієнта, є ефективною для нейтралізації РСВ і/або для запобігання або викликання вимірного ослаблення одного або більше симптомів захворювання або стану, пов'язаного із РСВ-інфекцією. "Ефективна доза" також означає кількість антитіла, або фрагмента, достатню для щонайменше часткового запобігання або ослаблення симптомів. У випадку, якщо індивідуальний активний інгредієнт вводять окремо, термін "ефективна доза" стосується даного окремого інгредієнта. Якщо інгредієнти використовують у комбінації, термін "ефективна доза" стосується сумарної кількості активних інгредієнтів, яка приводить до профілактичного або терапевтичного ефекту при введенні в комбінації, послідовно або одночасно. У конкретних варіантах здійснення ефективна кількість являє собою кількість, яка забезпечує клінічно цільову концентрацію в сироватці 10-30 мкг/мл протягом 5 місяців. В одному варіанті здійснення ефективна кількість являє собою дозу для людини, яка забезпечує зразкову цільову концентрацію 10-30 мкг/мл для досягнення ефективності, що визначають за допомогою стандартної доклінічної моделі на бавовняних хом'яках.

Набори

Також запропоновані набори, які містять один або більше компонентів, які включають, але 60 не обмежуються ними, антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білка лРСВ,

описане в даному документі (наприклад, КВІ1), у комбінації з одним або більше додатковими компонентами, у тому числі, але без обмеження, фармацевтично прийнятним носієм і/або профілактичним/терапевтичним засобом, описаним у даному документі. Антитіло, або фрагмент, і/або профілактичний/терапевтичний засіб можна формулювати у вигляді чистої композиції або в комбінації з фармацевтично прийнятним носієм у фармацевтичній композиції.

В одному варіанті здійснення набір включає антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білела лРСВ за винаходом (наприклад, КВ1) або його фармацевтичну композицію в одному контейнері (наприклад, у стерильному скляному або пластиковому флаконі) і фармацевтичну композицію і/або профілактичний/терапевтичний засіб в іншому контейнері (наприклад, у стерильному скляному або пластиковому флаконі).

В іншому варіанті здійснення набір містить комбінацію за винаходом, яка включає антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білю»а лРСОВ за винаходом (наприклад, КВ1) разом з фармацевтично прийнятним носієм, необов'язково, у комбінації з одним або більше профілактичними/терапевтичними засобами, сформульованими разом, необов'язково, у фармацевтичній композиції в одному загальному контейнері.

Якщо набір включає фармацевтичну композицію для парентерального введення пацієнту, набір може включати пристрій для виконання такого введення. Наприклад, набір може включати одну або більше голок для підшкірних ін'єкцій або інші ін'єкційні пристрої, описані вище.

Набір може включати вкладиш в упаковку, що містить інформацію про фармацевтичні композиції і лікарські форми у наборі. Як правило, така інформація допомагає пацієнтам і лікарям використовувати фармацевтичні композиції і лікарські форми, що входять в набір, ефективно і безпечно. Наприклад, вкладиш може містити наступну інформацію про комбінацію за винаходом: показники фармакокінетики і фармакодинаміки, результати клінічних досліджень, параметри ефективності, показання до застосування, протипоказання, застереження, запобіжний заходи, побічні реакції, відомості про передозування, належні дози і спосіб введення, опис форми, що постачається, належні умови зберігання, літературні джерела, інформацію про виробника/дистриб'ютора і патентну інформацію.

Набори для виявлення і набори для профілактики/герапії

Для зручності, анти-лРСВ антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за винаходом

Зо (наприклад, КЕВІ) можна надавати в наборі, тобто у вигляді упакованої комбінації реагентів у попередньо визначених кількостях з інструкціями із проведення діагностики або аналізу на виявлення. Якщо антитіло, або фрагмент, містить як мітку фермент, набір буде включати субстрати і кофактори, необхідні для ферменту (наприклад, попередник субстрату, який створює хромофор або флуорофор, що піддається виявленню). Крім того, можуть бути включені інші добавки, такі як стабілізатори, буфери (наприклад, блокувальний буфер або лізуючий буфер) і таке інше. Відносні кількості різних реагентів можуть варіюватися в широких межах для створення концентрацій реагентів у розчині, які суттєво оптимізують чутливість аналізу. Зокрема, реагенти можуть бути надані у вигляді сухих порошків, як правило ліофілізованих, включаючи ексципієнти, які при розчиненні утворюють розчин реагенту, що має відповідну концентрацію.

Також запропоновані реагенти для діагностики або виявлення і набори, що містять один або більше таких реагентів, для використання в різних аналізах на виявлення, включаючи, наприклад, імуноаналізи, такі як ЕГІЗА (у форматі "сендвіч" або конкурентного аналізу).

Компоненти набору можуть бути попередньо зв'язані із твердою підкладкою або можуть бути нанесені на поверхню твердої підкладки при використанні набору. У деяких варіантах здійснення винаходу засоби для генерування сигналу можуть бути надані попередньо зв'язаними з антитілом, або фрагментом, за винаходом або може знадобитися їх об'єднання з одним або більше компонентами, наприклад буферами, кон'югатами антитіло-фермент, ферментними субстратами або тому подібним, перед використанням. Набори також можуть включати додаткові реагенти, наприклад блокувальні реагенти для зменшення неспецифічного зв'язування з поверхнею твердої фази, промивальні реагенти, ферментні субстрати і таке інше.

Поверхня твердої фази може мати форму трубки, гранули, планшета для мікротитрування, мікросфери або інших матеріалів, придатних для іммобілізації білків, пептидів або поліпептидів.

У конкретних аспектах фермент, каталізуючий утворення хемілюмінесцентного або хромогенного продукту, або відновлення хемілюмінесцентного або хромогенного субстрату, є компонентом засобу генерування сигналу. Такі ферменти добре відомі в даній галузі. Набори можуть включати будь-які із захоплюючих засобів і реагентів для виявлення, описаних у даному документі. Необов'язково, набір також може включати інструкції зі здійснення способів за винаходом. бо Також запропонований набір, який включає антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білка лРСВ, упаковане в контейнері, такому як флакон або бутель, і додатково включає етикетку, прикріплену до контейнера або упаковану разом з ним, на етикетці зазначений вміст контейнера і наведені призначення і/або інструкції, що стосуються використання вмісту контейнера для запобігання/лікування одного або більше хворобливих станів, описаних у даному документі.

В одному аспекті набір призначений для запобігання або лікування захворювань/станів, пов'язаних із РСВ-інфекцією, і включає антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, до БЕ- білка лРСВ і додатковий профілактичний/терапевтичний засіб або вакцину. Набір також може, необов'язково, включати шприц для парентерального, наприклад внутрішньовенного, введення.

В іншому аспекті набір включає антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, до Е-білка

ЛРСВ і етикетку, прикріплену до контейнера або упаковану разом з ним, що містить інформацію про використання антитіла, або фрагмента, разом з вакциною або додатковим профілактичним/терапевтичним засобом. В іншому аспекті набір включає вакцину або додатковий профілактичний/терапевтичний засіб і етикетку, прикріплену до контейнера або упаковану разом з ним, що містить інформацію про використання вакцини або додаткового профілактичного/терапевтичного засобу разом з антитілом, або його фрагментом, до Е-білка

ЛРСВ. У конкретних варіантах здійснення антитіло до Е-білка лРСВ і вакцина або додатковий профілактичний/терапевтичний засіб знаходяться у різних флаконах або об'єднані в одній і тій же фармацевтичній композиції.

У випадку комбінованої профілактики або терапії для одночасного введення двох профілактичних/терапевтичних засобів необов'язково вводити засоби в один і той же час або одним і тим же шляхом введення, за умови, що має місце перекривання періодів часу, протягом яких засоби виявляють свою профілактичну/терапевтичну дію. Передбачене одночасне або послідовне введення, а також введення в різні дні або тижні.

Також можуть бути виготовлені набори для профілактики/герапії і виявлення, розкриті в даному описі, які включають щонайменше одне антитіло, пептид, антигензв'язувальний фрагмент або полінуклеотид, розкриті в даному описі, і інструкції з використання композиції як реагенту для виявлення або профілактичного/лерапевтичного засобу. Контейнери, використовувані в таких наборах, як правило, можуть являти собою щонайменше один флакон,

Зо пробірку, колбу, бутель, шприц або інший приданий контейнер, у який одна або більше з композицій для виявлення і/або профілактичних/терапевтичних композицій можуть бути поміщені й, переважно, розділені на відповідні аліквоти. У випадку додаткового надання другого профілактичного/терапевтичного засобу набір також може включати другий контейнер, у який може бути поміщена друга композиція для виявлення і/або профілактична/терапевтична композиція. Альтернативно, декілька сполук можуть бути приготовлені в одній фармацевтичній композиції і можуть бути упаковані в одному контейнері, такому як флакон, колба, шприц, бутель або інший придатний одиночний контейнер. Набори, розкриті в даному описі, як правило, також будуть включати засоби для вміщення флакона(ів) у щільній захисній оболонці для комерційного продажу, такі як, наприклад, виготовлені методом лиття під тиском або лиття з роздуванням пластикові контейнери, у яких містяться потрібні флакони. Якщо в набір включена радіоактивна, хромогенна, флуорогенна або інша детектована мітка, або засіб для виявлення, засіб для мічення або може бути наданий в тому ж контейнері, що і сама композиція для виявлення або профілактична/терапевтична композиція, або, альтернативно, може бути поміщений в другий окремий контейнер, у який ця друга композиція може бути поміщена і розділена на відповідні аліквоти. Альтернативно, реагент для виявлення і мітку можна приготовляти в одному контейнері й, у більшості випадків, набір, як правило, також буде включати засоби для вміщення флакона(ів) у щільній захисній оболонці для комерційного продажу і/або зручну упаковку і засіб доставки.

Також запропонований пристрій, або апарат, для здійснення методів виявлення або моніторингу, описаних у даному документі. Такий апарат може включати камеру або пробірку, у яку може бути поміщений зразок, систему подачі рідини, яка, необов'язково, включає клапани або насоси для спрямування потоку зразка через пристрій, необов'язково, фільтри для відділення плазми або сироватки від формених елементів крові, змішувальні камери для додавання уловлювальних реагентів або реагентів для виявлення і, необов'язково, пристрій виявлення для визначення кількості детектованої мітки, зв'язаної з імунним комплексом уловлювального реагенту. Потік зразка може бути пасивним (наприклад, під дією капілярних, гідростатичних або інших сил, які не вимагають подальших маніпуляцій з пристроєм після нанесення зразка) або активним (наприклад, за рахунок застосування сили, створюваної механічними насосами, електроосмотичними насосами, віддентровою силою або підвищенням бо тиску повітря), або може створюватися за рахунок комбінації активних і пасивних сил.

Зб

У наступних варіантах здійснення також запропонований процесор, машиночитаний пристрій пам'яті і підпрограма, що зберігається на машиночитаному пристрої пам'яті і адаптована до виконання на процесорі, для здійснення будь-яких способів, описаних у даному документі. Приклади придатних комп'ютерних систем, обладнання і/або конфігурацій включають персональні комп'ютери, серверні комп'ютери, портативні і переносні пристрої, багатопроцесорні системи, мікропроцесорні системи, телевізійні приставки, програмовані побутові електронні пристрої, мережні ПК, міні-комп'ютери, універсальні обчислювальні машини, розповсюджуване обчислювальне обладнання, яке включає будь-які з перерахованих вище систем або пристроїв, або будь-які інші системи, відомі в даній галузі.

ЗАГАЛЬНІ МЕТОДИ

Стандартні методи молекулярної біології описані в ЗатбгоокК, Егй5сп апа Мапіаїїв (1982, 1989, 24 Ба, і 2001, 39 Ба.) Моїіесшаг Сіопіпду, А Іарогаїту Мапиа!ї, Со бргіпд Нагбог

І арогайюгу Ргезв, Соїд 5ргіпд Нагбог, МУ; ЗатьгоокК апа Виззеї! (2001) Моїіесшаг Сіопіпоу, 3 Еад.,

Соіа бріїпа Натог І арогаюгу Ргезв5, Соїй бргіпу Натог, МУ; УМи (1993), Весотбіпапі ОМА, Мої. 217, Асадетіс Рге55, Зап Ріедо, СА). Стандартні методи також описані в збірнику А!й5беї еї аї. (2001), Ситепі Ргоюсої5 іп МоїІесшіаг Віоіоаду, Моїв. 1-4, допп Уміеу апа Зопв, Іпс. Мем Могк, МУ, у якому описане клонування в бактеріальних клітинах і мутагенез ДНК (том 1), клонування в клітинах ссавців і дріжджів (том 2), глікокон'югати і експресія білка (том 3) і біоїнформатика (том 4).

Методи очищення білків, включаючи імунопреципітацію, хроматографію, електрофорез, центрифугування і кристалізацію, описані (Соїїдап еї аї. (2000), Ситепі Ргоїосої5 іп Ргоїеїп зЗсіепсе, Мої. 1, дойп УмМіеу апа 5оп5, Іпс., Мем/ МогК). Методи хімічного аналізу, хімічної модифікації, посттрансляційної модифікації, продукування злитих білків, глікозилування білків описані (див., наприклад, Соїїдап еї аї. (2000), Ситепі Ргоїосої5 іп Ргоївіп Зсіепсе, Мої. 2, допп

УМіеу апа 5опв5, Іпс., Мем МоїКк; А!йзибеї еї а!. (2001), Ситепі Ргоюсо!5 іп МоіІесшаг Віоіоду, Мої. З,

Уонп Уміеу апа 5опв, Іпс., ММ, ММ, рр. 16.0.5-16.22.17; Бідта-Аїйагісн, Со. (2001), Ргодисів їог І Те

Зсієпсе ВНезеагсі, 51. І оці5, МО; рр. 45-89; Атегепат РНаптасіа Віоїеєсп (2001), Віодігесіогу,

Різсаїаумау, М.9., рр. 384-391). Методи одержання, очищення і фрагментації поліклональних і моноклональних антитіл описані (Соїїдап еї аї. (2001), Сигтепі Ргоїосої5 іп Іттипоїоду, Мої. 1, допп УМіеу апа 5опв, Іпс., Мем/ МоїКк; Напоу»х апа І апе (1999), Овіпд Апіїбодієв, Соїа Зргіпуд Нагрог

Іарогаїогу Ргез5, Соїй оЗргіпд Нагбог, МУ; Нагомж апа Гапе, вище). Стандартні методи характеризації взаємодій ліганд/рецептор описані (див., наприклад, Соїїдап еї аї. (2001), Сигтепі

Ргоїосо!5 іп Іттипоіоду, Мої. 4, дУопп УМіїеу, Іпс., Мем МогК).

Одноланцюжкові антитіла і діатіла описані (див., наприклад, Маїйескі еї аї., 2002, Ргос. Маї!.

Асай. осі. ОБА, 99:213-218; Сопгаїйй еї а!., 2001, 9. Віої. Спет. 276:7346-7350; Оевтуїег еї аї., 2001, 9. Віої. Снет. 276:26285-26290; Ниазоп апа Котпії, 1999, У. Іттипої. Меїпоав», 231:177-189; і патент США Мо 4946778). Біфункціональні антитіла описані (див., наприклад, Маск еї аї. (1995),

Ргос. Май). Асай. Зсі. ОБА, 92:7021-7025; Сапег (2001), у. Іттипої. Меїйоав, 248: 7-15; МоїКеї! єї а! (2001), Ргоївїп Епадіпеегіпуд, 14:815-823; 5едаї єї аї. (2001), 9. Іттипої. Меїйодв5, 248:1-6;

Вгеппап еї аї. (1985), Зсіепсе, 229:81-83; Вазо еї аї. (1997), 9. Віої. Спет. 272:27623; Мотгтізоп (1985), 5сіеєпсе, 229:11202-1207; ТгашпескКег еї аї. (1991), ЕМВО 9. 10:3655-3659; і патенти США

МоМо 5932448, 5532210 і 6129914).

Біспецифічні антитіла також описані (див., наприклад, Ал7опі еї аї. (1998), 9. Іттипо). 161:3493; Кіїа єї а!. (1999), У. Іттипої. 162:6901; МегсНапі еї аї. (2000), 9. ВіоІї. Снет. 74:9115;

Рапавєу еї а. (2000), 9. Віої. Спет. 275:38633; 7пепа евї а!. (2001), 9. ВіоїЇ Снет. 276:12999; Ргорві еї а. (2000), у. Іттипої. 165:2214; І опа (1999), Апп. Нем. Іттипої. 17:875).

Антитіла можуть бути кон'юговані, наприклад, з низькомолекулярними лікарськими засобами, ферментами, ліпосомами, поліетиленгліколем (ПЕГ). Антитіла корисні для терапії, діагностики, використання в наборі або інших цілей і включають антитіла, зв'язані, наприклад, з барвниками, радіоіїзотопами, ферментами або металами, наприклад колоїдним золотом (див., наприклад, Ге Юоиззаї еї аї. (1991) У. Іттипої. 146: 169-175; Сіреїїпі еї а. (1998), 9. Іттипої. 160:3891-3898; Нвзіпуд апа Візхпор (1999), 9. Іттипої. 162:2804-2811; Емепв еї аї. (2002), 9.

Іттипої!. 168: 883-889).

Методи проточної цитометрії, включаючи активовану флуоресценцією сортування клітин (ГАС5), описані (див., наприклад, Оугеп5 еї аІ. (1994), Ром Суютеїйгу Рііпсіріе5 ог Сііпіса!

І арогайогу Ргасіїсе, Чуопп Ум/еу апа бопе5, НороКеп, МУ; Сімап (2001), Ріом/ Суїотеїйгу, 2" Еа.;

М еу-Гів5, Норокеп, МУ; Зпаріго (2003), Ргасіїса! Ріом/ Суютеїгу, дойп УМіеу апа оп, Норокеп,

МУ). Флуоресцентні реагенти, придатні для модифікації нуклеїнових кислот, включаючи нуклеотидні праймери і зонди, поліпептидів і антитіл, для використання, наприклад, як 60 діагностичних реагентів, доступні (МоїІесшаг Ргобе5 (2003), саїаіюд, МоїІесшіаг Ргорев, Іпс.,

Епйдепе, ОВ; 5ідта-Аїагісн (2003), саїаод, 51. І оці, МО).

Стандартні методи гістології імунної системи описані (див., наприклад, МиПег-Наптеїнк (еа.) (1986), Нитап Тнутив: НівіораїпоЇоду апа Раїпоіоду, Зргіпдег Мепад, Мем МоїКк, МУ; Ніаїй! еї аї. (2000), Соїог АйМаз ої Нівіоіоду, І ірріпсой, УМПатв, апа УМїКін5, РНйа, РА; І оців єї а). (2002), Вавіс

Нівіоіоау: Техі апа Айаз, МесСтам-нпіїї, Мем МогК, ММ).

Пакети програм і бази даних для визначення, наприклад, антигенних фрагментів, лідерних послідовностей, згортання білка, функціональних доменів, сайтів глікозилування і вирівнювання послідовностей, доступні (див., наприклад, Сепрапк, Месіог МТІФ 5ийе (Іптоптах, Іпс, Веїпезаа,

МО); аа М/ізсопвзіп РасКаде (Ассеїгуз, Іпс., Зап бієдо, СА); ОеСурнег Ф (Тітеїодіс Согр., Стувіаї!

Вау, Мемада); Меппе еї аї. (2000), Віоіптогптаїйс5 16:741-742; Меппе 6ї аї. (2000), Віоіптогптаїйсв5

Арріїсайопе Моїє, 16:741-742; Мгеп, єї а. (2002) Сотриї. Меїйоа5 Ргодгатзв Віотеєа. 68: 177-181; моп Неї|пе (1983), Єиг. У. Віоспет. 133:17-21; моп Неї|пе (1986), Мисієїс Асід5 Нев. 14:4683-4690).

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Ідентифікація повністю людського нейтралізуючого РСВ антитіла

Для ідентифікації ефективних нейтралізуючих лРСВ антитіл збирали сироватку від донорів, що дали інформовану згоду, і аналізували на здатність нейтралізувати вірус лРСВ іп міго. Для аналізу нейтралізації зразки сироватки спочатку серійно розводили, а потім інкубували з 600

БУО штаму лРСВ А, експресуючого посилений зелений флуоресцентний білок (РСВ-СЕР). РСВ-

СЕР змішували у співвідношенні 1:1 з розведеною сироваткою в загальному об'ємі 200 мкл на ямку в 96-ямкових круглодонних планшетах і інкубували при 37 "С протягом 1 години. По 100 мкл суміші на ямку потім переносили в планшети, засіяні клітинами НЕр-2 (15000 клітин на ямку). Планшети сканували на приладі аситепФ Сеїїста (ТТР І абТесії, Сатрбгідде, МА), і дані експортували у вигляді кількості подій СЕР і загальної інтенсивності флуоресценції на ямку.

Значення МТ50 розраховували з використанням сСгарпРай Ргізт 6 (СгарпРайд 5ойпмаге, Іпс.,ї а

ЧоМа, СА) шляхом побудови чотирипараметричної кривої. Визначення титрів у реакції зв'язування з формами "до злиття" і "після злиття" Е-білел«а РОСВ методом ЕГІЗА виконували наступним чином. На планшети Мипс С9б МахізогрФ Мипс-Іттипо"м (Тнепто сієпійіс, Іпс.) наносили по 50 мкл у ямку Е-білок лРСОВ у формі "до злиття" (див. Ме! ейЇап еї аї., 2013, бсієпсе, 342:592) або "після злиття" (форма "після злиття" Е-білка Ї7Е21 складається з ектодомену Е

Зо дикого типу без пептиду злиття (див. Мсі ейїеп еї аї., 2011, 9. МігоІ. 85:7788)) у концентрації 1 мкг/мл в РВЗ ії інкубували при 4 "С протягом ночі. Планшети промивали буфером РВЗ/Гмееп 20, а потім блокували З 95 розчином нежирного молока в РВ5. Потім 50 мкл серійно розведених зразків сироватки додавали в ямки і інкубували при кімнатній температурі протягом 90 хв.

Планшети промивали і додавали НКР-кон'юговані антитіла кози проти дб людини (Бош ПпегпВіоїесі, Вігтіпудпат, АГ) у розведенні 1:2000. Через годину планшети промивали і додавали розчин ЗирегВіш Тигро ТМВ (Мігої ар», Іпс., еїтепіпуд, МА) для розвитку забарвлення.

Визначали поглинання (00) при довжині хвилі 450 нм на приладі УмаМйас 1420 МІСТОКО тм

Мишабреї! Соципег (РегКіп ЕІтег, МУакнтат, МА). Значення ЕСзо розраховували з використанням

СтгарпРай Ргізхт б шляхом побудови чотирипараметричної кривої. Групу донорів, у яких були виявлені високі титри антитіл при зв'язуванні і нейтралізації лРСОВ, повторно запрошували для здачі більших об'ємів крові для одержання МКПК. Препарати МКПК одержували в комерційній організації- постачальнику, і придбані МКІК зберігали в рідкому азоті до подальшого використання.

МКПК від одного пацієнта демонстрували гарні титри при нейтралізації і відрізнялися найвищими титрами в аналізі зв'язування методом ЕГІЗА з формою "після злиття" Е-білка, при цьому також демонстрували одні із кращих характеристик зв'язування з формою "до злиття" Е- білка (дані не представлені). Внаслідок цього, МКІОК від цього донора були вибрані для виділення специфічних для форми "після злиття" Е-білка В-клітин пам'яті методом ГАСЗ5.

Біотинільований тримерний Е-білок у формі "після злиття" (721) одержували шляхом біотинілювання 221 (Мсі ейеп еї аї., 2011, 9. МігоІ. 85:7788) з використанням набору для біотинілювання Е-2 ІГіпктм Буйо-МНО-І С (Ійе ТесппоЇодіе5, сгапа Ісіапа, МУ) відповідно до інструкцій виробника. Білок І 2Е21 складається з ектодомену Е-білка дикого типу без пептиду злиття (Мсі еПеп еї аї., 2011, 9. Мігої!. 85:7788). Специфічна для Е-білка "після злиття" мишача гібридома 407 являє собою мишачу гібридому, одержану шляхом імунізації мишей Ваїр/с вірусом РСОВ А2. Мишей Ваїр/с імунізували двічі внутрішньоочеревинно вірусом РСВ А?2 і виконували бустерну внутрішньовенну ін'єкцію 20 мкг очищеного РСВ А2 (Аймапсеа

Віотесппоїодієв5, Іпс., Соїштбіа, МО) за три дні до проведення злиття клітин. Селезінки мишей збирали і проводили злиття спленоцитів із клітинами мієломи 5Р2/0 за допомогою поліетиленгліколю. Клітини вносили в середовище Ю (З(етсеї! ТесппоїЇодіє5 Іпс., Мапсоимег, 60 ВС), висівали у квадратні чашки Петрі розміром 245х245 мм і інкубували при 37 20, 595 СО»

протягом 2 тижнів. Окремі колонії відбирали з використанням СіоперРіх (Сепеїїх), переносили в 9б-ямкові планшети і інкубували, як зазначено вище, протягом 1 тижня. Проводили скринінг супернатантів на анти-РСВ активність методом ЕГІЗА, використовуючи очищений РСВ Аг.

Позитивні клони, включаючи 407, нарощували і потім субклонували методом серійних розведень. Проводили скринінг субклонів, як описано вище, клон 407-8 був ідентифікований і використаний для оптимізації забарвлення кон'югатом І2Е21-біотин В-клітин пам'яті з використанням ЕАСЗ5 (дані не представлені). У процесі даних експериментів по оптимізації було встановлено, що концентрація 1,5 мкг/мл кон'югата І2Е21-біотин являла собою найкращу концентрацію для забарвлення специфічних для форми "після злиття" Е-білка В-клітин пам'яті.

Специфічність реакції забарвлення була продемонстрована з використанням сторонньої мишачої гібридоми як негативного контролю і конкуренції за зв'язування з 100-1000х надлишком неміченого І 2Е21.

Антигенспецифічні В-клітини пам'яті були позначені СО3ЗСО19:д4с1 7215. Ці клітини вносили в 96-ямкові планшети (одна клітина/ямку), що містять експресуючі ліганд СО40 клітини лінії НЕК293 (одержані стандартними молекулярно-біологічними методами) і 1/-21 (5іпо

Віоіодіса! Іпс., Могій УМаІе5, РА). Після тестування 30 зразків було показане зв'язування супернатанту з б ямок з формою "після злиття" Е-білка в аналізі ЕГІЗА (проведеному, як описано вище). Ці зразки також відрізнялися зв'язуванням з формою "до злиття" Е-білка (дані не представлені). Дані шість зразків потім тестували в аналізі нейтралізації, як описано вище, без розведення. Наявність нейтралізуючої активності була продемонстрована на основі скорочення кількості ЗЕР-подій. Із шести зразків, два зразки (позначені КВІ1 і КВ11) продемонстрували повну нейтралізацію штаму лРСВ А (див. Таблицю 3).

Таблиця З 17111111 БОВА,45Онм////////////// | Нейтралізацяд/ З

Е-білок "після Е-білок "до о . діт яка | ве | диня люту | ЯЕРтоді Денейтралізації

АВ | 0641. | 1743. | ї222 | 783

АВ | 1,743 | те 1771754 | 6898 | .-:« НИ

АТ 7817 17717906 | 555 | 500 17777711

Ві | 77782 17711925 | ле | 0 | 0096 ві2 | 801 1777838 | 1679 | 548 177771

Контроль | 0037 | 0038 | 0044 | 56

Екстрагування РНК і ЗТ-ПЛР для культури відсортованих одиничних В-клітин пам'яті

Частина 1

РНК із лізату найкращого клону КВІ1 в 96-ямковому планшеті екстрагували з використанням набору КМеазуФ Місго Кії (Оіадеп, Іпс., МаІепсіа, СА) відповідно до керівництва виробника.

Концентрацію РНК визначали з використанням МапоЮОгор'м 200 2б (Тнегто Різнег Зсієепійіс Іпс.,

Зо УМтіпдгоп, ОЕ) при довжині хвилі УФ-випромінювання 260 нм. РНК, екстраговану з ямки з КВІ1, використовували як матрицю при ампліфікації методом ЗТ-ПЛР генів важкого і легкого ланцюгів антитіла, використовуючи послідовності праймерів, створених на основі лідерної послідовності (прямий) і С'"-кінця дб ОН, константної області каппа або константної області лямбда (зворотний).

Набір Опезіер для ЗТ-ПЛР (Оіадеп Іпс, МаІепсіа, СА) використовували відповідно до інструкцій виробника для ампліфікації послідовностей антитіла. Умови ПЛР були наступними: 50 ес протягом 30 хв., 95 "С протягом 15 хв., 194 "С протягом 30 сек., 55 "С протягом 30 сек., 72 260 протягом 1 хв.|х40, 72 "С протягом 10 хв. і зберігання при 4 20.

Продукт ЗТ-ПЛР безпосередньо використовували як матрицю для вкладеної ПЛР.

Частина 2. Вкладена ПЛР

Продукти ЗТ-ПЛР використовували як матриці у вкладеній ПЛР для ампліфікації варіабельних областей антитіла із ДНК-полімеразою ріх50 (Іпийгодеп, каталожний Мо 12355- 012). Праймери для вкладеної ПЛР були розроблені на основі послідовностей зародкової лінії каркасної області 1 варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів Ї3 людини. 1 мкл продукту ЗТ-ПЛР змішували з 2,5 мкл 10х ПЛР-буфера, 2,5 мкл 10х розчину РСЕХ

Еппапсег (Іпмігодеп), 0,5 мкл суміші дНТФ, 0,5 мкл об'єднаних прямих праймерів (10 мкм кожний), 0,5 мкл зворотного праймера (10 мкМ), 0,5 мкл ДНК-полімерази ріх50 їі 17 мкл води.

Умови вкладеної ПЛР були наступними: 2 хв. при 94 2С, 10 циклів при 94 С протягом 30 сек., 50 об протягом 30 сек., 68 "С протягом 1 хв., з наступними 30 циклами при 94 С протягом 30 сек., 6О "С протягом 30 сек., 68 "С протягом 1 хв., потім 7 хв. елонгації при 68 "С, з наступним короткочасним зберіганням при 4 20.

Одержані для КВІ продукти вкладеної ПЛР при ПЛР-ампліфікації МН ії МК або МН і М використовували як матриці для ПЛР з праймерами, що перекриваються, зі специфічними лінкерами для спільного відпалу генів легкого і важкого ланцюгів антитіла для полегшення наступного етапу клонування методом іп-Тивіоп.

Частина 3. ПЛР з праймерами, що перекриваються, і іп-Тивіоп клонування

У даній реакції використовували ДНК-полімеразу ріх50 (Іпмігодеп). Були розроблені прямий і зворотний праймери для полегшення іп-тизіоп клонування продуктів ПЛР з праймерами, що перекриваються, в клонуючий вектор. 1 мкл продукту вкладеної ПЛР важкого ланцюга, 1 мкл продукту вкладеної ПЛР легкого ланцюга і 1 мкл лінкера змішували з 5 мкл 10х ПЛР-буфера, 5 мкл 10х РСЕКХ Еппапсег, 1 мкл суміші ДНТФ, 1 мкл прямого праймера (10 мкМ), 1 мкл зворотного праймера (10 мкМ), 1 мкл ДНК-полімерази ріх5о0о і 33 мкл води.

Умови ПЛР були наступними: 94 С протягом 2 хв., 194 "С протягом 30 сек., 60 "С протягом

ЗО сек., 68 "С протягом 2 хв.|х10, (94 "С протягом 30 сек., 65 "С протягом 30 сек., 68 "С протягом 2 хв.|х30, 68 "С протягом 7 хв., зберігання при 4 20.

Продукти ПЛР з праймерами, що перекриваються, очищали в агарозному гелі для іп-Тивіоп клонування (був одержаний продукт ПЛР з праймерами, що перекриваються, МНЯУК КВІ1 розміром приблизно 1,2 т.п.н.). Продукти ПЛР з праймерами, що перекриваються, МНАУК КВІ1 клонували у вектор рМар1і1Ехр2 (з лідерною послідовністю ОтрА для експресії легкого ланцюга, з лідерною послідовністю Ре!В для експресії важкого ланцюга) методом іп-ТШвіоп клонування. Використовували набір для клонування Іп-Ризіоп НОФ (Сіопіесп І арогайогієв, Іпс.,

Моипіаїп Мем, СА) відповідно до інструкцій виробника. Трансформанти відбирали і відправляли в компанію Сепеумі?, Іпс. (зош Ріаїптеїй, МУ) для секвенування.

Результати секвенування аналізували з використанням Зедциепспег (Сепе Соде5

Согрогаїййоп, Апп Агбог, МІ).

Нуклеотидні і амінокислотні послідовності КВІ представлені в Таблиці 7 (амінокислотні

Зо послідовності варіабельної області важкого ланцюга і варіабельної області легкого ланцюга

ЕВІ, виділеного зі зразка пацієнта, наведені в БЕО ІЮО МО: 9 і БЕО ІО МО: 8, відповідно). Через дизайн зворотних праймерів У, що мають нуклеотидну зміну, залишок ізолейцину, присутній у природній послідовності в положенні 125, був замінений на залишок треоніну в експресованому білку (одержана варіабельна область важкого ланцюга КВІ представлена ЗЕО ІЮ МО: 7).

Амінокислотні послідовності для генів варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів антитіла

КВІ були передані в компанію Сепобсгірі О5А, Іпс. (Різсаїаулау, МУ) для кодон-оптимізації і перетворення ІДОС1 людини, а також для тимчасової експресії і продукування в клітинах СНО.

Синтезовані молекули ДНК субклонували у вектор рТТ5 для експресії в клітинах СНО-ЗЕ7.

Рекомбінантні плазміди, кодуючі легкий і важкий ланцюги кожного антитіла, були тимчасово спільно трансфіковані в культури клітин СНО-ЗЕ7. Супернатанти клітинних культур, зібрані в день 6, використовували для очищення на колонці з білюоюм А. Очищене ІдС1 КВІ людини використовували в аналізі нейтралізації і інших експериментах з характеризації, як описано в прикладі 2.

Приклад 2. Характеризація анти-лРСВ антитіл

Антитіло КВІ1 зв'язувалося як з формою "до злиття" Е-білка, так і з формою "після злиття" Е- білка, в аналізі ЕГІЗА, як описано в прикладі 1, з величиною ЕсСбхо у діапазоні 1-10 нг/мл, у той час як антитіло 025 (див. КулаККепроз еї аї!., 2010, Маїшге Меаісіпе, 16:123-128) зв'язувалося переважно з формою "до злиття" Е-білка. Див. Фігури 1А-В.

Нейтралізуючу активність КВІ, КВІ11 і деяких контрольних антитіл, описаних у літературі (рг5, палівізумаб, повнорозмірне (антитіло 025 було одержано у власній організації на основі опублікованої послідовності і синагісф (палівізумаб) придбавали у компанії Муодепт, Моітівїомлп,

РАЇ), порівнювали відносно штаму РСОВ А Гопд (АТСС номер МЕК-267м) і штаму РСВ В

Умазпіпаоп 18537 (АТСС номер МК-15807м). Тестовані зразки серійно розводили в три рази в

ЕМЕМ з додаванням 295 інактивованої нагріванням ЕБС для одержання одинадцяти концентраційних точок. Потім серійно розведені зразки змішували з рівними об'ємами середовища ЕМЕМ з додаванням 2 95 інактивованої нагріванням ЕБС, що містить 100 БУО/ямку штамів РСВ А або В. Після інкубації при 37 "С протягом 1 години 100 мкл клітин НЕр-2 у концентрації 1,5х105 клітин/мл переносили в 9б-ямкові планшети, що містять суміш вірус/"антитіло. Через З дні після інфікування клітини промивали один раз РВ5, а потім фіксували в 80 95 ацетоні протягом 10 хв. при кімнатній температурі. Суміш специфічних відносно Е-білюла РСВ (тАр143-Е3-8138) і М-білка РСВ (3429) мишачих мАт (одержаних у власній організації) додавали в планшети і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети промивали буфером РВ5Б/0,05 95 Тмееп 20, у планшети додавали біотинільоване антитіло коня проти (ДО миші і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети промивали буфером РВ5З/0,05 96 Тмееп. Кон'югат поглинаючого в ІЧ- області барвника зі стрептавідином використовували для виявлення специфічного для РСВ сигналу, і два клітинні барвники для нормування аналізу додавали в 96-ямкові планшети і інкубували протягом 1 години в темряві. Після одногодинної інкубації планшети промивали, сушили на повітрі протягом 20 хвилин у темряві і прораховували в автоматизованій системі обробки зображень Гісог Аегійи5Ф з використанням 700-канального лазера для нормування клітин і 800-канального лазера для виявлення специфічного для РСВ сигналу. Розраховували коефіцієнти 800/700 і відсоток нейтралізації, і значення ІСбсо визначали шляхом побудови чотирипараметричної кривої в сгарпРаа.

Антитіло КВІ1 було здатне нейтралізувати штами РУОВ А і РСВ В з однаковою ефективністю (ІСво 1-5 нг/мл). ЕВ1 також продемонструвало більш ефективну нейтралізацію РСВ у порівнянні з контрольними антитілами. Див. Фігури 2А-В і Таблицю 4.

Таблиця 4

Здатність КВІ1 до зв'язування і нейтралізації в порівнянні з контрольними антитілами 00000 1ЙУМУ мя | вовмою | ковементот ргб ЇЇ 7771717ляю1 17711117 -11111111111136111111111 25980

АМ22 | 777/ляї 77771717 -111111111111115О1111 11111728 131-2А, мишаче щ/- щ 1046 510000

МіПіроге мишаче

МРЕВ 01777501 066146

АМІЄ Їх 17771717 -1111117111111132 | 77111190

Визначення афінності зв'язування КВ! для форми "до злиття" і форми "після злиття" Б- білка: кінетичну активність зв'язування антитіла КВІ до Е-білка РСОВ людини (одержаного, як

Зо описано в прикладі 1) вимірювали методом поверхневого плазмонного резонансу з використанням системи ВІіАСоге Т200 (ВІА;Соге, СЕ Неайпсаге, Різсаїамжау, МУ). Приблизно 5000

ЕО антитіл проти дос миші, СЕ Неаййсаге, каталожний номер ВК-1008-38, або приблизно 13000

ЕО антитіл кози проти Їд щура, специфічних для фрагмента Есу, дУаскбоп ІттипокКезеагсй, каталожний номер 112-006-071, іммобілізували зв'язуванням через аміногрупи на сенсорному чипі СМ5 серії 5, каталожний номер ВК-1005-30.

Сенсограми зв'язування за виключенням фону використовували для аналізу констант швидкості асоціації (Ка) і дисоціації (Ка), а також рівноважної константи дисоціації Ко. Одержані набори даних підганяли до моделі Ленгмюра для зв'язування 1:11 з використанням оцінної програми ВІіАСоге 1200 (версія 2.0). У Таблиці 5 наведені значення афінності антитіла до БЕ- білка РСВ людини при зв'язуванні з формою "до злиття" і формою "після злиття" Е-білка РСВ.

Таблиця 5

Вимірювання афінності КВ1 відносно форми "до злиття" Е-білка і форми "після злиття" Е-білка

РСВ з використанням ВІАСоОге

КВІ дуже сильно зв'язує форму "до злиття" Е-білка з Ка -31 пМ. Величина Ка для зв'язування форми "після злиття" була на порядок нижче, 0,41 нМ. Величина Ка для 025, наведена в публікації міжнародної патентної заявки Мо УМО 2014121021 А1, становила 57 пМ.

Крім того, антитіло КВ1 залишається довше зв'язаним з формою "до злиття", ніж з формою "після злиття", Е-білка, про що свідчать більш низькі швидкості дисоціації 1,4х10- у порівнянні зі швидкістю у випадку форми "після злиття" Е-білка.

Приклад 3. Картування епітопів антитіла КВ1

Епітоп зв'язування КВІ на Е-білку "після злиття" картували методом аланін-скануючого мутагенезу. Картування епітопа було проведено з використанням мутагенезу методом дробовика в компанії Іпіедга! Моїесціаг, як описано (Оамідазоп апа Рогап7, 2014, Іттипо!іоду, 143(1):13-20). Для конструювання бібліотеки за допомогою мутагенезу методом дробовика експресійний вектор Е-білка РСВ піддавали мутагенезу для створення бібліотеки клонів, кожний з яких представляв окремий точковий мутант, при цьому були кумулятивно охоплені всі залишки в білку. Були сконструйовані бібліотеки з використанням аланін-скануючого мутагенезу, який являє собою більш контрольований метод визначення внеску бічних ланцюгів кожного залишку. З використанням напівавтоматичних роботизованих операцій, кожну мутантну плазміду індивідуально клонували, секвенували, одержували міні-препарати і розміщали у форматі 384-ямкового мікропланшета для багаторазової трансфекції, експресії і аналізів зв'язування антигену в клітинах людини. Виконували скринінг бібліотеки, одержаної методом аланін-скануючого мутагенезу, проти КВІ1 на втрату зв'язування антитіла. Два залишки, аргінін- 429 і ізолейцин-432, були ідентифіковані як критичні для зв'язування КВІ1. Див. нижче і Фігуру

ЗА. КВІТ, судячи з усього, являє собою мАт до сайта ІМ (101Р-подібне), а антитіла, що зв'язують сайт ІМ, як повідомляється в літературі, зв'язують як форму "до злиття", так і форму "після злиття" Е-білка.

Здатність до зв'язування (95 ДТ)

Автори винаходу також провели спільну кристалізацію Бар КВІ з формою "до злиття" БЕ-

Зо білка для кращого розуміння зв'язування епітопа. Дані дифракції одержували від кристалів з розрізненням 3,4-3,5А. Антитіло ВІ зв'язується з формою "до злиття" Е-білка за допомогою взаємодій з петлями СОК як важкого, так і легкого ланцюгів. Петля СОКЗ легкого ланцюга взаємодіє з бічним ланцюгом Агд429 за рахунок утворення двох водневих зв'язків між атомами кисню карбонільних груп Рпез9і1 і І ец92 і атомами азоту гуанідинових груп Агд429. Також на легкому ланцюзі, А5зр50 і бІц55 у петлі СОК2 розташовані так, що утворюють водневі зв'язки з

Азп426 і Ї уз445 у РСВ. Екстенсивні взаємодії здійснюються через петлю СОКЗ важкого ланцюга

ЕВІ, що за рахунок Туг104 і Туг110 утворює поверхню для вандерваальсових взаємодій з Пе432 у РСВ. Гуз433 у РСВ утворює водневий зв'язок з А5п107 у петлі СОКЗ. Судячи із кристалічної структури, легкий ланцюг КВІ також укладається напроти Сіш1б61 і бег182 або сусіднього мономера тримера "до злиття" РСВ.

Зв'язувальний епітоп, ідентифікований для КВІ1, є висококонсервативним серед 944 з 946 послідовностей Е-білка, описаних у літературі. Це свідчить про те, що очікується дуже низька стійкість до антитіл, спрямованих на дану область.

Приклад 4. Анти-РСВ активність антитіл проти РСВ у тваринній моделі

Антитіло КВІ1 порівнювали з 025 і палівізумабом з точки зору можливого захисту в моделі зараження бавовняного хом'яка. У дослідженні використовували антитіла палівізумаб, 025 і

ЕВІ, введені в дозі 2,5 мг/кг і серійно розведені 10-кратно до 0,25 мг/кг. У даній моделі пасивної імунотерапії бавовняним хом'якам вводили КВІ, 025 або палівізумаб у різних концентраціях у день й0 і через один день заражали 105 БУО РСВ. Титри заражувального вірусу РСВ у носі і легенях визначали через чотири дні після зараження і використовували для визначення поширення вірусу в аналізі бляшкоутворення.

Бавовняні хом'яки

Щонайменше п'ять бавовняних хом'яків (Зідтодоп Пізрідив5) у віці 3-7 тижнів із середньою масою тіла приблизно 100 г одержували з БАСЕ І арх (Воуепомп, РА). Звичайний корм для гризунів і воду надавали тваринам ай Ірйит.

Антитіла 100 мг ліофілізованого палівізумабу (Муодегт, Моггізїомуп, РА) розчиняли у воді до концентрації 100 мг/мл. Інші антитіла були експресовані і очищені у власній організації.

Препарати антитіл

Буфери формулювання були підібрані для кожного антитіла з метою стабілізації білків і запобігання осадженню. Препарати були наступними: ЕВ! і 025 розводили в їх фосфатно- сольовому буфері, рН 7,2. Палівізумаб формулювали відповідно до рекомендацій виробника, розчиняючи в дистильованій НО, у результаті чого білок знаходився у буфері, що містить 25

ММ гістидину і 1,3 мМ гліцину, при рН 6,0.

Приготування розчинів для дозування, введення і аналізи

П'ять тварин у випадковому порядку зважували для визначення середньої маси тіла в експериментальних групах. Препарати приготовляли приблизно за годину до введення тваринам. Заморожені маточні розчини антитіл розморожували в льодяній бані тільки один раз.

Кожне антитіло розводили до відповідної концентрації дози, яка має бути введена тваринам у кожній групі. У день 0 (початок дослідження) тварин, розподілених у кожну групу випадковим чином, злегка анестезували з використанням 1-495 ізофлурану і вводили 0,1 мл внутрішньом'язово в правий чотириголовий м'яз шприцом 260 з голкою. Тварини відновлювалися після седації протягом двох хвилин. Через 24 години (4/-2 години) бавовняних хом'яків анестезували з використанням 1-4 95 ізофлурану, збирали кров через ретроорбітальний синус, а потім негайно вводили через ніздрі 0,1 мл 1х1055 БУО вірусу дикого типу РСВ А2 або

РСВ В УМазпіпоаїоп у середовищі Е Уїльямса. Через чотири дні після інокуляції тварин

Зо умертвляли інгаляцією СО», легені (ліві частки) і носові раковини витягали і гомогенізували в 10 об'ємах буфера 5РО (глутамат-фосфат сахарози), що містить збалансований сольовий розчин

Хенка (опа), на льодяній бані. Зразки прояснювали центрифугуванням при 2000 об./хв. протягом 10 хвилин, розділяли на аліквоти, швидко заморожували і негайно поміщали на зберігання при -70 "С до тестування в аналізі бляшкоутворення.

Як показано на Фігурах 4А-О і Фігурах 5А-О, антитіло КВІ було здатне викликати 2-3109 зменшення титрів вірусу, як РСВ А, так і РСВ В, у легенях і носі тварин у дозі 2,5 мг/кг, що було аналогічно показникам 025, але краще, ніж показники палівізумабу, який був не здатний впливати на титри вірусу в носі.

Приклад 5. Конструювання Ес КВ1

Дія неонатального Ес-рецептора для ІдсС (БсоКп) у процесі перенесення гуморального імунітету від матері до плода добре вивчена. Крім того, протягом життя ЕсКп захищає Ідс від розпаду, що пояснює тривалий час напівжиття антитіл цього класу в сироватці. Див., наприклад,

Ієгаєї! еї а!., 1996, Іттипоіоду, 89:573-8. БсКп зв'язується з Рсо-фрагментом Ідс у сайті, що відрізняється від сайтів зв'язування класичних Есук або компонента Сід комплементу.

Кристалічна структура комплексу ЕсКп-Ес показала, що ЕсКп зв'язується із шарнірною областю

СН2-СНЗ до антитіла. Відмітною характеристикою взаємодії І(95-ЕсКп є строга залежність від рН. Зв'язування Ідс-ЕсКп відбувається при кислому значенні рН (6,0) у лізосомі, у той час як дисоціація відбувається при нейтральному значенні рН (7,4) позаклітинного середовища. Кисле середовище (рН 6,0-6,5) у лізосомах дозволяє ЕсКп зв'язуватися з Ес-областю |дс з зі значеннями афінності в нижньому мікромолярному діапазоні і захищати його від катаболізму.

Захищений ЕсКп-зв'язаний дО надалі переноситься на клітинну поверхню і вивільняється в позаклітинне середовище. Цей процес захищає антитіла, зменшуючи їх схильність до позаклітинного розпаду.

Була проведена генна модифікація Ес антитіла КВІ у спробі збільшити тривалість часу напівжиття. КВ1-УТЕ являє собою похідне КВІ з потрійною мутацією (М252у/52541/1256Е (УТЕ)), введеною в Есо-фрагмент КВІ. Цей набір мутацій МТЕ приводить до посилення зв'язування антитіла з неонатальними Ес-рецепторами, приводячи до збільшення часу напівжиття в організмі людини. Див., наприклад, раїІгАсдоа еї аї., 2006, 9. Віо!Ї Спет. 281:23514- 24. Мутації в З амінокислотах (УТЕ: М252у/52541/1256Е) в Ес-області мотавізумабу привели до бо 10-кратного збільшення зв'язування ЕсКп іп міго при рН 6,0 у зразках як від людини, так і від мавп, і, як показано надалі, 4-кратного збільшення часу напівжиття в сироватці мавп іп мімо. Див.

ВобБбіє еї а!., 2013, Апіїтістор Адепів СпетоїНег. 57:6147-53.

Амінокислотні послідовності варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів антитіла

ЕВ1--УТЕ були передані в компанію Сепосгірі ОСОБА, Іпс. (Різсагаулау, МУ) для кодон-оптимізації і перетворення ІдДС1 людини, а також для тимчасової експресії і продукування в клітинах СНО.

Нуклеотидні і амінокислотні послідовності КВ1-УТЕ наведені в Таблиці 7.

Синтезовані молекули ДНК субклонували у вектор рТТ5 для експресії в клітинах СНО-ЗЕ7.

Рекомбінантні плазміди, кодуючі легкий і важкий ланцюги кожного антитіла, були тимчасово спільно трансфіковані в культури клітин СНО-ЗЕ7. Супернатанти клітинних культур, зібрані в день 6, використовували для очищення на колонці з білком А. Очищене ІдДО1 людини КВ1-УТЕ використовували в аналізі нейтралізації і інших експериментах з характеризації.

Приклад 6. Характеризація КВ1--УТЕ

Антитіло КЕВ1-УТЕ зв'язувалося з Е-білком в аналізі ЕГІЗА, проведеному, як описано в прикладі 1, з величиною ЕСово у діапазоні від 1,97 до 2,457 нг/мл. Див. Фігуру 6. Нейтралізуючу активність ЕВ1УТЕ і контрольного антитіла, описаного в літературі (мотавізумаб, Медіттипе,

Сайнпегзбигд, МО; див. публікацію патентної заявки США Ме 5 20110158985), одержаного у власній організації на основі опублікованої послідовності, порівнювали відносно штаму РСВ А

Гопд (АТС номер МК-2617М) і штаму РСВ В УМазпіпдаїоп 18537 (АТСС номер МК-158071М).

Тестовані зразки серійно розводили в три рази в ЕМЕМ з додаванням 2 95 інактивованої нагріванням ЕБС для одержання одинадцяти концентраційних точок. Потім серійно розведені зразки змішували з рівними об'ємами середовища ЕМЕМ з додаванням 2 95 інактивованої нагріванням ЕБС, що містить 100 БУО/ямку штамів РСВ А або В. Після інкубації при 37 б протягом 1 години 100 мкл клітин НЕр-2 у концентрації 1,5х105 клітин/мл переносили в 96- ямкові планшети, що містять суміш вірус/антитіло. Через З дні після інфекції клітини промивали один раз РВ5, а потім фіксували в 80 9о ацетоні протягом 10 хв. при кімнатній температурі.

Суміш специфічних відносно Е-білка РСВ (тАБ143-Е3-В138) і М-білка РСВ (3439) мишачих мАт (антитіла тАБб143-Е3-8138 і 34С9 одержували у власній організації шляхом імунізації мишей відповідними антигенами і імморталізації В-клітин з використанням технології гібридом) додавали в планшети і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети

Зо промивали буфером РВЗ/0,05 95 Тмееп 20, у планшети додавали біотинільоване антитіло коня проти дО миші і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшети промивали буфером РВ5З/0,05 95 Тмжеєеп. Кон'югат поглинаючого в ІЧ-області барвника зі стрептавідином використовували для виявлення специфічного для РСВ сигналу, і два клітинні барвники для нормування аналізу додавали в 96-ямкові планшети і інкубували протягом 1 години в темряві.

Після одногодинної інкубації планшети промивали, сушили на повітрі протягом 20 хвилин у темряві і прораховували в автоматизованій системі обробки зображень Гісог Аегіи5Ф з використанням 700-канального лазера для нормування клітин і 800-канального лазера для виявлення специфічного для РСВ сигналу. Розраховували коефіцієнти 800/700 і відсоток нейтралізації, і значення ІСсо визначали шляхом побудови чотирипараметричної кривої в

СтарнРавє.

Антитіло КВ1І-УТЕ було здатне нейтралізувати штами РСВ А і РСВ В з однаковою ефективністю (ІСво 5-10 нг/мл). Див. Таблицю 6.

Таблиця 6

Вимірювання нейтралізації і афінності КВ14-УТЕ для форми "до злиття" Е-білка і форми "після злиття" Е-білка РСВ міїго (нг/мл) (форма "до злиття" Е) "після злиття" Е) (М"с (с" (НМ) (М'с (с" (НМ)

Введення мутацій УТЕ в Есо-фрагмент КВІ не привело до зміни здатності антитіла нейтралізувати штами РОВ А і В іп міїго. Показники іп міго ефективності нейтралізації РСВ А становили З і 3,6 нг/мл у випадку КВІ1 і КВ1-4-УТЕ, відповідно. Показники іп міго ефективності нейтралізації РСВ В становили 1,7 і 3,49 нг/мл у випадку КВІ1 і КВ1-«УТЕ, відповідно. Кінетичні константи, виміряні з використанням ВіІАСоге, були аналогічними для КВІ1 і КВ1-УТЕ, свідчачи про те, що введення мутацій МЖТЕ в со-область антитіла не привело до зміни його антигензв'язувальної здатності.

Фармакокінетичне дослідження, що не відповідає вимогам СР. (Належної лабораторної практики), було проведено в Дослідному центрі Нової Іберії (ШОЇ І атауене, ГА). Вісім самців макак-резусів, що раніше не одержували біологічні препарати, випадковим чином розподіляли в одну із двох груп дослідження (п-4 у групі). Кожна тварина одержувала внутрішньовенно (в/в) одну дозу 10 мг/кг КВ14УТЕ або мотавізумабу-УТЕ. Зразки крові збирали до введення доз у день 0, через 0,5, 1, 3, 8 і 24 год. після дозування і через 1, 2, 3, 5, 7 і 10 днів після дозування.

ЕХЛ імуноаналізи використовували для кількісного визначення КВ1-МТЕ (людськех|РСВ|мАТ(КВ1-ХТЕ) до 1/каппа (СЕ)) і мотавізумаб-ЖТЕ (гуманізованех|РСВІ|мАтідс1/каппа) у сироватці макак-резусів.

В аналізі використовували біотинільоване антитіло миші проти каппа-ланцюга дб людини (ВО Віозсієпсе5, зап дозе, СА) як уловлювальний реагент і антитіло ЗиїО ТАС миші проти Ес- області (4 людини як реагент для виявлення (5оцїПпегпВіоїесі Віппіпопат, АГ). Установлена нижня межа кількісного визначення (НМКВ) аналізу становила 1,37 нг/мл з мінімальним необхідним розведенням (МНР) 20.

Фармакокінетику КВ1-4УТЕ і мотавізумабу-УТЕ оцінювали протягом аж до 10 днів у макак- резусів після внутрішньовенного введення дози 10 мг/кг з використанням одного і того ж аналізу для кількісного визначення КВ1--УТЕ і мотавізумабу-УТЕ. Для кожної тварини використовували некомпартментну модель при побудові кривих залежності сироваткових концентрацій від часу з використанням Ріпоепіх М/ппопіїп 6.3 (Сегіага, МОУ) для оцінки площі під кривою (АШсСо-однів).

Значення АШсСо-тоднв усереднювали для 4 тварин у кожній групі приймання препарату і представляли у вигляді середнього значення ї- стандартне відхилення. Для КВ1-УТЕ АОсо- 1тоднів- 1159--116 мкг/мл"день і для мотавізумабу-УТЕ АОсСо-тоднів- 1381-63,0 мкг/мл"день.

КЕВ1-УТЕ (позначене КВ1-ЖТЕ на підписі до фігури) і мотавізумаб-УТЕ демонстрували подібні профілі сироваткових концентрацій і фармакокінетики у макак-резусів. Див. Фігуру 7.

Крім того, було встановлено, що ФК КВІ1І-УТЕ у нижчих приматів була порівнянна з ФК мотавізумабу-УТЕ у яванських макак, описаною в літературі. Див. БаІгАсдпа еї аї., 2006, 9. Віої.

Спет., 281:23514-24.

Зо Усі літературні джерела, цитовані в даному описі, включені за допомогою посилання такою ж мірою, як якби було б спеціально і індивідуально зазначено, що кожна окрема публікація, інформація в базі даних (наприклад, послідовності в бепрапк або інформація в Сепеї!Ю), патентна заявка або патент включені за допомогою посилання. Дана заява про включення за допомогою посилання, згідно з намірами авторів винаходу і відповідно до 37 С.Е.К. 1.57()(1), повинна стосуватися будь-якої і кожної окремої публікації, інформації в базі даних (наприклад, послідовностей в Сепрапк або інформації в сепе!Ір), патентної заявки або патенту, усі з яких чітко ідентифіковані відповідно до вимог 37 С.Б.К. 1.57(0)(2), навіть якщо при цитуванні літературного джерела відразу ж не іде заява про включення його за допомогою посилання.

Наявність спеціальних заяв про включення за допомогою посилання, якщо такі є, у тексті специфікації жодним чином не применшує дану загальну заяву про включення за допомогою посилання. Цитування літературних джерел у даному описі не є визнанням того, що літературне джерело є відповідним попереднім рівнем техніки, так само, як і не є визнанням змісту або дати цих публікацій або документів.

Даний винахід не обмежений в обсязі конкретними варіантами здійснення, описаними в даному документі. Дійсно, різні модифікації винаходу на доповнення до тих, які описані в даному документі, стануть очевидними для фахівців у даній галузі з наведеного вище опису і супровідних креслень. Такі модифікації повинні входити в обсяг прикладеної формули винаходу.

Таблиця 7

Інформація про послідовності 6 фввлі-СОвВЗ /// ФЇООРШРРЕТГ/Г/Г/:/ССССС77777111111111С1С

Таблиця 7

Інформація про послідовності

ЕМОЇ МЕЗСОСІСЇ МАРОВБІ ВІ ЗСТУЗагЗЕВОЗАМОУУВОА 7 ВВ ун РОКОаГЕМІ5РІКЗЕКТУВОа ТКЕМААБУКОаВЕТІБАВОБКМІАМІ.

ОММ5І КТОДТАМУУУСТАСАРУССОСМБОУУУСІ ЮОМУУСОСТТМ

ТУ55

ВВІ М. (виділена зі РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТСАТ5ОБУВОСАГАМУМУООКРО зразка пацієнта) КАРК ЕРАБЗОІ ЕТаУРОВЕЗОЗОаЗИаТМЕТІ ТЗІ ОРЕОБАА й ц УУСООРГОГРЕТРСОСТВІ ЕІКАТ

ЕМОЇ МЕЗСОСІСЇ МАРОВБІ ВІ ЗСТУЗагЗЕВОЗАМОУУВОА

ЕВІ МН (виділена зі. | РОКаГЕМІ5РІКЗЕКТУСОаТКЕМААБУКОаВЕТІБАВОБКМІАМІ. зразка пацієнта) ОММ5І КТОДТАМУУСТеАСАРУССМЗОУУУОІ ОМУМУСОСТТМІ

УЗ

МОм СПІР МАТАТаУМНЗЕМОЇ МЕЗОСІСЇ МАРОВБІ ВІ СТ 14 ВВ УНлідерна УБаЕЗЕВОЗАМБЗУМУВОАРИКаї ЕМІЗРІКОКТУСаткКЕМАА

ЗМКОКЕТІЗЕООЗКМІАМІ ОММ5І КТОДТАМУУСТАСАРУСО

МзоУуУУаі румсосттУтУзо

МОам/5СПРІ МАТАТауМнЗОІОмМтТО5РБЗБІ БАМИ ОСВМТІТСВ 12 ВВІ Мі «лідерна Т5ОРУВОАГАМУСФОКРОКАРКИ ІРА ЕТаМРОВЕбОа5 азатувт ІЗ ОРЕОРГААУУСООГБІ ОЕРЕТЕРСОСТВІ БІКА т

АЗТКОаРБОМЕРІ АРОЗКЗТЗИасСТАА асСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ М

ЗзаАГТ5амНтТЕРАМІГ О55ИЇ УБІ 55БММТУРЗББИТОТМІСММ

Константний домен МНКРОЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇ І СОРБМРІ ЕР 13 важкого ланцюга - РКРКОТІ МІЗАТРЕМТСМУМОУМЗНЕОРЕМКЕМУ УМОСМЕМН юс МАКТКРАЕЄОММЗТУВУМУ5МІ ТМІ НОВУ МСОКЕУКСКУ ЗМК 9 АЇ РАРІЕКТІЗКАКЕИОРАВЕРОММУТІ РРОВОЕЇ ТКМОМУБІ ТО М

КаЕєМРБОІАМЕМЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О5РаБЕРІ УБКІ Т

МОКЗАМОСОамММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКБІ 5І Рак

Константний домен | МААРЗМЕІЕРРБОЕОЇ КЗОСТАЗУМСІ І ММЕУРКЕАКМОУКУД 14 легкого ланцюга НКСОБОМЗОЕЗМТЕОЮЗКОБТУЗІ З5ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКММА каппа СЕМТНОСІ 55РУТКЗЕМВИаЕС слестасластаатавАаатстассасвАаа,аста7астАСас ссадсасассатооСтаАвпАСсТотТоСтасСсАСАССТТТСТасАТ тєАдасттаАСаАстота|астТАталаСстасатоСасСсАаас тосАсапААлс,сасастацпААТацпАТААИТТТСАТТААдАдат

Нуклеїнова кислота, | ААААСТТАТастасаАСААААСААтАсассаса ттаталх кодуюча ЕВ1 УН ААСасСАсСатТСсАССАТСТСААПАСпСАТаАТТССАААААСАТС аСоСтТАТСТаСАААТаААСАаССтТаААААССа,аАдапАСАСАс сса,ататАТТАТТатАСТАаАасаааСбассттАСссасаатТАА

СстТосСОаАТТАСТАСТАССЯСТ ТасСАСсатотасааССААаас

АССАСОССТСАСТатТтСсТОоСтТСА

САСАТССАВАТаАСССАаТСТоСАТОСТОССТатстТасАТ статдаспйАвАСАаАаТСАССАТСАСТТаССОааАСААаТСА саАабаттАсСАсатастТАасстааТАТСААСАСПСАААССА

Нуклеїнова кислота аапАААаСТоСтТАААСТОСТаАТСТТТаАтТасстоСАСТТ 16 кодуюча ЕВ МІ. з тапвдаАдСстасайаТоССАТСААСОЯТтСоАа,аСсасАатасАтТо тасапАСАаТТТТсАСТСТСАССАТСАС,ССАСОоСсТасАасст

СААДСАттттасадастТАТТАСТатсАаСАаттсТТаАТТТО

СсСстТтТсАССТІсССсаССАсСапаАСАСаАСТасАААТСАААС аТАССОа

Таблиця 7

Інформація про послідовності сластасда,астатссАХдсаасосавса,ввовасТсатасСОо асстааСсАдатсТсТАвАСстТаАаСсТСАССа,атТаАаСоа

СстТТсТоСтТтТаАСОАТТСТаССАТОДОаСТОСИТаСаСсСАС

Нуклеїнова кислота ВСсТоСАваСААдаааАСсТвАсТапАТСТОСТТСАТСААСТ 17 кодуюча ЕВ МН " ІСТААСАССТАСЯааСасССАСААДАспАастАсассастосст (кодон-оптимізована) вАДОСаССОСТТТАССАТСАаСАпаСАСОАТТССААСААС

АТСаССТАТСТОаСАСАТОаААСАаССТаААСАССОАОСАСА

СсАаССатаТАСТАТТОСАСААДОДаспАасСтТоСТТАСасСАсО

СААСАаСОАСТАСТАТТАСЯСАСТОСАСО,СОТатаайссАСАС

ССААССАСА,СТаАССаТтаАасСтос

САСАТТСАСАТОАСТСАСТОСССТТСААа,атСсТаАаСасстТ ссатаваСОАСАпАаТОАССАТСАСАТОССОВАССАСаСС давАТаИТасС,асосеаС,ассстаасСТааТАССАаСАСАдаС

Нуклеїнова кислота, | САСОССААасСасссССААаасСтТа|астаатсттаАса,аст;асто 18 кодуюча ЕВІ1 МІ. сстапбАдвАассса,асатассстосАааст псотаасСАс,соа (кодон-оптимізована) | СТССИССАСА,ТИаТТСАСССТаАСААТСТСТАаССтТаСАС

ССстТОАОпОАСсТТассСасСТТАСТАТТаССАаСАСсТТоСсТаС

АТ ССССТТСАССТТСОаССААпаСАСАСОаСТасСсАСАТ

СААПСАСОАСС

Нуклеїнова кислота, 19 кодуюча лідерну АТОСОСОТТасСтТоСтТатАТТАТССТО ТоСТааТСаТссАСТа послідовність важкогої СТАСТаСИССаТтсССАСТСА ланцюга

Нуклеїнова кислота, кодуюча лідерну АТаСОаОСсСТааТОоСтТатАТТАТОССТОТТОоСТОааСТаасСААССа послідовність легкого | СААСТИСТатасАТАСаС ланцюга

ВсССсСТСсТАСАААсСса,аСссСстАаасСататСсССАСсТаасСТоСстТ

СТТССААСТСТАССАаСОапАппААСА,асССасСстстТааОАТО тТСстТааТОААОССАТТАСТТСССАсСАаВСсСС,аТтОАССатаТос тавААсТоТааСассСсСсТАССАаСапАСТаСАСАСАТТТС сластатастаСсАХдатостотТассСтТатАТТОССтТОаАОаСстТо сатаатТАсСатТасссТстТАасСТоССсТпаСАСССАСАС

АТАСАТСТаТААСИаТаААТСАСААДИССААССААТАСАДАСО тацпсАСААЧАдАааТСОаАаСССААаТоСТатаАТААСАСССА

САСАТОССССССТІатТОоСсСТОСтТоСсАсАХа,аСсТастТааОАсаОА

СсСстТАаСаТаттсСстТат ТсСАСССААДИССТААОСАСАССС

Нуклеїнова кислота тТаАТОАТСТСТАСаАСсСсСсСсСаАдасТОАСсАТаСсатаатаат кодуюча константний ввАСаТОАаССАСОАдаваАТССТОАСОаТОААСТТТААСТаС 21 омен важкого тТАСЯТСсОАТаИаСаТапАСаТаСАСААТаССААСАСАААОС ла юга - ІЯС. СссАаАдаАдпапАдаСАаТАТААСТОСАССТАССЯСИаТОИТатТо ланцюга 779 ТаТОСтТОАСАСТОСТОСАССАССАСТООСТОААСООСАА вОАСТАСААСТаСААватТаТСсСААТААДСаСоСТаСССаТст

ССТАТСОАСААСАССАТСТСТААОСССААДапаССАаСсСтТА вапАаССАСАСОаТатТАТАСАСТаССТоСАТССАСАСАСОА

ССТОАССААСААССАваИТтатстсТаАСАТаТСТОСТОААС вастТстТАСССТТСТаАТАТСЯССОЯТООСАХаСтТаапАпАСаСА

АТаВССАСССАСАСААСААТТАТААВАССАСАСССССТаТ

ВСстТОАСсАаСаАТаасСТоСТ СТ ТСсТатАСАССААОаСтТа

АссатавпАТААХСТОССОССТОаваСсАаСсАасаСААСаТататто асТаТатсСстТатТОАТаСАСОААаСССТаСАСААТСАСТАСА

СТСАСААСАаССТаТоССТаТСАССТОСТААА

Таблиця 7

Інформація про послідовності стаассастосстосататТТАТСТТоСССсСсСтТТСтТОдСа дасдасСстаАдАдатТсТавСАСАсСстТАаасстаататасстасті

Нуклеїнова кислота, | ЗААСААТТ ТСТАСССТССС,АпСасСсААа,сатасАаатацсААа 29 кодуюча константний | аТапАТААСЯСТОТаСАСТотТааСААТАаСсСА,аСаАаТтОоСа домен легкого тТОАССОАдаСАСОаАСТСтТААДаСАТАаСАСАТАТТОССТИаТО ланцюга каппа СТСТАСССТаАСАСТаТСТААС асССОаАТТАСОАДСАДасСАС

ААСКТаТАТАСТТатОААаСТСАСССАССАСОЯСОСтТаАаИТттТт

САССАСТСАССААаТСсАТТСААТССССОСсИаАатОс

ЕМО! МЕЗОСОЇ МАРОВБІ ВІ БСТУ5БОЕ5ЕО0О5АМОУМУВОА

РОКОаГЕМІ5РІКЗЕКТУВОа ТКЕУМААБУКОаВЕТІБАВОБКМІАМІ.

ОММ5І КТОДТАМУУУСТАСАРУССОСМБОУУУСІ ЮОМУУСОСТТМ

ТУМ55АБТКОаРБОМЕРІ АРЗБКЗТЗОСТААГаСІ МКОМЕРЕРМТ

Важкий ланцюг МБМУМ5ОАЇ ТЗаМНТЕРАМІ О5501І М5І 55УМТУРЗЗ ИТОТ 23 ВВ ТЕ МСМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕТІ СОР

МЕГЕРРКРКОТІ МІТВЕРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕМКЕМУ УСС

МЕМНМАКТКРАЕЄОУМЗТУВМУМ5МІ ТМ НОСУІ МОКЕУКОСК

М5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРАЕРОМУТІ РРОВОБ!І ТКМОМБ5І.

ТС УКОЕУРБОІАМЕМЕЗМООРЕММУКТТРРМІ О5БОО5ЕРІ М

ЗКІ ТМОКЗВУОСОа ММ ЕЗЄСЗУМНЕАІНМНУТОКОІ. БІ РОК сасатасдастаатТааААТОСЯОСсОСаСасАСТааТСАСА сстаасАВАТОССТОАсастоаастатасСса,;стадасовОос

ТТСсАВСТТСОАСаАСТоСаССАТОАДОСТОСИТОАСАСАСИ соосстТааСААл,сосСстааАатапАТСАаСТТСАТСААСА

ССААААССТАТОССОСААССААИСААТАСОЯССОЯИсстоСаИт вАдааасАааТТСАССАТТТОСАаСапАСаАСАССААСААС

АТСаСТТАССТОСАСАТаААСТОССТСААСАССОадОааАТА ссеосататАТТАТТаСАССАсАасасассссстАссвСаса

ССААТТОСОСАСТАТТАСТАССЯССТООСАТО ТСТОаСОВаССА

АПСССАСААСАСТаАССс,атадеСстТоСастАасСАССАДОСО

АоссАХасататтосоостаавссСсССАССАСаСААаАаСАС

АдасапАапААСАаассаооствастатстаатТаАААаА

СТАСТТССССОАассСстТаТаАСАСТСАаСтТасААтТАаСасо аСсТотТОАСсСсАсоссасатсСАСАССТІ ТОССОЯСТаТтоСсТОС

АдадестосааостТатАСсАа,асСстТа|атостСатТааТСАСАСТ

Нуклеїнова кислота аСссСТоСсТоСАаССсТапОСАСАСАААССТАСАТСТатТААС кодуюча важкий " ТатТаААССАСААДаСССАаСААСАССААаСаТтапАСААСААс 24 ланцюг ЕВ1-УТЕ СТоОААСССАААТССТатаАСААСАСССАСАСАТИАССССС (кодон-оптимізована) сстасссс,ессссталастаставасса7асссттосатат

ТоСТатсСсСтТоССААДаСССААдДааАТАСССТаТтАТАТСАССО

АВАСААСССОС;АсСаталсстататаатсатаАСсатсАас

САССААСАТОССТОаАСаТтСААСТТСААСТОатАТОТасСАСИ ссатавАдватасСАТААСОССААААССААДаСССАСааАдсс

ААСАСТАТААСАВСАССТАСАСССЯТОСОТО ТСОСОТОоСТОАС сатаСстТасАСсСсАааАСТааСТаААСИпАААСаАСТАСАА

АТОТААИСТСАССААСАААДаСсССтТасссастосСтТАТССАА

ААСАССАТСТОССААЧаССАААааССАаСССАССАСААССС

СсАССаТатТАСАСССТОСССССтТАасСсАЧАСАСсадастаАсс

АААААССАСИТотоССтТаТалхстасстастаАААааТ сто

АССССАаСаАТАТСЯАССОСТОСААТаСОСАААДаСААСа,асс

АВССТОАСААСААСТАСААВАССАССССТоССсаИТтасСтоаА

САССаАТаССАасСТТСТТТСТОТАСАССААХасСтТаАССстТа

САСААСАХаСАаааТапСААСААСасАасататстсСтТОастТ

ССстТаАТОСАСИАааСТСТОСАСААССАСТАТАСССАСАА есТооСсТаАасСсСТСАОССССасСААдААТОА

Таблиця 7

Інформація про послідовності

РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТСАТ5ОБУВОСАГАМУМУООКРО

КАРКІ ПЕОАББІ ЕТаМРЗВЕБаЗОБатуУвТІ ТЗІ ОРЕОБАА

Легкий ланцюг УУСООРГОГРЕТРЯОСТВІ ЕІКАТМААРБУРІЕРРБОЕОІ Ка

ВАВ14УТЕ ТАБЗБММСІ ММЕМРКЕЕАКМОУМУКУДНКІ О5ОМЗОЕЗМТЕООЗК

ОБТУ5І 55ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКУМАСЕМТНОСІ 55РУТК5ЕМА

СЕС

САСАТТСАСАТаАСТСАИатТоССсСсТТсААдатсталавсасст ссатТаваСОАСАСАСТОАССАТСАСАТаССапАССАаСС дасататас,асевасса,ассстаасттаатТАССАасСАСсАдас

СсАааСААд,васссСсСАда,астТа|астТаАтсттаАсастАасто сставдадосса,7асатассстосаастт потасАс,соа

СсТоСОпасСАСАСТаТТСсАСССТОАСААТСТСТАО,СССТасАа

ЄСтТаАдавАСтттТассастТАСТАТТаОССАОССАИТтТОоСтТОас

Нуклеїнова кислота, | АТІТТССССТТСАССТІ сСаСССААсасСАСАСасСстасасАСАТ 26 кодуюча легкий САДдаАда,аасАссатасосастоостосатат ТАТСТТОоСОоС ланцюг ЕВ1-УТЕ ЄСстТстТаАСОдасАаСТААатоТавСАСА,стАасСатас татасстастОоАдАСААТТТСТАСССТОСОваАпасССААсатТ ссдатавдАдастТасАтТААСастотасСсАаТСсТаасСААТАОС бАааваАсТоСатадССадасСАаспАСТСТААаСАТАОСАСАТ

АТТОоССТаТОСТСТАСССТОАСАСТатсСтТАДаасССаАТТАС

САСАДОСАСААСЧаИататАТасттатТаААаТСАСССАССАСа вастаАаТСсАССАСТСАССААСТСАТТСААТовСасасаА сстас

ПЕРЕЛІК ПОСВІДОВНОСТЕЙ

«1185 зага, Бафнії й. їЇск, Кака з.

Тай, віжів

Сівя, ІМЕТене

Вістетатве, паті

Яінатв, Ма. 5, Ния г Раю «1285 АНТИТІЛ, НЕЙТРЕДІЗУЮЧЕ РЕСПЕРАТОРНСИНЦИТТАЛЬНИЙ ВІРУЄ ЛЮДИНИ «133 яд 5Е НВК ваз Ццевлядя, ВД храїз 8І5-38-25 «ЕЩЯ» Це ага, «а» ЖВіБ-ВУ-Я «ваз ай «78» РаЕааКІЙйЙ чееБЯя 3,5 ч-21іВ» 1 ка1Е «їх» БЖ «43 Нева варівях «айва і шжр Зае від ит ве 1 З «Ей» 2 «ЖБі» В «22» БІЛОК «ЖІ» Мово зарівпе «аа з

Річ Езєе йщЕ Єві Еш ТВі" Ку ЗУ Бім Тве її Бі Ту А1а АТ Єві і 5 ій 5

Уаї кре вію кій Я «іїУ їж «ЗХ БІЛОК «413 Нам зарівях кааах З бік важ бро Ту йіу Б3іу йо бе дер ту Тк тк бік ев МеВ УВІ. ї 5 їв її «ех Я «УХїи «33 БІЛО «іавех Я вгЕ Твг о5ег па ар Уві йбк Бу АД ів Вїх 3 5 їв «ЕХ «Ба БІЛОК «ЖКЯ» ово 5арієнх ка 5 вар ві Хек бее ван Я Те 1 5 «УЩ8» Б «ак З «435» БІЛОК «З335 ово завіси «ах

Біб й3й РФ фер йхе Рі Бех бі Тве

ІВ ких 157 «ін БІВОХ «ІЗ» Штучна песжідовнікт «3285 «хи Важке пз Я ж звінсавнетатною замаеюене «КО бі Уві біз во чі бів бен бі бік бі їв.» Уві дев Бе йіж РЕ

Х ї їв іх

Ха кжм бен ее бек був Те лі веб біу Рі ее МК бро бер ба

КЗ я За дів меї чек їкор Узі вге бів йіз Бк бік іх Ху без біб Терощів шев Ве Жіж ух зве іже ЯНе Тук бі бір Те бух Біб Ту ва іх

Жае МАВ іх щі» кр Бве тТне їі бек Ага дер ойвев Зее був й їі1в ях Я 75 яв

Аів ТУув ів ім Меї й бек ією 15 Те біз бер Же Аж МАХ ук

Тук Сує Тк атв біж ів бто Тує ім Бі зап бек ав же тує же

ЖОВ ке 138

Біг іже бер Мах Тер оЄлу біт Ям Те ке заз те млі бе Зеє їх Іа «КіБе В «ий» ЩО «жах БЕЖ. «Зй3 Нове карі «БИ Я зв їі1е Бій Межф ТВе о бЗа бек Бе бек бе іа ев вія Зв Уві бу

З ї і ї5 азв аРШ УВІ їВе ЕЗе Те бує аке Тве бе бів йхр маі дев Бі вів «8 а зе їев ажя ТР; отже б3е жо вуз Рез бі іе5 дів бга уз цез ем Ще

Вйє йзв аія бек бек фау Біш ТвВе бію Уві Ре бжве де Вбе Бе ббу

Зде ік Бає Бір Кк жі ббе Те боае хе жа баб бан іш бій бе 8 та ТЕ Я бін хв бе дів діа Те Ту» Су БІя ій Реве свв йев рве БРО бве

ТвВе вне біж бів бах ЗМК аг осев Бін Іі ее аг ОТве

188 185 «2383 З кам» 135 «15: БОШ «ЖАХ НО ззрішлх «фа дім чаЗі біз іє ща3 53) бек Яіж іх бік іею і йев РРО БЖ аКВ ї 5 її 35

Заг рен дев і бек Гує Тк Май ек Фі Мне Бек Бе вер бер зе віз Меї бев ТРр Узі яки цій йіз го Фі С Бі ве Бі їРБр о їЗе 35 За Я5

Баг рі тіж іме Бек іч Тег Тув біб бів гне вує бів Тує й Аза ща ке -8 аг Узі ух бі аев Ре тЯе Іі чег ЯРЕ й5Ю Ар БЕР б дже 118 ка КЗ т ве

Віа тує іже бій Меж вет ев ів ух ТВе біц вер Тве Віа жай їук а 35

Тек Сух Тве ав Біу За ба Те пі Бін й За" Вр о Туг Те Тур їв 185 ма бБіж ік йвр маї Тер ім бів б3у Те ТвРомаї тів Уа) бет о Увг «ЖЕ: ХО «33» Штучна посаздевністьв яЖЖИЕ «3» Лідевня песлідавність сатах 8

Нет Б3у Тгробве Сев Же Біб іве БВе іс: ма віз Те із ТР віх ї 5 38 15 чаї жі ак «їх В сих ак кейх» БІЛОК «33» Зтучна поклідевнестіь «вх «йи3х ВІ УНН з змінекноветнима заміншиян Б лідерня песаадювнасть «ев» 15

Меж Зіу Теробее Суб Жів ТІ6 Сем ББ5 ів Уві йбзв Те дія тТве Ку 3 5 38 15 уаі міх бег бін еї бій іже ві біб бет біуУ Бім Бім ів ця дев я я зв

Кго Ф1У Агро бат ієм АР Оу баг стє Те УВІ бе бій Ве Бек ве

Я ще

Ар бок Зак йіз Веб Зеє Ттр Уа) лен біз йка бере бік феї 18 ве

Ку 55 БА

Фіз Ттр ів бег Ріє Тів іже 5егому»х ТвВе о Тує Біу біу Тв ім бів т т5 я

Тут йіж дів Зек за3 їж са йтр Ре Тче Тіз Бее йгя ав дер Зав щ5 ЕзЯ Зх

Бу5 йБа ів йіз Тук ів ФІй МеК дб Зег іже БУ Тв біб дер тях ев 195 ї58 із Маф Тує Тут Сує Тк дев Ян А1з ба Тув біж біу дяп ек Дер 115 іа 3135

Так Тук Тук біу іти йжр мні Тер с1у Бій біж Тв Хв зві ве заї їі3в їх и зве дег 5 «йійх їх а1і1з ЗЕ

«иїжх БІЛОК «аа» Зучна півсліванЯєть «вах «833» Ві У і лідерна послідовність «дез З ес бі Тгробаєе бе Еів тів Се бе іез Угі ка Тве о йбж ТВе біу ї 5 за 15 чаї Мі бек вар Хів Бій Ме Тв бій Заб Ре обее Бе св зее йід ха 5 зв бе ей БЕ Аж й маі Те І18 тк См вед же Зеб пі джр о маї агЕ ої акта бе віз Жер о Тує ія бів іш Рез Ям кт АЗе вето вже 58 БЕ ей

Беи бен ХКе Рне йер аа бе ет вві Біб Те бім ай био бек дер вх я 5 яв

Рі ев пам ее бі Бае іу Те уві Рее ТвРеб Бей Тве її5 бае ее

Е5 ва зь ве бік Рг Бі бер Ре Іа дій ТУ Ту Су ав бів рве гей бр мн 385 іа фіне бра Ре Те фе б51у бій біх Те дей із біш 118 Бу Аж Тве 115 за 35 «їй 13 кайї ЗВ «їз БОЮК «835 Ново аріємх «Ева її жів Зве Те іже біб без; его ві Бе фей із йза бга Зек бе рух 1 З 18 І ак ве бе» бік бін ТВ ака вів йев бію Си іш чаї су до т в ж за вве ве БВ Бех жа| КВ ОУжІ Зеб Трр АБ зве ім я18 реу Те бат я 5

Кі Ві ніх Те Бе Бге віз мі без іа зе де" бБішж іец Тек ожег

В 55 ві івц 5етг бет хві Уві Кат ові Рг бве бев ве ев БЖ Те бій Пе

Ти Ків Сех бе Ма бою ВЕ: бує Ру бее вх ЗВе фея Ма й ік ве за я іжж Уаі іо ба Куб бак сух йеробув Те Ні Те бує Бр Ве Кух 198 іч ІВ

Бго дія Бко Бін ей іди 539 Бу Вт ее Уві Бе без ВВя реа веЕ і їх Зе5 іже вго фу йбр ої Бе Меї жів бек вед Тк БР ЗБ Уві ТВ сш ї38 і155 дае уві узі Узі вер аі зак ніх Бін дер Бе бів Уві уз Ре бл тер ах 5 їх 158

Тук мії Яхве бів ЧЯХ бін чаї мія дб Мія Ге5 Аг був Бо йеЕ тах 7 Ух 5ів іп тує би ет ТОе Ту» дев ма зі бек узі бен ТВе УВЕ ев 185 ї55 58

Ні пів бяр Тер о вею дев пак вух із Тек вує СУБ ув хі бек дет іуз ліз іец Бео дій Мо Т3іе Бір фея Те іє бег вух ДЕ вуж БЕ бів Бе ве бів; бе» бій УБЕ Ту УКе Бош Вей буз Зае вид й Бе

ЖЖВ аа 35 жав

Мо бів" биБ Як ія За Хеб їен ТвВе Сук бе УВІ іт бік бче тує

Ртз бак дер її5 віз Узі іч те біз сае Аа Оз ів ро «ів йяй яка Я Кз дек Ту 5 Так Те орго Бо Уві рем о йей Беб йжре б3у Зек Бме вна -Т5 ВЕ шк їв Ту баг у ву Те ма) АБю же Зве ве Те Бій ав обію Аєй 81 Ре зав Суб зва Узі УЖ іє зЗін Віз Без Ніє Ват ММЗ Те ТВе за ЗІ5 Зав іп ге его ів ее рац беєе вт 1 ж зах з3а «яайз «ії: БІЛОК «аа Бра арія «ВЕ Я

Ма3 віз Дів бго бек о уаї вне ї3ю ВНе Вега Вес бек дер Сім бій Ше 1 а 18 15 ву вве ія їКе аів ее ма жі сСух Бе фен да йБй бе Гує Ре ка я З век бів віз 5 Уві пів зброї ВЕ азродхв дів Бен ія Баг лу

З и З йзпойег БІ бі Бек Уві ївВг обі бій йзр бек фу бер бек ТВжЖ о Тує

Б З я

БР жи ЗР Бе Зве ро ТвВе бен бек бум вів дер тує бін мб нів іх чаі Тує віз Сує Бію Мн1 Тже ні Біж БїЇх бер бве Бек вка чаї

К5 а ще

Те жк ояее Бне аби дер о біу зів Кук 158 МЕ «3 83 гі» ДН «ДЯ» Зручна несязденніств

ХВ

«253 В з звіноевслетнаю завів хай» 5 вив ЕЕевик завів фев зеве ТТвеСЗсввВ сЯВЕВеВЕ сстиавеКе ва тссішсясви ХІБСТДЕВІ сашстТіКЕас КееКсВЕстВ МЗС сЕКНЕ содксвЕне ЖІ тсайивахри весівшаиов вакзанткУє зЗібзавиетв азасетатве тери асизав ТЯ язаїТасЕссК сЕосТяскаЗ вашої вссзтстсав яЗЕекнакес свазавкяке 588

Ждссівістяє зяаінавсвя сестжаезаєсс каяивсвсяи СеКЗНКаКТа гТдКастяя зав

ВЕВВсЕссЕТ невБевЕЇВа єтесвНЖТВе Іастасеете Траст вешссопеве ка зссасЕВТКА КІЕСКТЄСКЕ В зи

ХЕ 16 «ЖКі» б каз ДНЕ «Ж» обме: завів; «айв 1 шасаєсслюв Екаєтсавтс фекатЕєтТеЕ ЄТНІСТреаї стТЕїлеБАЮХ сараБОСасє ва зксасітикк везказкосз шеЗсЕКОжна рЕкшекееи сстваЕВіса заЄзувнасся 128 верзавостїс сіБнасієсї виїсхЕТЕнї шЕсТссавії ТЕКА ЗдЕ БЕЖсССГаТСВ їівй

НЕТ ЕсЕ ЕСЗВТННаЇС ТЕНІЯСНЕВКЕ стсВеККіса ссатсВНаК соЕВеЗКоСК зе

КЗЗ савеїтєатїз сідтєвосзеЕ ТКТЄТТЕВЕЕ їссстїїсас сбісвис ее ох кВдсяских СНЕЗаассве вон аСЕ У «лів» її «йіїх 381 «іх ВК «ЖіЯ Штучна пюглідакість «ве «ЖЖЯз КН УМ. кое сттмех сви я «ак У

ЕЗКЕБІЖсЗЕс ЕКТсЕВКНЕ сеЕЕКЕЖКЕК сСІБЕТвонЕС сККЕКСВЕККХ КкінавакстВ ща зЕсівсясеЕ кеаЕСеЕСТК сте Іївас важкі ВВБСТеБЕї ве ВишеК в-е

ЕВ; ВОІВ Виїсзесє зісзаКеске зрасстасвй срихасвяяе В кавтасвесв сТЕєсвідаВ ВЕЕССЕАЇЕЄ зсєатсавея вра вс сзаюваснЕЄ зва

ЕсКТВКстЕЄ ВЕЗКЕВаКак сстраавоєх Фааквсасви ссржЕТаста ЇтвеВвсаВЕВ зва

ЕВЗВСЕССІК зсовзоиеве свИсЮаетих КЗЕСВСВВИЄ БеДесВЕнВа векЗсавНЕВ зва жвЕсвслеткяа кЕжКваТС Є 83 «гівх З з21іх ЗУ «325 ДЕ «8155 Штучна пеаслідочнасть «ДВ» «аа» НІ У. кодове птне і жна аний «Ва» БА

ДисВЕКеВа ЗЮнсТеВВс вКесттсяаиТ сТШаВСВЕек сосБТЕВВСЕВ саБЯВКваЄ в вксавгаївсх вевссявска КРИТЕЇНКви ЕБСВХССЕЕЕ СКСБЕТВССЯ шдевнаВЕсеа ТЯ шКеНаЕЕссе сКВБЕКТЕЕКЕ КНеСеТТЕВиС ЕКІЗВСУКес ФнЕВНаКснй скан КоКе ке

ЗЕКТЕЕТсТВ ВЕЗБЕВЕЕСС клдеасявіВ ЕСсЗессєвв сВаТсЕстав сетвевессх а

ЖеЕНеКІБКЕ с«свссквкта ЗЕдксанкан іст квшнВк Бекссктсв СтакЕнекаВ зав шкеВсасряи ХЕЕанатсяя даВЕаее За? аа «Кіз 5 «ах ВК «ТЯ штучна песлідоаність «гав» «хх йідерна послідовність важжокє авг «шах ІЗ аквжеіЖВЕ секта так сетвжжсств яежессВевЕ стВсСтВЕЕВЕ ссжетев 5 «ахах хв «аж 57 «зжоз ДЕК «аїЇ35 Штучна яасжідовієть ких «ЖЖ бідиреа пеклідоанієть люте линшюга «ай. В яТЕЕЕСТЕЕХ ССтЕЕНЕКТОХ сетВЕТсеВВ шЕКреавсгю СВесТВКВКЕ деакаще ЖІ «385 5 ху» 7 Й «ВрйвУ ді вссїстасва завис осае СЕБЕ оссв сідшстесех сібсевавтє Кассввсвра яке яшавсаквсся сіскдвваїи стіна Зк вата сзиеЕсКсЕК ДЗсСКЕВКсЄ 12 тЕКазстєкЕ кс сетКах Как снКЕКВ. свсвеВеКтс сВКсЖЕЖКСК Все жекеЕ ЗЕ

КЕБХІТЕТАСЕ сестіВавеТЕ еВТЕБЕЖасс БІД сТвВ детокс КЕВКЕ саксеаВНа ЯКЕ твсасстака зсеснаяв сазксгавня звсзевавае зер еааЕаи БЕХсВавесе ЕЕ аавігствтв віввазссеа сасвівскес СЕЕТЕІСсТВ сжссовенЕсх кехжЕКВКма АЖ «сТНшСЕВНІ СЕС С весожаЕксї зашшесекеЕ ЗБЕ САБЕЯКССКе хе

Ввршквасях яскіншЕниЕ пезсКсванє сесававаїс стра кнаа Ве КавоаЕ че

ХвскускасЕ ВОВК ВЕЕХ всзситЕсс Задасвезшє ссБешНЕВ КеВЕКафевс в

Жеслестнсє нежінеснОс сКЕВстивВеВ ВішетвеВсє ВЕ ТЕЕСХ шаеснЕсСНаЕ ще язЗЕОсанИї презенти сазан сід СЕЗ КЕаЕВа ВасСЯКЄТКЕ НЕ ака несеДесТаХ ВЕК вка Тиси «ви ТЯ

ТЕДНЕНІа ВссввиТЕК БСкВасаткІ сідштЕНВаи ШжККЕБакеК ЕКЕКВКаКО КК

БеСЕККЕОИЇ пЕраедеюсяя фЕМссЖжесеВ КаКІасВЕЕ зкавуатсве Вест ВЕ вх ства є ЗЕ ЗЕДЕК ЕСЕ ЕЖЖТСЕВИ арозврисва ке везиая дУкесннкие зад серсакажки зскініїкак скік інКи іде сект Ве ТеВствсеКХ ЗЕ свЕНаЕВНюс ЄЕЖсссїОтх всстветвяа ще за як «ах 35 «йІаз ДНК «ЖЕЗХ Нова зріст: «Я М вІдЕссяеТе «СтстЕуВ Хиїсстског ссктсідяси ЗКсадетиаа КеСтваєЗся БВ

ЕСТаКСЕКЕН СЕІБКИНЇ павсватетс їн сісвЕв звЕссВевне КсЗЕЇКНане 128 кевяасачси сіствес березні сЗЕЕВаККеВ ЕВБсжванса вті ааЕ зав кабакевеке зіісссіміс стстаєсськ оасвсівкс звкежКекта сенавсве КО звшитаТв сІТнтЕНаЕт сасссвссяк КЕЕСТЕеКІЖ свскаЕжкає свяджкасте Зав

ЗаКЕРНЕВСИ ВТК Б

Claims (19)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Виділене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з Е-білююм РОВ людини, причому антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, містить СОВ1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 1, СОВ2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 2, СОВЗ варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБЕО 10 МО: 3, СОВІ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 4, СОВ2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІО МО: 5, ї СОВЗ варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ХЕО 10 МО: 6. бо

2. Виділене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, що зв'язується з Е- білком РСВ людини, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має щонайменше 90, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичності з 5ЕО ІЮ МО: 7, і/або варіабельну область легкого ланцюга, що має щонайменше 90, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичності з «ЕО ІЮО МО: 8.

3. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1 або 2, причому антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, зв'язується з формою "до злиття" Е-біль»а РСОВ людини з величиною Ка від приблизно 1х109 М до приблизно 1х1072 М при визначенні методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад ВІАСОКЕ) або аналогічним методом (наприклад КіпЕха або ОСТЕТ).

4. Виділене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за одним із пп. 1-3, причому антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 8.

5. Виділене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 4, яке являє собою повнорозмірне антитіло, що має два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, при цьому кожний легкий ланцюг містить: варіабельну область, що містить 5ЕО ІЮ МО: 8, і константну область легкого ланцюга каппа людини 5ЕО ІЮ МО: 14; і кожний важкий ланцюг містить: варіабельну область, що містить ЗЕО ІЮ МО: 7, і константну область ЇдДе1 людини ЗЕО ІЮ МО: 13.

6. Виділене антитіло за п. 4, яке містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 23, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 25.

7. Виділене антитіло за п. 5, яке відрізняється тим, що амінокислотна послідовність важкого ланцюга складається з амінокислотної послідовності ЗЕБЕО ІО МО: 23 і амінокислотна послідовність легкого ланцюга складається з амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО: 25.

8. Виділене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким із пп. 1-7, яке являє собою дос антитіло.

9. Виділене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким із пп. 1-8, яке являє собою антитіло, продуковане в клітині СНО.

10. Експресійний вектор, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну область легкого ланцюга, яка містить Зо ЗЕО ІЮО МО: 8, та варіабельну область важкого ланцюга, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 7.

11. Клітина-хазяїн, яка містить експресійний вектор за п. 10.

12. Клітина-хазяїн за п. 11, яка являє собою клітину Ріспіа або клітину яєчника китайського хом'яка.

13. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким із пп. 1-9 і фармацевтично прийнятний носій або розріджувач.

14. Спосіб одержання антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким з пп. 1-9, який включає: а) культивування клітини-хазяїна, яка містить полінуклеотид, кодуючий важкий ланцюг і/або легкий ланцюг будь-якого з антитіл, або їх антигензв'язувальних фрагментів, за пп. 1-9, в умовах, сприятливих для експресії полінуклеотиду; і р) витягання антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, із клітини-хазяїна і/або культурального середовища.

15. Спосіб профілактики або лікування РСВ-інфекції у пацієнта-людини, що включає введення пацієнту ефективної кількості антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь- яким із пп. 1-9.

16. Спосіб профілактики або лікування пов'язаних з трансплантацією РСВ-інфекцій у пацієнта- людини, що включає введення пацієнту ефективної кількості антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким із пп. 1-9.

17. Спосіб за п. 16, в якому антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, вводять у комбінації з додатковим профілактичним або терапевтичним засобом.

18. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким із пп. 1-9 для застосування в одержанні лікарського засобу для: а) профілактики або лікування інфекції або інфекційного захворювання; або р) профілактики або лікування респіраторних захворювань і ускладнень після трансплантації, пов'язаних з інфекцією.

19. Застосування антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за пп. 1-9 або фармацевтичної композиції за п. 13 в одержанні лікарського засобу для лікування або профілактики РСВ-інфекції.

Зв'язування форми 4- «до злиття» Е-білка ! --025 4 що «Ш-Синагіс

3. ИН . и г 2- й в. М а І ДІ я І 1- // 0 Я п в ОО 0001 01110 ОО001 ОХ 1 100 Концентрація антитіла (мкг/мл)

Фіг. А Зв'язування ворми 4 «після злиття» К-білка і . --025 4 «Ж Синагіс - урни -к- КВ ще и І 7 «б ті й їй -- ух 51, 1 ГАЙ 14 Ї 0 пері т ші не о х третя 00000 0000 о ОО 00 1 100 концентрація знтитіла (макг/ми

Фіг. 16

Нейтралізація штаму РСВ А ок 100- нраа --- 025 І050-7.011нпМЛ ЕЕ у А синагіс |С5Ос:245.1 НИМ М ти «-к-- ВВ 15054 ном 50 Ї - рою? ло? лото Концентрація (нг/мл) -50-

Фіг. 2А Нейтралізація штаму РСВ.В Мазінпроп 100- її КИНЕ --- 025 1С50--49,95НГ/МЛ Ти -Й-Синагіс |С5О-216.7нИМл шк і. -Ж-- ВВ 1С50-5.З7НИМЛ я 05 -Ж/ / хе 0 окккккжктккк т г сон ; в Ю 10 10 Концентрація (нг/мл!) че В -

Фіг. 28

ОВ щ оосютдд вх, ї ТЕ Я я п 7 я т - че т ува во с р нях, - яв узи ше ці вив Б КУуУх я у тек ВК й а 7 как св її Ех, одн В КК В В МО В саму аж ол іш. вою тн ва у оту о ПН я шо Умови ОБО 5, сни й З о рою и Бак а окщочяко і у о, нт с В і та 5 ше ЯК КТ МОЖ хи я ВК Ви жк В - ї й

Фіг. ЗА КВІ Раб проти мАт 025 00: І З Мутантні клони в ! і еКлючові клони і я . КУ б | Й зе жор | бо ж КІ з | ща О і й Фе Ж т 0 і 2 е оч ; й ЕКО | - 2 ча -Й ро де я зе ж | ре Вб. Є с р в ще в щі в в'я вк а г а 0100 з З КХ Я її ве о | п уні як в, с, дх б са й й 0 100 200 З00 БА мАт 225 (Середня інтенсивність флуоресценції, 2 від ДІЇ

Фіг. ЗВ

Ефективність в легенях проти КОУ-А В ж че г в Кл я шо й ца -- КВ Легеня А --025--легвня А бло! Од Мем)

Фіг. 4А Ефективність в легенях проти Н5У-В о й ф М в с 25 чий м що ф 4 КВ Легеня В - - 4 025-Легеня В юю юю? од (мкгмл)

Фіг. 48

Легеня: К5У-А (опо) с їх В яна В ря де» без СЗНВІ 5 Ба 025 ЕЗКОнтроль їх в ш ЖЕ Ж Б Її щ й жо соєю є св ЛІКУВАННЯ

Фіг. АС Легеня: МБ5У-В (Мавв) д- міх ї в 43 кВ я КИ ї ш ! ше г 5 се дн ШЕ СК 8 | ка 025 ЄМКонтроль Кк «ев «з с «с ЛІКУВАННЯ

Фіг. 40

Ефективність у носі проти Н5У-А б Х 44 б МАТ ж хх в М» -к- КВ1-НіСА --025-НісА юю о! 102 оо мкг мл!

Фіг. зд Ефективність у носі проти К5У-В ви и, и й, -Б- КВІ-нісв й «к- 025--Ніс В лоб юю? од (мкгимл)

Фіг. 5

Ніс: Н5У-А (опу) в як. Е ня Й Е г В з т 4- М ї-е г Ех й 24 СТВІ ВТ 3025 ЕЗКОонтроль Що кб Ж ОЇ : : із ех с З о с с с с ЛІКУВАННЯ фіг. 52 ніс: К5У-В (Мав) ї др й ВО В ; ТЯ 2-8 СІ КВ! С щ2025 СУКОнтроль Я ЛЕ Ж сш Ж В - З З 5 г ча ЛІКУВАННЯ

Фіг. 50

Зв'язування КВІ1-УТЕ з Бебілкам РСВ А методом КБЕМА - / я І ж 2 й / ЕВ1-УТЕ контрож 14 / во | ам ОО и, -й 0 й 4 Гео Кону. нем

Фіг. б 15-М100-7265, ФК у маканхревусів, в/я 10 мг/кг

0 в. х т е а ВВІ-ЖЕ 5 0-4 ШИ 8 4 -- Мотавізую «МЕ, НМА нгйяя 0 й 4 в 8 то Чан гідні)

Фіг. 7