[go: up one dir, main page]

UA127432C2 - Олігонуклеотид для зниження експресії pd-l1 - Google Patents

Олігонуклеотид для зниження експресії pd-l1 Download PDF

Info

Publication number
UA127432C2
UA127432C2 UAA201810179A UAA201810179A UA127432C2 UA 127432 C2 UA127432 C2 UA 127432C2 UA A201810179 A UAA201810179 A UA A201810179A UA A201810179 A UAA201810179 A UA A201810179A UA 127432 C2 UA127432 C2 UA 127432C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
oligonucleotide
nucleosides
antisense oligonucleotide
conjugate
group
Prior art date
Application number
UAA201810179A
Other languages
English (en)
Inventor
Люккє Педерсен
Люкке ПЕДЕРСЕН
Хассан ЯВАНБАКХТ
Малєне Якеротт
Малене ЯКЕРОТТ
Сьорен Оттосен
Сёрен ОТТОСЕН
Суфалон Луангсей
Original Assignee
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of UA127432C2 publication Critical patent/UA127432C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

Винахід належить до антисмислового олігонуклеотиду, який здатний знижувати експресію PD-L1 (ліганд-1 запрограмованої смерті) в клітині-мішені. Даний олігонуклеотид гібридизується з мРНК PD-L1. Винахід також належить до кон'югата олігонуклеотиду, фармацевтичної композиції і способу лікування вірусної інфекції печінки HBV (вірусу гепатиту В).

Description

ОБЛАСТЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід відноситься до олігонуклеотидів (олігомерів), які є комплементарними ліганду-1 запрограмованої смерті (РО-І 1), що призводить до зниження експресії РО-І1 1 в печінці.
Даний винахід також відноситься до способу полегшення вичерпання Т-клітин, викликаного інфекцією печінки або раком в печінці. Релевантними інфекціями є хронічні інфекції НВМ (вірус гепатиту В), НСМ (вірус гепатиту С) Її НОМ (вірус гепатиту 0) і паразитарні інфекції, подібні малярії і токсоплазмозу (наприклад, викликані протистами Ріазтоадішт, зокрема, видами Р. мімах, Р. таїагіає і Р. Таісірагит).
ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Відомо те, що костімулюючий шлях, що складається з рецептора запрограмованої смерті-1 (РО-1) та його ліганда - РО-11 (або В7-НІ, або СО274) - безпосередньо сприяє вичерпанню Т- клітин, що приводить до відсутності контролю за вірусами під час хронічних інфекцій печінки.
Шлях РО-1 також відіграє роль в автоїмунітеті, тому що у мишей з порушеннями даного шляху розвиваються аутоімунні захворювання.
Було показано те, що антитіла, які блокують взаємодію між РО-1 ї РО-І1, підсилюють відповіді Т-клітин, зокрема, відповідь цитотоксичних Т-клітин СО8- (див. Вагбег єї аї. 2006
Маїшге Мої 439 рб82 і Маїйег єї а. 2007 У. Іттипої. Мої! 178 р 2714).
У МО 2006/042237 описано спосіб діагностики раку за допомогою оцінки експресії РО-Ї 1 (87-НІ) в пухлинах і запропоновано доставлення пацієнтові агента, який перешкоджає взаємодії РО-1/РОБ-І1. Перешкоджаючими агентами можуть бути антитіла, фрагменти антитіл, міРНК (мала інтерферуюча РНК) або антисмислові олігонуклеотиди. Немає ані конкретних прикладів таких перешкоджуючих агентів, ані будь-якої згадки хронічних інфекцій печінки.
Опосередковане РНК-інтерференцією інгібування РО-І1 з використанням дволанцюжкових молекул РНК (дуЧРНК, РНКІ або міРНК) також було розкрито, наприклад, в УУО 2005/007855, УМО 2007/084865 і 05 8507663. У жодній з них не описано таргетне доставлення в печінку.
У Боїїпа еї аІ. 2013 МоїІесшаг Тнегару-Мисівїс Асій5, 2 е/2 описано доставлення іп мімо молекул міРНК, націлених на РО-Ї71, в клітини Купфера, посилюючи, за допомогою цього кліренс клітинами МК (природна клітина-кілер) і Т-клітинами СО8-- у мишей, інфікованих МСММ (мишиний цитомегаловірус). В даній статті робиться висновок про те, що молекули міРНК,
Зо націлені на РО-І11, доставлені в гепатоцити, не є ефективними відносно посилення ефекторних функції Т-клітин СОв-.
Підхід з міРНК значно відрізняється від підходу 3 одноланцюжковими антисмисловими олігонуклеотидами, тому що біорозподілення і механізми дії є абсолютно різними. Як описано в
Хи еї аІ. 2003 Віоспет. Віорпуз. Ке5. Сотют. тому 306, сторінки 712-717, антисмислові олігонуклеотиди і міРНК мають різні переваги відносно сайтів-мішеней в мРНК.
У УМО 2016/138278 описано інгібування імунних контрольних точок, включаючи РО-Ї1, з використанням двох або більше ніж двох одноланцюгових антисмислових олігонуклеотидів, які зв'язані на їх 5'-кінцях. У даній заявці не згадується НВУ або таргетне доставлення в печінку.
МЕТА ВИНАХОДУ
В даному винаході ідентифіковані нові олігонуклеотиди і кон'югати олігонуклеотидів, які дуже ефективно знижують рівень мРНК РО-11 в клітинах печінки - як в паренхімних (наприклад, гепатоцити), так і в непаренхімних клітинах, таких як клітини Купфера і синусоїдальні ендотеліальні клітини печінки (5ЗЕС). За допомогою зниження або сайленсінгу РО-Ї1 олігонуклеотиди і кон'югати олігонуклеотидів зменшують опосередковане РО-1 інгібування і, за допомогою цього, активізують імуностимуляцію виснажених Т-клітин. Полегшення вичерпання
Т-клітин при хронічній патогенній інфекції печінки буде приводити до відновленого імунного контролю і зниженими рівнями вірусних антигенів в крові під час хронічної патогенної інфекції печінки. Клітини природні кілери (МК) і Т-клітини природні кілери (МКТ) також можуть активуватися олігонуклеотидами і кон'югатами олігонуклеотидів за даним винаходом.
Кон'югати олігонуклеотидів забезпечують місцеве зниження рівня РО-1| 1 в клітинах печінки і, отже, зменшують ризик аутоїмунних побічних ефектів, таких як пневмоніт, невірусні гепатит і коліт, асоційований з системним вичерпанням РО-1 1.
КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ
Даний винахід відноситься до олігонуклеотидів або їх кон'югатів, націлених на нуклеїнову кислоту, здатнимх модулювати експресію РО-1І1 і лікувати або попереджати захворювання, пов'язані з функціонуванням РО-1 1. Олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів, зокрема, можуть використовуватися для лікування захворювань, при яких була виснажена імунна відповідь проти інфекційного агента.
Відповідно, в першому аспекті винаходу запропоновані олігонуклеотиди, які містять бо безперервну нуклеотидну послідовність з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 956-ною комплементарністю до нуклеїнової кислоти мішені РО-І 1. Даний олігонуклеотид може являти собою антисмисловий олігонуклеотид, переважно з гепмерною конструкцією. Переважно даний олігонуклеотид здатний інгібувати експресію РО-Ї1 за допомогою розщеплення нуклеїнової кислоти-мішені. Розщеплення переважно досягається за допомогою рекрутування нуклеази.
В іншому аспекті даний олігонуклеотид кон'югований з щонайменше одним кон'югатним угрупованням, націленим на рецептор асіалоглікопротеїну, таким як кон'югатне угруповання, що містить щонайменше одне М-ацетилгалактозамінне ((за!МмАс) угруповання. Кон'югатне угруповання і олігонуклеотид можуть бути зв'язані один з одним за допомогою лінкера, зокрема, біорозщеплюваного лінкера.
В іншому аспекті відповідно до винаходу запропоновані фармацевтичні композиції, що містять олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів за винаходом і фармацевтично прийнятні розчинники, носії, солі та/або ад'юванти.
В іншому аспекті відповідно до винаходу запропоновані способи іп мімо або іп міго для зниження експресії РО-/1 в клітині-мішені, яка експресує РО-Ї1, за допомогою введення в зазначену клітину олігонуклеотиду або композиції за винаходом в ефективній кількості.
В іншому аспекті відповідно до винаходу запропоновані олігонуклеотиди, кон'югати олігонуклеотидів або фармацевтичні композиції для застосування у відновленні імунітету проти вірусу або паразита.
В іншому аспекті відповідно до винаходу запропоновані олігонуклеотиди, кон'югати олігонуклеотидів або фармацевтичні композиції для застосування як лікарського засобу.
В іншому аспекті відповідно до винаходу запропоновані способи лікування або запобігання захворюванню, розладу або дисфункції за допомогою введення терапевтично або профілактично ефективної кількості олігонуклеотиду за винаходом суб'єкту, який страждає від або сприйнятливому до захворювання, розладу або дисфункції, зокрема, до захворювань, вибраних з вірусних інфекцій печінки або паразитарних інфекцій.
В іншому аспекті олігонуклеотид, кон'югати олігонуклеотиду або фармацевтична композиція даного винаходу використовуються для лікування або попередження вірусних інфекцій печінки, таких як інфекції НВУ, НСМ і НОМУ, або паразитарних інфекцій, таких як малярія, токсоплазмоз, лейшманіоз і трипаносомоз, або раку печінки, або метастазів в печінці.
Зо КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Фіг. 1: ілюструє типові кон'югати антисмислового олігонуклеотиду, де даний олігонуклеоід або представлений хвилястою лінією (А-Г), або як "олігонуклеотид" (Д-3), або як Те (І), а кон'югатні угруповання, націлені на рецептор асіалоглікопротеїну, являють собою тривалентні
М-ацетилгалактозамінні угруповання. Сполуки А-Г містять дилізинову розгалужувальну молекулу, ПЕГЗ спейсер і три кінцеві баіМАс вуглеводні угруповання. У сполуці А і Б олігонуклеотид безпосередньо приєднаний до кон'югатного угруповання, націленого на рецептор асіалоглікопротеїну, без лінкера. У сполуці В і Г олігонуклеотид безпосередньо приєднаний до кон'югатного угруповання, націленого на рецептор асіалоглікопротеїну, через Сб лінкер. Сполуки Д-И містять потроювальну розгалужувальну молекулу, спейсери варіюючої довжини і структури, і три кінцеві саіІМАс вуглеводні угруповання.
Фіг. 2: графік, який демонструє ЕСво (напівмаксимально ефективна концентрація) (А) і нокдаун РО-Ї1 як 95 від впливу фізіологічним розчином (Б) для сполук, протестованих в
Прикладі 2, в зв'язку з їх положенням на нуклеїновій кислоті-мішені. Клітинними лініями, в яких тестували дану сполуку, були ТНРІ (2) і Каграв (Ж).
Фіг. 3: структурна формула тривалентного саіМАс кластера (5М2). 5М2 є корисним в даному винаході як кон'югатне угруповання. Хвиляста лінія ілюструє сайт кон'югування даного кластера, наприклад, з Сб амінолінкером або безпосередньо з олігонуклеотидом.
Фіг. 4: структурна формула СМР ІО МО 766 2.
Фіг. 5: структурна формула СМР ІО МО 767 2.
Фіг. 6: структурна формула СМР ІОЮ МО 768 2.
Фіг. 7: структурна формула СМР ІО МО 769 2.
Фіг. 8: структурна формула СМР ІО МО 770 2.
Фіг. 9: вестерн-блот, який виявляє експресію білка РО-11 в печінці від тварин, індукованих полі(ІС), після обробки фізіологічним розчином і зазначеними СМР ІЮ МО. Кожний блот показує голий олігонуклеотид відносно версії того ж самого олігонуклеотиду, кон'югованої з заїЇМАс, блот А) СМР ІО МО 744 1 755 2, Б) СМР ІОЮ МО 747 1758 2, В) СМР ІО МО 748 1 759 2, ГГ)
СМР ІЮО МО 752 1 763 2, і ДУ СМР ІО МО 753 1 ї 764 2. Верхня смуга являє собою контроль завантаження - вінкулін, нижня смуга являє собою білок РО-І 1. Перша доріжка в кожному блоті демонструє мишей, оброблених фізіологічним розчином, без індукції полі(ІС). Дані миші 60 експресують дуже мало білка РО-Ї.
Фіг. 10: популяція одноядерних клітин в печінці після обробки Ф носієм (група 10 і 1), Ф ДНК- вакциною (група 11 і 2), О антитілом проти РО-І1 (група 12), А голим АСО (антисмисловой олігонуклеотид) проти РО-Ї17 плюс ДНК-вакциною (група 7) або /Л АСО проти РБО-І1, кон'югованим з (заїмМАс, плюс ДНК-вакциною (група 8) представлена для кожної групи індивідуальних тварин, і середнє значення показано для кожної групи вертикальною лінією (див.
Таблицю 18). Оцінювали статистичну значність між групою ДНК-вакцини і трьома групами обробки, і, при наявності, вона показана " між групами ("7 - Р менше 0,05; и - Р менше 0,001, і ях р менше 0,0001). А) представляє число Т-клітин в печінці після обробки. Б) представляє частку Т-клітин СО4-, і В) представляє частку Т-клітин СОв'к.
Фіг. 11: модуляція РО-ІЇ 1-позитивних клітин в печінці після обробки Ф носієм (група 1011), Ф
ДНК-вакциною (група 11 і 2), О антитілом проти РО-І1 (група 12), А голим АСО проти РО-І 1 плюс ДНК-вакциною (група 7) або ЛА АСО проти РО-ІЇ1, кон'югованим з сСаіМАс, плюс ДНК- вакциною (група 8) представлена для кожної групи індивідуальних тварин, і середнє значення показано для кожної групи вертикальною лінією (див. Таблицю 19). Оцінювали статистичну значність між групою ДНК-вакцини і трьома групами обробки, і, при наявності, вона показана 7 між групами (" - Р менше 0,05 і 777 - Р менше 0,0001). А) представляє процентну частку Т-клітин
Сов, які експресують РО-1 1 в печінці після обробки. Б) представляє процентну частку Т-клітин сра, які експресують РО-11 в печінці після обробки, і В) представляє процентну частку В- клітин, які експресують РО-1| 1 в печінці після обробки.
Фіг. 12: специфічні відносно антигену НВМ цитокіни-секретуючі клітини СОв8- після обробки
Ф носієм (група 10 і 1), Ф ДНК-вакциною (група 11 і 2), О антитілом проти РО-І1 (група 12), А голим АСО проти РО-І 1 плюс ДНК-вакциною (група 7) або А АСО проти РО-11, кон'югованим з саіМмАс, плюс ДНК-вакциною (група 8) представлені для кожної групи індивідуальних тварин, і середнє значення показано для кожної групи вертикальною лінією (див. Таблицю 20).
Оцінювали статистичну значність між групою ДНК-вакцини і трьома групами обробки, і, при наявності, вона показана " між групами (" - Р менше 0,05). А) представляє процентну частку секретуючих ІЕМ-у (інтерферон-гамма) Т-клітин СО8-- в печінці, які є специфічними відносно антигену Ргез21-5 НВУ, після обробки. Б) представляє процентну частку секретуючих ІЕМ-у Т- клітин СО8-- в печінці, які є специфічними відносно коров'ячого антигену НВУ, після обробки, і В)
Зо представляє процентну частку секретуючих ІЕМ-у Її ТМЕ-о (фактор некрозу пухлин-альфа) Т клітин СОВ8-- в печінці, які є специфічними відносно антигену Ргебз25 НВУ, після обробки.
Фіг. 13: ДНК НВУ, НВзАОЯ і НВеАяд у мишей ААМ/НВМУ після обробки антисмислового СМР МО: 759 2 проти РО-11, кон'югованим з СаІМАс (Ж), в порівнянні з носієм (ш). Вертикальна лінія показує кінець обробки.
ВИЗНАЧЕННЯ
Олігонуклеотид
Термін "олігонуклеотид" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, визначається таким чином, як зазвичай зрозуміло фахівцеві, як молекула, яка містить два або більше ніж два ковалентно пов'язаних нуклеозиди. Такі ковалентно зв'язані нуклеозиди також можуть називатися молекулами нуклеїнової кислоти або олігомерами. Олігонуклеотиди зазвичай одержують в лабораторії за допомогою твердофазного хімічного синтезу з подальшим очищенням. При посиланні на послідовність олігонуклеотиду, робиться посилання на послідовність або порядок угруповань нуклеїнових основ або їх модифікацій ковалентно зв'язаних нуклеотидів або нуклеозидів. Олігонуклеотид за винаходом є штучним, синтезується хімічно і типово очищується або виділяється. Олігонуклеотид за винаходом може містити один або більше ніж один модифікований нуклеозид або нуклеотид.
Антисмислові олігонуклеотиди
Термін "антисмислової олігонуклеотид" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, визначається як олігонуклеотид, здатний модулювати експресію гена-мішені за допомогою гібридизації з нуклетовою кислотою-мішенню, зокрема з безперервною послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені. Антисмислові олігонуклеотиди по суті не є дволанцюговими і, отже, не є міРНК. Переважно антисмислові олігонуклеотиди за даним винаходом є одноланцюжковими.
Безперервна нуклеотидна послідовність
Термін "безперервна нуклеотидна послідовність" відноситься до ділянки олігонуклеотиду, яка є комплементарною нуклеїновій кислоті-мішені. Даний термін використовується в даному документі взаємозамінно з терміном "безперервна послідовність нуклеїнових основ" і терміном "послідовність олігонуклеотидного мотиву". У деяких втіленнях всі нуклеотиди даного олігонуклеотиду складають безперервну нуклеотидну послідовність. У деяких втіленнях бо олігонуклеотид містить безперервну нуклеотидну послідовність і, можливо, може містити додатковий(і) нуклеотид(и), наприклад, ділянку нуклеотидного лінкера, яка може використовуватися для приєднання функціональної групи до безперервної нуклеотидної послідовності. Ділянка нуклеотидного лінкера може бути або може не бути комплементарною нуклеїновій кислоті-мішені.
Нуклеотиди
Нуклеотиди являєть собою структурні елементи олігонуклеотидів і полінуклеотидів і для цілей даного винаходу включають і нуклеотиди, що зустрічаються в природі, і нуклеотиди, що не зустрічаються в природі. У природі нуклеотиди, такі як нуклеотиди ДНК і РНК, містять угруповання цукру рибози, угруповання нуклеийнової основи і одну або більше ніж одну фосфатну групу (яка відсутня в нуклеозидах). Нуклеозиди і нуклеотиди також можуть взаємозамінно називатися "ланками" або "мономерами".
Модифікований нуклеозид
Термін "модифікований нуклеозид" або "модифікація нуклеозиду" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до нуклеозидів, модифікованих в порівнянні з еквівалентним нуклеозидом ДНК або РНК за допомогою введення однієї або більше ніж однієї модифікації цукрового угруповання або угруповання (нуклеийнової) основи. У переважному втіленні модифікований нуклеозид містить модифіковане цукрове угруповання. Термін "модифікований нуклеозид" також може використовуватися в даному документі взаємозамінно з терміном "аналог нуклеозиду" або модифіковані "ланки" або модифіковані "мономери".
Модифікований міжнуклеозидний зв'язок
Термін "модифікований міжнуклеозидний зв'язок" визначається так, як зазвичай зрозуміло фахівцеві: як зв'язки, відмінні від фосфодіефірних (РО) зв'язків, які ковалентно зв'язують разом два нуклеозиди. Нуклеотиди з модифікованими міжнуклеозидними зв'язками також називаються "модифікованими нуклеотидами". У деяких втіленнях модифікований міжнуклеозидний зв'язок збільшує стійкість олігонуклеотиду до нуклеаз в порівнянні з фосфодіефірним зв'язком. Для олігонуклеотидів, що зустрічаються в природі, міжнуклеозидний зв'язок включає фосфатні групи, що утворюють фосфодіефірний зв'язок між сусідніми нуклеозидами. Модифіковані міжнуклеозидні зв'язки є особливо корисними в стабілізації олігонуклеотидів для застосування іп мімо, і вони можуть служити для захисту проти нуклеазного розщеплення в ділянках нуклеозидів ДНК або РНК в олігонуклеотиді за винаходом, наприклад в межах ділянки гепа (дар) гепмерного олігонуклеотиду, а також в ділянках модифікованих нуклеозидів.
В одному втіленні олігонуклеотид містить один або більше ніж один міжнуклеозидний зв'язок, модифікований від природного фосфодіефіру до зв'язку, який, наприклад, є більш стійким до нуклеазної атаки. Стійкість до нуклеаз можна визначати за допомогою інкубування олігонуклеотиду в сироватці крові або за допомогою застосування аналізу стійкості до нуклеаз (наприклад, фосфодіестерази отрути змії (5МРО)), які обидва добре відомі в даній області.
Міжнуклеозидні зв'язки, які здатні посилювати стійкість олігонуклеотиду до нуклеаз, називаються нуклеазостійкими міжнуклеозидними зв'язками. У деяких втіленнях щонайменше 50 95 міжнуклеозидних зв'язків в олігонуклеотиді або в його безперервній нуклеотидній послідовності є модифікованими як, наприклад, щонайменше 60 95, як, наприклад, щонайменше 70 95, як, наприклад, щонайменше 80 95 або як, наприклад, щонайменше 90 95 міжнуклеозидних зв'язків в олігонуклеотиді або в його безперервній нуклеотидній послідовності є модифікованими. У деяких втіленнях всі міжнуклеозидні зв'язки олігонуклеотиду або його безперервної нуклеотидної послідовності Є модифікованими. Буде зрозуміло те, що в деяких втіленнях нуклеозиди, які зв'язують оолігонуклеотид за винаходом з ненуклеотидною функціональною групою, такою як кон'югат, можуть містити фосфодіефір. У деяких втіленнях все міжнуклеозидні зв'язки олігонуклеотиду або його безперервної нуклеотидної послідовності є нуклеазостійкими міжнуклеозидними зв'язками.
Модифіковані міжнуклеозидні зв'язки можуть бути вибрані з групи, що містить фосфоротіоат, дифосфоротіоат і боранофосфат. У деяких втіленнях модифіковані міжнуклеозидні зв'язки, наприклад, фосфоротіоатний, дифосфоротіоатний або боранофосфатний, є сумісними з рекрутуванням олігосахаридом за винаходом РНкКази Н.
У деяких втіленнях міжнуклеозидний зв'язок, такий як фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок, містить сірку (5).
Фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок є особливо корисним через стійкість до нуклеаз, корисної фармакокінетики і легкості одержання. У деяких втіленнях щонайменше 50 95 міжнуклеозидних зв'язків в олігонуклеотиді або його безперервної нуклеотидної послідовності являють собою фосфоротіоат, як, наприклад, щонайменше 60 95, як, наприклад, щонайменше 70 95, як, наприклад, щонайменше 80 95 або як, наприклад, щонайменше 90 95 міжнуклеозидних бо зв'язків в олігонуклеотиді або його безперервної нуклеотидної послідовності являють собою фосфоротіоат. У деяких втіленнях всі міжнуклеозидні зв'язки олігонуклеотиду або його безперервної нуклеотидної послідовності являють собою фосфоротіоат.
У деяких втіленнях олігонуклеотид містить один або більше ніж один нейтральний міжнуклеозидний зв'язок, зокрема, міжнуклеозидний зв'язок, вибраний з фосфотриефіру, метилфосфонату, ММІ, аміду-3, формацеталю або тіоформацеталю.
Додаткові міжнуклеозидні зв'язки розкриваються в УМО 2009/124238 (включеній в даний документ за допомогою посилання). В одному втіленні міжнуклеозидний зв'язок вибрано з лінкерів, розкритих в УМО 2007/031091 (включеній в даний документ за допомогою посилання).
Зокрема, міжнуклеозидний зв'язок може бути вибраний з -О-Р(0)2-0-, -О-Р(О,5)-О-, -О-Р(Б)2-О-, -5-Р(0)2-О-, -5-Р(О,5)-0О-, -5-Р(5)2-0-, -О-Р(О)2-5-, -О-Р(О,5)-5-, -5-Р(0)2-5-, -0О-РО(ВН)-О-, 0-
РО(ОСНз)-0-, -О-РО(МАН)-О-, -0О-РО(ОСНаСН»г5-В8)-О-,. -0О-РО(ВН»з)-О-,. -О-РО(МНАМ)-О-, -0-
Р(Ф)2-МАН-,. -МАН-Р(О)2-О-,. -МАН-СО-0О-, -МАН-СО-МАН-, та/або міжнуклеозидний лінкер може бути вибраний з групи, що складається: -0-С2О-0О-, -0-СО-МАН-, -МАН-СО-СНе-, -0-СНо-СО-МАН-, -0-Сно-СнНо-МАН-, -«СО-МАН-СНе-, -«СН»-МАиСО-, -0-СнНо-СНе-5-, -5-СН2-СНе-О-, -5-СН2-СНе-5-, -
Сно-502-СНе-, -«СН»-СО-МАНМ-, -0-СНо-СНа-МАН-СО -, -СНо-МОСНз-О-СНе-, де В" вибраний з водню і С1-4-алкілу.
Нуклеазостійкі зв'язки, такі як фосфотіоатні зв'язки, є особливо корисними в ділянках олігонуклеотидів, здатних рекрутувати нуклеазу, при формуванні дуплекса з нуклеїновою кислотою-мішенню, таких як ділянка С для гепмерів або немодифіковані ділянки нуклеозидів хедмерів (пеадтег) і тейлмерів (айтег). Однак, фосфоротіоатні зв'язки можуть бути також корисними в ділянках, які не рекрутують нуклеазу, та/або в ділянках, що підсилюють афінність, таких як ділянки Е і Е" для гепмерів, або в ділянці модифікованих нуклеозидів хедмерів і тейлмерів.
Кожна з сконструйованих ділянок може, однак, містити міжнуклеозидні зв'язки, відмінні від фосфоротіоатних, такі як фосфодіефірні зв'язки, зокрема, в ділянках, де модифіковані нуклеозиди, такі як МА (замкнені нуклеїнові кислоти), захищають зв'язок від нуклеазної деградації. Включення фосфодіефірних зв'язків, як, наприклад, одного або двох зв'язків, зокрема між або поруч з модифікованими нуклеозидними ланками (типово в ділянках, які не рекрутують нуклеазу), може модифікувати біодоступність та/або біорозподілення олігонуклеотиду - див. УМО 2008/113832, включену в даний документ за допомогою посилання.
В одному втіленні всі міжнуклеозидні зв'язки в олігонуклеотиді є фосфоротіоатними та/або боранофосфатними зв'язками. Переважно всі міжнуклеозидні зв'язки в олігонуклеотиді являють собою фосфоротіоатні зв'язки.
Нуклеїнова основа
Нуклеїнова основа включає пуринове (наприклад, аденін і гуанін) і піримідинове (наприклад, урацил, тимін і цитозин) угруповання, присутнє в нуклеозидах і нуклеотидах, які утворюють водневі зв'язки при гібридизації нуклеїнових кислот. У контексті даного винаходу термін нуклеїнова основа також охоплює модифіковані нуклеїнові основи, які можуть відрізнятися від нуклеїнових основ, що зустрічаються в природі, але є функціональними під час гібридизації нуклеїнових кислот. В даному контексті термін "нуклеїнова основа" відноситься і до нуклеїнових основ, що зустрічаються в природі, таких як аденін, гуанін, цитозин, тимін, урацил, ксантин і гіпоксантин, також як і до таких варіантів, що не зустрічаються в природі. Такі варіанти, наприклад, описуються в Нігао сї аї. (2012) Ассоцпів ої Спетіса! Везеєагсиі, том 45, стор. 2055 і
Веговзігот (2009) Ситепі Ргоїосоїв іп Мисівїс Асій Спетівігу Зиррі. 37 1.4.1.
У деяких втіленнях угруповання нуклеїнової основи модифікується заміною пурину або піримідину на модифікований пурин або піримідин, такий як заміщений пурин або заміщений піримідин, як, наприклад, нуклеїнова основа, вибрана з ізоцитозину, псевдоізоцитозину, 5- метилцитозину, 5Б-тіозолоцитозину, 5-пропінілцитозину, 5-пропінілурацилу, 5-бромурацил-5- тіазолоурацилу, 2-тіоурацилу, 2'-тіотимідину, інозину, діамінопурину, б-амінопурину, 2- амінопурину, 2,6-діамінопурину і 2-хлор-6-амінопурину.
Угруповання нуклеїнових основ можуть бути вказані буквеним кодом для кожної відповідної нуклеїнової основи, наприклад, А, Т, й, С або О, де кожна буква можливо може включати модифіковані нуклеїнові основи з еквівалентною функцією. Наприклад, в проілюстрованих як прикладах олігонуклеотиду угруповання нуклеїнових основ вибрані з А, Т, (с, Сб і 5- метилцитозину. Можливо для гепмерів ІМА можна використовувати 5-метилцитозин нуклеозидів І МА.
Модифікований олігонуклеотид
Термін "модифікований олігонуклеотид" описує олігонуклеотид, що містить один або більше ніж один нуклеозид з модифікованим цукром та/або модифікованими міжнуклеозидними бо зв'язками. Термін "химерний олігонуклеотид" являє собою термін, який використовували в літературі для опису олігонуклеотидів з модифікованими нуклеозидами.
Комплементарність
Термін "комплементарність" описує здатність нуклеозидів/нуклеотидів до утворення пар основ за Уотсоном-Криком. Парами основ за Уотсоном-Криком є гуанін ()-цитозин (С) і аденін (А)-тімін (Г/урацил (0). Буде зрозуміло те, що олігонуклеотиди можуть містити нуклеозиди з модифікованими нуклеїновими основами, наприклад, 5-метилцитозин часто використовується замість цитозину, і термін "комплементарність" як такий охоплює утворення пар основ за
Уотсоном-Криком між немодифікованими і модифікованими нуклеїновими основами (див., наприклад, Нігао еї аї. (2012) Ассошпів ої Спетіса!| Незеагсі, том 45, стор. 2055 і Вегодвігот (2009) Ситепі Ргоїосої5 іп Мисієїс Асій Спетівігу Зиррі. 37 1.4.1).
Термін "96 комплементарності" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до числа нуклеотидів безперервної нуклеотидної послідовності в молекулі нуклеїнової кислоти (наприклад, в олігонуклеотиді) в процентах, які, в даному положенні, є комплементарними (тобто утворюють пари основ за Уотсоном-Криком) в даному положенні безперервної нуклеотидної послідовності окремої молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, нуклеїнової кислоти-мішені). Дана процентна частка розраховується підрахунком числа вирівняних основ, які утворюють пари між двома послідовностями (при вирівнюванні з використанням послідовності-мішені 5-3! і послідовності олігонуклеотиду від 3' до 5), ділячи на загальне число нуклеотидів в олігонуклеотиді і поножуючи на 100. При такому порівнянні нуклеїнова основа/нуклеотид, що не вирівнюється (не утворює пару основ), називається невідповідністю.
Термін "повністю комплементарний" відноситься до 100 95-ної комплементарності.
Наступне являє собою приклад олігонуклеотиду (ЗЕО І МО: 5), який є повністю комплементарним нуклеїновій кислоті-мішені (ЗЕО І МО: 772).
Б'дсадіададссааназ' (5ЕО ІЮ МО:772)
З'єдісаїсісдонаа (5ЕО ІО МО: 5)
Ідентичність
Термін "ідентичність" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до числа нуклеотидів у відсотках безперервної нуклеотидної послідовності в
Зо молекулі нуклеїнової кислоти (наприклад, в олігонуклеотиді), які в даному положенні є ідентичними (тобто за їхньою здатністю утворити пари основ за Уотсоном-Криком з комплементарним нуклеозидом) безперервної нуклеотидної послідовності в даному положенні окремої молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, нуклеїнової кислоти-мішені). Дана процентна частка розраховується за допомогою підрахунку числа вирівняних основ, які є ідентичними між двома послідовностями, включаючи пробіли, ділячи на загальне число нуклеотидів в олігонуклеотиді і помножуючи на 100.
Відсоток ідентичності - (Відповідності х 100)/Довжину вирівняної ділянки (з пробілами).
Гібридизація
Термін "здійснення гібридизації" або "гибрідизується" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, слід розуміти як дві нитки нуклеїнової кислоти (наприклад, олігонуклеотид і нуклеїнова кислота-мішень), що утворюють водневі зв'язки між парами основ на протилежних нитках, формуючи, за допомогою цього, дуплекс. Афінність зв'язування між двома нитками нуклеїнової кислоти являє собою силу гібридизації. Вона часто описується в показниках температури плавлення (Тт), визначеної як температура, при якій половина олігонуклеотідов утворює дуплекс з нуклеїнової кислотою-мішенню. При фізіологічних умовах Тт не є строго пропорційною афінності (Мегопу апа Гасгоїх, 2003 Оіїдописіеоїідев 13: 515-537). Вільна енергія Гіббса в стандартному стані - ЛО" - є більш точним поданням афінності зв'язування і пов'язана з константою дисоціації (Ка) реакції згідно з рівнянням ЛИ" - -ВТІп(Ка), де
Е являє собою газову константу, і Т являє собою абсолютну температуру. Отже, дуже низька да? реакції між олігонуклеотидом і нуклетновою кислотою-мішенню відображає сильну гібридизацію між олігонуклеотидом і нуклетїновою кислотою-мішенню. ЛО" являє собою енергію, зв'язану з реакцією, де концентрації в воді складають 1 М, рН становить 7, і температура становить 37 "С. Гібридизація олігонуклеотидів з нуклеїновою кислотою-мішенню являє собою спонтанну реакцію, і для спонтанних реакцій ЛО" менше, ніж нуль. ЛЯ" можна вимірювати експериментально, наприклад, за допомогою застосування способу ізотермічної титраційної калориметрії (ІТС), як описано в Напзеп вї а!., 1965, Спет. ботт. 36-38 і НоІдоагїе еї аї., 2005,
Огид Рівсом Тодау. Фахівцю буде відомо, що є доступне у продажу обладнання для вимірювань да". да" також можна оцінювати чисельно за допомогою застосування моделі найближчого сусіда, як описується бапіаї исіа, 1998, Ргос Маї! Асай 5сі ОБА. 95: 1460-1465, з використанням 60 відповідним чином виведених термодинамічних параметрів, описаних Зидітоїо еї аї., 1995,
Віоспетівігу 34:11211-11216 і МеТідие еї а!., 2004, Віоспетівігу 43:5388-5405. Для того щоб мати можливість модулювання їх наміченої нуклеїнової кислоти-мішені за допомогою гібридизації, олігонуклеотиди за даним винаходом гибрідизуються з нуклетовою кислотою-мішенню з оціночними значеннями ЛО" менше -41,8 кДж для олігонуклеотидів, які мають 10-30 нуклеотидів в довжину. У деяких втіленнях ступінь або сила гібридизації вимірюється за допомогою вільної енергії Гіббса в стандартному стані - ЛО". Олігонуклеотиди можуть гібридизуватися з нуклеїновою кислотою-мішенню з оціночними значеннями ЛО" менше нтервалу -41,8 кДж, як, наприклад, менше -62,8 кДж, як, наприклад, менше -83,7 кДж і як, наприклад, менше -104,6 кДж для олігонуклеотидів, які мають 8-30 нуклеотидів в довжину. У деяких втіленнях олігонуклеотиди гибрідизуються з нуклеїновою кислотою-мішенню з оціночним значенням ла" від -41,8 до -251 кДж, як, наприклад, від -50,2 до -167,4 кДж, як, наприклад, від -62,8 до -125,5 кДж або від -66,9 до 113 кДж, як, наприклад, від -75,3 до -104,6 кДж.
Нуклеїнова кислота-мішень
Згідно з даним винаходом нуклеїнова кислота-мішень являє собою нуклеїнову кислоту, що кодує РО-11 ссавця і може являти собою, наприклад, ген, РНК, мРНК і пре-мРНК, зрілу мРНК або послідовність КДНК. Отже, ця мішень може називатися нуклеїнова кислота-мішень РО-11.
Олігонуклеотид за винаходом, наприклад, може бути націлений на ділянки екзонів РО-Ї 1 ссавця, або, наприклад, може бути націлений на ділянку інтрона пре-мРНК РО-ІЇ1 (див.
Таблицю 1).
Таблиця 1
Екзони та інтрони людського РО-Ї 1
ЗЕО ПО МО 1 ЗЕО ПО МО 1 ою) початок | кінвць/// 00) початок | кінець ев | лвавв | о лвзаї//// | 6) лвзав | 17337 е7 | пз | гою | | |! 77777711
Відповідним чином, нуклеїнова кислота-мішень кодує білок РО-І1, зокрема РО-І1 ссавця, такий як РО-Ї1 людини (див., наприклад, Таблиці 2 і 3, в яких наводиться посилання на послідовності мРНК і пре-мРНК для людського, мавпячого і мишиного РО-1| 1). У контексті даного винаходу пре-мРНК також вважається нуклеїновою кислотою, яка кодує білок.
У деяких втіленнях нуклеїнову кислоту-мішень вибрано з групи, що складається з 5ЕО ІЮ
МО: 1,2 і З або їх варіантів, що зустрічаються у природі (наприклад, послідовностей, що кодують білок РО-1І1 ссавця).
При використанні олігонуклеотиду за винаходом в дослідженні або діагностиці нуклеїнова
Зо кислота-мішень може являти собою кКДНК або синтетичну нуклеїнову кислоту, що походить з
ДНК або РНК.
Для застосування іп мімо або іп міго олігонуклеотид за винаходом типово здатний інгібувати експресію нуклеїнової кислоти-мішені РО-І1 1 в клітині, яка експресує нуклеїнову кислоту-мішень
РО-І1. Безперервна послідовність нуклеїнових основ олігонуклеотиду за винаходом типово комплементарна нуклеїновій кислоті-мішені РО-І1 при вимірюванні по довжині олігонуклеотиду, можливо, за винятком одної або двох невідповідностей, і, можливо, за винятком лінкерних ділянок на основі нуклеотидів, які можуть зв'язувати олігонуклеотид 3 можливою функціональною групою, такою як кон'югат або інші некомплементарни кінцеві нуклеотиди (наприклад, ділянка С або 0"). Нуклеїнова кислота-мішень в деяких втіленнях може являти собою РНК або ДНК, таку як матрична РНК, як, наприклад, зріла мРНК або пре-мРНК. У деяких втіленнях нуклеїнова кислота-мішень являє собою РНК або ДНК, яка кодує білок РО-І 1 ссавця, такий як людський РО-І1, наприклад, послідовність пре-мРНК людського РО-11, таку як послідовність, розкрита як ЗЕО ІЮО МО 1, або послідовність людської мРНК з реєстраційним номером ММ 014143 МСВІ (Національний центр біотехнологічної інформації). Додаткова інформація по типовим нуклеїновим кислотам-мішеням наводиться в Таблицях 2 і 3.
Таблиця 2
Інформація по геному і збірці для РО-І 1 між видами
Хр. | Нитка Геномні координати Збірка Номер доступу мРНК
Початок Кінець еталонної послідовності МСВІ" ення дня
СсМО00671.2
Яванський 15 73560846 73581371 СЕ. ХМ 005581779 макак 000364345.1 мертве нен р
СМО01012.2
Прям. - пряма нитка. Геномні координати дають послідовність пре-мРНК (геномна послідовність). Посилання МУСВІ дає послідовність мРНК (послідовність кКДНК). " База даних еталонних послідовностей Національного центру біотехнологічної інформації являє собою всеосяжний, інтегрований, ненадлишкових, добре анотований набір еталонних послідовностей, що включають геномні, послідовності транскриптів і білків. Вона розміщується на м/млу.пебі. піт. пій.дом/геїзед.
Таблиця З
Подробиці послідовностей для РО-11 між видами 77771 Вид | Тип РНК | Довжина(їну | 5ЕОЮМО
Послідовність-мішень
Термін "послідовність-мішень" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до послідовності нуклеотидів, яка присутня в нуклеїновій кислоті-мішені, що містить послідовність нуклетових основ, яка є комплементарною олігонуклеотиду за винаходом. У деяких втіленнях послідовність-мішень складається з ділянки на нуклеїновій кислоті- мішені яка є комплементарною безперервній нуклеотидній послідовності олігонуклеотиду за винаходом. У деяких втіленнях послідовність-мішень довше, ніж комплементарна послідовність одного олігонуклеотиду, і, наприклад, може представляти переважну ділянку нуклеїнової кислоти-мішені, на яку можуть бути націлені кілька олігонуклеотидів за винаходом.
Послідовність-мішень може являти собою підпослідовність нуклеїнової кислоти-мішені.
У деяких втіленнях підпослідовність являє собою послідовність, вибрану з групи, що складається з а1-а149 (див. Таблиці 4). У деяких втіленнях підпослідовність являє собою послідовність, вибрану з групи, що складається з екзонів МРНК РО-11, такого як екзон людської
МРНК РОБ-І1, вибраний з групи, що складається з еї, е2, 63, 64, е5, еб і е7 (див. Таблицю 1 вище).
У деяких втіленнях підпослідовність являє собою послідовність, вибрану з групи, що складається з інтрона мРНК РО-1 1, такого як інтрон людської мРНК РО-1 1, вибраний з групи, що складається з іт, іг, ІЗ, і4, і5 та іб (див. Таблицю 1 вище).
Олігонуклеотид за винаходом містить безперервну нуклеотидну послідовність, яка є комплементарною або гібридизується з нуклеїновою кислотою-мішенню, такою як підпослідовність нуклеїнової кислоти-мішені, такої як послідовність-мішень, описана в даному документі.
Даний олігонуклеотид містить безперервну нуклеотидну послідовність із щонайменше 8 нуклеотидів, яка є комплементарною або гибрідизується з послідовністю-мішенню, яка присутня в молекулі нуклеїнової кислоти-мішені. Безперервна нуклеотидна послідовність (і, отже, послідовність-мішень) містить щонайменше 8 суміжних нуклеотидів, як, наприклад, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 суміжних нуклеотидів, як, наприклад, 12-25, як, наприклад, 14-18 суміжних нуклеотидів.
Клітина-мішень
Термін "клітина-мішень" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до клітини, яка експресує нуклеїнову кислоту-мішень. У деяких втіленнях клітина- мішень може перебувати в умовах іп мімо або іп міго. У деяких втіленнях клітина-мішень являє собою клітину ссавця, таку як клітина гризуна, як, наприклад, клітина миші або клітина щура, або клітина примата, як, наприклад, клітина мавпи або клітина людини.
У переважних втіленнях клітина-мішень експресує мРНК РО-11, таку як пре-мРНК РО-І1 або зріла МРНК РО-11. Полі А хвіст мРНК РО-1І 1 характерно не береться до уваги для націлювання антисмислового олігонуклеотиду.
Варіант, що зустрічається в природі
Термін "варіант, що зустрічається в природі" відноситься до варіантів гена РО-І/1 або транскриптів, які походять з тих же самих генетичних локусів, що і нуклеїнова кислота-мішень, але можуть відрізнятися, наприклад, за рахунок виродженості генетичного коду, що викликає множинність кодонів, що кодують ту ж саму амінокислоту, або завдяки альтернативному сплайсингу пре-мРНК, або присутності поліморфізмів, таких як однонуклеотидні поліморфізми і алельні варіанти. На основі присутності досить комплементарної послідовності до олігонуклеотидів, олігонуклеотид за винаходом, отже, може бути націлений на нуклеїнову кислоту-мішень та її варіанти, що зустрічаються в природі.
У деяких втіленнях варіанти, що зустрічаються в природі, мають щонайменше 95 9б, як, наприклад, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 гомології з нуклесновою кислотою- мішенню РО-11 ссавця, такий як нуклеїнова кислота-мішень, вибрана з групи , що складається з
ЗЕОІЮ МО 1,2 і 3.
У гені РО-І1 відомі численні однонуклеотидні поліморфізми, наприклад, однонуклеотидні поліморфізми, розкриті в наступній таблиці (початок/еталонна послідовність людської пре-мРНК являє собою 5ЕО ІЮ МО 2). мінорного алеля ІО МО: 1 т5147367592 |АбА 77777771 -11111111111111021 11113425 ШЩГ мінорного алеля ІО МО: 1
Модуляція експресії
Термін "модуляція експресії" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, слід розуміти як загальний термін для здатності олігонуклеотиду змінювати кількість
РО-І1 в порівнянні з кількістю РО-Ї1 до введення даного олігонуклеотиду. Як альтернативу, модуляцію експресії можна визначати за допомогою посилання на контрольний експеримент.
Зазвичай зрозуміло те, що контроль являє собою індивіда або клітину-мішень, оброблену композицією фізіологічного розчину, або індивіда або клітину-мішень, оброблену ненаціленим олігонуклеотидом (імітація). Однак він також може являти собою індивіда, якого лікували стандартом лікування.
Одним типом модуляції є здатність олігонуклеотиду інгібувати, здійснювати знижувальну регуляцію, зменшувати, придушувати, видаляти, зупиняти, блокувати, запобігати, послаблювати, зменшувати, усувати або припиняти експресію РО-І11, наприклад, за допомогою деградації мРНК або блокування транскрипції. Іншим типом модуляції є здатність олігонуклеотиду відновлювати, збільшувати або посилювати експресію РО-11, наприклад, за допомогою репарації сайтів сплайсингу або запобігання сплайсингу, або усунення або блокування інгібуючих механізмів, таких як репресія мікроР НК.
Високоафінні модифіковані нуклеозиди
Високоафінний модифікований нуклеозид являє собою модифікований нуклеотид, який, при включенні в олігонуклеотид, збільшує афінність олігонуклеотиду відносно його комплементарної мішені, наприклад, при вимірюванні по температурі плавлення ("7"). Високоафінний модифікований нуклеозид за даним винаходом переважно призводить до збільшення температури плавлення від 40,5 до 412 "С, більш переважно - від 1,5 до -10 "С, і найбільш переважно - від 43 до ї-8 "С на модифікований нуклеозид. У даній галузі відомі численні високоафінні модифіковані нуклеозиди, і вони включають, наприклад, багато 2'-заміщені нуклеозиди, а також замкнені нуклеїнові кислоти (І МА) (див., наприклад, Егеіїєї 5 Айтапп; Мисі.
Асій РНев., 1997, 25, 4429-4443 і ОпІтапип; Ситт. Оріпіоп іп Огид ОеємеІортенпі, 2000, З(2), 293-213).
Модифікації цукру
Олігомер за винаходом може містити один або більше ніж один нуклеозид, який має модифіковане цукрове угруповання, тобто модифікацію цукрового угруповання в порівнянні з рібозним цукровим угрупованням, що знаходиться в ДНК і РНК.
Були одержані численні нуклеозиди з модифікацією рібозного цукрового угруповання, головним чином, з метою поліпшення певних властивостей олігонуклеотидів, таких як афінність та/або нуклеазостійкість.
Такі модифікації включають модифікації, де модифікується структура рібозного кільця, наприклад, за допомогою заміни на гексозне кільце (НМА) або біциклічне кільце, яке типово має бірадикальний місток між вуглецями С2 і С4 на рибозному кільці (І МА), або на незв'язане рібозне кільце, у якого типово відсутній зв'язок між вуглецями С2 і СЗ (наприклад, ОМА). Інші нуклеозиди з модифікованим цукром включають, наприклад, біциклогексозні нуклеїнові кислоти (МО 2011/017521) або трициклічні нуклеїнові кислоти (МО 2013/154798). Модифіковані нуклеозиди також включають нуклеозиди, де цукрове угруповання замінюється на нецукрове угруповання, наприклад, в разі пептидних нуклеїнових кислот (РМА) або морфолінонуклеїнових кислот.
Модифікації цукрів також включають модифікації, зроблені за допомогою зміни груп, що заміщуються, на рибозному кільці на групи, відмінні від водню, або групи 2'-ОН, що знаходиться в природі в нуклеозидах ДНК і РНК. Замісники, наприклад, можна вводити в 2", 3, 4" або 5'- положення. Нуклеозиди з модифікованими цукровими угрупованнями також включають 2'- модифіковані нуклеозиди, такі як 2'-заміщені нуклеозиди. Справді, значну увагу було витрачено на розробку 2'-заміщених нуклеозидів, і було виявлено те, що численні 2'-заміщені нуклеозиди мають корисні властивості при включенні в олігонуклеотиди, такі як підвищена стійкість нуклеозидів і підвищена афінність. 2'-Модифіковані нуклеозиди
Нуклеозид з 2'-модифікованим цукром являє собою нуклеозид, який має в положенні 2" замісник, відмінний від Н або ОН (2'-заміщений нуклеозид) або містить 2'-пов'язаний бірадикал і включає 2'-заміщені нуклеозиди та нуклеозиди І МА (зв'язані 2-4" бірадикальним містком).
Наприклад, 2'-модифікований цукор може забезпечувати підвищену афінність зв'язування
Зо та/або підвищену нуклеазостійкіїсть олігонуклеотиду. Прикладами 2'-заміщених модифікованих нуклеозидів є 2'-О-алкіл-« РНК, 2'-О-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2-О-метоксіетил-РНК (МОЕ), 2'- аміно-ДНК, 2"-фтор-РНК і 2'-фтор-АМА (Е-АМА) нуклеозид. Відносно додаткових прикладів, будь ласка, див., наприклад, Егеієї 5 Айтапп; Мисі. Асіа Вев., 1997, 25, 4429-4443; ОпІтапи; Ситт.
Оріпіоп іп Огид ОемеІортепі, 2000, З(2), 293-213 і ОсІвауєу апа Сатна, Спетівгу апа Віоіоду 2012, 19, 937. Нижче наводяться ілюстрації деяких 2'-заміщених модифікованих нуклеозидів. ч че ч
Б. Основа шах Основаї У рова а ост ак ; і " і Н
ОМ ДЖ Е-РНК РАМА зе з. ! о. СОкснова Обнова о Основа се | то» ! | но» ! ї Її во о п
Ї 1 Ї У ; ї ? з но -СМмОЕ Се Аліл 2 ЕтТипамін
Нуклеозиди замкнених нуклеїнових кислот (І МА)
Нуклеозиди МА являють собою модифіковані нуклеозиди, які містять лінкерну групу (іменовану бірадікал або місток) між С2'ї Сб4" рібозного цукрового кільця нуклеотиду. Дані нуклеозиди також звуться в літературі місточковою нуклеїновою кислотою або біциклічною нуклеїновою кислотою (ВМА).
У деяких втіленнях модифікований нуклеозид або нуклеозиди І МА олігомеру за винаходом мають загальну структуру формули І або ІІ: т б фен
ЗИ ж в Го ! з з з Ж Я ! г, -А и -
Ж жен сні г Ко або
Формула | Формула де МУ вибраний з -О-, -5-, -М(Наг)-, -С(ВаВе)-, таким чином, що в деяких втіленнях -О-; В означає нуклеїнову основу або модифіковане угруповання нуклеїнової основи; 7 означає міжнуклеозидний зв'язок з сусіднім нуклеозидом або 5'-кінцеву групу; 2" означає міжнуклеозидний зв'язок з сусіднім нуклеозидом або 3'-кінцеву групу;
Х означає групу, вибрану з списку, що складається з -С(Ваве)-, -С(На)-С(ВЬ)-, -С(Ваг)-М-, -О-, -5І(Ва)2-, -5-, -502-, -М(На)- і 50-72.
У деяких втіленнях Х вибраний з групи, що складається з: -О-, -5-, МН-, МВеРе, -СНе-, СВ, -б(-СНг)- і -С(-СВаВ)-.
У деяких втіленнях Х являє собою -О-.
У означає групу, вибрану з групи, що складається з -С(В2Не)-, -С(Н2)-С(ВВ)-, -Ф(Нг)-М-, -О-, - з(Вег)2-, -5-, -505-, -М(В2)- і 50-72.
У деяких втіленнях М вибраний з групи, що складається з: -СНе-, -С(В2В»)-, -СНеСНе-, - сС(ваве)-С(вВане)-, -СНгСнНгсСнНе-, - (вав с(Вавес(ване)-, -С(Нг)-С(ВВ)- і -С(Ваг)--ІМ-.
У деяких втіленнях У вибраний з групи, що складається з: -СНе-, -СНАг-, -СНОНз»-, СВеВ-. або -Х-У- спільно означають двоядерну лінкерну групу (також звану радикал), що складається з 1, 2, З або 4 груп/атомів, вибраних з групи, що складається з -С(В2аНе)-, - сС(внг)-С(ВВ)-, -С(Ваг)-М-, -О-, -5І(Ва2)2-, -5-, -502-, -М(В2)- і 20-72.
У деяких втіленнях -Х-У- означає бірадикал, вибраний з груп, що складаються з: -Х-СНе-, -Х- сСваеве-, -Х-СННАе, -Х-С(НеОН»з), -О-У-, -0-СНе-, -5-СНе-, -МН-СНе-, -0-СНеНз-, -СНо-О-СН», -0- сн(СНзонНз)-, -0-СНо-СНе-, ОСН»-СнНо-СнНео-,-0-СНгОоСН»е-, -0О-МОНе-, -С(-СНег)-СНе-, -МАг-СНеь-,
М-О-СНе, -5-СВаВ- і -Б5-СНАУ-.
У деяких втіленнях -Х-У- означає -0-СНео- або -0О-СН(СНЗ)-, де 7 вибраний з -О-, -5- і - (Вг)-, і Ва, і, при наявності ВУ, кожний незалежно вибраний з водню, можливо заміщеного Сі-6- алкілу, можливо заміщеного Сг-вє-алкенілу, можливо заміщеного Сг-в-алкінілу, гідрокси, можливо
Зо заміщеного Сі-є-алкокси, Сг-в-алкоксіалкілу, Сов-алкенілокси, карбокси, С:-в-алкоксикарбонілу,
Сі-в-алкілкарбонілу, формілу, арилу, арилоксикарбонілу, арилокси, арилкарбонілу, гетероарилу, гетероарилоксикарбонілу, гетероарилокси, гетероарилкарбонілу, аміно, моно- і ди(С:-6- алкіл)аміно, карбамоїлу, моно- і ди(С:-в-алкіл)уаміно-карбонілу, аміно-С:-в-алкіл-амінокарбонілу, моно- і ди(С:1-вє-алкіл)аміно-С:-в-алкіл-амінокарбонілу, Сі-в-алкіл-карбоніламіно, карбамідо, Сі-6- алканоїлокси, сульфоно, Сі-в-алкілсульфонілокси, нітро, азидо, сульфанілу, С-в-алкілтіо, галогену, де арил і гетероарил можливо, можуть бути заміщені, і де два гінальних замісника Ка і
В? можуть разом означати можливо заміщений метилен («СН»), де для всіх хіральних центрів асиметричні групи можуть знаходитися або в РН, або в 5 орієнтації. де В", Аг, ВЗ, А5 і А незалежно вибрані з групи, що складаються 3: водню, можливо заміщеного Сі-вє-алкілу, можливо заміщеного Сг2--алкенілу, можливо заміщеного Сг-в-алкінілу, гідрокси, С:-в-алкокси, Сг2-в-алкоксіалкілу, Со-алкенілокси, карбокси, С:-в-алкоксикарбонілу, Сі-6- алкілкарбонілу, формілу, арилу, арилокси-карбонілу, арилокси, арилкарбонілу, гетероарилу, гетероарилокси-карбонілу, гетероарилокси, гетероарилкарбонілу, аміно, моно- і ди(Сі-в- алкіл)аміно, карбамоїлу, моно- і ди(С:-в-алкіл)-аміно-карбонілу, аміно-С:-в-алкіл-амінокарбонілу, моно- і ди(С:1-вє-алкіл)аміно-С:-в-алкіл-амінокарбонілу, Сі-в-алкіл-карбоніламіно, карбамідо, Сі-6- алканоїлокси, сульфоно, Сі-в-алкілсульфонілокси, нітро, азидо, сульфанілу, С-в-алкілтіо, галогену, де арил і гетероарил можливо можуть бути заміщені, і де два гемінальних замісники можуть разом означати оксо, тіоксо, іміно або можливо заміщений метилен.
У деяких втіленнях В", В2, ВЗ, Во і ВУ незалежно вибрані з Сі-в-алкілу, такого як метил, і водню.
У деяких втіленнях всі В', В2г, ВЗ, Во ії ВУ являють собою атоми водню.
У деяких втіленнях всі В', В2, ВЗ являють собою атоми водню, і або В», або ВУ також являє собою атом водню, а другий з ВЗ і ВУ відрізняється від атома водню, як, наприклад, являє собою Сі-в-алкіл, такий як метил.
У деяких втіленнях Ве являє собою або атом водню, або метил. У деяких втіленнях Ре, при наявності, являє собою або атом водню, або метил.
У деяких втіленнях один або обидва з В: і В? являють собою атом водню.
У деяких втіленнях один з Вз і В? являє собою атом водню, а інший відрізняється від атома водню.
У деяких втіленнях один з Вз і Р? являє собою метил, а другий являє собою атом водню.
У деяких втіленнях обидва з В: і В? являють собою метил.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- являє собою -О-СНег-, М/ являє собою 0, і всі В", В-, ВЗ,
ВЗ ї ВУ являють собою атоми водню. Такі нуклеозиди МА розкриті в УУХО 99/014226, МО 00/66604, МО 98/039352 і МО 2004/046160, які все включені в даний документ за допомогою посилання, і вони включають те, що зазвичай відоме як нуклеозиди бета-О-окси І МА і альфа-Ї - окси І МА.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- являє собою -5-СНе-, ММ являє собою 0, і всі з В', В, ВУ,
Во ї ВУ являють собою атоми водню. Такі нуклеозиди тіо І МА розкриті в УУО 99/014226 і МО 2004/046160, які включені тим самим за допомогою посилання.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- являє собою -МН-СН»-, М/ являє собою 0, і всі з В", Не,
ВЗ, Во ї А являють собою атоми водню. Такі нуклеозиди аміно І МА розкриті в УУО 99/014226 і
МО 2004/046160, які тим самим включені за допомогою посилання.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- являє собою -0О-СНо-СНе- або -9-СНо-СНо-СнНе-, УМ являє собою 0, і всі з В", В2, ВЗ, В5 і ВУ являють собою атоми водню. Такі нуклеозиди І МА розкриті в
МО 00/047599 і Мона евї а!., Віоогдапіс 5 Мей.Спет. І ей. 12 73-76, які тим самим включені за допомогою посилання, і включають те, що зазвичай відомо як нуклеїнові кислоти, зв'язані 2'-0О- 4"Сб-етиленовим місточком (ЕМА).
Зо У деяких втіленнях бірадикал -Х-Уу- являє собою -0О-СНе-, ММ являє собою 0, і всі з В", В, ВЗ і один з В5 ії ВУ являють собою атоми водню, а другий з В: і В" відрізняється від атома водню, як, наприклад, С:і-валкіл, такий як метил. Такі 5'-заміщені нуклеозиди МА розкриті в УУХО 2007/134181, яка тим самим включена за допомогою посилання.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- являє собою -О-СВ2РЕ, де один або обидва з Б2г і Ве відрізняються від атома водню, як, наприклад, метил, М/ являє собою 0, і всі з В", В2, ВЗ ії один з
В? ії А являють собою атом водню, а другий з НВ? і В" відрізняється від атома водню, як, наприклад, С:-валкіл, такий как метил. Такі біс-модифіковані нуклеозиди МА розкриті в УМО 2010/077578, яку тим самим включено в даний документ за допомогою посилання.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-Уу- означає двовалентну лінкерну групу -?-СН(СНгОСНЗ)- (2 О-метоксіетилбіциклічна нуклеїнова кислота - Зеїй аї аї., 2010, 9У. Огд. Спет. Мої 75(5) рр. 1569-81). У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- означає двовалентну лінкерну групу -0О-
СН(СНеСН 5) - (2'О-етилбіциклічна нуклеїнова кислота - Зеїй аї а!., 2010, у. Огу. Спет. Мої 75(5) рр. 1569-81). У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- являє собою -О-СНК2, М/ являє собою 0, і всі з
В", Вг, ВАЗ, Во ії А являють собою атоми водню. Такі 6'-заміщені нуклеозиди І МА розкриті в УМО 10036698 і М/О 07090071, які обидві тим самим включені за допомогою посилання.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-у- являє собою -0О-СН(СНогОСН:)-, М являє собою 0, і всі з
А", Вг, ВАЗ, А5 ії А являють собою атоми водню. Такі нуклеозиди І МА також відомі в даній області як циклічні МОЕ (СМОЕ) і розкриті в УУО 07090071.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-Уу- означає двовалентну лінкерну групу -О-СН(СНЗ)- або в
В-, або в 5-конфігурації. У деяких втіленнях бірадикал и -Х-У- разом означає двовалентну лінкерну групу -0-СН2г-О-СНо- (Зеїй аї аї., 2010, 9. Огд. Спет). У деяких втіленнях бірадикал -Х-
У- являє собою -О-СН(СНЗз)-, УМ являє собою 0, і всі з В', В2, ВУ, В5 і ВУ являють собою атоми водню. Такі б'-метилнуклеозиди І МА також відомі в даній області як СЕТ нуклеозиди і можуть являти собою або (5)СЕТ, або (ЮЮОСЕТ стереоізомери, яак розкрито в УМО 07090071 (бета-О) і МО 2010/036698 (альфа-Ї), які обидва тим самим включені за допомогою посилання).
У деяких втіленнях бірадикал -Х-Уу- являє собою -0О-СВ2РЕ-, в якому ані один з Рг або В? не є атомом водню, М/ являє собою 0, і всі з В', В2, ВЗ, В5 ї ВУ являють собою атоми водню. У деяких втіленнях і На, і В? являють собою метил. Такі 6б'-двозаміщені нуклеозиди І МА розкриті в
МО 2009006478, яка тим самим включена за допомогою посилання. 60 У деяких втіленнях бірадикал -Х-Уу- являє собою -5-СНа2-, М являє собою о, і всі з В", Не,
ВАЗ, ВА5 ї А являють собою атоми водню. Такі 6'-заміщені нуклеозиди тіо ГМА розкриті в УМО 11156202, яка тим самим включена за допомогою посилання. У деяких втіленнях 6'-заміщених тіо ГМА Ве являє собою метил.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-Уу- являє собою -С(-СНг)-С(ВеРе)-, як, наприклад, -С(-СНг)-
Сне- або -С(-СНг)-СН(СНЗз)-, М/ являє собою 0, і всі з В", В2, ВУ, В5 і ВУ являють собою атоми водню. Такі нуклеозиди вінілкарбо І МА розкриті в УУО 08154401 ії М/О 09067647, які обидві тим самим включені за допомогою посилання.
У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- являє собою -М(-ОН2)-, ММ являє собою о, і всі з В", В,
ВЗ, Во і ВУ являють собою атоми водню. У деяких втіленнях Ва являє собою С:-валкіл, такий як метил. Такі нуклеозиди І МА також відомі як М-заміщені І МА ї розкриваються в УМО 2008/150729, яка тим самим включена за допомогою посилання. У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- разом означає двовалентну лінкерну групу -0О-МАг-СНз- (Зеїй аї аї., 2010, 9У. Огу. Спет). У деяких втіленнях бірадикал -Х-У- являє собою -М(Н2г)-, МУ являє собою 0, і всі з В", В2, ВУ, В5 і ВУ являють собою атоми водню. У деяких втіленнях Не являє собою С: .валкіл, такий як метил.
У деяких втіленнях один або обидва з В: і ВУ являють собою атом водню, і, при заміщенні, другий з В: і ВУ являє собою С:-валкіл, такий як метил. В такому втіленні всі з В', 82, ВЗ можуть являти собою атоми водню, і бірадикал -Х-У- може бути вибраний з -0-СНео- або -0О-С(НСВЗ)-, такого як -0-С(НСНЗ)-.
У деяких втіленнях бірадикал являє собою -СНаВе-0О-СВ2еВ-, такий як СН»-О-СНе-, УМ являє собою 0, і всі з В', В-, ВУ, Во ії ВУ являють собою атоми водню. У деяких втіленнях Ве являє собою С:-валкіл, такий як метил. Такі нуклеозиди І МА також відомі як конформаційно обмежені нуклеотиди (СВМ) і розкриваються в УМО 2013036868, яка тим самим включена за допомогою посилання.
У деяких втіленнях бірадикал являє собою -0О-СНаНе-О-СВагве-, такий як О-СН2г-О-СНе-, М являє собою 0, і всі з В", Не, ВЗ, 5 і ВУ являють собою атоми водню. У деяких втіленнях На являє собою С:-валкіл, такий як метил. Такі нуклеозиди І МА також відомі як нуклеотиди СОС і розкриваються в МіїзиокКа еї аї., Мисівїс Асід5 Кезеагсп 2009 37(4), 1225-1238, яка тим самим включена за допомогою посилання.
Буде зрозуміло те, що, якщо не визначено, нуклеозиди І МА можуть перебувати в бета-О або
Зо альфа-їЇ. стереоізоформі.
Деякі приклади нуклеозидів І МА представлені на Схемі 1.
Схема З т в во В - ше ДВ. | г. ї 7 ш- пт Коди ню І ' ' ; "
С ші - . - / / ;
Ві-онси ЦА ГО дкбчаміно МА Ко ВолівімА й о. В и: ше ще: Ши ск й -0О | і ОМ 50:58 ко 8 ко ке у КТ і їж ї щі ! 2-- у 0 м о- 0-0 х х ї " і ще са-енсн МА. ; ді аміно БНА зе-тю МА В-О-амінозаміщена БА 1 ! ! о о 0, сто «Ко х й м : і ! 7 - : | шк оо бо 079 оо і ! і ! б'єметил-В-нокси ММА. 5 -диметип-в-о-окси ММА 5 -матил на виси ММА 5 метил, диметитв-
Бокси (МА й ні 0-0 0-7 - - - 9 - о 1 пен В ! х ї І с
У св лето 0- и КА у р ав 075 "ше; / А / / в
Карбоксициклічна Карбонсициклічна б'метинлчо во ММА Заміщена (еб-аміно МА (вініпеь ВО МА івініг)-о МА
Як проілюстровано в прикладах, в переважних втіленнях винаходу нуклеозиди МА в олігонуклеотидах являють собою нуклеозиди бета-ЮО-окси-Ї МА.
Деградація, опосередкована нуклеазою 5 Термін "деградація, опосередкована нуклеазою" відноситься до олігонуклеотиду, здатному опосредковувати деградацію комплементарної нуклеотидної послідовності при утворенні дуплекса з такою послідовністю.
У деяких втіленнях олігонуклеотид може функціонувати за допомогою деградації нуклеїнової кислоти-мішені, опосередкованої нуклеазою, де олігонуклеотиди за винаходом здатні рекрутувати нуклеазу, зокрема, ендонуклеазу, переважно ендорибонуклеазу (РНКазу), таку як РНКазу Н. Прикладами конструкцій олігонуклеотидів, які працюють за допомогою механізмів, опосередкованих нуклеазами, є олігонуклеотиди, які типово містять ділянку з щонайменше 5 або б нуклеозидів ДНК ії фланковані на одній стороні або на обох сторонах нуклеозидами, збільшуючими афінність, наприклад, гепмери, хедмери і тейлмери.
Активність і рекрутування РНКази Н
Термін "активність РНКази Н антисмислового олігонуклеотиду" відноситься до його здатності при знаходженні в дуплексі з комплементарною молекулою РНК рекрутувати РНКазу
Н. в М 01/23613 запропоновані способи іп міго для визначення активності РНКази Н, які можна використовувати для визначення здатності рекрутувати РНКазу Н. Характерно олігонуклеотид вважається здатним рекрутувати РНКазу Н, якщо він, при наданні з комплементарною послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені, має вихідну швидкість, виміряну в пмоль/л/хв., щонайменше 5 95, як, наприклад, щонайменше 10 95 або більше, ніж 20 95 від початкової швидкості, визначеної при використанні олігонуклеотиду, що має таку ж послідовність основ, що і тестований модифікований олігонуклеотид, але містить тільки мономери ДНК з фосфоротіоатними зв'язками між всіма мономерами в олігонуклеотиді, і з використанням методології, запропонованої в прикладах 91-95 М/О 01/23613 (включеної тим самим за допомогою посилання).
Гепмер
Термін "гепмер" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься до антисмислового олігонуклеотиду, який містить ділянку олігонуклеотидів (геп), рекрутуючу РНКазу Н, яка фланкована 5 і 3' ділянками (фланги або крила), які містять один або більше ніж один модифікований нуклеозид, що підсилює афінність. В даному документі описуються різні конструкції гепмерів, і вони характеризуються за їх здатністю рекрутувати
РНКазу Н. Хедмери і тейлмери являють собою олігонуклеотиди, здатні рекрутувати РНКазу Н, де відсутній один з флангів, тобто тільки один з кінців олігонуклеотиду містить модифіковані нуклеозиди, що підсилюють афінність. Для хедмерів відсутній 3'-фланг (тобто 5'-фланг містить модифіковані нуклеозиди, що підсилюють афінність), і для тейлмерів відсутній 5'-фланг (тобто
З'-фланг містить модифіковані нуклеозиди, що підсилюють афінність).
Гепмер І МА
Термін "гепмер МА" відноситься до гепмерного олігонуклеотиду, в якому щонайменше один з модифікованих нуклеозидів, що підсилюють афінність, являє собою нуклеозид Ї МА.
Гепмер із змішаними крилами
Термін "гепмер зі змішаними крилами" або "гепмер зі змішаними флангами" відноситься до гепмеру МА, в якому щонайменше одна флангова ділянка містить щонайменше один нуклеозид МА і щонайменше один модифікований нуклеозид, який не є І МА, такий як щонайменше один 2'-заміщений модифікований нуклеозид, такий як, наприклад, нуклеозид(ди) 2-О-алкіл- РНК, 2'-О-метил-РНК, 2'"-О-алкокси-РНК, 2'-О-метоксіетил- "НК (МОЕ), 2'-аміно-ДНК, 2-фтор-РНК і 2-Р-АМА. У деяких втіленнях гепмер зі змішаними крилами має один фланг, який містить тільки нуклеозиди МА (наприклад, 5' або 3), і другий фланг (3 або 5' відповідно) містить 2'-заміщений(ні) модифікований(ні) нуклеозид(ди) і можливо нуклеозиди І МА.
Олігонуклеотид з розірваним гепом
Зо Термін "олігонуклеотид з розірваним гепом" використовується по відношенню до гепмера, здатного підтримувати рекрутування РНКази Н, навіть незважаючи на те, що ділянка гепа розривається нуклеозидом, що не рекрутує РНКазу Н (нуклеозидом, що розриває геп, Е), таким чином, що ділянка гепа містить менше, ніж 5 послідовних нуклеозидів ДНК. Нуклеозиди, що не рекрутують РНКазу Н, являють собою, наприклад, нуклеозиди в З3З'-ендоконформації, такі як
МА, де місток між С2' ії С4" рибозного цукрового кільця нуклеозиду знаходиться в бета- конформації, як, наприклад, нуклеозид бета-О- окси І МА або 5СЕТ. Здатність олігонуклеотиду з розірваним гепом рекрутувати РНКазу Н типово є специфічною відонсно послідовності або навіть сполуки - див. Ником єї аІ. 2015 Мисі. Асід5 Нев. Мої. 43 рр. 8476-8487, в якій розкрито "олігонуклеотиди з розірваним гепом", які рекрутують РНКазу Н, які в деяких випадках забезпечують більш специфічне розщеплення РНК-мішені.
У деяких втіленнях олігонуклеотид за винаходом являє собою олігонуклеотид з розірваним гепом. У деяких втіленнях олігонуклеотид з розірваним гепом містить 5'-фланг (РЕ), геп (С) і 3'- фланг (ЕР, де геп розірваний нуклеозидом, який не рекрутує РНКазу Н (нуклеозидом, що розріває геп, Е), таким чином, що геп містить щонайменше З або 4 послідовних нуклеозиди
ДНК. У деяких втіленнях нуклеозид, що розріває геп (Е), являє собою нуклеозид І МА, де місток між С2"ї С4" рибозного цукрового кільця нуклеозиду знаходиться в бета-конформації, і він розміщується в межах ділянки гепа таким чином, що нуклеозид МА, що розріває геп, фланкований 5' і 3 щонайменше З(5') і 3(3") або щонайменше 3(5)) і 4(3), або щонайменше 4(5) і 3(3) нуклеозидами ДНК, де даний олігонуклеотид здатний рекрутувати РНКазу Н.
Олігонуклеотид з розірваним гепом може бути представлений наступними формулами:
Е-Я-Б-0-Е"; зокрема Е1-7-С3-4-Е1-С3-4-Е 4-7 р'АБ-8-Р", зокрема 0'1-3-Е1-7- Сіз-4-Е1-Са3-4-Е 4-7
Б-а-Е-О", зокрема Е1-7- Сіз-4-Е1-(а3-4-Е4-7-074-3 р'-Б-а-Е-р", зокрема 0" -3-Е1-7- Сіз-4-Е1-Са3-4-Е-7-074-3
Де ділянки 0 і О" є такими, як описано в розділі "Конструкція гепмера".
У деяких втіленнях нуклеозид, що розриває геп (Е), являє собою бета-О-окси І МА або 5СЕТ, або інші нуклеозиди бета-і МА, показані на Схемі 1).
Кон'югат
Термін "кон'югат" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, бо відноситься до олігонуклеотиду, який ковалентно зв'язаний з ненуклеотидним угрупованням
(кон'юЮгатне угруповання або ділянка С, або третя ділянка), також званому кон'югатом олігонуклеотиду.
Кон'югування олігонуклеотиду за винаходом з одним або більше ніж одним ненуклеотидним угрупованням може поліпшувати фармакологію даного олігонуклеотиду, наприклад, за допомогою впливу на активність, клітинне розподілення, клітинне поглинання або стабільність олігонуклеотиду. У деяких втіленнях кон'югатне угруповання націлює олігонуклеотид в печінку.
У той же самий час кон'югат служить для зменшення активності олігонуклеотиду в типах клітин, тканинах або органах, які не є мішенями, наприклад, активність поза мішені або активність в типах клітин, тканинах або органах, які не є мішенями. В одному втіленні винаходу кон'югат олігонуклеотиду за винаходом демонструє поліпшене інгібування РО-Ї1 в клітині-мішені в порівнянні з некон'югованим олігонуклеотидом. В іншому втіленні кон'югат олігонуклеотиду за винаходом має поліпшене клітиннийе розподілення між печінкою і іншими органами, такими як селезінка або нирки (тобто більше кон'югованого олігонуклеотиду надходить в печінку, ніж в селезінку або в нирки), в порівнянні з некон'югованим олігонуклеотидом. В іншому втіленні кон'югат олігонуклеотиду за винаходом демонструє поліпшене клітинне поглинання в печінку кон'югата олігонуклеотиду в порівнянні з некон'югованим олігонуклеотидом.
В МО 93/07883 ії УМО 2013/033230 запропоновані відповідні кон'югатні угруповання, які тим самим є включеними за допомогою посилання. Додатковими відповідними кон'югатними угрупованнями є угруповання, здатні до зв'язування з рецептором асіалоглікопротеїну (АБОаРГ).
Зокрема, придатними для зв'язування з АБОРІг є тривалентні М-ацетілгалактозаміннивєї кон'югатниєї угруповання, див., наприклад, УМО 2014/076196, МО 2014/207232 і МО 2014/179620 (включені тим самим за допомогою посилання). Кон'югатне угруповання є по суті частиною кон'югатів антисмислових олігонуклеотидів, яке не складається з нуклеїнових кислот.
Кон'югати олігонуклеотидів та їх синтез також були описані у всеохоплюючих оглядах
Мапопйагап в Апіїзепзе Огид Тесппоїіоду, Ргіпсіріе5, 5ігагедієз, апа Арріїсайопв, 5.Т. Стооке, еєд.,
Сп. 16, Магсеї Оеккег, Іпс., 2001 ії Мапопагап, Апіїзепзе апа Мисієїс Асіа Огид ЮОемеІортепі, 2002 12, 103, кожний з яких включений в даний документ за допомогою посилання у всій його повноті.
В одному втіленні ненуклеотидне угруповання (кон'югатне угруповання) вибранао з групи, що складається з вуглеводів, лігандів рецептора поверхні клітини, лікарських речовин, гормонів, ліпофільних речовин, полімерів, білків, пептидів, токсинів (наприклад, бактеріальних токсинів), вітамінів, вірусних білків (наприклад , капсидів) або їх комбінацій.
Лінкери
З'вязка або лінкер являє собою з'єднання між двома атомами, яке пов'язує одну хімічну групу або необхідний сегмент з іншою хімічною групою або необхідним сегментом за допомогою одного або більше ніж одного ковалентного зв'язку. Кон'югатні угруповання можуть приєднуватися до олігонуклеотидів безпосередньо або через зв'язуюче угруповання (наприклад, лінкер або зв'язок). Лінкери служать для ковалентного приєднання третьої ділянки, наприклад, кон'югатне угруповання (ділянки С), до першої ділянки, наприклад, олігонуклеотидів або безперервної нуклеотидної послідовності, комплементарної нуклеїновій кислоті-мішені (ділянка А).
У деяких втіленнях винаходу кон'югат або кон'югат олігонуклеотиду за винаходом можливо може містити лінкерну ділянку (друга ділянка або ділянка В, та/або ділянка ХУ), яка розташовується між олігонуклеотидом або безперервною нуклеотидною послідовністю, комплементарною нуклеїновій кислоті-мішені (ділянка А або перша ділянка), і кон'югатним угрупованням (ділянка С або третя ділянка).
Ділянка В відноситься до біорозщеплювальних лінкерів, що містять або складаються з фізіологічно лабільною зв'язку, яка є розщеплюваною за умов, які зазвичай зустрічаються або є аналогічними умовами, які зустрічаються в організмі ссавців. Умови, при яких фізіологічно лабільні лінкери піддаються хімічному перетворенню (наприклад, розщепленню), включають такі хімічні умови, як рН, температура, окисні або відновлювальні умови або агенти і концентрація солі, виявлені або аналогічні умовам, які трапляються в клітинах ссавців.
Внутрішньоклітинні умови у ссавців також включають присутність ферментативної активності, зазвичай присутньої в клітці ссавця, як, наприклад, від протеолітичних ферментів або гідролітичних ферментів, або нуклеаз. В одному втіленні біорозщеплювальний лінкер чутливий до розщеплення нуклеазами 51. У переважному втіленні нуклеазочутливий лінкер містить від 1 до 10 нуклеозидів, як, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 нуклеозидів, більш переважно - від 2 до 6 нуклеозидів, і найбільш переважно - від 2 до 4 зв'язаних нуклеозидів, що містять щонайменше два послідовних фосфодіефірних зв'язків, як, наприклад, щонайменше 3 або 4, або 5 послідовних фосфодіефірних зв'язків. Переважно нуклеозидами є ДНК або РНК. бо Біорозщеплювальні лінкери, що містять фосфодіефір, більш докладно описуються в УМО
2014/076195 (включеній тим самим за допомогою посилання).
Ділянка М відноситься до лінкерів, які не обов'язково є біорозщеплювальними, але, головним чином, служать для ковалентного приєднання кон'югатного угруповання (ділянки З або третьої ділянки) до олігонуклеотидів або безперервної нуклеотидної послідовності, комплементарної нуклеїновій кислоті-мішені (ділянки А або першої ділянки). Лінкери ділянки У можуть містити структуру ланцюга або олігомер з повторюваних ланок, такий як етиленгліколь, амінокислотні ланки або аміноалкільні групи. Кон'югати олігонуклеотидів за даним винаходом можуть бути сконструйовані з наступних елементів ділянок: А-С, А-В-С, А-В-У-С, А-У-8В-С або А-
У-Сб. У деяких втіленнях лінкер (ділянка У) являє собою аміноалкіл, як, наприклад, С2-С36 аміноалкільну групу, що включає, наприклад, С6-С12 аміноалкільні групи. В переважному втіленні лінкер (ділянка У) являє собою Сб аміноалкільну групу.
Лікування
Термін "лікування" в тому вигляді, в якому він використовується в даному документі, відноситься як до лікування існуючого захворювання (наприклад, захворювання або розладу, на які дається посилання в даному документі), так і до попередження захворювання, тобто профілактиці. Отже, буде зрозуміло, що лікування в тому вигляді, в якому на нього дається посилання в даному документі, у деяких втіленнях може бути профілактичним.
Відновлення імунної відповіді проти патогенів
Імунна відповідь підрозділяється на вроджену і адаптивну імунну відповідь. Вроджена імунна система забезпечує негайну, але неспецифічну відповідь. Адаптивна імунну відповідь активується вродженою імунною відповіддю і є високоспецифічною по відношенню до конкретного патогену. При презентації антигену, що відбувається з патогену, на поверхні антигенпрезентуючих клітин імунні клітини адаптивної імунної відповіді (тобто Т і В-лімфоцити) активуються за допомогою їх антигенспецифічних рецепторів, приводячи /- до патогенспецифічної імунної відповіді і розвитку імунологічної пам'яті. Хронічні вірусні інфекції, такі як НВМ ї НСМ, асоційовані з вичерпанням Т-клітин, що характеризується невідповідністю вірусоспецифічних Т-клітин. Вичерпання Т-клітин добре вивчено, відносно огляду див., наприклад, "Уї еї а! 2010 Іттипоіоду 129, 474-481. Хронічні вірусні інфекції також асоційовані зі зниженою функцією МК-клітин, які є вродженими імунними клітинами. Посилення імунної
Зо відповіді проти вірусів є важливим для кліренсу хронічної інфекції. Відновлення імунної відповіді проти патогенів, опосередкованого Т-клітинами і МК-клітинами, можна оцінювати за допомогою вимірювання проліферації, секреції цитокінів та цитолітичної функції (Ооїїпа еї аЇ. 2013 МоїІесшаг
Тпегару-Мисівїс Асідв5, 2 е72 і Приклад 6 в даному документі).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід відноситься до застосування антисмислових олігонуклеотидів, їх кон'югатів і фармацевтичних композицій, що містять їх, для відновлення імунної відповіді проти патогенів, які інфікували тварину, зокрема людину. Кон'югати антисмислових олігонуклеотидів за даним винаходом є особливо корисними проти патогенів, які інфікували печінку, зокрема, проти хронічних інфекцій печінки, подібних НВУ. Дані кон'югати забезпечують таргетне розподілення олігонуклеотидів і запобігають системному нокдауну нуклеїнової кислоти-мішені.
Олігонуклеотиди за винаходом
Даний винахід відноситься до олігонуклеотидів, здатних модулювати експресію РО-Ї1.
Модуляція може досягатися гібридизацією з нуклеїновою кислотою-мішенню, кодуючою РО-Ї 1, або з такою, яка бере участь в регуляції РО-11. Нуклеїнова кислота-мішень може являти собою послідовність РО-І1 ссавця, таку як послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ
МО: 1, БЕО ІО МО: 2 та/або ЗЕО ІО МО: 3. нуклеїнова кислота-мішень може являти собою пре-
МРНК, мРНК або будь-яку послідовність РНК, експресовану з клітки ссавця, яка підтримує експресію або регуляцію РО-ЇІ 1.
Олігонуклеотид за винаходом являє собою антисмисловий олігонуклеотид, який націлений на РО-І1.
В одному аспекті винаходу олігонуклеотиди за винаходом кон'юговані з кон'югатним угрупованням, зокрема, з кон'югатним угрупованням, націленим на рецептор асіалоглікопротеїну.
У деяких втіленнях антисмисловий олігонуклеотид за винаходом здатний модулювати експресію мішені за допомогою здійснення її інгібування або понижувальної регуляції.
Переважно така модуляція дає інгібування експресії щонайменше 20 95 в порівнянні з нормальним рівнем експресії мішені, більш переважно щонайменше 30 95-не, 40 Фо-не, 50 Фо-не, 60 Фо-не, 70 9Уо-не, 80 Уо-не або 90 Ф5-не інгібування в порівнянні з нормальним рівнем експресії мішені. Переважно така модуляція дає інгібування експресії щонайменше 20 95 в порівнянні з 60 рівнем експресії при зараженні клітини або організму інфекційним агентом, або при обробці агентом, що імітує зараження інфекційним агентом (наприклад, полі ІС або ІРБ5 (ліпополісахарид)), більш переважно щонайменше 30 95-ве, 40 9о-ве, 50 9о-ве, 60 Уо-ве, 70 Уо-ве, 80 бо-ве або 90 95-ве інгібування в порівнянні з з рівнем експресії при зараженні клітини або організму інфекційним агентом, або при обробці агентом, що імітує зараження інфекційним агентом (наприклад, полі С або ГР5). У деяких втіленнях олігонуклеотиди за винаходом можуть бути здатні інгібувати рівні експресії мРНК РО-І1 щонайменше на 60 95 або 70 95 іп міто з використанням клітин КАКРАБ-299 або ТНРІ1. У деяких втіленнях сполуки даного винаходу можуть бути здатні інгібувати рівні експресії білка РО-Ї/1Ї щонайменше на 50 95 іп міго з використанням клітин КАКРА5Б-299 або ТНРІ1. Відповідним чином в прикладах запропоновані аналізи, які можна використовувати для вимірювання РНК РО-Ї1 (наприклад, Приклад 1).
Модуляція мішені запускається гібридизацією між безперервною нуклеотидною послідовністю олігонуклеотиду і нуклеїновою кислотою-мішенню. У деяких втіленнях олігонуклеотид за винаходом містить невідповідності між даними олігонуклеотидами і нуклетновою кислотою- мішенню. Незважаючи на невідповідності гібридизація з нуклеїнової кислотою-мішенню все ще може бути достатньою для демонстрації бажаної модуляції експресії РО-11. Знижена афінність зв'язування, яка відбувається через невідповідності, переважно може компенсуватися більшим числом нуклеотидів в олігонуклеотиді талабо великим числом модифікованих нуклеозидів, здатних збільшувати афінність зв'язування з мішенню, таких як 2'--модифіковані нуклеозиди, включаючи І МА, присутніх в межах послідовності олігонуклеотиду.
У деяких втіленнях антисмисловий олігонуклеотид за винаходом здатний відновлювати патогенспецифічні Т-клітини. У деяких втіленнях олігонуклеотиди за винаходом здатні збільшувати число патогенспецифічних Т-клітин щонайменше на 40 95, 50 95, 60 95 або 70 95 в порівнянні з необробленими контролями або контролями, обробленими стандартом лікування.
В одному втіленні антисмисловий олігонуклеотид або кон'югат за винаходом здатний збільшувати рівень НВМ-специфічних Т-клітин в порівнянні з необробленими контролями або контролями, обробленими стандартом лікування. Відповідним чином, в даних прикладах запропоновані аналізи, які можна використовувати для вимірювання НВМ-специфічних Т-клітин (наприклад, проліферація Т-клітин, секреція цитокінів та цитолітична активність). В іншому втіленні антисмисловий олігонуклеотид або кон'югат за винаходом здатний збільшувати рівень
Зо НСМ-специфічних Т-клітин в порівнянні з необробленими контролями або контролями, обробленими стандартом лікування. В іншому втіленні антисмисловий олігонуклеотид або кон'югат за винаходом здатний збільшувати рівень НОМ-специфічних Т-клітин в порівнянні з необробленими контролями або контролями, обробленими стандартом лікування.
У деяких втіленнях антисмислової олігонуклеотид за винаходом здатний зменшувати рівні
НВ5ЗАд у тварини або людини. У деяких втіленнях олігонуклеотиди за винаходом здатні зменшувати рівні НВ5Ад щонайменше на 40 95, 50 95, 60 95 або 70 95, більш переважно щонайменше на 80 95, 90 95 або 95 95 в порівнянні з рівнем до обробки. Найбільш переважно олігонуклеотиди за винаходом здатні досягати сероконверсії НВ5зАд у тварини або людини, ініційованого НВУ.
Один аспект даного винаходу стосується антисмислового олігонуклеотиду, який містить безперервну нуклеотидну послідовність з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною комплементарністю з нуклеїновою кислотою-мішенню РО-ЇІ 1.
У деяких втіленнях даний олігонуклеотид містить безперервну послідовність, яка є щонайменше на 90 95 комплементарною, як, наприклад, щонайменше на 91 95, як, наприклад, щонайменше на 92 95, як, наприклад, щонайменше на 93 95, як, наприклад, щонайменше на 94 до, як, наприклад, щонайменше на 95 95, як, наприклад, щонайменше на 96 95, як, наприклад, щонайменше на 97 95, як, наприклад, щонайменше на 98 95 або на 100 95 комплементарною ділянці нуклеїнової кислоти-мішені.
У переважному втіленні олігонуклеотид за винаходом або його безперервна нуклеотидна послідовність є повністю комплементарним (на 100 95 комплементарним) ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, або у деяких втіленнях може містити одну або дві невідповідності між олігонуклеотидом і нуклеїновою кислотою-мішенню.
У деяких втіленнях олігонуклеотид містить безперервну нуклеотидну послідовність з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною комплементарністю, як, наприклад, з повною (або 100 95-ою) комплементарністю з ділянкою нуклеїнової кислоти-мішені, яка присутня в ЗХЕО
ІОЮО МО: 1 або 5ЕО ІЮ МО: 2. У деяких втіленнях послідовність олігонуклеотида є на 100 95 комплементарною відповідній ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, яка присутня в ЗЕО ІО МО: 1 Її
ЗЕО ІЮ МО: 2. У деяких втіленнях послідовність олігонуклеотиду є на 100 95 комплементарною відповідній ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, яка присутня в 5ЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІЮО МО: 3. бо У деяких втіленнях олігонуклеотид або кон'югат олігонуклеотиду містить безперервну нуклеотидну послідовність з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 Фо-ною комплементарністю, як, наприклад, 100 95-ною комплементарністю з відповідною ділянкою нуклеїнової кислоти-мішені, де безперервна нуклеотидна послідовність є комплементарною підпослідовності нуклеїнової кислоти-мішені, вибраної з групи, що складається з положення 3711-3068, 5467-12107 і 15317-19511 на 5ЕО ІЮО МО: 1. В іншому втіленні підпослідовність нуклеїнової кислоти-мішені вибрана з групи, що складається з положення 371-510, 822-1090, 1992-3068, 5467-5606, 6470-12107, 15317-15720, 15317-18083, 18881-19494 та 1881-19494 на
ЗЕО ІЮ МО: 1. В переважному втіленні підпослідовність нуклеїнової кислоти-мішені вибрана з групи, що складається з положення 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 та 15690- 15735 на 5ЕО ІО МО: 1.
У деяких втіленнях олігонуклеотид або кон'югат олігонуклеотиду містить безперервну нуклеотидну послідовність з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 Фо-ною комплементарністю, як, наприклад, 100 95-ною комплементарністю з відповідною ділянкою нуклеїнової кислоти-мішені, присутньою в ЗЕО ІО МО: 1, де ділянка нуклеїнової кислоти-мішені вибрана з групи, що складається з ділянок від а! до а449 в Таблиці 4.
Таблиця 4
Ділянки 5ЕО ІО МО 1, на які може здійснюватися націлювання з використанням олігонуклеотиду за винаходом
Діл.а | Положення в | Дов- | Ділла | Положення в | Дов- | Діл.а Положення в Дов-
ЗЕО ОО МО 1 | жина ЗЕОІО МО 1 | жина ЗЕОІО МО 1 жина 6994 | 7020 13092 | 13115 7033 | 7048 13117 | 13134 7050 | 7066 13136 | 13169 7078 | 7094 13229 | 13249 тов | 7122 13295 | 13328 ав | зо4 | зво | 47 | аївв | 7123 | 7144 13330 | 13372 7146 | 7166 13388 | 13406 ав | зве | 423 | з5 | аї5в | 7173 | 7193 13408 | 13426 аз | 425 | 440 | 16 | аї5о | 7233 | 7291 13437 | 13453 7300 | 7333 13455 | 13471 7336 | 7351 13518 | 13547 7353 | 7373 13565 | 13597 7375 | 7412 13603 | 13620 7414 | 7429 13630 | 13663 тазі | тав 13665 13679 7453 | 7472 13706 | 13725 74тА | 7497 13727 | 13774 7517 | 7532 13784 | 13821 7Бат | 7601 13831 | 13878 7603 | 7617 13881 | 13940 | во 7632 | 7647 13959 | 14013 7649 | 7666 14015 | 14031 7668 | 7729 14034 | 14049 1000 7731 | 7164 14064 | 14114 1002 | 1054 7767 | 7817 14116 | 14226
Таблиця 4
Ділянки 5ЕО ІО МО 1, на які може здійснюватися націлювання з використанням олігонуклеотиду за винаходом
Діл.а Дов- | Діл.а Дов- | Діл.а Дов-
Що ЗЕО ІЮО МО 1 я ЗЕО ІЮО МО 1 і ЗЕОЮО МО 1 аа |оаат|оавБ| 15 | агог| 9072 9139 68 | азва | 15453 | 15491 | 39 або |отвв|ов19| 32 /агіо| 9300 | 9331 | 32 | азво | 15690 | 15735| 46
Таблиця 4
Ділянки 5ЕО ІЮО МО 1, на які може здійснюватися націлювання з використанням олігонуклеотиду за винаходом
Діл.а Дов- | Діл.а Дов- | Діл.а Дов-
Що ЗЕОЮО МО 1 я ЗЕОЮО МО 1 і ЗЕО ІЮО МО 1 абз |овеб 2912| 17 |агіз| о400 | о4вв | 89 / азез | 15ВОз | 15819 17 о авб |2973 2992| 20 | агі6| етов | 9721 | 16 / азвє | 15936 | 15962 27 о аве |3036|3051| 16 /агію| 9767 | 9788 | 22 | азве | 16025 | 16061 | 37 оавз |3727|з812| 86 | агзз | 10339 10363 25 | азез | 16655 | 16701) 47 аво |4075 4123| 49 | агао | лов00| 10621 | 22 азео | 17072 | 17109 з8 аз |4277 4336| во | агаа | 10775| 10792| 18 азел | 17244 | 17299 56 аз |4383|4398| 16 | агав | 10874 10888 0 15 | азеє | 17346 | 17400| 55 азу |до 4446| 42 | агат | 108е3| 10972| 80 / азе | 17447 | 17466 го аз | аа лава| 17 | агав | 10974| 10994| 21 азев | 17474 | 17539 66 ав |4466|4493| 28 | ага | 10996 | 11012| 17 | азее | 17561 | 17604 | 44
Таблиця 4
Ділянки 5ЕО ІЮО МО 1, на які може здійснюватися націлювання з використанням олігонуклеотиду за винаходом
Діл.а Дов- | Діл.а Дов- | Діл.а Дов-
Що ЗЕОЮО МО 1 я ЗЕОЮО МО 1 і ЗЕО ІЮО МО 1 аг | 4624 |4в83| 60 | агво | 11140) 11157 18 | айо? | 17793 | 17810 | 18 алоє |4873|4932| 60 | ав | 11279) 11337 5е | а4об | 18007 | 18035| 29 аю |4979|5010| 32 | агве | 11427 | 11494 68 | айое | 18163 | 18177 | 15 ага | во 5в3е| 40 | агта | 12019| 12114| 96 адоя | 18731 | 18758 28 о аї27 | 5737 5770| за | агт? | 12165) 12192| 28 ад? | 18861 | 18926 66 ваза |в119 вівє| вв | агва | 12397| 12434 | 38 аяза | 19215 | 19240 26 аз | 6236 |62ув| 43 | агвє | 12511 | 12543 | 33 | а4зє | 19358 | 19446 | 89
Таблиця 4
Ділянки 5ЕО ІО МО 1, на які може здійснюватися націлювання з використанням олігонуклеотиду за винаходом
Діл.а | Положення в | Дов- | Ділла | Положення в | Дов- | Діл.а Положення в Дов-
ЗЕО ОО МО 1 | жина ЗЕОІО МО 1 | жина ЗЕОІО МО 1 жина 6291 | 6312 12545 | 12565 19450 | 19468 6314 | 6373| 60 | агвв | 12567 | 12675 19470 | 19512 6404 | в447 12677 | 12706 19514 | 19541 6449 | 6482 12708 | 12724 19543 | 19568 6533 | 6555 12753 | 12768 19570 | 19586 6562 | 6622 12785 | 12809 19588 | 19619 6624 | 6674 12830 | 12859 19683 | 19739 6679 | 6762 12864 | 12885 19741 | 19777 6764 | 6780 12886 | 12916 19779 | 19820 6782 | 6822 12922 | 12946 19822 | 19836 6824 | 6856 12948 | 12970 19838 | 19911 6858 | 6898 12983 | 13003 19913 | 19966 6906 | 6954 13018 | 13051 19968 | 20026 в969 | 6992 їзо70|їзово|Ї 21
У деякому втіленні олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність є комплементарною ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, де дану ділянку нуклеїнової кислоти- мішені вибрано з групи, що складається з а7, а26, а43, а119, а142, а159, а160, а163, а169, а178, а179, а180, а189, аго1, агог2, аг2г04, а214, а221, аг224, а226, аг4АЗ3, аг254, аг2г58, 269, аг74, аз50, азбо, азб4, а365, а370, а372, аз381, а383, а386, а389, а400, а427, а435 і а438.
У переважному втіленні олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність є комплементарною ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, де ділянку нуклеїнової кислоти-мішені вибрано з групи, що складається з а160, а180, а221, а269 і азб0.
У деяких втіленнях олігонуклеотид за винаходом містить або складається з 8-35 нуклеотидів в довжину, як, наприклад, від 9 до 30, як, наприклад, від 10 до 22, як, наприклад, від 11 до 20, як, наприклад, від 12 до 18, як, наприклад, від 13 до 17 або від 14 до 16 суміжних нуклеотидів в довжину. У переважному втіленні олігонуклеотид містить або складається з 16-20 нуклеотидів в довжину. Слід розуміти те, що будь-який інтервал, наведений в даному документі, включає кінцеві точки інтервалу. Відповідно, якщо йдеться про те, що олігонуклеотид включає від 10 до 30 нуклеотидів, включені і 10, і 30 нуклеотидів.
У деяких втіленнях безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 суміжних нуклеотидів в довжину. В переважному втіленні олігонуклеотид містить або складається з 16, 17, 18, 19 або 20 нуклеотидів в довжину.
У деяких втіленнях олігонуклеотид або безперервна нуклеотидних послідовність містить або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з послідовностей, перелічених в
Таблиці 5.
У деяких втіленнях антисмисловий олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною ідентичністю, переважно із 100 95-ною ідентичністю з послідовністю, вибраної з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 5-743 (див. мотиви послідовностей, перелічені в Таблиці 5).
У деяких втіленнях антисмисловий олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною ідентичністю, переважно із 100 95-ною ідентичністю з послідовністю, що вибрана з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 5-743 і 771.
У деяких втіленнях антисмисловий олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною ідентичністю, переважно із 100 95-ною ідентичністю з послідовністю, вибраної з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, А15, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 і 735.
У деяких втіленнях антисмисловий олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною ідентичністю, переважно із 100 95-ною ідентичністю з БЕО ІЮО МО: 287.
У деяких втіленнях антисмисловий олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною ідентичністю, переважно із 100 95-ною ідентичністю з БЕО ІЮО МО: 342.
У деяких ввтіленнях антисмисловий олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною ідентичністю, переважно із 100 95-ною ідентичністю з БЕО ІЮ МО: 640.
У деяких втіленнях антисмисловий олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною ідентичністю, переважно із 100 95-ною ідентичністю з БЕО ІЮ МО: 466.
У деяких втіленнях антисмисловий олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 10-30 нуклеотидів в довжину з щонайменше 90 95-ною ідентичністю, переважно із 100 95-ною ідентичністю з БЕО ІЮ МО: 566.
У втіленнях, де олігонуклеотид довше, ніж безперервна нуклеотидна послідовність (яка комплементарна нуклеїновій кислоті-мішені), мотиви послідовностей в Таблиці 5 утворюють частину безперервної нуклеотидної послідовності антисмислових олігонуклеотидів за винаходом. У деяких втіленнях послідовність олігонуклеотиду є еквівалентною безперервній нуклеотидній послідовності (наприклад, якщо не додаються біорозщеплювальні лінкери).
Зрозуміло те, що безперервні послідовності з нуклеїнових основ (мотив послідовності) можуть бути модифіковані, наприклад, для збільшення стійкості до нуклеаз та/або афінності
Зо зв'язування з нуклеїновою кислотою-мішенню. Модифікації описуються у визначеннях і в розділі "Конструкція олігонуклеотидів". У Таблиці 5 перелічені переважні конструкції кожного мотиву послідовності.
Конструкція олігонуклеотиду
Термін "конструкція олігонуклеотиду" відноситься до картини модифікацій цукру нуклеозидів в послідовності олігонуклеотиду. Олігонуклеотиди за винаходом містять нуклеозиди з модифікованим цукром і також можуть містити нуклеозиди ДНК або РНК. У деяких втіленнях олігонуклеотид містить нуклеозиди з модифікованим цукром і нуклеозиди ДНК. Включення модифікованих нуклеозидів в олігонуклеотид за винаходом може збільшувати афінність олігонуклеотиду відносно нуклеїнової кислоти-мішені. В даному випадку модифіковані нуклеозиди можна називати модифікованими нуклеотидами, що збільшують афінність, модифіковані нуклеозиди також можна називати ланками.
В одному втіленні олігонуклеотид містить щонайменше 1 модифікований нуклеозид, як, наприклад, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15 або щонайменше 16 модифікованих нуклеозидів. В одному втіленні олігонуклеотид містить від 1 до 10 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, від 2 до 8 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, від З до 7 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, від 4 до 6 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, 3, 4, 5, 6 або 7 модифікованих нуклеозидів.
В одному втіленні олігонуклеотид містить один або більше ніж один нуклеозид з модифікованим цукром, як, наприклад, нуклеозиди, модифіковані 2'-цукром. Переважно олігонуклеотид за винаходом містить один або більше ніж один нуклеозид, модифікований 2'- цукром, незалежно вибраний з групи, що складається з 2'-О-алкіл- РНК, 2'-О-метил-РНК, 2-0- алкокси-РНК, 2'-О-метоксіетил- РНК, 2'-аміно-ДНК, 2'"-фтор-ДНК, арабінонуклеїнової кислоти (АМА), 2'-фтор-АМА і нуклеозидів Ї МА. Навіть білош переважно один або більш ніж один модифікований нуклеозид являє собою замкнену нуклеїнову кислоту (І МА).
В іншому втіленні олігонуклеотид містить щонайменше один модифікований міжнуклеозидний зв'язок. В переважному втіленні всі міжнуклеозидні зв'язки в межах безперервної нуклеотидної послідовності являють собою фосфоротіоатні або боранофосфатні бо міжнуклеозидні зв'язки. У деяких втіленнях всі міжнуклеозидні зв'язки в безперервній послідовності олігонуклеотиду являють собою фосфоротіоатні зв'язки.
У деяких втіленнях олігонуклеотид за винаходом містить щонайменше один нуклеозид І МА, як, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 нуклеозидів І МА, як, наприклад, від 2 до 6 нуклеозидів
ІГМА, як, наприклад, від З до 7 нуклеозидів І МА, від 4 до б нуклеозидів І МА або 3, 4, 5, 6 або 7 нуклеозидів МА. У деяких втіленнях щонайменше 75 95 модифікованих нуклеозидів в олігонуклеотиді являють собою нуклеозиди І МА, як, наприклад, 80 95, як, наприклад, 85 95, як, наприклад, 90 95 модифікованих нуклеозидів являють собою нуклеозиди МА В ще одному іншому втіленні всі модифіковані нуклеозиди в олігонуклеотиді являють собою нуклеозиди І МА.
В іншому втіленні олігонуклеотид може містити і бета-О-окси-Ї МА, і один або більше ніж один з наступних нуклеозидів І МА: тіо-І МА, аміно-Ї МА, окси-Ї МА та/або ЕМА або в бета-О, або в альфа-їЇ. конфігураціях, або їх комбинації. В іншому втіленні всі цитозинові ланки І МА являють собою 5-метилцитозин. В переважному втіленні олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність має щонайменше 1 нуклеозид І МА на 5'-кінці і щонайменше 2 нуклеозиди І МА на 3-кінці нуклеотидної послідовності.
У деяких втіленнях олігонуклеотид за винаходом містить щонайменше один модифікований нуклеозид, якийй являє собою нуклеозид 2'-МОБ-РНК, як, наприклад, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10 нуклеозидів 2'-МОБ-РНК. У деяких втіленнях щонайменше один з зазначених модифікованих нуклеозидів являє собою 2'-фтор-ДНК, як, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 нуклеозидів 2"- фтор-ДНК.
У деяких втіленнях олігонуклеотид за винаходом містить щонайменше один нуклеозид І МА і щонайменше один 2'-заміщений модифікований нуклеозид.
У деяких втіленнях винаходу олігонуклеотид містить і нуклеозиди, модифіковані 2'-цукром, і ланки ДНК. Переважно олігонуклеотид містить і нуклеотиди (ланки) Ї МА, ї ДНК. Переважно об'єднане загальне число ланок І МА і ДНК становить 8-30, як, наприклад, 10-25, переважно 12- 22, як, наприклад, 12-18, навіть білльш переважно 11-16. У деяких втіленнях винаходу нуклеотидна послідовність олігонуклеотиду, така як безперервна нуклеотидна послідовність, складається з щонайменше з одного або двох нуклеотидів І МА, та інші нуклеозиди являють собою ланки ДНК. У деяких втіленнях олігонуклеотид містить тільки нуклеозиди ІМА і нуклеозиди, що зустрічаються в природі (такі як нуклеозиди РНК або ДНК, найбільш переважно нуклеозиди ДНК), можливо з модифікованими міжнуклеозидними зв'язками, такими як фосфоротіоатний.
В одному втіленні винаходу олігонуклеотид за винаходом здатний рекрутувати РНКазу Н.
Структурна конструкція олігонуклеотиду за винаходом може бути вибрана з гепмерів, олігонуклеотидів з розірваним гепом, хедмерів і тейлмерів.
Конструкція гепмера
В переважному втіленні олігонуклеотид за винаходом має конструкцію або структуру гепмера, що також зветься в даному документі просто "гепмер". У структурі гепмера олігонуклеотид містить щонайменше три відмінні структурні ділянки: 5'-фланг, геп і 3'-фланг, Б-
С-Е в орієнтації "5 -» 3". У даній конструкції фланкуючі ділянки Е і ЕР" (також звані ділянки крил) містять безперервний відрізок модифікованих нуклеозидів, які є комплементарними нуклеїновій кислоті-мішені РО-І 1, тоді як ділянка гепа - С - містить безперервний відрізок нуклеотидів, який здатний рекрутувати нуклеазу, переважно ендонуклеазу, таку як РНКаза, наприклад, РНКаза Н, коли олігонуклеотид знаходиться в дуплексі з нуклеїновою кислотою-мішенню. Нуклеозиди, які здатні рекрутувати нуклеазу, зокрема РНКазу Н, можуть бути вибрані з групи, що складається
ДНК, альфач-ї -окси-І МА, 2'-фтор-АМА і ОМА. Ділянки Е і ЕР фланкуючі 5'- і 3"-кінці ділянки С, переважно містять нуклеозиди, що не рекрутують нуклеазу (нуклеозиди з 3'-ендоструктурою), більш переважно один або більш ніж один модіфікованій нуклеозид, що збільшує афінність. У деяких втіленнях 3'-фланг містіть щонайменше один нуклеозид І МА, переважно щонайменше 2 нуклеозиди МА. У деяких втіленнях 5'-фланг містіть щонайменше один нуклеозид І МА. У деяких втіленнях обидві 5'- і 3'-фланкуючі ділянки містять нуклеозид І МА. У деяких втіленнях всі нуклеозиди в даних фланкуючих ділянках являють собою нуклеозиди І МА. В інших втіленнях фланкуючі ділянки можуть містити і нуклеозиди І МА, та інші нуклеозиди (змішані фланги), такі як нуклеозиди ДНК та/або модифіковані нуклеозиди, які не є нуклеозидами І МА, такими як 2'- заміщені нуклеозиди. В даному випадку геп визначається як безперервна послідовність з щонайменше 5 нуклеозидів, рекрутуючих РЕНКазу Н (нуклеозиди з 2'-ендоструктурою, переважно ДНК), фланкована на 5- і 3-кінці модифікованим нуклеозидом, що збільшує афінність, переважно І МА, таким як бета -Ю0-окси-І МА. Отже, нуклеозиди 5'-фланкуючої ділянки та 3--фланкуючої ділянки, які є суміжними з ділянкою гепа, являють собою модифіковані нуклеозиди, переважно нуклеозиди, що не рекрутують нуклеазу. 60 Ділянка Е
Ділянка Е (5'-фланг або 5-крило), приєднана до "5-кінця ділянки б, включає, містить або складається з щонайменше одного модифікованого нуклеозиду, як, наприклад, з щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7 модифікованих нуклеозидів. В одному втіленні ділянка Е містить або складається з від 1 до 7 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 2-6 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 2- 6 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 2-5 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 2-4 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 1-3 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 1, 2, 3 або 4 модифікованих нуклеозидів. Ділянка Е визначається наявністю щонайменше одного модифікованого нуклеозидуу на 5'-кінці і 3'-кінці даної ділянки.
У деяких втіленнях модифіковані нуклеозиди в ділянці Е маєють З3'-ендоструктуру.
В одному втіленні один або більше ніж один модифікований нуклеозид в ділянці Е являє собою 2'-модифікований нуклеозид. В одному втіленні всі нуклеозиди в ділянці Є являють собою 2'"-модифіковані нуклеозиди.
В іншому втіленні ділянка Е містить ДНК та/або РНК, крім 2'-модифікованих нуклеозидів.
Фланги, що містять ДНК та/або РНК, характеризуються наявністю 2'-модифікованого нуклеозиду на 5-кінці і З'-кінці (поруч з ділянкою (1) ділянки БЕ. В одному втіленні ділянка Е містить нуклеозиди ДНК, як, наприклад, від 1 до З суміжних нуклеозидів ДНК, як, наприклад, від 1 до З або від 1 до 2 суміжних нуклеозидів ДНК. Дані нуклеозиди ДНК у флангах переважно не повинні бути здатні рекрутувати РНКазу Н. У деяких втіленнях 2'-модифіковані нуклеозиди і нуклеозиди
ДНК та/або РНК в ділянці Е чергуються з 1-3 2'-модифікованими нуклеозидами і 1-3 нуклеозидами ДНК та/або РНК. Такі фланги также можуть зватися флангами з чергуванням.
Довжина 5'-фланга (ділянки Е) в олігонуклеотидах з флангами з чергуванням може складати від 4 до 10 нуклеозидів, як, наприклад, від 4 до 8, як, наприклад, від 4 до 6 нуклеозидів, як, наприклад, 4, 5, 6 або 7 модифікованих нуклеозидів. У деяких втіленнях тільки 5'-фланг олігонуклеотиду є флангом з чергуванням. Конкретними прикладами ділянки Е нуклеозидами, що чергуються, є: 21-8-М'1-4-2-3 21-2-М 12-22 М'1-2-2-2, де 2 показує модифікований нуклеозид, і М''являє собою РНК або ДНК. У деяких втіленнях
Зо всі модифіковані нуклеозиди у флангах з чергуванням являють собою І МА, а М' являє собою
ДНК. В іншому втіленні один або більше ніж один 2'і-модифікований нуклеозид в ділянці Е вибраний з ланок 2'-О-алкіл- РНК, 2'і-О-метил-РНК, ланок 2'-аміно-ДНК, ланок 2'-фтор-ДНК, 2'- алкокси-РНК, ланок МОЕ, ланок І МА, ланок арабінонуклеїнової кислоти (АМА) і ланок 2'-фтор-
АМА.
У деяких втіленнях ділянка Е містить і нуклеозид І!МА, і 2'-'заміщений модифікований нуклеозид. Вони часто називаються олігонуклеотидами зі змішаними крилами або зі змішаними флангами.
В одному втіленні винаходу всі модифіковані нуклеозиди в ділянці Е являють собою нуклеозиди І МА. В іншому втіленні всі нуклеозиди в ділянці Е являють собою нуклеозиди І МА.
В іншому втіленні нуклеозиди І МА в ділянці Е незалежно вибрані з групи, що складаються з окси-І МА, тіо-І МА, аміно-І МА, СЕТ та/або ЕМА або в бета-0, або в альфа-Ї конфигураціях, або їх комбинації. В переважному втіленні ділянка Е містить щонайменше 1 ланку бета-О-окси І МА на 5"-кінці безперервної послідовності.
Ділянка С
Ділянка С (ділянка гепа) переважно включає, містить або складається з щонайменше 4, як, наприклад, з щонайменше 5, як, наприклад, з щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15 або щонайменше 16 послідовних нуклеозидів, здатних рекрутувати вищезгадану нуклеазу, зокрема РНКазу Н. В іншому втіленні ділянка З включає,
БО містить або складається з від 5 до 12 або від б до 10, або від 7 до 9, як, наприклад, з 8 послідовних нуклеотидних ланок, здатних рекрутувати вищезгадану нуклеазу.
Нуклеозидні ланки в ділянці С, які здатні рекрутувати нуклеазу, в одному втіленні вибрані из групи, що складається з ДНК, альфа-І-ІМА, С4-алкілованої ДНК (як описано в
РСТ/ЕР2О09/050349 і Мевіеєг еї а!., Віоогд. Мед. Спет. Гей. 18 (2008) 2296 - 2300, які обидві включені в даний документ за допомогою посилання), нуклеозидів, що походять з арабінози, подібних АМА і 2'Є-АМА (Мапооз евї а. 2003 У. АМ. СНЕМ. 506. 125, 654-661), ОМА (незамкнена нуклеїнова кислота) (як описано в Рішйег еї аї., Мої. Віозуві., 2009, 10, 1039, включеної в даний документі за допомогою посилання). ОМА являє собою незачинену нуклеїнову кислоту, типово де зв'язок між С2 і СЗ рибози було видалено, утворюючи незамкнений "цукровий" залишок. бо В ще одному іншому втіленні щонайменше одна нуклеозидна ланка в ділянці С являє собою нуклеозидну ланку ДНК, як, наприклад, від 1 до 18 ланок ДНК, як, наприклад, 2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 ланок ДНК, переважно від 2 до 17 ланок ДНК, як, наприклад, від
З до 16 ланок ДНК, як, наприклад, від 4 до 15 ланок ДНК, як, наприклад, від 5 до 14 ланок ДНК, як, наприклад, від 6 до 13 ланок ДНК, як, наприклад, від 7 до 12 ланок ДНК, як, наприклад, від 8 до 11 ланок ДНК, більш переважно від 8 до 17 ланок ДНК або від 9 до 16 ланок ДНК, від 10 до 15 ланок ДНК або від 11 до 13 ланок ДНК, як, наприклад, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ланок
ДНК. У деяких втіленнях ділянка с складається з 100 95 ланок ДНК.
В інших втіленнях ділянка З може складатися з суміші ДНК та інших нуклеозидів, здатних опосередковувати розщеплення РНКазою Н. Ділянка С може складатися з щонайменше 50 95
ДНК, більш переважно - з 60 95, 70 95 або 80 95 ДНК, і навіть більш переважно з 90 95 або 95 95
ДНК.
В ще одному іншому втіленні щонайменше одна нуклеозидна ланка в ділянці С являє собою нуклеозидну ланку альфа-І-Ї МА, як, наприклад, щонайменше одну данку альфа-їЇ -І МА, як, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9 ланок альфа-ї -Ї МА. В іншому втіленні ділянка С містить щонайменше одну ланку альфа-1Ї-І МА, яка являє собою ланку альфа-і -окси-Ї МА. В іншому втіленні ділянка с містить комбинацію нуклеозидних ланок ДНК і альфа-і -І МА.
У деяких втіленнях нуклеозиди в ділянці з мають 2'-ендоструктуру.
У деяких втіленнях ділянка б може містити нуклеозид, що розриває геп, який приводить до олігонуклеотиду з розірваним гепом, який здатний рекрутувати РНКазу Н.
Ділянка Е"
Ділянка РЕ" (3'-фланг або 3'-крило), приєднана до "З-кінця ділянки б, включає, містить або складається з щонайменше одного модифікованого нуклеозиду, як, наприклад, з щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7 модифікованих нуклеозидів. В одному втіленні ділянка ЕР" містить або складається з від 1 до 7 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 2-6 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 2- 4 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 1-3 модифікованих нуклеозидів, як, наприклад, з 1,2, З або 4 модифікованих нуклеозидів. Ділянка Е" визначається наявністю щонайменше одного модифікованого нуклеозиду на 5'-кінці і на 3'-кінці даної ділянки.
У деяких втіленнях модифіковані нуклеозиди в ділянці Е" мають 3'-ендоструктуру.
В одному втіленні один або більше ніж один модифікований нуклеозид в ділянці Е'" являє собою 2'-модифікований нуклеозид. В одному втіленні всі нуклеозиди в ділянці Е" являють собою 2'"-модифіковані нуклеозиди.
В одному втіленні один або більше ніж один модифікований нуклеозид в ділянці Е" являє собою 2'"-модифікований нуклеозид.
В одному втіленні всі нуклеозиди в ділянці Е' являють собою 2'-модифіковані нуклеозиди. В іншому втіленні ділянка Е" містить ДНК та/або РНК, крім 2'-модифікованих нуклеозидів. Фланги, що містять ДНК та/або РНК, характеризуються наявністю 2'--модифікованого нуклеозиду на 5'- кінці (суміжному з ділянкою (5) і З'-кінці ділянки ЕР. В одному втіленні ділянка ЕР" містить нуклеозиди ДНК, як, наприклад, від 1 до 4 суміжних нуклеозидів ДНК, як, наприклад, від 1 до З або від 1 до 2 суміжних нуклеозидів ДНК. Дані нуклеозиди ДНК у флангах переважно не повинні бути здатні рекрутувати РНКазу Н. У деяких втіленнях 2'-модифіковані нуклеозиди і нуклеозиди
ДНК та/або РНК в ділянці Е' чергуються з 1-3 2'--модифікованими нуклеозидами і 1-3 нуклеозидами ДНК та/або РНК, причому такі фланги також можуть зватися флангами з чергуванням. Довжина 3'-фланга (ділянки Е") в олігонуклеотидах з флангами з чергуванням може складати від 4 до 10 нуклеозидів, як, наприклад, від 4 до 8, як, наприклад, від 4 до 6 нуклеозидів, як, наприклад, 4, 5, б або 7 модифікованих нуклеозидів. У деяких втіленнях тільки
З'і-рланг олігонуклеотиду є флангом з чергуванням. Конкретними прикладами ділянки Е"' з нуклеозидами, що чергуються, є: 21-8-М'1-4-2-3
БО 21-2-М 12-22 М'1-2-2-2, де 2 показує модифікований нуклеозид, і М''являє собою РНК або ДНК. У деяких втіленнях всі модифіковані нуклеозиди у флангах з чергуванням являють собою І МА, а М'являє собою
ДНК. В іншому втіленні модифіковані нуклеозиди в ділянці ЕР" вибрані з ланок 2'-О-алкіл-«РНК, 2"-
О-метил-РНК, ланок 2'-аміно-ДНК, ланок 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, ланок МОЕ, ланок І МА, ланок арабінонуклеїнової кислоти (АМА) і ланок 2'-фтор-АМА.
У деяких втіленнях ділянка Р" містить і І МА і 2'-заміщений модифікований нуклеозид. Вони часто називаються олігонуклеотидами зі змішаними крилами або зі змішаними флангами.
В одному втіленні винаходу всі модифіковані нуклеозиди в ділянці Е"7 являють собою нуклеозиди І МА. В іншому втіленні всі нуклеозиди в ділянці Е" являють собою нуклеозиди І МА. бо В іншому втіленні нуклеозиди І МА в ділянці Е" незалежно вибрані з групи, що складаються з окси-І МА, тіо-І МА, аміно-І МА, СЕТ та/або ЕМА або в бета-0, або в альфа-Ї конфигураціях, або їх комбинації. В переважному втіленні ділянка Е" має щонайменше 2 ланки бета-О-окси І МА на 3'-кінці безперервної послідовності.
Ділянка" і Ю"
Ділянка Б" ї Юр" може бути приєднана до 5'-кінця ділянки Б або до 3-кінця ділянки РЕ відповідно. Ділянка ОС" або О" є опцією.
Ділянка 0" ії 0" може незалежно містити від 0 до 5, як, наприклад, від 1 до 5, як, наприклад, від 2 до 4, як, наприклад, 0, 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових нуклеотидів, які можуть бути комплементарними або некомплементарними нуклеїновій кислоті-мішені. В даному відношенні олігонуклеотид за винаходом може у деяких втіленнях містити безперервну нуклеотидну послідовність, здатну модулювати мішень, яка фланкована на 5'- та/або 3'-кінці додатковими нуклеотидами. Такі додаткові нуклеотиди можуть служити як нуклеазочутливий біорозщеплювальний лінкер (див. визначення лінкерів). У деяких втіленнях додаткові 5'- та/або 3'-кінцеві нуклеозиди зв'язані фосфодіефірними зв'язками і можуть являти собою ДНК або РНК.
В іншому втіленні додаткові 5'- та/або 3'-кінцеві нуклеозиди являють собою модифіковані нуклеозиди, які можуть бути включені, наприклад, для збільшення нуклеазостійкості або для легкості синтезу. В одному втіленні олігонуклеотид за винаходом містить ділянку р" та/або р" на 5- або 3"-кінці безперервної нуклеотидної послідовності. В іншому втіленні ділянка С" та/або 0" складається з 1-5 нуклеозидів ДНК або РНК, зв'язаних фосфодіефірними зв'язками, які не є комплементарними нуклеїновій кислоті-мішені.
Гепмерний олігонуклеотид з даним винаходом може бути представлений наступними формулами: 3-Б-а-Е-3"; зокрема, Е1-7-Сб4-л12-Е-7 5-р'-Б-а-РЕ-3", зокрема, 0/-3-Е1-7-С4-12-Е-7 5-Б-а-Е-0"-3", зокрема, Е1-7-б4-12-Еч--07-3 5-р'АБ-а-Р-р'-3", зокрема, О"1-3-Е1-7-С1412-ЕЧ-7-074-3
Переважне число і типи нуклеозидів в ділянках Е, і ЕР", р ї ЮО" були описані вище. Кон'югати олігонуклеотидів за даним винаходом мають ділянку С, ковалентно приєднану або до 5", або до 3-кінця олігонуклеотиду, зокрема гепмерних олігонуклеотидів, представлених вище. В одному
Зо втіленні кон'югат олігонуклеотиду за винаходом містить олігонуклеотид з формулою 5'-0-Е-(4-Е-
З' або 5-Б-С0-Е-0"-3, де ділянки Е і Е" незалежно містять 1-7 модифікованих нуклеозидів, Сі являє собою ділянку з 6-16 нуклеозидів, які здатні рекрутувати РНКазу Н, і ділянка С" або 0" містить 1-5 нуклеозидів, зв'язаних фосфодіефірними зв'язками. Переважно ділянка Р" або 0" присутня в кінці олігонуклеотиду, де розглядається кон'югування з кон'югатним угрупованням.
Приклади олігонуклеотидів з флангами з чергуванням можуть бути представлені наступними формулами: 21-8-М'1-а4-24-8-С36-12-21-2-М'1-4-211-4 21-2-М-2-2-2-М1-2-211-2-С6-12-21-2-М1-2-2-2- М'1-2-211-2
Е-Св-1і2-24-2-М'1-4-214-4
Е-Св-1і2-24-2-М'1-2-274-2-М'1-2-24-2 21-8-М'-а-214-3-С6-12-Е 21-2-М-2-24-2-М1-2-21-2- 6-12 де фланг зазначений Е або Р", якщо він містить тільки 2'-модифіковані нуклеозиди, такі як нуклеозиди І МА. Переважне число і типи нуклеозидів в ділянках з чергуванням і ділянки Е, С і
Е,б'їОр" були описані вище.
У деяких втіленнях олігонуклеотид являє собою гепмер, що складається з 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 нуклеотидів в довжину, де кожна з ділянок Е і Е'" незалежно складається з 1, 2, З або 4 модифікованих нуклеозних ланок, комплементарних нуклеїновій кислоті-мішені РО-І 1, ії ділянка о складається з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 нуклеозидних ланок, здатних рекрутувати нуклеазу при знаходженні в дуплексі з нуклетїновою кислотою-мішенню РО-171, ії ділянка 0" складається з 2 ДНК, зв'язаних фосфодіефірним зв'язком.
В інших втіленнях олігонуклеотид являє собою гепмер, в якому кожна з ділянок Е і г незалежно складається з 3, 4, 5 або 6 модифікованих нуклеозних ланок, таких як нуклеозидні ланки, що містять цукор 2'-О-метоксіетил-рибозу (2'-МОЕ), або нуклеозидні ланки, що містять цукор 2'-фтор-дезоксирибозу, та/або ланки І МА, і ділянка С складається з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 нуклеозидних ланок, таких як ланки ДНК або інші нуклеозиди, рекрутуючі нуклеазу, такі як І-І МА або суміш нуклеозидів ДНК і нуклеозидів, рекрутуючих нуклеазу.
В іншому конкретному втіленні олігонуклеотид являє собою гепмер, в якому кожна з ділянок
Е ї ЕР складається з двух ланок І МА, і ділянка С складається з 12, 13, 14 нуклеозидних ланок, бо переважно ланок ДНК. Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають 2-12-2, 2-13-2 і
2-14-2.
В іншому конкретному втіленні олігонуклеотид являє собою гепмер, в якому кожна з ділянок
Е ї Е незалежно складається з трьох ланок І МА, і ділянка с складається з 8, 9, 10, 11, 12, 13 або 14 нуклеозидних ланок, переважно ланок ДНК. Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають 3-8-3, 3-9-3 3-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3 і 3-14-3.
В іншому конкретному втіленні олігонуклеотид являє собою гепмер, в якому кожна з ділянок
Е ї Е" складається з чотирьох ланок І МА, і ділянка С складається з 8 або 9, 10, 11 або 12 нуклеозидних ланок, переважно ланок ДНК. Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають 4-8-4, 4-9-4, 4-10-4, 4-11-4 і 4-12-4.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 6 нуклеозидами і, незалежно, з 1-4 модифікованих нуклеозидів в крилах, включаючи гепмери 1-6-1, 1-6-2, 2-6-1, 1-6-3, 3-6-1, 1-6-4, 4-6-1, 2-6-2, 2-6-3, 3-6-2 2-6-4, 4-6-2, 3-6-3, 3-6-4 і 4-6-3.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-С2-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 7 нуклеозидами і, незалежно, з 1-4 модифікованих нуклеозидів в крилах, включаючи гепмери 1-7-1, 2-7-1, 1-7-2, 1-7-3, 3-7-1, 1-7-4, 4-7-1, 2-7-2, 2-7-3, 3-7-2, 2-7-4, 4-7-2, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 і 4-7-4.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 8 нуклеозидами і, незалежно, з 1-4 модифікованих нуклеозидів в крилах, включаючи гепмери 1-8-1, 1-8-2, 1-8-3, 3-8-1, 1-8-4, 4-8-1,2-8-1, 2-8-2, 2-8-3, 3-8-2, 2-8-4,, 4-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3 і 4-8-4.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 9 нуклеозидами і, незалежно, з 1-4 модифікованих нуклеозидів в крилах, включаючи гепмери 1-9-1, 2-9-1, 1-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 1-9-4, 4-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 2-9-4, 4-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3 і 4-9-4.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 10 нуклеозидами, включаючи гепмери 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3- 10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 і 4-10-4.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 11 нуклеозидами, включаючи гепмери 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3- 11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 і 4-11-4.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 12 нуклеозидами, включаючи гепмери 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3- 12-1, 1-12-4, 4-12-1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 і 4-12-4.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-С2-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 13 нуклеозидами, включаючи гепмери 1-13-1, 2-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3- 13-1, 1-13-4, 4-13-1, 2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13-4, 4-13-3 і 4-13-4.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 14 нуклеозидами, включаючи гепмери 1-14-1, 2-14-1, 1-14-2, 1-14-3, 3- 14-1, 1-14-4, 4-14-1, 2-14-2, 2-14-3, 3-14-2, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14-4, 4-14-3 і 4-14-4.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 15 нуклеозидами, включаючи гепмери 1-15-1, 2-15-1, 1-15-2, 1-15-3, 3- 15-1, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-2, 2-15-3, 3-15-2, 2-15-4, 4-15-2 і 3-15-3.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 16 нуклеозидами, включаючи гепмери 1-16-1, 2-16-1, 1-16-2, 1-16-3, 3- 16-1, 1-16-4, 4-16-1, 2-16-2, 2-16-3, 3-16-2, 2-16-4, 4-16-2 і 3-16-3.
Конкретні конструкції гепмерів даної природи включають конструкції Е-(23-Р", вибрані з групи, що складається з гепа з 17 нуклеозидами, включаючи гепмери 1-17-1, 2-17-1, 1-17-2, 1-17-3, 3- 17-1, 1-17-4, 4-17-1, 2-17-2, 2-17-3 1 3-17-2.
У всіх випадках конструкція Е-С-Е" може додатково включати ділянку 0" та/або О", яка може мати 1, 2 або 3 нуклеозидних ланки, таких як ланки ДНК, таких як 2 ланки ДНК, зв'язаних 2- фосфодіефіром. Переважно нуклеозиди в ділянці Е і ЕР являють собою модифіковані нуклеозиди, тоді як нуклеотиди в ділянці З переважно являють собою немодифіковані нуклеозиди.
При кожній конструкції переважним модифікованим нуклеозидом є І МА.
В іншому втіленні всі міжнуклеозидні зв'язки в гепі в гепмері являють собою фосфоротіоатні та/або боранофосфатні зв'язки. В іншому втіленні всі міжнуклеозидні зв'язки у флангах (ділянки
Е ї Р) в гепмері являють собою фосфоротіоатні талабо боранофосфатні зв'язки. В іншому переважному втіленні всі міжнуклеозидні зв'язки в ділянці СО'бї 0" в гепмері являють собою бо фосфодіефірні зв'язки.
Зо
Для конкретних гепмерів, як розкрито в даному документі, при анотації залишків цитозину (С) як 5-метил-цитозин в різних втіленнях один або більше ніж один С, присутній в олігонуклеотиді, може являти собою немодифікований залишок С.
В конкретному втіленні гепмер являє собою так званий шортмер, як описано в УМО 2008/113832, включеної в даний документ за допомогою посилання.
Додаткові конструкції гепмерів розкриті в МО 2004/046160, МО 2007/146511 і включені за допомогою посилання.
Для деяких втіленнях винаходу олігонуклеотид вибраний з групи олігонуклеотидних сполук з
СМР-ІО-МО від 5 1 до 743 1771 1.
Для деяких втілень винаходу олігонуклеотид вибраний з групи олігонуклеотидних сполук з
СМР-ІО-МО 6 1,81,9 1,13 1,41 1,42 1,581, 77 1, 921, 111 1, 128 1, 151 1, 164 1, 166 1,169 1, 171 1, 222 1, 233 1, 245 1, 246 1, 250 1, 251 1, 252 1, 256 1, 272 1, 273 1, 287 1,292 1, 303 1, 314 1, 318 1, 320 1, 324 1, 336 1, 342 1, 343 1, 344 1, 345 1, 346 1, 349 1, 359 1, 360 1, 374 1, 408 1, 409 1, 415 1, 417 1, 424 1, 429 1, 430 1, 458 1, 464 1, 466 1, 474 1, 490 1, 493 1,512 1,519 1, 519 1, 529 1, 533 1, 534 1, 547 1, 566 1, 567 1, 578 1,582 1, 601 1, 619 1, 620 1, 636 1, 637 1, 638 1, 640 1, 645 1,650 1, 651 1, 6521, 653 1, 658 1, 659 1, 660 1, 665 1, 678 1, 679 1, 680 1, 682 1, 683 1, 684 1, 687 1, 694 1, 706 1, 716 1,728 1, 733 1, 734 1, і 735 1.
В одному переважному втіленні винаходу олігонуклеотид являє собою СМР-ІО-МО: 287 1.
В іншому переважному втіленні винаходу олігонуклеотид являє собою СМР-ІО-МО: 342 1.
В іншому переважному втіленні винаходу олігонуклеотид являє собою СМР-ІО-МО: 640 1.
В іншому переважному втіленні винаходу олігонуклеотид являє собою СМР-ІО-МО: 466 1.
В іншому переважному втіленні винаходу олігонуклеотид являє собою СМР-ІО-МО: 566 1.
В іншому втіленні винаходу безперервна нуклеотидна послідовність олігонуклеотидних мотивів і олігонуклеотидних сполук за винаходом містить від двох до чотирьох додаткових нуклеозидів, зв'язаних фосфодіефірним зв'язком, на 5'-кінці безперервної нуклеотидної послідовності (наприклад, ділянки 0). В одному втіленні нуклеозиди служать як біорозщеплювальний лінкер (див. розділ "Біорозщеплювальні лінкери"). В переважному втіленні динуклеотид са (цитидин-аденозин) зв'язаний з 5'-кінцем безперервної нуклеотидної послідовності (тобто з будь-яким з мотивів послідовностей або олігонуклеотидних сполук, перелічених в Таблиці 5) за допомогою фосфодіефірного зв'язку. В переважному втіленні динуклеотид са не є комплементарним послідовності-мішені в положенні, де інша частина безперервного нуклеотиду є комплементарною.
У деяких втіленнях винаходу олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність вибрана з групи, що складається з послідовностей нуклеотидних мотивів з зЕО ІЮ МО: 766, 767, 768, 7691 770.
У деяких втіленнях винаходу олігонуклеотид вибраний з групи, що складається з олігонуклеотидних сполук з СМР-І0О-МО 766 1, 767 1, 768 1, 769 11770 1.
Вуглеводні кон'югатні угруповання
Вуглеводні кон'югатні угруповання включають галактозу, лактозу, М-ацетилгалактозамін, манозу і моноз-б6-фосфат, але не обмежуються ними. Вуглеводні кон'югати можуть використовуватися для збільшення доставки або активності в цілому ряді тканин, таких як печінка та/або м'язи. Див., наприклад, ЕР1І495769, МО 99/65925, мап еї аї., Віосопінд Спет (2009) 20 (2): 213-21. 7аїверіп 6. ОгеївКауа Спет Віодімегв. (2004) 1 (10): 1401-17.
У деяких втіленнях вуглеводні кон'югатні угруповання є багатовалентними, таким чином, що, наприклад, 2, З або 4 ідентичні або неідентичні вуглеводні угруповання можуть бути ковалентно зв'язані з олігонуклеотидом, можливо через лінкер або лінкери. У деяких втіленнях відповідно до винаходу запропоновано кон'югат, що містить олігонуклеотид за винаходом та вуглеводне кон'югатне угруповання. У деяких втіленнях кон'югатне угруповання являє собою або може містити манозу або манозу-6-фосфат. Це особливо корисно для націлювання в м'язові клітини, див., наприклад, О5 2012/122801.
Кон'югатні угруповання, здатні до зв'язування з рецептором асіалоглікопротеїну (АБОРГ) є особливо корисними для націлювання в гепатоцити в печінці. У деяких втіленнях відповідно до винаходу запропонований кон'югат олігонуклеотиду, що містить олігонуклеотид за винаходом і кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну. Кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, містить одне або більше ніж одне вуглеводне угруповання, здатне до зв'язування з рецептором асіалоглікопротеїну (вуглеводні угруповання, що зв'язуються з АБОРГ) з афінністю, рівною або більшою, ніж афінність галактози. Афінності численних похідних галактози відносно рецептора асіалоглікопротеїну були досліджені (див., 60 наприклад, чЧореї, 5.Т. апа Огіскатег, К. УВ.С. 1996 року, 271, 6686) або легко визначаються з використанням способів, типових в даній області.
Одним аспектом даного винаходу є кон'югат антисмислового олігонуклеотиду, що містить а) олігонуклеотид (ділянка А), що містить безперервну нуклеотидну послідовність з 10-30 нуклеотидів в довжина з щонайменш 90 9о-ною комплементарністю до нуклеїнової кислоти- мішені РО-Ї1; ї б) щонайменше одне кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну (ділянка С), ковалентно приєднаної до олігонуклеотидіву в а).
Олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність може бути такою, як описано в будь-якому з розділів "Олігонуклеотиди за винаходом", "Конструкція олігонуклеотидів" і "Конструкція гепмерів".
У деяких втіленнях кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, містіть щонайменше одне вуглеводне угруповання, що зв'язується з АЗРОГ, вибране з групи, що складається з галактози, галактозаміну, М-форміл-галактозаміну, М-ацетилгалактозаміну, М- пропіоніл-галактозаміну, М-н-бутаноїл-галактозаміну і М-ізобутаноїлгалактозаміну. У деяких втіленнях кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, є одновалентним, двовалентним, тривалентним або чотиривалентним (тобто містить 1, 2, З або 4 кінцеві вуглеводні угруповання, здатні до зв'язування з рецептором асіалоглікопротеїну). Переважно кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, є двовалентним, навіть більш переважно тривалентним. В переважному втіленні кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, містить 1-3 угруповання М-ацетилгалактозаміну (СаІМАс) (також зване саіМАс кон'югат). У деяких втіленнях кон'югат олігонуклеотиду містить кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, яке є тривалентним /-/ М- ацетилгалактозамінним ((за!мАс) угрупованням. ЗатМАс кон'югати використовували з фосфодіефірними, метилфосфонатними і РМА антисмисловими олігонуклеотидами (наприклад, 5 5994517 і Напаєїапа еї а!., Віосопіша Спет. 1995 Мом-ЮОес;6(6):695-701, Віеззеп єї аї. 1999
Віоспет у. 340, 783-792, і Маїєг єї аі. 2003 Віосопішд Спет 14, 18-29 ) і міРНК (наприклад, УМО 2009/126933, МО 2012/089352 і МО 2012/083046) і з модифікованими нуклеозидами І МА і 2'-
МОЕ (МО 2014/076196, МО 2014/207232 і МО 2014/179620, які включені тим самим за допомогою посилання).
Для одержання кон'югатного угруповання, націленого на рецептор асіалоглікопротеїну,
Зо вуглеводні угруповання, що зв'язуються з АБРОг (переважно СаіМАс), приєднуються до розгалужувальної молекулі через С-1 вуглеці сахаридоїв. Вуглеводні угруповання, що зв'язуються з А5РОГг, в основному зв'язуються з розгалужувальною молекулою через спейсери.
Переважним спейсером є гнучкий гідрофільний спейсер (патент США 5885968; Віез5зеп еї аї. .).
Мей. Спег. 4-1995 Мої. 39 р. 1538-1546). Переважним гнучким гідрофільним спейсером є ПЕГ (поліетиленгліколь) спейсер. Переважним ПЕГ спейсером є ПЕГЗ спейсер (три етиленових ланки). Розгалужувальною молекулою може бути будь-яка маленька молекула, що допускає приєднання двох або трьох кінцевих вуглеводних угруповань, що зв'язуються з А5РОІ, і додатково забезпечує приєднання точки розгалуження до олігонуклеотидів. Типовою розгалужувальною молекулою є дилізін. Молекула дилізіну містить три аміногрупи, за допомогою яких три вуглеводні угруповання, що зв'язуються з АЗРОГг, можуть бути приєднані до карбоксильної реакційноздатної групи, через яку дилізін може бути приєднаний до олігонуклеотидів. Альтернативними розгалужувальними молекулами можуть бути подвоювач або потроювач, такі як поставляються Сієп Кезеагсй. У деяких втіленнях розгалужувальна молекула може бути вибрана з групи, що складається 3 /1,3-біс-І(5-(4,- диметокситритилокси)пентиламідо|пропіл-2-(2-ціаноетил)-(М,М-діїзопропілу)|фосфорамідиту (номер за каталогом Сіеп Кезеагсі: 10-1920-хх), три-2,2,2-І3-(4,- диметокситритилокси)пропілоксиметилі|етил-|(2-ціаноетил)-(М,М-діїзопропіл)|-фосфорамідиту (номер за каталогом Сіеп Кезеагсі: 10-1922-хХ), трис-2,2,2-І3-(424- диметокситритилокси)пропілоксиметил|метиленоксипропіл-(2-ціаноетил)-(М,М-діїзопропіл) |- фосфорамідиту і 1-(5-(4,4"-диметокси-тритилокси)пентиламідо|-3-(5-флюоренометокси-карбоніл- окси-пентиламідо|-пропіл-2-(2-ціаноетил)-(М,М-діїзопропіл)|-фосфорамідиту (номер за каталогом Сієп Кезеагсп: 10-1925-хх). В УМО 2014/179620 їі заявці РСТ Мо РСТ/ЕР2О0О15/073331 описано одержання різних кон'югатних угруповань саїІМАс (включених тим самим за допомогою посилання). Між розгалужувальною молекулою і олігонуклеотидом може бути вставлений один або більше ніж один лінкер. В переважному втіленні лінкер являє собою біорозщеплювальний лінкер. Лінкер може бути вибраний з лінкерів, описаних в розділі "Лінкери" та його підрозділах.
Кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, зокрема, кон'югатне угруповання СаїІМАс, може бути приєднано до 3' або 5'-кінця олігонуклеотиду з використанням способів, відомих в даній області. В переважних втіленнях кон'югатне угруповання, націлене на бо рецептор асіалоглікопротеїну, зв'язується з 5'-кінцем олігонуклеотиду.
Модулятори фармакокінетики відносно доставлення міРНК були описані в МО 2012/083046 (включеної тим самим за допомогою посилання). У деяких втіленнях вуглеводне кон'югатне угруповання містить модулятор фармакокінетики, вибраний з групи, що складається з гідрофобної групи, що має 16 або більше атомів вуглецю, гідрофобної групи, що має 16-20 атомів вуглецю, пальмітоїлу, гексадек-в-еноїлу, олеїлу, (9Е,12Е)-октадека-9,12-діеноїлу, діоктаноїлу, С16-С20-ацилу і холестерину. В переважному втіленні вуглеводне кон'югатне угруповання, що містить модулятор фармакокінетики, являє собою саїЇМАс кон'югат.
Переважні вуглеводні кон'югатні угруповання містять від одного до трьох кінцевих вуглеводних угруповань, що зв'язуються з АБРОГ, переважно угруповання /-- М- ацетилгалактозаміну. У деяких втіленнях вуглеводне кон'югатне угруповання містить три вуглеводні угруповання, що зв'язуються з АБРОгГ, переважно М-ацетилгалактозамінні угруповання, зв'язані через спейсер з розгалужувальною молекулою. Спейсерна молекула може мати довжину від 8 до 30 атомів. Переважне вуглеводне кон'югатне угруповання містить три кінцеві саіМАс угруповання, зв'язані через ПЕГ спейсер з розгалужувальною молекулою дилізином. Переважно ПЕГ спейсер являє собою ЗПЕГ. Відповідні кон'югатні угруповання, націлені на рецептор асіалоглікопротеїну, показано на Фіг. 1. Переважне кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, показано на Фіг. 3.
Інші сЗаіМАс кон'югатні угруповання можуть включати, наприклад, маленькі пептиди з приєднаними (заіМАс угрупованнями, такі як Туг-СІШ-Сіи- (аміногексил-(заїмМАс)3 (МЕЕ (апсаІМАс)З; глікотрипептид, який зв'язується з рецептором асіалоглікопротеїну на гепатоцитах, див., наприклад, ий, еї аІ.,, МеїШйоаз Еплутої, 2000, 313, 297); галактозні кластери на основі лізину (наприклад, І 324; Вієззеп, єї аі!., Сагдомазс. Мед., 1999, 214); і галактозні кластери на основі холану (наприклад, мотив розпізнавання вуглеводу для рецептора асіалоглікопротеїну).
У деяких втіленнях винаходу кон'югат антисмислового олігонуклеотиду вибраний з групи, що складається з наступних СРМ ІО МО: 766 2,767 2,768 2,769 21770 2.
В переважному втіленні кон'югат антисмислового олігонуклеотиду відповідає сполуці, представленій на Фіг. 4.
В іншому переважному втіленні кон'югат антисмислового олігонуклеотиду відповідає сполуці, представленій на Фіг. 5.
Зо В іншому переважному втіленні кон'югат антисмислового олігонуклеотиду відповідає сполуці, представленій на Фіг. 6.
В іншому переважному втіленні кон'югат антисмислового олігонуклеотиду відповідає сполуці, представленій на Фіг. 7.
В іншому переважному втіленні кон'югат антисмислового олігонуклеотиду відповідає сполуці, представленій на Фіг. 8.
Лінкери
Біорозщеплювальні лінкери (ділянка В)
Застосування кон'югата часто асоційоване з поліпшеними фармакокінетичними або фармакодинамічними властивостями. Однак присутність кон'югатного угруповання може перешкоджати активності олігонуклеотиду проти наміченої мішені, наприклад за допомогою стеричної перешкоди, що запобігає гібридизації або рекрутуванню нуклеази (наприклад, РНКази
Н). Застосування фізіологічно лабільною зв'язку (біорозщеплювального лінкера) між олігонуклеотидом (ділянка А або перша ділянка) і кон'югатним угрупованням (ділянка С або третя ділянка) забезпечує поліпшення якості через присутність кон'югатного угруповання при забезпеченні того, що при знаходженні в тканині-мішені кон'югатна група не запобігає ефективній активності олігонуклеотиду.
Розщеплення фізіологічно лабільного зв'язку відбувається спонтанно при досягненні молекулою, що містить лабільний зв'язок, відповідного внутрішньо- та/або позаклітинного середовища. Наприклад, рН-лабільний зв'язок може розщеплюватися під час вступу молекули в підкислену ендосому. Таким чином, рАН-лабільний зв'язок може розглядатися як зв'язок, що розщеплюється в ендосомі. Зв'язки, що розщеплюються ферментом, можуть розщеплюватися при впливі ферментів, таких як фермети, присутні в ендосомах або в лізосомах, або в цитоплазмі. Дисульфідний зв'язок може розщеплюватися під час вступу молекули в більш відновлювальне середовище цитоплазми клітини. Таким чином, дисульфід може розглядатися як зв'язок, розщеплювальний в цитоплазмі. рН-лабільний зв'язок в тому вигляді, в якому цей термін використовується в даному документі, являєтє собою лабільний зв'язок, який селективно розщеплюється при кислотних умовах (рН менше 7). Такі зв'язки також можуть називатися ендосомно-лабільними зв'язками, тому що клітинні ендосоми і лізосоми мають рН менше, ніж 7.
Для біорозщеплювальних лінкерів, асоційованих з кон'югатним угрупованням для таргетного бо доставлення, переважним є те, що швидкість розщеплення, що спостерігається в тканині-мішені
(наприклад, в м'язі, печінці, нирці або пухлині), була більше, ніж спостерігається в сироватці крові. Відповідні способи для визначення рівня (95) розщеплення в тканині-мішені відносно сироватки або розщеплення нуклеазами 51 описуються в розділі "Матеріали і методи". У деяких втіленнях біорозщеплювальний лінкер (також іменований фізіологічно лабільний лінкер або нуклеазочутливий лінкер, або ділянка В) в кон'югаті за винаходом розщеплюється щонайменше приблизно на 20 95, як, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 30 95, як, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 40 95, як, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 50 95, як, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 60
Фо, як, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 70 95, як, наприклад, розщеплюється щонайменше приблизно на 75 95 в порівнянні зі стандартом.
У деяких втіленнях кон'югат олігонуклеотиду за винаходом містить три ділянки: ї) першу ділянку (ділянку А), яка містить 10-25 суміжних нуклеотидів, комплементарних нуклеїновій кислоті-мішені; ії) другу ділянку (ділянку В), яка містить біорозщеплювальний лінкер, і їїї) третю ділянку (ділянку С), яка містить кон'югатне угруповання, таке як кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, де третя ділянка ковалентно зв'язана з другою ділянкою, яка ковалентно зв'язана з першою ділянкою.
В одному втіленні даного винаходу кон'югат олігонуклеотиду містить біорозщеплювальний лінкер (ділянку В) між безперервною нуклеотидною послідовністю (ділянку А) і кон'югатним угрупованням, націленим на рецептор асіалоглікопротеїну (ділянку С).
У деяких втіленнях біорозщеплювальний лінкер може перебувати або на 5'-кінці та/або на 3'- кінці суміжних нуклеотидів, комплементарних нуклеїновій кислоті-мішені (ділянка А). В переважному втіленні біорозщеплювальний лінкер знаходиться на 5'-кінці.
У деяких втіленнях розщеплювальний лінкер є чутливим до нуклеази(з), які, наприклад, можуть експресуватися в клітині-мішені У деяких втіленнях біорозщеплювальний лінкер складається з 2-5 послідовних фосфодіефирних зв'язків. Даний лінкер може являти собою коротку ділянку (наприклад, з 1-10, як докладно описано в визначенні лінкерів) нуклеозидів, зв'язаних фосфодіефирними зв'язками. У деяких втіленнях нуклеозиди в ділянці В біорозщеплювального лінкера (можливо незалежно) вибрані з групи, що складається з нуклеозидів ДНК і РНК або їх модифікацій, які не перешкоджають нуклеазному розщепленню.
Зо Модифікації нуклеозидів ДНК і РНК, які не перешкоджають нуклеазному розщепленню, можуть являти собою нуклеїнові основи, що не зустрічаються в природі. Деякі нуклеозиди з модифікованим цукром також можуть забезпечувати нуклеазне розщеплення, як, наприклад, альфа-їЇ -окси-І МА. У деяких втіленнях всі нуклеозиди ділянки В містять (можливо незалежно) або цукор 2-ОН-рибозу (РНК), або 2-Н цукор - тобто РНК або ДНК. В переважному втіленні щонайменше дві послідовних нуклеозиди ділянки В являють собою нуклеозиди ДНК або РНК (як, наприклад, щонайменше 3 або 4, або 5 послідовних нуклеозидів ДНК або РНК). В навіть більш переважному втіленні нуклеозиди ділянки В являють собою нуклеозиди ДНК. Переважно ділянка В складається з від 1 до 5 або від 1 до 4, як, наприклад, з 2, 3, 4 послідовних нуклеозидів ДНК, зв'язаних фосфодіефірним зв'язком. В переважних втіленнях ділянка В є такою короткою, що вона не рекрутує РНКазун. У деяких втіленнях ділянка В містить не більше, ніж З або більше, ніж 4 послідовних нуклеозиди ДНК та/або РНК, зв'язаних фосфодіефірним зв'язком (таких як нуклеозиди ДНК).
Коли ділянка В складається з нуклеозидів, зв'язаних фосфодіефірним зв'язком, ділянки А і В можуть разом утворити олігонуклеотид, який зв'язаний з ділянкою С. В даному контексті ділянка
А може відрізнятися від ділянки В тим, що ділянка А починається з щонайменше одного, переважно щонайменше двох модифікованих нуклеозидів з підвищеною афінністю зв'язування з нуклеїновою кислотою-мішенню (наприклад, МА або нуклеозиди з 2'-заміщеним цукровим угрупованням), і ділянка А сама по собі здатна до модуляції експресії нуклеїнової кислоти- мішені в релевантній лінії клітин. Крім того, якщо ділянка А містить нуклеозиди ДНК або РНК, вони пов'язані нуклеазоустійким міжнуклеозидним зв'язком, таким як фосфоротіоатний або боранофосфатний. Ділянка В, з іншого боку, містить фосфодіефірні зв'язки між нуклеозидами
ДНК або РНК. У деяких втіленнях ділянка В не є комплементарною або містіть щонайменше 50 до невідповідностей з нуклеїновою кислотою-мішенню.
У деяких втіленнях ділянка В не є комплементарною послідовності нуклеїнової кислоти- мішені або суміжним нуклеотидам, комплементарним нуклеїновій кислоті-мішені в ділянці А.
У деяких втіленнях ділянка В є комплементарною послідовності нуклеїнової кислоти-мішені.
В даному відношенні ділянки А і В разом можуть утворити одну безперервну послідовність, яка є комплементарною послідовності-мішені.
В деяких аспектах винаходу міжнуклеозидний зв'язок між першою (ділянка А) і другою 60 ділянкою (ділянка В) може розглядатися як частина другої ділянки.
У деяких втіленнях послідовність основ в ділянці В вибрана для забезпечення оптимального сайту розщеплення ендонуклеази на основі переважаючих ендонуклеазних розщеплюючих ферментів, присутніх в тканині-мішені або в клітині-мішені, або в субклітинному компартменті- мішені. В даному відношенні за допомогою виділення клітинних екстрактів з тканин-мішеней і тканин, які не є мішенями, можуть бути вибрані послідовності розщеплення ендонуклеази для застосування в ділянці В на основі переважної розщеплювальної активності в необхідній клітині- мішені (наприклад, печінки/гепатоцитах) в порівнянні з клітиною, яка не є мішенню (наприклад, нирки). В даному відношенні ефективність сполуки відносно понижувальної регуляції мішені може бути оптимізована для необхідної тканини/клітини.
У деяких втіленнях ділянка В містить динуклеотид послідовності АА, АТ, АС, АС, ТА, ТТ, ТС,
ТО, СА, СТ, СС, СО, СА, СТ, СС, або ос, в якому С може являти собою 5-метилцитозин, та/або
Т може бути замінений О. Переважно міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфодіефірний зв'язок. У деяких втіленнях ділянка В містить тринуклеотид послідовності АДА, ААТ, ААС, Ада,
АТА, АТТ, АТС, АТО, АСА, АСТ, АСС, Або, АСА, АСТ, Ас, Асі, ТАА, ТАТ, ТАС, ТАС, ТТА,
ТТ, ТС, ТАС, ТСА, ТСТ, ТОС, Тба, ТОА, тат, ТаС, Тс, САА, САТ, САС, САС, СТА, Ста,
СТО, СТТ, ССА, ССТ, ССС, ССО, СОА, СОТ, Сас, бос, САА, САТ, САС, САС, атА, атт, ато, ста, асСА, СТ, СС, або, асшсА, асТ, сб і 00, в якому С може являти собою 5- метилцитозин, талабо Т може бути замінений Ш. Переважно міжнуклеозидні зв'язки являють собою фосфодіефірні зв'язки. У деяких втіленнях ділянка В містить тетрануклеотид послідовності АДАХ, ААТХ, ААСХ, АдОИХ, АТАХ, АТТХ, АТОХ, АТИаХ, АСАХ, АСТХ, АССХ,
АСахХ, АСАХ, АСсТХ, ДЯСХ, АСОИХ, ТААХ, ТАТХ, ТАСХ, ТАСХ, ТТАХ, ТТТХ, ТТОХ, ТА,Х, ТСАХ, тСтТХ, ТоСХ, тбахХ, ТаАХ, ТаТХ, ТаСХ, ТасХ, СААХ, САТХ, САСХ, САОХ, СТАХ, СТИХ,
СТОХ, СТІХ, ССАХ, ССТХ, ССОСХ, сах, СаАХ, СОатТХ, сасСХ, бах, СААХ, САТХ, САСХ, сдах, атАх, аттх, атох, атах, асдх, астх, асох, абах, ааАхХ, сСИатХ, васх і авах, де Х може бути вибраний з групи, що складається з А, Т, У, б, С та їх аналогів, де С може являти собою 5-метилцитозин, та/л"або Т може бути замінений ОШ. Переважно міжнуклеозидні зв'язки являють собою фосфодіефірні зв'язки. Буде зрозуміло те, що при посиланні на (такі, що зустрічаються в природі) нуклеїнові основи А, Т, О, б, С вони можуть бути замінені аналогами нуклеїнових основ, які функціонують як еквівалент природних нуклеїнових основ (наприклад,
Зо пара основ з комплементарним нуклеозидом).
Інші лінкери (ділянка У)
Лінкер може мати щонайменше дві функціональні групи: одну для приєднання олігонуклеотиду та іншу - для приєднання кон'югатного угруповання. Типові функціональні групи лінкера можуть бути електрофільними для здійснення реакції з нуклеофільними групами на олігонуклеотиді або кон'югатному угрупованні або нуклеофільними для здійснення реакції з електрофільними групами. У деяких втіленнях функціональні групи лінкера включають аміно, гідроксил, карбонову кислоту, тіол, фосфорамідат, фосфоротіоат, фосфат, фосфіт, ненасичені групи (наприклад, з подвійними або потрійними зв'язками) тощо. Деякі типові лінкери (ділянка М) включають 8-аміно-3,6-діоксаоктанову кислоту (АБО), сукцинімідил-4-(М- малеїімідометил)циклогексан-І-карбоксилат (5МСС), б-аміногексанову кислоту (АНЕХ або АНА), б-аміногексилокси, 4-аміномасляну кислоту, 4-аміноциклогексилкарбонову кислоту, сукцинімідил-4-(М-малеімідометил)циклогексан-І-карбокси-(6б-амідо-капроат) (СМС), сукцинімідил-м-малеімідо-бензоїлат (МВ5), сукцинімідил-М-е-малеіїмідо-капроїлат (ЕМС5), сукцинімідил-6-(бета-малеїімідо-пропіонамідо)гексаноат (5МРН), сукцинімідил-М-(а- малеімідоацетат) (АМА5), сукцинімідил-4-(п-малеімідофеніл)бутират (ЗМРВ), бета-аланін (бета-
А А), фенілгліцин (РНО), 4-аміноциклогексанову кислоту (АСНС), бета-(циклопропіл)аланін (бета-СУРК), амінододеканову кислоту (АОС), алілендіоли, поліетиленгліколі, амінокислоти і тому подібне. У деяких втіленнях лінкер (ділянка У) являє собою аміноалкіл, як, наприклад, С2-
С36 аміноалкільну групу, що включає, наприклад, С6-С12 аміноалкільні групи. В переважному втіленні лінкер (ділянка У) являє собою Сб аміноалкільну групу. Аміноалкільна група може бути додана до олігонуклеотиду (ділянка А або ділянка А-В) як частина стандартного синтезу олігонуклеотиду, наприклад, З використанням (наприклад, захищеного) аміноалкілфосфорамідиту. Зв'язуюча група між аміноалкілом і олігонуклеотдом може являти собою, наприклад, фосфоротіоат або фосфодіефір, або одну з інших нуклеозидних зв'язуючих груп, на які дається посилання в даному документі. Аміноалкільна група квалентно зв'язується з 5 або 3-кінцем олігонуклеотиду. Наявні в продажу аміноалкільні лінкери являють собою, наприклад, 3'-аміномодифікуючий реактив для зв'язування на 3'-кінці олігонуклеотиду, і для зв'язування на 5'-кінці олігонуклеотиду доступний 5'-аміномодифікатор Сб. Дані реактиви доступні у Сіеп Кезеагсп Согрогаїйоп (егегіїпд, Ма.). Дані сполуки або аналогічні сполуки були бо використані Кгієд, еї аІ., Апіїзепзе Кезеагсп апа ОемеІортепі 1991 року, 1, 161 для зв'язування флюоресцеїну з 5-кінцем олігонуклеотиду. У даній області відомий широкий спектр інших лінкерних груп, і вони можуть бути корисними при приєднанні кон'югатних угруповань до олігонуклеотидів. Огляд багатьох корисних лінкерних груп можна знайти, наприклад, в Апіізепзе
Везеагсі апа Арріісайопв, 5. Т. СтооКе апа В. І еріє!м, Едв., СВС Ргезв, Воса Вайшп, Ніа., 1993, р. 303-350. Інші сполуки, такі як акридин, приєднували до 3З'-кінцевої фосфатної групи олігонуклеотиду за допомогою поліметиленового зв'язку (Авзеїїпе, єї аї., Ргос. Маї). Асай. 5сі.
БА 1984, 81, 3297). Будь-яку з наведених вище груп можна використовувати як одиночний лінкер (ділянка У) або в комбінації з одним або більше ніж одним іншим лінкером (ділянка У-У" або ділянка У-В, або В-У).
Лінкери та їх застосування в одержанні кон'югатів олігонуклеотидів приводяться у всій даній області, як, наприклад, в МО 96/11205 і МО 98/52614 і в патентах США Мо 4948882; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5580731; 5486603; 5608046; 4587044; 4667025; 5254469; 5245022; 5112963; 5391723; 5510475; 5512667; 5574142; 5684142; 5770716; 6096875; 6335432 і 6335437,
УМО 2012/083046, кожна з яких включена за допомогою посилання у всій її повноті.
Спосіб виготовлення
В іншому аспекті відповідно до винаходу запропоновані способи виготовлення олігонуклеотидів за винаходом, що включають проведення взаємодії нуклеотидних ланок і, за допомогою цього, утворення ковалентно зв'язаних суміжних нуклеотидних ланок, що містяться в олігонуклеотиді. Переважно в даному способі використовується фосфорамідитна хімія (див., наприклад, СагиїНегз єї аї!., 1987, Меїнодз іп Епгутоіоду тому 154, сторінки 287-313). В іншому втіленні даний спосіб додатково включає проведення взаємодії безперервної нуклеотидної послідовності з кон'югованим угрупованням (лігандом). В іншому аспекті запропонований спосіб виготовлення композиції винаходу, що включає змішування олігонуклеотиду або кон'югованого олігонуклеотиду за винаходом з фармацевтично прийнятним розріджувачем, розчинником, носієм, сіллю та/або ад'ювантом.
Фармацевтична композиція
В іншому аспекті відповідно до винаходу запропонована фармацевтична композиція, що містить будь-який з вищезазначених олігонуклеотидів та/або кон'югатів олігонуклеотидів і фармацевтично прийнятний розріджувач, розчинник, носій, сіль та/або ад'ювант.
Зо Фармацевтично прийнятний розчинник включає фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5), а фармацевтично прийнятні солі включають натрієві і калієві солі, але не обмежуються ними. У деяких втіленнях фармацевтично прийнятний розчинник являє собою стерильний фосфатно- сольовий буферний розчин. У деяких втіленнях олігонуклеотид використовується в фармацевтично прийнятному розчиннику у вигляді розчину в концентрації 50-300 мкМ.
Відповідні препарати для застосування в даному винаході знаходяться в Кетіпдіоп'є
Рпагтасецшіїйса! Зсіепсе5, Маск Рибіїзпіпу Сотрапу, РПйадеїрпіа, Ра., 171й єд., 1985. Відносно короткого огляду способів доставлення лікарського засобу, див., наприклад, І апдег (Зсіепсе 249: 1527-1533, 1990). У УМО 2007/031091 запропоновані додаткові відповідні і переважні приклади фармацевтично прийнятних розріджувачів, носіїв і ад'ювант (включені тим самим за допомогою посилання). Відповідні дозування, препарати, шляхи введення, композиції, лікарські форми, комбінації з іншими терапевтичними агентами, препарати проліків також наводяться
МО 2007/031091.
Олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів за винаходом можуть бути змішані з фармацевтично прийнятними активними або інертними речовинами для приготування фармацевтичних композицій або препаратів. Композиції та способи для приготування фармацевтичних композицій залежать від цілого ряду критеріїв, що включають шлях введення, ступінь захворювання або дозу, що підлягає введенню, але не обмежуються ними.
Дані композиції можна стерилізувати традиційними методиками стерилізації, або вони можуть піддаватися стерилізуючому фільтруванню. Утворені водні розчини можуть бути упаковані для застосування в тому вигляді, в якому вони знаходяться, або ліофілізують, причому ліофілізований препарат поєднується зі стерильним водним розчином перед введенням. рН препаратів типово становитиме від З до 11, більш основном - від 5 до 9 або від 6 до 8, і наібільш переважно - від 7 до 8, як, наприклад, від 7 до 7,5. Утворені композиції в твердій формі можна упаковувати в численні одиничні стандартні дози, причому кожна з них містить фіксовану кількість вищезгаданого агента або агентів, як, наприклад, в закритому пакеті або таблетках, або капсулах. Композицію в твердій формі також можна упаковувати в контейнер для гнучкої кількості, в такий, що піддається видавлюванню тюбик, розроблений для місцевого нанесення крему або мазі.
У деяких втіленнях олігонуклеотид або кон'югат олігонуклеотиду за винаходом являє собою бо проліки. Зокрема, відносно кон'югатів олігонуклеотидів кон'югатне угруповання відщеплюється від олігонуклеотиду, як тільки проліки доставляються до місця дії, наприклад, в клітину-мішень.
Застосування
Олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів за даним винаходом можуть використовуватися як дослідні реактиви, наприклад, для діагностики, терапії і профілактики.
У дослідженні такі олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів можна використовувати для специфічної модуляції синтезу білка РО-І 1 в клітинах (наприклад, в культурах клітин іп міїго) і в експериментальних тварин, полегшуючи, за допомогою цього, функціональний аналіз мішені або оцінку її корисності як мішені для терапевтичного втручання. Характерно модуляція мішені досягається за допомогою здійснення деградації або інгібування мРНК, яка продукує білок, запобігаючи, за допомогою цього, утворення білка, або за допомогою здійснення деградації або інгібування модулятора гена або мРНК, яка продукує білок.
При використанні олігонуклеотиду за винаходом в дослідженні або діагностиці нуклеїнова кислота-мішень може являти собою кДНК або синтетичну нуклеїнову кислоту, одержану з ДНК або РНК.
Згідно з даним винаходом запропоновано спосіб іп мімо або іп міо модуляції експресії РО-Ї 1 в клітині-мішені, яка експресує РО-І1, причому зазначений спосіб включає введення в зазначену клітину олігонуклеотиду або кон'югата олігонуклеотиду за винаходом в ефективній кількості.
У деяких втіленнях клітина-мішень являє собою клітину ссавця, зокрема, людську клітину.
Клітина-мішень може являти собою культуру клітин іп мйго або клітину іп мімо, що утворює частину тканини ссавця. У переважних втіленнях клітина-мішень присутня в печінці. Клітина- мішень печінки може бути вибрана з паренхімних клітин (наприклад, гепатоцитів) і непаренхімних клітин, таких як клітини Купфера, І 5ЕС, зірчасті клітини (або клітини Іго), холангіоцити і лейкоцити, асоційовані з печінкою (які включають Т-клітини і МК-клітини).. У деяких втіленнях клітина-мішень являє собою антигенпрезентуючу клітину. Антигенпрезентуючі клітини піддають дисплею чужорідні антигени, що утворюють комплекс з головним комплексом гістосумісності (МНС) класу І! або І класу на їх поверхнях. У деяких втіленнях антигенпрезентуючі клітини експресують МНС класу ІЇ (тобто професійні антигенпрезентуючі клітини, такі як дендритні клітини, макрофаги і В-клітини).
Зо При діагностиці дані олігонуклеотиди можуть бути використані для виявлення і кількісного виміру експресії РО-І 1 в клітині і тканинах за допомогою норзерн-блоттинга, гібридизації іп ві або аналогічних методик.
Для терапії олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів за даним винаходом або їх фармацевтичні композіції можуть вводитися тварині або людині, у якої підозрюється наявність захворювання або розладу, який може бути полегшено або вилікувано за допомогою зменшення експресії РО-І1, зокрема, за допомогою зменшення експресії РО-І1 в клітинах- мішенях печінки.
Згідно до винаходу запропоновані способи лікування або запобігання захворюванню, що включають введення терапевтично або профілактично ефективної кількості олігонуклеотиду, кон'югата олігонуклеотиду або фармацевтичної композиції за винаходом суб'єкту, який страждає від або сприйнятливому до захворювання.
Винахід також відноситься до олігонуклеотидів, кон'югата олігонуклеотиду або фармацевтичної композиції відповідно до винаходу для застосування як лікарського засобу.
Олігонуклеотид, кон'югат олігонуклеотиду або фармацевтичну композицію відповідно до винаходу типово вводять в ефективній кількості.
Згідно винаходу також запропоновано застосування олігонуклеотиду або кон'югата олігонуклеотиду, або фармацевтичної композиції за винаходом, як описано, для виготовлення лікарського засобу для лікування захворювань або розладу, на які дається посилання в даному документі. В одному втіленні дане захворювання вибрано з: а) вірусних інфекцій печінки, таких як інфекції НВМ, НСМ ї НОМ; б) паразитарних інфекцій, таких як малярія, токсоплазмоз, лейшманіоз і трипаносомо»з, і в) раку печінки або метастазів в печінці.
В одному втіленні даний винахід відноситься до олігонуклеотидів, кон'югатів олігонуклеотидів або фармацевтичних композицій для застосування в лікуванні захворювань або розладів, вибраних з вірусних або паразитарних інфекцій. В іншому втіленні дане захворювання вибрано з: а) вірусних інфекцій печінки, таких як інфекції НВМ, НОМ і НОУ; 6) паразитарних інфекцій, таких як малярія, токсоплазмоз, лейшманіоз і трипаносомоз, і в) раку печінки або метастазів в печінці.
Захворювання або розлад, на які дається посилання в даному документі, асоційоване з виснаженням імунної системи. Зокрема, дане захворювання або розлад асоційоване з бо виснаженням вірусоспецифічних відповідей Т-клітин. У деяких втіленнях захворювання або розлад може бути полегшено або вилікувано за допомогою зменшення експресії РО-Ї 1.
Способи за винаходом в основном використовують для лікування або профілактики проти захворювань, асоційованих з виснаженням імунної системи.
В одному втіленні винаходу олігонуклеотид, кон'югат олігонуклеотиду або фармацевтичні композиції за винаходом використовуються у відновленні імунної відповіді проти раку печінки або метастазів в печінці.
В одному втіленні винаходу олігонуклеотид, кон'югат олігонуклеотиду або фармацевтичні композиції за винаходом використовуються у відновленні імунної відповіді проти патогену. У деяких втіленнях патоген може перебувати в печінці. Даними патогенуми можуть бути вірус або паразит, зокрема, віруси або паразити, описані в даному документі. У переважному втіленні патоген являє собою НВУ.
Даний винахід додатково відноситься до застосування олігонуклеотиду, кон'югата олігонуклеотиду або фармацевтичної композиції, як визначено в даному документі, для виготовлення лікарського засобу для відновлення імунітету проти вірусної або паразитарної інфекції, як згадано в даному документі.
Олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів, або фармацевтичні композиції даного винаходу можна використовувати в лікуванні вірусних інфекцій, зокрема, вірусних інфекцій в печінці, де піддається впливу шлях РО-1 (див., наприклад, Кароог апа Коші 2014 Ршиге Міго!
Мої. 9 рр. 565-585 і Заіет апа ЕІ-Вадажу 2015 Мопа у Нераїо! Мої. 7 рр. 2449-2458). Вірусні інфекції печінки можуть бути вибрані з групи, що складається з вірусів гепатиту, зокрема НВУ,
НеСМ ї НОМ, зокрема, хронічних форм даних інфекцій. В одному втіленні олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів, або фармацевтичні композиції за даним винаходом використовуються для лікування НВМ, зокрема, хронічного НВМ. Показниками хронічних інфекцій НВМ є високі рівні вірусного навантаження (ДНК НВУ) і навіть більш високі рівні порожніх часток НВ5ЗАд (більш ніж 100-кратний надлишок щодо віріонів) в системі кровообігу.
Олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів за даним винаходом також можна використовувати для лікування вірусних інфекцій печінки, які спостерігаються як супутні інфекції
ВІЛ (вірус імунодефіциту людини). Іншими вірусними інфекціями, які можна лікувати олігонуклеотидами або кон'югатами олігонуклеотидів, або фармацевтичними композиціями
Зо даного винаходу, є Істм (вірус лімфоцитарного хоріоменінгіту) і ВІЛ як моноінфекції, НОМ-1 і -2, та інші герпесвіруси. Дані віруси не є гепатотрофічними, однак, вони можуть бути чутливими до понижувальної регуляції РО-ЇІ 1.
У деяких втіленнях відновлення імунітету або імунної відповіді включає поліпшення відповіді
Т-клітин та/або МК-клітин, талабо ослаблення вичерпання Т-клітин, зокрема, відновлюється
НВМ-специфічний Т-клітинну відповідь, НСМ-специфічний Т-клітинну відповідь і НОМ- специфічна Т-клітинна відповідь. Поліпшення Т-клітинної відповіді, наприклад, можна оцінювати як збільшення рівня Т-клітин в печінці, зокрема, збільшення рівня Т-клітин СОв8'- та/або СО4- в порівнянні з контролем (тобто рівнем до обробки або рівнем у суб'єкта, обробленого носієм). В іншому втіленні відновлюється або зростає саме рівень вірусоспецифічних Т-клітин СОв в порівнянні з контролем, зокрема, відновлюється або зростає рівень НВМ-специфічних Т-клітин
Сов або НСМУ-специфічних Т-клітин СОвж, або НОМ-специфічних Т-клітин СО8 в порівнянні з контролем. У переважному втіленні зростає рівень Т-клітин СО8вж, специфічних відносно антигену 5 НВМ (НВзАОЯ) та/або Т-клітин СОв8', специфічних відносно антигену е НВМ (НВедо), та/або Т-клітин СОв8'-, специфічних відносно антигену кора НВМ (НВсАо), у суб'єктів, оброблених олігонуклеотидів, кон'югатом олігонуклеотиду або фармацевтичної композицією даного винаходу в порівнянні з контролем. Переважно Т-клітини СО8-, специфічні відносно антигену
НВМ, продукують один або більше ніж один цитокін, такий як інтерферон-гамма (ІЕМ-у) або фактор некрозу пухлин альфа (ТМЕ-о). Збільшення рівня Т-клітин СО8-ж-, описаних вище, зокрема, спостерігається в печінці Описане в даному документі збільшення повинно бути статистично значуним в порівнянні з контролем. Переважно дане збільшення складає щонайменше 20 95, як, наприклад, 25 95, як, наприклад, 50 905, як, наприклад, 75 95 в порівнянні з контролем. В іншому втіленні олігонуклеотидами або кон'югатами олігонуклеотидів за даним винаходом активуються природні клітини-кілери (МК) та/або природні Т-клітини-кілери (МКТ).
Олігонуклеотиди або кон'югати олігонуклеотидів, або фармацевтичні композиції за даним винаходом можна використовувати в лікуванні паразитарних інфекцій, зокрема, паразитарних інфекцій, де підпадає під вплив шлях РО-1 (див., наприклад, Впайга еї аї. 2012 У Іптесі ів мої 206 рр. 125-134; Впаайга єї аї. 2011 Ргос Маї! Асай сі ОБА Мої. 108 рр. 9196-9201; Евсп еї аї.
Іттипо! мої 191 рр. 5542-5550; Егеєтап апа ЗНпагре 2012 Маї Іттипо!ї Мо! 13 рр. 113-115;
Сішієте єї аІ. 2011 Іпівсї Іттип Мо! 79 рр. 1873-1881; Чозні єї аі. 2009 Ріо5 Раїнод Мої! 5 60 е1000431; Папод єї а). 2006 Єиг У Іттипої! Мої. 36 рр. 58-64; Мукез вї а. 2014 Егопі Містобвіо! Мої 5 рр. 249). Паразитарні інфекції можуть бути вибрані з групи, що складається з малярії, токсоплазмозу, лейшманіозу і трипаносомозу. Малярійна інфекція викликана протистом роду
Ріазтодійт, зокрема виду Р. мімах, Р. таїапйає і Р. Таісірагит. Токсоплазмоз являє собою паразитарне захворювання, викликане Тохоріаєта допаї. Лейшманіоз являє собою захворювання, викликане протозойними паразитами роду Іеї5зпПтапіа. Трипаносомоз викликаний простішим роду Тгурапозота. Хвороба Чагаса, яка є тропічною формою, викликається видом Тгурапозота сги?гі, а розлад сну викликається видом Ггтурапозота Бгисеві.
У деяких втіленнях відновлення імунітету включає відновлення відповіді паразитоспецифічних Т-клітин і МК-клітин, зокрема, відповіді Ріазтодішт-специфічних Т-клітин, відповіді Тохоріахта допаїй-специфічних Т-клітин і МК-клітин, відповіді І еівптапіа-специфічних
Т-клітин і МК клітин, відповіді Тгурапозота сгигі-специфічних Т-клітин і МК-клітин або відповіді
Ттурапозота Бргисеі-специфічних Т-клітин і МК-клітин. В іншому втіленні відновлюється саме відповідь паразитоспецифічних Т-клітин СО8-- і МК-клітин.
Введення
Олігонуклеотиди або фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити місцево (як, наприклад, на шкіру, за допомогою інгаляції, в око або у вухо), ентерально (як, наприклад, перорально або через шлунково-кишковий тракт) або парентерально (як, наприклад, внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньом'язово, інтрацеребрально, інтрацеребровентрикулярно або підоболонково).
У переважному втіленні олігонуклеотид або фармацевтичні композиції за даним винаходом вводяться за допомогою парентрального шляху, що включає внутрішньовенну, внутрішньоартеріальну, підшкірну, внутрішньобрюшинну або внутрішньом'язову ін'єкції або інфузію, внутрішньооболонкове або внутрішньочерепне, наприклад, інтрацеребральне або інтравентрикулярне, інтравітреальне введення. В одному втіленні активний олігонуклеотид або кон'югат олігонуклеотиду вводиться внутрішньовенно. В іншому втіленні активний олігонуклеотид або кон'югат олігонуклеотиду вводиться підшкірно.
У деяких втіленнях олігонуклеотид, кон'югат олігонуклеотиду або фармацевтична композиція за винаходом вводиться в дозі 0,1-15 мг/кг, як, наприклад, 0,1-10 мг/кг, як, наприклад, 0,2-10 мг/кг, як, наприклад, 0,25-10 мг/кг, як, наприклад, 0,1-5 мг/кг, як, наприклад, 0,2-5 мг/кг, як, наприклад, 0,25-5 мг/кг. Введення може здійснюватися один раз на тиждень, кожний 2-й тиждень, кожний третій тиждень або навіть один раз на місяць.
Комбінвані терапії
У деяких ввтіленнях оолігонуклеотид, кон'югат олігонуклеотиду або фармацевтична композиція за винаходом призначені для застосування в комбінованому лікуванні з іншим терапевтичним агентом. Даний терапевтичний агент може являти собою, наприклад, стандарт лікування для описаних вище захворювань або розладів.
Для лікування хронічних інфекцій НВМ як стандарт лікування рекомендується комбінація противірусних лікарських засобів і модуляторів імунної системи. Ефективними противірусними лікарськими засобами проти НВМ є, наприклад, аналоги нуклеоз(т)идів. Є п'ять аналогів нуклеоз(т)идів, ліцензованих для терапії НВУ, а саме: ламівудин (епівір), адефовір (гепсера), тенофовір (віреад), телбівудин (тизека), ентекавір (бараклуд). Вони є ефективними в придушенні вірусної реплікації (ДНК НВУ), але не мають впливу на рівні НВзАа. Інші антивірусні лікарські засоби включають рибавірин і терапію антитілом проти НВМ (моноклональних або поліклональних). Модуляторами імунної системи можуть бути, наприклад, інтерферон-альфа-2а і ПЕГілований інтерферон-альфа-2а (пегасіс) або агоністи ТІ К7 (наприклад, (55-9620), або терапевтичні вакцини. Лікування ІЕМ-х демонструє лише дуже помірний ефект у зменшенні вірусного навантаження, але призводить до деякого зниження рівня НВ5ЗАд, хоча і дуже неефективно (менше 10 95 після 48 тижнів терапії).
Олігонуклеотид або кон'югати олігонуклеотиду за даноим винаходом також можуть бути об'єднані з іншими противірусними лікарськими засобами, ефективними проти НВУ, такими як антисмислові олігонуклеотиди, описані в МО 2012/145697 і МО 2014/179629, або молекули міРНК, описані в УМО 2005/014806, МО 2012/024170, МО 2012/2055362, МО 2013/003520 і МО 2013/159109.
При введенні олігонуклеотидів або кон'югатів олігонуклеотидів за даним винаходом в комбінованих терапіях з іншими агентами, вони можуть вводитися індивіду послідовно або супутньо. Як альтернативу, фармацевтичні композиції відповідно до даного винаходу можуть містити комбінацію олігонуклеотиду або кон'югата олігонуклеотиду за даним винаходом в асоціації з фармацевтично прийнятним ексципієнтом, як описано в даному документі, і з іншим терапевтичним або профілактичним агентом, відомим в даній області. 60 ВТІЛЕННЯ
Наступні втілення даного винаходу можна використовувати в комбінації з будь-якими іншими втіленнями, описаними в даному документі. 1. Антисмисловий олігонуклеотид, який містить або складається з безперервної нуклеотидної послідовності з 10-30 нуклеотидів в довжину, здатний зменшувати експресію РО-
ІТ. 2. Олігонуклеотид за втіленням 1, в якому безперервна нуклеотидна послідовність є щонайменше на 90 95 комплементарною нуклеїновій кислоті-мішені РО-1 1. 3. Олігонуклеотид за втіленням 1 або 2, в якому безперервна нуклеотидна послідовність комплементарна нуклеїновій кислоті-мішені, вибраній з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 1,
ЗЕО І МО: 2 та/або 5ЕО ІЮ МО: 3. 4. Олігонуклеотид за втіленнями 1-3, в якому безперервна нуклеотидна послідовність комплементарна ділянці в межах положення 1 і 15720 на 5ЕО ІО МО: 1. 5. Олігонуклеотид за втіленнями 1-4, де даний олігонуклеотид здатний гібридизуватися з нуклеїновою кислотою-мішенню, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 1, 5БЕО І МО: 2 та/або 5ЕО ІО МО: 3, з Ла" менше -41,8 кДж. 6. Олігонуклеотид за втіленнями 1-5, в якому безперервна нуклеотидна послідовність комплементарна підпослідовності нуклеїнової кислоти-мішені, де дана підпослідовність вибрана з групи, що складається з положення 371-3068, 5467-12107, 15317-15720, 15317-18083, 15317- 19511 і 18881-19494 на 5ЕО ІЮО МО: 1. 7. Олігонуклеотид за втіленням 6, в якому підпослідовність вибрана з групи, що складається з положення 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 і 15690-15735 на 5ЕО ІЮ МО: 1. 8. Олігонуклеотид за втіленнями 2-7, в якому нуклеїнова кислота-мішень являє собою РНК. 9. Олігонуклеотид за втіленням 8, де РНК являє собою мРНК. 10. Олігонуклеотид за втіленням 9, де мРНК являє собою пре-мРНК або зрілу мРНК. 11. Олігонуклеотид за втіленнями 1-10, в якому безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з щонайменше 14 безперервних нуклеотидів, зокрема, з 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 або 24 безперервних нуклеотидів. 12. Олігонуклеотид за втіленнями 1-10, в якому безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 16-20 нуклеотидів. 13. Олігонуклеотид за втіленнями 1-10, де даний олігонуклеотид містить або складається з 14-35 нуклеотидів в довжину. 14. Олігонуклеотид за втіленням 13, де даний олігонуклеотид містить або складається з 18- 22 нуклеотидів в довжину. 15. Олігонуклеотид за втіленнями 1-14, де даний олігонуклеотид або безперервна нуклеотидна послідовність є одноланцюговою. 16. Олігонуклеотид за втіленнями 1-15, в якому безперервна нуклеотидна послідовність комплементарна підпослідовності нуклеїнової кислоти-мішені, де дана підпослідовність вибрана з групи, що складається з А7, А26, А43, А119, А142, А159, А160, А163, А169, А178, А179, А180,
А189, А201, А202, А204, А214, А221, А224, Аг226, Аг243, А254, А258, 269, А274, АЗ5О, АЗбО,
АЗб4, АЗ65, АЗ70, АЗ72, АЗ81, АЗ83, АЗ86, АЗ89, А400, А427, А43З5 і А438. 17. Олігонуклеотид за втіленням 16, в якому підпослідовність вибрана з групи, що складається з А221, АЗбО, А180, А160 і А269. 18. Олігонуклеотид за втіленнями 1-17, де даний олігонуклеотид не є міРНК і не є комплементарним самому собі. 19. Олігонуклеотид за втіленнями 1-18, в якому безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з послідовності, вибраної з ЗЕО І МО: 5-743 або 771. 20. Олігонуклеотид за втіленнями 1-19, в якому безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з послідовності, вибраної з 5ЕО ІЮО МО: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 і 735. 21. Олігонуклеотид за втіленнями 1-20, в якому безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з послідовності, вибраної з ФБЕО ІЮ МО: 466, 640, 342, 287 і 566. 22. Олігонуклеотид за втіленнями 1-21, в якому безперервна нуклеотидна послідовність має від нуля до трьох невідповідностей в порівнянні з нуклеїновою кислотою-мішенню, якій вона комплементарна. 23. Олігонуклеотид за втіленням 22, в якому безперервна нуклеотидна послідовність має 60 одну невідповідність в порівнянні з нуклеїновою кислотою-мішенню.
24. Олігонуклеотид за втіленням 22, в якому безперервна нуклеотидна послідовність має дві невідповідності в порівнянні з нуклетїновою кислотою-мішенню. 25. Олігонуклеотид за втіленням 22, в якому безперервна нуклеотидна послідовність є повністю комплементарною послідовності нуклеїнової кислоти-мішені. 26. Олігонуклеотид за втіленнями 1-25, який містить один або більше ніж один модифікований нуклеозид. 27. Олігонуклеотид за втіленням 26, в якому один або більше ніж один модифікований нуклеозид являє собою високоафінні модифіковані нуклеозиди. 28. Олігонуклеотид за втіленням 26 або 27, в якому один або більше ніж один модифікований нуклеозид являє собою нуклеозид, модифікований 2'-цукром. 29. Олігонуклеотид за втіленням 28, в якому один або більше ніж один нуклеозид, модифікований 2'- цукром, незалежно вибраний з групи, що складається з нуклеозидів 2'-0- алкіл- РНК, 2'-О-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2"-О-метоксіетил-РНК, 2'-аміно-ДНК, 2"-фтор-ДНК, 2'-фтор-АМА і І МА. 30. Олігонуклеотид за втіленням 28, в якому один або більше ніж один модифікований нуклеозид являє собою нуклеозид І МА. 31. Олігонуклеотид за втіленням 30, в якому модифікований нуклеозид І! МА являє собою окси-Ї МА. 32. Олігонуклеотид за втіленням 31, в якому модифікований нуклеозид являє собою бета-О- окси-Ї МА. 33. Олігонуклеотид за втіленням 30, в якому модифікований нуклеозид являє собою тіо-Ї МА. 34. Олігонуклеотид за втіленням 30, в якому модифікований нуклеозид являє собою аміно-
І МА. 35. Олігонуклеотид за втіленням 30, в якому модифікований нуклеозид являє собою сЕТ. 36. Олігонуклеотид за втіленням 30, в якому модифікований нуклеозид являє собою ЕМА. 37. Олігонуклеотид за втіленням 30, в якому модифікований нуклеозид МА вибраний з бета-О-окси-І МА, альфа-їЇ -окси-Ї МА, бета-ЮО-аміно-І МА, альфа-і -аміно-ІЇ МА, бета-ЮО-тіо-І МА, альфа-і -тіо-І МА, (5)СЕТ, (РОСЕТ, бета-О-ЕМА і альфа-Ї -ЕМА. 38. Олігонуклеотид за втіленнями 30-37, в якому, крім модифікованого нуклеозиду І МА, є
Зо щонайменше один 2'-заміщений модифікований нуклеозид. 39. Олігонуклеотид за втіленням 38, в якому 2'-заміщений модифікований нуклеозид вибраний з групи, що складається з 2'-О-алкіл- РНК, 2'-О-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2-0- метоксіетил-РНК (МОЕ), 2'-аміно-ДНК, 2'"-фтор-ДНК, 2'-фтор-АМА. 40. Олігонуклеотид за будь-яким з втілень 1-39, де даний олігонуклеотид містить щонайменше один модифікований міжнуклеозидний зв'язок. 41. Олігонуклеотид за втіленням 40, в якому модифікований міжнуклеозидний зв'язок є стійким до нуклеаз. 42. Олігонуклеотид за втіленням 40 або 41, в якому щонайменше 50 95 міжнуклеозидних зв'язків в межах безперервної нуклеотидної послідовності являють собою фосфоротісатні міжнуклеозидні зв'язки або боранофосфатні міжнуклеозидні зв'язки. 43. Олігонуклеотид за втіленням 40 або 41, в якому всі міжнуклеозидні зв'язки в межах безперервної нуклеотидної послідовності являють собою фосфоротіоатні міжнуклеозидні зв'язки. 44. Олігонуклеотид за втіленнями 1-43, де даний олігонуклеотид здатний рекрутувати
РНКазу Н. 45. Олігонуклеотид за втіленням 44, де даний олігонуклеотид являє собою гепмер. 46. Олігонуклеотид за втіленням 44 або 45, де даний олігонуклеотид являє собою гепмер формули 5'-Е-С0-І-3", де ділянки Е і Е" незалежно містять або складаються з 1-7 модифікованих нуклеозидів, і 5 являє собою ділянку з 6-16 нуклеозидів, які здатні рекрутувати РНКазу Н. 47. Олігонуклеотид за втіленням 44 або 45, де гепмер має формулу 5-0'-Е-(3-Е-3' або 5-БЕ-
С-Е-0"-3, де ділянки Е і ЕР" незалежно містять 1-7 модифікованих нуклеозидів, 5 являє собою ділянку з 6-16 нуклеозидів, які здатні рекрутувати РНКазу Н, і ділянки Б" або 0" містять 1-5 нуклеозидів, зв'язаних фосфодіефірним зв'язком. 48. Олігонуклеотид за втіленням 47, в якому 0" або 0" є опційними. 49. Олігонуклеотид за втіленням 47, в якому ділянка С складається з двох нуклеозидів, зв'язаних фосфодіефірним зв'язком. 50. Олігонуклеотид за втіленням 49, в якому нуклеозиди, зв'язані фосфодіефирним зв'язком, являють собою са (цитидин-аденозин). 51. Олігонуклеотид за втіленням 46 або 47, в якому модифікований нуклеозид являє собою бо нуклеозид, модифікований 2'-цукром, незалежно вибраний з групи, що складається з нуклеозидів 2'-О-алкіл- РНК, 2'-О-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-О-метоксіетил- РНК, 2'-аміно-
ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабінонуклеїнової кислоти (АМА), 2'-фтор-АМА і І МА. 52. Олігонуклеотид за втіленнями 46-51, в якому один або більше ніж один модифікований нуклеозид в ділянці Е і Е" являє собою нуклеозид І МА. 53. Олігонуклеотид за втіленням 52, в якому всі модифіковані нуклеозиди в ділянці Є і РЕ" являє собою нуклеозиди І МА. 54. Олігонуклеотид за втіленням 53, в якому ділянка Е і Е' складається з нуклеозидів І МА. 55. Олігонуклеотид за втіленнями 52-54, в якому всі модифіковані нуклеозиди в ділянці Є і Е" являють собою нуклеозиди окси-І МА. 56. Олігонуклеотид за втіленням 52, в якому щонайменше одна з БЕ ії додатково містить щонайменше один 2'-заміщений модифікований нуклеозид, незалежно вибраний з групи, що складається з 2'-О-алкіл- РНК, 2'-О-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-О-метоксіетил-РНК, 2'-аміно-
ДНК і 2'-фтор-ДНК. 57. Олігонуклеотид за втіленнями 46-56, в якому нуклеозиди, рекрутуючі РНКазу Н, в ділянці
С незалежно вибрані з ДНК, альфач-і -І МА, С4"-алкілованої ДНК, АМА, 2'-Е-АМА і ОМА. 58. Олігонуклеотид за втіленням 57, в якому нуклеозиди в ділянці б являють собою нуклеозиди ДНК та/або альфа-і -І МА. 59. Олігонуклеотид за втіленням 57 або 58, в якому ділянка С складається з щонайменше 75 до нуклеозидів ДНК. 60. Олігонуклеотид за втіленнями 1-59, де даний олігонуклеотид вибраний з будь-якого олігонуклеотиду СМР ІО МО: від 5 1 до 743 1 і771 1 (Таблиця 5). 61. Олігонуклеотид за втіленнями 1-60, де даний олігонуклеотид вибраний з групи, що складається з СМР ІО МО: 6 1,8 1,9 1, 13 1, 41 1,42 1, 58 1, 77 1, 92 1, 111 1, 128 1, 151 1,164 1, 166 1, 169 1,171 1, 222 1, 233 1, 245 1, 246 1, 250 1, 251 1, 252 1, 256 1, 272.1, 273 1, 287 1,292 1, 303 1, 314 1, 318 1, 320 1, 324 1, 336 1, 342 1, 343 1, 344 1, 345 1, 346 1, 349 1, 359 1, 360 1, 374 1, 408 1, 409 1, 415 1, 417 1, 424 1, 429 1, 430 1, 458 1, 464 1, 466 1, 474 1, 490 1,493 1,512 1,519 1, 519 1, 529 1, 533 1, 534 1, 547 1, 566 1, 567 1, 578 1, 582 1,601 1,619 1, 620 1, 636 1, 637 1, 638 1, 640 1, 645 1, 650 1, 651 1,652 1, 653 1, 658 1, 659 1, 660 1, 665 1, 678 1, 679 1, 680 1, 682 1, 683 1, 684 1,
Зо 687 1,694 1,706 1, 716 1, 728 1, 733 1, 734 1 і 735 1. 62. Олігонуклеотид за втіленнями 1-61, де даний олігонуклеотид вибраний з групи, що складається з СМР ІО МО: 287 1, 342 1, 466 1, 640 1, 566 1, 766 1, 767 1, 768 1, 76911 770 1. 63. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду, що містить: а. олігонуклеотид за будь-яким з втілень 1-62 (ділянку А); і б. щонайменше одне кон'югатне угруповання (ділянку С), ковалентно приєднану до зазначеного олігонуклеотиду. 64. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 63, в якому кон'югатне угруповання вибрано з вуглеводів, лігандів рецептора поверхні клітини, лікарських речовин, гормонів, ліпофільних речовин, полімерів, білків, пептидів, токсинів, вітамінів, вірусних білків або їх комбінацій. 65. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 63 або 64, в якому кон'югатне угруповання являє собою вуглеводовмісне угруповання. 66. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 65, в якому вуглеводне кон'югатне угруповання містить щонайменше одне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, ковалентно приєднане до олігонуклеотиду за будь-яким з пп. 1-62. 67. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 66, в якому кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, містить щонайменше одне вуглеводне угруповання, вибране з групи, що складається з галактози, галактозаміну, М-форміл-галактозаміну, /- М- ацетилгалактозаміну, М-пропіоніл-галактозаміну, М-н-бутаноїл-галактозаміну і М- ізобутаноїлгалактозаміну. 68. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 6б або 67, в якому кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, є одновалентним, двовалентним, тривалентним або чотиривалентним. 69. Кон'югат олігомеру за втіленням 68, в якому кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, складається з двох-чотирьох кінцевих СаІМАс угруповань, ПЕГ спейсера, що зв'язує кожне саїІМАс угруповання з розгалужувальною молекулою. 70. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленнями 66-69, в якому кон'югатне угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, являє собою тривалентне М-ацетилгалактозамінне (СаІМАс) угруповання. бо 71. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленнями 66-70, в якому кон'югатне угруповання вибрано з одною з тривалентних саїЇМАс угруповань на Фіг. 1. 72. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 71, в якому кон'югатне угруповання являє собою тривалентне саїЇМАс угруповання на Фіг. 3. 73. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 63-72, в якому присутній лінкер між олігонуклеотидом або безперервною олігонуклеотидною послідовністю і кон'югатним угрупованням. 74. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 73, в якому лінкер являє собою физіологічно лабільний лінкер (ділянку В). 75. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 74, в якому фізіологічно лабільний лінкер являє собою нуклеазочутливий лінкер. 76. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 74 або 75, в якому фізіологічно лабільний лінкер складається з 2-5 послідовних фосфодіефірних зв'язків. 77. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 76, в якому фізіологічно лабільний лінкер є еквівалентним ділянці р" або 0", присутній у втіленні 47-50. 78. Кон'югат олігонуклеотиду за будь-яким з втілень 63-77, де даний кон'югат олігонуклеотиду вибраний з СМР ІЮ МО: 766 2,767 2,768 2,769 21770 2. 79. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленням 78, де даний кон'югат олігонуклеотиду вибраний з кон'югата олігонуклеотиду, представленого на Фіг. 4,5,6, 7 і 8. 80. Кон'югат олігонуклеотиду за втіленнями 63-76, який демонструє поліпшене інгібування
РО-І1 в клітині-мішені або поліпшене клітинне розподілення між печінкою і селезінкою, або поліпшене клітинне поглинання в печінці кон'югата оолігонуклеотиду в порівнянні з некон'югованим олігонуклеотидом. 81. Фармацевтична композиція, що містить олігонуклеотид за втіленнями 1-62 або кон'югат за втіленнями 63-80 і фармацевтично прийнятний розчинник, носій, сіль та/або ад'ювант. 82. Спосіб виготовлення олігонуклеотиду за втіленням 1-62, який включає проведення взаємодії нуклеотидних ланок, утворюючи, за допомогою цього, ковалентно зв'язані суміжні нуклеотидні ланки, що містяться в олігонуклеотиді. 83. Спосіб за втіленням 82, який додатково включає проведення взаємодії безперервної нуклеотидної послідовності з ненуклеотидним кон'югатним угрупованням.
Зо 84. Спосіб виготовлення композиції за втіленням 81, який включає змішування олігонуклеотиду з фармацевтично прийнятним розчинником, носієм, сіллю та/або ад'ювантом. 85. Спосіб іп мімо або іп міго модулювання експресії РО-І 1 в клітині-мішені, яка експресує
РО-І1, причому зазначений спосіб включає введення олігонуклеотиду за втіленнями 1-62 або кон'югата за втіленнями 63-80, або фармацевтичної композиції за втіленням 81 в ефективній кількості в зазначену клітину. 86. Спосіб лікування або запобігання захворюванню, що включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості олігонуклеотиду за втіленнями 1-62 або кон'югата за втіленнями 63-80, або фармацевтичної композиції за втіленням 81 суб'єкту, який страждає від захворювання або сприйнятливому до захворювання. 87. Спосіб відновлення імунітету проти вірусу або паразита, що включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості кон'югата олігонуклеотиду за втіленнями 63-80 або олігонуклеотиду за втіленнями 1-62, або фармацевтичної композиції за втіленням 81 суб'єкту, інфікованому вірусом або паразитом. 88. Спосіб за втіленням 87, причому відновлення імунітету являє собою збільшення в печінці
Т-клітин Сов, специфічних відносно одного або більше ніж одного антигену НВМ в порівнянні з контролем. 89. Олігонуклеотид за втіленнями 1-62 або кон'югат за овтіленнями 63-80, або фармацевтична композиція за втіленням 81 для застосування як лікарського засобу для лікування або попередження захворювання у суб'єкта. 90. Застосування олігонуклеотиду за втіленнями 1-62 або кон'югата за втіленнями 63-80 для одержання лікарського засобу для лікування або попередження захворювання у суб'єкта. 91. Олігонуклеотид за втіленнями 1-62 або кон'югат за оввтіленнями 63-80, або фармацевтична композиція за втіленням 81 для застосування у відновленні імунітету проти вірусу або паразита. 92. Застосування за втіленням 91, де відновлення імунітету являє собою збільшення в печінці Т-клітин СО8ж, специфічних відносно одного або більше ніж одного антигену НВМ в порівнянні з контролем. 93. Застосування за втіленням 92, де антиген НВМ являє собою НВзЗАЯ. 94. Спосіб, олігонуклеотид або застосування за втіленнями 86-93, де захворювання бо асоційоване з активністю РО-Ї 1 іп мімо.
95. Спосіб, олігонуклеотид або застосування за втіленнями 86-94, де захворювання асоційоване з підвищеною експресією РО-1І 1 в антигенпрезентуючій клітині. 96. Спосіб, олігонуклеотид або застосування за втіленням 95, де експресія РО-Ї1 знижується щонайменше на 30 95 або щонайменше на 40 95, або щонайменше на 50 95, або щонайменше на 60 95, або щонайменше на 70 95, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 956, або щонайменше на 95 95 в порівнянні з експресією без обробки або до обробки олігонуклеотидом за втіленнями 1-62 або кон'югатом за втіленнями 63-80, або фармацевтичною композицією за втіленням 81. 97. Спосіб, олігонуклеотид або застосування за втіленнями 86-95, де захворювання вибрано з вірусної інфекції печінки або паразитарних інфекцій. 98. Спосіб, олігонуклеотид або застосування за втіленням 98, де вірусна інфекція являє собою НВУ, НСУ або НОМ. 99. Спосіб, олігонуклеотид або застосування за втіленнями 86-95, де захворювання являє собою хронічну інфекцію НВУ. 100. Спосіб, олігонуклеотид або застосування за втіленням 98, де паразитарна інфекція являє собою малярію, токсоплазмоз, лейшманіоз або трипаносомоз. 101. Спосіб, олігонуклеотид або застосування за втіленнями 86-100, де суб'єкт є ссавцем. 102. Спосіб, олігонуклеотид або застосування за втіленням 101, де ссавець являє собою людину.
ПРИКЛАДИ
Матеріали та методи
Мотиви послідовностей і олігонуклеотидні сполуки
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ря и ПЕВ 1 6 сосаїаадааасі | 4-10-2 |ГСОСайаадаадшаст | 61 | 371 |-19 8 |сбаасасасадієдс | 3-10-3 |СТОаасасасадісоС. | 81 | 383 |-22 9 фсідаасасасадієд | 3-11-2 |ГСТоаасасасадісй. | 91 | 384 | -19
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ери и ГЕТЕ 1 57 |дадаїататаюсаа! | 3-10-3 |сАСааіаюсАаАТ | 571 | 906 | -5 58 |ссададатататвюс | 2-11-3 |ССададаєнаавтОаС | 581 | 909 | -15 60 |осавіайссададала | 4-10-3 |ССААіайссададАТА | 601 | 916 | -22 66 |стаасітаонасасис | 4-11-2 |СТААсіаонасасітс | 661 | 958 | -18 68 МОасіаадіаднаса | 3-94 |ГСАсівададітАСА | 681 | 962 | -195 69 (|сфоасіаастаона | 4-10-3 |СТТТоасізадївотТА | 691 | 964 | -195
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ря ри ГЕЙ 1 80 |сададіайсаадйс | 3-10-3 |САСадіаїсавоттС | 801 | 1078 | -18 86 |дасасісйціасай | 2-10-4 |ЗАсасісндіасАТТ | 861 | 1213 | -19 89 |сшанааасіссаї | 2-10-4 |СТйанадвасісСАТ | 891 | 1266 | -18 90 |ассааасшанааа | 4-10-2 |АССАаасшанадіА.//- | 901 | 1272 | -14 96 аоосіаодатюоство | 2-12-2 |АСодіаодаюдос | 961 | 1842 | -20 98 |сааодстаодаювої | 2-12-2 |САаоодіаодаюЧдат | 982 | 1844 | -20 98 |сааодстаодаювої | 3-11-2 |СААоодіаосаюдєот | 981 | 1844 | 21 99 (|ссааростаодаюда | 2-12-2 |ССааоодіаосаюсь | 991 | 1845 | -22
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ери ри ГЕТЕ 1
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ери ри ГЕТЕ 1
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ери и ГЕТЕ 1
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ери ри ГЕТЕ
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ери ри ГЕТЕ 1
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ери ри ГЕТЕ 1
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ери и ГЕТЕ 1
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ери и ПЕТЕР 1
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ря и ГЕТЕ
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ря и ПЕТЕР 1 600 ааайюосаддаассс | 3-11-2 |ТААаюосаддаассС | 6001 | 13710 | 19 606 (ассснадісадсіюс | 2-10-4 |АСсспадісадСтОС | 606 1 | 13998 | -27 609 ссіаісідісаїсаю | 2-11-3 |ССівісідісаєсато | 6091 | 14178 | -20
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ря и ГЕТЕ 1 (660 (|аоомаанаанйсаатас | 4-11-4 |дОСтіаанаайсадтАє | 6601 | 16102 | -21
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас ря и ГЕТЕ 1 666 (|ссаадшааайсаао | 4-10-4 |ССААдіааашсААс | 666 1 | 16189 | -21 669 Оасасссаїййсадіда | 2-11-3 |АСаїсссаїасадтсА | 669 1 | 16208 | -21 690 фЮсссюснайвааї | 4-10-2 |ГОСОсіснавадт | 6901 | 16901 | -23 696 (діасссаанаюси | 2-11-3 |СТасссаапаюСТтт | 6961 17180 | 21 699 (Шоїасссаанайс | 3-11-2 |ГТТоїасссаанатс | 6991 17183 | 17
Таблиця 5
Список послідовностей олігонуклеотидних мотивів (зазначених за ЗЕО ІО МО), націлених на транскрипт людського РО-І 1 (ЗЕО ІЮ МО: 1), їх конструкції, а також специфічні антисмислові олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІЮ МО), розроблені на основі мотиву послідовності
ЗЕО І Мотив Конструк- Олігонуклеотидна СМРІВ| ІЮ МО | ас леж рми реехТ" 1
Мотиви послідовностей являють собою безперервну послідовність нуклеїнових основ, присутню в олігонуклеотиді.
Конструкції відносяться до конструкції гепмерів - ЕС-Е- де кожне число представляє число послідовних модифікованих нуклеозидів, наприклад, 2 модифікованих нуклеозидів (перше число - 5'-фланг), з подальшим числом нуклеозидів ДНК (друге число - ділянка гепа), з подальшим числом модифікованих нуклеозидів, наприклад, 2 модифікованих нуклеозидів (третє число - 3'і-фланг), якому можливо передують або після якого можливо слідують додаткові повторювані ділянки ДНК і І МА, які не є необхідною частиною даної безперервної послідовності, яка є комплементарною нуклеїновій кислоті-мішені.
Олігонуклеотидні сполуки представляють конкретні конструкції мотивів послідовності.
Заголовні букви позначають нуклеозиди бета-О-окси І МА, малі літери позначають нуклеозиди
ДНК, всі С МА являють собою 5-метилцитозин, всі міжнуклеозидні зв'язки являють собою фосфоротіоатні міжнуклеозидні зв'язки.
Таблиця 6
Олігонуклеотиди, націлені на мишиний транскрипт РО-І 1 (ЗЕО ІО МО: 4), їх конструкція, а також специфічні олігонуклеотидні сполуки (зазначені за СМР ІО МО), розроблені на основі послідовності мотиву
ЗЕО І Мотив Конст- Олігонуклеотидна |СМРІО| Початок на ас
МО послідовності рукція сполука МО ЗЕОЮ МО: 4 адшасашістюс 3-10-3. | АСТНасанетас 744 1 4189
Іаюідазоадоадад | 3-10-3 | ТАТоїдаадаодасьсь | 745 1 7797 3-10-3. | САСсШаааассссСА 746 1 9221
Іссшагааісасас 3-10-3. | ТССШагїааісасАС 747 1 10386 асодіаннсаса9да 3-10-3. | АСбСдіашісаса СО 748 1 12389 дасасіасазідадда | 3-10-3 | йАСасіасааічзайсА | 749 1 15088 ідишаоддасіді 3-10-3 | Тасищшадоастат 750 1 16410 судасааайсіаїссі 3-10-3. | СсАсааансіа(юст 751 1 18688
Ююдаїаіасааюсіас 3-10-3 | ТОАїіаіасааюстАС 752. 1 18735
Ісонподоїаааша 3-10-3 | ТСсподоїааайт ТА 753 1 19495
Ююсшаїааащою 3-10-3 | ТаСшагаааюста 754 1 19880
Мотиви послідовностей являють собою безперервну послідовність нуклеїнових основ, присутню в олігонуклеотиді.
Конструкції відносяться до конструкції гепмерів - ЕС-Е- де кожне число являє собою число послідовних модифікованих нуклеозидів, наприклад, 2" модифікованих нуклеозидів (перше число - 5'-фланг), з подальшим числом нуклеозидів ДНК (друге число - ділянка гепа), з подальшим числом модифікованих нуклеозидів, наприклад, 2 модифікованих нуклеозидів (третє число - 3'і-фланг), якому можливо передують або після якого можливо слідують додаткові повторювані ділянки ДНК і І МА, які не є необхідною частиною даної безперервної послідовності, яка є комплементарною нуклеїновій кислоті-мішені.
Олігонуклеотідні сполуки представляють конкретні конструкції мотивів послідовності.
Заголовні букви позначають нуклеозиди бета-О-окси І МА, малі літери позначають нуклеозиди
ДНК, всі С МА являють собою 5-метилцитозин, всі міжнуклеозидні зв'язки являють собою фосфоротіоатні міжнуклеозидні зв'язки.
Таблиця 7
Послідовності олігонуклеотідних мотивів і антисмислові сполуки з 5'-са біорозщеплювальним лінкером 5ЕО Ір МО олігонуклеотидна ссполука з лінкером | СМР ІЮ МО са сааоашасашісідс Соаса С ТНасашіста С 755 1 саївідічаададоаоай сесас ТА Тоїщдаададдасяс 756 1 саїссщшаїааісасас Содо ТС ШаїааіїсасАС 758. 1 саасддтайінсасада СсоаосбАССдіаннсасасо 759 1 садасасіасааюадда Соао АСасіасаащасох 760 1 садоаншадодастоі Сосас ТИСИШаддастат 761 1 сасдасазайсіаїссі СоаєСС Асааансагєст 762.1 саїщдаїайасааіюдсіас Соао ГО АїаїасааюстАС 763 1 саїсоподдіаааша СосасГСстддоаааай ТА 764 1 бо
Таблиця 7
Послідовності олігонуклеотідних мотивів і антисмислові сполуки з 5'-са біорозщеплювальним лінкером 5ЕО Ір МО олігонуклеотидна ссполука з лінкером | СМР ІЮ МО са садсшаїаваюцюіо Соас ТИС Шаїаааюсто 765 1 саасааавіааюойнасісі СсосагаСААаїааюонастот 766 1 сасадандаюдіадії СосассСА СА йдаюдіадтт 767 1 сассіашіаасаїсадас СоасСсСіашаасаїсАСс АС 768 1 сасіаайдіадіадіасіс СоаоС ТАайдіадіадіасто 769 1 сааіааасащдааїсісісс СоагсАа ТазасаюазісіСтоС 770 1
Заголовні букви позначають нуклеозиди бета-ЮО-окси І МА, малі літери позначають нуклеозиди ДНК, всі С І МА являють собою 5-метилцитозин, підрядковий символ о означає фосфодіефірний міжнуклеозидний зв'язок, і, якщо не вказано інакше, інші міжнуклеозидні зв'язки являють собою фосфоротіоатні міжнуклеозидні зв'язки.
Таблиця 8
Антисмислові олігонуклеотидні сполуки, кон'юговані з СаіМмМАс аМ2-СбосоасАС ПШасашістас 755.2
ОеМ2-Сбососас ТА ТадаададдасА с 756 2 аМ2-СбососадСАСсШаааассссСА 757 2 аМ2-Сбосоао ГОСТШаїааісасАс 7582
ОеМ2-СбососасАСсідіашнсасА а 759 2
ОМ2-Сбососаосс:АСасіасааїідассА 760 2
ОМ2-Сбоссаг ТИСИШадчастат 76812 аМ2-Сбососадос 1 Асааайста(юстТ 7622 аМ2-Сбосоао Га АайасааюстАс 763 2
ОеМ2-Сбосоасо ГССпПоОДдоагааат ТА 764 2 аМ2-Сбосоао ГаСщШагаааюиста 765 2
ОеМ2-СбососасАСАлЛаїааіднастот 766 2
ОеМ2-Сбоссає АСАНаадаіаачтт 767 2 аМ2-СбососаоєосСташаасасАсАС 768 2
ОеМ2-СбосоаоС ТАайдіавчіадіаСто 769 2 аМ2-СбососасАТааасаюаайсіСстоС 7702
С2М2 представляє тривалентний СаіМАс кластер, показаний на Фіг. 3, Сб представляє аміноалкільну групу з 6 атомами вуглецю, заголовні букви позначають нуклеозиди бета-О-окси
МА, малі літери позначають нуклеозиди ДНК, всі С МА являють собою 5-метилцитозин, підрядковий символ о позначає фосфодіефірний нуклеозидний зв'язок, і, якщо не вказано інакше, інші міжнуклеозидні зв'язки являють собою фосфоротіоатні міжнуклеозидні зв'язки.
Хімічні формули, що представляють деякі з цих молекул, показані на Фіг. 4-8.
Мишині моделі ААМ/НВМУ
Модель Пастера:
В Інституті Пастера створили і розводили трансгенних за НІ А-А2.1-/НІ А-ОК1 нокаутованих за Н-2 класом І-/класом ІІ мишей (званих в даному документі НГА-А2/ОКІ1). Дані миші являють собою експериментальну модель іп мімо для досліджень людської імунної функції без будь- якого впливу, що заважає відповіді мишиного МНС (головний комплекс гістосумісності) (Райої еї аІ. 2004 Єик у Іттипої. 34 (11): 3060-9.
У даних дослідженнях використовували вектор на основі аденосателітного вірусу (ААМ) серотипу ААМ 2/8, що несе компетентний до реплікації ДНК-геном НВУ. Вектор ААМ-НВМ (партія
СМРМ Ж 6163) розводили в стерильному фосфатно-сольовому буферному розчині (РВ5) з досягненням титру 5х10!! вг (геном вектора)/мл. Мишам внутрішньовенно (в. в.) ін'єктували 100 мкл даного розведеного розчину (доза/миша: 5х1079 вг) в хвостову вену. У крові мишей-носіїв
НВМ виявляли повні вірусні частинки, що містять ДНК НВУ. НВсАд виявляли протягом з точністю до одного року в печінці, поряд з тими, які циркулюють білками НВМУ - НВеда і НВзАа - в крові. У всіх мишей, трансдукованих ААМ2/8-НВУ, НВзАд, НВедо і ДНК НВУ зберігалися в сироватці протягом щонайменше одного року (біоп еї аї. 2013 У Міго! 87: 5554-5563).
Шанхайська модель:
У даній моделі у мишей, інфікованих рекомбінантним аденосателітним вірусом (ААМ), що несе геном НВМ (ААМ/НВУ), підтримується стабільна віремія і антигенімія протягом більше, ніж 30 тижнів (Юап Мапод, еїаІ. 2014 СеПшаг 5 МоІесшаг Іттипоїіоду 11, 71-78).
Самців мишей С57ВІ /6 (4-6-тижневих), що не містять специфічних патогенів, отримували в
ЗІ АС (Центр тварин Шанхайської лабораторії Китайської академії наук) і містили в віварії в індивідуально вентильованих клітинах. Слідували інструкцій з догляду та застосування тварин, як вказується МиХхі ІАСИС (Інституційний комітет з догляду та застосування тварин, номер потокола УМОХІ ІАСОС К20131126-миша). Мишам давали акліматизуватися до нових умов протягом З діб і групували їх згідно зі схемою екперименту.
Рекомбінантний ААМ-НВМ розводили в РВ5, 200 мкл на ін'єкцію. Даний рекомбінантний вірус несе 1,3 копії геному НВМ (генотип 0, серотип аум/).
В добу 0 всім мишам ін'єктували через хвостову вену 200 мкл ААМ-НВУ. В добу 6, 13 і 20 після ін'єкції ААМ всім мишам робили підщелепні кровопускання (0,1 мл крові/миша) для відбору сироватки. В добу 22 після ін'єкції миші зі стабільною віремією були готові для обробки олігонуклеотидами. Дані олігонуклеотиди можуть бути некон'югованими або кон'югованими з
СаІМмАс.
Зо ДНК-вакцина
Плазмідна ДНК не містила ендотоксинів і була виготовлена Ріазтіа-Расіогу (Німеччина). рОМУ-52.5 аумж/ кодує домени ргеб52 і 5 НВ5ЗАд (генотип 0), та їх експресія контролюється негайним раннім промотором гена цитомегаловірусу (Міснпеї еї аї. 1 995 Ргос Маї! Асад сі ОБ А 92: 5307-5311). РОМУ-НВс кодує капсид НВУ, що несе Ад (антиген) кора вірусу гепатиту (НВс) (Ріоп єї а. 2013 У Міго! 87: 5554-5563).
Обробку ДНК-вакциною проводили, як описано в даному документі. За п'ять діб до вакцинації в м'язи мишей ін'єктували кардіотоксин (Сатх, латоксан реф. І 81-02, 50 мкл/м'язи).
СатТх деполяризує м'язові волокна з індукцією дегенерації клітин, через 5 діб після ін'єкції з'являться нові м'язові волокна, і вони будуть отримувати ДНК-вакцину для кращої ефективності трансфекції. Кожен з рСММУ-52.5 аумж і рСмММСоге в концентрації 1 мг/мл змішували в рівній кількості, і кожна миша отримувала всього 100 мкг двосторонньої внутрішньом'язової ін'єкції в оброблені кардіотоксином передні великогомілкові м'язи, як було описано раніше в Міснеї еї аї. 1995 Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 92: 5307-5311, під анестезією (100 мкл 12,5 мг/мл кетаміну, 1,25 мг/мл ксилазину).
Антитіло проти РО-І 1
Це мишине антитіло ЇдсС1 проти мишиного РО-Ї1 клону 6Е11, вироблене всередині
Сепеїесп. Воно являє собою імітуюче антитіло, яке перехресно блокує атезолізумаб, і має аналогічну активність, яка блокує іп міго атезолізумаб, вироблений всередині Коспе. Дане антитіло вводили внутрішньочеревною ін'єкцією (в. ч.) в дозі 12,5 мкг/г.
Синтез олігонуклеотидів
Синтез олігонуклеотидів звичайно відомий в даній області. Нижче представлений протокол, який можна застосовувати. Олігонуклеотиди за даним винаходом можливо були одержані злегка відмінними способами в показниках використаних приладу, підкладки та концентрацій.
Олігонуклеотиди синтезуються на уридинових універсальних підкладках з використанням фосфорамідитного підходу на ОіїдотаКег 48 в масштабі 1 мкмоль. В кінці синтезу олігонуклеотиди відщеплюються від твердої підкладки з використанням водного аміаку протягом 5-16 годин при 60 "С. Олігонуклеотиди очищуються за допомогою ВЕРХ (високоефективна рідинна хроматографія) з оберненою фазою (ВЕРХ-ОФ) або за допомогою екстракції твердої фази і характеризуються за допомогою НЕРХ (Надефективна рідинна бо хроматографія), і далі підтверджується молекулярна маса за допомогою МСеС-Ері (мас-
спектрометрія з електророзпилювальною іонізацією).
Елонгація олігонуклеотиду:
Зв'язування р-ціаноетил-фосфорамідитів (ДНК-А(В2), ДНК-С(іби), ДНК-С(В2), ДНК-Т, СМА-5- метил-С(В2), І МА-А(В2), І МА-Скаті) або І МА-Т) проводиться шляхом застосування розчину 0,1
М амідиту, захищеного 5'-О-ОМТ, в ацетонітрилі і ОСІ (4,5-диціаноїмідазол) в ацетонітрилі (0,25
М) як активатора. Для останнього циклу може бути використаний фосфорамідит з необхідними модифікаціями, наприклад, Сб-лінкер для приєднання кон'югатної групи або кон'югатної групи як такої. Тіолування для введення фосфортіоатних зв'язків проводиться з використанням ксантангідриду (0,01 М в ацетонітрилі/піридині 9:1). Фосфодіефірні зв'язки можуть вводитися з використанням 0,02 М йоду в ТНЕ/піридині/воді 7:2:1. Іншими реактивами є реактиви, які типово використовуються для синтезу олігонуклеотидів.
Для кон'югування після твердофазного синтезу можна використовувати наявний у продажу
Сб амінолінкер фосфорамідит в останньому циклі твердофазного синтезу, і після зняття захисту і відщеплення від твердої підкладки виділяється зв'язаний амінолінкером олігонуклеотид зі знятим захистом. Кон'югати вводяться через активацію функціональної групи з використанням стандартних способів синтезу.
Які альтернативу, кон'югатне угруповання можна додавати до олігонуклеотидів, в той час як він все ще знаходиться на твердій основі з використанням фосфорамідиту з СаІМАс або з кластером СаїЇМАс, як описано в РСТ/ЕР2015/073331 або в заявці ЕР Мо 15194811.4.
Очищення шляхом ВЕРХ-ОФ:
Неочищені сполуки очищають препаративною ВЕРХ-ОФ на колонці Рпепотепех дУирйег С18 10 мкм 150х10 мм. Як буфери використовують 0,1 М ацетат амонію, рН 8, і ацетонітрил при швидкості струму 5 мл/хв. Відібрані фракції ліофілізують з одержанням очищеної сполуки - типово у вигляді білої твердої речовини.
Скорочення:
ОСІ: 4,5-диціаноіїмідазол ром: дихлорметан
ОМЕ: диметилформамід ом: 4,4 диметокситритил
Зо ТНЕ: тетрагідрофуран
В: бензоїл
Іри: ізобутирил
ВЕРХ-ОФ: високоефективна рідинна хроматографія з оберненою фазою
Аналіз Тт
Дуплекси олігонуклеотиду і РНК-мішені (зв'язаної фосфатом - РО) розводять до З мМ в 500 мл води, яка не містить РНКази, і змішують з 500 мл 2х Тпт-буфера (200 мМ Масі, 0,2 мМ ЕОТА (етилендіамінтетраоцтової кислоти), 20 мМ фосфат Ма, рН 7,0). Даний розчин нагрівають до 95 "С протягом З хв. і потім дають здійснюватися відпалу при кімнатній температурі протягом 30 хв. Температури плавлення дуплексу (Тт) вимірюють на спектрофотометрі Гатраа 40, що працює в ультрафіолетовій/видимій ділянці, оснащеному програматором температури Пелетьє
РТРб, використовуючи програму РЕ Тетріаб (Регкіп ЕІтег). Температура підвищується від 20 "б до 95 "С ії потім знижується до 25 "С, із записом поглинання при 260 нм. Для оцінки Тт дуплексу використовуються перша похідна і локальні максимуми як плавлення, так і відпалу.
Аналіз тканеспецифічного розщеплення лінкера іп міго
Мічені ЕАМ олігонуклеотиди з біорозщеплювальним лінкером, що підлягають тестуванню (наприклад, фосфодіефірний лінкер ДНК (РО лінкер)), піддаються розщепленню іп міго з використанням гомогенатів релевантних тканин (наприклад, печінки або нирки) і сироватки.
Зразки тканини і сироватки відбирають у відповідної тварини (наприклад, миші, мавпи, свині або щура) і гомогенізують в гомогенізаційному буфері (0,5 95 Ідера! СА-630, 25 мМ Тті5, рН 8,0, 100 мм Масі, рН 8,0 (доведений 1 н. Маон). В гомогенати тканини і сироватку впорскують олігонуклеотид до концентрацій 200 мкг/г тканини. Зразки інкубуються протягом 24 годин при 37 "С, і потім дані зразки піддають екстракції фенолом-хлороформом. Розчини піддають аналізам
ВЕРХ АО (високоефективна рідинна хроматографія на аніонообмінній колонці) на Оіопех
ОШітагїе 3000 з використанням колонки біопех ОМАрас р-100 і градієнта в інтервалі від 10 мМ до 1 М перхлорату натрію при рН 7,5. Вміст розщепленого і нерозщепленого олігонуклеотиду визначається відносно стандарту з використанням як флюоресцентного детектора при 615 нм, так і УФ детектора при 260 нм.
Аналіз розщеплення нуклеазою 51
Мічені ЕБАМ оолігонуклеотиди з лінкерами, чутливими до нуклеази 51 (наприклад, бо фосфодіефірний ДНК-лінкер (РО лінкер)), піддаються розщепленню іп міїго в екстракті нуклеази
91 або сироватці. 100 мкМ олігонуклеотидів піддаються розщепленню іп мйго нуклеазами 51 в буфері для нуклеази (60 ШО на 100 мкл) протягом 20 ї 120 хвилин. Ферментативну активність зупиняють додаванням в розчин буфера ЕОТА. Розчини піддають аналізам ВЕРХ АО на біопех ОШтаїе 3000 з використанням колонки Оіопех ОМАрас р-100 і градієнта в інтервалі від 10 мМ до 1 М перхлорату натрію при рН 7,5. Вміст розщепленого і не розщепленого олігонуклеотиду визначається відносно стандарту з використанням як флюоресцентного детектора при 615 нм, так і УФ детектора при 260 нм.
Одержання одноядерних клітин печінки
Клітини печінки від мишей ААМ/НВМ отримували, як описано нижче, і відповідно до способу, описаного Тиріп еї аіІ. 2006 Меїпод5 Епгутої 417: 185-201, з невеликими модифікаціями. Після умертвіння мишей здійснювали перфузію печінки 10 мл стерильного РВ5 через портальну вену печінки з використанням шприца з голкою калібру 25. Коли орган став блідим, даний орган відбирали в збалансований сольовий розчин Хенкса (НВЗ5) (СІВСОФ НВ5З5, 24020) плюс 5 95 фетальної телячої сироватки з віддаленим комплементом (ЕС5). Відібрану печінку акуратно продавлювали через 100 мкм клітинне сито (ВО Раїсоп, 352360), і клітини суспендованих в 30 мл НВ5З5 плюс 5 96 ЕС5. Суспензію клітин центрифугували при 50 д протягом 5 хв.
Супернатанти потім центрифугували при 289 9 протягом 10 хв. при 4 "С. Після центрифугування супернатант відкидали, і осади ресуспендували в 15 мл при кімнатній температурі в 35 бо-ному ізотонічному розчині Перколла (Регсої! від СЕ Неайпсаге Ж 17-0891-01, розведений в КРМІ 1640 (СІВСО, 31870)) і переносили в 15 мл пробірку. Клітини далі центрифугували при 1360 9 протягом 25 хв. при кімнатній тмпературі. Супернатант відкидали відсмоктуванням, і осад, що містить одноядерні клітини, двічі промивали НВ55З плюс 5 95 ЕС5.
Клітини культивували в повному середовищі (сх-мінімальне незамінне середовище (сірсо, 22571), додаткове 10 до ЕС5 (Нусіопе, Ж 5НЗО066, партія АРО21570), 100 О/мл пеніциліну плюс 100 мкг/мл стрептоміцину плюс 0,3 мг/мл І-глутаміну (Сшірсо, 10378), їх замінними амінокислотами (бібсо, 11140), 10 мМ Нерез (бірсо, 15630), 1 мМ піруватом натрію (сзібсо, 11360) ії 50 мкм р-меркаптоетанолом (І КВ, 1830)).
Поверхневе мічення клітин
Клітини висівали в 96-лункові планшети з О-подібним дном і промивали РВ5 для РГАС5 (флуоресцентне сортування клітин) (РВ5, що містить 1 95 бичачого сироваткового альбуміну та 0,01 95 азиду натрію). Клітини інкубували з 5 мкл РВ5 для ЕАС5, що містить щуряче антитіло проти мишиного СО16/СО032 і маркер життєздатності ГО фіксується жовтий, ПТпептоїї5пег,
І 34959, протягом 10 хв. в темряві при 4 С. Потім клітини фарбували протягом 20 хв. в темряві при 4 "С з використанням 25 мкл РВ5 для РАС5, що містить моноклональні антитіла (Маб) проти МК РА46 ВУ421 (щуряче Мар проти мишиного МК Р46, ВіоІедепа, 137612) та Е4/80 (щуряче
Мар проти мишиного Е4/80, кон'югованих з РІТС (флюоресцеїнізотіоціанат), ВО ВіоїІедепа, 123108), і також додавали два додаткових поверхневих маркера: РОЇ (щуряче Мар проти мишиного РОМ, кон'югованих з РЕ (фосфоестераза), ВО Віозсіепсе5, 551892) і РОІ1 (щуряче
Маб проти мишиного РОЇ 1 ВМ711, Віоієдепа, 124319).
Аналіз внутрішньоклітинного фарбування на цитокіни (ІС)
Аналізи ІС5 проводили і на спленоцитах, і на одноядерних клітинах печінки. Клітини висівали в 96-лункові планшети з О-подібним дном. Планшети з клітинами інкубували протягом ночі при 37 "С або в одному повному середовищі як негативного контролю, або з пептидами, описаними в таблиці 9, в концентрації 2 мкг/мл. Після однієї години інкубації додавали брефельдин А (бідта, Вб6542) в концентрації 2 мкг/мл.
Після культури протягом ночі клітини промивали РВ5 для ЕБАСЗ5 та інкубували з 5 мкл РВ5 для ЕАС5, що містить щуряче антитіло проти мишиного СО16/С032 і маркер життєздатності І О фіксується жовтий, ТПпегтоїї5Ппег, 134959, протягом 10 хв. в темряві при 4 "С. Потім клітини фарбували протягом 20 хв. в темряві при 4 "С з використанням 25 мкл РВЗ для РАС5, що містить Мар. Суміш складалася з моноклональних антитіл проти СОЗ (Мар хом'яка проти мишиного СОЗ-РегСР, ВО Віозсіепсе5, 553067), проти СО8 (щуряче Маб проти мишиного СО8-
АРС-Н7, ВО Віозсіепсе5, 560182), проти СО4 (щуряче Маб проти мишиного СО4- РЕ-Су7, ВО
Віозсіепсе5, 552775) і проти МК-клітин (щуряче Маб проти мишиних МК Р46 ВМ421, ВіоІєедепа, 137612). Клітини фіксували після декількох промивок і робили проникними протягом 20 хв. в темряві при кімнатній температурі з використанням Суїоїх/Суїорегт, промивали розчином
Репт/л/лазп (ВО Віозсіепсев, 554714) при 4 760.
Внутрішньоклітинне фарбування на цитокіни з використанням антитіл проти ІЕМу (інтерферон-гамма) (щуряче Мар проти мишиного ІЕМу-АРС, клон ХМО1.2, ВО Віозсіепсев, бо 554413) і фактора некрозу пухлин-альфа (ТМЕо)д (щуряче Мар проти мишиного ТМЕсо-РІТС, клон
МРб-ХТ22; 1/250 (ВО Віозсіепсе5 554418) проводили протягом 30 хв. в темряві при 4 "С. Перед аналізом за допомогою проточної цитометрії з використанням аналізатора МАСЗОцапі клітини промивали Репгт///азхі і ресуспендували в РВ5 для ЕАС5, що містить 1 956 формальдегіду.
Живі клітини СОЗ- СОв8- СО4- і СОЗ3- СО8-СО4-- сортували і представляли на точковому графіку. Визначали дві ділянки для сортування позитивних клітин відносно кожного цитокіну.
Число подій, виявлене при даних сортуваннях, ділили на загальне число подій в батьківській популяції для отримання процентних вмістів відповідаючих Т-клітин. Для кожної миші процентна частка, отримана в одному середовищі, розглядалася як фон і віднімалася з процентної частки, отриманої при стимулюванні пептидами.
Поріг позитивності визначали згідно фону експерименту, тобто середньої відсоткової частці забарвлених клітин, отриманої для кожної групи в умовах одного середовища, плюс два стандартних відхилення. Тільки процентна частка цитокіну, представленого щонайменше в 5 подіях, вважалася позитивною.
Таблиця 9
Епітопи, обмежені НІ А-А2/ОВІ1, що містяться в коровому білку НВМУ і доменах оболонки НВзАа (52-45)
Білок Поло- Поло- Послідовність Обмеження Посилання ження | ження НІГА початку | кінця 18 27 ЕСРБОБЕРБМ Аг Вепо!ейі єї аї. (ЗЕО ІО МО: 773) СавзігоепієгоЇїоду
Ядро 1997 112:193-199 111 125 СВЕТМ'ЕМІ М5ЕИаММУ р (Вепоїені еї аї. реле в 1997 112:193-199 114 128 ТТЕНОТГ ООРВУВИЇ. р Раіої ві а. (ЗЕО ІО МО: 775) Місторевз Іптесі 2006;8:2783-2790. 179 194 ОАСЕРІТВІСТІРОБ Аг я ОВ1 Раіої ві а. (ЗЕО ІО МО: 776) Місторевз Іптесі 2006;8:2783-2790. 183 191 ЕТАП ТІ Аг Зейе єї аї. У (ЗЕО ІО МО: 777) Іттипо) 1994;153:5586- 5592. 200 214 ТІ МЕ, саттУсі ас Аг я ОВ1 Раіої ві а. (ЗЕО ІО МО: 778) Місторевз Іптесі 2006;8:2783-2790.
Оболон- 204 212 гааттМсі Аг Вепегтапп е6ї аї. ка (525) (ЗЕО ІЮ МО: 779) Ехр Меа 1995;181: 1047-1058. 335 343 МІ ЗІ СМРЕМ Аг Мауеєгзіпа єї аї. у (ЗЕО ІЮ МО: 780) Іттипо! 1993150: 4659-4671. 337 357 ЗП МРЕМОМУЕМаї ЗРТУМІІ ЗМ | А2 - ОВ Гоїгаї єї аї. у (ЗЕО ІО МО: 781) Іттипої 2000;165: 4748-4755 348 357 СІ 5РТУМІ 5У Аг Гоїакї єї аї. (ЗЕО ІО МО: 782) Іттипо!ї 2000;165: 4748-4755 370 379 ЗІ ЗРЕГРІЇ Аг Міг2гиКозні еї аї. У (ЗЕО ІО МО: 783) Іттипо!ї 2004173: 5863-5871.
Приклад 1. Тестування ефективності іп міо
Проводили прогулянку по гену по людському транскрипту РО-І1, використовуючи, головним чином, 16-20-мірні гепмери. Тестування ефективності проводили в експерименті іп міго в моноцитарній лінії клітин людського лейкозу ТНРІ їі в лінії клітин людської неходжкінської лімфоми К (КААРАБ-299).
Лінії клітин
Лінію клітин ТНРІ1 їі Каграз5-299 початково отримували в Європейській колекції автентичних культур клітин (ЕСАСС) і підтримували, як рекомендовано постачальником, в зволоженому інкубаторі при 37 "С з 5 95 СО».
Ефективність олігонуклеотидів
Клітини ТНР-1 (Зх107 в АРМІ-Сішатах, 10 95 ЕВ5, 1 95 пеніциліну-стрептоміцину (Тпегто
Еівпег Зсієпійіс) додавали до олігонуклеотидів (4-5 мкл) в 96-лункові круглодонні планшети і культивували протягом б діб в кінцевому об'ємі 100 мкл/лунку. Олігонуклеотиди піддавали скринінгу в одній єдиній концентрації (20 мкМ) і в інтервалі дози-концентраціях від 25 мкМ до 0,004 мкМ (розведення 1: З у воді). Загальну мРНК екстрагували з використанням набору для клітинної РНК в великому об'ємі МадМмА Риге 96 на системі МадМА Риге 96 БЗуєіет (Коспе
Ріадповіїйс5) згідно з інструкціями виробника. Для аналізу експресії генів проводили кКПЛР-ОТ (кількісна полімеразна ланцюгова реакція, сполучена зі оборотною транскрипцією) з використанням набору ТадМап РМА-ю-сі 1-5їер (Тпепто Рібзпег Бсіепійіс) на приладі
Оцапізіцай (Арріїєїй Віозувзівт5) з попередньо сконструйованими праймерами Тадтап, націленими на людський РО-11 і АСТВ, який використовується як ендогенний контроль (ТНпегто
Еі5пег Зсіепійіс). Відносний рівень експресії мРНК РО-Ї1 розраховували з використанням способу 2(-дельта дельта С (Т)), а процентну частку інгібування висловлювали в 95 в порівнянні з контрольним зразком (необроблені клітини).
Клітини Кагра5-299 культивували в КРМІ 1640, 2 мМ глутаміну і 20 до ЕВ5 (5ідта). Клітини, посіяні в кількості 10000 клітин/лунку в 9б-лункові планшети, інкубували протягом 24 годин перед додаванням олігонуклеотидів, розчинених в РВ5. Кінцева концентрація олігонуклеотидів була в одній дозі 5 мкМ в кінцевому об'ємі культури 100 мкл/лунку, або їх додавали в дозі, що варіює від 50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ в об'ємі культури 100 мкл. Клітини відбирали через З доби після додавання олігонуклеотидних сполук, і РНК екстрагували з використанням набору для очищення РНК Ригеї іпК Рго 96 (Атрбіоп) згідно з інструкціями виробника. кКДНК синтезували з використанням зворотної транскриптази М-
Зо МІ.Т, випадкових декамерів КЕТКО зогірі, інгібітора РНКази (Атрбіоп) і набору 100 мМ днНтФ (дезоксинуклеотидтрифосфат) (Іпмійгодеп, рівень якості для ПЛР) згідно з інструкцією виробника. Для аналізу експресії генів проводили КПЛР з використанням майстер-міксу (2х)
Тадмап ГРабхі Адмапсеа (Атрбіоп) в дуплексі, встановленому з праймерами Тадмап для аналізів
РО-І1 (Арріїєй Віозубіет5; Н5ьО1125299 т!1) ії ТВР (Арріїей Віозубіет5; 4325803). Відносний рівень експресії МРНК РО-Ї1 показаний в Таблиці 10 як 95 від контрольного зразка (клітини, оброблені РВ5Б).
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5)
Клітини КАВРА5-299 Клітини ТНР1 5 мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о
СМР 95 МРНК від уо МРНК Сполука (СМР) ЗЕО І МО
МО контролю за від за 1 р контролю
Стоаасасасавісос
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о, контролю 141 | з | 7 | 21 | 6 |сбАСпаснадаюст | 497 5 | 41116 0011118 000110 |АбСаспаснадатос// | 4980 161 | 96) 14 140 007 |оСАбовададастас | 506 22.12 1119 0 з |ААтАаапосонсдос | Би 181 | 34 | 6 | 2 | 9 |оСАлавааюсстт | 55 201 | 73 | 8 | 56 | 15 |САСАосаавіваайос./-/// | 548 2 | 83 18 165 ло |тобАсарадсааавддт//-/ | 551 221 | 86 | 6 | 80 0 8 фАТобОСасададсаддті//-/ | 554 261 | 601114 10056 019 |ААоасавасссадастоа | 675 291 | 30) 2 | 18 06 |тоттаварасаавасос | вва 321 | 29.) 5 | 14 08 |АОббіаравасааюютА.Г////О| 720 351 | 83 2 | 66 21 |САвоонташааттс | 773 зв | 69111149 0013 |ТАСпасосааютдаГ///| 8170 391 | 49 15 | 26 9 |САтнаонавссдАТ | ва ої | 23117 18 02 |тсАшарассяА | 822 а | 24 | 6 | 12 | з |ттсашавнасссл//// | 823 31 | 71118 1145 0 з |САОтоаоованадттт | 837 441 | 60 | 5 | 45 | 17 |СсСААсасоюародАтт | ва
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о, контролю я | 44131127 000100 |ТТаїсссаасадтсд | ва; 481 | 38 | з | 26 | 6 |ТтТаййсссавсаотса///-/ | вав вот 220,8 5 | 2 | ТААОставосслА |в
Ба! | 80 | 11 | 48 | ло |ОтАваішасстаті//// | 859 551 | 86 | 12 | 70 | 15 |АОвіаюаюсвата.ї /-/-/-/-/--/| 905 561 | 568 027 7 |бАбайавюслат | 906 571 | 281117 1113005 |ССвовомаватос | 909 581 | 88013 0069 0023 |СААТайосададдтАт | 915 51 | 29 | з | 74 | 6 |оСААІаносададдТтА | 916 631 | 23 | 6 | 12 | 6 Ц|АСААЮарсаавттос | 923 в41 | 58 19 143 015 |АСіаадіаонасасист | 957 651 | 32 | 5 | 14 6 |СтААсіаонасавс | 958 вв | 35 | 4 | з | 6 |сбАСіаасадтасастт | 959 691 | 42 | 9 | 5 | 13 |СтСшовсіввотда | 967 то | 81116 1 56 12 |осСтСшоавааота.//-/// | 968 й | 27113 1139 09 |ССпвавівсютсяс | слово 731 | 35 | 6 | 43 |з |тоСпааавсютто | лов2 751 | 58 16 128 06 |ТАсаївоююстт | 1073 761 | 26 | 4 | 9 | 2 |Абтаюавоютос | 1075 781 | 49 15 | 35 6 |АСаоівюавотст | 1077 782 | 74 | 6 | зв | 8 |АсбАоіаюсаюцттст | 1077
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о, контролю контролю вал | 24 | 6 | 20 | 7 |ттСтісарарівіаті | лов 861 | 5о | 4 | 54 | 8 |ТСаоасасюаса | 1215 871 | 5 8 128 08 |ТСасасасюютас | 12160 вв | 61114133 06 |Стайававослт | 12660 вел | 7 | 8 | 43 | 12 |АССАвасшанадА/// | 1272 вої | 62) 5 | 42 9 |АААСсісасівадто | лов80
МО - не чається се | 42 | 4 | 60 | 24 |АААСіаодарсавддос | 1476 свя | 86) 15 46 010 |Стіаарсадосадода | 806 ев | 666 182 027 |АСосізодаюддАС | ва е71 | 60 | 9 | 69 | 5 |СААоодадоаюют | ва вві | 65 8 | 76 28 |ССавоодаодаююо | ва5О о, 341116 11122 02 |САдоааоювюдостса | 1938 вт | 01178. 29. | 6 |СААтоааяюавастос 101956 ов | 30) 4120 6 |АОСАвюаааювлАСТ | 1958 69118 135 8 |Абаапаюассатлт | 200
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о, контролю паті вв | 8 | 54 | 21 |СттоароваоватАТО | 27 петлі вв | 6 | 104 | з5 (сттопоароівасдАТ 12021 п 850,6 | в | 17 |тоттосворяавдА | 2ого пелті ло | 74 | 102. | 8 | топюнсвоюаСА | 2028 от я4600| 6 | 81 | 11 |стптооюіааоююдю | 209 а | 74.11.81 55.) 21 |СлопорюіявододА 010 2оБо 231650 8 | 95 | 21 Со опооюіавоаюдА | 2ово 5165006 | Мо | Мо (ОСаопосваовсА | ооБт 71220, 6 | 70.0| з Стозівісадюююлот | 2ов ет во0 | 40 | я6 | 8 СА саюпотає | 2087 за 350 | 6 | 26 | 11 СА овюаюіавадсяс | 21 тв | 5201061 2 | 18 |СААТасаавдвюатотА 1 20в зи 38051 20 | 6 АсАліасавареюдтот | 29 тет| 851.81 58 | 8 |сСАсавіясававАТСА 122 алі т | 4 | 50 | 6 Або садавівсваадт | 2пя ат 280, 6 | 16. | 4 СО оооювюратла | ов ал 450,6 | 22 | 5 Ттаорарвавлавс ал | 851..7..1..44.0| 9 | тАвюваноото 1 гов я в | 80 | з | 10 |Стіааювашовт | вв.
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на контролю ал 320,0 | 15 | 8 СА оранасаяидА | зго я 64072 50 | 8 Снвааювотсат | зав ват 870 8 | 88 | 22 сАсАпаваюіаютсА | 2336 в.з 8 | 24 | 6 АстасіводавлАЄ | 5 вв ло2 | 6 | 113 | 18 СА донаасюясА | 256 е| 78.11.81 42.0 | 10 |ТОлавіяасаюаатсАт 1027 вет 1060 | Мо | Мо (стоаавівасюдото | 273 тат | в620105:.1..29..| 9 |стстотаюсаєт 001 27в2 51370801 12. | 5 тсосіюшаютсА | о/вя тва 3600 | 80 | 13. | 2 стоосарсватАТ ово та 701,72 38 | 8 ТАпосссяютст | зп 51 вв | ле | 440012 тАіваостаюатаю 1013175 тва | 27201186. з | 6 |Асюсанюєятт 013875 талі я, 780 | 28 | 6 Асоасюсаюста |з вот 3206 | 27. | 7 сАоовсюсаюст | 3379 ваті в | я | 52 | 9 |ССазиовінатос | зз
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о контролю контролю вет 600 8 | 26 | 5 Стпадсаряєюяаєт | зво ви я600 | 6 | 28 | 6 сАліяюсядтст | 4066 тет | 831.51 27.01 8 |ССлаясювдваято 15075. яті 77081 37 | 11 |Тосанасааююті | ая ет 7430 60 | 36 | 8 ттосянасваювт | ав ат | 81111..8..1 51 | ов |Асівюроводатт яв теє в 5 | 47. | 16 |ТАвсоівівююдсА | дов теє | лог 03106167.) 20 |СліявсаіяасА 5438. ел 10 6 | 80 | 13 | ТОвізасавіяюто | 249 21 25 | 4 | 30 | 8 СОсаасареююдА | 4782 2712605 | 21 | 6 Стозсізататоя | вв ті 600 | 51 850 | 19 АтосюспоавАТОТ | 4879. пої 0 | 780 | о | 25 Аптавваювист 00015027 а | 26.1..3.1 19... 6 |СлнфяасвівостА 1 БоБт 251880 | 8 | 58 | 16 | тАвінйосассват 005295 в | 25..1..2..1.29. | 9 |СліваяносаєслА 15257 т 270,71 27. | 6 |Асавзвносюса | ов.
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о контролю контролю тлі 790,6 | 5 | 11 | СОсаврзараядтАТ | 55 сті вв | 160 | 680 14 СА доосвозвааст 156 ют| 01.21 72. | 12 |ТованююдаваС 1 Бав3 231300 | 11 32 | 8 СтоосіавоюедА | вв ті лоб | 8 | ев | 2 СтпсяставтаттА | вв ет 800 | 12 | 80 | 19 стостсаснаадА 10556 оті 90 | 0 | 79 | 25 АлоасіюснсяєттА | Б мл | 28.11.81 77.0) за |СААтососіванато 1 ББв я | 81101161 72.0) 25 |СтАаюрварданто 5673 зві вв | 4 | 88 | 21 САадавтрааютт | 5769 за в | 5 | 36 | 10 |СТАСаіярворовата | 6202 ті т | 4 | з | 8 Сстсвояводоє | 6207
МА - не
ЕТ вали 21 вв | 6 | 69 | 15 САпіаятавало | 657 ситі 80.21 5: | 2 Тооопяютатслт | 640 | л8 | 91 72 | 4 Слопаююотося | во 21 4600 12. 29. | 8 АСоіоасарівадта | 6577 алі 70,72 28 | 9 ССвозівіяюьстт | 6вої оті 755, 6 | 28 | 7 |Слюнойяссатдс | 67
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о контролю 5101240, 72 | в | 2 толяпоіаюдтА | бив ат 480 | 8 | 91 | м | пттосісюдоватте | ва 51.10.51 28 | 8 САнаюсарсда | 66 ваті ва | 8 | 104 | 75 АТОсюсаашсасАт | 6532 вт 4200 | 8052 | 22 АСсассатосюатса ве ваті вв | 5 | 118 | 65 / Сосассатосюато | 6869 ват | 841.61 72. | 35 |Стояюдрсаєдс 1 бвво ваті 450, 7.|.50. | 8 | Атсовспасавоадт 6987 слі 700191 74 | 5 ТАстоаовясяююс | 738 51.61 50 | ов |Астюоодаводравюдо 1765 т 80 | 6 | Мо | Мо (Аоосюваосравюда 17265 21 71 9 | Мо | Мо (тАоорюваороюююА 17266 21840019 Мо | мо |АтаоюоваюодаююА 17266 21 2 | 6 | 64 | 55 |ТАсіюрюваоювая | 7267 311 60001022 10 мо | мо |Слісюрюваюєда 1768 вв 810 60 | 72 | 19 |сАтоооарвівююст | 7276.
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о, контролю контролю ві 070, 11 2 | 8 АсАаіааюртастот | 730 вит 660 | 8 | 48 | 20 (АС асвавіваюсттА | 7306. ев | 671.61 58 | го |САСодасасасаватААТ 107311 юті 22 | 6 | мо | Мо | Повіяоссст | 7398 сет | 701.78. 54.0 | 8 |Ппюсатоната 7400. 31300 | 101 30 | 9 СТ оаараіяюють | 7512 тет во | 8 | 58 | 13 | тобсаюсювст | 7526 71 7а0 | 6 | 52 | 14 Атооснаюсютяє | 7527 вті 75071 89. | 25 |ТАтооснаюсютА | 7528 зюті 27 | 8 | з | 6 Атоааіівюсслого | 7547 зиті я 80 | 38 | 9 слюваіввюсссА | 759 зет| 812 | Мо | мо |Сллоаданввтосс 107551 зві 4751 4 | 8 Слсюсюююютт | 7601 зв | 38 | 6 | 38 | 7 ААсасісівютст | 7603 з 6808 42 | 14 |ТАвсасювотось | 7604 зві 5 | 5: | 690 | 22 Стаясасюсвото | 76065. зв 11 з | 6 | Мо | Мо |тсторовінюассс | 780 зви | 47.11.31 87.01 8 ЦАТАТодаводраято 7875 зюті т | 6 | 34 | 5 |АбосадлаатслясА | 7898.
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о контролю ваті в | 9 | 32 | 11 (Спасяпаюсдат | 7908. змі 6 | 4 | 20 | 9 /тслосняснідсс | 7907 зл| 281.31 8.1 2 |САСАтсарютаєт 17918 зют| в 1 8 | з | зо |Алоясісаятяюда 17932 зі 90 | 9 | 80 | 19 (сАттяаюістсА | 7984 ялі| я 7177861 50 | 5 |Толтмааюастся 117984 зві в | 5: | 80 | 27 | Тсашвантяюто | 7985 зві 87 | 2 | 86 | 2 сАолюанаатстА | тов зал| 31.11 74.1 8 |Сттароссюадатто 1803 зи за | 80 | 78. | 8 | Ттовсавіюювслт |в зеті в5 | 8 | 44 | 15 |ААТсіястясяавт | возв зи 240020 30 | 9 САвсасарівряюсс | вав зі 25 з | 24 | 6 |Тстаавіютюалає | вав
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на контролю контролю зе! 6 | 2 | и | 2 ССлооанавсют | ве зи | 8600181 73.0) 13 |СТтоссадранняст 1 вадо зві 490 | 8 | 5 | 14 |ААсовааснатАст | вв зт| 381.61 87. | 4 |СААосарааастатАСТ ват зт 80 | 81 79 | 38 /Тссрозаратост | ви зял| 4551..86..1 525 | 25 |АТобапоораюасА 1118772 зт 270,7. 30 | 8 Ас аюоанооовютА | 8774 з 7308 | 28 | 6 ААаюоанодвст | 875 з 88 | 9 | вв | 32 (Асладоксазасттт | вва злі т | 2 | 3 | 8 |Тосозаропердо | вва зяже| 816 1 и | 8 |АСТтОсаряаюютлс 1 вв залі з | 6 | 35 | 7 ААстосадаарютсА |в зт 4 | | 24 | 6 ТАвоіюсярааювто | вва зи 3705 | 5 | 9 /ТОварідсарадост | вва зві 800 | 160 | ля | 55 старост |в зт 73 | 8 | 234 | 6 Аюооооассаююда | вав
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о контролю контролю зи 8006 | 64 | 6 Сіоовогювсюда | вебо зт 83 | 5 | 57 | 6 АТАюоаооютсА | веб зт 25 | 2 | 30 | 6 | ССзііоовоюювст | веб хот| 31.41 251 9 |ТОсвівюравдюаст 1 вва ет 8061 37 | 11 | Тосаінюрвоююаст | веб ті 25 .2| 69 | 19 | ТтОсоіюдарююдс | веб вті 8 | 2 | 9 | 6 Алоідавютаволос | ве ет! 26 | 8 | 109. | 52 /ТСсооааоюваюттся | 800 тої 280,78 | 79. | 10 |сАооовавюваєтт | 804 лет 280 | лю | 17.0 8 Сто ювюозавююдА | 8007 из | 5501..4..1 з | 8 |АповдюваюсддА 11199 яв вв | 6 | 74. | 2 сАтапоарюватос | 8122 яв в | 6 | 64 | 15 С озавогюлАТА | 8156 от | 75.1..8..1.50. | 13 |АтнавасісасявдС 119171 о 200,78 | 28 | 6 |стопаожсассся | возв.
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о контролю ят| 871..3.1 525 | 8 |Стааюсаюваюс 1 ов вт | 1801761 21.1 3 |СААяіядстаюся 19835 ет! ла | 6 | 17. | 4 ССвавіввотдТос | 836 оті з | 4 | 27 | 8 Тославіяоютато | 8537 75:18. .43.0| 7 |САТСоаавівюютА 19839 ет 870 | | 32 | 8 Атоюсванівостт | зи за 88 | 5 | я | 6 |ТАТОзюсваяюют | 82 1 878 | 86 | 29 | ТААсаооосююолАТ | вв ет! в | 17. | 280 | 9 | СТАарадаасасттА | во щет| з | 6 | 20 | то АсаіаавюсісасдоА | 9430 меті з80 | 6 | 27 | 7 |ТАсовівааюєтАсА | в меті 800 | 80 | 32 | 8 ТА оврзвааюст | ви т 6530, 6 | 48 | 11 |СтАсасавніястяє | вав ві | 871.81 29. 2 |сстАсасавійАСТА 1 оБа 51 780,74. 8 | 1 АТО юавюстає | ваея зва вв | 6 | я | 10 СТАоовооараоводсА 500
БІ | 3з11011..3..1..29..| 9 |ТтАТансводавсдо 19507
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-І 1 в лініях клітин ТНРІ1 і КАКРАЗ-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о контролю и 750,6 | 15 | 8 Тсоаошяюнтяос | вва оті 80 | 801 47. | 22 |Пттооовваюатслт |в 176.0, 8 | 39 | 5 Абосваюсата | ввБ же | 51..6..1.830.| 9 |ТОСюсаддяєст 1 8755. зі 270.8 | 25. | 6 ТАооясюодтда | вв 511.8 |.2 | 7. | з Стаановсвоюсто | вв жел| в 13 | 32 | 6 |ТОсіанляєтлст 1 ово? зи вв | 101360 16 Аотосіваняюті |ввя зві 3500 | 6 | 32 | з соАоюсіваютА | 9827 затв | 8 | Мо | МО (сАозавіювасяаютА | вве ло 87051 42 | 6 ССоіврадююос | во ел 3500 | 5 | 20 | 8 Атотасаювюалос | ве вл 2600, 6 | 19. | 4 Ааоасасісяратса | веб ява 10 80 | 37 | 6 АовсасасюадаптсА | веб ал | 801.81 68 | 10 |ТОваарасасасюаслтт 109871 ваті 420 | 8 | 68 | 22 /ТОдаадасасасюасаТ | 8972 511 480.8 | 4 | 20 |АПОзавоасасастся 8975 зве 270| 6 | 27. | 12 | ТОаозавоасасдот 18977 зві 800 | 120 | Мо | МО АТАліяссаспатоАт 0|001о от | 321.5... 60. | 2я |ТАовасіядотатсА 110101
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на контролю 31 37 | 6 | 35 | 5 /ТОпаювнсваястт | товв5. ат | 301.01 27.01 6 |ПСпеювіясяяст 1 103в6 51270, 8 | 78. | з Слотопаюато | пово ет 250 | 16 | 25. | 6 СслошстаюатА | тов ел 77 | 76 | 72 | 29 |ТАсАаюсянаюєт | 457 в | 861.51 69. | 17 |ТОтАсаваююттяє 110460 вил 2111171 830. | 8 |Асствювівююда 01010550 вті з | 5 | 39 | 8 АТоСопоасанА | тоБ65 вжл| 94171 22. | 6 (|АсСкюавоанатоя 1 10бов вті зі | 6 | з | 10 |ААсссавоаната | тоб вті 850 | 6 | 62 | 17 |САСаассісвадататт | 0обов вол | в61..12..1.540. | 4 |стаспяанааОсТ 110667 вві 780 | 5 | 80 | 10 |Астасняанардос |то6в8 вп 27017173 0| 6 ОСасвасссараююдА | 10736. вят| 28.11.81 55 | 15 |ААновадсасадсссс 01010742 вт | 737.1..3..1 80.0 | 12 |АТАЛІясіваіяаноААСС 10010749 вві 80.81 6 | 1 ТАсаноиоаюстяа | пов5. вті и | 4 | з | 8 ААтоасіяаюєтА | 1100. вял| 341.81 з | 7 |Стаяювюравсс 111103. ваті 52 | 6 | 52 | 17 |Астаяювювслосьюм | 1104 вті во | 4 | 54 | 10 |САпіяасаюттАТ | 1165. вм | 57121 55 | 8 ЦАСААсіясанаасяюттс 111170. вті ва | 6 | 44 | 5 |ТТАСаадласанааслта | 1173
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на контролю контролю 531 | 77.18 12404 |АОсСАваововттАТ | 11205
Ба | 8 | з | 15 | 6 |ТАСапошашасі////// | 228 вм | 41161133 01 |сАСАвісвовсалтт | 11238 5361 | 49 17 136 06 |оСтбасаайнаюті | 2 51 | 96 | 5 | 20 | 6 |ТСАсданаадаасо | 1264 вів! | | 4 | 26 | 8 |ТАОСассасапаюд | 1389 вм | 64) 6 |) Мо 0 мо |тоСАівашанослт | аБя0 551 | 85 8 | 38 09 |АтаасіаавасюсАТА | 11465 ва! | 86 | 4 | мо | мо |ТтАпавівасіввастос | 11468 5561 | 80 | 7 | 55 | 13 |СотСаівасівадодс | 11496 5571 | 863 59 011 |ТСоаіваваадба | 11497
БВ | 5119033 012 |АтодіовіаавдАєс | 11498 5591) 91 | 6 | 65 | 26 |Стіаоіаюнаслтт | 11525 во | зо | з | 41 1 8 |СтсіайовтадАто | 11532
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на контролю контролю вил 880 | 80 | 28 | 6 Астаоаовютат | 567 вт | 800015. 45. | 11 |стоютаваасато 11181 ваті вв | 9 | 44 | 4 | ТтАаатаноюсАТА | пвлю вот | 761.81 48. | 12 |СтпааатаюнтосА 1 ев вл 620 5 | 86 | 5 стопіаванаюто | певз 51 280, 6 | 36 | 11 | сААпаютаалосА |в вял| 74117781 з | 7 |СССтавансасА 11 119во вті 370 | 8 | 30 | 9 АсАссютасс | пев5. вті 4530 714. 27.0| 6 |ТОсавсавюястт | 12000 вті 850 | 714. | 39 | 9 Сстасапаювсст | гово вті 40071 35 | 6 сАтоподасаютАТ | пговв ваті в | 160 | 48 | 9 АлаюаютоютсА | 12093 вват| 461. 34 | 39 | 6 (|Алюнсараюссто 12197 вві 75: 8 | я | 12 |сстасвіяоєюата | 12267 вві 20051 27. | 9 Стдасавівююта | 12780 вюті 97 | 9 | 80 | 12 |ТтОзавівпиаюдо | 13153 вил 841791 47.01 9 |Алостядааттос 113217 ваті в | 7 | 80 | 9 сстоасіяранадА |за вті 420 | 8 | 32 | 9 САтасасюностАА |з вял| 07017601 79...) 17 |АтТОоююаваюдтт 1 13814
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о контролю контролю вті 47 | 6 | з | 6 ттосяпаюаєт | тзвб8 вті 870.12. 4 | 6 |Тттосіюнсясаядс 13600 вюті 5 4 | 24 | 8 стАяюрсадюваєсс | 87 вит 200 | 6 | 26 | 8 /ТтовамодерюдА | 83 вет| 581121 26. | 6 |аюеоняазюсАТо 13885 вм 77 | 8 | 85: | 18 (ССспіарюеряюст | зву вті 760081 30 | 8 | Тотопасіядютос | п4091 вті 06 | 850 | 13 (сАсавторарвавс | 14808 вві 740801 58 | 11 | Таюсаапиясс 01151, вті 600 | 7.52 | 8 СОспсаюнсюює | п5ово ват| 81.31 8 | 5 |Стлювсаєюттст 11538 вм 78 | 8 | 69 | 6 |ТтООсасароіваата | ББ6ТО вті 8005 | 64 | 11 | ТоАссаютавата |в вті ло | 6 | 86 | 19 Стовсюаютаат | 1562 вет| 3161 и | 6 |ПТасююатюто 1 15628 вюті вв | 2 | вв | 15 |ТАПосвозванатт | 15642
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на контролю вис 8802 27 | 6 стАкооарозандт | пвбаз вза1| 21.81 88 | з |сТСютоютаст 1 15е66 висі 400,76 | 42 | 12 |ТоодасіанюсдАТ | 5737 ват| 831.31 8 | 1 |слюстяянстов 1 15еБя вті за | 6 | 54 | 10 |АПСзавстатост | 5вбя вил| 43311..31 27.1 6 |АсюсанрявСТТ 01015870 вті 070.01 36 | 18 (слАпяшототос | вто ват | 75.1..8..1.73.| 2я |ССтодсаясавтАТТ 01015919 вв 2106 | 39 | 6 АТОсатсаєюсс | 15873 вв 25008 | зв | 8 ТААтасеноашстА |в вю2| 641 7141 з | 8 |САтнюваюстас 1 16163. вті я800 | 06 | з | 6 АСАлавюєстА | 16164 ваг с | 6 | 28 | 5 Алсашлайссст | 6165 вет| 30161 78. | 6 |ААСатоянюсст 16165. вті 80 | 1 26. | 6 |ТАвашсавоююта | твтва.
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на контролю вв 22 | 7. 50 | 8 | ССАотааансляє |в вв | 89011101 мо | мо |АСоавотаватттс 1016192 вві 600 | 16018708 С есаідвоосааюттт 116199 вві 65 | 9 | 50 | 12 АСаюсоіасавтоя 016208 ваті в | 8 | 103 | 4 Ассасадієвсято | 1619 вот | 8019 | 150 | з6 |АТАврсасадетотА 116223 вті ва | лю | 106. | 8 | АтпосоівівюслсА | бог вл | 78.1..31 96 | 14 |ПтАШосявідоСА 116281 ваті 770781 з | 7 |Тпташмосявідос | воза вті 32 | 6 | Мо | МО (ААоарадовоатАТЯ | 16409 вті 32 | 5 | 24 | 6 Астоююююст | вав вті 01721 20 | 6 Атозапаанаюслто | пввез висі 800| 8 | 30 | 10 /ТОвозінсоюютата | вве вті мо | мо | во | 8 /ТсотсавайсАт | пвово ві 802 17.0| 5 сААювааєнюююта | 17047 ват | 88161 5 | 9 |АттаюстясюдТ 11017173. вті 4 | 2 | 48 | 8 /Тстасссаятаюст |В вті я | 4 | 38 | 6 |Тттоіасссяанято | 1783
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5) мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о контролю контролю вті в | 0 | св | 12 (Ассосаротатт | 1797 тт в | 6 | аз | 12 | Тобоватоюююся | 17282 7218206 | 27. | 9 А сюдапясюто | 17954 741136 | 16 | 80 | 12 | ТтопоовавАТОС | 17625. вл | 79.11.81 47.01 8 |слювтатосла 117646. тов 2400 | мі | 80 | 9 САлакапояедос | 17в6о 77116, 8 | 32 | 98 |ттоівасяютс |в тв | 56.01.0179... 17 |САПаарсадсавютт 117923 тет 30 | 9 | 46 | 7 |ТтАсіоаюююсА | 7942 леті 28 | 4 | 36 | 6 /Тпсісеююдос | 7943 паї я | 30 | 40| 6 А ооварсаютса | 797 лат зо | 6 | з | 7 АтооопаавівдлбЯ 1802 латі т |72 | 24 | 8 | ТОавссвоаюаюда | 8067 ла | п010171774.1 26.0) 8 |СтСаяссадаввта 1 1вобв лету сл» | 8 | 02600 60 АпоіавадоюатаТ 00118135. лет 230, 8 | 85: | 18 СдоосюсвнтАС | 18274 7212701, 6 | 30 | 8 ССпеюсяююйс | пвБо9 761240, 80 | 61 | 16 Аскааюротюса | пввво 717800 4 | 8 | 14 |ААоозаюрютоЯ | пев та | 361.81 58 | 11 |АСлаююнайяТТ 0119005. 71 3800 | ма | 42 | 8 ст овдсаавістт | перо 71 370 | 6 | 8 | 5 |сттсавосясавсода | 19493,
Таблиця 10
Ефективність іп міго сполук проти РО-11 в лініях клітин ТНР1 і КАКРА5-299 (середнє з експериментів з п, що дорівнює 3). Рівні МРНК РО-І-1 нормували до ТВР в клітинах КАКРАБЗ-299 або до АСТВ в клітинах ТНРІ, і вони показані як 95 від контролю (клітини, оброблені РВ5)
Клітини КАВРАБ5Б-299 Клітини ТНР1 мМ СМР 20 мкм СМР Початок на о
СМР 95 МРНК від уо МРНК Сполука (СМР) ЗЕО І МО
МО контролю за від за 1 р контролю
Приклад 2 - тестування ефективності іп міїго в кривій доза-відповідь
Набір олігонуклеотидів з Таблиці 10 тестували в клітинах КЕВРА5Б-299 з використанням напів-іюд серійних розведень в РВ5 (від 50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 5 МКМ, 0, 05 мкМ до 0,0158 мкМ олігонуклеотиду) в аналізі ефективності іп міо, описаному в
Прикладі 1. Для даних олігонуклеотидів оцінювали /Схо (напівмаксимальна інгібуюча концентрація) і максимальне інгібування (95 залишкової експресії РО-І 1).
Розрахунки ЕСбво (напівмаксимальна ефективна концентрація) проводили в СгарпРай
Ргівтб. ІС50 і максимальний рівень нокдауну РО-І 1 показані в Таблиці 11 як 95 від контрольних клітин (оброблених РВ5).
Таблиця 11
Максимальне інгібування як 95 від обробки фізіологічним розчином і ЕСво в лінії клітин КАВРА5-299
СМР МО Макс. інгібування ЕСрво (мкМ) Сполука СМР Початок на (96 залишкової експресії ЗЕО ІЮ МО:
РО-І 1; 95 від оброблених 1 фізіологічним розчином)
Тстовасасасавіс ттсанавнасося
Таблиця 11
Максимальне інгібування як 95 від обробки фізіологічним розчином і ЕСво в лінії клітин КАВРА5-299 (96 залишкової експресії ЗЕО ІЮ МО:
РО-І 1; 95 від оброблених 1 фізіологічним розчином 251 7779 | .25 | 029 003 (ССосавівююьстт | 6557 т 17791728 1075 | 020 (САеносвосатлс | 67 21777711 735 1069 | 010 (ТАСтововасяююс | 738 81779179 1021 | 001 (САовюевввтосс | 755 зи 7779 | .24 | 02 005 (Слоснасенссо | 706 зв 775 | 25 | 021 003 (бАтоанаантюсА | 75 зи 7791798 1012 001 (Сттадосоюаратто | 835 зв 775 123 | 056 004 (Тбенонаююсто | во зе | 5 129 | 029 005 (пПбАюаоостаютс | 85 з 17779177 1018 | 002 (СС оданнеєстт | ве 91 17779778 1021 1002 (ААодзаотавслос | 85 яв 17797771 774017025 | 002 |АновоюваюстА | 820
Таблиця 11
Максимальне інгібування як 95 від обробки фізіологічним розчином і ЕСво в лінії клітин КАВРА5-299 (96 залишкової експресії ЗЕО ІЮ МО:
РО-І 1; 95 від оброблених 1 фізіологічним розчином
Ся 17771091 0и5 1001 |Стоаваноююхя | 95 ее 77601792 | 019 009 (Стсановартста | вв яю 17777127. 1066 | 005 (ССавваоєтАтОс | 9386 ві 77790171 1095 007 (ПТбовотаюютлов | 952 ж |775711117101о56 ол (Тобюсарювоюст | 85 47 1717977711724 1027 1008 |ВАСасоссаданоло | 957 9 17791779 1029 003 (пПеснеанстсс | 0055 82 17779138 10695 | 010 (ЗСасаасосадавюлА | 0795 55 779 | 27 | 022 003 (Аблосменаютт | 187 ви 17776775 1012 | 001 (тАбаюютанося | ов я 775 1799 | 006 000 (Старенотаєтос | оо 51 777950 | 00 006 (Атовасаюваюютос | ВО 58 7772118 1009 001 (ТАсАненоююєто | 15061 61779179 1019 | 001 (АС сарасавстотА | 15699 в8117110122 | 086 | 004 |ТААСоарасааєто | 5695 8 177972 1021 100 (ПттАвсаюаовсадсто| 5695 1772 1798 | 09 006 (ССемозоюдоло | 15700 51 779724 | 022 003 (Абоаюнаєююдтт | 5877 8 17779179 1016 | 001 (ОТО саваюавоюсА | 5696 е81171174120 1009 001 |Слятанстотос | тво
Таблиця 11
Максимальне інгібування як 95 від обробки фізіологічним розчином і ЕСво в лінії клітин КАВРА5-299
СМР МО Макс. інгібування ЕСрво (мкМ) Сполука СМР Початок на (96 залишкової експресії ЗЕО ІЮ МО:
РО-І 1; 95 від оброблених 1 фізіологічним розчином
Набір олігонуклеотидів з Таблиці 6 тестували в клітинах ТНР-1 з використанням серійного розведення 1:3 у воді від 25 мкМ до 0,004 мкМ в аналізі ефективності іп міт, описаному в
Прикладі 1. Для даних олігонуклеотидів оцінювали ІіСво і максимальне інгібування (95 залишкової експресії РО-Ї 1).
Розрахунки ЕСво проводили в сгарпРаай Ргізтб. ІСво і максимальний рівень нокдауну РО-Ї 1 показані в Таблиці 12 як 95 від контрольних клітин (оброблених РВ5).
Таблиця 12
Максимальне інгібування як 95 від обробки фізіологічним розчином і ЕСзво в лінії клітин ТНР1
СМР МО Макс. інгібування ЕСрво (мкМ) Сполука СМР Початок на (Уо залишкової експресії ЗЕО Ір
РО-І 1; дь від оброблених МО: 1 фізіологічним розчином) 87717776 551041 | 00 |Стовасасасафсс
Таблиця 12
Максимальне інгібування як 95 від обробки фізіологічним розчином і ЕСзво в лінії клітин ТНР1 (Уо залишкової експресії ЗЕО Ір
РО-І 1; дь від оброблених МО: 1 фізіологічним розчином) »3176071725 1 057 | 059 |Абанвадаеюютох | 1910 я 1777814 | бив ол |бтсаюраняваст | 5оя с 17777601 220 057 | обо |ТСтотаюсаєте 878 6771777911798 | 025 0яї |ТТсарозаненсст | 995 в 17007980 | 029 | 02 |ТОлюносесслтА 6618 з 177775771796 | 081 ол |Слотозанаюсто 76 я 17771711 78001044 | 06 |бттаросоювовттв | 8039 яБ- 17777171171796 1096 012 |ААноаюваюсАА 8150 58717778 1152 | 045 026 |тАонноююютАА | поББ в 17778065 1 005 | 00 |Старанютаєтас | 1225 ве 77791728) 083 028 ААтСаютююоят ов 687177781104 | 035 ол |тАбасасюсатстт | 15917 вв 17172154 1 000 | 000 |ТААСаюадасанєто | 15695 17779112 | 024 005 |бслаясаасюєдтс | 5896 81777918 041 006 |тТСавеоюювоюс | їбовя 7877 177791 686 | 1105 обяв |САСаонаанеАЄ | 827
Результати в Таблицях 7 і 8 також показані на Фіг. 2 в зв'язку з їх положенням, де вони націлені на пре-МРНК РО-І1 5ЕО ІО МО: 1.
З наведеного можна бачити те, що майже всі з сполук мають значення ЕСзо менше 1 мкМ і цільовий нокдаун менше 25 95 від рівня експресії РО-І1 в контрольних клітинах (оброблених фізіологічним розчином).
Приклад З - активність і ефективність іп мійго і зниження рівня РО-І1 іп мімо у мишей, індукованих полі(І:С), з використанням голих і кон'югованих з сбаіМАс антисмислових олігонуклеотидів до РО-Ї 1
Тестування ефективності і активності проводили в експерименті іп міго в дослідженнях доза- відповідь в клітинах МСР-11 з використанням олігонуклеотидів в Таблиці 6. Ті ж самі олігонуклеотиди, а також версії, кон'юговані з бЗаіМмАс (Таблиця 8, СМР ІЮ МО 755 2-765 г), тестували іп мімо у самок мишей С57ВІ/6), індукованих полі(І:С), на їх здатність зменшувати експресію мРНК і білка РО-І 1.
Аналіз іп міо
Клітини МСОСР-11 (початково придбані в АТСС (Американська колекція типових клітинних культур)), суспендовані в ОМЕМ (середа Ігла, модифікована за Дульбекко) (кат. Мо Зідта 0о819), доповненої 10 95 кінської сироватки, 2 мМ І-глутаміном, 0,025 мг/мл гентаміцином і 1
ММ піруватом натрію, додавали при щільності 8000 клітин/лунку до олігонуклеотидів (10 мкл) у 9б-лункові круглодонні планшети і культивували протягом З діб в кінцевому об'ємі 200 мкл/лунку в зволоженому інкубаторі при 37 "С з 5 95 СО». Олігонуклеотиди піддавали скринінгу в інтервалі концентрацій (50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158
МКМ).
Загальну мРНК екстрагували з використанням набору для очищення РНК Ригеї їпК Рго 96 (Атбріоп) згідно з інструкціями виробника. кКДНК синтезували з використанням зворотної транскриптази М-МІ Т, випадкових декамерів КЕТКО зогірі, інгібітора РНКази (Атрбіоп) і набору 100 мм днНтФ (Іпміїгодеп, рівень якості для ПЛР) згідно з інструкцією виробника. Для аналізу експресії генів проводили кПЛР з використанням майстер-міксу (2х) ТадМап Разі Адмапсейд (Атбріоп) в дуплексі, встановленому з праймерами Тадмап для аналізу РО-І1 (Тпегто Рівпег
Зсіепіййс; ЕБЕАМ-МОаВ Мто0452054-т1) і Сби5р (Тпепто Рібзпег Зсіепійіс; МІС-МОаВ-РІ.
Мто1197698-т1). Відносний рівень експресії мРНК РО-Ї1 показаний в Таблиці 9 як 95 залишкової експресії РО-Ї1 в 95 від контрольних зразків з РВ5 (клітини, оброблені РВ5).
Розрахунки ЕСво проводили в СгарпРайдРгізіттб. ЕСво і максимальний рівень нокдауну РО-Ї 1 показані в Таблиці 13 як 95 від контрольних (РВ5) клітин.
Аналіз іп мімо
Зо Самкам мишей С57ВІ/6 (20-23 г; 5 мишей на групу) п. ш. ін'єктували 5 мг/кг некон'югованих олігонуклеотидів до мишиного РО-ЇІ 1 або 2,8 мг/кг кон'югованих з СсСаіІМАс олігонуклеотидів до мишиного РО-І1. Через три доби мишам в. в. ін'єктували 10 мг/кг полі(І:С) ((М/М, Іпмімодеп).
Мишей умертвляли через 5 годин після ін'єкції полі(І:С), і зразки печінки поміщали в КМАЇаїег (Тпепто Ріхпег 5сіепійіс) для екстракції РНК або заморожували на сухому льоді для екстракції білка.
Загальну мРНК екстрагували з гомогенізованих зразків печінки з використанням набору для очищення РНК РигеГіпк Рго 96 (Атрбіоп) згідно з інструкціями виробника. кДНК синтезували з використанням зворотної транскриптази М-МІ-Т, випадкових декамерів КЕТКО зсгірі, інгібітора
РНКази (Атрбіоп) і набору 100 мм днтФ (Іпмігодеп, рівень якості для ПЛР) згідно з інструкцією виробника. Для аналізу експресії генів проводили КПЛР з використанням майстер-міксу (2х)
Тадмапе Разі Адмапсейа (Атрбіоп) в дуплексі, встановленому з праймерами ТадМап для аналізу
МРНК РО-Ї1 (ТНепто Рівзйег бсіепійс; ЕАМ-МаВ Мто0452054-т1) і ТВР (Тпепто Різпег
Зсіепійіс; МІС-МОЕВ-РІ МітО0446971 Іп1). Відносний рівень експресії мРНК РО-Ї 1 показаний в
Таблиці 13 як 95 контрольних зразків від мишей, яким ін'єктували фізіологічний розчин і полі(І:С).
Гомогенати печінки отримували за допомогою проведення гомогенізації зразків печінки в 2 мл на 100 мг тканини реактиву для екстракції тканинного білка Т-РЕКФ (Тпепгто Рівпег
Зсіепійіс), змішаного з їх сумішшю інгібіторів протеаз Наїї, яка не містить ЕОТА (Тпепто Різпег
Зсіепійіс). Концентрації білка в гомогенатах печінки вимірювали з використанням реактиву для аналізу кумассі плюс (Бредфорд) (ТПпепто Зсіепійіс) згідно з інструкціями виробника. Гомогенати печінки (40 мкг білка) розділяли на 4-12 95-них Віб5-Тгі5 Рі поліакриламідних гелях (Тпегто
Еі5пег бсіепійіс) в 1х електродному буфері МОРЗ5 і переносили на нітроцелюлозні мембрани з використанням системи блоттинга ІВГОТ Огу (Тегто Ріхпег Зсіепійіс) згідно з інструкціями виготовлювача. Кожен блот розрізали горизонтально на дві частини по смузі 64 кДа. Після блокування в ТВ5, що містить 5 95 знежиреного молока і 0,05 95 Туеєп 20, мембрани інкубували протягом ночі при 4 "С з кролячим моноклональним антитілом проти вінкуліну (Арсат, кат. Мо абБ129002), розведеним 1:10000 (верхні мембрани), або з поліклональним антитілом кози проти тРО-Ї1 (К 8 О Бузіет5, кат. Мо АЕ1019), розведеним 1:1000 (нижні мембрани) в ТВ5, що містить 5 965 знежиреного молока і 0,05 95 Тмеєп 20. Мембрани промивали в ТВ5, що містить 0,05 956 Тмееп 20, і піддавали дії протягом 1 г при кімнатній температурі свинячого антитіла бо проти дО кролика, кон'югованого з НКР (пероксидаза хрону) (САКО), розведеного 1:3000
(верхні мембрани), або кролячого антитіла проти дсС кози, кон'югованого з НКР (БАКО), розведеного 1:2000 в ТВ5, що містить 5 96 знежиреного молока і 0,05 95 Глуєеп 20. Після промивання мембран реактивність виявляли з використанням ЕСі бвеїЇесі (Атегпат СЕ
Неайсаге). Для кожної групи мишей, оброблених олігонуклеотидами, оцінювали інтенсивність смуг РО-І1 по відношенню до смуг вінкуліну за допомогою порівняння з інтенсивностями смуг
РО-І1/вінкулін мишей, яким ін'єктували фізіологічний розчин і полі(І:С) (контроль). Результати показані в Таблиці 13, і вестерн-блот з парами голих і кон'югованих олігонуклеотидів показані на
Фіг. ЗА-Д.
Таблиця 13
Ефективність іп міїго та іп мімо олігонуклеотидів до мишиного РО-Ї 1
СМР Сполука СМР Макс. ЕСво МРНК РО-І1 | Білок РО-Ї 1
МО інгібу- (мкм) (У від (відносно вання (95 контролю) контролю) від РВ5 7652 |К-СМо-Сб-сатостіаваасто ж-н: аналогічна інтенсивності смуги РО-І1/вінкуліну контролю; -ч-: слабкіше, ніж інтенсивність смуги РО-І 1/вінкуліну контролю; -«: Значно слабкіше, ніж інтенсивність смуги РО- 1/вінкуліну контролю; па - не визначається.
З даних Таблиці 13 можна бачити те, що кон'югування олігонуклеотидів з (заїМАс явно поліпшує зменшення рівня РО-Ї1 іп мімо. Зменшення рівня мРНК зазвичай корелює зі зменшенням рівня білка РО-І1. За винятком СМР ІЮО МО: 754 1, низьке значення ЕСбо іп міо зазвичай відображає хороше зниження рівня мРНК РОБ-І1 іп мімо, якщо тільки олігонуклеотид кон'югований з СаІМАс.
Приклад 4 - РК (фармакокінетикау/РО (фармакодинаміка) іп мімо в відсортованих гепатоцитах і непаренхімних клітинах від мишей, індукованих полі(І:С)
Досліджували розподілення голих і кон'югованих з (за!їМАс олігонуклеотидів, а також зменшення рівня мРНК РО-Ї1 в гепатоцитах і непаренхімних клітинах, виділених з мишей, індукованих полі(І:С).
Самкам мишей С57ВІ/62 (п дорівнює З на групу) п. ш. (підшкірно) ін'єккгували 5 мг/кг некон'югованого олігонуклеотиду (748 1) або 7 мг/кг олігонуклеотидів, кон'югованих з (заіїМмАс (759 2), націлених на мишину мРНК РО-11. Через дві доби мишам в. ч. (внутрішньочеревно) ін'єктували 15 мг/кг полі(І:С) (ГМ/УМ, Іпмімодеп). Через 18-20 г після ін'єкції полі(І:С) мишей анестезували, і піддавали печінку перфузії при швидкості струму 7 мл на хв. через порожнисту вену з використанням збалансованого сольового розчину Хенкса, що містить 15 мМ Нерез і 0,38
ММ ЕСТА, протягом 5 хв., з подальшою перфузією розчином колагенази (збалансований сольовий розчин Хенкса, що містить 0,17 мг/мл колагенази типу 2 (МопПпіпдіоп 4176), 0,03 95
В5А, 3,2 мМ Сабсіг ї 1,6 г/л МаНСОз) в протягом 12 хв. Після перфузії печінку видаляли і відкривали капсулу печінки, суспензію печінки фільтрували через 70 мкм клітинне сито з використанням середовища УМіПат Е, і аліквоту клітинної суспензії (змішані клітини печінки) видаляли для більш пізнього аналізу. Залишок клітинної суспензії центрифугували протягом З хв. при 50 9. Супернатант відбирали для пізнішого очищення непаренхімних клітин. Осад ресуспендували в 25 мл середовища МУйіат ЕЕ (Бідта, кат. Мо УМ1878, доповнена їх пеніциліном/стрептоміцином, 2 мМ І -глутаміном і 10 925 ЕВ5 (АТС я 30-2030)), змішували з 25 мл середовища УМіПШат Е, що містить 90 95 перколла, і гепатоцити осаджували центрифугуванням при 50 9 протягом 10 хв. Після 2-кратного промивання в середовищі УМ Пат
Е осаджені гепатоцити ресуспендували в середовищі УМійПат Е. Супернатант, що містить непаренхімні клітини, центрифугували при 500 д 7 хв., і дані клітини ресуспендували в 4 мл середовища АРМІ і центрифугували через два шари перколла (25 95 і 50 9о перколла) при 1800 9 протягом З0 хв. Після відбору непаренхімних клітин між двома шарами перколла, дані клітини промивали і ресуспендували в середовищі АРМІ.
Загальну мРНК екстрагували з очищених гепатоцитів, непаренхімних клітин і загальної суспензії печінки (нефракціоновані клітини печінки) з використанням набору для очищення РНК
РитеГіпк Рго 96 (Атрбіоп) згідно з інструкціями виробника. кДНК синтезували з використанням зворотної транскриптази М-МІ Т, випадкових декамерів ВЕТВО зстірі, інгібітора РНКази (Атбіоп) і набору 100 мМ дНТтФ (Іпмийгодеп, рівень якості для ПЛР) згідно з інструкцією виробника. Для аналізу експресії генів проводили кКПЛР з використанням майстер-міксу (2х) ТадМап РГаві
Адмапсед (Атрбіоп) в дуплексі, встановленому з праймерами Тадмап для аналізу РО-І 1 (Тпегто
Зо Еівпег Зсієпіййс; РЕАМ-МОаВ Мто0452054-т1) і ТВР (ТНепто Рівпег 5сіепійіс; МІС-МОаВ-РІ
Мто0446971 т!1). Відносний рівень експресії мРНК РО-Ї1 показаний в Таблиці 10 як 95 контрольних зразків від мишей, яким ін'єктували фізіологічний розчин і полі(І:0).
Аналіз вмісту олігонуклеотидів проводили з використанням ЕїІ5ЗА (твердофазний імуноферментний аналіз) з використанням біотинілування захоплюючого зонда з послідовністю
Б-ТАССОТ-5-Віо-3' і виявляє зонд, кон'югований з дигоксигеніном, з послідовністю 5'-0123-С12-
З1І-ССТата-3". Дані зонди складалися тільки з І МА з фосфодіефірним зв'язком. Зразки печінки (приблизно 50 мг) гомогенізували в 1,4 мл буфера для лізису МадМа ригте (Коспе, кат. Мо 03604721001) в 2 мл пробірці Еппендорфа, що містить одну 5 мм кульку з нержавіючої сталі.
Зразки гомогенізували на гомогенізаторі Кеїзсп ММ400 (МегсК ЄЕигоїаб), поки не був отриманий однорідний лізат. Зразки інкубували протягом 30 хв. при кімнатній температурі. Стандарти отримували впорскуванням некон'югованої антисмислової олігонуклеотидної сполуки (СМР І
МО 748 1) в визначених концентраціях в зразок необробленої печінки, і обробляли їх таким самим чином, як і зразки. Впорскнуті концентрації вибирали таким чином, щоб вони відповідали очікуваному вмісту олігонуклеотидів в зразку (в межах -10-кратних відмінностей).
Гомогенізовані зразки розводили мінімум в 10 разів в 5 х буфері 55СТ (750 мМ Масі і 75 мМ цитрат натрію, що містить 0,05 95 (06./06.) Тмееп-20, рН 7,0), і робили серію 6 розведень в 2 рази з використанням розчину для захоплення-виявлення (35 нМ захоплюючий зонд і 35 нм виявляє зонд в 5 х буфері 55СТ) та інкубували протягом 30 хв. при кімнатній температурі.
Зразки переносили в 96-лунковий планшет, покритий стрептавідином (Мипс, кат. Мо 436014), по 100 мкл в кожну лунку. Планшети інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з легким струшуванням. У кожній лунці була зроблена промивка три рази 2х буфером 55СТ, було додано 100 мкл фрагмента Бар проти 0БІС-АР (Коспе Арріїей Зсіепсе, кат. Мо 11093274910), розведеного 1:4000 в РВЗТ (фосфатно-сольовий буферний розчин, що містить 0,05 95 (0б./о6.)
Тмееп-20, рН 7,2, свіжоприготований), і проведена інкубація протягом 1 години при кімнатній температурі з легсим струшуванням. Була зроблена промивка три рази 2х буфером 55СТ, і було додано 100 мкл розчину субстрату лужної фосфатази (АР) (субстрат Вісе Ріо5, КРІ., код продукту 50-88-00, свіжоприготований). Інтенсивність забарвлення вимірювали спектрофотометрично при 615 нм після З30-хвилинної інкубації з легким струшуванням.
Необроблені дані експортували з рідерів (програма Сеп5б 2.0) в формат Ехсеї і далі аналізували бо в ЕхсеїІ. Стандартні криві отримували з використанням програми СгарпРаадРгізт 6 і логістичної регресійної моделі 4РІ.
Таблиця 14
Експресія РО-1 1 і вміст олігонуклеотидів в загальній суспензії печінки, гепатоцитах і непаренхімних клітинах від поли(1:2) мишей, оброблених некон'югованими і кон'юЮгованими з
Саї!МАс олігонуклеотидами, п дорівнює З 9; ві Експресія РО-ЇЛ Вміст олігонуклеотидів
Тип клітин СМР І по (5 від фізюлогчного розчину: (нг/105 клітин)
Загальна печінка тя св ровом
Гепатоцити
Непаренхімні
Результати показують те, що голі (СМР ІЮ МО: 748 1) і кон'юговані (СМР ІЮ МО: 759 2) олігонуклеотиди однаково добре знижують рівень мРНК РО-11 в загальних клітинах печінки. У виділених гепатоцитах ефект кон'югованого олігонуклеотиду майже в 5 разів сильніше, ніж ефект голого олігонуклеотиду, тоді як голі олігонуклеотиди демонстрували в два рази сильніший ефект, ніж олігонуклеотиди, кон'юговані з (замАс, в непаренхімних клітинах. В гепатоцитах і непаренхімних клітинах зменшення експресії МРНК РО-1 1 в деякій мірі корелює із вмістом олігонуклеотидів в даних типах клітин.
Приклад 5 - нокдаун РО-1 1 іп мімо у мишей ААМ/НВУ з використанням голих і кон'югованих з сСаІМАс антисмислових олігонуклеотидів до РО-Ї 1
У даному дослідженні мишей ААМ/НВМ обробляли голими або кон'юЮюпгованими з саїіМмАс антисмисловими олігонуклеотидами проти РО-1 1, і оцінювали в печінці експресію мРНК РО-1І 1 і експресію генів НВУ.
Самок мишей НІ А-А2/ОВ1 5-8-тижневого віку (5 тварин на групу) попередньо обробляли на тиждень -1 носієм (фізіологічний розчин), голими антисмисловими олігонуклеотидами до РО-Ї 1 (СМР ІО МО 752 1 п. ш. в дозі 5 мг/кг) і антисмисловими олігонуклеотидами до РО-11, кон'юЮгованими з (аюмАс (СМР ІЮ МО 763 2 п. ш. в дозі 7 мг/кг), дані дози відповідають еквімолярній концентрації олігонуклеотидів. Даних мишей трансдуквали 5х10!? вг ААМ-НВМ на тиждень 0 (відносно додаткових подробиць див. опис мишиної моделі ААМ/НВМ в розділі
Матеріали і методи). З М/ (тиждень 1) після трансдукції ААМ-НВМ до УМА миші отримували 4 додаткові п. ш. ін'єкції олігонуклеотидів до РО-11 або носія (фізіологічний розчин), які давали з інтервалом в один тиждень.
Зразки крові відбирали за один тиждень до трансдукції і через один тиждень після кожної ін'єкції.
Мишей умертвляли через два тижні після останніх ін'єкцій, та їх печінку видаляли після перфузії РВ5. Печінку розрізали на менші шматки і прямо заморожували.
Для вимірювання експресії генів НВМ ДНК екстрагували з сироватки з використанням Оіадеп
Зо Віогорої, використовуючи ОіІДать Опе для всього набору нуклеїнових кислот, кат. Мо 965672, сироватку розводили 1:20 в РВ5, всього 100 мкл лізували в 200 мкл буфера АГ. ДНК елюювали з набору в 100 мкл.
Для кКПЛР в реальному часі користувалися майстром-мікс для експресії генів ТадМап (кат. Мо 4369016, Аррієй Віозубзіет5) разом з сумішшю праймерів, приготовленої за допомогою додавання 1:1:0,5 наступних праймерів: З соге, КЗ соге, РЗ соге (Іпівдгаєд ОМА
Тесппоподіев, всі розведені до концентрації 100 мкМ кожен):
Прямий (ЕЗ согє): СТа Таб СТ са та ст т (5ЕО ІЮ МО: 784)
Зворотній (З согє): АД 2АА АСА АСТ САС; АДСХ аСА АДА (ЗЕО ІЮ МО: 785)
Зонд (РЗ согє): 56-РЕАМ-АаС ТС ААА/ЛЕМ/ТТО ТТ АТА ДаОа саТО ПАТ СТО САТ О-
ЗІАВКРО (5ЕО 0 МО: 786)
Отримували стандартну криву з використанням плазміди НВМ (генотип 0, СТО),
використовуючи 10-кратні розведення, починаючи з 1х109 копій/мкл з точністю до 1 копії/мкл, і використовували в 5 мкл на реакцію.
Для кожної реакції додавали 10 мкл майстер-міксу для експресії генів, 4,5 мкл води, 0,5 мкл суміші праймерів і 5 мкл зразка або стандарту, і проводили кПЛР.
Для аналізу розраховували число копій/мл/лунку з використанням стандартної кривої.
Результати показані в Таблиці 15.
Експресію мРНК РО-І1 вимірювали з використанням кПлЛР.
МРНК екстрагували із заморожених шматків печінки, які додавали в 2 мл пробірки, що містять керамічні кульки (пробірки ГГ узіпуд Маїгіх ОЮ, 116913500, тррбіо) і 1 мл тризолу.
Шматок печінки гомогенізували з використанням дезінтегратора тканин РгесеПу5. У гомогенат додавали 200 мкл хлороформу, перемішували на віброзмішувачі і центрифугували при 4 "С протягом 20 хв. при 10000 об./хв. Прозору фазу, що містить РНК (близько 500 мкл) переносили в свіжу пробірку, і додавали такий же об'єм 70 95-ного ЕН. Після гарного перемішування даний розчин переносили на колонку КМеазу 5ріп, і РНК далі екстрагували, слідуючи керівництву набору КЕМеазу для міні набору КМеазу, кат. Мо 74104, Оіадеп (що включає розщеплення РНК, набір ДНКази, який не містить РНКаз, кат. Мо 79254). Елюювання здійснювали в 50 мкл НгО. Кінцеву концентрацію РНК вимірювали і доводили до 100 нг/мкл для всіх зразків.
КПЛР проводили на 7,5 мкл РНК з використанням набору ЕМА-ю-сі 1-«ер від Тадтап, кат.
Мо 4392938, Тпегто Різ5пег, згідно з інструкціями виробника. Використані змішані праймери містили РО-Ї1 1-3 (номер праймера Міт00452054 ті, Мтт03048247 т! і Мто3048248 ті) і ендогенні контролі (АТСВ МітО0607939 51, САМХ Міт00500330 тпт1, УМ/НА7 Міт0Оо3950126 51 і свО5В МтО1197698 ті).
Дані аналізували з використанням способу 27-дасї Для розрахунку значень асі використовували середнє всіх чотирьох ендогенних контролів. Експресію РО-Ї1 висловлювали відносно середнього значення для ендогенних контролів і в 95 від фізіологічного розчину.
Таблиця 15
Експресія мРНК РО-11 і ДНК НВУ у мишей ААМ/НВУ, оброблених некон'югованими і кон'югованими з заїІМАс олігонуклеотидами, п дорівнює 5 (95 від фізіологичного (95 від фізіологичного
СМР І по розчину розчину ененанизсянєї ла 11050181
З даних результатів можна бачити те, що і голі, і кон'юговані з саїіМАс олігонуклеотиди
Зо здатні знижувати експресію мРНК РО-Ї1 в печінці миші ААМ/НВУ, причому олігонуклеотид, кон'югований з СаЇМАс, є в деякій мірі кращим. Обидва олігонуклеотиди також приводили до деякого зниження рівня ДНК НВУ в сироватці.
Приклад 6 - вплив іп мімо на відповідь Т-клітин у мишей ААМ/НВМ
У даному дослідженні мишей ААМ/НВМ з моделі Пастера обробляли антитілом або антисмисловими олігонуклеотидами, націленими на РО-11. Антисмислові олігонуклеотиди були або голими, або кон'юЮгованими з СаіМАс. Під час обробки тварини були імунізовані ДНК- вакциною проти антигенів НВ5 і НВс (див. розділ Матеріали і методи) для забезпечення ефективного примування Т-клітин антигенпрезентуючими клітинами. Оцінювали, як дана обробка впливала на популяцію клітин в печінці і селезінці, а також на експресію РО-І1 в даних популяціях і то, чи могла бути ідентифікована НВМ-специфічна відповідь Т-клітин.
Протокол обробки:
Самок мишей НІ А-А2/ЮМКІ обробляли згідно з протоколами, наведеним нижче. Дане дослідження проводили в двох окремих піддослідженнях з невеликими відмінностями в схемах введення, як показано в Таблиці 16 та 17 нижче.
ДНК-вакцину і антитіло проти РО-Ї1 вводили, як описано в розділі Матеріали і методи.
Використаними антисмисловими олігонуклеотидами були СМР ІЮ МО 748 1 (голий) в дозі 5 мг/кг і СМР ІО МО: 759 2 (кон'югований з СсаїЇМАс) в дозі 7 мг/кг, які обидва вводили у вигляді підшкірних ін'єкцій (п. ш.).
Таблиця 16
Протокол обробки мишей ААМ/НВМ ДНК-вакциною і ДНК-вакциною плюс антитілом проти РО-І 1, 6 мишей в кожній групі
Доба Носій ДНК-вакцина ДНК-вакцина «з АБ проти (Група 10) (Група 11) Рол
Група 13 01111111 ААМНВМГ//С/:/ССССС/С/-:: : о 134 |Фізрняізотипчне | -(:0/- 77777777 ТАС 141 |Физорфржізотилчнеї/// | 77777777 ТАС 148 |Фізрняізотилчне | 7777-7777 ТАБ 50177111 |Їбах//// |ЇСаїх/77/7//// 62 |Фіз.р-нжізотилчнеї | -(:(((-71111 С ЇА6С/С///:/3 с 69 |РВЗжізотилчне |ДНК 77777777 ІДНА С 00767 |Фізорняіотилчнеїд | 77777777 -117177171711111С ТАБ 83 |Фізрняізотилчне | (:(:б6иГГ/Г//- 77777 ФА СС
Ізотипічне - мишине контрольне АБ ІдсС, СаїТх - кардіотоксин, ДНК - ДНК-вакцина, АБ - антитіло проти РО-11,, і " - відбір сироватки.
Таблиця 17
Протокол обробки мишей ААМ/НВМ ДНК-вакциною і ДНК-вакциною плюс голим або кон'югованим олігонуклеотидом до РО-І 1 (АБО), 7 мишей в кожній групі (Група 1) (Група 2) АБО до РО-Ї 1 до РО-Ї 1
Група 7 Група 8 0 11111111 ААМНВМГ///////////// 39 |Фіїрн о |Фзарно// ЇЇ
А | 77777171 |Фізрно////// ФАО фоМмАБО7ССССС 46 |Фіїрно ////// |Фзарно// | 1 Її 49 | ЮЛ. |Фізарно////// ФАБО фо МмАБОСССССС 53 |Фіїрно //// |Фзарно// ЇЇ 56 | .юЙии/0/ |Фірно//// ФАБО фо МАБО7СССС 62 | рю |Фізрно ФАО фОМмАБО7СССС 67 |Фіхрно о |Фарно///// ЇЇ 71111111 70 | ..юЮюЮюЮрЮю/0/л|Фізрно ФАО фоМАБО7ССССС 77 | 77777171 |Фірно ФАО фоМмАБО7С7ССС 81 |Фіхрно /// |Фарно///// ЇЇ 84 | 77777717 |Фізрно ФАО фОМмАБО7СССС 88 |Фіхрн о |Фізарно///// | 7777771 Її 91 17717171 |Фізрно ФАО фоМмАБО77ССС
ДНК - ДНК-вакцина, Саїх - кардіотоксин, АБ - антитіло проти РО-І1, АБО - голий олігонуклеотид до РО-І 1, (4М-АБО - кон'югований з саіІМАс оліонуклеотид до РО-І1 і" - відбір сироватки.
У момент умертвіння відбирали одноядерні клітини крові, селезінки і печінки кожної миші з кожної групи, і збіднювали еритроцитами (лізуючий буфер, ВО Бріозсіепсе5, 555899). Одноядерні клітини печінки потребують специфічного приготування, як описано в розділі Матеріали і методи.
Популяції клітин:
У момент умертвіння відбирали одноядерні клітини крові, селезінки і печінки кожної миші з кожної групи, і збіднювали еритроцитами (лізуючий буфер, ВО Біозсіепсе5, 555899). Одноядерні клітини печінки потребують специфічного приготування, як описано в розділі Матеріали і методи. В печінці популяцію клітин аналізували поверхневим міченням на одноядерні клітини печінки (див. Матеріали і методи) з використанням цитометрії.
Не спостерігалося значних змін в частотах МК-клітин в селезінці і печінці оброблених мишей у порівнянні з контрольними групами (тобто групами, імунізованими носієм і ДНК). У Таблиці 18 показано те, що в печінці групи, оброблені голим олігонуклеотидом до РО-Ї1 (СМР ІЮ МО 748 1) ї кон'югованим з саіІМАс олігонуклеотидом до РО-Ї1 (СМР ІО МО: 759 2), мали значне збільшення числа Т-клітин в порівнянні з кожною з контрольних груп (тобто групами, імунізованими носієм і ДНК), також представленими на Фіг. 10А. Дане збільшення було обумовлено збільшенням обох популяцій Т-клітин: СО4- і СО8-- (Таблиця 18 і Фіг. 10Б і 108 відповідно).
Таблиця 18
Т-клітини в печінці після обробки, в мільйонах клітин (мільйони (мільйони) (мільйони) донести | 05006 пБЕО| 16, 0060
Доля
Ар проти РО-І1 (Група 13)
АБО до РО-І 1 (Група 7)
Мотя 1 1111
АБО СМ-РО-І1 (Група 8)
Експресія РО-Ї 1:
Експресію білка РО-І 1 оцінювали на макрофагах, В- і Т-клітинах з селезінки і печінки під час умертвіння. Присутність антитіла проти РО-Ї1 в суміші антитіл, які мітять поверхню (див.
Матеріали і методи), забезпечувало кількісне вимірювання клітин, що експресують РО-І11, за допомогою цитометрії.
В селезінці не спостерігали значної різниці між обробками в 95 макрофагів, В-клітин і Т- клітин СО4.к, експресуючих РО-11. 95 Т-клітин СО8-, що експресують РО-І 1, був нижче у мишей, оброблених голим олігонуклеотидом до РО-Ї1 (СМР ОО МО 748 1) і кон'югованим з СаіМАс олігонуклеотидом до РО-Ї1 (СМР ІО МО: 759 2), в порівнянні з іншими обробками (дані не показані).
У печінки РО-І1 експресувався, головним чином, на Т-клітинах СО8-- з середньою частотою 32 95 і 41 95 в контрольних групах (дві групи носія і комбіновані групи з ДНК-вакцинацією відповідно, Фіг. 11А). Обробка голим олігонуклеотидом до РО-Ї1 або кон'югованим з саіМАс олігонуклеотидом до РО-І 1 приводила до зменшення частоти Т-клітин СО8ж, експресуючих РО-
Ї1 (див. Таблицю 19, Фіг. 11А). Значні відмінності в 95 клітин, що експресують РО-11, також були відзначені для В-клітин і Т-клітин СО4.- після обробки АБО, хоча дані типи клітин експресують значно менше РО-11, ніж Т-клітини СО8-- (див. Таблицю 19 і Фіг. 11Б і В). Обробка Ар проти РО-
Ї1 також приводила до удаваного зниження в експресії РО-Ї71 у всіх типах клітин. Однак можливо те, що дане зниження частково обумовлено блокадою епітопу РО-І1 антитілом проти
РО-І71, використовуваним для обробки, таким чином, що запобігає зв'язуванняю з РО-Ї 1 антитіла, що виявляє РО-І 1, в суміші антитіл для мічення поверхні. Отже, те, що проявляється як знижуюча регуляція РО-І1 антитілом проти РО-Ї1, використовуваним для обробки, може бути результатом конкуренції за епітоп між антитілом для обробки і виявляючим антитілом.
Таблиця 19 до популяції клітин печінки з експресією РО-Ї 1 сен в сеедко| вюо 0 сеек| во
ДНК-вакцина
Група 11 36,8 7,7 0,61 0,08 5,5 1,1
ДНК-вакцина
Ар проти РО-І 1 18,6 12,3 0,33 010 2,9 1,7 (Група 13)
Носій
Група 2
ДНК-вакцина
АБО до РО-Ї 1 2,4 0,37 0,21 2,9 (Група 7)
ДНК-вакцина
АБО СМ-РО-І1 14,6 3,3 0,31 0,11 2,6
Група 8
Відповідь НВМУ-специфічних Т-клітин:
МК-клітини і Т-клітини СО4- і СОвж, які продукують прозапальні цитокіни, зустрічалися з використанням аналізів фарбування на внутрішньоклітинні цитокіни (див. розділ Матеріали і методи), які виявляють продукцію ІЄМу і ТМЕох.
В селезінці не виявлялися МК-клітини, що секретують ІЄМу ії ТМЕсо, і виявлялося мало Т- клітин СО4 ж, що секретують ІЄМу ії ТМЕс, (частота менше 0,1 95) в момент умертвіння. ІЄМу- продукуючі Т-клітини СО8, націлені на два антигени НВУ, виявлялися у мишей, оброблених голим олігонуклеотидом до РО-І1 або кон'югованим з ЗаіІМАс олігонуклеотидом до РО-І1, а також у мишей з даного дослідження, які одержували тільки ДНК-вакцину (дані не показані).
У печінки імунізованих ДНК мишей-носіїв НВМ не виявляється МК-клітин, що продукують
ІЕМу, в момент умертвіння, тоді як секретуючі ІЕМу Т-клітини СО4-, специфічні відносно кора або 5215, виявляли в печінці небагатьох імунізованих ДНК мишей з низькою частотою (менше 0,4 95, дані не показані). Специфічні відносно 52-55 НВМ Т-клітини СОв», які продукують ІЕМУу, виявляли у більшості мишей, імунізованих ДНК. Частота Т-клітин СОвж, які секретують ІЕМУ, зростала у мишей, оброблених комбінацією ДНК-вакцини і голого олігонуклеотиду до РО-І 1 або кон'югованого з саіМАс олігонуклеотиду до РО-11, тоді як обробка антитілом проти РО-11 не додавала будь-якого уявного додаткового ефекту до вакцинації ДНК (Фіг. 12). Т-клітини СОв,, які продукують ІЄМу, націлені на антигени оболонки і кора, були виявлені у більшості груп, імунізованих ДНК (за винятком антитіла проти РО-1 1) (Фіг. 12Б). Більшість 52-5-специфічних Т- клітин продукували і ІЄМУу, і ТМЕсх (Фіг. 12В). Дані результати також показані в Таблиці 20.
Таблиця 20
Фо Т-клітин СО8.ї, специфічних відносно антигену НВМ (52-5 або кора) із загальної популяції клітин, що продукують ІЕМу або ІЕМу плюс ТМЕо;
Преб2-5-специфічні Т- | Т-клітини, специфічні у З2г-5-специфічні Т- клітини відношенні кора клітини (9о клітин, секретуючих | (95 клітин, секретуючих | (95 клітин, секретуючих
ІЕМ ІЕМ ІЕМу плюс ТМЕс; 1 сек ве 0 сеюдео| ве | Сеюде | вм
Носій
Фруштю 00005087 ов | оома | 00000
ДНК вакцина 148 110 047 0,53 042 1,02 (Група 11) з з з з з з
ДНК-вакцина дЬ проти-РО-І 1 118 0,95 0,38 0,49
Носій бути 0001070) ов) ооо
ДНК-вакцина (Група 2) 1,70 1,02 0,27 0,51 0,98
ДНК-вакцина
АФО РО-І 1 2,56 1,60 0,78 0,60 1,44 1,55
ДНК-вакцина
АФО СМ-РО-І 1 3,83 2,18 0,68 1,16 2,62 1,62
Приклад 7 - вплив іп мімо на антиген НВМУ і ДНК НВУ в сироватці мьішей ААМ/НВМ
У даному дослідженні мишей ААМ/НВМ моделі Шанхай (див. розділ Матеріали і методи) обробляли кон'югованим з сзаіМАс антисмисловим олігонуклеотидом до РО-Ї1 СМР І МО 759 2.
Оцінювали, як дана обробка впливала на рівні антигенів НВе і НВ5, і ДНК НВУ в сироватці в порівнянні з тваринами, обробленими носієм.
Протокол обробки:
В даному дослідженні використовували самців мишей С57ВІ /6, інфікованих рекомбінантним аденосателітним вірусом (ААМ), що несе геном НВМ (ААМ/НВУ), як описано в Шанхайській моделі в розділі Матеріали і методи. Мишам (6 мишей на групу) один раз на тиждень протягом 8 тижнів ін'єктували антисмисловий олігонуклеотид СМР ІО МО: 759 2 в дозі 5 мг/кг або носій (фізіологічний розчин), причому і той, і інший вводили у вигляді підшкірних ін'єкцій (п. ш.). Зразки крові відбирали щотижня протягом обробки, а також 6 тижнів після обробки. Рівні ДНК НВМУ,
НВзАЯ і НВеАд вимірювали в зразках сироватки, як описано нижче. Результати для перших 10 тижнів показані в Таблиці 21 та на Фіг. 13. Дане дослідження все ще тривало під час подання заявки, тому дані для залишених 4 тижнів не були отримані.
Виявлення НВ5АЗ і НВедо:
Сироваткові рівні НВзАд і НВеАд визначали в сироватці інфікованих мишей ААМ-НВМ з використанням хемолюмінісцентного імуноаналізу НВ5зАд (СІІА) і набору для СПА Нбредд (Ашобіо аіадповіїс5 Со. (а., 7пепд2пои, Китай, кат. Мо СІ 0310-2 ії СІ 0312-2 відповідно) згідно з протоколом виробника. Якщо коротко, 50 мкл сироватки переносили в планшет для мікротитрування, покритий відповідним антитілом, і додавали 50 мкл реактиву з кон'югованим ферментом. Планшет інкубували протягом 60 хв. на шейкері при кімнатній температурі перед промиванням всіх лунок шість разів промивання буфером з використанням автоматичної промиваючої машини. У кожну лунку додавали 25 мкл субстрату А і потім 25 мкл субстрату Б.
Планшет інкубували протягом 10 хв. при КТ (кімнатна температура) перед виміром люмінісценції з використанням люминисцентного рідера Епмізіоп. НВЗАд наводиться в одиницях
І (міжнародні одиниці)/мл, де 1 нг НВзЗАЯд відповідає 1,14 ІШ). НВеАд наводиться в одиницях
МСИ (національна клінічна одиниця)/мл сироватки.
Екстракція ДНК НВУ їі кпЛР:
Вихідну сироватку мишей розводили в 10 разів (1:10) фосфатно-сольовим буферним розчином (РВ5). ДНК екстрагували з використанням робота МадМмА Риге 96 (Коспе). 50 мкл розведеної сироватки змішували в картриджі для обробки з 200 мкл зовнішнього лізуючого буфера МадмМА Риге 96 (Коспе, кат. Мо 06374913001) та інкубували протягом 10 хвилин. ДНК потім екстрагували з використанням "Набору для маленького об'єму ДНК і вірусних нуклеїнових кислот МадМмА Риге 96" (Коспе, кат. Мо 06543588001) та протоколу "Вірусна МА плазма 5М зовнішній лізис 2.0". Об'єм елюції ДНК становив 50 мкл.
Кількісний вимір екстрагованої ДНК НВМ проводили з використанням приладу для кПЛР
Тадтап (Мії7, Се ТесппоЇодіе5). Кожний зразок ДНК тестували в ПЛР в подвійній повторності. 5 мкл зразка ДНК додавали до 15 мкл майстер-міксу для ПЛР, що містить 10 мкл майстер-міксу для експресії генів ТадМап (Арріїеа Віозує(ет»5, кат. Мо 4369016), 0,5 мкл праймера/зонда для
КПЛР РгітеТіте Хі (ІТ) і 4,5 мкл дистильованої води, в 384-лунковий планшет, і ПЛР проводили з використанням наступних встановлень: інкубація ОО (2 хв, 50 "С), ферментативна активація (10 хв., 95 "С) ії ПЛР (40 циклів по 15 с, 95 "С для денатурації і 1 хв., бО "С для відпалу та елонгації). Число копій ДНК розраховували з значень Сї на основі стандартної кривої плазмідної ДНК НВУ, отриманої програмою міїА7.
Послідовності праймерів і зондів Тадмап (ІСТ):
Прямий праймер до кора (ЕЗ согє): СТа ТИС Стаса тос Ст т (5ЕО ЮО МО: 784)
Зворотний праймер (КЗ соге):; ААС САА АСА АСТ САС ААС ОСА ААА (5ЕО ІЮ МО: 785)
Зонд Тадтап (РЗ соге): 56-РГАМ/ДаС ТОС ААДА/ЛЕМ/ТТО ТТ АТА Ас ато ПАТ СТО САТ
С/ЗІАВКРО (5ЕО І МО: 786).
Таблиця 21
Рівні ДНК НВУ, НВзАа і НВеАЗ в сироватці від мишей ААМ/НВМУ після обробки антисмислового олігонуклеотиду до РО-11, кон'югованим з СсаІМмМАс 117 воіолоічнийромин 000000 СМР МО: 759 2 вдові Ми 0000 дненвМ НВзАд НВедо ДНК НВМ НВ5Ад НВелу о | 746 |035| зеє |048| 323 |0и4 744 |0,29| 387 |040| Зи7 (03 22 | 758 |02з| зве |о65| 334 1010, 669 1089) 260 105) 1980 ОБ.
З даного дослідження можна бачити те, що кон'югований з саіМАс антисмисловий олігонуклеотид до РО-Ї1 СМР МО 759 2 має значний вплив на зменшення рівнів ДНК НВУ,
НВ5ЗАд і НВеАд в сироватці після б тижнів обробки, і вплив, який підтримується протягом щонайменше 2 тижнів після завершення обробки.
Приклад 8 - нокдаун РО-Ї1 іп міго в людських первинних гепатоцитах з використанням олігонуклеотидів до РО-1І 1, кон'югованих з саіМмАс
Здатність антисмислових олігонуклеотидних сполук до РО-Ї1, кон'югованих з саїІМАс, зменшувати рівень транскрипта РО-Ї/1 в первинних людських гепатоцитах досліджували з використанням геноміки.
Зо Культура клітин
Кріоконсервовані людські гепатоцити суспендували в М/МЕ, доповненою 10 о фетальною телячою сироваткою, пеніциліном (100 Ш/мл), стрептоміцином (0,1 мг/мл) і Г-глутаміном (0,292 мг/мл), при щільності приблизно 5х106 клітин/мл і висівали в покриті колагеном 24-лункові планшети (Весіоп ОісКіпвоп Ас, АЇЇбспм/їЇ, Швейцарія) в щільності 2х109 клітин/лунку. Клітини попередньо культивували протягом 4 г, забезпечуючи прикріплення до чашек для культури клітин до початку обробки олігонуклеотидами в кінцевій концентрації 100 мкМ. Використані олігонуклеотиди показані в Таблиці 21 та Таблиці 8, носієм був РВ5. Середовище для посіву замінювали 315 мкл безсироватковою УМУМЕ (доповненою пеніциліном (100 О/мл), стрептоміцином (0,1 мг/мл), І -глутаміном (0,292 мг/мл)), і в клітинну культуру додавали 35 мкл 1
ММ маткових розчинів олігонуклеотидів в РВ5, і залишали на клітинах на 24 години або 66 годин.
Одержання бібліотеки
Профілювання експресії транскриптів проводили з використанням хімії Шитіпа 5ігапдей
ТЕМА на платформі для секвенування Шитіпа з використанням стратегії секвенування 2 х 51 п. о. парних кінцевих зчитувальних фрагментів і мінімальної глибини зчитування ЗОМ на зразок (0 в квадраті ЕА). Клітини лізували в лунках за допомогою додавання 350 мкл буфера КІТ від
Оіадеп, і привласнювали їм номер доступу за рандомізованою схемою.
МРНК очищали з використанням міні набору Кпеазу від Оіадеп. мРНК кількісно вимірювали, і оцінювали цілісність з використанням біоаналізатора Адіїепі. При вихідній оцінці якості виділеної РНК спостерігали те, що всі зразки задовольняли вхідному показнику якості 100 нг з балами КІМ (число цілісності РНК) більше 7,0.
Для всіх зразків отримували секвеновані бібліотеки з використанням препарату бібліотеки
Шитіпа ТгиезЗед 5ігапдей ткМА, починаючи зі 100 нг загальної РНК. Кінцеві бібліотеки кКДНК аналізували на розподілення розмірів з використанням біоаналізатора Адііепі (набір ОМА 1000), кількісно вимірювали за допомогою кКПЛР (набір КАРА ГІ іргагу ОцапО) і унормували до 2 нМ в препараті для секвенування. Для зв'язування бібліотек КДНК з поверхнею проточного осередка використовували набір для отримання стандартних кластерів м5, а сВої використовували ізотермічні для ампліфікації приєднання конструкцій КДНК до включно клональних кластерів, кожний 3 яких складається з -1000 копій. Послідовність ДНК визначали технологією секвенування за допомогою синтезу з використанням набору ТгизЗед ЗВ5.
Обробка даних
Зчитувані фрагменти секвенування з парними кінцями Шитіпа довжиною 2х51 п. о. картували на людському еталонному геномі п919 з використанням програми для вирівнювання коротких зчитувальних фрагментів З5МАР. Вирівнювання в форматі ЗАМ перетворювали в сортовані файли вирівнювання в форматі ВАМ з використанням програми БАМТООЇ1| 5. Числа зчитувальних генів оцінювали для РО-1І 1 на основі анотації екзонів з Кеїзед МУСВІ, визначеному
Зо відповідним файлом СТЕ для п919. Стадію нормування, що враховує різний розмір бібліотеки кожного зразка, застосовували з використанням пакета К ОЕзЗед2.
Зменшення рівня транскриптів РО-Ї71 опісля інкубування з антисмисловими олігонуклеотидними сполуками до РО-11, кон'югованими з саїЇМАс, показані в Таблиці 22.
Таблиця 22
Зменшення рівня транскриптів РО-І 1 в людських первинних гепатоцитах після обробки олігонуклеотидами, кон'югованими з Ссаї!МАс, п дорівнює 4 осно | нет и с 24 (числа, скориговані в залежності від полука й с. . до. (числа, скориговані в залежності від розміру бібліотеки) розміру бібліотеки)
Носій 7677 о ва1111111119 7662 76937
Таблиця 22
Зменшення рівня транскриптів РО-І 1 в людських первинних гепатоцитах після обробки олігонуклеотидами, кон'югованими з Ссаї!МАс, п дорівнює 4 осно |неюсттянтютн С с 24г (числа, скориговані в залежності від полука й с. . до. (числа, скориговані в залежності від розміру бібліотеки) розміру бібліотеки 768.7 7797
Всі п'ять антисмислових сполук, кон'югованих з заіМАс, демонстрували значне зменшення рівня транскриптів РО-І1 після 24 і 66 годин інкубації в порівнянні із зразками, обробленими носієм.
Приклад 9 - ЕСво кон'югованих і голих антисмислових олігонуклеотидів до РО-Ї 1 в клітинах
АБОаРВ-Неракос, інфікованих НВУ
Ефективність двох голих і еквівалентних кон'югованих з саМАс антисмислових олігонуклеотидів до РО-І 1 порівнювали в клітинах АБОРК-Неракос, інфікованих НВУ.
Лінія клітин
Клітини Неракс (Віоргедіс Іпіегпайопаї, Заіпі-огедоїге, Франція) культивували в середовищі
УМШіате Е (доповненому 10 95 ростової добавки Неракс (Віоргеаіс)). З даної лінії клітин отримували лінію клітин Неракс, стабільно надекспресуючу людський АБОРКІ і АБОРК, з використанням лентивірусного способу. Проліферуючі клітини Неракс трансдукували при МОЇ (множинність зараження) 300 з використанням лентивірусу, виробленого на вимогу б5ігіоп
Біотесп. (СІ М-СМУ-АБаРНА1-Тга АБОаРНА2-ІВЕ5-Риго), кодуючого людський АБОРКІ і 2 під контролем промотора СММ (цитомегаловірус) і ген стійкості до пуроміцину. Трансдуковані клітини піддавали селекції з 1 мкг/мл пуроміцину протягом 11 діб і потім підтримували при такій же концентрації антибіотика для забезпечення стабільної експресії трансгенів. Надекспресію
АБОРКТІ/2 підтверджували як на рівні мРНК за допомогою кпПЛР-ОТ (АБОРКІ1: 8560 разів у порівнянні з нетрансдукованими, АБОРК2: 2389 разів у порівнянні з нетрансдукованими), так і на рівні білка за допомогою аналізу проточної цитометрії.
Клітини диференціювалися з використанням 1,8 96 ОМ5О протягом щонайменше 2 тижнів до інфекції. НВМ генотипу О отримували з супернатанта культури клітин Нерос2.2.15 і концентрували з використанням осадження з ПЕГ. Для оцінки активності тестованих сполук проти НВМ диференційовані клітини АБОРК-Неракс в 96-лункових планшетах інфікували НВМ при МОЇ від 20 до 30 протягом 20 г до того, як клітини були промиті 4 рази РВ5 для видалення інокулума НВУ.
Ефективність олігонуклеотиду
Наступні олігонуклеотиди: додавали до клітин АБОРК-Неракс, інфікованих НВУ, в добу 7 і добу 10 після інфекції з використанням серійних розведень від 25 мкМ до 0,4 нМ (розведення 1:4 в РВ5). Клітини відбирали в добу 13 після інфекції.
Загальну мРНК екстрагували з використанням набору для клітинної РНК в великому об'ємії
МаодмА Риге 96 на системі МаомА Риге 96 (Коспе Оіадпозвіїс5) згідно з інструкціями виробника.
Для аналізу експресії генів проводили КПЛР-ОТ, як описано в Прикладі 5.
Дані аналізували з використанням способу 27-дасі. Актин В використовували як ендогенний контроль для розрахунку значень асі. Експресія РО-Ї1 приводиться відносно ендгенних контролів і відносно сольового носія.
Розрахунки ЕСзо проводили в сСгарпРаєй Ргізіпб, і вони показані в Таблиці 23.
Таблиця 23
ЕСво в клітинах АБОРЕК-Неракос, інфікованих НВУ, п дорівнює 4
Ці дані явно показують те, що кон'югування з СаІМАс антисмислових олігонуклеотидів до
РО-І1 значно поліпшує значення ЕсСбо.
Приклад 10 - стимулювання функції Т-клітин в РВМС, одержаних від пацієнтів з хронічною інфекцією НВМ
Досліджували, чи могли голі антисмислові сполуки до РО-Ї1 збільшувати функцію Т-клітин пацієнтів, хронічно інфікованих НВМ (СНВ), після стимулювання одноядерних клітин периферичної крові (РВМС) ех мімо антигеном НВУ.
Заморожені РВМС від трьох пацієнтів, хронічно інфікованих НВУ, відтавали і висівали при щільності 200000 клітин/лунку в 100 мкл середовища (КРМІ1640 плюс СішамМмах плюс 8 95 людської сироватки плюс 25 мМ Нере5 плюс 1 95 пеніцилін/стрептоміцин). На наступну добу клітини стимулювали 1 мкМ білковою сумішшю великого білка оболонки НВМ або 1 мкм білковою сумішшю білка кора НВМ (див. Таблицю 9) з 5 мкМ СМР ІО МО: 466 1 або СМР ІО МО: 640 1 або без них в 100 мкл середовища, що містить 100 пг/мл 1-12 (інтерлейкін-12) і 5 нг/мл
І--7 (стимулювання конканаваліном застосовували тільки в добу 8). Через чотири доби обробку антисмислових олігонуклеотидів до РО-Ї1 оновлювали з використанням середовища, що містить 50 ІШ 1-2. В добу 8 після першої стимуляції клітини повторно стимулювали білковою сумішшю або 5 мкг/мл конканаваліну А плюс антисмисловий олігонуклеотид до РО-І1 протягом 24 г. Протягом останніх 5 г стимулювання додавали 0,1 мкл брефельдину А, 0,1 мкл моненсину і
З мкл антитіла проти людського СО-107 (АРС).
Через 24 г клітини промивали буфером для фарбування (РВЗ плюс 1 95 ВЗА плюс 0,09 95 азид натрію плюс ЕОТА), і застосовували фарбування поверхні протягом 30 хв. при 4 "С (антитіло проти людського СОЗ (ВМ 605), антитіло проти людського СО4 (РІТС), антитіло проти людського СОВ8 (ВМ711), антитіло проти людського РОЇ 1 (ВМ421), антитіло проти людського РО1 (РегСР-Суб5.5) і фарбування на живі і мертві клітини (8ВМ510) (ВО Віозсіепсе5))|. Клітини фіксували в фіксуючому буфері ВО протягом 15 хв. при 4 "С. На наступний ранок клітини пермеабілізували буфером для пермеабілізації/промивання ВО протягом 15 хв. при 4 "С, їі
Зо здійснювали внутрішньоклітинне фарбування протягом 30 хв. при 4 "С (антитіло проти людського ІЕМу (РЕ)Ї. Після промивання в буфері для пермеабілізації/промивання клітини розчиняли в 250 мкл буфера для фарбування.
Вимірювання ЕАС5 проводили на ВО Еогезза (ВО Віозсіепсе5). Для аналізу всю популяцію клітин спочатку сортували на живі клітини (фарбування на живі і мертві, ВМ510) і потім на клітини СОЗ- (8М605). Клітини СОЗ- потім позначали на графіку як СО107-- (АРС) відносно
ІЕМух (РЕ). Результати показані в Таблиці 24.
Таблиця 24
Ефект обробки АБО до РО-1 1 на Т-клітини СОЗ-- з РВМС, виділених від трьох пацієнтів, хронічно інфікованих НВУ
Фіз. Фіз. Фіз. р-н ІСМР 466 1|ІСМР 640 1) р-н |ІСМР 466 1ІСМР 640 1| р-н |(СМР 466 1|СМР 640 1 меу/ Мб 4е5 | 481 |47 92 | вва |з84| 966 | 731
Со107я
ІМЕун/
Со107
МЕ со107- силі 57 | пла |ї22| вв | бе || ові | то
З наведених даних можна бачити те, що сама по собі стимуляція антигеном здатна індукувати активацію Т-клітин (збільшення 95 клітин СЮОЗж, що експресують ІЕМу та/або СЮО107а) в РВМС пацієнтів СНВ (п дорівнює 3). Додавання антисмислового олігонуклеотиду до РО-Ї 1
СМР 466 1 або 640 1 приводило до додаткового збільшення відповіді Т-клітин СОЮЗ. Дане збільшення, головним чином, спостерігали в групі, стимульованій оболонкою НВУ.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ
РОШ ІННОВЕЙШЕН СЕНТЕР КОПЕНГАГЕН А/С «120» ОлЛІГОНУКЛЕОТИДИ ДЛЯ ЗНИЖЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ РО-ІІ1 «1305 РЗЗ3358-МО «1605 786 «1705 РатепсІп мег5топ 3.5 «2105 1 «2115» 20064 «212» ДНК «2135 ото 5арієпьо «4005 1 ддсдсаасдс хдадсадстуд дсдсдісссд сдсддсссса деЕхстдсдса дсеЕссссдад 60
Зо дсессдсасс адссдсдстх стдіссдссІ дсаддасаддд адсдеЕтдєс стссдсдаде 120 дсссасддес садстаєсстісї ддстадсссд стдддсасесї таддасддад ддЕсестаса 180 ссстІсЕ3ї додасддада даддадаадд дааадддаас дсдахтддісї аддоддасадсі 240 ададссааєії асстдісддд дссаасаада асаддсаастд саєстддссе хсстссадас 300 дсдаєсссаді єесдсЕстаа ааасаасттста тасстістааа аатааатаад асаддсадта 360 таддастаддає адссаєсстє ахкдсдастдї дсдЕссадаа хтасадсесстдуд ахкастаддсе 420 ддаддаєскдуд асасдддісс аадсссассуд ссадстдсеї дстадсааса стдасетдсди 480 аадссаєссс адстдсадса устаадсаад сс сстд сдстаадсад дсіссаддаєс 540 сстдаасада асстаєсстстдс сстдІссаєі стдадаассс аааддадсісс таааададда 600 асддаддадс стаадаасаа ааасадсаста асаааасаєт ссттадасас ассдассттд 660 дсстатдєса аадстсадсс сдадеесдЕс стасаасаса аддадсаааа дсассаєтах 720 тстасстстт теЕсттаасас стдаааааава кстастоатдд асадастесест асдааєстааа 780 таассттста аааватаєтт єсаєссдстдс асссдаєсад астдддсаас таааєсдааат 840 т таасссстса стастдддаста саааддссає ссасадсддє стодссттад ссастсаста 900 аастсаєтдс асасасаєстї стддаасаєс дссдаєсуєсє ссстесааді ааасттадаа 960 дсдсаастас стадссааад адсстдааса кестаааддс сттстдаада ааастдаааа 1020 тастстессад аааддаєсдса єсадссдаса асдасадссд їсаасадстає ссааддадаа 1080 стасдастасі стдаадаааа ассттадссеї ссісадсааа адсаддсадд сададдссас 1140 7 асдасадсад єссададсуєд десетссаадд аадссасада аатастдсдд ддаассдааа 1200 ссссасдсдуд аааасдсаса ададсдуєссс адсуєдасстд адааддаддає содоасатдда 1260 десссатдда діссаасааа деЕссдудєсас ссадсададда сссаасааат саастдесе 1320 аассттсдає сстастсаад аассеееее ссдеЕєсос ададаєсдддад стсттдетат 1380 деЕсдсссадд стдасстсда астсстадсс хсаддсдаєс стссстсстс аддстссада 1440 т адссстддда ссасстддсдуд дадссассає дсаддсстст тдстсстаст стдадааад 1500 даадессаас суда суссесе есте сдадасадад кстсастста 1560 тсдсссатдс тддадсдсад сдасдсааєсс хсадстсаст дсстсссдда есаадтсдатє 1620 тстсстдссІ садсстсссдуд адсадсстддд астасаддса сстдссасса сдсссадста 1680 асктссдсає ссссадсада аасддддаєєє сассастаєсд дссаддсстда кстсдаастс 1740 т стдасстсад дседаєсссдсес ткдсстсддсес тсссааадсд стдуддаєсас аддсаєсдадс 1800 састдстсст ддстдссстаа стетесстст асстсаєсст сстасссаєс стасссттдад 1860 аадасадада адсадсаєса десссастаді дессасастдд дсесссссса дддасааасс 1920 састстсссса асстдааєсда дссаєсастт сттссссаді ссасаєтьсса стдстсттта 1980 аасдустсса сссддасатуд ддаасссаса тасддісата астсттасст даадаадата 2040 " тсадсстест сстсттадас саастдссст дасасдаддє ссададдеєста аадаасатде 2100 дсадасасссас асдаєсттстуд кассстдсст еЕссдЕссст састаасдас адстдсассс 2160 сааддааастуд дадстусдда адададддеє сдасаадааа ссаадсааасє астдддаєста 2220 асссаєссасс стссаддаад сстттастас ссстааааає стссаассааа тссастааад 2280 дасаадаасі ссассададі аддссасааа сассддсааа астадссуса асссатсдаст 2340 о адаєссаастд кссстттує стасесссат асддеєсасаа тдстсдсес ддасаєсадда 2400 дсассссаад ес тстд сстадсааді даасссдсді ссасаасаса асаассатаа 2460 65 аасаєссасає саасаєссса саастдсаса дессасаааат ассстсасаад саасаєттатє 2520 асстсасаад саасаєссса саастдсаса десаасестуд дсссааддаа аадатадест 2580 70 дасадасдсс дсадссссає сІтадсааає дсдасстсас аддсстдаає дссатсдста 2640 тессасаєсї асаддасада сддаааддаа адааасаааа ааасаддсас стаасастад 2700 саададдастд асдасссатд стассссаст таасстееео асстессаас асдааддаст 2760 састасадд-ус дасаадааас садсдасаста аасадассаа аааасдаєса дасстсссаа 2820 ассадсаааа ааасаасаєі ссстааасаа тдддсдаааа стасадсдсаа садсассаат 2880 тассаасасд тдасстдадаас садааааастд сестсесст тсдатсадса асастаєттта 2940 т ддааааєста хсстсадддс стадсстддуд дссстддсас асадсаддса стсаасдаат 3000 асстдсстдаа сасасаааста сттаєдастає сссаааааає стддсаасаає стдатасста 3060 асаасададд даєссааасає сасддаастуд ссааасаада сдстстасдаа хтассатодсад 3120 таадасдддс аасасссасд ссастаадстї саасдаааса аасдддсає ааасдасасда 3180 тааддеєсаса аассастєсс саааадаєса садддааааа аассдааада статасастда 3240 7 аасдее дсесасадсуд дсдасааддає сестсадсас тддсастудєс дасдаеєесад 3300 дстдсасдес есдстоасдо даддстддес тасдсастдс адддаєадєссуд дсадсастст 3360 тадсстстдс ссстадатад саастадсаді сстссстсаа ссадсссаат етдасаасс 3420 ааааасду сс ссаддсаєса ссадаєсдссс сстддуєдад адсдаєдааа садсадддда 3480 теЕстсссст сте ссттає есстдсаат тссаттатат тасттстаата асааадаааа 3540 т ааасасаааа аасааасдаа кудрєсаєссаєс стасдуесадс ссддасдс ддастссатт 3600 тсдддасесе тессаєстата ссасттддсс хдстааасає сстасдаєсе доасаадаєда 3660 адсдаєссає даааєссссдд сеесаєссьсю сесстдатас тааааасааа асастстттс 3720 асттддааасє ссддасасад аасассаааа аааасссата асстсаєстс тсеста 3780 сте Есст сс сс стттааааас аасааададі дааасстасс тастстссс 3840 т стаасссаає сстааастає аассастуєс аасаєсстсдуд асаєсссстуд сдстаааса 3900 сасасасаса ст садсаааад тададаєсьостуд стасаєсдсад стадасстдсаа 3960 стстастетсст асдідессас аааВссадса сасдсасата тдстдааєтсс адессттаат 4020 ддасассасає сссудсдааса сассаааасї сдсссаасса сттадасаасє стаддатаєтт 4080 стсадессдс хуаєсасдадс аасдстстсс сттстасатає асадасатає асастасататх 4140 " адксасасасає дідо сссадсадда стадаєсеста ддададддєд аааддсстта 4200 тдасаєссдс асксстасдаєс дсаасаддаа дсаєссааадсі дссссстааа дааааааатс 4260 стсссаєттад хтдддсаадаа адсстаєссд кссатаєстс сасааасаст ааатаєтада 4320 аасаєсссаса ассусддуеса адсссасаад сдаааасддау ассссатаєс ттатасть 4380 тассдуєсдада ссдаасаєст сесатасдєс стасастдассас стасаєсьст таттстстда 4440 о астатасуєс асдассттсс асттес стсастддуаєсє асдсдсаде сосасадета 4500 тстстассдає тдассаддадс тасссастаста сстаддаасаєт таасстсстд ссттатсататє 4560 65 асдсддсаєс даєссадссда ссасссдсда дессасдусс дсасасааад ассодадада 4620 састаададд даааассттас стстесстста ссаааденосуд сааасастатд сасаасадаа 4680 70 дадддадааа асассаасаа асдсасадає сддсєдааасє ададсасааа сте тастс 4740 ссстастсса асасааастуд сааааддада дседастееес теесасесту астсссдтат 4800 тсстсасдсе таааасадсд сстадсасад аададдсдсї саассадстдє сєсодстааасд 4860 ааасаассад ссасаєтссса адсаддаєда стааасдаад аастадааєссї аддсадатас 4920 тстддаадад стддстдсдад єсасссатає стсадсаєда астадссааа хссаастстс 4980 тссссттссс астссссаст деЕтадсадаа дааєстодаєс астдададаа хтадаєсстата 5040 т ассстадааста адсдададдд дсадаададд адаєссссдаа ддаєсддсасс сдааддадда 5100 стадсасддс сдадасадсуд аадсддаадс сттдаасадс хтааадддсаа дасдааадтса 5160 теЕсадстдса дддддааааа дсаєссдасад дессддаааад таааадссад ассстсстта 5220 сЕстдаааєі ссдсасаддд саддеєєстас таддсаєсуєс асаасдсада ааааасаєда 5280 аасааєссдад аддааєссдуд сдсаасаєса сстссттддс сте дад хтоддасадати 5340 7 тире ссасдд сстдсааста саасааассо дааасетсстс ассттетадеі аасттетс 5400 асттаадноє асдсддстдс дддсаасдда асдаадасасє сдаасетесса асттссстде 5460 ддаесссас аастасааді саассаєдас тддссаєсад аадасстаєтс садссадаас 5520 сассаадссс сатаєстдсса сассдсасдс ссаассаєса адсдаадсад сєсесстс 5580 дсдсссса хаассадддс ассссадааа дасдаддаста сстдстдєст статастесат 5640 т дасстастдд саєсссдссда асддсаадас ассааассст кссастаддає єстатаєсь 5700 ааасаєстса ассаєдадес саааасстааа асдаєсаєс аавааєсдсатд сааєсттєст 5760 асадададаа саєссстаєсс еестсстас тсттасасаас ддсааадестя ксетеСТаст 5820 тсасдсаасд асааадссас стдатдхсаєі ссдсааааає асададааста садасааатт 5880 дааадасаса ааасаасста стасссаєтсї сссадддеєста астассдааа ахсасстддад 5940 т ааасддсестуд хтасдсасаса кттасссуєс сдстсссаас ааддссаада кссттсдатс 6000 теЕссадсстє дастдссстод сдасатдсст ссстдаєда ддасасстета аддаадаатт 6060 дсаадасаса хтддаааасді саддсстааса садсастддс ассассстдс дсЕсттсст 6120 даастссата ссаастдсаст хстсдссада ааастдаєса ааадсссадд даадсааааа 6180 дадаєдастуд сстадааєста ссассссстс тасдсаддаа дсааасаддає дсесстуаєсаа 6240 " аддасаєсссї ддддасдісс асасдааасс аадсстссст ддаєсдсаадд астссатстс 6300 сасасаасає сстасасадса асасасдсс асаааєсуєд ддддсаасте діссадстаа 6360 теЕсстастаєс стдстаєсдд дасастдтудє сстсадсаєда дататадсду сссаааасатх 6420 ассссаадсс саєсстддасаа аасасдсуєс садсаадесс ссааасасаа сдасаасата 6480 ассдассада стааадсдаєс сасааасдсс дсдссааєтсс сдсааасдеє ссдаддааєст 6540 о тЕсСсстт ес тдаадаєтує сстесттЕст ттЕттадсать хтастдаєсасд деЕтсссаада 6600 асстастасасє ддсададсає ддсадсааса сдасааєссда асдсааассс ссадсадааа 6660 65 аасаастада сстддстдса стааєсстдєст ассдддааас ддаддаєсаад аасаєтаєтс 6720 аасссдсдса хтддададдаа дасстдаадд їссадсатад стадстасада сададддссс 6780 70 дастдссдаа ддассадстс кссстдддаа асдстдсасі ссадаєсаса датдаєдааатх 6840 тасаддастдс аддддаєдсас сдстдсаєтда хсадстатдд тдасдссдас тасаадсдаа 6900 тсастдсдаа адссаасдду аадааєсаєс асадаєдада ддсестдаєст ттсастдаааа 6960 састассссаа дсдссдаада стттесаєсс тдсаадссс ахтасттаєтс ссааасадаа 7020 садсасадес хтуасєссассса кссасссаає ссасдааєтсс астсасастаа стасссааст 7080 тсттдадсас стассстдаста десастддаа асссададас ааасаасаса дадссатаєт 7140 т стасадсатд сасадесссс сааааадаає кестадесеє тастеесста стсасааатсда 7200 аасасдсата сттдсааата асссадасас тдасддаадад ассаааєсдаа ссдсаааадсі 7260 деЕссстсстсС ссттсассас тасстсссасї ддсасдсада дададсаасс астаєсстота 7320 тасссстсса дааастсесе тасссааста стаєссесеес асстстаєсад асссассадс 7380 теЕссстте тдадсстстс татассааає дсааасааає асасссадаа сааассссас 7440 7 тасааддеєс асаєсстааааа адасссдаад хсассстатуд аадасааааа асаассасатх 7500 таадсдсдаа адаасстає стсссадсас аддасаадсс асасттастд дасататаєт 7560 сасстсдааа асстасастуд асдтуєсс ддаддааєссда аааддааста ддадсдесад 7620 тЕсстсддра седасссаса детастдасєсає саддассастє дадессааад єестасаєта 7680 дсастадста адсаааддаа аасасстстуд сттссаєсстдсє сдадесесас адаассдада 7740 т дсідааадда хсссаддсад дадсадстаа сссааастсс сасааадаас ааааатсссс 7800 сададдаєст сстдєсстста сасстесстдс аасддсдісс стдссатаєс ссасаатдудс 7860 стссстдсса сттддастаєс ссттссатає сстуєсдааа стастссста атадсаадст 7920 дааасстдсес сстстадесуд садссесддауд ассассесає ссасаєдатд асстеетаат 7980 асссдасстад аасстаааєса кстсссстту дЕстесссає ксстдддста астассатса 8040 т асстдадддас саасаасаса адсадааааа дсасасаєсс дссассдаєс астдаєсаат 8100 тассаассаа сдаєсастда саастастааа сісаааааса ааассатдастд дддассаада 8160 дааасдсаєс адссссасдє сурсаєсссстуд дессстдата стддсесссадд саасдссаст 8220 ассуєсаада адасассастї судсааадсад ассстаассьеє саєсстасаєто сассататсдс 8280 теЕсСтссаєссс асдасаєстс стдадасаєє дсдастсата сттесадее сестссадстс 8340 " сасссдсааа тассаддсає стастдєуєє ссаадасаєс ааадааасса хсасдастта 8400 дсстсассаа садсаєсдсс адаєссдудда сддаааддаа дадсасааєс стддсадсса 8460 ддаадааддс адсасааадс асаадессст дсесссаааа ааддустстс ассадсстди 8520 адддадсудсд садддааддд асадстдусс тдсадсадда даадддаеюсь асссадаєса 8580 тстдддстсс асаастаєссс ттоатдасасст дсадсстсст ссдссатдда ссаасасаат 8640 о аддааасстсї ссддсастда тддееессс аадддддадеі ссессстудда дсааадсааа 8700 тдассаасса дасесдадда сстдаєстує ссдасааєсс састеттстдтає сдсаааттас 8760 65 тсаасстддса стестастссс аатссасстї дссастсдса хтасадсддсє ссаддааєстда 8820 деЕссадстає ассаааадсс сдаасстсстІ дсасстстадаа сааддсаасс ассаадсттс 8880 70 асттдсастуд аддссдєдес кссаасддаа асдаддсадс тддсесдсад дадсесссса 8940 астсадддаа дсадаасссс кдадесасст ссатасдсаа асдаєссєсас адсаасдстд 9000 тсдаастеса сттсссатса садсааатуає дсддсаасає адсттсссса саддадеета 9060 стсассаєсдд хтассссааад дсдааасаєі ссаааастда аасссдааад аасстадее 9120 тадаєсссасті саастаєсас тассастссд ддахсасстаєсд сасстессте асстасдадсе 9180 тсааасдсса дастстсадд ссастаастс ссаасстаааа дсаєсесест ссаатсаста 9240 т аасстаасад садддаааас дааасдєєса кссадастсс садаасстсс аасдадаєта 9300 ддсадссдаа адаєссааадї десдсасаді стдассссдата аадстаєссд даєсастасда 9360 ассааассда стдстдесає кссссассаа ссссасстст ссссааааєс сссадссста 9420 теЕсаадсдеє сеістдтадса етасстста стадсатає тдсдсадсає ассататсатє 9480 асттеестає сссдєссаєь деістстстсс тсстадаата стааассссас аадсасааад 9540 7 асстдддсст десссасаає ассуєсдсає ссссадддсс хдастасасад сададсадса 9600 дсасдаааад адсасасааа аааасаєссуд ссдадссаасє даасдааєсда кстесстсааа 9660 таддаєсадс стааааєтсї ддааасаєда асадаєссдд асасдасдааа акттаєттсс 9720 адассуєсса ссаддаастуд ссадсадсес стааадддса сассддадса дсадсадсаа 9780 ааддаддаад аддадсадссї стдстастдс тастаєсдад стастастаса астадсасет 9840 т дсетаєссстуд сдсуєсаддс сстудсастда асастстуєс таааєсстадеє саєсттсстсс 9900 тадааасдас сстадддддає аадсдсссса хсастдасаада тдадсаєьсє єсасаєстта 9960 тод єстда аасстдадса тасстессаа сдасддааєс стдаєссса сдасааатад 10020 тассаєсссс ассттстаадда сдаддааасї даддіссааа дааассаадеі аастстдссса 10080 аасссассса дсстадаааа сдасааадссї адссстааас ссаадсадає садстстдаа 10140 т дЕстдддассс ттаасаасса стттетаєсд сстатаєссд хтасстстдді дсасдсаєса 10200 адссасасдає сдассссааа астассаєда ссттессттд деессдаєсуд сссаасатта 10260 дсасадсуєс стдддаєстдс аааааєсьссуд ассастсаєс ксасстдсраа аасаєтсесда 10320 астсасасає ссдсдсасдс асассстдсді дсаассасаа ааасстсстаст ксстостаат 10380 асасаадесд стассасаада аастдссуєс сссдаададс аааааааддс сдаастуєтас 10440 " садссасаєс хтддеЕссаасс таасадасає сстдсасаааа асадасаєсє саададаєта 10500 ааасааааає сстаасаааса акасссссад сессстастаа сстдсдасдст ссастатсат 10560 тадстаастає дісааддсає аасастассттї адддсдааст сттассаєстаа саааддсдда 10620 тадсдесаає аассттдадда етос сссатсатаас астдсдаддає стсаатсттаадвсі 10680 асттастуєс стассасстса тасадсддсес дасааааадсі десастесту стадессстс 10740 о тадассдєдс седааєссаєсє адсаєссаєст хсадссстса дстестстоас аддаааасттт 10800 тІсаассаде деЕссааєстє дсаадасдду хсадессадсс аааассадає аададаастт 10860 65 дааааєсссді адстасссса аадсаасста сасасаадаа стастаєсеє соахоаєсесда 10920 аассасаасс сстассдаєсє ссадсуєесс састддсаді ддаєсесаєсд асасаддаде 10980 70 ассаааасає састсаєтає стастсссаді кесаєсссдає сстадссуєсє ссдсастсаас 11040 тстІстдсдаа дааастасст сасааасста стдстадсссІ хтдасааадда ахаддадаатт 11100 ааддсестад ассаєссадсуд дессасастає адсаєссадаа дсаааааааа даєссатасса 11160 асаааасаад аасасдєстаа судсасссдса асдаасааас асдаасааад стсттатсдс 11220 асасаддсдс астааасаасє стастадаасє стдісадсааа стасдсаєст саассстдаа 11280 адддесссаа ассааєсдаєс стаааассдаа ссааасттес тссстсдадс асаастасет 11340 т аааєсдаєссса сстаааасадс садсаєссаа аадсстстаааа сдсааастаєс асаасдсдає 11400 ассстадата дсассссада асадааааад дасаєссаддд ааааастдудда ддаатддаат 11460 ааассасдса десссадссає саасаасдса стаасдусст тадссаєдас даєссдсасса 11520 тададсаасдса адасассаас аасададдаа ассдддсаад дадсасасад саастстата 11580 стасстстсдс аастсссд саааєссааа астсстаааа стааадаасаа асстааасат 11640 7 тааааадсає сассаддаас ахсастаєсастї дссстасадає дааатастає дсаєсстессатє 11700 асстаастсс сдаєсаєсда стссаааєса даааадсдаа сдасасстса ааассаддаєтс 11760 тЕсСтаєстас тдаадістаа даааадааад сасассадсї аддададаєьс ахкастстатаа 11820 адасадаєссє асаасаасаа ааасааааста сссаадааста аассстаадаа даадсасте 11880 астдадааас асасдаааас стдаасааасї ддададддає ассссусаєс сдаасадааа 11940 т дастсстдає ссааадасаа ссстстстаа астасстес дсадаааєсс ааддддсаса 12000 ададсадсає сурєсасаєдуд асасаєссаса тадсдудєдаа дестдддуаєє ссадсудсааа 12060 тсаасстета сасссттуєсс дадсссаата аасдсассаа сасдаєсьсо асадааадає 12120 адссаєссстї ассаасссаа асттдсссса астттдааєс даассдаддс ададстадса 12180 ддаєдессссс асддсєдадд саєстдааса стаадсатає ссстстдада ассадсстдс 12240 т ассдасастс тсстаасді ддасадсаєс аадстаєсдса сдсадеестуд сдстсадсаа 12300 аадссстдас есте стасдссста дссссатаса асааааєсаа ссааадаатт 12360 тсдассуєдд асссадссас стстдаасат даастдасат десаддссда ддастасссс 12420 ааддссдаад хсасстддас аадсадсдас сассаадссс сдадсддсаа дассассасс 12480 ассааєсссса ададададда даадсеес аасдсдасса дсасастдад аассаасаса 12540 " асаастаатуд адаєсьссста стдсастєссї аддадаєсад ассстдадда ааассатаса 12600 дссдааєссдуд хсассссадд саасаєсстуд аасдсудєсса ссаааастатд сстаасаста 12660 тсссстадса сстадсаєда хтдсстдсста хсатадссає ссадсдаєсд єссдаасааатх 12720 даасдааєда асаасастає деіссасаааа тахсассстаа тссстсасст ссаттсатсс 12780 ааассатаєі десастсаасє ааасаєссад садасаєсса сддаасастас сттттуєссс 12840 о асдсаєсдса дсасссаєсд дасасасаста даасаасаад астсадесса сассстссад 12900 дааасадата ааааассаад ааасааасаа аааасаддса асссаасасс ахтдсдддааа 12960 65 тастстссата дссдддааас стддддааста сстдададда асастсааєтс саддсесттдс 13020 тісаддааєс сааассстдд сасаєссадад стдсттссст стттссаддд хдасаддааа 13080 70 тааасддаас ахкассесест ассттасдсс ааасаєсдадда дассстттст ссссадсдсс 13140 тстсссаадд тадестасаа тастссааст стадсадестї дстстадсдса хтадаасаєда 13200 дастасасаЄ ссстдуддсаа ассастадас кестдсдсдс тссастессс стасаддатєтт 13260 асаасстасі дадсаадсеї ассдсааддд ссадаєсадс аасадсдсає дааааєдаєт 13320 тдадассаєс дсстдсасаа асссаастає есе стає стсастастс тасадаадта 13380 ддасаддасадд дадасададї ссдаєсдадад дсісадаасд сдааадааад сдаддсдадсе 13440 т дадсаєсдата сссаасасаа асасааадає ассстдадаа дадстдстса стдссссстс 13500 ссссаатаса тдєсдасадд аааасдссас дсастссадс ааааасаассї даааааєстад 13560 асадаааадї саассаасад даааадастаа сссаддасдд хтдассдсдаас адааададад 13620 ддаааааасі стадаааастуд асддддаєдс ксттастддд дсасдадссс ссаддасаєта 13680 аастддсееес садсаааадс тадаєсадсд дасссстдсс асттасаадс тассесатсда 13740 7 саасттастї деЕсддуєддс стасадсаас ссасстааст дсастдадеіс таеесстса 13800 тстасааасс ддадассьсе сесстааатас стддсастдсес хтаастсастаа адстаєсста 13860 ааассдааас ааавасастасд сдаасаддса сстдсааастуд стаадссасдд ааааадстда 13920 стассдеєкає дессстааад ке есасстдуд дсадесааад асддаєсатд ддакстсадта 13980 дададссдад ссаддсадда дссдассаад ддаєдададдає ддададссадс адсстстдаа 14040 т сасстудсдса ссасдуддасс ссстттссІс стдсаєсддсра ссссадасаа ддадсстадс 14100 аададастасі аасддсетдс сурсєссадада тд ссаааст дсададааад асаадасаас 14160 аадсаєссддс стссаассаєї даєсдасадає аддаддаддє ддададсесст тадсадсдсе 14220 ддаскддссе ссастдесста стдсдддсса кстстдссає дсастдаєсадд стастадсе 14280 стастаєссааа даасдсаада ддддссадда дсддаддсес асдсстдсаа кстсадсаст 14340 т тсдддаддсс ааддсдддса дассасстсда ддассаддаді ссодсдассад сстддссаас 14400 асддєдааас кстдсстста стаааааастає аааааєссадс таддоасоєдає доасдєдсасс 14460 тасаасссса дстастсддд адассдаддс асаадааєстд сстдаасстд ддадасддаа 14520 десдсадсда дсссадаєсуд сдссастдса стссассстуд ддсаасадад ааадасеста 14580 ссІсаааааа аааааааааа адсаададда адсдааасаа ссааддссдс сасстаатад 14640 " тдадсадсса стссатуаєдд тастдстдсаа дсасаєтата аатассадсс хсасаадааа 14700 тасассадса сесдсастсс дсасастдду саадсасєстє дсссаадасс хсаааастад 14760 тсаадддсад садааєсстад ссссадсасс асстттссаа адсстдддсе стсасастт 14820 стссасдстуд рсссастт аасасаддса сстсдссаєс ссадссастс ааастттддс 14880 ассстаадааа ассассстаа адсстаааста аастссаадд асдассаєсс тсстдасссс 14940 о тЕсссаєссаа аастттаєст стадссадеє хтдеесесас стае єессадааст 15000 асстстддса сассстссаа асдаааддас ссасттддса ассстдддад ссассттатт 15060 65 асдссттдає дсадсастда саєсссасєсес ссдссаада аааддсадса сеессттаат 15120 тасадсддус сссастдддад дсдаддаадд ддасдадааєс ддаєсастддс хдсааддааа 15180 70 сссдасттаа сстІстдсаад дсдудсдсааа ддсаєсссас хтуасєссаасад саастсатати 15240 даадссдаді дддаєсастуд ддсдаадаєд аадсдсаадд дасдаддддс аддадаасда 15300 дсасддаєдуд аддсадаада сдсадсдіса стасадеееес ссстассатуд аааастаасса 15360 садастстаса даададааад адссаааасд сссудрєсаєтє ссадессдсає сстадесета 15420 сасстадссдс аассадстдд ктЕестддуса ссстаадсаа стааааасаді ксстстасад 15480 аастдсадса суєссассасє ададсаєссс дсааааєссесє сддсададда сдсасатаа 15540 т теЕсдсасдсд стесасьсстс сатттасстуд хтдддаасаає стааааєсссад даааасдадс 15600 асасссааасє аасстссстсс састсаадає дадссададї ааасааєсссс хссаатасет 15660 ададаадсає ассаададає ссадсдаєдд сасададесуд сстдасдєса аасадддаад 15720 тадаасасдд ааддддаєсс саасадссудє сдаааааєссс сссатаассс сттасатдад 15780 ддааадсаді дссаассдад ададсадада саадстдєс ссааааатта хтасссттаас 15840 7 аддассдада садссадаасє асааддаєса адссссаасуд асадсаадає сстдадасда 15900 адссдаєссд сасааадааа саассуєсдс садсасдсає сстдаастаєс сстстдудааа 15960 аааадаєсад ссддсадсад ааасддасад ааассаасад асассаааасє асстсадаатє 16020 тсддасесаєс сстдддаааа дасдааааає аааадсдстає астсстсаад аасатсстада 16080 ассаааадса хтдсдссстас астасстдаасє стаассаасстї сатаадесдуд дасстоатдда 16140 т асааддаєсду ссассадасті ссстадддає стасааасдєсє ссасадаасс сдаааєсстаа 16200 асттдддаєса стдстасддда сдсададстд тдсстасасдда ааасаааааєт дасстьтстт 16260 тстсааддда дчаасдаєсдда сдсдаааааа тдсддсаєсс аадатасааа стсааадаад 16320 сааадсддса адаасаєсад ааддааєсдуд даадсаааад ссаааддааа сааааадста 16380 аадсаасаас ааададааає ссаєссадсса таасстсстс тссттстааа даасдстдає 16440 т тсссстттдс стсасадста асасаадаас хсстссассд хстдаддадда етаддадса 16500 дддаадддда аддадссадс кссаєсссдсе аасстсстдс сдссстдсас сстадсадст 16560 ссттдсадса ддддасаадд асдасссадд сддасддаста ассаассдає сстаааататє 16620 тасдасдссад тассдсааса стастдаєсаає стдсассатдс асададсаєстс асттаатссс 16680 ссассссітуд ссастстассаа ададададад ададададад ададааасас садаасетатє 16740 " сстісатсттта садсададаа аасададдду саадаадаста асдсааадсд сссаадааса 16800 сасадстдає сасааааасс аадсссдуддуд дссаєстадсс таассасада сссттастс 16860 таасссаєст дсттсаастсс асттсдстас ааастдесстас астстасаадс адддсадааа 16920 аасстсаєсс аддессаєсда асстаадаада аадссасаєс ааддесеста ассстесетаа 16980 тасадссада аассааастї аасаасдадс ссаадесстаа адсадсістаа ссаасстдда 17040 о саадсссадд саадсессає сстдсддссс атадсаєсає стдсдссудса аадстаадта 17100 дсааасадаєсд сесддуєсає дстдддаддас аадссаєссс аастттдссса ддаастдадда 17160 65 деЕсеессадд ахсассасдса аддаєааєсуд ддсасаааса саасстдстд стесстстса 17220 теЕссаааєстє ассастстстаєс ахсассадсаа стаєсдадетста хтодсесестає тадасттст 17280 70 десастстс ссссадасса сттсссаєсда аастаастата стастаєсас скстссадата 17340 сасаєсстсдда ддадасдсаа сссадсаєсуд даасесстда сстссаадса ддадаєсстса 17400 асстасаддс саддддаєєса ссдудддссда дсдсдасаад аддааддаає дддсссатад 17460 дасдсаддса асдсдддасі сааааддссс аадсастдаа аатуддаассї ддсдааадса 17520 даддаддада асдаадааад асддадсесаа асадддадсс тддадддада ссесдатаст 17580 тісааасдсс тдаддддссс ассдасдссї дсдасаддда даааддатас Естдаасаа 17640 т ддадсстсса адсаааєссає ссаєсстдссса ссстаддаад асдддаєсдад аасссстаат 17700 тсдадддєса дЕссстдсад аадстдссст тдсстссаст саасдсстса астттатс 17760 тасаєсдастд ададссссад тадастддаасд ддасадсаєє састдастасдад єееессстат 17820 тсассссдад сстасдаддає сессттдса тасдадсава астоасдаата асссттета 17880 аадасастаєї дсадсадаєсд ссасаасссс дссдссааас тааасттдсе дсесаасдатє 17940 7 тктдстсасає стадсаааас ахкддадсаєс сдсааддсдс садсстсст стасаастас 18000 аадсасасає студдаадсата аадаєссааас садастдураєсдс асаддатдєс асстетатт 18060 аасссаєттаа тастстдує дасстаасстї тассстсада сстсаадсді стдсдсадта 18120 тстасессає стааастаєса дстстасаат хтасдсддсад сстасасаса таасстсати 18180 тсассдстус аассассстуд тдсдасаас састаєтаєто ссасссаєсд хтасадстдад 18240 т даадсаааса даєссаадсаа сттдсссааа ссадсаааста дсадасстса дастдссасс 18300 састадассст сстасаасаса асстасадссї ахтасстстаст ссаадсааєс стестаєсса 18360 аааассаєсі ассаадсдсес сттдсаастає саассдстдс дссаддсаєс дааєсстасад 18420 асдсдадсаа дасааадсас стдісстсаа ддадсссата дсасааєсдад дадаєсааса 18480 адааааєсдса ссассасаає сстадессаді десасадсає ааддаєдастд сдаддддааа 18540 т асссдадсад тдеЕсдссаад аддаддааасє аддссаасдс: дасєстдддас дадаєсддасатх 18600 асттааасає стсаасааєс ададсааєсє ссасссасаа адададдусд дсасттаааа 18660 таассстдаа ааасаасастї ддаастссте сєсстадсаєо асастсттаєсс стдатетсдсс 18720 теЕсдссатає аасстаастдс стасстасає адсдсстдає астдсссаас адсстаєс 18780 теЕсстастстта аастдссаста аастсстааає ссатассттт ссаєсдаєттса ааасссаааа 18840 " дассссасдуд дадасддаєсд дааааєсстсс астссассст ссаадссаєс саадееесст 18900 тиіссадаадс аастдстаст дссттесатт састастдєст стааадата дестасаєте 18960 ддааасдсає дссаааадса сдсаєссесса ааасстьес сстааастаді аасасаєтди 19020 асдеістдстд кудасастссдс кассессаєс сасстссадсд єсестсатає адсадатдда 19080 асдааєссда адсссссадд дседаддаєс саєсдсесеєст тд сстаа дестассттс 19140 о ссастадсесее ссассаєстс ссатаєсдаєс садсасасдс сааасаєсдєс стасататас 19200 ассстадасаа ссассаєттуд сстаадсаєсє дсестаддас ададессдда стату 19260 65 тЕсдстсааа аддадассса тдддстстсс адддасдсаст дадесааєсся адссстаааа 19320 адсаасстта стассаастс турстаєдасад аассасдєст ддаасьсту сеесстадсе 19380 70 тстассааді асааасттса стттдасдсе дсасттдсаа аассасаєть єстеЕсстддаа 19440 аассссддса дсдсассттд астдстадсе ассстдсдсс адаааадсст саєсссєтдх 19500 дсесдаассс стдаасдсса ссадстдіса ссастасаса дссстсстаа даддсесст 19560 ддаддаєєссд адаєссадає дссстдддад ассссададеі ссссттессс тсттсддесат 19620 аскстддасасє сааєсдасаад дадсасстсуд дсестдссас асдісааддс хтдаадаааса 19680 дкдсстссаа сададстсст куасудаєсаєст дессдсасає дсдсаєссдс асадсааєста 19740 т дсасдасадї дес судсд сдааєстасад дсаадааєсуд сддстдадса аддсасатад 19800 тстастсаді стасссстаа деЕсстаастс стссттадсда хтдастоаддаєссе дсааддсаст 19860 тсасссстт тасстсатуає єесассдсаа асддсатадда сададаєсдає асстаастст 19920 дсаєсссдаєс дссастєсс дсасстдсає стаасссааса ааастаєссстє асстаєтта 19980 тсастсддсра сассадсатд хссастстест хаєетаєстсє дсасссааста ааатаєссад 20040 7 т ітаасаєсс садстдуддадаа ад 20064 «2105» 2 «2115 20261 «212» ДНК «2135 тасаса Тазсісшатів «400» 2 дсааааєсаа ддсдсдесса дасдеЕсдасе хдстдсааає ссстдесктає астаатсааса 60 т тассааасдає ддаєстає сааєстссддрд аастсттсс ддхдаааасс ксатттасаа 120 даааастдда стдасаддеє ссасесестуд сессаєстьст асасасадст стасесстад 180 дасассааса ссастсдста сссааастда аадстесссс датессдссдуд ааддесадда 240 аадсссаатд ссдддсааас тадаєстдсе дссетдсдса даддсдддсд ддассссдсс 300 тссдддссдо дсдссаадеї дадсадскдд сасдсестсдс даадссссад хсстдаадсс 360 о ссадсісстдс дстдсессс даддсессдс ассадссдсд стестстстд сстдсаддта 420 дддадсдєта єЕсстссдса дасдсссасуд дсссадсаєс сстддстаас ссдстдддса 480 ссттаддасд даддаєстст асассстттс еЕсдддатад адададдадд адддаааддад 540 ааддсдаєда єстаддддас адсададсса астасстдє даддесааса адаасаддса 600 акдсаєстда дсттсстсса дасдсаастсс адсеесдсес тааааасаає сттатасстся 660 " ааааасааасє ааддсдддаса дсасаддаста ддсадесаєе сттатдсдас сдедсдєеса 720 даасасадсс стдаєсдстад дстддаадіс хтддасасддд хсстадссса ссдесадста 780 сетдстадста асасдасстд сдсаадесає сссадстдса дсадаєааді аадестстс 840 стдсдстаад сасдіссадд асссстдаас ддааєстаєтє тдсестдаєсс атстдаааа 900 сссаааддад єсстаааада ддааєддадд адсстаадаа сааааасадс асаастаааас 960 о астстстада сасдєсдасс стддсестатд ссааадесса діЕстддаєє десттатсаас 1020 асааддадса ааадсассає куєсстасст сте стаа тастстдаааава ааааюсстаст 1080 65 дсадаєсдсее сєсстассаає сааасаасст сстааааагасї десесадсд стдсаєтсда 1140 тсаддєссдда саастааасд ааассаассс стсастадаєсд ддасастааадд стсасттасад 1200 70 тадесстдсс ттадстаєсс астдаасаєс асстасатада тасстстдда ахсастдстда 1260 тідЕстЕссуЄ саастаааст адаадсдсаа стастстадсс ааададастд аатастестаа 1320 аддсаєсссд аадаааастуд аааасдсесс ссадааадда сдсассадес дасаасдата 1380 дЕстдєсааса дсаєсссаадд адаастаєда тассстдаад ааааасттад ссттстсад 1440 тадаадсадд стаддсададд ссасаєсдаса дсадссадад тдатдассесс ааддаадсса 1500 садааастасії дсддддааєс дааассссаа дсддаааасд тасаададсд хстсадсота 1560 т астдадаадд аддаєсддудсе кдддаєссаа стсаадаасє сесесест стада 1620 адасадддсе сєесуєсасдс сасссаддсес дассесдаас ксстадсстс аддсдатсст 1680 сссдсстсад дстдсадаад ссстдддаєс астддссудда дссассастдс аддсстстта 1740 стсстастсс сдадааадда адстсаасст сессесссто сет сссуєсе 1800 дет д адасдадест сассстдеєсд сссаадстдуд адсдсадсдд сдссатстса 1860 7 дсесасддса асстстдсст сстддуаєсса адсдаєсстс стдсстсадс стсссдадта 1920 дстдддаста саддсассса ссассасдсес садстааєсє ссдсастьс адсададата 1980 ддаессасс атассддуса ддстдаєстс даастсстда стсаддєдає ссасстдсст 2040 садсстссса аадсдссддд ассасаддсд сдадссассд сдсстддсса стедасьте 2100 кстстаєсстс тесстІсСтас ссатсстасс сттддаадат ададаадстаа тахссадесс 2160 т ассдсуєсає астдддсееес ссссадддас ааасссастт ссссаасстуд аасдадссат 2220 састтсттсс ссадсссаса ктссассдсе стссдаасду ссссдсдоу асасдддаат 2280 тсасасдаєдд ссасаассст тасстдаада адасстдасде сттстестст тадассааст 2340 дссстдасає даддаеєєсада ддессааадаа сасдусуєдса сстасаєдає стесдстасьс 2400 тасстесд сссстсаста ахсдасадстуд аассссаадд ааастададсї дсададдада 2460 т ддаассдатд адааадсадд сааасаєсдд асстаассса ксасстссса ддааасстсс 2520 ассастсста аааассссаа ссаааєтссді стаааддасаа даастссасс ададсаддадас 2580 сасааасаєії ддсааааста десудсаасстї асдасстадає ссаасдессс тет тат 2640 тсасататдд ссасаасдст стдсттддаа ссадддатає сстаадеесе сесстдсста 2700 дсаадсдсрає ссдсдсетстас аасасаасаа стасааааста ссасаєсаає ассстатаас 2760 " тасасадеса ассстддсесс ааддаааада хтадсссддса датдстдсад сстдаєсета 2820 тасстаассс тддсаададда асаасдассс асдетаєстсс асттасссте тат 2880 аасаєсдаадд дсісасасад дссаасаада аассадсдає асааасадас сааааааєсда 2940 тсадаєстсс сасаєсстадса ааааааааса кс тааас аатасссаас тдадсдаааа 3000 тасадсдсаа садсассааа тассаасасд тдссаадаас садааааатд СЕТтасес 3060 о тсдассадса асастаєссд аддаааєста хсстсадддс стадсстддд дсстддсаса 3120 садсаддсас сдаасааата сІтдссдаас асасасатас стасдатаєе сссааааєттд 3180 65 дсаасааєссс аастасссааї аасададдаа ссааасаєса стадаастуєс саасаадатад 3240 сттасдааста ссасдсадса адасдддсаа тассстастаєс асаадссстаа асдааасааа 3300 70 тадасаєсаа аддсасддса аддеєсасааа ссастесстса ададаєстааа дддаааадас 3360 тдааадастає асассдааає дстсасадсд дсдасаадду хссссадсст хдасастати 3420 дасаєсссдд дстасдестс кдстдсддда дастддестд кадассстдсад даддеЕссдадс 3480 адсасссттд деЕссстассс стадасадса дсадсаассс тссстІсаасс адсссаастт 3540 тдасаассаа ааатдаєсссс аддсаєсасс адаєсстссс тдадсдадад сдаєсдаааса 3600 дсаддаєдаєє сєсссссткст тестсаєтє сстусааєсє сдісасаєтса сдесаатаат 3660 т ааддаааааа сасаааааасє адаєдааєсє ассассстас стсадеесдд асдасесддас 3720 тссстттдда дасестсесс астатаєсас тддсстасІ ааасадсста тдасссдаса 3780 аддаєдааасд асссаєсдааа сте асстетсасс сдатастааа адсаааасат 3840 тсаєсссдст дааааєссдд асасадааса ссаааааааа хссатаатст сасстстст 3900 теЕсСстТДссСте теЕсССттсССт ЕТ сСссСТТІ ааааасаада дсдаааасст ассдаєтстс 3960 7 сстссааєтї аасссстааа тасаассаст десаасаєст тддасаєсес стадасдсстаа 4020 асасасатас хсасттес Ер сстад сааааадсдд асссстдста сатоатадсд 4080 тссдсаастє сстасасдсєс сасааааєсса дсасаєсстас асасдстдаа кесаассст 4140 аасддсаєса сассссдсда асасаасааа асстаєсссаа ссасттадас аасстаадатхє 4200 асксстсадеє сдстдесастуд адсаасдстс тесстттаса татасатата сахтоасоасоа 4260 т тасасасаса сасасасаса сасасасдасд єеестадсадда асадаєсься аддададдас 4320 дааасдссасє асдасаєсса сасстстасаасє тдсаасадда адсаєсааад тдссссстаа 4380 ааааааааає ксстсссасті адсуєдєдад ааадсстаєс сдессатаєс сссасаааса 4440 стааасаєста дааасаєсса саасстусуєс саадсстаада адсдааааасє ддасаєсесат 4500 асстстастаає стосу адаєсдааса тасстесстає десесасаєсдає сасстоататт 4560 т тсттаєссстс тдаастатас детасдасст ссасттаєь сєссстсатдд детатоатота 4620 дЕстоасасад ссдсстсасс даєссдєсадд адстаєсссає асассаддаа саєстаатстс 4680 стдустстата стдсасдсддс ассдаєсаді сдассаєссд сдадессастд сстдсатаса 4740 аадаєсадад аддсадсаад адддааааст хтасстсттсс ттассааадеї ссдсааататє 4800 асдсасааса даадададад аааасаєсаа стааасдссда аасааадсає ааасьееета 4860 " стссастасті їсаасасааа стасаааадд ададсдасеє ссстессатд стдасттсса 4920 тассссссає дсстааааса дсдсстадса садаададдє дстсаассад татетсдстаа 4980 асдааадаасє стадсаасаєі ссаадсадда сдасстааастуд аадаасадаа сстаддсада 5040 тастістуддаа дадсдастує дадесаєссса тддЕстсдоаєЄ асдаастаді сааатссадс 5100 теЕсстсссст тсссастссс састадаєтаді адаасааєстї дссстаєссдад адаасадаєтт 5160 о тасааєсссад аасаададдд дсадаададд адаєссєсдаа ддасддсасс тдааддадда 5220 стадсасддас сдадасадсуд аадсддааді сестддааадс тааадддсаа дасдааадта 5280 65 теЕсадссдса дддддааааа дсаєссдасад дессддааасд стаааадссад ассстсстта 5340 сЕстдаааєі ссдсасаддд саддеєєстас хтаддсасдє асаасдсада ааааасаєда 5400 70 аасадссдад аддааєссдуд сдааасаєса сстссстддс сте дад сдадсадатєтт 5460 тире ссаддд сстдсааста саасааассо дааасетсстс ассттетадеі аасттетс 5520 асттаааднє асдсддстдс дддсаасдда асдааддсає сдаастесст астссстаси 5580 ддаесссас аастасааді саассаєдас тддссаєсад аадасстаєтс саастадаас 5640 сассаадссс састаасдіса ктассдсдсд ссаассаєса адсааадсад ссессте 5700 дсдсессса хаасстадсас ассссадааа дасдаддаста сстдстдЕст стататесас 5760 т даєсстастдд саєсссдссда асддсаадас ассааассст кссастаддає єстатаєсьт 5820 ааасаєссса ассаєдадес саааасстааа асдаєсаассс аааасдсатдд саасттестт 5880 асадададаа хтассстстес тест сстас тсттасасаас дасааадеьст ссстестдс 5940 тІсасасаасд асааадсссс стдатдєсаєі дсдсаааааї асададааса тадасаааєтт 6000 дааадасаса ааасаасста стасссаєтсї сссадддеєста астассдааа ахсасстддадад 6060 7 ааасддсестуд хтасдсасата ктстасссуєс кас ссаас ааддссадда ксттесаатс 6120 теЕссаасстє дастдссстд сдасатдсст ссстдаєда даасассста аддаадаатт 6180 дсаддасаса хтддаааасду садддсааса садсастддс ассассстдс даєсстест 6240 даастссата ссаастдсаст кстсдссада ааастдаєса ааадсссадд даадсааааа 6300 дадаєсдєтвад аасстассає кссстстатуд стаддаадсаа асаддасдісс адссааадда 6360 т саєссстддад асдуестасає дааассаадї стсстддетд саадсастсс асстссатат 6420 аасаєсссста садсаасата сусєссасааа тстдсддддас аасттуєсса дстааєттта 6480 тсассстдаєс ассдддасас татдасссстуд саєсдадасає адсдісссаа аасатасєттс 6540 аадсссаєтуд дасаааасає дсасссадса адссстсааа стасаасдата асасаастда 6600 ссадасаадд сдасссссаа асдстдсдсес аастсстасаа асдиссдад даасттссс 6660 т теЕстЕсСтдаад детастстсс есте сстта дсаєтсттастуд хсасддтсс сааддасста 6720 тасдсддаєсад адсаєсддсад саастаєсдаса ассдаасдса аатссссадеі адааааасаа 6780 тсадасстда сессастаає тдсстаєссдд дааасддадд асаадаасає тасссаастт 6840 дедсаєсддад аддаадассї дааддеєєсад сатадсааст асадасадад дасссадстад 6900 тсдааддасс адстстсссІ дддааасдсї дсасттсдда хсасадатдє даааєтодсад 6960 " дасдсадддад сстассдстуд саєсдаєсадс хтахтддасддасд ссдастасаа дсддаєтасс 7020 дсдааадсса асддсаадаа сстассасада сдададдссс даєстссаста даааасататє 7080 тстаадсдє даадасстесе сасестстата адсссатаст татттссааа садаасадса 7140 тадестстсс аскссаєсссає ссадсссастуд аастссаттса сдсаадсстс саастадсат 7200 ст сдадса сстатаєдає адссаєссдда аасссадада саасасадад ссатаєсста 7260 о сдасаєсдсас адссссссаа ааасаасссс тадсстеєстас ее естаєтса сааатдєаат 7320 асасасастї дсааадааєї садасастасє ддаададаєс ааасдааєсуд саааадсуес 7380 65 сстсстссст хсассастає стсссаєсдад асаассаада дасассссаа дададсаасс 7440 асксаєсссдстд кдєссстсса даасстеесе тасссааста ссаєстетееею ассстсаєтад 7500 70 дЕстассаде сєеесст сдадсстстс тасассааає дстаасааасє астасссадатє 7560 сааассссас тдсааддаєєс асассааааа адасссдаад хстссстатд аадасааааа 7620 асаассатає саадсудсааа адаастсаєс стсссадсас адсасаааст атастсаста 7680 ддсасатаєс сасстсдааа асстастастуд асдтуаєстс даддааєсда ададдааста 7740 ддадсдссаа кссстдддаа стдасссаса дестасдєсає саддесастс дадсссдаад 7800 теЕстдсуаєсд дсастадста адсаааддаа аасасстстд сттесасттоає сдадеессатє 7860 т адааєссдада дссдааадда ссссаддсад дадсдастаа сссааастсс сасааадаас 7920 ааааассссс сададдаєст сстуєссата тасстесстдс адсддсаєсс стдассататс 7980 ссасаасддс асссстдсса ттддастсс ссттссатає сстуєсдааа стастссста 8040 асадсаадссї дааасстдсес сстстадесуд садесессдда астаєссесає ссссатсдата 8100 асстттстаає асссдасстад аасстаааєса сстсссстту дсастсссає ссстддаста 8160 7 астассаєса асстдадддс саасаасаса адсадааааа дсстасастє дссаєтдатс 8220 астдаєсаасї даєссаассаа сдаєсастда стаасстасааа сссаааааса ааассатута 8280 ддадасєссаада дааасдсаєс адссессасдає соасаєссестуд дессстдаєс стддсссааа 8340 таастдстасі асстдссаада адасаєсастї хтудсааадсад ассстаасесє састатаєт 8400 тассатдаєдс теЕстссассс асддсаєьсс ссдадастаєє дсадесссата сттесаает 8460 т тістссадсс сассадсааа тассаддсає стастдстдсс ссаадатаєто ааадаааєсса 8520 тсаєсдастта дсстсаєссаа садсаєсдсї адаєсстддда тддаааадаа дадсаєсаатс 8580 стддсадсса ддаадааддс хкдсасааадсї асаадеетст дсесссааад аадаєстстс 8640 ассадсстасє адддадсдса садддадддд асадстдусс сдсадсадс аааддаєсть 8700 асссаддаєса стдддсесс асаастаєссс ттдсдсаєст дсадестсст стдссатдда 8760 т тсаасасааї аддааасстс ссддсастда хтддесеЕссс ааддаддадеі сстесадада 8820 дсааадсааа сдассаасса ддаєссдадда сстдаєссда саастссаєс стдсаєсеета 8880 аассадссаа ссетдсаєссст адссссаасс саєссттдсса сстдсадаса дсаддеЕсесда 8940 ддаєссдадесд адсстасасса ааадссстдаа сстсстдсас сстадаасаад дааддсаасс 9000 ассаадстсс асттдсастуд аддсадсуєс кссаасддаа асдаддсадс тддсесдсад 9060 " аадсттссса астсадддаа дсадаасссс сдадесасстї ссатасдсаа ахсаастсесас 9120 адсастдстуд сдаасстсса сттсссасса садсааасді дсдудсаасає адстесдсса 9180 саддадесса сссассаєсдуд даєссссааад дсдааасаєо ссаааассда аасстсдааад 9240 аасссадеес сддаєссаст саассаєсає даєсасессд дасдаєсаєсдд сассттесат 9300 дЕсстдсдаді ссааастасса дастстсадд сстстаастє ссаастааайа дтасесесст 9360 о тїсаассастуд аасстаастад стадддаааас дааасдссса сссадасттє саддассттс 9420 аасдадаєда ддсадссдаа адаєссааадсї десдсасаді стассссадса аадстаєста 9480 65 дассдсасдуд ассадаєсаа стдстдєсає сссссассаа ссссатст ссссаааатт 9540 сссадссстд стстаадсуєє стстдсадса сетасстста сстадсастає стоасдсадсатх 9600 70 ассатаєссає асттеестає тує саєсь дестстстсс тсстадаата сааастссас 9660 аадсасадад асссддаєст деЕссессаає ассуєсдсрає ссссадддсє сдасдсааад 9720 сададсддса дсасдасааа адсасасааа аааастаєссуд ссдадссаасє даасдаасда 9780 теЕссстІсааа таддаєстадс стаааасісї ддааасаєсда асадасстда асасасдааа 9840 асссаєссссс аааастдєсс ассаддаасі десадсасстї сстааадддс асастдаадс 9900 адсадсадса аааддаддад даддадаадс адссстдсста стастаєтає сдадсастас 9960 т тасаастаєс дадсастасі асаастаєсуд адсастаста саастадсас стасттаєтс 10020 тасдасдассад дЕсстдсасті даасаєсстуд сстааассад сссасессст сстддааатд 10080 астстуасдад дсаддасдсес саєсасдсаа даєсдадсаєс сеесасастт састдєустст 10140 даааєссстдад скдсдесес аасдаєсддаа ссттсдаєсо саєсдасаадсі ддасаєстаєьс 10200 ссаєтсстсаад дасдаддааа стддддесса аадааасстаа дсааєсстдсес саааєтссасс 10260 7 тадсстсдсра аасдастааад стадсестаа асссаадсад астддассстд ааадсстадас 10320 ссттаастаас састтаєстдс стдатаєсссдс асстстдудаєд стасдсаєсаа дссасататт 10380 ддстссаааа стассаєдас стттестсда кессдаєсдс ссаастаєсад хтахтадсаєсс 10440 тадаєстаді адассадддд єстдсаааава асстсдаєса стсасстсає стасааааса 10500 теЕстааастє акад стуЄ дсаддсасає ссдсдсдсаа ссасаааааа тетастатся 10560 т ассаасасає аддеєсдсасс дсаадааааа ссдссаєстс сдаададсаа ааааддесда 10620 асассассад теесаєсстдуд сссаасстаа тадасаєссуд стасаааааса дасаєсетаа 10680 даддаєдааа саааааєссса асааасааста кесссааєтє ссастааєтсуд сдасдсесса 10740 стассуєсад стаасасуєс ааддсаєдає асасстстадд дсддааєсса ссастаасаа 10800 аддасддасад судсєсаасаас стсдаддаесє дід асасаасаст дсдаддеста 10860 т ассаадсаст саассуєсса саасстсата садссдссаа таасаадсуду састтстдст 10920 дЕсссстсту ддєкдсдсес даассаєсад стастаєстес аатсстсаде ссстетасда 10980 аааастесс аасстадессдє ссаассесдс аадаєсддаєса дессадссаа аастадаєсаа 11040 дадааєстда ааасссастаа стассссааа дсаасссаст сатаадааст астаєста 11100 тассссдааа ссасаассеє аскссдаєсьсс адсдсессса стадсадсдд єессастдатє 11160 " дсаддадсає саааасаєса стаасстаєстє ассссадее хтасєсеєдаєсс тадстдеЕе 11220 дсдссаастс сдаадаааєі асассасада сстастдєсд сссттддсаа аддаасддад 11280 адссааддсеє стадаєсаєі адсддеєсасд стдсадсаєс аддадсаааа ааааадаєта 11340 тассаасааа асаадаасаї десаасдстас ссдсаасада стааасаєсдаа сааадстст 11400 асдсстастата дасдсассда асааєстасі адааєссдіса дсааасддста хсетсаатсся 11460 о аааадддєсєс сааассаатуд асстааааєсї даассаааст сстссттд адсатаатта 11520 тІеЕсаадсдає ссассаааає адссадсаєс саааадссеста ааасасаадс ассатаатде 11580 65 ддсаєссстад асадаєссса даасададаа аддасаєсад ддааааастуд даддаасдда 11640 асаааєссастд садесссадес ассаасаасд стастаасдєс сттадссатд ассаєтсдтас 11700 70 сасддсааад саадасасста асаасададд ааассдддса аддддасасає дсаастстат 11760 астаєстттд саасстсєсс дсаааєссстаа аасттстааа асааадааса аасстдааса 11820 тсааааадсд ссдссаддаа састдсаєссас хтдстасада тдааасадста хтдтастеьеета 11880 тасстаастсє стдаєссаєсд дстссаааєс адаааадсда асдасасаєс аадассадає 11940 теЕсстдста стааатааад їстаадаааа сааадсатас садстддада дасесатаєт 12000 тасааадаса дассстасаас аасаааааса ааатаєсссаа даасаааєссї аадаадааатє 12060 т адддсастає дсааааадса садсасссса стдадаааса тасдаааасс сдаатсасата 12120 дадададдста сессасаєсс даасадааад ассдстдуаєс сааадаєсаає кстстстааа 12180
ЕСЕ адаааєссаа даддсасаад адсадесесуд ссасасддає асастасата 12240 дсаддедааді стддадєеє адсудсааасс аасстттаса тету сда дсссаатааа 12300 тасассааса тдаєссессає адсаадастад хсаєссстає стаасссааас ттадаксссаас 12360 7 теЕсдаастда астдаддсад адстадсадд хдекссссас тдстдаддса стдаасати 12420 аадсдсаєсс стістдадаас садсстдсає сдассстст їстаасдсад асадсаєсаа 12480 дсстасатаєс хтадессстусд стсадсаааа дссстдастє стттесдсес асдассстадс 12540 тссатасаас аааассаасс ааадаасстсї ддаєсдєсдає ссадссасст стдаасатда 12600 астаасасдас саддссдадд дстассссаа ддссдаадес асссддасаа дсадсдасса 12660 т тсаадссстуд адсддсаада ссассассас саассссаад адададдада адсетстааа 12720 тасдассадс асастдадаа ссаасасаас адстаасдад ассесстаст дсаєтсестад 12780 дадаєсадає сстдаддааа ассастасадс стдаассддес ассссаддса асастсстдаа 12840 тасдсссассї аааасаєсдєс таасастдсс ссстадсасс хтадсаєдатд єстдсстатс 12900 асадссаєсс адсуєссуєс даасааасда ассаасдаасє аасаєсастає стсасаааатад 12960 о тассстааєт сстсасттсс асссастссаа ассатаєтсдє тасттаасаа асастссасса 13020 аасаєсссаєс даасасдсст сетуєсссат дсаєссдсаді астсаєсссда сасасатада 13080 асаасаадас хсасдіссас астстссадд ааасадасаа аааасааатуд аасааасааа 13140 ааасаддсаа хссаастасса тустдддааає дсесесатас сатуасдддаа асстдддададаа 13200 аксасстдада ддаасаєссса асссаддсса тдастесадда асссааассс тддсасаєтса 13260 " дадссдестс стесттаста ддаєсстді ддасаддааас ааасддаасд сассесеста 13320 тсттасдсса аасаддаддд ассстесстс ссстдтдсст стсссаадді адсстасаатє 13380 ассссаасдс хтадсадсстуд ссадсдсас аддасаєдад дстдкдстаєс сстдддсааа 13440 ттдстасаст сстасдсдст ссастесстс тдстаддаєста саасстастдуд адсааддета 13500 тсдсдддддє сааасстадса асадсдсасд аааасдаєссї дадассадсд сстдсасааа 13560 о тЕсаастаєє сесесеттаєс тсастастстї асадаадсад дсаддасддд адасададсс 13620 тдатдддадд стісадаатує дааадсааді даддасдадсад адсаєсдатає тссататааа 13680 65 сасааадата сістдадаад адстестсас тесссссдсес сссаатадає дссдасадда 13740 ааасдссатд хтастссадса аааасадстуд ааааассада сасаааадес аассаатада 13800 70 аааадасаас ссаддасдду сетсудсдааса дааададдда аааааааадс ссадаааатад 13860 асдддадаєдас кстстасстддд дсаєдадссс ссаддсаєсс аастддсееес садааааадс 13920 тадастадсд дасесстдсс ассстаааадс хтуаєесстасда саасттастє деЕтдадсдас 13980 стасадсаас хсасттаастї дсдстдадес тастесстса сстдсаааєс ддаддась 14040 таааасаасї ддсасдсста астсастааад тд сстдаа астдааасаа аасататата 14100 аасаддсаєї дсааассдса адссасддаа ааадстддсее дет стесааадст 14160 т тсасстудддає адссададає ддаєсаєсддд хсесадсдда дадстдадсс ададсаддадс 14220 тдасстааддд саададдсдда дадесадсаа хстстдааса хстдтдсасс ахдддасссс 14280 теЕссстссІ дсатддсасс ссадасаадд адсстадсаа дадастастаа сдасттаєта 14340 тссададаєд стісааастдс ададааадає аадасаасаа дсаєстддсст ссаатсатда 14400 тдасадасад даддаддаєда дадсссстта дсадсдстдада ссадеесьсс атассстаст 14460 7 дсдддссаєс хстдссастдє астдсаддсее астаасесстї асассааааа асдсаададад 14520 ддссддададі ддаддсесає дсстдсаасс ссадсастес ддададдсессаа ддастоддодсада 14580 тсастсдадда ссаддадесс дсаассадсс хтддссаасає ддасдаасстс тдсстстаст 14640 ааааасасаа ааассадсса дасдсддасдод сдєдсасссд хтаассссадс тастсдддаа 14700 дстдаддсас дадааєсдсс сдаасстддауд аддсддаддає сдсадсдадс саадаєсдта 14760 т ссастдссст ссадсстддд саасададаа адасєсстдсс ссаааааасаа асааасааах 14820 ааасааасаа асааасааас ааасддааді дааасаасса аддссассає ссаасастда 14880 дсадссастс сатусддсрас кусдсстаадс асасстасааа асассадсст сасаадааахє 14940 дсассадсає ссдсаєссссд сасастддаєс аадсаєстстуд сссаадасст саааастддх 15000 тааддддсад садааєсссаа ссссадсдсс ассттессаа адсстдддсе єсттасасту 15060 т стссасдстуд рсссастт аасадаєсдсра сстсдссаєс ссадссастс ааастттддс 15120 ассстаадааа ассассстаа адсстаааста аастссаадд асдасстаєсс ксстдаєдас 15180 сссттсссаєт саааассттта сстттадсса деЕстодсесес десстуєсс дессессада 15240 астасстстуд дсдсттсстІс саааєсдааад дасссасттд дсааєсстдд дадссасст 15300 теЕсастсстї ддсдсадсас сдасаєссає стестаєсстса адааааддса дсассьсст 15360 " аассдсадсд дістссасту дддаєсдадда дддддасєдада асстдуддаєсда ссасддстдс 15420 ааддааассї дастсаассї стдсаддуєд дсдсаааддс астссастає ссаасадсаа 15480 тсасаєсдаа дстдсасддда ассастдддає даадаєдадда тдсаадддає дадддасада 15540 адаасдддса тддасддадд садаадаєдс адсудєсастас аасттес тассасдааа 15600 асаассасад асттасстдса аадааддадс стаааасдсст десаєсесса дестдсаєсь 15660 о адсессдсає садссдсасс садстддаеєс стдддасастс таадсаасаа ааатадессс 15720 тстдасадаас тдсадсаєсє ссассатада дсаєссесдса ааастаєсдд сададдатає 15780 65 тасасаастсє дсатдатдєсс сттестссат тасстдсдуд даасааєссаа аасссаддаа 15840 аасдадсата сссааасаасє кссстсссат ттасдаєдає ссададсааа таастсстс 15900 70 дасастсада даадсасасс аададаєсса дсдаєсдсає ададессдєст дасдаєсааат 15960 адддаадсад аасасдуддаад ддаассссаа тадссуєсда аааасссссс асаасссстт 16020 асасдддадда аадсддасдес аассдадаста дсададаєсаа дстудєсасса аааВзстатдчи 16080 тсттаасадд ассдадастад ссадаасаста аддаєсаадс сссаасдаса дсаадатсся 16140 дадаєсдсаді сдаєссдсас ааадааасаа стдесдссад сттдсаєстє даастастсст 16200 стддааааад адаєссадссд дсадсадааа сдаасадааа ссаастадата ссаааатасс 16260 т тсадааєссуд асссассісї дддаааадаї дааааасааа адсдсатадс сстсаадааа 16320 асстдддаєс аааадсасдд дсстстассст ассдааєсаа ссаасстсад аадссдддаа 16380 стдсддааста аддаєсдєсса ссадастссс тадддаєсас ааатдєєсса садаасетсда 16440 аасссааастї хтуддуєсастуд тсасдддаєдс ададсстдсдс татасддааа саааааєсдатх 16500 ст с саадддадаа сдасддастає даааааасдсє ддсасссдад ссасааастс 16560 7 ааадаадсаа сусддсаада асассадаад даассдддаа дсадааддса ааддааасаа 16620 ааадсстааад саасаасааа дадааассса сттадссастаа сстсстстсс тт ттааадаа 16680 тастддеєсс сстетдсстс асаастаата саадаастсс хссассатст саддаааес 16740 адддаєсддсес ссаададса дададсаддд адсадсестуд стддадададд ададдадсад 16800 ддаадддадаа ддадесадсе ксесттсдсе аасстуєсдс сстдсассст адсадстссс 16860 т тасадсаддд дчасааддесд асстсаддаєда асддаєсааєсс аассдаєьст аава2атастає 16920 дсдссадсає судрсасаєссдс аасастасдсі саастдсдсс асдсасддсра сстсатттаа 16980 тсссссассс сттдссаєта ссааааадад адададаааа асастадаає тастсстсати 17040 тІсасадсада даааасадад ддссаадаад асааадсааа дсдсссаада асасасааст 17100 дассасааасє ассаадсссуд дддаєссаєса дсстаассас адасссттас тсттаассса 17160 т тстдстссаа тссастстдс тасааастдєє стасаєссттата тдсадддасад аааадсстса 17220 тссадессає сдаастаада адааадссає ассааддсдє стсаастсесе ссаатдатадс 17280 тадааассаа астстаасааї дадсссаадї ссааадсадї стаассааст сдасаадстс 17340 аддсаадееє саєссстдсдуд сстдсадсає саєстуасуєс дсааадсстаа дсадсааатад 17400 тсасссддудає сассстддда ддааадссає сссаассттдс хсаадастда ддадсееес 17460 " аддасаєссає дсааддаєстаа ссдуддасасаа асасаасстд сттсттестс тсаттссааа 17520 тесассаєтє ассаєссстсад саастаєдад стасдеєсесе сассадаєсе сттдстаст 17580 теЕсссссада ссдстсссса тдааастааст асастаєтсає састстссад ахсасасаатт 17640 ддаддадасд саасссадса стддаасесс сдаєсстссаа дсадддаєсс ссадсстота 17700 дЕстддадає ссдссадддс сдадсаєдас сададдаастд аатдддессдуд тдддасдсатх 17760 о дсадсасддд асссаааадд сссаадсасі даааасддаа сстддсдааа дсададдада 17820 адаасдаада аааасдуддаді сдаасаддда дсдсддаддд адасстєдає асттесааат 17880 65 дсстдаддад стсассддсд сасдєдасад ддадааадда стасстстдаа сааддадсст 17940 ссаадсааасє сасссастдс ксасстсадд аааасдддаеє дадаасссстї аасссдадада 18000 70 тсадсссстуд садаадсдсс сеттдсстсс астсаатдсес хсаатттаєт єестоасасда 18060 стдадддаєсс садсдссдда асадсаєсса сдасаєсдадає сеесстаєте ассссдадсес 18120 тасдаддєсе ссттдсастд ддадсасддає сдсдаасдає сс сдаа дататасттає 18180 адсадасуєс асаассссдс сдссаааста аастсдаєсдс ссааєсдасеє дсесасатст 18240 адсаааасає ддадсаєссуд сааддасдсес даєстсстст асаастасаа дсасасаєта 18300 даадсасааа дассааассуд ксдаєсссдса саддаєсдєса сстттаєссса асссаттаатє 18360 т астстдаєсд астстаасстє ассстсадас стсаадсдєс тдахдсадсає статессатт 18420 тааасаєсад стстасааєі асдсддсасс астасасасає аасстссттт сатсастота 18480 ассассстасє хтудрєдаєдасс астаєстаєсє тасссаєтує асадссдадд аадсааасад 18540 ассаадсаас ссдссаааас садсааасад сададсссад астдссассс астдесст 18600 тасаасасаа сетасадста тасстсстаст саадсааєсс асттаєсссаа аасссаттта 18660 7 тсаадсдссс ттдсаатаєс аассастдса ссаддсаєстд аасстасада тдсдадсааад 18720 адааадсасс худасєсстсаад дадсессддад стасаасаадд адаєсаасаа даааасататх 18780 тассасааєс тадсссадсд єсасадсаста аддаєсдасдає даддадаааа дстдадсадс 18840 дЕстдссаада ддаддаааста ддссаасусд десстдуддаса дессдаасдсра сстааасатс 18900 тсаасааєсса аадсааєссє сасстсасааа дадаадссад тасттаааає аассстдааа 18960 т аасаасастуд даасссстс сстадсаєса тастстаєссс тдасттдсст стсдссатаса 19020 асстаасдст хусссасата дсдсстдаста сстдссааса деЕкстдєсе ссстаттсаа 19080 асдстаєссаа ассстсааасс сасассттсс саєдаєссаа аасссаааад ассссатдад 19140 адасддаєєюсд ааааєстсса сттсассстс саадссаєтсс аадсетссстс сссадаадса 19200 астдстастуд ссттетаєтсс астасдестс стааадастад сстасаєссд дааасдсатад 19260 т тсаааадсає ахкассессаа асссссс стааастадса асасаєтата тасстастде 19320 дсастттдсе асстсстаєсто ассдсадсдсє сестсасдса дсадаєсддаа сдаасстдаа 19380 дсесссаадд дісаддасас асдсстест тасеестаад сстаєсстессс сатадсеее 19440 сасаасстсс састаєсдаєссї адсасасуєс ааасасдсдс тасастатаса сстадасаас 19500 садсаєстадсє саадсаєссд стстаддасі дадесссддає ссасдеєсдс ссааааддад 19560 " асссатддас хстссаддає дсастдадес аасстадссс тааааадсаа ксттастатт 19620 аастстдасрає дасадааєса ктасстуддаас есте ес тдстесстдс саадсатааа 19680 стссастттуд асдстдсаст кдсаааасса саєстессте стддааассс садсадтота 19740 ссттдастдс хтадссассстї дсдссадааа адсстсаєсс деЕтусдсеку аассстттаа 19800 тассассадс тдассассасті асасаддсест сстаададдс ссстддада єеЕссдадать 19860 о садасдсссї дададаєссс ададееесст ессстстту дссасаєсст доасдаєсадса 19920 асааддааста ссттсдсе дссасссуєс ааддессдаад ааасадсудєс сссаасадад 19980 65 сессттасає сасстуєссд сасасдєдса есустасаді аассстуєуєд асадтдеєст 20040 тсдсдсдаає сасаддсаад аастдсддсї дадсааддса сатадестас хсадсстати 20100 70 сстаастсст ссттттддстд ссддасссдє ааддсасесе асссстества хстсатадєє 20160 сассдсааас ддсасаддса дадаєдастає стаассстдс асссдаєстдє састтетди 20220 асстдсаєса ассстаасааа ахсасссттає тсасстодта 20261 «210» 3 «2115 20340 «212» ДНК «2135 тасаса Тазсісшіагів «220» «2215» тібс Театиге «222» (1658)..(18813 «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «2215» тібс Театиге «222» (274235..(2745) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «2215» тібс Театиге «222» (2747)..(2747) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «2215» тібс Театиге «222» (27493..(2749)3 «223» п являє собою а, с, а або ї
Зо «220» «2215» тібс Театиге «222» (4764)3..(4802) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «2215» тібс Театиге «222» (8775)..(8778) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «2215» тібс Театиге «222» (8980)..(8984) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «2215» тібс Театиге «222» (91613..(9293) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «2215» тібс Театиге «222» (93443..(9348) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «2215» тібс Театиге «222» (98403..(9874) «223» п являє собою а, с, а або ї 60 «220» «2215» тібс Театиге «222» (99583)..(9973) «223» п являє собою а, с, а або ї 65 «220» «2215» тібс Театиге «222» (10437)..(010452) «223» п являє собою а, с, а або ї 70 «220»
«221» тівзс Театиге «222» (106033..(10603) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» (108303)..(010830) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» (10989)..(/11006) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» (111053..(011122) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» (11457)..(11457) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» («137103..(13710) «223» п являє собою а, с, а або ї
Зо «220» «221» тівзс Театиге «222» (14015)..(14049) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» (145183..(14585) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» (14689)..(14699) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» (147073..(014767) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» (14837)..(14865) «223» п являє собою а, с, а або ї «220» «221» тівзс Театиге «222» («157033..(015741) «223» п являє собою а, с, а або ї 60 «220» «221» тівзс Театиге «222» (174033..(17415) «223» п являє собою а, с, а або ї 65 «220» «221» тівзс Театиге «222» («191223..(019135) «223» п являє собою а, с, а або ї 70 «4005» З стдааадстс ссссдаєссс дссдааддіс аддааадссс ааєдссдддс ааастадатєс 60 тастдссттуд сдсададдасд ддсдддассс сдсстсс9ддд ссдддсдсса адссдадсад 120 стддсасдсс хсдсдаадсс ссадесстда адссссадес стдсдстдсе ссссдададсе 180 ссдсассадс сдсдсежстсС Естдсстодса ддасадддадс деЕтдеЕссстс сдсадаєдсс 240 сасддсссад сасстстддс таасесдстуд ддсассттад дасддаддає сеЕстасассс 300 т Ес стоддо ахтддададад даддадддаа адддааддсд асддаєстада ддасадсада 360 дссааєтасс хтдастддда аасаадааса ддсаатдсає стдддсееесс тссадсдсаа 420 жесадеьсд сестааааат аатттатасс стаааааса аатааддасдд дсадсасадад 480 асаддсадес аскссттатдс дассдхдсдє єсадаасаста дсестдаєсдс таддстддаа 540 дЕстддасас ддасєсстаді ссассдісад стдсетдста дсаасаєсдас седсдсааде 600 7 сатсссадсї дсадсадата адсаадестс ЕсстдсдсЕ аадсасдісс аддасссста 660 аасддааєст асстдсестд єссаєтсстда ааасссааад дадісстааа ададдаатдд 720 аддадсстаа даасааааає адсаєаасаа аасаєтсстї адасаддесд ассетдасся 780 аксдісааадї ссадестддад єссдЕстстає аасастаадда дсаааадсас саєтаєсста 840
ССС таатасстсда аааааааєсст астурсадасд стесестате аастааатаа 900 т сстЕсстаааа аатдессста дсдстдсаєі сдаєсаддаєє ддаєсаастаа аєдаааєтаа 960 тесстсастд ттддоасасаа аддесаєссса садтддест дісттадста есастдаас 1020 ассасстасає адасаєстсї ддаасаєсдс сдассуєсєсс сдісаастааа стсадаадта 1080 таастастта дісааадада стдаастаєсс саааддсаєс ссдаадаааа стдаааатдс 1140 теЕсссадааа ддастдстаєса десдасаасд асддассдєса асадсаєетста аддадааста 1200 т тдастассстуд аадаааааст хтадссттсї садсадаадс аддсаддсад аддссасата 1260 асадсадсса дадсдсддес ссааддаад ссасадааасє астусддудда ассдааассс 1320 саадсддааа асдсасаада дсдестсаді дседассдада аддаддаєсдо дсеЕсддадае 1380 таастсаада ассесесст есте тосо дадастадддс сттоастатд ссасссадас 1440 тадістсдаа стсстадсст саддсдаєсс хсссдсстса ддстдсадаа дЕсстадаат 1500 " тастддссдд адссассатд саддсестстї дсесстастї ссдадааадд аадсттаасс 1560 геЕсетететт асстуєстсь дес ее стотад асдадестса стстастдсс 1620 саадстуддад єдсадсддід ссасстсадс єсасадсппп пппиппппппп. пипппппппп 1680 пппппппппп пппппппппп пппппппппп. пипипппппи. ппиппппппп. пипппппппп 1740 пппппппппп пппппппппп пппппппппп. пипипппппи. ппиппппппп. пипппппппп 1800 о пппппппппп пппппппппп пппппппппп. пипипппппи. ппиппппппп. пипппппппп 1860 ппппипиппп пппппппппи пдасттетес тстаєсстст сстсстассс ассстассст 1920 65 тадаадасад адаадсааса ссадссссає сдсдсстастас хтдаддсесссс ссадддасаа 1980 асссасттсс ссаасстдаа сдадссаєса сттсттсссс адесстасаєє тсастдстст 2040 70 тсдаасдист ссасссддає ахсдддааєсс асасдастддсс асаассстта сстдаадааад 2100 астдасадаєст хсесстстта дассаастдс сстдасдсда ддаессададд ссааадааса 2160 тасдасдасаєє сасаєсдаєст стодасаєсстд сс есдсс сстсастаає дасадстдаа 2220 ссссааддаа асададссдсє ддаддададд дессдаєдад ааадсаддса аасассддах 2280 стаасссатс асстстссадд ааасстссає тасттстааа аастттсаасс аааттсдіта 2340 ааддасаада ассссассад адсадддсса стааасаєсдд сааааєсстаді содсаасстат 2400 т дастадаєсє аасдессст куєессаєссс асастасддаєс асаасдсеееє дсеЕсддааєтт 2460 аддадасаєсє саадееесст сстдсстаді аадсдсаєсе дсдсеєсасаа тасаасааст 2520 асаааастаєс асассаасає ссстасаастуд стасадссаас сстддсссаа ддаааадата 2580 діссддсада хтдстдсадсс кдаєсстссдса сстаассстуд дсаададдає аасдасесат 2640 дісасстссас стассстте тассттстстаа сасдаадддс ссатасаддас саасаадааа 2700 7 ссадсдасасє ааасадасса аааааєсдаєс адаєстєсса сппппапапа ааааааататє 2760
Т2Естааасаа тасссаастуд ддасдааааста саасдсааса дсассааата ссаасатата 2820 тсаадаасса дааааасдєє кдссстс дассадсаас астаєтстсдад даааєстатс 2880 стЕсадддасєсї адсстддддс стддсасаса дсаддсастуд аасааатаєс сдстсдаасас 2940 асасасастсї асдастаєссс саааассддс аасаасссаа тасссаастаа сададдааст 3000 т ааасаєсаста даастуєсса асаадаєсдсс стасдаасаєс асдсадсаад асдддсаата 3060 тесастаєссає аадстстаааєї дааасааасд ддасассааад дасасддсаад адстатсааатт 3120 астттстаад адаєсааадд даааадассуд ааадасасасє астдааасдс ссасадсдахє 3180 дасааддеєс сссадссттуд дсастаєсда састесдддс хтасдєстсо стасдддаада 3240 стддсстудстд сеістдсадда ддаессддсад састсттдде сєсстасссст адатсадсадс 3300 т адсаассстс сстІсаассад сссааєттссуд асаассаааа ахдиєсссад дсаєссассад 3360 аскстссстуд ддаєдададсуд асдааасаді аддсдасстє ссссексте кстсатс 3420 тасааєссоссуд ссасаєсасд сстаасаасаа ддааааааса таааааатад асдаасттат 3480 тассстасст садессстодддає адеЕстддассс сстетдддад сс ессає тататсасту 3540 ддаєстдсстаа асадсстатд дессддсаад дсдаааєдає ссасдаааєс стдсесетат 3600 " теЕсесасстуд ахтастаааад таааасаєсс асссдстсда ааасстсддас асадаасасс 3660 аааааааасс сасаасстса ссесесесс сстуссете ссесссттт сссстттаа 3720 ааасаададі даааасстас сддесстссс тссаатттаа сссстааата саассастди 3780 таасаєсттуд дасастссст дідстааас асасатастс астттесст сет ттадса 3840 аааадсддає ссстдстаса тудсадсдесс сдсаастссс тасатуєсєсса саааассадсе 3900 о асаєсстасає асдссдааєс: садссстстаа тддсаєссаста тессдсдаає асаасаааат 3960 тсасссаасс асттадасаа єстаадатає хстсадесд стастасдад саатдстст 4020 65 сстттасата стасасастата кдсдсдсдсд касдєуєоєд касова каса 4080 тІсадсаддає адаєсссстад дададддсда аасдссатаєт дасастссаса тетасааєтта 4140 70 таасаддаад стассааадсд ссссстаааа аааааааєссо стсссаттад тодатоасдадаа 4200 адсстаєссд сссастасстс сасааасасі ааастаєссада аатасссаса астдтуєсса 4260 адсстаадаад сдааааасдд сассесастає стстасааєтс ссдссудєдад ассдаасата 4320 теЕссстатує ссасатдаєса сстдастаєьсс стаєсстстуд аастатасдє татсдасстт 4380 састтаєстес сстсасддає сасдсдсаді ссдсдсаде дестсаєсда ссадссаддад 4440 стассстасає ассаддааса стаасстсст деістстасатд статдасддсає сдаєссадета 4500 т ассаєсссудсд адсссасдєс кусасасааа даєссададад дсадсаадад ддаааастта 4560 сстСтт ст ассаааднсї дсааасасає дсасаасада ададададаа аасаєссаата 4620 аасдссдааа сааадсасаа асстсстассс састастсса асастаааста сааааддада 4680 дсдастсеес тессасдстуд астсссатат хссссатдсес таааасадсд сстадсасад 4740 аададдсасе сааєссадтдє ссдппипппп пппппппппп. ппиппппппп. пппппппппп 4800 7 ппааасдаад аасадааєстї аддсадастас сстадаадад тдастаєсдад ссасссатда 4860 тсттддасасд аассадссаа акссадсесе стссссттсс састссссас таттадсада 4920 асаасстуєє хтассдадада асадаєссає аасссадаасє аададдддса даададдада 4980 тЕстдаадда сддсасстда аддаддаста дсасддсстда дастадсдаад тддаадсст 5040 ддааадссаа адддсаадає дааадсаєсє адссдсаддд ддааааадса ссдасаддет 5100 т ддааасдсаа аадссадаєт стссттдсес сдаааєсосуд сасадддсад деестастад 5160 дсасдссаса асдсадаааа аасаєсдааасє адссдададд аасссддсда аасаєстаєст 5220 тсстддсесс теЕстдадсда дсадаєсьсе сссадддсст дсаастастаа хтаааєтстдаа 5280 асткстсаєс ттсттадсаас сте ессаст таадессатд хтддстдєдад саасддаатд 5340 ааддсаєсда астссстаєс ссстдстддд есссасаає тасаадссаа ссасдастда 5400 т тсассадаад астасстссаа стадаассас саадссссає аатдссатає тдатодатоасета 5460 ассассаадсі ааадсадест кс сдсд ес сссатаа стадсасаєс ссадааадатє 5520 даддасаєссє дстдеєсссста сасссасдає стастддсає ссдстдаастуд дсаадасасс 5580 ааасссттсс аттаддест асассссааа тасстстстаасс асдадсссаа аастаааатад 5640 асаасссааа асдсаєсдсаа ке сстстаста дададаастає ссестссте стистаст 5700 " асасаасдас ааадесттсс сстдсесса сасааєсдата аадстсссту хтассаєстота 5760 тааааасаса дадаасастад асаааєссдаа адасасаааа саасстаєта сссатттссс 5820 адддєсаастї астдааааста сстддддааа тддсстдсає дсасасаєсь асттдсди 5880 теЕссаасаад дссаддаєст есаассттє саастсттддає хтдстстасда сатдсесттс 5940 стдаєсдадаа тассстаадд аадааєсдса ддасасаєсдд аааасдєсад ддсаасасад 6000 о тастддсасс ассстдсддеі сстесстдаа стссатасса асдатасттст сдссадаааа 6060 стдаєссаааа десссадддаа дсааааадад асдссадаасє стассаєссс стстатдсад 6120 65 даадсааата ддсдессаді саааддасає сстддуддаєтд сстасаєдаа ассаадтстс 6180 стддесдсаа дсастссаєс кссатасаає асссстасад таасасасдє ссасаааєттад 6240 70 тадддадасаас стдстадсе аасссстаєсса єсстоастає дддасастає дестстасат 6300 дадасастаді дісссаааас ахстассссаад сссаєстддає аааастаєсдста сссадсаадс 6360 тсттааатає аасдасааса саастдасса дасааддсда ссстааатд статдссаас 6420 тсстасааасд сестдаддаа сеЕстссстт хСстддааддет асстстестт стттттадса 6480 т2састудєса сддаессссаа ддасстатаї дсддасададі асддсадсаа тасдасааєтт 6540 даасдсааає схсссадсада аааасааєсса дасстдасеє састаастдє стассдддаа 6600 т асддаддаса адаасаєсає ссааєсссусд сасддададда аадасстдаа ддессадсат 6660 адсаастаса дасададддс ссадстдєсуд ааддассадс хстссстддау ааасдстдса 6720 стссддаєса садасдсдаа ассдсаддає дсадддаєє ассдстдсає даєсадстат 6780 ддасдасдссд астасаадсуд даєссассуєд ааадссаастуд дсаадааєса стсасадаєда 6840 даддсестдає стсстасадаа аасастаєссї аадсдсєсдаа дастесеесає ксттатсаадсе 6900 7 ссастасттає тссааасад аасадсастад кстстссато саєсссаєсса дессасдаат 6960 тсасссасує аадсстссаа стадсаєьсс ссдадсасстї асасдатаді сассаддааатє 7020 ссададасаа сасададсса тдєсстасдуд тасдсасаді ссессааааа саасттсстад 7080 тстесастте тетасстасаа асдсаасаса тахтсасттдса аадааєссад ахкастатдда 7140 ададаєсааа тдаассдсаа аадсдіссст сстссстсса ссастатєстс ссатсдадата 7200 т ассаададас астссаадад адсаассаєс асстдсдсдЕ ссстссадаа ссттеетат 7260 тсаастасса стесесеттастт стастаддаєс хтуаєсадеесе сстеЕствда дсстстстат 7320 ассааасдсї аасааасата сссадаєсаа ассссастді ааддессата стаааааада 7380 стЕсдаадессї ссстасдаад асаааааата ассастаєсаа дсдсаааада асттасст 7440 ссадсасаді асааастата стсастдддс астастасссає ссттдааааєс татсастсдата 7500 т тоасстсддоа даассдаада ддаастадда дсдесаассс стдддааста асссасадает 7560 асдссаєссад дсесасстсдад сссдаадееєї сдасуєсадса стадсстааді аааддаааас 7620 асстстадстс ссатсдссда деЕсссасада ассдададсс даааддаєсс саддсаддад 7680 сдасстаассс ааастсссас ааадаасааа аассссссад аддаєстсст дессатсатат 7740 теЕсстдсаді ддсасссстуд хсатасссса саатддсаєс сстдссаєсте ддастсссся 7800 " тссатассст деЕсдаааєста стссстаата дсаадстдаа асстдсссст стадстасад 7860 теЕстдддааєт асксстсаєьтсс састдаєдасс те таатаєто сдастадаає стааатсатс 7920 ссссттддса кесссасссс туддастааст ассаєсааєс хтдадддсетаа саасасаадсе 7980 адааааадсс хтасастсуєс ассдаєсасі даєсааєдає саассаасда ссастдатаа 8040 тТстасааассс ааааасаааа ссатдастаддд ассаададаа асдасаєссаде сетатаєтає 8100 о асктстддес сстдаєсстуд дсісааасаа стдстастаєс дссаадаада тассасттає 8160 ааадсадаєс саассессає сасаєсстсстас сасдєдсеес тссаєсссасдуд дсаєссстта 8220 65 адасдєсдаєд деЕссасастє ссадеееесс тссадсссає садсааастає саддсаєста 8280 стдсдеЕссса адасаєсааа даааєссаєса сдастстадсс ссассаасад саєстсдстада 8340 70 тстдддатдда аааадаадад стасааєссстуд дсадссадда адааддстдс асааадтсата 8400 адеестдсе хссааадаад асстстсаєс адсстдсадд дадсдсасад ддаддддаса 8460 дстдессттуд хадсадсааа дддаеессаєсс саддесаєст дддсессата атассссттад 8520 тасасстдса дЕстссттд ссатддаєса асасаастада ааассессса асастдатад 8580 теЕстЕсссаад дддададсся ссадддадса аадсаааєсда ссаассадді ссдаддассе 8640 дасссдасаа ссссаєссссд сассссааає стадссаассо дсаєсестаді сссаатссат 8700 т сттдаєсаєссс дсадасадсд десссдддає сдадесдадс тастассаааа дсстсдаасся 8760 тстдсастта даасппппаа ддсаассасс аадсттсаст тдсастдадда саататстсс 8820 аасддааасд аддсадссдуд стстдсадаад сттсссааст садддаадса даастсстда 8880 деіесасстсса хтасдсааата ассссасаді астдстдесд аастесастс сссассасад 8940 сааасдсдсд дсаасасадс єстдссасад дадесессасспи ппппссастдд даєссесааад 9000 7 дсдааасаєі ссаааастда аасссдааад аасссадес сддаєссаст саастаєсат 9060 дассастсстд ддєдаєсаєсд сассттссає дессдсдаді ссааастасса дассстсада 9120 сстстаастт ссаастаааа дгдеееесст ссааєсастд ппиппипипппп. пппипиппиппп 9180 пппппппппп пппппппппп. пппппппппп. пипипппппп. ппипппппппп. пппппппппп 9240 пппппппппп пппппппппп пппппппппп. пипипппппп. ппипппппппп. пппстассат 9300 т тссссассаа ссссасстт ссссаааатт сссадссста єстпппппає ее стттаа 9360 тсастдаасс таасадсадд даааасдааа тдсесастса дасетесадд ассттсаатд 9420 адаєсдаддса дссдааадає сааадсадес дсасадессає сссадсааад стастесддах 9480 сдсасддасс адаєсаастуд стдусаєсссс ссассаассс сатстттссс сааааєттссс 9540 адссстасс аадсдеєстс туасадсаєсе асстстаєст адсасаєсдсє дсадсататс 9600 т аксассатаст сеестаєст дессаєссдєс кстстсстсс тадаасастаа астссасаад 9660 сасададаєс хдддєстдс сессаасаєс десудсаєссс садддсесда сдсааадсад 9720 адсддсадса сдасаааадс асасаааааа тасстстуєсда дсесаасдаає дааєсдастсс 9780 стісааастадд ассадсстаа аассстуддааа сасдаасада сттдуддастата сдааааєстьп 9840 пппппппппп пппипипппппп. пппппппппп. пиппстсСтаа аддадсасасі даадсадсад 9900 " тадсаааадд аддаддадда даадсадссс хдстастаст астассдаде астастаппп 9960 ппппипипиппп пппстасаас тассдадстас тастасааєстї адсасттаст тассстдатде 10020 десаддесст дсастдааса сстдсстаа асстадесссає ссстсстдоу ааасдастст 10080 дсддадсадд хдстссаєсса кудсаадаєда дсаєссьесса састесасту кстстдааат 10140 стдадсасає стсссаасда куддаасстсє даєссссаєда саадсддсає таєссссатт 10200 о тсааддаєда ддааассддда дЕссааадаа ассаадсаає ссдсссааат хсасстадсс 10260 тсдсаааєсда сааадстаді єстааассса адсадаєсдд сстстдаадсс хдадссстта 10320 65 асаассастт ассдсстдста сетдсасстс тадсдсасді ассаадесає асассдаст 10380 саааастаєс асдасстте стсдаєсссд ассуєссаає ассадсасад тдДеєсстппиппп 10440 70 ппппиппипппп ппдадестодсС ааааааасссї дастастсас стсаєстаса ааасаєсеета 10500 аастстдсудаєтд єстдсдсадд сасаєссуєд сдсаассаста ааааассстас тасстаєтаа 10560 тасасаддаєє дсассдсаад аааааєссдсс асссдаад адпсаааааа ддассдаататх 10620 тассадеесс асстддсєса асстаастада саєссстдсаса аааасадаса кетсаадада 10680 асдааасааа аасссаасаа асаасаєссє саасеесестас таассуєдас дсессастат 10740 тассадсстаа тасдссаадд сасдастатас сттаддаєда аасстаєссає таасаааддс 10800 т ддасадсудсєс аасаасстсд аддаєєсдєди есе сасає аасастдєсда ддаєстаатта 10860 адсастсаасє стусєссасаас стсатасаді сдссаасаас аадсдссаст стдстаєе 10920 ссІСТДЯДІЦЄ дсдсесдаає сассадсаєс асстесааєс стсадеесст ссдсддаааа 10980 сЕсетесаапи пипипипипи ппиппиппаада тададістадес адссааааєс адасаадада 11040 асстдаааає ссасаастас сссааадсаа сссастсата адаастаєса сеестокає 11100 7 тстддпппппп ппипппппппп писеЕсссадеі десессастд дсадсдаєсе сассдатота 11160 ддадсаєсаа аасаєссаста ассасстсаєс ссадееесдсє ссдаєсстад стасестота 11220 тТсаастстсда адаааєссаса ссасадаєст ассдстдаєсс соаддсааадда аатддададе 11280 тааддссста дассаєсаді ддаєссасдсстд тадсаєсадд адсааааааа адаєтататс 11340 аасаааасаа даасасдсса асдсасссді аасадаєсааа сасдаасааа дсесттатдс 11400 т тасасадаєд састдаасаа сстастадаа ссдісадсаа асддсаєстє аатсстпааа 11460 адддесссаа ассааєсдаєс стаааассдаа ссааасттес тссстсдадс асааєтаєт 11520 аадсдаєссса сстаааасадс садсаєссаа аадсстстаааа тасаадсаєс асаатдсдає 11580 ассстадата дассссадаа сададааадд асассаддда аааассддад даасддаата 11640 аассасдсад сссадессаєс аасаасдсрас стаасдісстс адссаєсдасс астдсассат 11700 т ддасааадсаа дасасстааса асададдааа ссдддасаадд ддасасаєсдса асестатаст 11760 асстсттдсаа ес сдса аасссаааас сстаааата аадаасааає ссдаасаєтта 11820 аааадсдусд ссаддаасає дсассастдс ссасадаєда аасадсаєсдає асессесатат 11880 стаасьсстуд ассасстдудсес ссаааєссада ааадсдаасд асасаєсаад ассаддеЕее 11940 стдеЕссаста аасааадссї аадаааасаа адсастассад стддададає єсасдестат 12000 " ааадасадає ссасаасаас аааасаааає асссаадаасє ааасссаада адааасадда 12060 састасдсраа ааадсасадс астстсассда дааасастатуд аааасстдаа сасатдддада 12120 даддсаєтє асасссдаасє адааадаєсд стддєєсааа дасаастстс ткттааат 12180 теЕстдсєсада аасссаадад дсасаададс адсесстдсса сасддатата ссасатадтад 12240 дсдаадсстуд ддаєессаді дсаааєсаає стстасаєсє тдасєссдадсс саатсааатдче 12300 о ассаасаєда сс стасадс аадасадсса сесстаєсстаа сссааастту ксссааст 12360 даасстдаасі даддсададс стадсаддсді хссссастдс хдаддсаєст даасаєсаад 12420 65 сдсасссстс тдадаассад сстдсаєсда ксстстсст аатудсадаса дсаєссаадст 12480 асасаєстад сстдсдстс адсаааадсс стдастестє сстдсетатд ксстадстсс 12540 70 асасаасааа ассаассааа даастсссддасє сдассдаєсса дсесасстстуд аасасдааст 12600 аасасдєсад дседадддсес ассссааддс сдаадссаєс сддасаадса дсдассаєтса 12660 адссстдаді ддсаадасса ссассассаа тІссаадада даддадаадс сеесааатдчи 12720 дассадсаса стдадаасса асасаасадс таасдадаєсє ссстастдса кеестаддад 12780 ассадасєссї даддаааасс асасадссда асстддісаєс ссаддасааста ссстдаатдче 12840 дессаєсстааа асасдісстаа састдісссс тадсасстад тасдасдєст дсстассата 12900 т діесасссаді деЕсстдссдаа саааєсдааєі аасдаасаас астастаєсса саааасдсатх 12960 сстаастссст састтссасі сасссааасс ахтасстуєсас ссаасаааса тссассааат 13020 аскссаєссдаа хтасдсесетс дісссастдса стдсадсаст саєсссдасас асатадаата 13080 асаадассса суєссасасі сттсаддааа садасааааа асааасдаас ааасаааааа 13140 саддсаассс аасассасдс дддааасдсс сссасассає дсдуддааасс тддодддаата 13200 7 сстдададда асасссааєсї саддссастдс сссаддааєс саааєсстдд сасаєсадад 13260 ссдсстсст сттастаддд еЕеЕстусддс аддааасааа тддаасдтає сеесстасст 13320 тасдссааас аддадддасс сетестсссс ткдсстстс ссааддстадеі стасаатату 13380 тсаасдстад садсстуєЄсс адсдсасада асаєсдадаст асасаєсссст адасаааєстад 13440 стасастсст дсдсдсесса стесстстдІ аддаєсасаа сстастдадс ааддеєтаєта 13500 т таддддасєсаа ассадсааса дсдсасдааа асдаєссдад ассадсдсст дсасааастс 13560 аастаєсстсс есстасстса стастстата даадсаддса ддасдддада сададестда 13620 таддаддссс адаасдсдаа адсаадсдад дсдадсдадс асдатаєьсс асасааасас 13680 ааадасассс сдадаададс ксстсастстп ссссдссссс аатадатуєс дасаддаааа 13740 тассасдстас тісадсаааа асадстдааа аасстадасає аааадссаає саасаддааа 13800 т адасаассса ддасддаесєті дсдаасадаа ададдааааа ааавадсссад ааааєсдасда 13860 ддасдсест астдддасає дадссстсад дсасссаастї ддасеессада аааадстада 13920 стадсдддєє сстдссассі аааадстуєс ссасдасаас стасттдєсд ддасддсстас 13980 адсаастсас сстаастдсдс сдадестде єссспппппп ппипипипппп. пппипппипи 14040 пппппппппа тасстаастс атааадєтудс сстдааастд ааасааааса тахстасдааса 14100 " ддасаєссдсаа астдсааднї асддааааад стддстдетд ссдсдЕстс ааадстесас 14160 стадасадеє ададаєсддає сасддуаєстс адсуддададс сдадссаддс аддадстдас 14220 таадддсаад аддсдддаає садсаасстс сдаасаєстд тдсдссатдд дасссстет 14280 ссісстдсасї ддсассссад асааддадсс тадсаадада стастаасдас стдстуаєсса 14340 дадаєсдеєса аастдсадад ааадасаада саасаадсає тддсстссаа ссасдаєдас 14400 о адасададда ддасдддадсе сстстадсаді дскддаєсдає сеессатдес стастоасдадад 14460 ссаєсстстдс сатдсастдс аддссасстаа стсстатаєс ааааааєсдса ададдддпппи 14520 65 ппппипппппп пппппппппп пппппппппп. ппипппппппп. пппппппппп. ппппппИпппп 14580 ппппписсада аассстдсаас садсстддсс аасасаддсда асстстдсст стастааааа 14640 70 тасааааасї адссадатдає дасддсдсдс асссдсааєс ссадстасппи пппппппппа 14700 ддсасдппппи пппппипппи ппипипипппи. ппипипипппи. пппипипипи. ппипипппппп 14760 пппппппадс ахтдддсааса дадааадаст сттдсстсааа аасааасааа ааасааатаа 14820 асааасааає ааасаапппи пппппипипи пппипипипи пппппсастс аатастдадсе 14880 адссастсса хтдсддсастд сдсстаадсас асстасаааасє астадсстса саадааатди 14940 ассадсаєсє дсассссдса састддєстаа дсасстсдсес саадасстса ааастддета 15000 т аддддсадса даассстаасс ссадсдсесас сттсааад сстдддсеес ттсасасетст 15060 ссасдстудєс сссасстсстаа садаєдсаєс ссдссаєссс адссастсаа астттддсат 15120 тсаадаааає тассстааад стааастааа стссааддає дастаєсстс стсатдассс 15180 сттсссаєсса ааасстсаєс ктсадссаді стдеєсекдє сс сеессадаас 15240 тасстстддс дсттсстсса аасдааадда стсасттддає аассстддда дссасст 15300 7 тастссттдд тдасадсастуд асаєссаєст стасстстаад ааааддсаде асксстессттаа 15360 тсдсадсддає сессастдда дасдаддадда дддаєдадаає хтддассдаєс ахсддстодсаа 15420 ддааасстда стсаасстсї дсадддсддс дсаааддсає кссастаєіс аасадсааєтт 15480 асассдаадс хтдсасдддає састддаєда адасдддадєд саадддаєда додасаддад 15540 аасдддсастд дасддаддса даадаєдсад тдссасасаа ее еста ссатсдаааат 15600 т аассасадас стастдсааа дааддадсса ааасдсстдє саєссессаде тдсаєсетад 15660 теЕстдсаєта деЕсдсассса дстддест дддаєассста аспппппппп пипипппппп 15720 ппппипиппп пппппппппп пссастададт асстсодасааа ассассддса даддаєсдсас 15780 асаасссдса хкдсдексст кстссаєттста сстусдддаа саасстаааає ссаддаааатх 15840 дадсасаєсс ааасаасссс стсссастста сдасдаєсса дадсааасаа сссстстдат 15900 т астстададаа дсасассаад адаєссадсд ассудсасада детдаєстдає дссааатада 15960 даадсадаасє асддааддда ссссаастаді сдссдааааа стсссссасаа ссссттасат 16020 дадддааадсі ддаєдеєсаасі дадасадсад адасаадстуд ссассааааа ттасдеесе 16080 аасаддаєсд адасадссад аасасаадда ссаадсссса асдасадсаа дассстдада 16140 тасадессдає ссдсасааад ааасаастує скдссадсетд састтстдаає асстсестад 16200 " ааааададає садссддсад садаааєсдаа стадаааєссаа стадасаєсаа аасасстсад 16260 аасссдаєсс асстістдудда ааадаєдааа аасаааадсд сахтадссстс аадаааатст 16320 дддассаааа дсасдддсст тассстаєсуд аасстаассаа сстсадаадс: тдддаастдчи 16380 ддаасаадда худессассад астссстадд даєсасааає деессасада асесдааатт 16440 тааасесддд ссастдстасд ддаєсдастадад стдідстата тддааастааа аасдаєссться 16500 о тЕрлстсаад ддадааєсдає ддасаєсдааа ааатдтддса єссдадсстас ааастсааад 16560 аадсаасдсд дсаадаасає садааддаасє сдддаадсад ааддсааадд ааасааааад 16620 65 стааадсаасє аасааадада аасссаєстад ссасааєстс стстсстт ааадаатдст 16680 ддаєксссст тудсстсасаа стаастасаад аасттстсса ссасстсадд ааасссадда 16740 70 асддсестсса ададсадада дсадддадса дсістусдда дададдадад дадсадддаа 16800 ддадааддад ссадсеестс етдстаасс тадастдссстд сассстадса дстссстдса 16860 дсаддддаса аддесєсдасєсї аддасддаєдуд асаассааєс даєссстааааАА састдсадсах 16920 садсаєссдса стассдсааса стасдссаас тдсдссасдс асддасаєстс астсттаатссс 16980 ссассссітуд ссаєтстассаа ааадададад адааааасас тадаассаєс стсаєтетас 17040 адсададааа асададддес аадаадасаа адсааадсдс ссаадаасас асаастдатс 17100 т асааасаєса адстсддддає ссассадссї аассасадас ссттастстс аасссатста 17160 стссаассса тс тдстаса аасдуєссаса стастасдсад ддсадаааад кстсасссад 17220 теисассдаас таадаадааа десастаєссаа ддастасстаат се стаає адасадссадаа 17280 ассааастта асаасдадсс саадсссааа дсадустаасє стаастсдаса адсссаддса 17340 адссссаєсс хасддсстЯдс адсаєсаєст дсдсдсааа дсстаадсадс ааасдетаєтт 17400 7 тдпппппиппп пппппдодєса хсстддадоад ааадссаєсс сааєсттдстс аадастдада 17460 ддаєеессад дасаєссасдс ааддасааєссї дддсасааасє асаасстусе ссетстстс 17520 ассссааасс тассаєссстає сасстсадса астаєсдадес асдеєсесста ссадастсст 17580 тассастесе сссссадасс дстссссатуд ааастаатстає астастстаєса стстссадає 17640 асасааєссдуд аддадасдса асссадсаєсї ддаасесстуд ассттсаадс адддаєсстс 17700 т адсстдасдає єссдддадаєс десадддастд адсаєдасса даддаасдаа тдддсссдта 17760 ддасдсаєсдс адсасдддасє ссааааддсес саадсастда ааасддаасс тддсдааадс 17820 ададдаддад аасдаадааа аасддадесд аасадддадс дсддадддад асстсдатас 17880 теЕссааатдс стдаддддсї сассддсдса тдсдасаддд адаааддата сттстдааса 17940 аддадсстсс аадсаааєсса кссастдстс асстстаддаа аасдддаєєда даасссстаа 18000 т теЕсдадддаєс адсесстдса даадсдссст тдсстссас хсаатдестс аастсттаєт 18060 стдсадасдасі дадддауєссса дсдесддаас адсаєссасд сасдадаєсь ксстасетат 18120 теЕсдадсстд сдаддаєсесс тоассасдда адсасдаєсод сдаасдаєсь сетстсдаада 18180 тасаєссуєсад стадасдсєсас аасстсстуєсд ссааастааа сттдастдстє аатсдасттас 18240 тсасаєстад стаааасаєсдд адсаєссдса аддасдасстдд єстсстстає аастасаадсе 18300 " асасаєссдда адсасааада ссааассуєс даєсссдсаса ддаєсдессасс тттаєсстаас 18360 ссассаасас хстдаєсдас сстаассттає сстсадасст саадсудєсту сдсадсасст 18420 деісссастта аасассадссї стасааєссає дсдудсассає асасасатаа хстсстттса 18480 тсдстдсаас сассстдєсд сдаєсдассас хтастаєсеста сссаттдстас адстдаддаа 18540 дсааасадає саадсаассї дссаааасса дсааасадса дадсісадас сдссасссас 18600 о тасссттетста саасасааєс тасадстата кестастеста адсааєстсає стсастссаааа 18660 сссастттаєі аадсдссстї дсаасаєсаа ссастдсрасс аддсаєсдаа сстасадата 18720 65 тдадсаадад ааадсасстуд хсстІсаадда дсетддадса саасааддад ассаасаада 18780 ааасасаєса сстасааєста дсессадсуєс асадсасаад даєсдаєсдсда ддадаааадс 18840 70 тдадсадсдє сдссаададда аддааасадд ссаастдсддає стададдасаде сдаатсдтасть 18900 тааасаєстї аасаассааа дсаасстссса сстасааада даадссадста сттаааатаа 18960 ссстдааааа саасастдда асссстс тадсаєсата сстаєсссту асттдссе 19020 дссатасаасє стаасдсстуд сссасасаді дестсдастаєє дессаасаде сєстдесе 19080 стасссаатуд стассааєсс сааасссата ссттессатд апппппипипипи пппппдатсс 19140 сасддададає ддассдаааа кстссасттс ассстссаад ссаттсаадеі ссссттсса 19200 т даадсаастуд стастдссеє стасссастає дессесстаа адасадеста сасстддааа 19260 тасасдссаа аадсастатає сестаааєсь єсессстаа асадсаасас астататадтс 19320 тастдтдсас тесдстаєсе стасссаєсд хтадсдєсест татдсадсад ахсддаатдаа 19380 теЕсдаадссс ссаааддсса ддасасатдс стестетЯдс стаадстає стттсссата 19440 дсетессата асстстссата сдаєссадса сасдєсааає асдсдсстаса хтахсасаєтта 19500 7 дасаассадс асстдссаад сасссдсест аддассдаді ссддаєссає дессдсесаа 19560 ааддадассс асдддсестс садддсдсас сдадесааєс тадссстааа аадсаассет 19620 ассассаастї стдсасдаса даассатаєс тддаасесеє дессестдсе сстдесаад 19680 тасааастсс астесдаєтдс кдсастсдса ааассасаєть єссттстда ааастссаде 19740 адсудсасстс дастдстаді стассстдсдс садаааадсс ксасттсдтд кдстсдаасс 19800 т стстаасдсес ассадстуєс ассастасас аддсстсста ададдсессс тоададдеее 19860 дадаєсссада стдссстдада даєссссадад сексстессс стсттддсса саєссстддата 19920 тсадсдасаа ддаасасстї сдстттдсса сссдІсаадд ссдаадааас адсдустсса 19980 асададстсс тдсдесаєс куєссдсаса тадасдсаєссуд сасадсааєс косдсдасад 20040 тасстстуєЄ дсдаассаса ддсаадааст дсддстдадс ааддсасата дестастсад 20100 т тстастесста астсстсстт стддсассдоа ассстдсаадд састттаєсс сттттасстс 20160 асдесссаєс дсааасддса стаддсадада сдасаєстаа ссстдсаєтє даєсдссаст 20220 теЕстдтасст дсаєтаассо аасаааастає ссттаєссттає єстдссастє ддсасассад 20280 сасдєссась ссстстудєсса сстдсдесс сасаааасдс ссадессаас ассссдасда 20340 «210» 4 «211» 20641 «212» ДНК «2135 ти5 ти5си1и5 «А00» 4 дсстсаєдсс аддстдсаст кдсасдісдс дддссадест сстсдсстдс аддсааддда 60 дсасстестс дсддааєссд сттдсадддс астстааада дссадааєсс стадассттє 120 тсаддасдда даадддаасс ддеєесстдуд дааадссаад аастсадаат ссдсадее 180 о дедсадаесас ддаєсттдсд дасаддсадс хтдддісадаа дадаєсдааєє аастдаєсся 240 адсадсдастї дастдеєтодс тадсаастдас хдадестсес сасесдаадс аєстссддад 300 65 аксссттссе стдусдаддає стаддаєдсе ддадсектаад акттссаєсєс тасстдссса 360 дадаасстаа аддаєьсссд даадааааєсуд єсссааасад ссстстадата садсдасста 420 70 ддстаєдеєта аадсстадає єадддаєсасс ахсаададдасд ааадсасаах аксстаєсеє 480 тЕсстстааааа тааастаєса саддасдсесе сстасдааєс асттадссад ета 540 асктдстатаєт сссаєтдтдс хаддаеєсаєса аадддсаєса стстсссаст даддаасдса 600 саддаєсадса асадсдсстї астадсссад єсаєссастд ассаєстовд тахєдсдастад 660 тстддаастає ддстаддсає сесасстсада стааастстта тастдстатаад тасттсатта 720 тасесдадід сстдаааддс стетдсдсад аааааааааа аасаасаасс сдадаатаса 780 т тІссадааад тасссдсадс сдаєдаєдає адсдассаад сддідеєсаа ддадаастт 840 асасадддаа аасастсасс тЕсссадсі дадсаєсаста дасаддаада саєдастадта 900 десасаєдст дсестаадда дддасддада адддаєддає єсдадсасад ддаессаддає 960 саєсссдасад аасссдаааа стдддасааає кессастстс ссдадааадд аадсесдсат 1020 сЕдстЕсСссс хссссдсссс аддсастстє ссссссссса хссссссссду хдсссссссс 1080 7 ссссасддда адасааадаа дсддсуєссс аадаєстсса сстддастс ссстдуддаса 1140 аасстаєттсс сссасстсда асдадсдіса сткстттаст ссааасестуд ссстдсдааа 1200 ддстстсадс ста сстду даасссдсда ааддессасад ст сдссд даддададдда 1260 дааддсдасс стддастстї адсссаєсдса ададдсдсад десссададду саааддссатє 1320 дседаєсссас асддєссстуд аасстсссст тсесдаєстас тдстсасасс тдсассстда 1380 т дадссаддда ддддаддаста єдасастдаа дааддсдасе ассадассса асссатсасс 1440 теЕссадастє тастастаадс стааадсад асссасаадс аатадастаас тдстессааст 1500 дадсстдсса хсаасдсадд аааааєссадд стасадссесс адсдуддастаєс асдсасстса 1560 тсдсдастує стадсастсд дсттддссає єсстсссадд дсстсаттдс аасадссаст 1620 дсдссстсас аддсстддає десаєсстдс стсаєстудсс тдддсадатд аастддадад 1680 т асасдаєссаа саасдадсса єесдаєсссстд сс оєЄ ааасдесстє дасстдаєє 1740 ддаєстдєсста сессстаєсє кустдссуєє дестдєесею астетесатдс стат 1800 дЕссдадаса дадсстсаст асдсадссса ддастадсстс тссссссадеі стстсадата 1860 стдасстдсаєс хдссстс таасаєсаасї даєссасаасє аассадсаад ааддстатсда 1920 ссттаасаді саааасааді аассаддсаа сстассдадад стааасаєто асстсааасаа 1980 " ассаадссдс асссаад аассдаасдд ддддаєстаа ааадсаасду ссдсдстдса 2040 сааадаєсдса дсддсаєсад ссдссатаді сессстссст адасссдсад асстссттад 2100 ддааасстає аасссаадсс тааастсддда сстддсасас аастддсасо сдсссаааса 2160 тсддссаадс асасасатаєт стдсдастсї дааааааддд асаасасата асадсааадд 2220 сдстссасає саддддсестд ссааасасаа дастстдддда аасстасдсса саассттаса 2280 о теЕстааааає ддстасстаса тдсдсдадас аасддддасті ддададатас стсададдта 2340 стаддсасас ахтахтддсаад садаєдсаса адсаддсааа асаєсстстаа аааасааааа 2400 65 саааасссса ааасадаєсь стесстатає стасстстасастд ддасестдсс тодсдсдсаса 2460 сстдааддас ададдададс ассаддессс ахсаддасдуаєс ддаєсдсаадс хтассататад 2520 70 тстдстаддаа сстааасссад дасетсттддса ададсадсса дсастсттаа сстстдадсс 2580 асссстссад хсссадасаа аасастстста сасасаааає ааассаасст стаааадтдие 2640 ададдаааає ддссдаасад ааастаєссда садасасдсс дададсддаєс ассдетстс 2700 садсстстддса стддсдадасдс худасаддсесає стсадсдеєст дссассесда дасдддасадаа 2760 ддаддсдадад ддддддаадд сддсадддса дадістсддс адсаєстсддода дсстстаєе 2820 сассасаєса дсаасадстс ксстсдісс саадсаадст ссддсаасса аасааатата 2880 т тІсадссааса сстассааасд діссстадад дадаасдатдас асаастдсдсс тасаттсаєт 2940 тсстасаасаа сассаасааї асссаассаєї ааааасааас тдааастддіс астстасстс 3000 адсдасаасд хстдадсссс дЕсссадддає ссстсасаад ааасссдата ддасдсаасда 3060 тесастсюсс стаасаадса ааасдаєсає ссастсаєсї дааааєссдда сасасасаса 3120 ааааааєсдаа дааааааєст дстаєстесає стстсстте стаєсстсте ссстттаааа 3180 7 ааадсасааа сдсдддсстаа ададаєсддсес садсадесаа дадсастддс тадстстсса 3240 даддсассда деіссааастуд сассаассас ахтддсддсес асаассаєст дсаатдддах 3300 стдасдсесст сттстддасЯдє дсстададас адсдасадсуд стасссасата сасаааатаа 3360 дсаааааааа аааааасааа ас аадсасааас дсдсаадаас ттасстдест 3420 тссстатааа адссасааєт асстттдсад асаассастуд хсаддсадсд стесаадад 3480 т аадсддадеє деЕсстасдас асаадаастає есте ссає асастассст стаадстсся 3540 тсстасттст стдсааассс атсссстудсд сасатастда аасстаєтссд хсасадтате 3600 тсдадсастас асадссаєсс деісасддастає сссдадсаста сасадестета ссадстаата 3660 сасдддастає сссаадестуд ддастдаєсоас сддстдаєдаєс асстстуєса сатаєдасет 3720 аксасссста адаєдааєссї ссаадасадд аасададада ссастасдаса сдсасадета 3780 т аадесссаад адаєсасааа ассдасстсс аадаадсстає асаасссєсас асссттсса 3840 ддаааддуіса адаааєссстї дсасстсєсас таасдстасс тасдаддаді стдсаасте 3900 ддасададсад ааддуессааа сддсаєссаса даєсстссає ддасетестє ассдададсад 3960 тест тссдс теЕстаєссдає тассстссда дстатдсдад астстсаєтсс дЕсттсстс 4020 тдассдатдає асадесесест састдадесс ададдстадд асдсадаадс сдтсстсдІс 4080 " адстсстасас ассттссада ссдасстдсда асдадсасас аддссадада дасддсаадд 4140 даадасстас хстсссаєсда асдістдсааа сасдсдааста асасадаадс адаааатута 4200 аастаєсстада стддсстддаа сдсадсдсес ассттсдадс ссастсст с адасассддх 4260 тесасддаад аасддсссст дестсссасс тдстдстса дсадсдсссс ааатадсдсс 4320 адаєсссадад дадасассса дсдеесдссуд адсдааєсад дааадсдес адсодаддад 4380 о асастадсає ссадасаєсс адасстсада дсаассдддс садасддаад ссесстсст 4440 тсссатадсе десассастд хтастадастс астддддааа адаєссаєса тдсддааатсад 4500 65 дсдсдаддса даддсдадає сссаасддиад аддаадсаєс даааадсдаа адсдаааатст 4560 ддасдсестє сдсссдаад стссдсстаа адсаддеєес адстессааа тасдестссаа 4620 70 тассдааада асдсаєсдаса састасддада дддасстдда ддадаєсст дастададаес 4680 даасдсасає саасааєстуд дддддссаає аастсаасді ааадссдстд ассссатсат 4740 астдасткст сссасттдуд єсстасаєсдуд стссдадесса саааасдааа дсассдаатт 4800 тсдаастдє садстдсдє сссасасттуд сааассддє дстддссадс сстсадаатт 4860 дсетссадесса садстуддстс деістдсест сссадастдд сттстадддс ссасдсатат 4920 асдадаадда сасаєстсаст адсуєстсст тдстстдста ссдаааєсаа дсадасстст 4980 т стадахдсссс суєстастада садсссссаа аасаєсдадда стасссдстдд саєстатаєтс 5040 асадсстудсї десастсдсс асддддєаад ссассаааєс теессадсдд деестататт 5100 тусаатаєсє стадстаєдаа сстааааасдд аадсаассса сдадасатає ахсасасдатде 5160 асасдасасає дсададддад дЕСстдсдсЯЄ асдсдсадеї дсстаддсаса сасааадсди 5220 тсатаддаса асстададсе хтадесстсас стестасстт дсстсдадаса адаєстстта 5280 7 теЕтастдтас асстдстдаді сстдастадесс ддстадстса даасстсста ддадстстсс 5340 тасстссасс тсссадссса стдадаєстує аддсасастдс хтастдсасст ддсесстасс 5400 тадесестдода ддаєссстдаас стдддаєссає дддстасаса дсаадссдєє тасттастад 5460 дсаассастс састсссстаа дасаассаста аддаасасас сттдсттаєс сааасасатт 5520 сесаєссстсс тттдссастаа асаадссаст хтддсааасає ассустаєсдсра ссестаатаа 5580 т асааасаааа ссттааааак ааасааааєі асссдсдаад асаааааааа саадетасе 5640 ддаааддасуд ааддааааста стддадсеес дадсдсдуаєс садсадсада асасттддст 5700 дасдсааааа аааадссста ддсдсаассс саасассада аасаааєтдаа ддаасдааса 5760 асаассдссс ссасссссса ддддаєдаає асааааастає саддсаасас адаастааса 5820 ддаєдаєссядє сєссстасдаа саастастда асаєтссссад ддаддасддес састсдатаат 5880 т аксассестсає сстассддеєс стссаааса адастдддаа статаєссаєст адсттдсатс 5940 ассассасса ссссссассс ссдссссатуд аадссаєссос ааадаадаає кстадсадєс 6000 асдсдаєссс стааасаааа сдасадсаас сттттассса дадасессада статоасстдда 6060 ддадест дістестдад ддстдудєсст сестссттс садсдеєстас тассасддси 6120 ссаааддасі хдсасдсддас ддадсасддсо адсаасдіса сдасддадсд садаєстссся 6180 " дсадаасддад адстддассї дсесдсдєса дсдураєдасасі даддаааадда адасдадсаа 6240 дсдасссаді ссдсддсадд ададдаддас стсаадсстс адсасадсаа стісадддадад 6300 ададсстсдс хдссааадда ссадсеессуд аадддааасд стдссстсса дассасадас 6360 діесаадстдс аддасдсадд сдсстастдс кдсасааєсса дстасддасдуд кодсддастас 6420 аадсдааєса сдстдааадс саасддсаад аасстасссту датддддаад дсессатссад 6480 о тасссаааас адстссстаа тдастдададс хсттсастст сдададсосд сасдсасттс 6540 тсасадааса асадсадсст адсстестсд стсдстдє сатьсдсд есасасаст 6600 65 тсассадсда аааадсстад састдатоасує ссдасадсаа сстдадаєсс адсассадає 6660 аасасссадс сасдстссдс адссадсасс асдаєстсдс аааддсдааа сдссадасах 6720 70 тд естта ссасааастдс аастастастаас асастасаста дасдстатада тасаастата 6780 таасастдсаа таадастастаа стасдсатата ссссатасаа сасаасдстає аатататаатє 6840 дсасаасаасє асасастаса асасасадтї асасдсасад ссасасаєсуд саєсссаєдатє 6900 аааавадсааа сасстддсає сссастессд саадсеееес даассастсуд сааататата 6960 тасасдсааа сатасатаса сасасастдєє єс тасаад таастсдаає десатддааа 7020 дааасадаасє сасаааааєсд кссстсстсс стаастасса ст сстаадс атааататас 7080 т адсаастаст асстдсрасає ссстссаєсда стттесдаєс ддаєссастдє ссасаєстаа 7140 тстассаддс сстадсасаєт тест есст тдаатасстс сатасаааає ссаататата 7200 тссасастата тасдсасаста стастадссаста ссатаєсата тассастасаа адсетстататє 7260 асдсасасає асасааасас асастаєсстас асасасастас асаєстестса сасататаса 7320 саасасасаа сдсасасдсд куасуаєуаєуаєд сасастасстс татаєстаєс тасстатста 7380 7 тстасстаєс тасстаєста єстасстаєс тасадстест астдстааддд хсастетета 7440 ааааассаад десаасстасє дааддаєдад аадсдаадає сстаадсдса даадаадссад 7500 тест сссаса дадасддсас аддстасасі садсаддсає дсаєссаєсе ссададдсста 7560 сасстстддад адсдссдадд аддаастатд адсусаадеї сстддудсаас дадссасада 7620 аасдссаєса ддєссстсда деіссасддаєє стдддаєсдда астаастаад ддааддаааа 7680 т сассттдста ассасссстуд стессастдс хтдддаєсдсає адасстдада дсессастса 7740 тІсдсадасді асасасадсс адсссадетуд сссассадда стддаааєсс ссааддсест 7800 сстстісаса хтасстсссас адсддсдесс стсдааєсад дессстсс кддсстасадаа 7860 ааастссасс ттдасдддаса стдадссдаа ссссдістс тссаддсада сдесдсадат 7920 ддаєстдсстуд стссттсу деЕссесатаа таасттстааа астасссддс хтадааєссада 7980 т тадестсстт сдассттес астсстааас тадсдсдаад сстсаастаєта тасатаддаа 8040 аааєсссасає хсстсасаад ддаєсасддс адсстаєссаас дсааєсттає дсададаєта 8100 ддааааасдс діссасссда садсссаєсса асддаєстос дасддасддає сдсттададс 8160 тсасдаадає дссасттдсс ттасстсддає дсеЕтоддсесе аасттссате асстттетаст 8220 тасаассстє састссдсдас астсаєсдааа ддадасссдд датасдаєтд ссаатасст 8280 " дадсадстдасє садсасаєса дсааасаєда дастсстдс сддасессаад ассестааад 8340 асаєссдсдаа дстддааддс саєсдадсаді сааадссдсї ддасстдддад састддаадд 8400 адстсааддс дадсадесад даадааддда дсаддадсаса адсстстасд асаададаєс 8460 тстсатддсе тассаддаді аддєдастстї ддасааддадда аасстасест адаєтатата 8520 стсадсдата хстстдастас сааадасаає сттттддадс дсасддсетес тссасдаада 8580 о дасстудєдає дсддсааадс хтддсасссаа дсадусесда аддсстдсес дастаєта 8640 теЕсісСттаса дааассаста сдссдатаєє стастсссад сссассттдс сатттдсата 8700 65 сасдестадссї ддєстаддсес аададсстда ассттддесд сддсетсаааєт стдсаатстс 8760 адстасдсдуд даадссдадд саддадааєс дсдсааєстад дасстстуєстуд адстасдаас 8820 70 асасадсадд їссаададса дсстдддсаа тетддсаада сссуєсстса аадасатаса 8880 тасастасата тасссддсаа дасссдІсІ сааадасата сатасатаса тасатетдас 8940 аадасссуєс сісааадаса стасастасатуд сасдсаєсдса стааасасатд хтасааатдаа 9000 тасааааєсса ааасаддаас аддассдадд асасдсссад сдаєсдсасад дассстаде 9060 тсадсесста дсассасдудє сдстддсастд саааадсесу ссасдссаад даадсадаас 9120 тсстдааєссс тдасдстасдс аааєсдастсс асадсаадду хссттсссат састасаадсе 9180 т дсасддсдаЄ даадсадссс тасадддаді ссастсдсса тдддаєесса ааддсдаатт 9240 ассссаааас тдаааєсстда аададсдсад сессддаєса астсадеееє тастасстст 9300 тсддасаасд сестасстсс аааддессас адаадассстї саддсаєсад дстетстаатт 9360 дааааасаєі садсессаає састдассос аастаєссадаа аадааєсдаад хтдхссаєтта 9420 дсадесстісуд дассдсадає ддсаєсаадс адсстдсаада аасасдссса ссасатаддєє 9480 7 саасаасстаа ддаєсдссає ддсдсасссуд астсссссадс ст сстааа сстсесстст 9540 дісаєстатуд сстаєсстаад асдсстсадс атассаєтдсе тасстдссест єссстстс 9600 тдаасасаад стстаддадді адддассссд дссадесеста ссастддасс татстадсст 9660 дасдсаєссасє дааддддсад сдсаасаада ааадаааасс дідо асддаатдахє 9720 тсаааааааа ассадсссаа аасдсасдсе асасдаасдд дсасдаасст ддадачась 9780 т адастдєссс тдсдадссуд хтаддаасесє сттуєестд кдасссасаді сстссдсадс 9840 тасдстсастд дЕсстссаса стдсстаас аасадсаддд дсадаєсдєта саастаасас 9900 тсасадааса сстдатастуає дададдаєстдає дссстдддсе сттдстсає асдаастсатє 9960 тесасстета асасаастстї хсдддадддада састтдссса тдассатадс ттасеесст 10020 тсстассдас тассттссаа ахссддаатдає діесесессст адасдасатс хсадаєтссаа 10080 т тассасасад састдстдсд сссаттстсса ддсассаааа асдсдаєссд сстаааттсс 10140 ассссдастаа аасстасдсад ссаддеєєсду аасссааста дсссасстст ааааасстатє 10200 дсссттсста дсстсдсе деЕсдсстдєс етутасстс тддадсддає ассааддаас 10260 адаасддсес сааасаєдає ссдаастсє сстддеЕес даєсасадса дсаасададс 10320 дЕсстадада саадссадад дессдаааас ааасадааст тдахсессдад дсдстатааа 10380 " сасдсдсудсд ассасааадд асасаєстдуд сдссаастадд тахтадсестає астасаадаа 10440 асддссаєсуд сдаадаєсад ааддадастаа стсастдаєс ссаддасдуаєс даєссаатст 10500 аасасаєдає асастссстдаа астдсасааа ааадасаєсс аааадаадаа асасасддаа 10560 сааададсає асддаааєссс сдасаассса даассадсдє асдссаадає даадессатд 10620 ассаасааас ддадаєсддес дсадссаєсс сдаадсестає сстадссаає дсестатссас 10680 о асссаастса ассттсадес сеееттс адасддаєсть ксссастт аастаасстт 10740 ассаєсдастад сссстадсаа ддсаєсдесст дасаєсстестє сестесес статадстта 10800 65 тастссте сесаааагаєт сесестастас атаєссессст саастасате хссаатодста 10860 тсссааааді сссссатасс стсстссссс астсссстас ссасссастс ссасттттта 10920 70 дссстдадає єсссстдсас тддддадасає ааадестдсд таєссаатдд дссесест 10980 ссадсдаєсдуд сстастаддс сассттссда сасасаєсдса дсесдадсса ададссссда 11040 ддасастддс адсссасаді деЕсудаєсссас стастадддчеє дсадаєссст ттадеЕсссе 11100 ддакасееес стадсесст ссастсдддад ссстдсдаєс сатссаатад стдастдсда 11160 дсаєсссастс стдасдссдс таддесссдуд ссаадсстса саададасад статессада 11220 дессттссад сатасдсесд стадсудусасд саасддсдес ассуєссдда ддастсааєтат 11280 т дддасддсес сстддасатуд дсадесеста аасддуессає ссттетдсст садстссааа 11340 сЕстЯКстст дсаастсстт ксаасстссд ет саастді ссдаааасда стддсаасди 11400 састдсттас асстссстт дсестусуаєс даассдєдад стесаєсстес дасєстддаде 11460 тЕсСтттаада адасстесдса асдасдсттає єсстааадає ддасдаассса астааадата 11520 дасаададдд асдддаєстдсє ассссаєсту дсададсдсє тасстдссає ссасдаадес 11580 7 стддессдає ссссддсаса дсасадаасс асасдсддасд дсаасссаді хтдсстдсдас 11640 сссадсастс аддадсстада ддсаддеєстас стссдастас асадсаадесї сааддстадс 11700 стддестаса хтдсаастстї ссІсаааддд аааасаааас ааааасадас аддадааєста 11760 дааасаєсса хтадааассса аастаєсдааєс аасадастсс сстстссста хтдассадасатє 11820 тсадасссад сдасадссудї сассдестстає даддсаєдас хдаєссестаса дассстадад 11880 т саадсудсдса саассстддє дЕсссстдсс тодсуєсстса сасасасдсет сассттадда 11940 асддаддсад сддаддеста дсесадссса дасдааєсса стсассадсс дсесассата 12000 дЕстестадд сдаадсадаа стстссттсс ассадсассс дсдаааааса ааадсдуддааа 12060 дсадасаєсє састссдаає дсесстассає сддсадсдає сссаааєсса аассастаатє 12120 тісссадаад аастаддіса сдддссатдє ддсассадас сстасттоасдд сдасаєтати 12180 т тсстдасдсрд сстасстсаас аасдсастадс ддасстсатєст тстастсааес аддесттсдаат 12240 дсдасаааста саадассддд саадсдуєєса ссааадстдє тасстсдааасє сдсаастсата 12300 сстастсттає сддасддсдеє сеЕесстсддає ссасддасаа ссааасасає тасддсеста 12360 сЕстдсстта дстастстдс дісаадессс тдасдаааата ссдсаєссаса дсдсесттат 12420 тасаєстсесд дсаасдааді адссасстаа дсссстаєсс тдадстстст ахкаддстсаст 12480 " ааадаасєсдсі аадссддата асдаєсдссуд аадааасада сахтуєстсає ссасаєсдад 12540 дсадааадас стдсддаєєсс таддсаасад кетастсаас стстадесдста сатстадєес 12600 дсасстсадса аасассстдада хтдсддс асаасаасаа ддаєсдсст даадсссааа 12660 сасддсссад асссдаасад аадасстдад дсадасстаас астсастссс тодстдссааа 12720 дсадсададс сддддасата кестссаає адссадсссуд адссдаєсдсє стесдсаадс 12780 о адасассаса аадссасасуд дстадссста адасдддада дссстдасст стстетаст 12840 стдасстадс сссатассдс аааВассаасс ададааєссс сдсддаєсса дссастста 12900 65 адсаєсдаасі аасасдуєсад дссдадддес асссадаадс сдаддсааєс сддасаааса 12960 дсдассасса асссдідаді дддаададаа дсдссассас тссссуддаса даддддасдс 13020 70 тестсаатує дассадсадїі стдадддіса асдссасадс дааєсдатаєє єестастота 13080 сдЕссддад ассасадсса дддсаааасс асасадсудда дстдаєсаєс ссаддсдадсе 13140 тасстаастс деіссссддає єсстадсасд асддссаєсс дссатадсса ттадсадта 13200 дЕсддссдад хкудсасдааста саєсдааастє асассддста дасдстаєсст адссссес 13260 тстсттдсуЄ дсаадссата акдстасттуд дссаасассс адсаадааєс ааатасстаДс 13320 тсстдасада садсатуаєса десассдаді асссдсддс ддасаддаса таадстастс 13380 т тастссадда аасаддсдас адссдсастдє аддадасдсе сстдсаастс ддасассаса 13440 ддсаасдсда дадсаадсесї асдсессадд аасдсааасс студссасає сааадстдсс 13500 сЕСтЕссстІсС ссдуддстдсе дсадсадааа дсааасдсає тдссесеее коасаєсттат 13560 асссаасадд аадаассстт кстссссата стсстстсса дддсаєсьссс тсдатастсса 13620 астссаддаа дістдсстдІ дсасадааса сдаддседає дсстасдддас аассдастад 13680 7 стдддаєсдса асссассадд ссадддсаєс дсадддаєсад аасдадссдс асдааааєсда 13740 тсідсаддааа ахссдссєсдад аасссадстд ст ттаааас ссасттасст тасадааата 13800 ддассасадд адасадеессд дсдададдсї сададсаєта стасдаасатд аасссадада 13860 тастсастст даддаддаєє дстестдссІ ссассдасас ссстттссса ахтасатаєса 13920 асадсасаєії дасдсєссада дасадссстд сдаадсссад адаадастата саааастаса 13980 т тсааааадсс аассаасаєсд ааааасдаад сссаддатдд дсасддадсс ааааддадса 14040 сасаадессуд даааааєсдса ааасааааад даадасассс таастадаасє тддастс 14100 сасаааадссї асассуєсдуд єеесстасса стааастдесє сасддддастд дадасдетди 14160 адсссадесуд ддададсасі кдсстадсає ссасаастдсс стдассссад сдссататаа 14220 асдсасасад ддсссасста тадсстааас астттддсду сддаадссду адддесаде 14280 т сааддуісаєс стсадсстсса садсаадєсс ааддссадса сддассдасі асаададасс 14340 стдсстІсааа дасаааасаа дсааасаєса ссасаасааа асадсааааа дстдесстст 14400 ддссастст ссдсаддаса ссстддадса астстаассас хстдадсдєс хсесстсатс 14460 тасаастсдд деЕссатадсд ддассаааста ддадстдаді сасаасадда дасддаадсет 14520 адсаасстса дадсаєсссса дадссстддд асссаєстьє сестесстса ааастссада 14580 " сададаааса дддадаєсєс: аасдассддда дседсссаада діесссадаса тддаадааас 14640 асаасссдса стддессаса тІтуасдддад асадаадсдд сттадсадсд ссссдсеттс 14700 ссатадаєссдуд дадесддсесе сссасассаа дісадссаєс астдустата ссаасдадсад 14760 сасааддаад сстастдсасі ааддесасса сссаасаєсд садссастес стдсддсаас 14820 асдссасадд сстддадес єсстстдсдс тастсссадеі ссстсаддад асстдістс 14880 о ст сссаас ссттасстдд асаєтаастї ссадсдаєста адаєтассст аадассааас 14940 тасассссад дадесаєсає ксссстдасті асддсдсадс ааадссттас сттссатсад 15000 65 стЕстсттта хссттттсса даастдсстуд саасасаєсс хссасадаас аддастсаст 15060 ддакасесс дуддаєссаєс стдтуєссс тсассдсаді дессасддес стсстсесст 15120 70 тдадааааса аддсаєсесс кссасттдстд хтастдсстдс ададаадстдс асдаддаєсс 15180 стссассаєії дсстсдадса ддсадсдсса дадаєсддсас сассстдаса адаасадасс 15240 сасаєсасад ддсдЕсстас астдсасдсс адссдаасстї сассаддааа састсдастта 15300 аааддсдстд ссстссаєтс сстдддсеесд стсссадесса сасададсаа десссаасад 15360 тдассстдудає дсасстдадсс ессттааді сстдстсаса стастдстст дсдасатстс 15420 стассттдда дсеісддасдєс ддассстуєс дсаасаєдаа даддсаєсад ссддасаадад 15480 т дсасадддаа дсстаааадас сстадсеессса аддсасддад дадддддаадада дсаєссоєдад 15540 дЕсссстуЄ садсддеєєса дадсааадссї дддсадсаса саадссстада саасааддаа 15600 дасдсестаа стдддауєсду аддесаасдд сдсадддата ддасадсаатд даддстааад 15660 аадааадсса хтааддеєсст ссстасадас сстдаадаса дадсастуєд дсдсстаєтта 15720 дестсаддсд аастсаадес стдсдЕсст тасассасст астдадстдуд деестддата 15780 7 ссстаадсдуд ааааасастє стдістаааа ададсстдсдд сатстстасс асааадсаст 15840
Есе. дсаадаєтстсс сдаадасдаа асдасасаді стсааааса асктессататє 15900 асссаєсссса дсассттассс асаадааєда стдаааєста ддааааєсдаа сахсасссааа 15960 таастдсстсс стасстдсааа дсдасстстада дсааассттт хсассааата стттсдааатд 16020 састассааді дадссааєсда сдсасддасі хтусусдаадс сааатдддда аасадаататх 16080 т дддадддаас ассаассаєс адададдаасє сссссаєссас ссттттддад ддасодсдтдхта 16140 таддаааадї деЕсдсаастд ддасддсадс дассадстдс сссааадаа хтаадссстда 16200 дсадаассаа дадддаесдсс адддєдєдаа дассаадсес сададасаса сстддсттад 16260 ддстадсста ддасссдсас аддассдсад стдетдсста асддсаєсту дааєсдаєсда 16320 стдаддаєда ддааадсада дадссадсса ддасддсаадс тадстсадда тоахтдддасди 16380 т пЕстдаддда адддсддаад асааадсада садссстааа аассаєстда даасдааадс 16440 асдсассста аастдссдаа саассаастс тдсддсдасду даєстддаасє ааддаадес 16500 асдддасстааа адсстддасда ссаддддаєс даєссдудаєдєс ссстааааас сттаадетсда 16560 ааассдадес сстдсддуаєє дсадсадсає стстдсстасаа ддааєссаада ссдастестт 16620 стстттаді дадаасдсста дасдсддада аасдсддсдє сдаадасаса адсссааааа 16680 " ассдааасдуд саадсуєдад саасдаддда ддддсаадсс дадддааєда дсдоддасада 16740 дсадссаадс адддесстдс аадддстдса деЕсссадсдс сстоастаддсс даддсаддад 16800 дасадддаді хссаддссад саассасаса дссаааасаа аасааасааа асааааааса 16860 аадсаааадд аададсадаа ааадсстастуд сстассаасаа дадасатаст стадссдсда 16920 тстсстсСтсс тІссааадда адстаєстоє ддддастдсе дасесстстд сстааддатс 16980 о дссасаєстуд адаааассстї ддассдстд стдсддаєдаєс тахудсддсад ссстдсаасс 17040 адддасдстуд ссдастсаєс сдаасдддса єссдаєсаад саааєдаєсс тоастасасда 17100 65 тсадстуаєса астасессає дсдсасдаста хтддсаєстса стсассатс стодсссссаа 17160 тсадасааає асдадааєса кстссастді асадсаддда ааасадддсї дадаадаєсаа 17220 70 тасдаддєдс стаадаасас асадассттдс хтассасадас діссаєсст тдстаддсдс 17280 тЕсааєсстає дстдстаста ахдестутає ссасаададсі адаааастст дсссадасає 17340 тадсддссса сдсстттаас сссадсассс дддаддсада ддсадссдда єеЕсстдаде 17400 тдаддссадс стддістаса дадсдадесс саддасадсс аддстасаса дадааассст 17460 дЕстсдаааа ааассааааа адаааааада асаадаааас сстаастдаа стассттдута 17520 дсаааєстаса дсдсдесста асссаєтстсса дсдсудєсад ааассаааса дсааддссад 17580 т дсадаассаа адсддеєссуд стаастсддд садасссаад саддесссст сстратасатт 17640 ассаєттстаєс стдстдадес ассстдадда ассддсестдд сттдсссаад астдаддасие 17700 тстсадссає даасастесс састсстаааа стадддсадї сссддасаад сааддатдає 17760 тадсесаєсст ссассасдса адддсадсса дасасаддса дсаєстаєст стассттаса 17820 дсаасдєтас хтасстдстст адсааасаєс ссаєссттдеес асстстасата хсатасаєте 17880 7 сссссссаса хтассссстдс ссстдідааа стастатаст асдаєсастс сссадатаса 17940 саасссдадд адасдсаадс адсуєсдаас сстстдаєсу ссдаєссддса дсеЕтдсдаєс 18000 тасдааадаа адддсссатуд ддасаєсдаді ссааадассс аадастддаас стдадддаада 18060 даассаадаа адсуєсдудда даддадсстуд даасаасудда саєссесессс адддадасас 18120 тастаадсаа деЕсдсссатс адссдсттд ддааасддає сдадддаєссс тдасттадса 18180 т дстддЕсст дсасадсдас стеесстст дстсадсдсес дадаєсдадад асддадесатх 18240 дадсдсєсдаа даасаадсдс стестаєсстса сеесдадеся дсдсдсестс астттддодса 18300 тасааєссасд астддєдаає єстдасдаса сдасадаєст саадаєсдсад ссассаааст 18360 саастдстдс сстадсаєсстї ссдсаастас сдасасаадс адддаасаса даддесасст 18420 дсетддеетуд асаддасестє дстудєстдас ссааастааєс тстаєстьвсс адссстсаад 18480 т дсестссдає адсадесуєс стдсаєссадс стстасаддасд ссаддсасад сасссаасат 18540 стсастстсає тасаасадса ассстсаєса ссасадсаас адстаасстс тоастастсстс 18600 астссатадс саддаадстуд адсдасстаад ссасттдссс асададсаєс адссстсада 18660 теЕсстТдсСт ссадссастд тссттсадд асадааєссд хсастаадаа астааєттаа 18720 ааассдаєса ссдадсадса ссдсасаєса ассасаасає дссттудсдса статсдстдас 18780 " сЕСстдадсає ааадаєсдсас дссудуддадсас сддссддаса тадассстасуєд содссааатас 18840 тсададааає дессассаас ааддадсесуд саєсссстадад асастддааа дсаастссад 18900 тесастуєст адсаєсстасає стасстсає тдстассст дссатасаде стсттаєтс 18960 ссаєсдаадсд хсасдааєстї куссдаасад есте таєт сстстааастде ссстатттаа 19020 асдасаєссда сасстдаддс дасадсссад ссдудсаааас сстттсстса саадсудсдаа 19080 о ассстдадес стасссстад аасссасата ааааасадеї дсдасасдес дсдсатдсе 19140 тсдассссад састадддад дсададдсад дсадаєсстд адстстсаєт дассасссад 19200 65 сстадсстас асддаєсадсс ссаддсстас аддадстддс ададсстдаа ааасдатдсес 19260 тадасасаса сасасасаса сасасасаса сасасасаса сасасассає асастсатад 19320 70 асстаадсдс ассстсстас асасдсасас асастасааєс сааасасааа ссаасаддда 19380 ассуєсссад аасддісссс аадасааада адаадааааа сассааасса дсестаєттсс 19440 стсадсстає сстстстаст сстссстада адсаастаст астуєсссд хтасасааатт 19500 тасссаасда садсстаастає дсадаасаста тассааадсд стдссаата тататтатс 19560 сСТТЕСТСТССТ ТоСТссСсСттІ ССС СсСТ ССС СТСТ ССС СсСІ ІСТ ет 19620
СЕСКСЕСССТ КССЕСССТЄС СТЕСССТЕСССТ КССЕСССТЕЄС СЕКС КСТ ЕСЕ КСТ 19680 теЕсЕСтТЯєст асстуатасст ааатддстдс хсастатдса сстестатадс тстЕсдссс 19740 теЕсстасссаа тдсасддаста сетасдстдс сссадаатд дасстааадс стттасес 19800 тадаєтсест сссссастсст стаддсаєс хстсасастуд хстаддссад асассатдтс 19860 тастдсстда асстудстадас ассасттаста аадсасдтас тсассдааєс тдатасетсадс 19920 тдсстдсд сстдаєсааа дддадассає дадессссад ддсасастда детассссад 19980 тассааддда чдадссттд сдсдсстсса хтддсадаадс аддасстддад ссастетдає 20040 тест сссттд асттстстса аасасадасд сстсасттдс хсастасада єестсстта 20100 ддаасдсісад саєстдстсст сдастдстду стдссстдда аддадсссає тадсестота 20160 тдадсссттуд асадстастуд сстстсстта ссасаддддс стстаадата стастасста 20220 даддесссда ддаєстдасає ксеЕстдоадад даддаааудда ддаддаассс адаастесст 20280 тасадееесс сттадастестудІ сасатдссаа дастдаадда асаддстддд стасасадта 20340 адаєсстуєс хсаааддааа дасдадсаста дссдаасссс сддсддаасс ссстстдотта 20400 сстдссаса саадстсаєс даєдадесес асдесаасду сттуєссдста сдаадсетаа 20460 даааасаєсд ддаесдддсаа сасаєсстає сстастссаєсе тасссдааає стсаатдсса 20520 тстсатддасд сстддаєссдуає деддсасесе ассстссоє дстдсдсата ассатааатт 20580 тТсассссдса ссадаєсдєс аастдсаєссдс ассаасссаа сааатаєьсє тасстаттаа 20640 а 20641 «2105» 5 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 15 таассддстс тастас 16 «2105. 6 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 6 65 тсдсастаада аскдаст 16 «2105 7 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 7 тдаасасаса десдса 16 «210» 8 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«А00» 8 стдаасасас адссдс 16 «2105» 9 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «А00» 9 тстдаасаса садссад 16 «2105» 10 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 10 тЕсСтдаасас асадтс 16
«2105 11 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 11 асаадссатдуд стаста 16 «2105 12 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 12 асасаадсса хустас 16 «2105» 13 «2115 16 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005» 13 стстастстада хдстдс 16 «210» 14 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 14 асттасттад асдстад 16 «2105» 15 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 15 дастстастта датдси 16 «2105» 16 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 16 адасттастс адасдс 16 «2105 17 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 17 дсаддаадад асетас 16 «2105» 18 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 18 аасаааєссс ді ссада 17 «2105» 19 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 19 дсааасааає тссдк 16 70 «2105» 20
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 20 адсааастааа сссди 16
«210» 21 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 21 сададсааасє ааасєстсс 17 «2105» 22 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 22 тддасададс ааатсааах 18 «2105» 23 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005» 23 асддасадад сааата 16 «2105» 24 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 24 садаасддас ададса 16 «2105» 25 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 25 тЕстІсадаає ддасад 16 65 «210» 26 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 26 стдаасестуд асатад 16 «2105 27 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 27 аадасааасс садастда 18 «210» 28 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 28 тасаадасаа асссадас 18 «2105» 29
Зо «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 29 тсасаадаса аасссада 18 «2105» 30 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 30 тдасстасаада сааассс 17 «210» 31 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 31 бо тадаасаастд дстаст 17 «2105» 32 «2115 16 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005 32 дсадаасаає ддкаст 16 «2105» 33 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 33 аддсадааса асддхта 16 «2105» 34 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 34 аададдсада асаатда 17 «2105 35 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 35 дсасссасад хтааатт 16 «2105 36 «2115 16 «2125» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 36 дааддесаєс хааттс 16 «2105» 37 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 37 стаассдаає дсадса 16 «2105» 38 «2115 16 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005 38 тасссаатст аатсда 16 «2105» 39 70 «2115 16
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 39 тадессассса асстаа 16 «2105» 40 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 40 састсадесса сссаах 16 «210» 41 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 41
Зо тсастссаде асссаа 16 «2105» 42 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 42 тесатеттаде тассса 16 «2105» 43 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 43 даассааєсє саєсстадие 18 «2105» 44 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 44 садсдаддаа каатт 17 65 «2105» 45 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 45 ссаасадсда ддаастт 16
«210» 46 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 46 сссаасадсд аддаах 16 «2105» 47 «2115 17 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 47 тахсасссаас адсдада 17 «2105» 48 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005» 48 тстасасссаа садсдад 17 «2105» 49 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 49 т-сасассса асадсда 17 «2105 50 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 150 сстттатасс саасад 16 бо «210» 51 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 51 70 таасстттає асссаа 16
«2105 ч3552 «2115 17 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 52 аасаасст т ахтассса 17 «2105 53 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 53 дсааасаасс жтттата 16 «2105» 54 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 54 астдсаааста асстетат 18 «2105 55 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 155 асасасасдс аасдад 16
«2105» 56 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 156 адасасасає дсаатад 16 «2105 57 «2115 16 «212» ДНК 60 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005» 57 дадасатата кдсаах 16 «2105» 58 «2115 16 70 «212» ДНК
«2135 Штучна послідовність «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 58 ссададасає ахсасдс 16 «2105» 59 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 159 саасаєссса дадатає 17 «210» 60 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 60 дсаастаєссс ададата 17
Зо «210» 61 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 61 адсаасаєсс сададатє 17 «2105» 62 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 62 садсаатаєс ссадад 16 «2105» 63 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив бо «4005 63 аассадсаає аштссад 17 «2105» 64 65 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005» 64 асаассадса ахассс 17 «2105» 65 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 65 астаадсадеі хтасасттст 19
«210» 66 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 66 стаадсадеє асасттс 17 «2105» 67 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 67 дастаадсад тасасе 18 «210» 68 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 68 тдасстаадса детаса 16 «2105» 69 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 69 стстсдастаа дсадета 17 60 «2105» 70 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 70 сеЕстесдаст аадсад 16 70
«2105 71 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 71 дсесттсдас хаадта 16 «2105 72 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 72 ссттааастас хдєсдас 17 «2105 73 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «4005 73 стсааатаст детсдас 16 «2105 74 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 74 тссттааата стастта 16 «2105 75 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 75 тстссттааа тастдт 17 «2105 76 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 76 65 тассатадее стссту 16 «2105 77 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 77 адсаєсатад сстсс 16 «2105 78 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 78 дадсаєсата дсс 16 «2105 79 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 79 ададсаєсає адес 16 «2105» 80 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 80 сададсаєса хтадес 16
«210» 81 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 81 тЕсададсає сатадс 16 «2105» 82 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 82 стссададса хсатад 16 «2105» 83 «2115 17 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005 83 тістссадад тассата 17 «2105» 84 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 84 тЕсстсада дсаєсах 17 «2105» 85 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 85 дадаааддсї аадт 16 «210» 86 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 86 дасастсттуд хасаєттс 16 «2105 87 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 87 тдадасастс ттдсаса 17 «2105» 88 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 88 тдадасассс ттдтас 16 «2105» 89 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 89 стттаєссааа сессає 16 70 «2105 90
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 90 ассааасттс астааа 16
«210» 91 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 91 ааасстстас таадтад 16 «2105» 92 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 92 адаєсаадас адссда 16 «2105» 93 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 93 аадсаддадс аададдс 17 «2105» 94 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 94 ааадсаддад саадада 17 «2105 95 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 95 деісаадсадс саддад 16 65 «210» 96 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 96 адддсаддає ддаасад 16 «2105» 97 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 97 аадддасадда хддухта 16 «2105» 98 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 98 саадддасадд асддахє 16 «2105» 99
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 99 ссааддасад датдада 16 «210» 100 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 100 тссааддаста ддатад 16 «2105 101 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 101 бо стсссааддуд хаддах 16 «2105 102 «2115 17 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005 102 асстсссаад ддсадда 17 «2105» 103 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 103 адаадсдатд дсесатт 17 «2105 104 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 104 аадаадсдає ддстсат 17 «2105» 105 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 105 даадаадсда кддсеса 17 «210» 106 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 106 асдааасдса аастада 17 «2105 107 «2115 18 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 107 саасдааастуд хааастда 18 «210» 108 «2115 18 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «400» 108 дсаасдааасє дсаааста 18 «210» 109 70 «2115 18
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 109 адсаасдааа кдсаааст 18 «210» 110 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 110 дадсааєсдаа асдсааас 18 «2105 111 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 111
Зо тдаассссса тасссда 17 «2105 112 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 112 адааєсстаєда ссатах 16 «2105 113 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 113 аддсаадаає хтасдасс 17 «2105 114 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 114 тсаддсаада астасдас 18 65 «2105» 115 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 115 стссаддасаа дааєстата 18
«2105 116 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 116 тсттсаддса адааєтта 17 «2105 117 «2115 17 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 117 стстссадд хаадаат 17 «2105 118 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 118 хсттсессад дсаадаа 17 «2105 119 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 119 тсттстссад асаада 16 «2105 120 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 120 тддЕстаада даадаад 17 бо «2105 121 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 121 70 дЕсддаєстаа дадаад 16
«2105 122 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 122 адссдудєста ададаа 16 «2105 123 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 123 садесддаєсе аададаа 17 «2105 124 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 124 дсадесддес хаададаа 18 «2105» 125 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 125 саадсесддєсе аадада 16
«2105 126 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 126 дсадссддес саадада 17 «2105 127 «2115 16 «212» ДНК 60 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005 127 дсадессдудєс хаадад 16 «2105 128 «2115 16 70 «212» ДНК
«2135 Штучна послідовність «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 128 стсатаєссад ддсадс 16 «2105 129 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 129 сасасатдеє стстаас 17 «210» 130 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 130 тааасасаса сатаєттст 18
Зо «2105 131 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 131 дсааасасас асатдєсс 18 «2105 132 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 132 тасааасаса сасататт 18 «210» 133 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив бо «400» 133 даєсаєсдсаа асасасас 18 «2105 134 65 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 134 адаєсаєдса аахтасаса 18 «2105» 135 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 135 сааадаєссає дсааасасас 20
«210» 136 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 136 асааадаєса хтдсааатаса 20 «2105 137 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 137 даасасааад ассатдута 18 «210» 138 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 138 адаасасааа дассатди 18 «210» 139 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 139 садаасасаа адаєсата 18 60 «210» 140 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 140 дсадаасаса аадаєса 17 70
«2105 141 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 141 аддсадаата сааадатє 17 «2105 142 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 142 ааддсадаає асааада 17 «2105 143 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «4005 143 ассадсдадд дасдаа 16 «2105 144 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 144 саєстадсдад ддасда 16 «2105» 145 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 145 даддаєдатд даєтад 16 «210» 146 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 146 тсаддадсаа сааадд 16 65 «2105 147 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 147 тсаасдааєт тдаєта 16 «2105 148 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 148 стЕстаасдаа Ед 16 «2105 149 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 149 сасддаєсас аастаа 16 «2105» 150
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 150 тсатддаєса сааста 16 «210» 151 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 151 дісатддаєс асааст 16 «2105 152 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 152 бо састааасст адссат 16 «2105» 153 «2115 17 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005» 153 дасаєстааає стадсса 17 «2105 154 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 154 адддасаєса аасста 16 «2105» 155 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 155 сааадсаєста хаасса 16 «2105» 156 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 156 асттастадд садаад 16 «2105 157 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 157 сададссаас тудсаса 16 «210» 158 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 158 ссададссаа стдсас 16 «210» 159 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 159 дссададеста астдта 16 70 «210» 160
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 160 тдддссадад стааст 16
«2105 161 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 161 садсаєстає садаст 16 «2105 162 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 162 тдааасааса тсдадссатє 18 «210» 163 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 163 дсдааастаас асдадес 17 «2105 164 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 164 тстассстатд ссаста 16 «2105 165 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 165 дЕстаекає дессаст 16 65 «210» 166 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 166 тадестадє асасса 16 «2105 167 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 167 ткоддсстааю тасдіс 16 «210» 168 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 168 тсасссаєтд стетааа 16 «210» 169
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 169 тЕсадсаааєт аскссдас 16 «210» 170 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 170 дсдкдссад сааатат 17 «2105 171 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 171 бо тстасстдєса ддататс 16 «2105 172 «2115 16 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005 172 аскссдсссатс хттаста 16 «2105 173 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 173 тастдсссає сттаст 16 «2105 174 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 174 ааасаєсдсес сассе 16 «2105» 175 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 175 асаассттає сатаса 16 «2105 176 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 176 тасаасстта ссатас 16 «2105 177 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 177 ттасаасстє ассата 16 «2105 178 «2115 16 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005 178 тттасаасст тахсає 16 «2105 179 70 «2115 16
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 179 астдстаєтд стасст 16 «2105» 180 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 180 аддастдста сдста 16 «2105 181 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 181
Зо даддастдсе астдст 16 «2105 182 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 182 асдсадаата асааса 16 «2105» 183 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 183 ссаадсдата хаасда 16 «2105 184 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 184 тсадсадасс аадсда 16 65 «2105» 185 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 185 дЕссадсада ссаадс 16
«210» 186 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 186 тдасадсдає тататсс 16 «2105 187 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 187 тасссаадає астдас 16 «210» 188 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 188 даасаєсста даєстди 16 «210» 189 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 189 сааастсдада ахатсс 16 «2105 190 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 190 дсааастдад аахатс 16 бо «2105 191 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 191 70 тсстастаса ахссдта 16
«2105 192 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 192 теЕсстаттас аатсдас 16 «2105» 193 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 193 астаасддда ддас 16 «2105 194 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 194 тадесссадад аахаад 16 «2105 195 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 195 таасататад тесада 16
«2105 196 «2115 16 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 196 асаасатата деЕссад 16 «2105 197 «2115 16 «212» ДНК 60 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005» 197 сасаасатає адесса 16 «210» 198 «2115 16 70 «212» ДНК
«2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 198 тсасаасата тадетс 16 «210» 199 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 199 тадсссстаа саатса 16 «210» 200 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 200 стссаасстт тудсата 16 «210» 201 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 201 тстссаатст ттоатає 16
«2105 202 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 202 тстатетссад ссаатс 16 «2105» 203 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 203 сддаадссад адсдаа 16 «2105» 204 «2115 16 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005» 204 тсаадсаєсда ддаата 16 «2105» 205 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 205 тдаєсдадса сстст 16 «210» 206 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 206 дастаастає сук 16 «2105 207 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 207 тдастааста теЕсса 16 «210» 208 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 208 дсдастааєтт асштсд 16 «210» 209 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 209 стдстсдааа хрдсдас 16 «2105» 210 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 210 сстдстсдаа асдсда 16 70 «2105» 211
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 211 ассстдсетд ааатдие 16 «2105 212 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 212 ассасаааєс такс 16 «2105» 213 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 213
Зо дстааатаст ссатс 16 «2105» 214 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 214 саєстдсааса хасста 16 «2105 215 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 215 дсаєссдсаас ахкасст 16 «2105» 216 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 216 таасаєсдса ссааатє 16 65 «2105» 217 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 217 даєсаасаєсд сассаа 16
«2105» 218 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 218 адасаасаєс дсасса 16 «2105» 219 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 219 дссаадаада хаатах 16 «2105» 220 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 220 сасадссаса хаааст 16 «2105» 221 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 221 тсдсаастує ддааас 16 «2105» 222 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 222 тдасттдсаа стасад 16 бо «2105» 223 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 223 70 тстаастдаа ахадсс 16
«2105» 224 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» (224 дсддесстаа стдааа 16 «2105 225 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 225 саастасддда сттдах 16 «2105» 226 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 226 асдасаастає дддаст 16 «210» 227 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 227 тасдасаата тдоадас 16 «210» 228 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 228 асасдасаає асддда 16
«2105» 229 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 229 65 сеЕссасттаа таатта 16 «210» 230 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 230 стдстссаст хаатаа 16 «2105» 231 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 231 аадастдсех сасіта 16 «2105 232 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 232 даасдссста астатад 16 «2105 233 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 233 тддаатдссс таатта 16
«2105» 234 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 234 дсааасдсса дсаддх 16 «2105» 235 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 235 стаасддаад даєсста 16 «2105» 236 «2115 16 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005» 236 аасасадаас стаатад 16 «2105 237 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 237 дааадаасад аахде 16 «210» 238 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 238 асдддасааста даєтах 16 «210» 239 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 239 дааададсас адддта 16 «2105» 240 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 240 стасастадад ддаатад 16 «2105» 241 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 241 дсексстаса хтадада 16 «2105 242 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 242 тасессстас ахадад 16 70 «2105» 243
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 243 тдддсесдаа ахатдие 16
«2105» 244 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 244 саєстастаєсс аадаас 16 «2105 245 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 245 тсадстасдє тахсає 16 «2105» 246 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 246 састстаєст дассда 16 «2105 247 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 247 ааассддсас адсуєт 16 «210» 248 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 248 ассдєдасад хааатад 16 65 «2105» 249 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 249 таддаассує дасадта 17 «2105» 250 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 250 ссасататад діссе 16 «2105» 251 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 251 састаєстсдста ссатас 16 «2105 252
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 252 тсатаєссдсе ассата 16 «2105» 253 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 253 саассудєсає астдст 16 «2105» 254 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 254 бо саєсссааєстуд хсатаєттад 18 «2105» 255 «2115 17 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005» 255 теЕсстастдд дааєттд 17 «2105» 256 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 256 саассадсдс адссад 16 «2105 257 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 257 даасаатдеє сттатсс 17 «2105» 258 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 258 сасаааєсда асаастдест 20 «210» 259 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 259 сасдсасааа ссдаасаат 19 «210» 260 «2115 17 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 260 аксстдсаає ссасат 17 «2105» 261 «2115 16 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005 261 ссассатадс хдаєса 16 «2105 262 70 «2115 17
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 262 ассассатад стдаєса 17 «210» 263 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 263 сассассата дстдаєтс 17 «2105» 264 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 264
Зо тадссддсас сассатє 16 «2105» 265 «2115 17 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 265 сттдсадссд дсассас 17 «210» 266 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 266 сттдсадссд дсасса 16 «2105 267 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 267 сдсттдсаді сддсас 16 65 «210» 268 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 268 тсаасааада ссаддас 16
«210» 269 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 269 тадасесаса адаатд 16 «2105 270 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 270 асддасетас аадаах 16 «2105 271 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 271 дсеісаадааа ссддах 16 «2105 272 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 272 тастдсадаа сатдас 16 «2105 273 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 273 дсаасссаєе сдасст 16 бо «2105 274 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 274 70 тадааадддадд адддасас 18
«2105 275 «2115 17 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 275 адсддсдаад догодад 17 «2105 276 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 276 тадтддсдаа дададдад 18 «2105 277 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 277 асадсдаєсда адддаддаад 19 «2105» 278 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 278 тадсддсдаа дддадда 17
«2105 279 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 279 асадсдаєда адддадда 18 «210» 280 «2115 16 «212» ДНК 60 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «400» 280 тадсддсдаа додада 16 «2105» 281 «2115 17 70 «212» ДНК
«2135 Штучна послідовність «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 281 аксадсдаєда адддада 17 «2105 282 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 282 дасадсддста аадоадада 18 «2105» 283 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 283 асадсдаєда адддад 16
Зо «2105» 284 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 284 дасадсаддсд аадддаад 17 «2105» 285 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 285 дадасадсдд сдаадад 16 «210» 286 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив бо «400» 286 сасддададає адсдах 16 «2105 287 65 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 287 асааасаатуд дестастст 18 «210» 288 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 288 асасасааас аатддета 18
«210» 289 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 289 дадддасаса сааатаах 18 «210» 290 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 290 асасададад дстсаа 16 «2105» 291 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 291 тсдасасада даддси 16 «2105 292 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 292 дсаєсссдаста хадада 16 60 «2105» 293 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 293 теЕсдасаєссд ахсатад 16 70
«2105» 294 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 294 стддаадаасє аддес 16 «2105» 295 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 295 астддаадаа хаддєс 16 «2105» 296 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «400» 296 тастддаада ахадає 16 «2105 297 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 297 тддасттаєсс тдахаси 16 «210» 298 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 298 асддстстаєс стдудтас 16 «210» 299 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 299 65 тасддсттає сстота 16 «2105» 300 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 300 дсасддсета хсстди 16 «210» 301 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 301 асдаасасає дсссаде 17 «2105» 302 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 302 даєсдаастата хкдссса 16 «2105 303 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 з03 саадаєдаає ахкасдсс 17
«2105» 304 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 304 дасаасаєса дсасада 17 «2105» 305 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 305 саадасааса хсадта 16 «2105» 306 «2115 16 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005 306 састсстаде сс 16 «2105» 307 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 307 аасастсста дЕсс 16 «2105 308 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 308 таасастсст адтсс 16 «2105» 309 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 309 стаасастсс тадес 16 «210» 310 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 310 тдасаасата астата 16 «2105 311 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 311 стдасаасає аастди 16 «2105 312 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 312 теЕсдаастса адсдас 16 70 «2105» 313
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 313 тсстттастє адстад 16
«2105 314 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 314 даадессддає хсадста 16 «2105» 315 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 315 таддастаєсда саддда 16 «210» 316 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 316 тасдддатає дасадд 16 «2105 317 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 317 асасддаадд дататс 16 «2105 318 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 318 асаддастатд даадда 16 65 «210» 319 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 319 ассссаасад дататда 17 «2105» 320 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 320 дадсаасссс аасадад 16 «2105 321 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 321 адддадсаає ссааса 17 «2105 322
Зо «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 322 аксадддаді аастетсса 17 «2105» 323 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 323 стстастаєтта додаде 16 «2105» 324 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 324 садсеттаста стаддд 16 бо «2105» 325 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 325 70 тсадсетасе астадад 16
«2105» 326 «2115 18 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 326 асксссадсеє астаєтад 18 «2105 327 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 327 тЕсадсттас тастад 16 «2105» 328 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 328 садаєссссад сттаст 16 «2105 329 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 329 дастасаасс ададда 16
«2105» 330 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 330 адасстасаас хададада 16 «210» 331 «2115 16 «212» ДНК 60 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «400» 331 аадастасаа стадад 16 «2105» 332 «2115 20 70 «212» ДНК
«2135 Штучна послідовність «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 332 асдаєссаає хстадссааа 20 «2105» 333 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 333 теЕсаассста дссааа 16 «2105» 334 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 334 дасссааєсс тадсса 16
Зо «2105» 335 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 335 асдаєссаає хстадсса 18 «2105» 336 «2115 19 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 336 даєдаєссаа сстадеса 19 «2105» 337 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив бо «4005» 337 дасссааєсс тадсса 16 «210» 338 65 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 338 даєдаєссаа сстадес 18 «2105» 339 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 339 тдаєсссааєс стадес 16
«2105» 340 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 340 дадаєдаєсє аассста 17 «2105 341 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 341 дадаєдаєтє аасксст 16 «2105 342 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 342 садаєсдатд дсаде 16 «2105» 343 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 343 стсадаєссда хддасад 16 60 «2105» 344 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 344 десадссстс адаєттад 16 70
«2105» 345 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 345 тасассдєса дссстс 16 «2105» 346 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 346 асттдсраєсд ссадсс 16 «2105 347 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «4005 347 адссадсаєс адддас 16 «2105» 348 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 348 тсдасаатад тдасає 16 «2105» 349 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 349 асаадсддта хсест 16 «2105» 350 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 350 65 аасстастє асаадсі 16 «2105» 351 «2115 18 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 351 сасадсадає дсстдата 18 «2105» 352 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 352 даасасадса дасдсс 16 «2105» 353 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 353 стітуддаасас адсадах 17 «2105 354 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 354 аксасстсдда асасад 16
«2105» 355 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 355 тсттстаатає сттддаас 18 «2105» 356 «2115 19 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 356 тдаєсстеьсттє аатаєстта 19 «2105» 357 65 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 357 тдаєдаєтсс тесаататс 19 «2105» 358 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 358 аддссаадес асдатад 16
«2105» 359 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 359 тсдасдаддс таадстс 16 «2105» 360 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 360 ссаддаєтає астсе 16 «210» 361 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 361 дссаддаєса хастст 16 «2105» 362 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 362 стдссаддає хахасті 16 60 «2105» 363 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 363 садааастта хтастстата 19 70
«2105» 364 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 364 аадсадааас статаст 17 «2105» 365 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 365 даадсадааа сттатаст 18 «2105» 366 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «4005 366 тддаадсада аасттатаст 20 «2105» 367 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 367 тддаадсада аасттатас 19 «2105 368 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 368 аадсадааас хтатас 16 «210» 369 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 369 65 тададаадсада аасттата 18 «2105» 370 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 370 аадддатаєс асддад 16 «2105 371 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 371 тадссоддаада сЕсс 16 «2105 372 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 372 асддаєсддуд адсада 16 «2105» 373
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 373 адасддаєсд ддадса 16 «2105» 374 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 374 аадасддаєс доддаде 16 «2105» 375 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 375 бо асаадасдудда ссддда 16 «2105» 376 «2115 16 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005» 376 адаадд-єса дасте 16 «2105 377 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 377 дсадаадд-є садаст 16 «2105» 378 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 378 тдасадаадді ссадас 16 «2105» 379 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 379 адсдсадаад деЕссад 16 «2105» 380 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 380 аадсдсадаа ддесса 16 «210» 381 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 381 таадсдсада адаєтс 16 «2105» 382 «2115 16 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005» 382 тстаадсдса даадає 16 «2105» 383 70 «2115 17
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 383 стсаддадеє стасттс 17 «2105» 384 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 384 стсаддадеє стасеї 16 «2105» 385 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 385
Зо асддаддаєда сссаддад 18 «2105» 386 «2115 17 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 386 асддаддаєда стсадда 17 «2105» 387 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 387 асддаддаєда сссадада 16 «2105» 388 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 388 тасддаддаєд асссадада 17 65 «210» 389 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 389 асасддадає дасссада 18
«2105» 390 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 390 тасддаддасд астсад 16 «210» 391 «2115 17 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 391 аксасддадає дасссад 17 «2105» 392 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005» 392 сасастддадд сдасесад 18 «2105» 393 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 393 асасддаддає дассса 16 «2105 394 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 394 састастддадд сєдастса 17 бо «2105» 395 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 395 70 сасасддадд кдастс 16
«2105» 396 «2115 17 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 396 дсасасддад деідастс 17 «2105» 397 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005» 397 тасасасдда ддасдастс 18 «2105» 398 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 398 тсдсатастдда аддсдастс 19 «2105 399 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 399 теЕсдсататд даддсдастс 20
«210» 400 «2115 16 «2125» ДНК «2135» Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 400 дсасасддад дсдаст 16 «2105» 401 «2115 17 «212» ДНК 60 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «400» 401 тдасатасдда ддасдаст 17 «2105 402 «2115 18 70 «212» ДНК
«2135 Штучна послідовність «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 402 тсдсататдда адаєдаст 18 «2105» 403 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 403 теЕтдсататд даддасдаст 19 «210» 404 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 404 тасатасдда дасдас 16
Зо «2105» 405 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 405 тсдсатастдд аддсдас 17 «2105» 406 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 406 теЕсдсататд даддсдас 18 «2105 407 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив бо «4005 407 теЕсдсататд даддсда 17 «210» 408 65 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 408 теЕсдсатата дадата 16 «210» 409 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 409 аадсдаадеє саасадс 17
«2105» 410 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 410 таддаадсда адссса 16 «2105» 411 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 411 асдддаадсд аадтс 16 «2105» 412 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 412 дасдддааді дааде 16 «2105» 413 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 413 стадаєсдаєддад аадсдаа 17 60 «2105» 414 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 414 аскссдадсдаа хссааа 16 70
«2105» 415 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 415 аассдадсда асссаа 16 «2105» 416 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 416 дасааєсдад сдаатсс 17 «2105» 417 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «4005 417 дсдасааєстуд адсдаа 16 «2105» 418 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 418 аадаааддсд саатаа 16 «210» 419 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 419 саадааадді дсаата 16 «2105» 420 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 420 65 асаадааадд хкдсаах 16 «2105» 421 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 421 асстааастс асааас 16 «2105 422 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 422 стдассаддес садсда 16 «2105 423 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 423 тстдаасдаа сасссд 17 «2105» 424 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 424 стсаєссдаад деЕста 16
«2105 425 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 425 стаасстсає сдаадад 16 «2105» 426 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 426 сстаасстса стдаад 16 «2105 427 «2115 16 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005 427 асттсдаєст ссадс 16 «2105» 428 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 428 астасдсаас асттта 16 «2105» 429 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 429 сааастадсеє тассда 16 «210» 430 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 430 ссааасадст стассад 16 «2105» 431 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 431 тссааасадс тетатс 16 «2105» 432 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 432 дасссааата дсттта 16 «2105» 433 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 433 асдаєссааа хадсет 16 70 «2105» 434
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 434 тасдаєссаа ахадст 16
«2105» 435 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 435 тааасадддс тсдддаах 17 «2105» 436 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 436 асттааасад доастада 16 «2105» 437 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 437 асасттааас адддси 16 «210» 438 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 438 даасасстаа асадда 16 «2105» 439 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 439 ададаасаст хааасад 17 65 «2105» 440 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 440 стасададаа састта 16 «2105» 441 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 441 аскдстасада даасаст 17 «2105 442 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 442 асааасдста сададааса 19 «2105 443
Зо «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 443 адасааасдс хасадада 18 «2105» 444 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 444 тададасааа сдстаса 17 «2105 445 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 445 бо тадасадада сааатдси 18 «2105» 446 «2115 18 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005» 446 саасасаста дасадада 18 «2105 447 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 447 тасасаатає астадатад 19 «2105 448 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 448 стасасаата хастад 16 «210» 449 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 449 дстасасааїєї ахаста 16 «2105» 450 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 450 аксасдсстаса саататас 18 «2105» 451 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 451 тдастаєсдста сасаає 16 «2105 452 «2115 17 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005 452 асдасаєдає аскдстас 17 «2105» 453 70 «2115 18
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 453 даддададад асаатааа 18 «2105» 454 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 454 стаддаддад ададаса 17 «2105» 455 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 455
Зо тастсстадда ддадада 17 «2105» 456 «2115 17 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 456 тсасаєсста одаддад 17 «2105» 457 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 457 дЕссасаєсс таддад 16 «2105» 458 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 458 тададессає ассстада 18 65 «210» 459 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 459 сдсассасса стстдс 16
«2105» 460 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 460 тадааддааасс актсаттс 18 «2105» 461 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 461 тЕсдаддааа хсаттсатє 18 «2105 462 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 462 аддстааєсс хтатттад 16 «2105» 463 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 463 тЕсаддстаа тсстає 16 «2105» 464 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 464 тдсессадсд хасссе 16 бо «2105» 465 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 465 70 тадсадсасе сдатад 16
«210» 466 «2115 18 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 466 стаассдсрад хтадсастс 18 «2105» 467 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 467 тастаасстує адтсадс 16 «210» 468 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 468 адсдсстаасс дсадса 16 «2105» 469 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 469 дсаадсдста астдта 16
«2105» 470 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 470 даддаааєсда астааєста 19 «2105» 471 «2115 17 «212» ДНК 60 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005» 471 саддаддааа сдааста 17 «2105 472 «2115 16 70 «212» ДНК
«2135 Штучна послідовність «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 472 ссстададетс астсс 16 «2105 473 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 473 ассттасатд асдаадс 17 «2105» 474 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 474 дасасассса даєсссад 18
Зо «2105» 475 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 475 адасасастс адаєсссад 19 «2105» 476 «2115 20 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 476 аадасасастї садаєсссад 20 «2105 477 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив бо «4005 477 адасасастс адаєтесса 18 «2105» 478 65 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 478 аадасасастї садаєсесса 19 «210» 479 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 479 ааадасасас хсадаєтесса 20
«2105» 480 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 480 дааадасаса стсадаєсс 20 «2105» 481 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 481 аадасасаст садаєссс 18 «2105 482 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 482 ааадасасас хсадаєстс 19 «2105» 483 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 483 тдааадасас астсадаєсе 20 60 «210» 484 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 484 тдааадасас астссадаєт 19 70
«2105» 485 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 485 тдааадасас астсадає 18 «2105» 486 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 486 ассдааадас асастса 17 «2105» 487 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «4005 487 тсаєсдааад асасаст 17 «2105» 488 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 488 тессатсатт дааада 16 «210» 489 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 489 аксаасассас тассат 17 «2105» 490 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 490 65 тсастсааєт сстстддаа 18 «2105» 491 «2115 18 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 491 тсадаастад стттаєсса 18 «2105 492 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 492 даддсасааа хахадд 16 «2105» 493 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 493 сттаєсдастас аастта 16 «2105» 494 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 494 тсттасдата саасту 16
«2105» 495 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 495 теЕсСттасдає асааст 16 «2105» 496 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 496 садессстста сдатас 16 «2105 497 «2115 16 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005 497 дсадееест асдата 16 «2105» 498 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 498 тасааасдес тассададаєс 19 «210» 499 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 499 тасасааастд сстаттад 18 «2105» 500 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 500 адсаєссасаа стадтса 16 «210» 501 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 501 стаасдасад сдаадс 16 «2105 502 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 502 адстаасдає адсдаа 16 «2105» 503 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 503 асдсстсдас ататта 16 70 «2105» 504
«2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 504 стісаадаєтта ссдасас 17
«2105» 505 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 505 асстсаадає хастсда 16 «2105» 506 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 506 аасстсаада тастад 16 «2105» 507 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 507 сасааасстс аадаєтаєтт 19 «2105» 508 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 508 дсасестаасс адасст 16 «2105 509 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 509 адсастсаає тадасс 16 65 «210» 510 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 510 дсасдаддсд дсааас 16 «2105 511 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 511 аддааасадс адаадта 17 «2105 512 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 512 дсасаассса даддаа 16 «2105» 513
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 513 саадсасаас ссадад 16 «2105 514 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 514 тЕсаадсаса асссад 16 «2105» 515 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 515 аасссаадса саассс 16 «210» 516 «2115 19 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4А00» 516 таасаассса адсасаасс 19 «2105 517 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 517 астаасааєі саадсас 17 «2105» 518 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 518 асаасастаа хаасссаадс 20 «210» 519 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 519 тадаєссдсд аддсаа 16 «2105» 520 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 520 адссттааєте стссат 16 «2105» 521 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 521 ааєсдаєстад адсстта 17 «2105 522 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 522 стааєсдаєст ададсс 16 70 «2105» 523
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 523 астаасдаєс хададс 16
«2105 524 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 524 саєстаасатд кссттатт 18 «2105» 525 «2115 20 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 525 асаадсасає хтаасастдєсс 20 «2105» 526 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005» 526 тсасаадсас ассаасата 19 «2105 527 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 527 дсеттаєссса хдетахє 17 «2105 528 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 528 дсетстассса хоста 16 65 «2105» 529 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 529 ададсесетає хсастдеє 18 «2105» 530 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 530 асаададсеє хасссата 18 «210» 531 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 531 сасаададст тастсса 17 «2105 532
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 532 адсаєсаадад стат 16 «2105» 533 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 533 тадаєсуєсє адсдса 16 «2105» 534 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 534 бо дсадаєсуєсє хадсдс 16 «2105» 535 «2115 17 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005» 535 дасааєссста дсадаєс 17 «2105» 536 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 536 стдасааєтсс тадсад 16 «2105» 537 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 537 дседасааєс стадта 16 «2105 538 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 538 аддаєссаада хасдха 16 «210» 539 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 539 саддаєсаад ахсасд 16 «2105» 540 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 540 тсаддаєсаа датасд 16 «2105 541 «2115 16 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005 541 тЕсаддаєста адахсас 16 «2105 542 70 «2115 18
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 542 аддаадааад кстдастс 18 «2105» 543 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 543 тсааддаада аадсстда 18 «2105 544 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 544
Зо стсааддаад ааадсста 18 «2105» 545 «2115 17 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 545 тдсісаадда адааадсі 17 «2105» 546 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 546 аассасдстс ааддаада 18 «2105 547 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 547 таддастасса саттатда 18 «2105» 548 65 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005» 548 сасааєссттає тссаєсісстс 20 «2105» 549 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 549 тдасасааттє аєсссат 17
«2105» 550 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 550 астдсатаає сттатсс 17 «210» 551 «2115 19 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 551 стааастдса хтаасттатт 19 «2105 552 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 552 асаастааас тдсата 16 «2105» 553 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 553 тїсассаасаа стааастдс 19 60 «2105» (554 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 554 тадсасаєта ссаатсааст 19 70
«2105 555 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 555 сасаастаад дасде 16 «2105» 556 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 556 тсасаастаа ддасає 16 «2105 557 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «4005 557 сдєсасааст ааддас 16 «2105» 558 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 558 тсдссатаас таадда 16 «2105 559 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 559 ассудєсастаа стаадад 16 «2105» 560 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 560 65 десадсаєст тасаєттс 16 «210» 561 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 561 сеЕстаєссуєс адсатс 16 «2105 562 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 562 адсасададе хастди 16 «2105» 563 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 563 теЕсстддєда тасьт 16 «2105 564 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 564 дЕссстддка ахасе 16
«2105 565 «2115 16 «2125» ДНК «2135» Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 565 тасесстдуає датаст 16 «2105» 566 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 566 асааасаєда асстстсс 18 «2105» 567 «2115 19 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005 567 стстасааас асдаатстс 19 «2105» 568 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 568 стдЕст стає ааасата 17 «2105 569 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 569 ттдесастааа тстасст 18 «2105» 570 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 570 тсаааєссстає ссттддата 19 «2105 571 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 571 стстааастста сссттдда 18 «2105 572 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 572 стЕсттааає ттаєсстта 19 «2105 573 бо «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 573 татдаєесстс адсааад 17 70 «2105 574
«2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 574 даассаєстє тааасса 17
«2105 575 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 575 сссттаааєтс сстаса 16 «2105» 576 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 576 асастдстст тусасс 16 «2105 577 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 577 тдасаасаст дстст 16 «2105» 578 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 578 тасастссаєтс ддастс 16 «2105» 579 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 579 дсасаєсстає тодддс 16 65 «2105» 580 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 580 тсддасасаєтє тастад 16 «210» 581 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 581 сахтдсддса сатттає 17 «2105 582 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 582 аассасдаєсд дсасах 16 «2105 583 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 583 ааассастуєс ддсаса 16
«2105» 584 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 584 дасаадсессд даєстаа 16 «2105» 585 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 585 аасдсєссада хдсстс 16 «2105» 586 «2115 16 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005 586 дсетаастуєс садатад 16 «2105 587 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 587 сдсасатадс сдата 16 «2105 588 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 588 дсдаддааєс аддата 16 «2105» 589 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 589 дсаасаасає даєса 16 «2105» 590 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 590 дааасаєссді адаста 16 «210» 591 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 591 тсдааастаєс дсадас 16 «2105 592 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 592 аадсстадса асссдс 16 70 «2105» 593
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 593 дсесадсада татаа 16
«2105» 594 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 594 сасасастадс хдстаа 16 «2105» 595 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 595 асддестсаа ахсаті 16 «2105» 596 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 596 саасддєстс аааєтса 16 «2105» 597 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 597 теЕсстаєссда ттдаст 16 «2105 598 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 598 теЕсстдссса саасас 16 65 «2105» 599 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 599 аддаасссас хаатст 16 «2105» 600 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 600 тааасддсад даассс 16 «210» 601 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 601 дсааасддса ддаасс 16 «2105» 602
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 602 тсдсааатдд саддаа 16 «2105 603 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 603 тсасдадеса ддсата 16 «2105» 604 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 604 бо ссаддасдааа стттаа 16 «2105» 605 «2115 16 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005» 605 сссттадсса дстсст 16 «2105» 606 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 606 асссттадсс адстсс 16 «210» 607 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 607 сасссттадс садстс 16 «2105» 608 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 608 тстсттаста ддстсс 16 «210» 609 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 609 сстасстуєс ассата 16 «210» 610 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 610 тсстастстує сатсає 16 «2105» 611 «2115 16 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005 611 дадаадсдсд адаадс 16 «2105 612 70 «2115 16
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 612 сассстстдаа дЕстад 16 «2105» 613 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 613 таасаадастд дстссс 16 «2105» 614 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 614
Зо сааддсастаа хаадатхє 16 «2105» 615 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 615 ссааддсата ахсаада 16 «210» 616 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4А00» 616 тдаєссаате стсасс 16 «2105 617 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 617 асдаєссаає хстсас 16 65 «210» 618 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 618 сдстссаєст хсассс 16
«210» 619 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 619 тасдасастд сасст 16 «2105» 620 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 620 дсасдасаст дсатст 16 «2105» 621 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 621 тадасасдасас тдсатс 16 «2105 622 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 622 теЕстсСтсстд таадтс 16 «2105» 623 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 623 тЕстасадад дааста 16 60 «2105» 624 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 624 астасадесс хтасада 16 70
«2105» 625 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 625 тісссасадд тазаата 16 «2105» 626 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 626 асссасссдаа хтахтастсатт 20 «2105 627 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «4005 627 тдаддаддааа стастстад 17 «2105» 628 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 628 тдастсаєтст тааата 16 «210» 629 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 629 стдастсаєс ттааат 16 «210» 630 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 630 65 тетастстда стсатс 16 «210» 631 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 631 тастстодадда актаст 16 «2105» 632 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005» 632 дсассддадд аастах 16 «2105» 633 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 633 тдадасастастє сеЕстаадтає 20 «2105» 634 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 634 даєсестсдд хахасті 16
«2105» 635 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 635 садасаастс татасс 16 «2105» 636 «2115 17 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 636 аасаєссадас аастста 17 «210» 637 «2115 18 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«400» 637 теЕсаасаєса дасаастс 18 «210» 638 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 638 таасаєсада саастс 16 «2105 639 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 639 ассстаасаєс адасаа 16 «2105» 640 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 640 сстассттаас ассадас 17 «2105» 641 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 641 тссстаєтта асасса 16 «2105 642 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 642 тсаасдаста ттддаах 17 «2105» 643 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 643 стстатаєссст ддстатх 16 70 «2105» 644
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 644 акссттатає хстддс 16
«2105» 645 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 645 дассстстата стада 16 «2105» 646 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 646 тдаєссттає асксста 16 «2105 647 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 647 ассдааастє датсст 16 «2105» 648 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 648 астурєсаєсуд ааастт 16 «2105» 649 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 649 тсттастадаєс астдаа 16 65 «2105» 650 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 650 аддаєсттас тдєсатт 17 «210» 651 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 651 дсаааєсаас хссатс 16 «2105» 652 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 652 дсдсаааєса астсса 16 «2105» 653
Зо «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 653 сааттаєтс ттддс 17 «2105» 654 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 654 тддсаасаат тастст 18 «2105» 655 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 655 бо дстддсааса астатт 16 «2105» 656 «2115 16 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005» 656 акссаєттьст астдсс 16 «2105» 657 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 657 таастаєстає сдаєьеста 19 «2105 658 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 658 тсаасадсдє адддса 16 «210» 659 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 659 тЕсаатадсд таддас 16 «210» 660 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 660 аддаєсааста асссаатад 19 «210» 661 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 661 саєстсдсаає ссстад 16 «2105» 662 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 662 асаєтстдсраа хссста 16 70 «210» 663
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 663 аасаєсссдста асссст 16
«2105» 664 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 664 тааассссаа ЯдЕсста 16 «2105» 665 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 665 дЕссаааєттє саадесст 18 «210» 666 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 666 ссаадесстаа астссаад 18 «210» 667 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 667 асссааднє аааттс 17 «2105» 668 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 668 сасасадсда сссаадеь 19 65 «210» 669 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 669 асассссата садсда 16 «2105» 670 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 670 адсасадстс хасатс 16 «2105 671 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 671 асасадсаса дстста 16 «2105 672
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 672 тссататадс асадст 16 «2105» 673 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 673 асссссатає адсаса 16 «2105 674 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 674 бо тестасетссса татадса 17 «2105» 675 «2115 16 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005» 675 теЕстастессса татадс 16 «210» 676 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 676 ааддададда даєссата 17 «2105 677 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 677 адессстсдтд садст 16 «210» 678 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 678 даадсесттає детадс 16 «210» 679 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 679 ассааєссаєс сатссас 17 «2105» 680 «2115 18 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 680 ассааєсстааєс татссатс 18 «210» 681 «2115 18 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «400» 681 адааєсааєс аастатсс 18 «2105» 682 70 «2115 16
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 682 тдадатассд тоасата 16 «2105 683 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 683 аасдадастас судсдса 16 «2105» 684 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 684
Зо стасддаеєсад дстаатх 16 «2105» 685 «2115 20 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 685 аададсаадд дЕстатадеЕ 20 «2105» 686 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 686 дасдддєстаа дадсаа 16 «210» 687 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 687 адсадасддуд ссаада 16 65 «210» 688 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70 «220»
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 688 тасааасаєє тдсадс 16
«210» 689 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 689 сстдстстата аатдудта 16 «2105» 690 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 690 тадссстдст ахтааає 16 «210» 691 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 691 тсттсттадеі ссаата 16 «2105» 692 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 692 тддсестаа стасає 16 «2105» 693 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 693 адссдає стааста 17 бо «2105» 694 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 694 70 даасдаааст тдсста 16
«2105» 695 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 695 ассассстта садах 16 «2105» 696 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 696 дсасссааєтт ассси 16 «210» 697 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 697 тадасасссаат татстсси 16 «2105» 698 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 698 тсдсасссаа ттатсс 16 «210» 699 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 699 теЕтдсассса астатс 16
«2105» 700 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 700 65 адсадсадає хата 16 «2105 701 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «400» 701 таддаадтдд стада 16 «2105 702 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 702 стддададсд асаата 16 «2105 703 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 703 аасдстддає хасуєс 16 «2105» 704 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 704 саасдстдда стсасди 16
«2105» 705 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 705 ттдеЕссадаа дсатсс 16 «2105» 706 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005» 706 даєсдаєссдс стсддад 16 «2105 707 «2115 16 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005 707 даааєсаєсс асаасс 16 «2105» 708 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 708 ттдсаасаєс тастас 16 «2105» 709 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 709 састаадсад саадетс 16 «2105 710 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 710 тсастадасд сдадса 16 «2105 711 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 711 теЕсастадає дсдадс 16 «2105 712 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 712 дассаадсас сттаса 16 «2105 713 бо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 713 адассаадса ссетас 16 70 «2105 714
«2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 714 асдддаєсааа хааадад 16
«2105 715 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 715 тсаассадад тастаа 16 «2105 716 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 716 деісаассада дсатта 16 «2105 717 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 717 ассдсааадс датах 16 «2105 718 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 718 сасаєсааєтуд хааадс 16 «210» 719 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 719 даддестдсе асетас 16 65 «2105 720 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 720 тасадаєсса атдсст 16 «2105 721 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 721 сстсаєттата стасда 16 «2105 722 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 722 ссттасдста сдасас 16 «2105 723
Зо «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 00«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 723 тссттастдсе асдаса 16 «2105» (724 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 724 аадасдеєса адсата 16 «2105 725 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 725 бо стдаєстаєса адасди 16 «2105 726 «2115 16 «212» ДНК 65 «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70 «4005 726 тддаааддса сдаатт 16 «2105 727 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 727 асттдаасдуд сттдда 16 «2105 728 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 728 аастсдаатд дсетда 16 «2105» 729 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 729 саасдсдеста стає 16 «2105» 730 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 730 асаасдсуєє астаєтт 16 «2105 731 «2115 16 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 731 саєстдстає атсаада 16 «2105 732 «2115 16 60 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 65 «4005 732 сстададсаа ахастт 16 «2105» 733 70 «2115 16
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 733 сададессаає аахаад 16 «2105» 734 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 734 дЕссаадсас аасдаа 16 «2105 735 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 735
Зо адддеєсаад сасаас 16 «2105» 736 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 736 тассодадас астде 16 «2105 737 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 737 ааддаддаді хаддас 16 «2105» 738 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 60 «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 738 стасдссаєс тасдахє 16 «2105» 739 65 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 70 «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 739 тсааатдсад аастад 16 «2105» 740 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 740 адсдасааєс ааатсдс 16
«2105 741 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 741 аадсдасаає сааатад 16 «2105 742 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 742 дсдсассаад хаасаа 16 «2105 743 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 743 тдадатдєса аастда 16 «2105 744 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 744 адсссасаєь сстдс 16 60 «2105» 745 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 65 «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 745 тасдасдаада ддадад 16 70
«2105 746 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 746 сасстттааа асссса 16 «2105 747 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 747 тсстттасаа ссасас 16 «2105 748 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
Зо «4005 748 асддсаєсеє сасадд 16 «2105 749 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 749 дасастасаа хдадда 16 «2105 750 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 750 тадесессад дастає 16 «2105 751 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 751 65 сдасааассс татсст 16 «2105 752 «2115 16 «212» ДНК 70 «2135 Штучна послідовність
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 752 тдастастасаа тдстас 16 «2105 753 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«4005 753 тсаєсдоадса аасета 16 «2105 754 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 754 тастсстасаа ахоадса 16 «2105» 755 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 755 саадсссаса тест дс 18
«2105 756 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 756 сасастдєдаа даддадад 18 «2105 757 «2115 16 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 60 «4005 757 сасстттааа асссса 16 «2105» 758 «2115 18 65 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив 70
«4005 758 сассстттає аассасас 18 «2105» 759 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 759 саасддсаєсє ссасада 18 «2105» 760 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 760 садасастас аасдадда 18 «2105 761 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
Зо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 761 саєсдаєсеє аддастди 18 «2105 762 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 762 сасдасааасє хстатсст 18 «2105» 763 «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 763 саєдасастас аасдстас 18 «2105 764 бо «2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» 65 «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 764 сассдаєсддуд саааєтста 18 70 «2105» 765
«2115 18 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 765 саєсдсесстає ааасдута 18
«2105» 766 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність
«220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005» 766 саасааасаа тддаетастст 20 «2105 767 «2115 18 «212» ДНК «2135» Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 767 сасадаєсда хтддасаде 18 «2105» 768 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив
«400» 768 сасстаєттта асассадас 19 «2105» 769 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «400» 769 састаастдс адсадсастс 20 «2105» 770 «2115 20 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність бо «220» «223» Олігонуклеотидний мотив «4005 770 саасааасає даасстстсс 20 65 «2105 771 «2115 17 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність 70
«223» Олігонуклеотидний мотив «4005 771 тдаєссааєс стадсса 17 «2105 772 «2115 16 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Последовательность-мишень «4005 772 дсадсададс саатта 16 «2105 773 «2115 10 «2125 ПпПРТ «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВУ «4005 773
Ре Геи Рго 5ег А5Зр Ре Ріе Рго 5ег Ммаї 1 5 10
Зо «2105 774 «2115 15 «2125 ПпПРТ «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВУ «4005 774 о1у Агд сій Тс омаї геи сіи Туг Ге Ма! 5ег Ре сіу ма! тер 1 5 10 15 «2105 775 «2115 15 «2125 ПпПРТ «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВМ «4005 775
ТАг отиг Рае ніх сіп тигогеи сіп А5зр Рго Агду маї Агд су гей 5Б Е'1 5 10 15 «2105 776 «2115 16 «2125 ПпПРТ бо «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВУ 65 «4005 776 сп Аїа сіу РПе Ре Геи Ге Тийг Агуд Іїе Ге Тйг ІЇе Рго сп 5ег 1 5 10 15 70 «2105 777
«2115 9 «2125 ПпПРТ «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВУ «4005 777
Ре Геи Геи Тийг Ага Іїе Гей Тк Пе 1 5 «2105 778 «2115 15 «2125 ПпПРТ «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВУ «4005 778
ТИг об5ег гей АЗп Ре Ге сіу сіу Тийг тйг маї Суз Гей сіу сп 1 5 10 15 «2105 779 «2115 9 «2125 ПпПРТ «2135 Штучна
Зо «220» «223» Епітоп НВУ «4005 779
Рпе Геи сіу сіу Ттийг тиг маї су Ге 1 5 «2105» 780 «2115 9 «2125 ПпПРТ «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВМ «4005» 780
Тер Ге 5ег Ге Гей ма! Рго РНе ма! 1 5 «2105 781 «2115 21 «2125 ПпПРТ «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВУ 60 «4005 781 5зег Гей ге ма! Рго Ре ма! сіп тер РіПе маїЇ сіу Гей 5ег Рго Тег 1 5 10 15 65 ма! тер Геи 5ег ма! 20 «2105 782 70 «2115 10
«2125 ПРТ «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВМ «4005 782 с1у Ге б5ег Рго Тиг маї Тер Геи 5ег маї 1 5 10 «2105» 783 «2115 10 «2125 ПРТ «2135 Штучна «220» «223» Епітоп НВМ «4005» 783 5ег ІчІЇе Ге 5ег Рго Ре Геи РгОо Гей Гей 1 5 10 «2105» 784 «2115 19 «212» ДНК «2135 Штучна
Зо «220» «223» Праймер «4005» 784 стасадсстта ддахдасе 19 «2105» 785 «2115 24 «212» ДНК «2135 Штучна «220» «223» Праймер «4005 785 ааддааадаа дссадааддс аааа 24 «2105» 786 «2115 25 «212» ДНК «2135 Штучна «220» «223» Праймер «4005» 786 тЕсСтттасаа аддассдатає ссата 25

Claims (1)

  1. 60 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Антисмисловий олігонуклеотид для зниження експресії РО-Ї71, в якому антисмисловий олігонуклеотид має формулу ССіашаасаїсАсАсС, де заголовні букви позначають бета-0- оксинуклеозиди І МА, малі літери позначають нуклеозиди ДНК, всі С Ї МА являють собою 5- 65 метилцитозин і всі міжнуклеозидні зв'язки являють собою фосфоротіоатні міжнуклеозидні зв'язки.
    2. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду для зниження експресії РО-І1, де кон'югат антисмислового олігонуклеотиду містить олігонуклеотид за п. 1 і кон'югатне угруповання,
    націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, ковалентно приєднане до зазначеного олігонуклеотиду.
    З. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за п. 2, в якому присутній лінкер між олігонуклеотидом і кон'югатним угрупованням.
    4. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за п. 2 або 3, в якому угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, являє собою тривалентне М-ацетилгалактозамінне (сЗаїЇМАс) угруповання.
    5. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким одним з пп. 2-4, в якому лінкер являє собою фізіологічно лабільний лінкер.
    6. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за п. 5, в якому фізіологічно лабільний лінкер являє собою нуклеазочутливий лінкер.
    7. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за п. 5 або 6, в якому фізіологічно лабільний лінкер містить динуклеотид цитидин-аденозин.
    8. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за п. 2, в якому присутній лінкер між олігонуклеотидом і кон'югатним угрупованням; де кон'югатне угруповання додатково містить угруповання, націлене на рецептор асіалоглікопротеїну, що являє собою тривалентне М- ацетилгалактозамінне (сСаіМмАс) угруповання; де лінкер являє собою фізіологічно лабільний лінкер; де додатково фізіологічно лабільний лінкер містить динуклеотид цитидин-аденозин.
    9. Кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким одним з пп. 2-8, в якому кон'югат антисмислового олігонуклеотиду має формулу ОМ2-СбосоаосСтіашаасаїсАсСАС, де Сб представляє аміноалкільну групу з б атомами вуглецю, заголовні букви позначають бета-О- оксинуклеозиди І МА, малі літери позначають нуклеозиди ДНК, всі С Ї МА являють собою 5- метилцитозин, підрядковий символ о позначає фосфодіефірний нуклеозидний зв'язок і, якщо не вказано інше, всі міжнуклеозидні зв'язки являють собою фосфоротіоатні міжнуклеозидні зв'язки, і де ОМ2 позначає тривалентний саіМАс кластер формули г о з о нО сич яти дитя, дити А з й ШК « Що що у у ча а К я о но судити тут и ую т КВ г ОН В та У ; ЩІ о о не учити нути 7 М - МВ 7 де хвиляста лінія ілюструє сайт кон'югування тривалентного кластера саїЇМАс з аміноалкільною групою Сб.
    10. Фармацевтична композиція, що містить антисмисловий олігонуклеотид за п. 1 або кон'югат Зо антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким одним з пп. 2-9 та фармацевтично прийнятний розріджувач, розчинник, носій, сіль та/або ад'ювант.
    11. Фармацевтична композиція за п. 10, де фармацевтично прийнятний розчинник являє собою стерильний фосфатно-сольовий буферний розчин.
    12. Фармацевтична композиція за п. 10 або 11, де фармацевтично прийнятна сіль являє собою натрій.
    13. Фармацевтична композиція за п. 10 або 11, де фармацевтично прийнятна сіль являє собою калій.
    14. Спосіб /л у/уо або /л міо модулювання експресії РО-І 1 в клітині-мішені, яка експресує РО-І 1, причому зазначений спосіб включає введення в зазначену клітину антисмислового олігонуклеотиду за п. 1, кон'югата антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким одним з пп. 2-9 або фармацевтичної композиції за будь-яким одним з пп. 10-13 в ефективній кількості.
    15. Антисмисловий олігонуклеотид за п. 1, кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь- яким одним 3 пп. 2-9 або фармацевтична композиція за будь-яким одним з пп. 10-13 для застосування у відновленні імунної відповіді проти вірусу.
    16. Антисмисловий олігонуклеотид, кон'югат антисмислового олігонуклеотиду або фармацевтична композиція для застосування за п. 15, де вірус являє собою НВУ.
    17. Антисмисловий олігонуклеотид за п. 1, кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь- яким одним 3 пп. 2-9 або фармацевтична композиція за будь-яким одним з пп. 10-13 для застосування у відновленні імунної відповіді проти паразита.
    18. Антисмисловий олігонуклеотид, кон'югат антисмислового олігонуклеотиду або фармацевтична композиція для застосування за будь-яким одним з пп. 15-17, де відновлення імунної відповіді являє собою збільшення в печінці рівня Т-клітин СО8ж, специфічних відносно одного або декількох антигенів НВУ, в порівнянні з контролем.
    19. Антисмисловий олігонуклеотид за п. 1, кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь- яким одним 3 пп. 2-9 або фармацевтична композиція за будь-яким одним з пп. 10-13 для застосування як лікарського засобу.
    20. Антисмисловий олігонуклеотид за п. 1, кон'югат антисмислового олігонуклеотиду за будь- яким одним 3 пп. 2-9 або фармацевтична композиція за будь-яким одним з пп. 10-13 для застосування в лікуванні інфекції НВМ.
    21. Застосування антисмислового олігонуклеотиду за п. 1, кон'югата антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким одним з пп. 2-9 або фармацевтичної композиції за пп. 10-13 для одержання лікарського засобу для лікування інфекції НВМ.
    22. Спосіб лікування або запобігання інфекції НВМ, що включає введення терапевтично або профілактично ефективної кількості антисмислового олігонуклеотиду за п. 1, кон'югата антисмислового олігонуклеотиду за будь-яким одним з пп. 2-9 або фармацевтичної композиції за будь-яким одним з пп. 10-13 суб'єкту, який страждає на інфекцію НВМ або сприйнятливий до інфекції НВМ. воя :
    ФІГ. 1 с. аз в ша М. І « о тяци ня А в в й до прути отри, «Аа т , Же їв ні ху х М детей нд іч - ШЕ ні були МНАє У т г а ; 4 др с дини деруни МА жна М й 5 но опо днтнняй. мя С НА: ; ов і во а г" ко : " дура в пнжке З і що 3 пов | . ;
    і о. рел Опігонуклеотид ння як 8 5 дл Фе май у див їн ,
    ФІГ. 1 продовження вн Е но б «У, а а 7 9 че у 7 п байт дит -ви оно у ж но 4 І хх ; ! не : - дити дити ви протя битих Опігонуклеотид нас ов В о - Ф но и ід ни удо ою нови ен ж я а о мо дети в и дин вий вкоояне у з у нина і і Те Зй ГКЗЙ і Й не дити нов я У ни св В зи чи? о тки тут Опігонуклеотид : іс Яна де ; Й а Ноя о ча Ся Й
    З 9.1.9 ЩІ Л мо! - и ди ик йнає В й шк З во зу" - вит ди ди пет ун іє пон іх дитя, оно ма : я У Ше - ХУ ї ; . т че ай ри едикт че дики поєднати тки Зититу "Олігонуклеотид їж ан В Ї є їма Я а ' є наб и ди з дити пити здерти Бк 8 В ФІГ, 1 продовження
    . о И Но он о о тя до І л АсНМ о но он о а , Ж о. ру от Й АсСНМ о но Он г о пт и Дь АН
    ФІГ. 1 продовження
    »
    РО-Ї1 (5 від імітації) є Ебс(мкМ)
    ре м Ф а о г о о її с т а а
    ! ИН . 20202100 Ше ши я. шишшишш нини : : о як : ї ча ж - . і : що :
    і ї : ,. ! ве 7 ке: змін! : ВИШ ; : Я : дал 5 г : | 5 : і і, :
    ж ан ши шеє щ
    ОО Я а Ж,
    т КВ о : : Ж : Ух :
    ж щ : нин: 5 : : МК я : ї г ї хх в и тп пит я 84 ВК б: : 7 і ав Е : а
    Б жа 55 шк ж хо ЩО ши 5 ! | Я
    Еко | ше Ж ! ді:
    й с Р в нин: НИ ш ши шшн й нн в ОЖ во. ж о; : . ї ! І жд ! : ! :
    да ПИ бо | : ше
    - 8 Б г о. : : с : ЕНН : о ше ше КОЖ НИ | | с : паж г пн и ан ши Жов
    БК | 000000 жк ен В ення Я стен нт няття 2 оч ГТК ее сх я ЗБ Бе 5 ВВ хх В ей в п х п ж фіг и Хо лмля ІнАє й ож ши. щу на чи чи за ди ї 7 АК .
    анг. З що БА : У ; ОМРІЮ МО 766 З т в, 5 де с ; о о Щі й ПВ ще. щх й тб ж воля то ще дея У
    ФІГ. 4
    СМР Ів МО 767 2 Кк і гл ще Ен і ее ня; : в б. 5, пи - сх ів д- - -- - ов; ДА где. яд
    ФІГ. 5
    СМР МО 768 2 п п ше Є і Я де но ще ви дос ДЯ як пт і Рея тво Му як ТВ, Тр бр
    СМРІЮ МО 769 2 й т ше її ї ХМ «и «і с НК; ОТ Осн ДКДУКЯ яйо Би е -ї до с» но МН ко
    ФІГ. 7
    СМРІО МО 770 2 ще 7 ще я ЩА т я нео. з Е . з ней. нх ная дя 7 ня
    А Фізіологічний 744 1 755 2 розчин (Стопе) (ОвічмАсі Полк - жо вові кДа 1 6 8 9 2124 25 16 15 20 120- Зк кийошенниш Є вВінкулін ш- 31. до ОО по оте Б Фізіологічний 747 1 758 2 розчин г гопе 3 (ба Ас) Поп я ж «Да 53 51 55 91 93 95 97 98 99 ОПО ОО во. ооо со ве о р о НИ ИЙ ШК -. . - Фашисти Вінкулін тон те МА нку 5о "(пі ро ООН дб - Б Фізіологічний 748 1 758 2 розчин (голе) (ОСвіМмАє) Потік - жов ж кДа 53 51 55 81 63 64 66 67 70 «ЕКО ОВО В ВОК кВ о о повин п-- А віулін 5-1, ОНИ М у що
    Фіг. 8
    Г Фізіологічний 752 1 753 2 розчин (гопе)3 (баїмАє) Полі (ГС3; сх ж сн за: ж сне ма, кН ИН кДа 1 6 8 9 42 44 45 36 39 40 по- В,, кулін шини РО ОКО в и в ЕН е до шк и Д Фізіологічний 7531-7642 розчин (голе) (СаіМмАс) Поліб я юю жов Да 1 5 6 9 41 А? Ай 4 АВ 50 А ММ ПТ ТТ Вінкулін с 1 40 п ФІГ, 9 продовження
    А Б - - Е 4 т є жквк а тету р опованннї « 8 6 Кк 5 з їй г. а й а Бей -Х Е в 4 зай ВА са 2 за : : 7 ее з з. й в в цк « її з 98. ле 4 м Е 412 Ку ж ЕК |дрчи яю 5 Чл ав я же й « Ж Фа. т 9 ; преси зе Ж ою в у пвх же Кк я Ку є часи зе г о а а КК Ж Ж ся я к-й К-ї ФР й т я хх м «й як т Ж б б ще СсЯ я ко Я СИ Ж я я я й й Кз я « я «7 а з ху й щ В ем, 8 20 у т -п---н 87" Бе ' З з що е я » ак ще х8 Оля є та ав - бо че т х й вот о ня ; од 5-4 я Зк ж Ка я ки е ШК Се ее о Фе щ є ч У х ху Кк Ка Ж я «й Ку о с що й е
    ФІГ. 10 т; у Збкнітян РДА СТВ з т з сереа тові со в б че є жк Ж 8 в Б 2 у т, зе ; Ї зо з ту Ех і я жо о с че я Кч а р «й з ех За ія . аа тр вх іх Ія кі її З й е тя,
    8. ба кайтцє РОЗ СО - З 4 о е серох Т-каїтни спе я ч.ч . «ві вза че т т т 4 5, сс Ж щ а й, в З у 7 з в ши , з, -. ь Ї РИМИ тора, |» би ЕЕ» Її че ще «Ух - об кліпі РІГ т Ф з» серед Веклітия щі т, Фу а о в в В з, У йо з тк «о а | я: Яр, КЕ Ж» в: в «я Ок "в з ще ФІГ, 44
UAA201810179A 2016-03-14 2017-03-14 Олігонуклеотид для зниження експресії pd-l1 UA127432C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16160149 2016-03-14
PCT/EP2017/055925 WO2017157899A1 (en) 2016-03-14 2017-03-14 Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127432C2 true UA127432C2 (uk) 2023-08-23

Family

ID=58314191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201810179A UA127432C2 (uk) 2016-03-14 2017-03-14 Олігонуклеотид для зниження експресії pd-l1

Country Status (30)

Country Link
US (5) US20170283496A1 (uk)
EP (2) EP3430141B1 (uk)
JP (3) JP6748219B2 (uk)
KR (5) KR102417646B1 (uk)
CN (5) CN114736901B (uk)
AR (2) AR108038A1 (uk)
AU (4) AU2017235278C1 (uk)
CA (2) CA3120687A1 (uk)
CL (4) CL2018002570A1 (uk)
CO (1) CO2018007761A2 (uk)
CR (2) CR20180432A (uk)
DK (1) DK3430141T3 (uk)
ES (1) ES2857702T3 (uk)
HR (1) HRP20210315T1 (uk)
HU (1) HUE053172T2 (uk)
IL (5) IL317818A (uk)
LT (1) LT3430141T (uk)
MX (2) MX2018010830A (uk)
MY (1) MY194912A (uk)
PE (3) PE20230157A1 (uk)
PH (1) PH12018501964A1 (uk)
PL (1) PL3430141T3 (uk)
PT (1) PT3430141T (uk)
RS (1) RS61528B1 (uk)
RU (1) RU2747822C2 (uk)
SG (1) SG11201807854SA (uk)
SI (1) SI3430141T1 (uk)
TW (5) TWI721128B (uk)
UA (1) UA127432C2 (uk)
WO (1) WO2017157899A1 (uk)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
CA2767253A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Ontorii, Inc. Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
WO2013012758A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Ontorii, Inc. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
JP6268157B2 (ja) 2012-07-13 2018-01-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ 不斉補助基
KR102712879B1 (ko) 2012-07-13 2024-10-04 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
US10144933B2 (en) 2014-01-15 2018-12-04 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
EP4137572A1 (en) 2014-01-16 2023-02-22 Wave Life Sciences Ltd. Chiral design
CA2993201A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 The Children's Medical Center Corporation Pd-l1 expressing hematopoietic stem cells and uses
HUE053172T2 (hu) * 2016-03-14 2021-06-28 Hoffmann La Roche Oligonukleotidok a PD-L1 expresszió csökkentésére
US10988763B2 (en) 2016-06-22 2021-04-27 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded RNA-editing oligonucleotides
US20220354888A1 (en) * 2016-08-03 2022-11-10 Aalborg Universitet ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES (ASOs) DESIGNED TO INHIBIT IMMUNE CHECKPOINT PROTEINS
PL3507366T3 (pl) 2016-09-01 2021-05-04 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemicznie modyfikowane jednoniciowe oligonukleotydy edytujące rna
US11666595B2 (en) 2016-10-07 2023-06-06 Secarna Pharmaceuticals Gmbh & Co. Kg Antisense oligonucleotides for inhibition of PD-L1 expression and treating cancer
WO2019060708A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 The Children's Medical Center Corporation TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISORDERS
CN118048356A (zh) 2017-10-16 2024-05-17 豪夫迈·罗氏有限公司 减少PAPD5和PAPD7 mRNA的核酸分子用于治疗乙型肝炎感染
KR102839166B1 (ko) * 2018-01-12 2025-07-28 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 알파-시누클레인을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도
BR112020013994A2 (pt) 2018-01-12 2020-12-08 Bristol-Myers Squibb Company Oligonucleotídeos antissenso que direcionam alfa-sinucleína e seus usos
GB201808146D0 (en) 2018-05-18 2018-07-11 Proqr Therapeutics Ii Bv Stereospecific Linkages in RNA Editing Oligonucleotides
JP2021527437A (ja) 2018-06-22 2021-10-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｓｃｎ９ａ発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
WO2020007772A1 (en) * 2018-07-02 2020-01-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting gbp-1
WO2020011653A1 (en) * 2018-07-09 2020-01-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting kynu
AU2019300324A1 (en) 2018-07-13 2021-01-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for modulating RTEL1 expression
WO2020081585A1 (en) * 2018-10-15 2020-04-23 The Brigham And Women's Hospital, Inc. The long non-coding rna inca1 and homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein h1 (hnrnph1) as therapeutic targets for immunotherapy
CN113507942A (zh) * 2019-03-05 2021-10-15 豪夫迈·罗氏有限公司 分子的细胞内靶向
AU2020254929A1 (en) 2019-04-02 2021-11-11 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for immunotherapy
JP2022532998A (ja) * 2019-04-26 2022-07-21 ストーク セラピューティクス，インク． 選択的イントロンのスプライシングを調節するための方法及び組成物
KR20220005045A (ko) * 2019-05-03 2022-01-12 세카나 파머씨티컬스 지엠비에이치 엔 씨오. 케이지 종양 치료에 사용하기 위한 pd-l1 안티센스 올리고뉴클레오타이드
WO2021122910A1 (en) * 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of sbds inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021122735A1 (en) * 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of sept9 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021123086A1 (en) * 2019-12-20 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Enhanced oligonucleotides for inhibiting scn9a expression
MX2022007909A (es) * 2019-12-24 2022-07-21 Hoffmann La Roche Combinacion farmaceutica de agentes antivirales que actuan sobre hbv y/o un inmunomodulador para el tratamiento de hbv.
WO2021173812A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Aligos Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeting pd-l1
WO2022029209A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotide treatment of hepatitis b patients
CN114507663A (zh) * 2020-11-16 2022-05-17 浙江柏拉阿图医药科技有限公司 寡核苷酸及其在抗乙型肝炎和丁型肝炎病毒中的应用
CN115216474B (zh) * 2021-04-15 2025-09-30 武汉大学 促进pd-l1外显子3跳跃的反义寡核苷酸及其应用
WO2023011597A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-09 Hepagene Therapeutics (HK) Limited Ligand conjugates for delivery of therapeutically active agents
CN113789324B (zh) * 2021-08-17 2023-08-25 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种aie探针及其制备方法与在荧光定量pcr方法中的应用
EP4430184A2 (en) 2021-11-11 2024-09-18 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical combinations for treatment of hbv
CA3257440A1 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Adverum Biotechnologies, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF ACHROMOTOPSY
TW202504619A (zh) * 2023-07-20 2025-02-01 大陸商上海舶望製藥有限公司 用於抑制pd-l1表達的組合物和方法

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
RU2175657C2 (ru) * 1990-11-08 2001-11-10 Чирон Корпорейшн Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
AU2916292A (en) 1991-10-24 1993-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
ATE222589T1 (de) 1994-10-06 2002-09-15 Isis Pharmaceuticals Inc Peptid-nukleinsäure-konjugate
US5684142A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Oncor, Inc. Modified nucleotides for nucleic acid labeling
AU1039397A (en) 1995-11-22 1997-06-27 Johns Hopkins University, The Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US5770716A (en) 1997-04-10 1998-06-23 The Perkin-Elmer Corporation Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same
EP0975370B9 (en) 1997-05-21 2004-11-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Composition and method for enhancing transport across biological membranes
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
NZ513402A (en) 1999-02-12 2003-06-30 Sankyo Co Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
JP2002543214A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 エクシコン エ／エス Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US20060276422A1 (en) 2001-05-18 2006-12-07 Nassim Usman RNA interference mediated inhibition of B7-H1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2005007855A2 (en) * 2003-07-14 2005-01-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF B7-H1 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US7595048B2 (en) * 2002-07-03 2009-09-29 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Method for treatment of cancer by inhibiting the immunosuppressive signal induced by PD-1
EP1569661B1 (en) 2002-11-18 2009-09-09 Santaris Pharma A/S Antisense design
CA3040025C (en) 2003-06-12 2023-01-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved hbv and hcv sequences useful for gene silencing
EP1495769B1 (en) 2003-07-11 2008-02-27 LBR Medbiotech B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
CN101084438B (zh) * 2004-10-06 2013-12-25 梅约医学教育与研究基金会 B7-h1和癌症的诊断、预后和治疗方法
HUE039237T2 (hu) 2004-10-06 2018-12-28 Mayo Found Medical Education & Res B7-H1 és PD-1 vesesejt karcinoma kezelésében
US20120122801A1 (en) 2005-01-05 2012-05-17 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
EP3130350A1 (en) 2005-06-08 2017-02-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the treatment of persistent infections and cancer by inhibiting the programmed cell death 1 (pd-1)pathway
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
US7399845B2 (en) 2006-01-27 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
JP5825754B2 (ja) 2006-05-05 2015-12-02 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ａｐｏｂの発現を調節するための化合物および方法
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
CN101490074B (zh) 2006-05-11 2013-06-26 Isis制药公司 5’-修饰的双环核酸类似物
NZ594510A (en) * 2006-12-27 2012-06-29 Harvard College Compositions and methods for the treatment of infections and tumors
US8580756B2 (en) 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
DK2170917T3 (da) 2007-05-30 2012-10-08 Isis Pharmaceuticals Inc N-Substituerede bicycliske nukleinsyreanaloge med aminomethylenbro
ES2386492T3 (es) 2007-06-08 2012-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos
ATE538127T1 (de) 2007-07-05 2012-01-15 Isis Pharmaceuticals Inc 6-disubstituierte bicyclische nukleinsäureanaloga
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
DK2285819T3 (da) 2008-04-04 2013-12-02 Isis Pharmaceuticals Inc Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider
EP3604533A1 (en) 2008-04-11 2020-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
DK2356129T3 (da) 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
SI2370593T1 (sl) 2008-11-28 2016-08-31 Emory University Postopek za določanje učinkovitosti antagonista pd-1
US8217149B2 (en) * 2008-12-09 2012-07-10 Genentech, Inc. Anti-PD-L1 antibodies, compositions and articles of manufacture
JPWO2010101249A1 (ja) * 2009-03-06 2012-09-10 国立大学法人三重大学 Ｔ細胞の機能増強方法
CN103223177B (zh) * 2009-05-06 2016-08-10 库尔纳公司 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病
JP5960049B2 (ja) * 2009-05-28 2016-08-02 クルナ・インコーポレーテッド 抗ウイルス遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による抗ウイルス遺伝子関連疾患の治療
US9012421B2 (en) 2009-08-06 2015-04-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
EP4385568A3 (en) * 2010-04-06 2025-02-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of cd274/pd-l1 gene
JP2013534410A (ja) * 2010-05-18 2013-09-05 ザ ロイヤル インスティチューション フォー ザ アドバンスメント オブ ラーニング／マクギル ユニバーシティ 悪性神経膠腫においてｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａの発現を減少させる方法
WO2011156202A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2 '-amino and 2 '-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
LT2606134T (lt) 2010-08-17 2019-07-25 Sirna Therapeutics, Inc. Hepatito b viruso (hbv) geno raiškos slopinimas, tarpininkaujant rnr interferencijai naudojant mažą interferuojančią nukleorūgštį (sina)
KR20180110186A (ko) 2010-10-28 2018-10-08 베니텍 바이오파마 리미티드 Hbv 치료
EP3192800A1 (en) 2010-12-17 2017-07-19 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for sirna
BR122020024388B1 (pt) 2010-12-29 2021-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotídeo e composição farmacêutica
EP3505528B1 (en) 2011-04-21 2020-11-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
KR102434346B1 (ko) 2011-06-30 2022-08-18 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 B형 간염 바이러스의 유전자 발현 저해용 조성물 및 방법
WO2013012758A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Ontorii, Inc. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
US10023861B2 (en) 2011-08-29 2018-07-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
HK1198766A1 (en) 2011-09-07 2015-06-05 玛瑞纳生物技术有限公司 Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
WO2013049307A2 (en) 2011-09-30 2013-04-04 University Of Miami Enhanced immune memory development by aptamer targeted mtor inhibition of t cells
BR112014009526B8 (pt) * 2011-10-17 2023-01-17 Herlev Hospital Composição de vacina compreendendo pd-l1, kit de partes compreendendo tal composição e uso dos mesmos para tratar ou prevenir câncer
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
WO2013159109A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
WO2013173635A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
AU2013262699A1 (en) * 2012-05-16 2015-01-22 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating ATP2A2 expression
JP6268157B2 (ja) 2012-07-13 2018-01-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ 不斉補助基
US20150291958A1 (en) 2012-11-15 2015-10-15 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Anti apob antisense conjugate compounds
CA2889298C (en) 2012-11-30 2024-01-02 Anton Belousov Identification of patients in need of pd-l1 inhibitor cotherapy
US20150368642A1 (en) 2013-01-30 2015-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
WO2014118272A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
US9127276B2 (en) 2013-05-01 2015-09-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
AU2014300981B2 (en) 2013-06-27 2017-08-10 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligomers and conjugates targeting PCSK9
WO2015114146A1 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 Sividon Diagnostics Gmbh Method for predicting the response to an anti-her2 containing therapy and/or chemotherapy in patients with breast cancer
WO2016025647A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and a cancer vaccine
SG11201702877TA (en) 2014-10-10 2017-05-30 Hoffmann La Roche Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
US9828601B2 (en) 2015-02-27 2017-11-28 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting checkpoint gene expression and uses thereof
GB201507926D0 (en) * 2015-05-08 2015-06-24 Proqr Therapeutics N V Improved treatments using oligonucleotides
JP6893505B2 (ja) * 2015-10-02 2021-06-23 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス オリゴヌクレオチドコンジュゲーション方法
EP3377510B1 (en) 2015-11-16 2020-12-02 H. Hoffnabb-La Roche Ag Galnac cluster phosphoramidite
US10982215B2 (en) 2015-12-09 2021-04-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) and methods of use thereof
HUE053172T2 (hu) * 2016-03-14 2021-06-28 Hoffmann La Roche Oligonukleotidok a PD-L1 expresszió csökkentésére

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022034059A (ja) 2022-03-02
AU2021236439A1 (en) 2021-10-14
AU2017235278A1 (en) 2018-08-09
AU2022202479B2 (en) 2025-03-20
CA3120687A1 (en) 2017-09-21
IL303077B1 (en) 2025-02-01
JP2024029180A (ja) 2024-03-05
LT3430141T (lt) 2021-03-25
WO2017157899A1 (en) 2017-09-21
AU2021236439B2 (en) 2022-06-16
CN114736900B (zh) 2024-05-10
CN108779465B (zh) 2022-05-13
MX2022012221A (es) 2022-10-27
IL317818A (en) 2025-02-01
RU2747822C2 (ru) 2021-05-14
US20200048344A1 (en) 2020-02-13
CL2020001126A1 (es) 2020-08-28
MY194912A (en) 2022-12-22
PE20230157A1 (es) 2023-02-01
PH12018501964A1 (en) 2019-06-24
IL290294B (en) 2022-10-01
AU2022202479A1 (en) 2022-05-12
IL290294B2 (en) 2023-02-01
JP7002603B2 (ja) 2022-02-10
US20230331837A1 (en) 2023-10-19
CR20180432A (es) 2018-11-21
CL2020000865A1 (es) 2020-08-28
CN114085836B (zh) 2024-01-26
US10829555B2 (en) 2020-11-10
KR102306797B1 (ko) 2021-10-05
IL296483B2 (en) 2023-10-01
CR20200119A (es) 2021-04-19
US20170283496A1 (en) 2017-10-05
DK3430141T3 (da) 2021-03-01
ES2857702T3 (es) 2021-09-29
IL303077B2 (en) 2025-06-01
PL3430141T3 (pl) 2022-02-28
IL303077A (en) 2023-07-01
TW201734209A (zh) 2017-10-01
TW202128997A (zh) 2021-08-01
AU2017235278A8 (en) 2018-08-16
US20210147535A1 (en) 2021-05-20
CN114736901A (zh) 2022-07-12
KR20220100095A (ko) 2022-07-14
CN108779465A (zh) 2018-11-09
BR112018068410A2 (pt) 2019-01-15
SI3430141T1 (sl) 2021-04-30
IL260759B (en) 2022-03-01
TW202328448A (zh) 2023-07-16
CN114736901B (zh) 2024-05-31
CL2020001127A1 (es) 2020-08-28
TWI721128B (zh) 2021-03-11
TWI790485B (zh) 2023-01-21
CA3013683C (en) 2021-07-13
KR20210120131A (ko) 2021-10-06
CN114736900A (zh) 2022-07-12
KR102805002B1 (ko) 2025-05-09
AU2024203581A1 (en) 2024-06-20
CN114085836A (zh) 2022-02-25
JP2020172488A (ja) 2020-10-22
AU2017235278C1 (en) 2022-03-10
JP2019512498A (ja) 2019-05-16
EP3786297A1 (en) 2021-03-03
TW202428874A (zh) 2024-07-16
PE20181892A1 (es) 2018-12-11
HRP20210315T1 (hr) 2021-04-16
IL290294A (en) 2022-04-01
NZ744548A (en) 2024-05-31
JP6748219B2 (ja) 2020-08-26
IL296483B1 (en) 2023-06-01
MX2018010830A (es) 2019-02-07
EP3430141B1 (en) 2020-12-30
CA3013683A1 (en) 2017-09-21
EP3430141A1 (en) 2019-01-23
TWI840950B (zh) 2024-05-01
AR118719A2 (es) 2021-10-27
TWI794662B (zh) 2023-03-01
RU2018134379A3 (uk) 2020-06-23
KR20230136689A (ko) 2023-09-26
RS61528B1 (sr) 2021-04-29
KR20180120702A (ko) 2018-11-06
JP7447073B2 (ja) 2024-03-11
US20200247884A1 (en) 2020-08-06
CL2018002570A1 (es) 2018-12-28
SG11201807854SA (en) 2018-10-30
TW202128998A (zh) 2021-08-01
KR20250065735A (ko) 2025-05-13
CO2018007761A2 (es) 2018-08-10
HUE053172T2 (hu) 2021-06-28
IL296483A (en) 2022-11-01
KR102580776B1 (ko) 2023-09-20
AU2017235278B2 (en) 2021-11-11
RU2018134379A (ru) 2020-04-15
PT3430141T (pt) 2021-02-25
CN114717235A (zh) 2022-07-08
AR108038A1 (es) 2018-07-11
US11466081B2 (en) 2022-10-11
PE20201499A1 (es) 2020-12-29
KR102417646B1 (ko) 2022-07-07
US10745480B2 (en) 2020-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127432C2 (uk) Олігонуклеотид для зниження експресії pd-l1
RU2667524C2 (ru) Модулирование экспрессии вируса гепатита b (hbv)
CN113171371B (zh) 一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的rna抑制剂及其应用
CN109843902A (zh) 用于B型肝炎病毒感染的RNAi剂
US10953034B2 (en) Nucleic acid molecule for reduction of PAPD5 and PAPD7 mRNA for treating hepatitis B infection
UA128437C2 (uk) Сполуки і способи модулювання ube3a-ats
JP7791222B2 (ja) Ｐｄ－ｌ１発現低減用のオリゴヌクレオチド
HK1263057B (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
HK1263057A1 (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
NZ785334A (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression
BR112018068410B1 (pt) Oligonucleotídeos para redução da expressão de pd-l1
NZ785335A (en) Oligonucleotides for reduction of pd-l1 expression