[go: up one dir, main page]

UA124575C2 - Пептид для лікування раку - Google Patents

Пептид для лікування раку Download PDF

Info

Publication number
UA124575C2
UA124575C2 UAA201803219A UAA201803219A UA124575C2 UA 124575 C2 UA124575 C2 UA 124575C2 UA A201803219 A UAA201803219 A UA A201803219A UA A201803219 A UAA201803219 A UA A201803219A UA 124575 C2 UA124575 C2 UA 124575C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cancer
peptide
cell
cancers
cells
Prior art date
Application number
UAA201803219A
Other languages
English (en)
Inventor
Андреа Мар
Тоні Вайншенк
Тони Вайншенк
Аніта Вейбе
Анита Вейбе
Олівер Шор
Оливер Шор
Йенс Фрітше
Йенс Фритше
Харпреет Сінгх
Харпреет Сингх
Original Assignee
Імматікс Біотекнолоджіс Гмбх
Имматикс Биотекнолоджис Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Імматікс Біотекнолоджіс Гмбх, Имматикс Биотекнолоджис Гмбх filed Critical Імматікс Біотекнолоджіс Гмбх
Publication of UA124575C2 publication Critical patent/UA124575C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Description

Цей винахід стосується пептидів, білків, нуклеїнових кислот та клітин для їх застосування в імунотерапії. Зокрема, цей винахід стосується імунотерапії раку. Цей винахід також стосується епітопів пухлино-асоційованих пептидів Т-клітин, які самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованими пептидами можуть, наприклад, служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні відповіді, або стимулювати Т-клітини ех мімо з їх перенесенням в організм пацієнта. Пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС), або пептиди як такі можуть також бути мішенями для антитіл, розчинних Т-клітинних рецепторів та інших зв'язувальних молекул.
Цей винахід стосується декількох нових пептидних послідовностей та їх варіантів, отриманих із молекул НІГА | класу пухлинних клітин людини, які можуть застосовуватися у вакцинних композиціях з метою викликати протипухлинну імунну відповідь або являють собою мішені для розробки фармацевтично або імунологічно активних сполук і клітин.
ПЕРЕДУМОВА СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Хронічний лімфоцитарний лейкоз (ХЛЛ) є В-клітинною неоплазмою із морфологічно зрілих, імунологічно неповністю зрілих В-лімфоцитів. ХЛЛ діагностується, коли у периферичній крові присутні принаймні 5000 В-лімфоцитів/мкл, із яких до 5595 є незрілими. Аномальні В-клітини виявляють характерний фенотип із експресією СО19 і слабекспресією (діт) СО20, СО5, СО23, сова і ІМ або дО (Ссгірбеп, 2010).
Для класифікації ХЛЛ використовуються дві різні системи стадіювання: систему Райя і систему Біне. Стадіювання за класифікацією Райя включає п'ять стадій (0-ІМ), за якими захворювання класифікується відповідно до прогресивного накопичення аномальних клітин. У системі Біне використовуються три стадії (А, В, С) для ранжування захворювання відповідно до кількості уражених ділянок тіла (пер:/Лумлми.сапсег.дом/сапсепорісз/радлгеантепуСТ І /Райепу).
ХЛЛ є головним чином захворюванням людей похилого віку. Середній вік під час встановлення діагнозу становить 72 роки для спорадичних випадків і 58 років для сімейних випадків. Захворюваність на ХЛЛ є вищою серед чоловіків, ніж у жінок, і співвідношення чоловіки/жінки дорівнює 2:1 (Сагімгтідні і співавт., 2002).
ХЛЛ є найпоширенішим лейкозом на Заході, де його частка сягає приблизно 1/3 від усіх лейкозів. Захворюваність схожа у США і Європі, і кількість нових випадків оцінюється у
Зо приблизно 16 000 на рік. ХЛЛ більш поширений серед представників європеоїдної раси, ніж у пацієнтів африканського походження, більш рідко спостерігається у латиноамериканців і корінних американців і рідко у пацієнтів монголоїдної раси. У представників монголоїдної раси захворюваність на ХЛЛ у З рази нижча за захворюваність у європеоїдної раси (бипажмагаапа еї а!., 2008).
П'ятирічна загальні виживаність пацієнтів із ХЛЛ становить приблизно 7995 (пер/лумлу.сапсег.пеусапсег-їурезЛеиКетіа-спгопіс-Іутрпосуїййс-сП/етаквзйнсв). Прогноз для конкретного пацієнта залежить від стадії під час встановлення діагнозу і наявності декількох прогностичних факторів. Якщо користуватися системою Райя, пацієнти з стадією 0 мають медіанну виживаність 10 років і більше, у той час як на стадії ІЛІ медіанна виживаність дорівнює 7 рокам, а у пацієнтів із стадією ШИ/М - 0,75-4 роки (Огіббеп, 2010). З поганим прогнозом при
ХЛЛ асоціюється декілька факторів. Вони включають високі рівні експресії АР-70 або СОЗз38, немутований статус ІДМН і цитогенетичні аберації аеї! 17р або аеї 114 (сгірреп, 2010).
Хоча ХЛЛ ще не є виліковним, у багатьох пацієнтів спостерігається лише повільне прогресування захворювання або погіршення симптомів. Оскільки пацієнти не отримали користі від раннього початку лікування, первісним підходом є практика «чекай і спостерігай» (Кіспагаз і співавт., 1999). Для пацієнтів із симптоматичним або швидко прогресуючим захворюванням існує декілька варіантів лікування. До них входять хіміотерапія, таргетна терапія, застосування імунних лікарських засобів, таких як моноклональні антитіла, застосування САК і активної імунотерапії і трансплантація стовбурових клітин.
Хіміотерапевтичними препаратами, застосовуваними для лікування ХЛЛ, є головним чином алкілювальні агенти, такі як хлорамбуцил і циклофосфамід, або аналоги пуріну, такі як флударабін. Німецька група з вивчення ХЛЛ (СІ | 55) ССІ 4 показала, що комбінаційна терапія флударабін/циклофосфамід є кращою за монотерапію флударабіном (повна ремісія (ПР) 2495 у порівнянні з 7905) (Еісппогвії і співавт., 2006).
Ірутиніб і іделалісіб є інгібіторами кіназ, які націлені на молекули у сигнальному каскаду В- клітинного рецептора. Ібрутиніб інгібує тирозинкіназу Брутона (ВТК), бвго-споріднену цитоплазматичну тирозинкіназу, важливу для визрівання В-клітин, і застосовується для первинної терапії або терапії другої лінії (Вугйа і співавт., 2013; О'Вгіеп і співавт., 2014).
Іделалісіб є інгібітором РІЗК-дельта, який використовується у комбінації з ритуксимабом для бо лікування рефрактерного ХЛЛ (Ригтап і співавт., 2014).
Трансплантати гематопоетичних стовбурових клітин (НБСТ) можуть бути показані для пацієнтів із поганим прогнозом, наприклад пацієнтів із мутаціями аеї! 17р або р53. НЗСТ можуть бути або алогенними, коли донором трансплантованих клітин є відповідний за НГ А індивід, або аутологічними, коли власні стовбурові клітини пацієнта повторно вводяться йому після хіміотерапії (5спеїеіїд і співавт., 2008).
Для лікування гематологічних злоякісних захворювань широко застосовуються моноклональні антитіла. Це пов'язано зі знанням відповідних антигенів, виходячи з добре вивчених молекул на поверхні імунних клітин і доступності пухлинних клітин у крові або кістковому мозку. Зазвичай моноклональні антитіла, що застосовуються у терапії ХЛЛ, націлені на СО20 або СО52. Ритуксимаб, перше моноклональне антитіло проти СО20, яке отримало схвалення Управління з контролю за харчовими продуктами та лікарськими засобами (ЕБА)
США для лікування НХЛ, зараз широко використовується у терапії ХЛЛ. Терапія комбінацією ритуксимаб/флударабін/циклофосфамід веде до вищих показників ПВ і покращеної загальної виживаності (05) у порівнянні з комбінацією флударабін/циклофосфамід і стало переважним варіантом лікування (СІ 5 СІ 8) (Напйек і співавт., 2008). Офатумумаб націлений на СО20 і застосовується для лікування пацієнтів з рефрактерним ХЛЛ (УмМегда і співавт., 2011).
Обінутузумаб є іншим моноклональним антитілом проти СО20, яке використовується для лікування першої лінії у комбінації з хлорамбуцилом (Соеде і співавт., 2014).
Алемтузумаб є антитілом проти СО52, застосовуваним для лікування пацієнтів із захворюванням, резистентним до хіміотерапії, або пацієнтів із такими несприятливими прогностичними факторами як аеї 17р або мутації р53 (Рагіки і співавт., 2011). Мішенями нових моноклональних антитіл є СЮО37 (отлертузумаб, ВІ 836826, ІМОМ529 і (177) и-тетуломаб) або с040 (дацетузумаб і лукатумумаб). Ці антитіла випробують поза умов лікарняного стаціонару (Кобак і Корак, 2014).
У декількох завершених випробуваннях і таких, які ще тривають, використовуються отримані методами генної інженерії Т-клітини, які несуть аутологічні химерні антигенні рецептори (САК) із специфічністю до СО19 (Машз і співавт., 2014). На цей час тільки меншість пацієнтів показала виявлювані або стійкі САК. Одна часткова відповідь (ЧВ) і дві повні відповіді (ПВ) спостерігалися у дослідженнях Т-клітин із САК, проведених Рогіег і співавт. і Каїоз і співавт. (Каїоз і співавт., 2011; Рогіег і співавт., 2011).
Активна імунотерапія включає наступні стратегії: генну терапію, застосування вакцин на базі модифікованих цільних пухлинних клітин, вакцин на основі ДК і пептидних вакцин, отриманих із
ТАА.
Підходи у генній терапії охоплюють аутологічні генетично модифіковані пухлинні клітини. Ці клітини В-СГ трансфековані імуно-(ко)стимуляторними генами на зразок ІЛ-2, ІЛ-12, ТМЕ- альфа, ГМ-КСФ, СО80, СО401, І БА-3 і ІСАМ-1 з метою підвищення презентації антигенів і активації Т-клітин (Сагбраїййао і співавт., 2012). У той час як специфічні відповіді Т-клітин і зниження кількості пухлинних клітин спостерігати легко, імунні відповіді спостерігаються лише тимчасово.
У декількох дослідженнях як антиген-презентуючі клітини використовувалися аутологічні ДК для отримання протипухлинної відповіді. ДК навантажували ех мімо пухлино-асоційованими пептидами, лізатом цільних клітин пухлин, отриманими з пухлин РНК або ДНК. У іншій стратегії використовували цільні пухлинні клітини для злиття з ДК і генерації гібридних клітин ДК-В-СІ |.
Трансфековані ДК викликали відповіді як СО4-ж, так і СО8- Т-клітин (МиПег і співавт., 2004).
Гібридні клітини, отримані внаслідок злиття, і ДК, навантажені лізатом пухлинних клітин або апоптичними тільцями, підвищували пухлиноспецифічні відповіді СО8-- Т-клітин. Пацієнти, які демонстрували клінічну відповідь, мали підвищені сироваткові рівні ІЛ-12 і знижені рівні регуляторних Т-клітин (Раїта і співавт., 2008).
Різні підходи використовують модифіковані пухлинні клітини для стимуляції або підвищення
ХЛЛ-специфічної імунної відповіді. Прикладом цієї стратегії є генерація клітин за триомною технологією: клітини В-СІ |. зливають з клітинами гібридоми, що експресують антитіла до Ес- рецептора і виявляють специфічність до анти-АПК. Клітини, отримані за триомною технологією, індукували ХЛЛ-специфічні відповіді Т-клітин іп міго (Кгопепрегодег і співавт., 2008).
У іншій стратегії використовується вакцина на основі опромінених аутологічних клітин ХЛЛ із бацилою Кальмета-Герена як ад'юванта. У декількох пацієнтів спостерігалося зниження рівнів лейкоцитів або стабілізація захворювання (Низ і співавт., 2008). Окрім виділених клітин ХЛЛ, як вакцину використовували цільну кров хворих на ХЛЛ пацієнтів після приготування у відділенні переливання крові. Ця вакцина індукувала ХЛЛ-специфічні відповіді Т-клітин, і її застосування привело до часткових клінічних відповідей або стабільного захворювання у декількох пацієнтів бо (Зрапег і співавт., 2005).
Декілька ТАА надмірно експресуються при ХЛЛ і є придатними для вакцинації. Вони включають фібромодулін (Мауг і співавт., 2005), КНАММ/СО168 (Сіаппоропціоз і співавт., 2006),
МОМа2 (Мауг і співавт., 2006), НТЕКТ (Соипіег і співавт., 1995), онкофетальний антиген-незрілий білок-рецептор ламініну іттаїйиге (ОЕБАЇ КР) (біведеї! і співавт., 2003), адипофілін (5сптіаї і співавт., 2004), сурвівін (Сгаплієго і співавт., 2001), КУМ1 - КМ/14 (КгасКпагаї і співавт., 2002) і отримана з пухлин ділянка І-УМНООКЗ (Нагід і співавт., 2001; Сагпбаїсйао і співавт., 2012).
Було проведене клінічне дослідження фази І з використанням як вакцини КНАММ-таргет пептиду КЗ. У 5 із б пацієнтів спостерігалися КЗ-специфічні відповіді СО8- Т-клітин, які піддаються виявленню (Зіаппороціоз і співавт, 2010).
Зважаючи на тяжкі побічні ефекти і витрати, пов'язані з лікуванням раку, існує потреба ідентифікувати фактори, які можливо буде використовувати для лікування раку взагалі і ХЛЛ зокрема. Є також потреба в ідентифікації інших чинників, які виконують роль біомаркерів раку взагалі і ХЛЛ зокрема, які забезпечать кращу діагностику раку, оцінку прогнозу і передбачення успіху лікування.
Імунотерапія раку являє собою варіант специфічного націлювання на ракові клітини, у той же час зводячи до мінімуму побічні ефекти. У імунотерапії раку використовується існування пухлино-асоційованих антигенів.
Сучасна класифікація пухлино-асоційованих антигенів (ТАА) охоплює наступні головні групи: а) Раково-тестикулярні антигени. Перші будь-коли ідентифіковані ТАА, які можуть бути розпізнані Т-клітинами, належать до цього класу, які були спочатку названі раково- тестикулярними (СТ) антигенами завдяки експресії його представників у гістологічно різних пухлинах людини і, поряд із нормальними тканинами, тільки в сперматоцитах/сперматогоніальних клітинах яєчок і іноді в плаценті. Оскільки клітини яєчок не експресують молекули НГА І та ІЇ класу, ці антигени не можуть розпізнаватися Т-клітинами у нормальних тканинах і можуть, таким чином, вважатися пухлинно-специфічними, з точки зору імунології. Добре відомими прикладами СТ антигенів є члени сімейства МАСЕ і МУ-Е5БО-1. б) Антигени диференціації. Ці ТАА розподілені між пухлинами та нормальними тканинами, з яких виникла пухлина. Більшість з відомих антигенів диференціації знайдена в меланомах і нормальних меланоцитах. Багато цих білків, пов'язаних із диференціацією у меланоцити,
Зо беруть участь у біосинтезі меланіну і тому не є пухлино-специфічними, але, тим не менше, широко застосовуються для імунотерапії раку. Приклади включають, без обмеження, тирозиназу і Меіап-А/МАВТ-1 для меланоми або ПСА для раку передміхурової залози. в) Надмірно експресовані ТАА. Гени, що кодують ТАА, які широко експресуються, були виявлені в гістологічно різних типах пухлин, а також у багатьох нормальних тканинах, загалом з нижчими рівнями експресії. Можливо, що багато епітопів, що були процесовані і, можливо, презентовані нормальними тканинами, присутні у кількості, що нижча за пороговий рівень розпізнання Т-клітинами, в той час як їх надекспресія в пухлинних клітинах може запустити антиракову реакцію, порушивши раніш встановлену толерантність. Відомими прикладами для цього класу ТАА є Нег-2/пеи, сурвівін, теломераза або М/11. г) Пухлино-специфічні антигени. Ці унікальні ТАА утворюються в результаті мутацій нормальних генів (таких як бета-катенін, СОКА тощо). Деякі з цих молекулярних змін зв'язані з неопластичною трансформацією і (або) прогресуванням пухлини. Пухлино-специфічні антигени загалом можуть викликати сильні імунні відповіді, не спричиняючи ризику аутоїмунних реакцій проти нормальних тканин. З іншого боку, ці ТАА у більшості випадків мають відношення тільки до певної пухлини, на якій вони були ідентифіковані, і зазвичай не є спільними для багатьох окремих пухлин. Специфічність пептиду до пухлини ( або асоціація з пухлиною) може також виникати, якщо пептид походить із екзону пухлини (пухлино-асоційованого екзону) у випадку білків з пухлиноспецифічними (-асоційованими) ізоформами. д) ТАА, що виникають в результаті посттрансляційних модифікацій. Такі ТАА можуть виникати з білків, які не є ні специфічними, ні надмірно експресованими у пухлинах, але, незважаючи на це, стають асоційованими з пухлинами в результаті посттрансляційних процесів, первинно активних у пухлинах. Прикладами ТАА цього класу є антигени, що виникають в результаті змін характеру гликозилювання, що приводить до утворення у пухлинах нових епітопів, таких як МОСТІ, або таких подій як білковий сплайсинг під час деградації, які можуть бути пухлино-специфічними, а можуть і не бути. е) Онковірусні білки. Ці ТАА є вірусними білками, які можуть відігравати вирішальну роль в онкогенному процесі і, оскільки вони є чужорідними (не походять від людини), вони можуть викликати відповідь Т-клітин. Прикладами таких білків є білки вірусу папіломи людини типу 16,
Еб і Е7, які експресуються клітинами карциноми шийки матки. бо Мішенями імунотерапії з використанням Т-клітин є пептидні епітопи, отримані з пухлино-
асоційованих або пухлино-специфічних білків, які презентуються молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС). Антигенами, які розпізнаються пухлино-специфічними Т- лімфоцитами, тобто їхніми епітопами, можуть бути молекули, що отримані з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, фактори транскрипції тощо, які експресуються і, у порівнянні з незміненими клітинами того ж походження, активність яких підвищена у клітинах відповідної пухлини.
Існує два класи молекул МНС, МНС | класу і МНС І класу. Молекули МНС І! класу складаються з альфа-важких ланцюгів і бета-2-мікроглобуліну, молекули МНС | класу складаються з альфа- і бета-ланцюгів. Їхня тримірна конформація приводить до утворення зв'язувальної щілини, що використовується для нековалентної взаємодії з пептидами.
Молекули МН І класу можна виявити в більшості клітин, що мають ядро. Вони презентують пептиди, які утворюються в результаті розщеплення протеолітичними ферментами переважно ендогенних білків, дефектних рибосомальних продуктів (ОКІР) та більш великих пептидів.
Однак пептиди, одержані з ендосомальних компартментів чи екзогенних джерел, також часто зустрічаються на молекулах МНС ! класу. Цей некласичний спосіб презентації | класом називається у науковій літературі крос-презентацієй (Вго55ап апа Вемап, 1997; Носк еї аї., 1990). Молекули МНС Ії класу містяться головним чином на професійних антигенпрезентуючих клітинах (АПК) і презентують головним чином пептиди екзогенних або трансмембранних білків, які поглинаються АПК в ході ендоцитозу і згодом процесуються.
Комплекси пептидів і молекул МНС І класу розпізнаються СО8-позитивними Т-клітинами, що несуть відповідний Т-клітинний рецептор (ТКР), в той час як комплекси пептиду і молекул МНС
МП класу розпізнаються СО4-позитивними Т-хелперами, що несуть відповідний ТКР.
Загальновідомо, що ТКР, пептид і МНС, таким чином, є присутніми у стехіометричних кількостях у співвідношенні 1:1:1.
Сора-позитивні Т-хелпери відіграють важливу роль, викликаючи та підтримуючи ефективну відповідь СЮО8-позитивних цитотоксичних Т-клітин. Ідентифікація епітопів СО4-позитивних Т- клітин, отриманих із пухлино-асоційованих антигенів (ТАА), може мати велике значення під час розробки фармацевтичних засобів для ініціювання протипухлинних імунних реакцій (Спайс єї а. 2003). У місці локалізації пухлини Т-хелперні клітини підтримують сприятливе для
Зо цитотоксичних Т-клітин (ЦТЛ) цитокінове середовище (Мопага єї аї., 2006) і притягують ефекторні клітини, такі як ЦТЛ, природні кілерні (МК) клітини, макрофаги і гранулоцити (Нжапд еїа!., 2007).
За відсутності запалення експресія молекул МНС Ії класу обмежується головним чином клітинами імунної системи, особливо професійними антиген-презентуючими клітинами (АПК), наприклад, моноцитами, клітинами, що походять з моноцитів, макрофагами, дендритними клітинами. Було виявлено, що клітини пухлин у хворих на рак пацієнтів експресують молекули
МНЄе Ії класу (Оеєпадіеї! єї а!., 2006).
Подовжені (довші) пептиди за винаходом можуть діяти як епітопи, активні по відношенню до молекул МНС ІІ класу.
Т-хелперні клітини, активовані зв'язаними з молекулами МНС ІІ класу епітопами, відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції ЦТЛ у протипухлинному імунітеті. Епітопи Т- хелперних клітин, які ініціюють реакцію Т-хелперів типу ТНІ, підтримують ефекторні функції
СОв-позитивних Т-кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлини, що презентують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/мНсС на поверхнях своїх клітин. У такий спосіб епітопи пухлино-асоційованих пептидів Т-хелперів самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованих пептидами можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції.
На моделях тварин-ссавців, наприклад, на мишах, було показано, що навіть за відсутності
СОрв8-позитивних Т-лімфоцитів, присутності СЮО4-позитивних Т-клітин виявляється достатньо для послаблення клінічних проявів пухлин шляхом інгібування ангіогенезу за рахунок секреції інтерферону-гамма (ІФН-у) (Вєайну апа Раїегзоп, 2001; Митрбега еї а!., 1999). Існують докази, що
Сбра4 Т-клітини є ефекторними клітинами прямої протипухлинної дії (ВгаштиПег еї аї!., 2013; Ттап еїа!., 2014).
Оскільки конститутивна експресія молекул НГ А ІІ класу зазвичай обмежується клітинами імунної системи, раніше вважалося неможливим виділити пептиди ІЇ класу безпосередньо з первинних пухлин. Однак Юепа|є! і співавт. вдалося ідентифікувати декілька зв'язаних з молекулами МНС ІІ класу епітопів безпосередньо із пухлин (ММО 2007/028574, ЕР 1 760 088 В1).
Оскільки обидва типи відповіді, залежні від СО8 та СО4, спільно та синергічно роблять свій бо внесок у протипухлинну дію, для розробки протипухлинних вакцин важливими є ідентифікація та визначення характеристик пухлино-асоційованих антигенів, які розпізнаються або СОв- Т- клітинами (ліганд: молекули МНС | класу ї- пептидний епітоп), або СО4- позитивними Т- хелперними клітинами (ліганд: молекули МН ІІ класу т пептидний епітоп).
Щоб пептид, зв'язаний з молекулою МНС Іі класу, ініціював (викликав) клітинну імунну відповідь, він також має зв'язатися з молекулою МНС. Цей процес залежить від алеля молекули
МНС ії специфічних поліморфізмів амінокислотної послідовності пептиду. Пептиди, що зв'язуються з молекулами МНС | класу, зазвичай мають 8-12 амінокислотних залишків у довжину і зазвичай містять два консервативні залишки («якорі») у своїй послідовності, які взаємодіють з відповідною зв'язувальною щілиною молекули МНС. У такий спосіб кожний алель
МНС має «зв'язувальний мотив», що визначає, які пептиди зможуть специфічно зв'язатися зі зв'язувальною щілиною.
В імунній реакції, залежній від молекул МНС І класу, пептиди не тільки мають бути здатними зв'язатися з певними молекулами МН І класу, що експресуються клітинами пухлини, але вони також мають розпізнаватися Т-клітинами, що несуть специфічний Т-клітинний рецептор (ТКР).
Для того, щоб білки розпізнавалися Т-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлино- асоційовані антигени, та щоб їх було можливо застосовувати в терапії, необхідно створити особливі передумови. Антиген має експресуватися, головним чином, пухлинними клітинами і не експресуватися або експресуватися у порівняно невеликих кількостях нормальними здоровими тканинами. В переважному втіленні вищезгаданий пептид має надмірно презентуватися пухлинними клітинами у порівнянні з нормальними здоровими тканинами. До того ж бажано, щоб відповідний антиген не тільки був присутнім у пухлині певного типу, але також був присутнім у високих концентраціях (тобто як декілька копій відповідного пептиду на клітину).
Пухлино-специфічні та пухлино-асоційовані антигени часто отримують із білків, які беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину, завдяки їх функції, наприклад, в контролі клітинного циклу або пригніченні апоптозу. Крім цього, низхідні мішені білків, що також є безпосередньою причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, таким чином, можуть бути опосередковано пухлино-асоційованими. Такі опосередковано пухлино-асоційовані антигени також можуть бути мішенями у вакцинаційному підході (біпайп-Уавзціа єї аї!., 2004). Важливим є те, щоб в амінокислотній послідовності антигену
Зо були присутні епітопи, оскільки такий пептид («імуногенний пептид»), отриманий із пухлино- асоційованого антигену, має приводити до відповіді Т-клітин іп міїго або іп мімо.
По суті, будь-який пептид, що здатний зв'язуватися з молекулою МНС, може відігравати роль епітопу Т-клітини. Передумовою індукції відповіді Т-клітин іп міго або іп мімо є присутність
Т-клітин із відповідним ТКР ії відсутність імунологічної толерантності до цього конкретного епітопу.
Таким чином, ТАА є стартовою точкою для розробки Т-клітинної терапії, включаючи, але не обмежуючись ними, протипухлинні вакцини. Методи ідентифікації та визначення характеристик
ТАА зазвичай базуються на використанні Т-клітин, які можна виділити з організму пацієнтів або здорових суб'єктів, або вони грунтуються на генерації різних профілів транскрипції або різному характері експресії пептидів тканинами пухлин і нормальними тканинами. Проте ідентифікація генів, які надмірно експресуються пухлинними тканинами або лініями пухлинних клітин людини, або селективно експресуються в таких тканинах або клітинних лініях, не дає точної інформації щодо використання антигенів, що кодуються цими генами, в імунній терапії. Причиною цього є те, що тільки окрема субпопуляція епітопів цих антигенів придатна для такого застосування, оскільки має бути присутня Т-клітина з відповідним ТКР, і імунологічна толерантність по відношенню до цього епітопу повинна бути відсутньою або мінімальною. Отже, у більш переважному втіленні цього винаходу важливо вибрати тільки ті надмірно або селективно презентовані пептиди, проти яких можна знайти функціонуючу Т-клітину і (або) Т-клітину, здатну до проліферації. Така функціонуюча Т-клітина визначається як Т-клітина, яка за стимуляції специфічним антигеном може бути клонована і здатна виконувати функції ефектору (с«ефекторна Т-клітина»).
У випадку націлювання специфічних ТКР (наприклад, розчинних ТКР) і антитіл або інших зв'язувальних молекул (каркасів) за цим винаходом імуногенність базових пептидів є вторинною. У цих випадках визначальним фактором є презентація.
Згідно з першим аспектом цього винаходу, пропонується пептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО: 385 або варіант його послідовності, який принаймні на 77956, переважно принаймні на 8895 гомологічний (переважно принаймні на 7795 або принаймні на 8895 ідентичний) послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 385, де згаданий варіант зв'язується з МНС і (або) викликає перехресну бо реакцію Т-клітин із згаданим пептидом або його фармацевтично прийнятною сіллю, де згаданий пептид не є базовим повнорозмірним поліпептидом.
Цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від 5ЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮО МО: 385 або його варіанту, який принаймні на 77905, переважно принаймні на 8895 гомологічний (переважно принаймні на 7795 або принаймні на 8895 ідентичний) послідовності від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 385, де згаданий пептид або його варіант має загальну довжину між 8 і 100, переважно між 8 і 30 і найбільш переважно між 8 і 14 амінокислот.
У нижче наведеній таблиці описані пептиди за цим винаходом, їх відповідні зЗЕО ІЮ МО і очікувані вихідні (основні) гени для пептидів. Усі пептиди у Таблиці 1 і Таблиці 2 зв'язуються з
НІ А-А"02. Пептиди Таблиці 2 були розкриті раніше у великих списках як результати високопродуктивного скринінгу з великою частотою помилок або були розраховані з використанням алгоритмів, але їхній зв'язок з раковими захворюваннями взагалі не був встановлений. Пептиди, наведені у Таблиці3, є додатковими пептидами, які доцільно використовувати у комбінації з іншими пептидами за винаходом. Наведені у Таблиц 4 пептиди також можуть використовуватися в діагностиці і (або) лікуванні різних інших злоякісних пухлин, пов'язаних з надмірною експресією або надмірною презентацією відповідних базових поліпептидів.
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом.
У - фосфосерин
Символи) генаців) 16 АТОМІ | 7777777771711222211 |в ГГ 118 ЗАСААБАЇРАЇМ ГГ | 77777777 61247777 |ВРІ3.///- Б 778 САССОТИТМ 7777/7777 27033. |Ивтв32///////
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом.
У - фосфосерин
Символи) генаців) 60 ЕМ ОНЕрсеСМ!! | 777777771149206, |МОМАТ///З 66 ЗІАОСІОЮМКА | 777777777715079.77 |РАХ5 68 ОІ0ООРАСІО. | 77777777 16564 7 фрох3Х77777/7/7//// 69 сІНОВЕ. 777 | 7777771717171119922 0ЙО5ЕСТ 180 МОЕОЕСЕЕС | 77777777 23224 |5УМЕ2 86 НІУРОАМТІЇ | 77777771 55103 |ВАБаРБ2ЇГ//-/-
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом.
У - фосфосерин
Символи) генаців) 89 шОРатТРОЄ 77777777 54832 ОЇМРБІЗС 780 МАбІОНАМ 7777/7777 54832 ЇУРБІЗ3С 96 шОоКТ5ЕМ 77777777 Ї777717171717171717171195111111111 1003721 98 І ЗИКУРІЕМ Її 777777171717171719517771111111 100371. 89 ШЕНВМАЄ 777 | 77777777 84636, |аРВТЄ -
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом.
У - фосфосерин
Символи) генаців) 101060301, 3183, 343069,
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом.
У - фосфосерин
Символи) генаців) 10288, 10859, 10990, 11024, (ПІ А8В5, ПІ ВАТ, 205 СІ БОАМЕТІ. 11025, 11026,11027, 23547, ПІ АВЗ, ПІ ВАЗ, 79166, 79168 ПІ ВА2г, ПІ ВАХ,
ШСАР2, ПСВАб
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом.
У - фосфосерин
Символи) генаців)
АМКНОТ1-ЕІР4ЕВРЗ, 100128168, 10096747, 389472, НБООБЬЯУ НЕПЕВЕВЄ, 271 МІВМІМЕАА 441502, ба 728937, ВРУ?БР28Я, ВРО2БбР2Б,
АРБЗ2бРОВ
КІААО2г26І. (також відомий як Сі1Зоп18) кодує КІДАО226-подібний білок і локалізується на хромосомі 13414.13 (Веїзед, 2002). Вважається, що КІААО226І. є геном-супресором пухлин і є гіперметильованим при раку шийки матки. Повторна активація КІДАО226бЇ веде до зниження росту клітин, їх життєздатності і формування колоній (Ниїзтап еї аї!., 2015; Еїївіпнк еї аї., 2012;
Ниївтап сеї аї., 2013). Профіль метилювання КІДАО226бЇ можна використовувати для розрізнення попередніх дисплазійних уражень і звичайного раку шийки матки (Міші еї аї., 2015). Профіль метилювання КІААО226їЇ не може використовуватися як специфічний біомаркер для раку шийки матки (5опгабі єї а!., 2014). Повторна активація КІААО226І. частково деметилює його промоторну ділянку і також зменшує рівень пригнічувального метилювання гістону (Ниїзтап єї а!., 2013).
ЕСКІЗ, також відомий як ЕСКНЗ або ІКТАЗ, кодує Ес-рецептор-подібний білок 3, один із декількох Ес-рецептор-подібних глікопротеїнів суперсімейства імуноглобулінових рецепторів, які можуть відігравати роль у регуляції імунної системи (Неїбед, 2002). Експресія ЕСКІЗ підвищена на С04-2026- Т-клітинах пацієнтів із синдромом Сезарі з високим пухлинним навантаженням, що наводить на думку про те, що експресія ЕСКІЗ корелює з високим навантаженням циркулюючих пухлинних клітин (М/узосКа єї аї., 2014). Активність ЕСКІЗ підвищена при хронічному лімфоцитарному лейкозі (Роізоп еї аї!., 2006). ЕСКІЗ є потенційним маркером, який має прогностичну значущість при хронічному лімфоцитарному лейкозі (2исспейно еї аї!., 2011)
Таблиця 2
Додаткові пептиди за цим винаходом, щодо яких зв'язок з раковими захворюваннями не був встановлений
Символи) генаців) 100505503, 402057, ВАРБ171, АРБ17РІ6,
Таблиця 2
Додаткові пептиди за цим винаходом, щодо яких зв'язок з раковими захворюваннями не був встановлений
Символи) гена(ів) 10541, 23520, 646791, 647020, | АМРЗ2В, АМРЗ2С, АМРЗ2ВРІ1,
Таблиця 2
Додаткові пептиди за цим винаходом, щодо яких зв'язок з раковими захворюваннями не був встановлений
Символи) генаців)
Таблиця З
Пептиди, які доцільно використовувати, наприклад, для персоналізованої терапії раку
ТОВАТВ, ТОВАЗЕ, ТОВАЗО, ' ' ' ТОВАТА, ТОВАТ1С
Таблиця З
Пептиди, які доцільно використовувати, наприклад, для персоналізованої терапії раку 147949, 163087, 342892, 2МЕ583, 7МЕЗ383, 2МЕ850, 100128168, 00996747, | НРЗ2бРЗЗ, АРВАВРТТ, 441502,6231,643003, | 526, НрЗабрав, 462 ХМІ РКІ ЖУК у : у АРБ2бР2О, АРБ2бР15, 644166, 644928, 644934, 646753, 728937,729188 | НРЗ26РБ50, НрЗабра, " " АРБ2бР25, АРБЗ2бРБВ
Таблиця З
Пептиди, які доцільно використовувати, наприклад, для персоналізованої терапії раку 117854, 445372, ТАІМб, ТАІМ6-ТАІМЗА4, 28796, 28815,
Іа Ст, 101 С2 3538
Цей винахід також загалом стосується застосування пептидів за цим винаходом для застосування при лікуванні проліферативного захворювання, такого як, наприклад гострий мієлогенний лейкоз, рак жовчних протоків, рак головного мозку, рак молочної залози, колоректальна карцинома, рак стравоходу, рак жовчного міхура, рак шлунка, гепатоцелюлярний рак, карцинома з клітин Меркеля, меланома, неходжкінська лімфома, недрібноклітинний рак легенів, рак яєчника, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, нирковоклітинний рак, дрібноклітинний рак легенів, рак сечового міхура і рак матки.
Особливо переважними є пептиди - для застосування самостійно або в комбінації - за цим винаходом, вибрані з групи послідовностей від 5ЕО 10 МО: 1 до 5ЕО І МО: 385. Більш переважними є пептиди - для застосування самостійно або в комбінації - вибрані з групи послідовностей від 5ЕО ІО МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 202 (див. Таблицю 1) і їх застосування при імунотерапії ХЛЛ, гострого мієлогенного лейкозу, раку жовчних протоків, раку головного мозку, раку молочної залози, колоректальної карциноми, раку стравоходу, раку жовчного міхура, раку шлунка, гепатоцелюлярного раку, карциноми з клітин Меркеля, меланоми, неходжкінської лімфоми, недрібноклітинного раку легенів, раку яєчника, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, нирковоклітинного раку, дрібноклітинного раку легенів, раку сечового міхура і раку матки і переважно ХЛЛ.
Як наведено далі у Таблицях 4А і Б, багато пептидів за цим винаходом також виявлені на пухлинах інших видів і можуть, таким чином, також застосовуватися в імунотерапії за іншими показаннями. Див. також Фігури 1 і Приклад 1.
Таблиця 4А: Пептиди за цим винаходом та їх конкретне застосування при лікування інших проліферативних захворювань, особливо інших ракових захворювань. Із таблиці видно, на яких додаткових видах пухлин вибрані пептиди були виявлені і демонструють або надмірну презентацію на більш ніж 595 досліджених зразків пухлин, або презентацію на більш ніж 595 досліджених зразків пухлин зі співвідношенням середніх геометричних показників для пухлин і для нормальних тканин більшим ніж 3. Надмірна презентація визначається як більш висока презентація на зразку пухлини у порівнянні із зразком нормальної тканини з найвищим рівнем презентації. Нормальними тканинами, у порівнянні з якими була досліджена надмірна презентація, були: жирова тканина, надниркова залоза, клітини крові, кровоносні судини, кістковий мозок, головний мозок, молочна залоза, стравохід, око, жовчний міхур, серце, нирки, товста кишка, печінка, легені, лімфатичний вузол, нервова тканина, підшлункова залоза, паращитоподібна залоза, очеревина, гіпофіз, плевра, слинна залоза, скелетні м'язи, тонка кишка, селезінка, шлунок, тимус, щитоподібна залоза, трахея, сечовід і сечовий міхур. 18 ФАСААБАІРАЇМ | ЇГМЛ7Г7/7/7//////77777777777ССсСсСсСС 79 ФАССОТИШТМ 0 |ЇНХЛ777//////11111111111111111111111111 жовчних протоків
(60 |РМІОНЕОСЬМІ |Меланома,ракстравоходу.//-/:/..///сссссс1111111сссСсС 66 |ЗІАССШОМКА ЇНХЛ////77777717171717171717171с1сСсСу рак жовчного міхура, рак жовчних протоків 68 |СІОООРАСІОЇ (НККОГЦКОНХЛ. меланома.у////7777171717171711111сссссссСсСсСсСС 69 |бЩЩНОВЕР //ЇНХЛ 71111111 80 |МШЕОЕНЕЕ ///ЇНХЛ//////77771111111111111111111111111ссСсССу 86 |НІУРСАМТІ (ЕН 77777771 089 МОРСТРОС ///О|ЇНХЛ//////111111111111111111111111сСС 96 МШОКТ5ЕМ 0 ЇНХЛ//////111111111111111111111111111С 098 |ЗИКУВЕМ ОО |ЇНХЛ 11111111 89 ДШЕНБМАЄ 0 ІЇНХЛІМЛ 77777111 01 КЕМ/МУААРІМЕ З (РЯ. 77717171 рак стравоходу, рак сечового міхура оте фноати окон 162 ЗМКООГЕМУ рак стравоходу, рак матки, рак жовчного міхура,
рак жовчних протоків рак стравоходу, рак сечового міхура, рак матки рак жовчних протоків союзними 200 УМЕЕЕМРІМІ РЯ, рак сечового міхура, рак жовчного міхура, рак жовчних протоків рак жовчного міхура, рак жовчних протоків оо |юнт По дшню 233 СПОІМУВІ рак сечового міхура, рак матки, рак жовчного міхура, рак жовчних протоків рак матки, рак жовчного міхура, рак жовчних протоків
НХЛ, ГМЛ, меланома, рак жовчного міхура,
рак жовчного міхура, рак жовчних протоків рак жовчного міхура, рак жовчних протоків рак жовчних протоків озеозмююотенм ев 354 ЕІМООРАСМБМІ. рак сечового міхура, рак жовчного міхура, рак жовчних протоків рак сечового міхура
НДРЛ - недрібноклітинний рак легенів, ДРЛ - дрібноклітинний рак легенів, НКК - рак нирки,
КРК--рак товстої або прямої кишки, РШ- рак шлунка, ГЦК- рак печінки, РПШЗ - рак підшлункової залози, РПМЗ - рак передміхурової залози, лейкоз, РМЗ - рак молочної залози,
ККМ - карцинома з клітин Меркеля, НХЛ - неходжкінська лімфома
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з Зед ІЮ Мо. 1, 2, З, 7, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 24,26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 38, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 55, 56, 57, 58, 59, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 86, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 105, 110, 112, 113, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 125, 126, 127, 130, 133, 137, 138, 139, 141, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165, 167, 168, 169, 170, 172, 175, 177, 178, 179, 180, 181, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 199, 200, 203, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 246, 247, 248, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 260, 261, 263, 264, 266, 267, 268, 269, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 286, 288, 290, 291, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 303, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 314, 316, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 341, 342, 343, 346, 347, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 357, 358, 360, 362, 363, 365, 367, 371, 373, 374, 375, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384 і 385 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування НХЛ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з б5ед ІЮ Мо. 5, 8, 12, 14, 15, 29, 35, 37, 39, 43, 56, 57, 74, 78, 93, 99, 100, 102, 109, 116, 117, 119, 120, 121, 147, 148, 151, 157, 158, 160, 164, 166, 172, 183, 185, 186, 188, 190, 195, 199, 214, 219, 221, 231, 234, 235, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 246, 258, 263, 264, 267, 269, 271, 281, 290, 296, 298, 303, 304, 311, 317, 335, 339, 342, 343, 346, 351, 354, 365, 367, 369, 374, 378, 382 і 385 для- у одному переважному втіленні комбінованого - лікування ГМЛ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮО Мо. 5, 28, 74, 121, 162, 208, 211, 212, 264,
Зо 296, 328 і 385 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування РМ3.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІЮ Мо 7, 67, 68, 78, 86, 112, 124, 152, 155, 162, 181, 199, 200, 204, 210, 246, 250, 274, 311, 333, 338, 341, 348, 351, 371, 375 і 383 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування ГЦК.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з Зед ІЮ Мо. 12, 15, 25, 29, 39, 42, 44, 45, 52, 57, 60, 67, 68, 72, 78, 93, 94, 112, 117, 130, 141, 159, 162, 169, 170, 172, 189, 197, 200, 204, 207, 211, 212, 217, 225, 232, 233, 234, 237, 239, 246, 250, 254, 258, 267, 276, 282, 291, 297, 300, 303, 305, 306, 311, 313, 328, 338, 339, 343, 348, 354, 359, 363, 365, 367, 370, 373, 375, 377 і 379 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування меланоми.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІО Мо. 27, 94, 122, 162, 164, 200, 274, 276, 311, 367, 375 і 379 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування НДРЛ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІЮ Мо. 27, 59, 79, 119, 158, 162, 164, 233, 235, 237, 264, 276 і 339 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування раку матки.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮО Мо. 29, 67, 93, 94, 111, 112, 200, 204, 207, 208, 219, 225, 244, 245, 264, 266, 282, 303, 306, 321, 328, 338, 357 і 367 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування раку яєчника (РЯ).
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІЮ Мо. 29, 35, 67, 161, 162, 188, 189, 200, 213,
233, 235, 239, 260, 276, 342, 346 і 354 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку жовчного міхура і (або) раку жовчних протоків.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ФЕО ІЮ Мо. 35, 68, 94, 124, 139, 162, 164, 197, 204, 232, 245, 258, 311, 346 і 371 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування
НКК.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з б5ед ІЮ Мо. 39, 40, 83, 93, 121, 138, 162, 178, 189, 200, 204, 207, 216, 235, 237, 245, 250, 272, 274, 216, 291, 296, 298, 311, 321, 333, 335, 348,353 і 379 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування ДРЛ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з Зед ІЮ Мо. 40, 55, 59, 119, 146, 159, 160, 164, 186, 187, 200, 202, 204, 208, 213, 215, 225, 233, 234, 235, 240, 249, 250, 266, 274, 292, 298, 313, 328, 335, 338, 341, 342, 349, 351, 354, 357, 364, 365, 370, 371, 376 і 384 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування раку сечового міхура.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІО Мо. 59, 60, 67, 79, 83, 87, 112, 136, 159, 162, 164, 179, 200, 201, 213, 215, 218, 228, 233, 252, 265, 271, 326, 343, 344, 348, 350, 354, 370, 371, 375 і 385 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування раку стравоходу.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮО Мо. 83, 87, 136, 164 і 271 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку шлунка (РШ).
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з зЗЕО ІЮ Мо. 88, 189, 233, 235, 271, 278 і 311 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування раку підшлункової залози (РІПШУЗ).
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з «ЕО ІЮ Мо. 94, 161, 172, 200, 232, 271, 321 і 354 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування колоректального раку (КРК).
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування пептиду за цим винаходом
Ко) відповідно до 5ЕО ІЮ Мо. 159 для лікування ККМ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування пептидів за цим винаходом для - бажано комбінованого - лікування проліферативного захворювання, вибраного з групи
ХЛЛ, гострого мієлогенного лейкозу, раку жовчних протоків, раку головного мозку, раку молочної залози, колоректальної карциноми, раку стравоходу, раку жовчного міхура, раку шлунка, гепатоцелюлярного раку, карциноми з клітин Меркеля, меланоми, неходжкінської лімфоми, недрібноклітинного раку легенів, раку яєчника, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, нирковоклітинного раку, дрібноклітинного раку легенів, раку сечового міхура і раку матки.
Таблиця 4Б. Пептиди за цим винаходом та їх конкретне застосування при лікування інших проліферативних захворювань, особливо інших ракових захворювань. Із таблиці видно, як і з
Таблиці 4А, на яких додаткових видах пухлин були виявлені вибрані пептиди, що демонструють надмірну презентацію (включаючи специфічну презентацію) на більш ніж 595 досліджених зразків пухлин, або презентацію на більш ніж 595 досліджених зразків пухлин зі співвідношенням середніх геометричних показників для пухлин і для нормальних тканин більшим ніж 3. Надмірна презентація визначається як більш висока презентація на зразку пухлини у порівнянні із зразком нормальної тканини з найвищим рівнем презентації. Нормальними тканинами, у порівнянні з якими була досліджена надмірна презентація, були: жирова тканина, надниркова залоза, артерія, кістковий мозок, головний мозок, центральний нерв, товста кишка, дванадцятипала кишка, стравохід, око, сечовий міхур, серце, нирка, печінка, легеня, лімфатичний вузол, мононуклеарні лейкоцити, підшлункова залоза, паращитоподібна залоза, периферичний нерв, очеревина, гіпофіз, плевра, пряма кишка, слинна залоза, скелетний м'яз, шкіра, тонка кишка, селезінка, шлунок, щитоподібна залоза, трахея, сечовід, сечовий міхур, вена. 18 ФАГААБАСРАЇМ 7 |ІГМЛЛККІШ /////7771111111111111111111СсСсСсСсС еовюоотсих рак жовчних протоків, ПККГШ 01086 НЕУРСАМТІЇГ// (МЛС 89 пшОРСТРО //// |ІРМЗ3З 77111111 90 |МАРІЯНВМ 0 |Меланома7/7/7/7/7////////////:«//3:/3-/334СССССС
КРК, ГЦК, меланома, НХЛ, НДРЛ, РЯ,
ГМЛ, РПМУ, рак головного мозку, ХГК,
ГМЛ, КРК, рак головного мозку, рак жовчного міхура, ХГК, ПККГШ, 293 АЛІ ОІМІРМУ меланома, НХЛ, НДРЛ, РЯ, рак головного мозку,
НКК, ДРЛ, рак сечового міхура, рак матки
Рак головного мозку, РПМ3У, рак матки,
КРК, рак головного мозку, рак жовчного міхура,
КРК, ПККГШ, меланома, НДРЛ, РЯ,
РМУ, рак матки, рак жовчного міхура, оно збвсяе креннвий 362 І/"ТЕЇ СОБЕМ меланома, НДРЛ, РЯ, рак стравоходу, РШ,
НКК, ДРЛ, рак сечового міхура, рак матки
Рак матки, рак жовчного міхура,
РМУ, РЯ, рак матки, рак жовчного міхура,
НДРЛ - недрібноклітинний рак легенів, ДРЛ - дрібноклітинний рак легенів, НКК - рак нирки,
КРК - рак товстої і прямої кишки, РШ - рак шлунка, ГЦК - рак печінки, РПШЗ - рак підшлункової залози, РМЗ - рак передміхурової залози, РМЗ - рак молочної залози, НХЛ - неходжкінська лімфома, ГМЛ - гострий мієлоїдний лейкоз, РЯ- рак яєчника, ПККГШ - пласкоклітинна карцинома голови та шиї, ХГК - холангіокарцинома.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮ Мо. 5, 7, 13, 29, 30, 35, 41, 44, 45, 51, 68, 93, 101, 112, 115, 126, 130, 138, 141, 160, 161, 172, 187, 191, 197, 198, 204, 212, 226, 228, 231, 232, 234, 258, 266, 268, 272, 279, 286, 289, 293, 299, 303, 311, 313, 321, 323, 324, 327, 335, 336, 340, 343, 351, 353, 355, 362, 365, 367, 368, 370, 374, 375, 377, 379,383 і 384 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування раку матки.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ед ІЮ Мо. 7, 8, 11, 25, 42, 44, 67, 82, 84, 86, 91, 94, 114, 136, 138, 145, 156, 161, 192, 202, 203, 204, 212, 216, 217, 218, 224, 226, 237, 257, 261, 293, 294, 299, 313, 321, 323, 324, 334, 340, 353, 358, 361, 362, 370 і 379 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування ГМЛ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ед ІЮ Мо. 8, 11, 14, 27, 38, 40, 48, 55, 59, 68, 84, 93, 94, 114, 118, 124, 126, 128, 146, 159, 161, 162, 164, 176, 179, 188, 189, 192, 200, 202, 208, 211, 212, 215, 216, 226, 228, 234, 235, 260, 264, 272, 273, 274, 279, 280, 293, 298, 305, 311, 321, 339, 342, 343, 344, 346, 348, 351, 353, 354, 362, 365, 370, 375, 377 і 379 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування ПККГШ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з Зед ІЮО Мо. 11, 26, 37, 44, 49, 58, 83, 84, 113, 128, 173, 176, 184, 201, 203, 226, 273, 279, 293, 317, 340, 348, 359, 360 і 361 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування НХЛ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з Зед ІЮ Мо. 11, 26, 45, 58, 84, 113, 136, 145, 173, 174, 176, 203, 226, 279, 293, 326, 335, 348, 351, 359,360 і 362 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування НДРЛ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІЮ Мо. 11, 45, 68, 162, 173, 174, 226, 293, 351, 359, 362 і 375 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування РЯ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮО Мо. 11, 35, 42, 59, 119, 126, 127, 152, 161, 172, 176, 192, 226, 228, 239, 260, 280, 293, 324, 362, 365, 374 і 384 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування ДРЛ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮО Мо. 13, 14, 30, 68, 89, 108, 125, 198, 200, 204, 228, 235, 242, 266, 269, 272, 280, 333, 353, 362, 363, 375, 377 і 379 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування РМ3.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ед ІЮ Мо. 14, 30, 49, 90, 107, 108, 111, 126, 136, 147, 161, 164, 173, 176, 181, 187, 190, 199, 208, 240, 274, 275, 280, 293, 340, 349, 351, 355, 359, 362,378 і 383 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування меланоми.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з зБЕО ІЮ Мо. 15, 82, 173, 211, 326, 362 і 378 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування раку стравоходу.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІЮО Мо. 30, 136, 164, 173, 187, 266, 293, 298, 335, 351, 362, 363 і 385 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування КРК.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІЮ Мо. 44, 76, 84, 145, 173, 211, 293, 306, 326, 351 і Зб2для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування НКК.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ед ІЮ Мо. 68, 94, 181, 226, 293, 335, 353, 370 і 375 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку жовчного міхура і (або) раку жовчних протоків і (або) холангіокарциноми.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІЮО Мо. 82, 87, 162, 351, і 362 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування РПШЗ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮ Мо. 84, 145, 173, 176, 258, 343 і 362 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування РШ.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІЮО Мо. 84, 126, 145, 173, 211, 239, 247, 349, 357, 362, 374 і 379 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування ГЦК.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮ Мо. 136, 211, 221, 226, 293, 321, 335, 31 і 354 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування раку головного мозку.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІЮ Мо. 128, 172, 188, 192, 293, 305, 312, 321, 348, 362 і 374 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку сечового міхура.
Зо Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІЮ Мо. 226, 321, 362 і 374 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування РІПМ3.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, які здатні зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І класу або- у подовженій формі, такій як відмінний за довжиною варіант - МНО ІІ класу.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згадані пептиди (кожний із них) складаються або по суті складаються з амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО
ІО МО: 385.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є модифікованим і (або) включає непептидні зв'язки.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є частиною злитого білка, зокрема злитого з М-термінальними амінокислотами НІГА-ОК антиген- асоційованого інваріантного ланцюга (Ії) або злитого з послідовністю (або вбудованого у послідовність) антитіла, наприклад, антитіла, що є специфічним до дендритних клітин.
Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти, що кодує пептиди за цим винаходом.
Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти за цим винаходом, яка являє собою ДНК,
КДНК, ПНК, РНК чи їх комбінацію.
Цей винахід також стосується вектора експресії, що здатний експресувати і (або) експресує нуклеїнову кислоту за цим винаходом.
Цей винахід також стосується пептиду за цим винаходом, нуклеїнової кислоти за цим винаходом або вектора експресії за цим винаходом для застосування для лікування захворювань і в медицині, зокрема в лікуванні раку.
Цей винахід також стосується антитіл, які є специфічними по відношенню до пептидів за цим винаходом або комплексів згаданих пептидів за цим винаходом з МНС та способів їх отримання.
Цей винахід також стосується Т-клітинних рецепторів (ТКР), зокрема розчинних ТКР (ртКР), і клонованих ТКР, вбудованих у аутологічні або алогенні Т-клітини, та способів їх отримання, а також МК-клітин або інших клітин, що несуть згаданий ТКР або вступають у перехресну реакцію із згаданими ТКР. бо Антитіла і (або) ТКР є додатковими втіленнями імунотерапевтичного застосування пептидів за винаходом що розглядається.
Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, що містить нуклеїнову кислоту за цим винаходом або вектор експресії, як зазначено вище. Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина є дендритною клітиною, і переважно дендритною клітиною.
Цей винахід також стосується способу отримання пептиду за цим винаходом, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна за цим винаходом і виділення пептиду зі згаданого клітини-хазяїна або її культурального середовища.
Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген навантажують на молекули МНС І або ІІ класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини або штучної антиген-презентуючої клітини шляхом контакту достатньої кількості антигену з антиген-презентуючою клітиною.
Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина містить вектор експресії, що здатний експресувати або експресує згаданий пептид, що містить послідовність від ЗЕО ІЮ Мо. 1 до 5ЕО ІЮ Мо.: 385, переважно, що містить послідовність від
ЗЕО ІО Мо. 1 до ЗЕО ІО Мо. 202 або варіант амінокислотної послідовності.
Цей винахід також стосується активованих Т-клітин, отриманих згідно способу за цим винаходом, де згадана Т-клітина селективно розпізнає клітину, яка експресує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за цим винаходом.
Цей винахід також стосується способу знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить будь-яку амінокислотну послідовність за цим винаходом, причому спосіб включає введення в організм пацієнта ефективної кількості Т-клітин за цим винаходом.
Цей винахід також стосується застосування будь-якого пептиду, що описаний тут, нуклеїнової кислоти за цим винаходом, вектора експресії за цим винаходом, клітини за цим винаходом або активованого Т-лімфоцита, Т-клітинного рецептора або антитіла або інших молекул, що зв'язують пептид або комплекс пептид-МНОС, за цим винаходом як лікарського засобу або в процесі виробництва лікарського засобу. Переважно, якщо згаданий лікарський засіб виявляє протиракову активність.
Зо Переважно, якщо згаданий лікарський засіб є засобом клітинної терапії, вакциною або білком на основі розчинного ТКР або антитілом.
Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де згадані ракові клітини є клітинами ХЛЛ, гострого мієлогенного лейкозу, раку жовчних протоків, раку головного мозку, раку молочної залози, колоректальної карциноми, раку стравоходу, раку жовчного міхура, раку 35 шлунка, гепатоцелюлярного раку, карциноми з клітин Меркеля, меланоми, неходжкінської лімфоми, недрібноклітинного раку легенів, раку яєчника, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, нирковоклітинного раку, дрібноклітинного раку легенів, раку сечового міхура і раку матки і переважно ХЛЛ.
Цей винахід також стосується біомаркерів на основі пептидів за цим винаходом, які у цьому 40 документі іменуватимуться як «мішені», які можуть використовуватися в діагностиці раку, переважно ХЛЛ. Маркером може бути надмірна презентація самого(-их) пептиду(-ів) або надмірна експресія відповідного(-их) гена(-ів). Маркери також можуть використовуватися для передбачення вірогідності успіху лікування, переважно імунотерапії і найбільш переважно імунотерапії, націленої на ту ж мішень, що ідентифікується біомаркером. Наприклад, антитіло 45 або розчинний ТКР може використовуватися для барвлення зрізів пухлини з метою виявлення присутності досліджуваного пептиду у комплексі з МНС.
Необов'язково, антитіло містить додаткову функціональну ділянку, таку як імуностимулюючий домен або токсин. Цей винахід також стосується цих нових мішеней у контексті лікування раку. 50 Стимуляція імунної відповіді залежить від присутності антигенів, що сприймаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Відкриття пухлино-асоційованих антигенів зробило можливим використання імунної системи хазяїна для втручання в ріст пухлини. Зараз вивчається можливість використання для імунотерапії раку різних механізмів задіяння як гуморальної, так і клітинної ланки імунної системи. 55 Специфічні елементи клітинної імунної відповіді здатні специфічно розпізнавати та знищувати пухлинні клітини. Виділення Т-клітин із популяції пухлино-інфільтруючих клітин або з периферичної крові говорить про те, що такі клітини відіграють важливу роль у природному імунному захисті проти раку. Важливу роль у цій відповіді відіграють, зокрема, СО8-позитивні Т- клітини, які розпізнають пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності І бо класу (МНС). Ці пептиди зазвичай складаються з 8-10 амінокислотних залишків, що отримані з білків або дефектних рибосомальних продуктів (ОРІР), які містяться у цитозолі. Молекули МНС людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (НІ А).
Якщо не зазначено інше, під нижче наведеними термінами, що використовуються у цьому описі, розуміються наступні поняття.
Термін «Т-клітинна відповідь» означає специфічну проліферацію та активацію ефекторних функцій, індукованих пептидом іп міїго чи іп мімо. Для цитотоксичних Т-клітин, обмежених МНЕ |І класу, ефекторними функціями можуть бути лізис клітин-мішеней, оброблених пептидом чи пептидним прекурсором чи клітин-мішеней, природно презентуючих пептид, секреція цитокінів, переважно гамма-інтерферону, ТМЕ-альфа або ІЛ-2, індукована пептидом, секреція ефекторних молекул, переважно гранзимів чи перфоринів, індукована пептидом, або дегрануляція.
Термін «пептид» використовується в цьому описі для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані один 3 одним зазвичай пептидним зв'язком між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Бажано, щоб пептиди були довжиною у 9 амінокислот, але можуть бути такими короткими, як довжиною у 8 амінокислот, і такими довгими, як довжиною у 10, 11, 12 13 або 14 або більшими по довжині, а у випадку пептидів, що зв'язані з молекулами МНС І класу (подовжені варіанти пептидів за цим винаходом), вони можуть досягати такої довжини, як 15, 16, 17, 18, 19 або 20 або більше амінокислот.
Термін «пептид» використовується також для позначення солей серії амінокислотних залишків, що з'єднані один 3 одним зазвичай пептидним зв'язком між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Переважно, щоб ці солі були фармацевтично прийнятними солями пептидів, наприклад, такими як хлорид або ацетат (трифторацетат). Треба зазначити, що солі пептидів за цим винаходом суттєво відрізняються від пептидів у їхньому стані іп мімо, оскільки пептиди не є солями іп мімо.
Термін «пептид» повинен також включати «олігопептид». Термін «олігопептид» використовується в цьому описі для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані один з одним зазвичай пептидними зв'язками між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Довжина олігопептиду не є критичною для цього винаходу за умови, що він містить правильний епітоп чи епітопи. Олігопептиди зазвичай коротші, ніж довжиною близько амінокислотних залишків, і довші, ніж довжиною близько 15 амінокислотних залишків.
Зо Термін «поліпептид» використовується для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані один з одним зазвичай пептидними зв'язками між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Довжина поліпептиду не є критичною для цього винаходу за умови, що він містить правильні епітопи. На відміну до термінів «пептид» і «олігопептид», під терміном «поліпептид» маються на увазі молекули, що містять більш ніж 30 амінокислотних залишків.
Термін «повнорозмірний поліпептид» означає повний білок (амінокислотний ланцюг) або повну субодиницю (амінокислотний ланцюг) мультимерного білка.
Пептид, олігопептид, білок або полінуклеотид, що кодує таку молекулу, має назву «імуногенного» (і, отже, є «їІмуногеном» в межах цього винаходу), якщо він здатний індукувати імунну відповідь. У межах цього винаходу імуногенність точніше визначається як здатність викликати відповідь Т-клітин. Отже, «імуногеном» може бути молекула, яка здатна індукувати імунну відповідь, і що стосується цього винаходу, молекула, що здатна індукувати відповідь Т- клітин. В іншому аспекті імуноген може бути пептидом, комплексом пептиду з МНС, олігопептидом і/або білком, який використовується для продукції специфічних антитіл або ТКР проти нього. «Епітоп» | класу Т-клітини потребує короткого пептиду, який зв'язаний із рецептором молекули МНС І класу, утворюючи потрійний комплекс (альфа-ланцюг молекули МНС І класу, бета-2-мікроглобулін і пептид), який може розпізнаватися Т-клітиною, що несе відповідний Т- клітинний рецептор, який зв'язується із комплексом МНС/пептид із належної афінністю.
Пептиди, які зв'язані з молекулами МНе І класу, зазвичай мають довжину в 8-14 амінокислот, і, найбільш типово, довжину в 9 амінокислот.
У людини є три різні генетичні локуси, які кодують молекули МНС І класу (молекули МНС людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (НІА)): НГА-А, НІ А-В і НІ А-6.
НІГА-А"ОЇ, НІГ А-АТО2 і НГА-В'07 є прикладами різних алелів МНС І! класу, які можуть експресуватися з цих локусів.
Таблиця 5. Частоти експресії Е для НІ А"Аб2 і НІ А-А"24 і найбільш поширених серотипів
НГА-ОК. Частоти, отримані з частот виявлення гаплотипів Її серед населення США, адаптовано з публікації Могі і співавт. (Могі еї а), 1997), з використанням формули Харді-
Вайнберга: Е -1 -(1-597. Комбінація А"02 або А"24 з певними алелями НІ А-ОК внаслідок 60 неврівноваженого зчеплення може бути збагаченою або збідненою у порівнянні з передбачуваною на основі індивідуальних частот виявлення. Докладну інформацію див. у
Спапоск і співавт. (Спапоск еї аї., 2004). із частоти алелів рАЄ |Європеоїднараса(ПівнчнаАмерика)д /-/:///////// | 77/77/7106 рве |Європеоїднараса(ПівнчнаАмерика)д /-/:///// | 77/71 рАЄ |Афроамериканці(ПівнчнаАмерика)ї 77717171 33700611 ре |Афроамериканці(ПівнчнаАмерика)ї 77171711 58096111
ОАЄ |Американцімонголоїдної раси (ПівнічнаАмерика)ї | 25096 -://--С:/ ре |Американцімонголоїдної раси (ПівнічнаАмерика) | 18,6096./.:/;./З
ОАЄ |Латиноамериканці(ПівнчнаАмерика)д | 77777171 ЗО ре |Латиноамериканці(ПівнчнаАмерика)д /-/:///////// | 777/7/7р7рюИюИ7/о20961111С
РЕ І Е2 тет; ПИОООООООООННННН КОН
ПС УМ КУ; ООН КОН
РЕ РІ Кт7:т; ВО КОН:
із частоти алелів
Пептиди за винаходом, переважно якщо введені до складу вакцини за винаходом, як описано в цьому документі, зв'язуються з А"02. Вакцина може також містити пептиди, що універсально зв'язуються з молекулами МН ІІ класу. Таким чином, вакцина за винаходом може застосовуватися для лікування раку у пацієнтів, що є А"02-позитивними, у той час як немає необхідності вибору алотипів МНС ІІ класу завдяки здатності цих пептидів до універсальності зв'язування.
Якщо пептиди, що зв'язуються з НІ А-А"02, поєднати з пептидами, які зв'язуються з іншим алелем, наприклад, А"24, лікуванню можна піддати більший відсоток будь-якої популяції пацієнтів, у порівнянні з охопленням пацієнтів, у яких кожний алель МНС І класу наявний окремо. У той час як у більшості популяцій менше ніж 5095 пацієнтів може бути охоплено кожним алелем окремо, вакцина, що містить пептиди, які є епітопами НІ А-А"24 ії НІГ А-А"О02, дозволяє вакцинувати принаймні 6095 пацієнтів у кожній відповідній популяції. Конкретно, наступні відсоткові долі пацієнтів будуть позитивними принаймні до одного з цих алелів у різних регіонах: США - 6195, Західна Європа - 6295, Китай - 7595, Південна Корея - 7795, Японія - 8695 (розраховано з даних улум.аПеІетедиепсіе5.пед.
У переважному втіленні термін «нуклеотидна послідовність» стосується гетерополімеру дезоксирибонуклеотида.
Нуклеотидна послідовність, що кодує конкретний пептид, олігопептид або поліпептид, може зустрічатися в природі або може бути сконструйована синтетично. Загалом, сегменти ДНК, які кодують пептиди, поліпептиди та білки за цим винаходом, зібрані з фрагментів кКДНК їі коротких олігонуклеотидних лінкерів або з серії олігонулеотидів з утворенням синтетичного гена, що здатний експресуватися в рекомбінантній транскрипційній одиниці, що містить регуляторні елементи, які отримані з оперона мікроорганізму або вірусу.
Термін «нуклеотидне кодування пептиду» в контексті цього винаходу означає нуклеотидну послідовність, що кодує пептид, включаючи штучні (створені руками людини) старт- і стоп- кодони, сумісні з біологічною системою, якою ця послідовність буде експресуватися, наприклад, з дендритними клітинами або іншою системою клітин, застосовних для отримання ТКР.
Для цілей цього винаходу посилання на послідовність нуклеїнової кислоти означає як
Зо одноланцюгову, так і дволанцюгову нуклеїнову кислоту. Отже, наприклад, для ДНК, конкретна послідовність, якщо контекст на вказує на інше, відноситься до одноланцюгової ДНК такої послідовності, дуплекса такої послідовності з її комплементом (дволанцюгова ДНК), і комплементу такої послідовності.
Термін «кодуюча ділянка» відноситься до тієї частини гена, яка або природно, або нормально кодує продукт експресії цього гена в його природному геномному оточенні, тобто до ділянки, що кодує іп мімо природний продукт експресії гена.
Кодуюча ділянка може бути ділянкою немутованого («нормального»), мутованого або зміненого гена, або навіть ділянкою послідовності ДНК або гена, повністю синтезованого в лабораторії з використанням методів, добре відомих фахівцям у галузі синтезу ДНК.
Термін «продукт експресії» означає поліпептид або білок, котрий є природним трансляційним продуктом гена та будь-якої нуклеїново-кислотної послідовності, що кодує еквіваленти, які є результатом виродження генетичного коду, і, таким чином, кодує ту ж амінокислоту (ті ж амінокислоти).
Термін «фрагмент», стосовно кодуючої послідовності, означає частину ДНК, яка містить менш ніж повну кодуючу ділянку, і продукт експресії якої зберігає по суті ту ж біологічну функцію чи активність, що й продукт експресії повної кодуючої ділянки.
Термін «сегмент ДНК» відноситься до полімеру ДНК у формі окремого фрагмента чи як компонент більшої конструкції ДНК, що одержаний з ДНК, виділеної принаймні один раз по суті в чистій формі, тобто без забруднюючих ендогенних матеріалів та в кількості чи концентрації, яка дає змогу ідентифікувати, виконувати маніпуляції та відновлювати сегмент і його складові нуклеотидні послідовності за допомогою стандартних біохімічних методів, наприклад, з використанням вектора клонування. Такі сегменти надаються у формі відкритої рамки зчитування, без порушень внутрішніми нетрансльованими послідовностями, чи інтронів, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетрансльованих ДНК можуть бути присутні за відкритою рамкою зчитування, де вони не заважають маніпуляціям або експресії кодуючих ділянок.
Термін «праймер» означає коротку нуклеїново-кислотну послідовність, котра може бути спарена з одним ланцюгом ДНК та надає вільний З'ОН-кінець, на якому ДНК-полімераза починає синтез дезоксирибонуклеотидного ланцюга.
Термін «промотор» означає ділянку ДНК, яка бере участь у зв'язуванні РНК-полімерази для ініціації транскрипції.
Термін «виділений» означає, що матеріал видаляється зі свого первісного середовища (наприклад, природного середовища, якщо він має природне походження). Наприклад, існуючий у природі полінуклеотид чи поліпептид, присутній у живих тваринах, не є виділеним, але той самий полінуклеотид чи поліпептид, відокремлений від якихось чи всіх співіснуючих матеріалів в природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути часткою вектора, і (або) такі полінуклеотиди чи поліпептиди можуть становити частину композиції і все ж таки бути виділеними, якщо такий вектор чи композиція не є частиною свого природного середовища.
Ці полінуклеотиди та рекомбінантні чи імуногенні поліпептиди, розкриті відповідно до цього винаходу, також можуть бути в «очищеній» формі. Термін «очищений» не вимагає абсолютної чистоти; скоріше він має відносне значення та може включати препарати високого ступеню очищення або препарати, які тільки частково очищені, в тому сенсі, як спеціалісти в цій галузі розуміють такі терміни. Наприклад, окремі клони, виділені з бібліотеки КкДНК, були стандартним чином очищені до електрофоретичної однорідності. Очищення вихідного матеріалу чи природного матеріалу принаймні на порядок величини, переважно на два-три порядки, та більш переважно, на чотири-п'ять порядків величини, чітко передбачається в цьому винаході. Крім того, заявлений поліпептид, котрий має чистоту переважно в 99,999, або принаймні в 99,9995 чи 99,99; і навіть бажано 9995 за масою чи більше, також чітко пропонується у винаході.
Нуклеїнові кислоти та поліпептиди як продукти експресі, що розкриваються відповідно до цього винаходу, а також вектори експресії, які містять такі нуклеїнові кислоти і (або) такі поліпептиди, можуть бути в «збагаченій формі». Термін «збагачений» в тому виді, в якому він використовується тут, означає, що концентрація матеріалу принаймні приблизно в 2, 5, 10, 100 або 1000 разів перевищує його природну концентрацію (наприклад), бажано 0,0195, за масою, принаймні краще приблизно 0,195 за масою. Також маються на увазі збагачені препарати приблизно в 0,595, 195, 595, 1095 та 2095 за масою. Послідовності, конструкції, вектори, клони та
Зо інші матеріали, які складають цей винахід, можуть, що більш сприятливо, бути у збагаченій чи виділений формі. Термін «активний фрагмент» означає фрагмент, зазвичай пептиду, поліпептиду або нуклеїново-кислотної послідовності, що генерує імунну реакцію (тобто має імуногенну активність) при введенні індивідуально чи, необов'язково, з прийнятним ад'ювантом або у векторі, тварині, наприклад, ссавцю, такому як кролик чи миша, і також включаючи людину, до того ж така імунна реакція має вид стимуляції Т-клітинної відповіді у тварини- реципієнта, такої як людина. Альтернативно, «активний фрагмент» також може використовуватись для індукції Т-клітинної відповіді іп міго.
В цьому винаході терміни «частка», «сегмент» і «фрагмент», якщо вони використовуються по відношенню до поліпептидів, означають безперервну послідовність залишків, таких як амінокислотні залишки, причому ця послідовність утворює підгрупу більшої послідовності.
Наприклад, якщо поліпептид був підданий обробці будь-якою з типових ендопептидаз, таких як трипсин або хімотрипсин, олігопептиди, одержані в результаті такої обробки, будуть представляти частки, сегменти чи фрагменти початкового поліпептиду. Якщо такі терміни використовуються стосовно полінуклеотидів, вони означають продукти, одержані після обробки згаданих полінуклеотидів будь-якою з типових ендонуклеаз.
Відповідно до цього винаходу, термін «відсоткова ідентичність» або «відсоток ідентичності» відносно послідовності означає, що послідовність порівнюється із заявленою або описаною послідовністю після вирівнювання послідовності, яка порівнюється («Послідовність, що порівнюється»), з описаною або заявленою послідовністю («Контрольна послідовність»).
Відсоткова ідентичність визначається відповідно до наведеної нижче формули:
Відсоткова ідентичність -100 (1 -(С/В) де С - кількість відмінностей між Контрольною послідовністю та Послідовністю, що порівнюється, на довжині вирівнювання між Контрольною послідовністю та Послідовністю, що порівнюється, де () кожна основа чи амінокислота в Контрольній послідовності, котра не має відповідної вирівняної основи чи амінокислоти у Послідовності, що порівнюється, і (ії) кожний розрив у Контрольній послідовності та () кожна вирівняна основа чи амінокислота в Контрольній послідовності, котра не має відповідної вирівняної основи чи амінокислоти у Послідовності, що порівнюється, становить 60 відмінність, і
(ійї) вирівнювання повинне починатися з позиції 1 вирівняних послідовностей; і К є числом основ або амінокислот у Контрольній послідовності по довжині вирівнювання з
Послідовністю, що порівнюється, причому будь-який розрив, створений у Контрольній послідовності, також вважається основою або амінокислотою.
Якщо існує вирівнювання між Послідовністю, що порівнюється, та Контрольною послідовністю, для якої відсоткова ідентичність, що розрахована вище, є приблизно рівною чи більшою, ніж зазначена мінімальна Відсоткова ідентичність, то Послідовність, що порівнюється, має зазначену мінімальну відсоткову ідентичність до Контрольної послідовності, хоча можуть існувати вирівнювання, в яких розрахована, як описано вище, Відсоткова ідентичність є меншою, ніж зазначена Відсоткова ідентичність.
Як згадано вище, цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІО МО: 385 або їхній варіант, який на 8895 є гомологічним послідовностям від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 385 або їхнього варіанту, який викликає перехресну реакцію Т-клітин із зазначеним пептидом. Пептиди за винаходом здатні зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини | класу, або подовжені версії згаданих пептидів - з молекулою ЇЇ класу.
У цьому винаході термін «гомологічний» означає ступінь ідентичності (див. «Відсоткова ідентичність» вище) послідовностей двох амінокислотних послідовностей, тобто пептидних або поліпептидних послідовностей. Згадана вище «гомологія» визначається порівнянням двох послідовностей, що були вирівняні в оптимальних умовах щодо послідовностей, які порівнюються. Таку гомологічність послідовностей можна розрахувати, створивши вирівнювання за допомогою, наприклад, алгоритму СіивіаіМУ. Загальнодоступне програмне забезпечення для аналізу послідовностей, більш конкретно, Месіог МТІ, СЕМЕТУХ або інші інструменти можна знайти у базах даних у вільному доступі.
Фахівець у цій галузі в змозі оцінити, чи будуть Т-клітини, індуковані варіантом конкретного пептиду, вступати в перехресну реакцію із самим пептидом (Аррау вї а!., 2006; Соіотрені еї аї., 2006; Бопа еї а!., 2001; 7агетрбва еї а!., 1997).
Під терміном «варіант» даної амінокислотної послідовності автори винаходу мають на увазі, що бокові ланцюги, наприклад, одного чи двох амінокислотних залишків змінюються (зокрема,
Зо шляхом заміни їх боковим ланцюгом залишку іншої природно існуючої амінокислоти чи якимось іншим боковим ланцюгом) таким чином, що пептид все ще здатний зв'язуватися з молекулою
НГА, по суті, у такий же спосіб, як і пептид, що складається з даної амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІО МО: 385. Наприклад, пептид може бути модифікований так, що він буде принаймні зберігати, чи навіть поліпшувати, здатність взаємодіяти та зв'язуватися зі зв'язувальною щілиною прийнятної молекули МНС, такої як НІ А-А"02 або -ОЕК, і у такий спосіб принаймні зберігати чи навіть поліпшувати здатність зв'язуватися з ТКР активованих Т-клітин.
Ці Т-клітини можуть згодом вступати в перехресну реакцію із клітинами і знищувати клітини, які експресують поліпептид, що містить природну амінокислотну послідовність спорідненого пептиду як визначено в аспектах цього винаходу. Як можна дізнатися з наукових публікацій і баз даних (КНаттепзев вї аї., 1999; СюакКіп еї аї!., 1997), окремі позиції пептидів, що зв'язують НІГ А, є типово якірними залишками, які формують ключову послідовність, що відповідає зв'язувальному мотиву рецептора НІА, який визначається полярністю, електрофізичними, гідрофобними властивостями і просторовою структурою поліпептидних ланцюгів, що утворюють зв'язувальну щілину. Отже, фахівець у цій галузі зможе модифікувати амінокислотну послідовність від 5ЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮО МО 385, зберігаючи відомі якірні залишки, і буде здатний визначити, чи зберігають такі варіанти здатність зв'язувати молекули МНС І або ЇЇ класу. Варіанти за цим винаходом зберігають здатність зв'язуватися з ТКР активованої Т- клітини, який потім може вступати в перехресну реакцію з- і знищувати клітини, які експресують поліпептид, що містить природну амінокислотну послідовність спорідненого пептиду як визначено в аспектах винаходу.
Первісні (немодифіковані) пептиди, що розкриваються в цьому винаході, можуть модифікуватися заміщенням одного чи кількох залишків на різних, можливо, селективних, ділянках пептидного ланцюга, якщо не зазначено інакше. Переважно, щоб ці заміщення знаходилися на кінці амінокислотного ланцюга. Такі заміщення можуть бути консервативного характеру, наприклад, коли одна амінокислота замінюється амінокислотою подібної структури та характеристик, наприклад, коли гідрофобна амінокислота замінюється іншою гідрофобною амінокислотою. Навіть більш консервативною буде заміна амінокислот такого ж чи подібного розміру та хімічного характеру, наприклад, коли лейцин замінюється на ізолейцин. В дослідженнях варіацій послідовностей в сімействах природних гомологічних білків певні бо амінокислотні заміщення допускаються частіше, ніж інші, ії вони часто демонструють кореляцію зі схожістю за розміром, зарядом, полярністю та гідрофобністю між первісною амінокислотою та її заміною, і це є основою для визначення «консервативних заміщень».
Консервативні заміщення визначаються в цьому документі як обмін в межах однієї з наведених нижче п'яти груп: група 1 - малі аліфатичні, неполярні чи слабо полярні залишки (Аа, зег, Тпг, Рго, Су); група 2 - полярні, негативно заряджені залишки та їх аміди (А5р, Авп,
Сім, СІп); група З - полярні, позитивно заряджені залишки (Ні, Аго, І уз); група 4 - великі аліфатичні неполярні залишки (Меї, Гей, Пе, Маї, Сувз); та група 5 - великі ароматичні залишки (Ре, Тут, Пр).
Менш консервативні заміщення можуть включати заміну однієї амінокислоти іншою, котра має подібні характеристики, але дещо відрізняється за розміром, наприклад, заміна аланіну залишком ізолейцину. Високо-неконсервативні заміни можуть включати заміщення кислої амінокислоти полярною, або навіть такою, що є основною за своїм характером. Такі «радикальні» заміщення не можуть, однак, відхилятись як потенційно неефективні, оскільки їх хімічні наслідки не є повністю прогнозованими, та радикальні заміщення також можуть несподівано призвести до сприятливих ефектів, які неможливо передбачити за простими хімічними принципами.
Звичайно, такі заміщення можуть включати структури, що відрізняються від звичайних | - амінокислот. Отже, Ю-амінокислоти можуть заміщуватися І-амінокислотами, котрі зазвичай виявляються в антигенних пептидах цього винаходу та все ж охоплюються розкриттям в ньому.
Крім того, нестандартні амінокислоти (тобто інші, ніж стандартні амінокислоти природних білків), також можуть використовуватись для заміщення з метою отримання імуногенів та імуногенних поліпептидів відповідно до цього винаходу.
Якщо виявляється, що заміщення в більш ніж одній позиції приводять до утворення пептиду по суті з еквівалентною чи більшою антигенною активністю, як визначено нижче, тоді комбінації цих заміщень будуть досліджуватись з метою визначення, чи мають комбіновані заміщення додатковий чи синергічний вплив на антигенність пептиду. Як правило, в пептиді замінюються одночасно не більш ніж 4 позиції.
Пептид, що по суті складається з амінокислотної послідовності як зазначено у цьому документі, може мати одну або дві неякірні амінокислоти (див. нижче пояснення щодо якірного
Зо мотиву), що були замінені без того, щоб здатність пептиду зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або Ії класу суттєво змінилася або піддалася негативному впливу у порівнянні з немодифікованим пептидом. У іншому пептиді, що складається або по суті складається з цієї амінокислотної послідовності як зазначено у цьому документі, одна або дві амінокислоти можуть бути замінені партнерами по консервативній заміні (також див. нижче у цьому документі) без того, щоб здатність пептиду зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або І класу суттєво змінилася або піддалася негативному впливу у порівнянні з немодифікованим пептидом.
Ті амінокислотні залишки, що не є суттєвими для взаємодії з Т-клітинним рецептором, можуть бути модифіковані шляхом заміни іншою амінокислотою, введення якої не має суттєвого впливу на реактивність Т-клітин та не виключає зв'язування із відповідним МНС. Отже, за винятком зазначеної умови, пептид за винаходом може бути будь-яким пептидом (до цього терміну автори винаходу відносять олігопептид чи поліпептид), котрий включає амінокислотні послідовності або їхню частину чи її варіант, як він є.
Таблиця 6
Варіанти і мотив пептидів відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 2, 5, 8,62 і 53
Позиця 7777777 11123145 617|8| 9 ло
ЗЕОІЮМО.2 7 ФА (С но |в Р (0 ЇМ М 1 1
ГГ 70171711 1 1 с.
Ім ГГ 1 її її 1 1 11 варіанти 1 ім ГГ 1 її її 1 п 11 ім Її Її 1 | г...
ЇЗА Її Її Її Її 1 1 її 11
ЗА Її Її Її Її її її м
ЗА Її Її Її Її її п 171
Таблиця 6
Варіанти і мотив пептидів відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 2, 5, 8,62 і 53
Позицяї (| 11231451 617 | 8 | 9 | поп
ТА Її Її Її Її | Її (А п ЛИ п ПО ПО КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ мМ 17 171717171717ї1 м 1 п Ли п ПО ПО КОХ КОНЯ КОНЯ К ПНЯ НОЯ НОЯ
МГ 1 її 1 1 (А. в ки я ПО ПО КОХ ПО КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ в ки я В ПО ПОЯ ПОЯ КОНЯ БУТОНИ НОЯ НО в ки я В ПО ПО ПО КОНЯ К ПНЯ НОЯ ОН в ки п ПО ПО КОХ ПО КОН КМИН НОЯ пи Ге я Я ПО КОХ ПОН КОНЯ КОНЯ НОЯ ОН 9 її її її її 1 їм 9 її її її її 1 її п 111 9 її її її 11 її (А...
Позицяї --:-:/// 1121314 | 51617 | 8 | 9 поп
ЗЕОЮМО5 777 ЛА | 0 Р |к (| А (5 А І в п п Я п ПНЯ ПО КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ ши п п Я п Я ПО ПО КОНЯ НОЯ ОН ши п п Я п Я ПО ПО КУТЯ ПО НО ни ГТ п ПО ОО КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ
Ім Її її 1 1111 ни ГТ я п о КОНЯ КОНЯ КОНЯ Ж НАННЯ НОЯ НОЯ
Ім! Її її її 1 їм
ЗА Її Її Її її її її її 11
ТА Її Її Її її її 111
ТА Її Її Її її 1 її п 11
Варіанти ТА 1 З 25 1 1 1 Х 1 1 п ЛИ п ПО ПО КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ п ЛИ п ПО ПО КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ п Ли п ПО ПО КОХ КО КОНЯ Ж ННЯ НОЯ НОЯ мМ Г1711717171717ї1м Ії в ки я ПО ПО КОХ ПО КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ в ки я ПО ПО КОХ ПОН КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ в ки я В ПО ПО ПО КОНЯ Ж ННЯ НОЯ НОЯ пГ1717171717717ї1 м пи Ге я Я ПО КОХ ПОН КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ 9 її її її її 1 її 111 9 її її її її 1 її п 111 9 її її її 1 їм
Позицяї --:-://(/.// 1121314 | 5167 | 8 | 9 поп
ЗЕОІЮМО.8 7777 ЛА |. ФА А |5 А | (Р А Гм ши п п Я п ПНЯ ПО ПО КОНЯ ПОН КО ши п п Я п Я ПО ПО КОНЯ НОЯ ПН ши п п Я п Я ПО ПО КОНЯ ПОН ПЗУ ни ГТ п ПО ОО КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ ОН ни ГТ п п о КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ КН
Варіанти ім ИШ21221222100020332010311
Ім! Її її 1 її 1 А
ЗА Її Її Її її її її її 11
ЗА Її Її Її її 1 її 1
ЗА Її Її Її її її її її
ТА Її Її Її її 1 її | ТА п ЛИ п ПО ПО КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ НОЯ м 17171717171717171
Таблиця 6
Варіанти і мотив пептидів відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 2, 5, 8,62 і 53
Позицяї (| 11231415 1617 | 8 | 9 | поп п ЛИ п ПО ПО КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ КН мМ г 71717171 1 1 711 ТА в ки я ПО ПО КОХ ПО КОНЯ КОНЯ НОЯ НО в ки я В ПО КОХ ПО КОНЯ КОНЯ КОН КО в ки я ПО ПО КОХ ПО КОНЯ КОНЯ НОЯ ПНЯ п 71171711 1 1 71 А пи Ге я Я ПО КОХ ПОН КОНЯ КОНЯ НОЯ ОН пи Ге я Я ПО ПО ПО КОНЯ КОНЯ КОН КО пи Ге я Я ПО КОХ ПОН КОНЯ КОНЯ НОЯ ПНЯ її її її 1 її 11 А 77177777. Позиця : | 1 | 2 | з | 4 | 5|6|7 | 8 | 5
ЗЕОЮв2 77777777 7 (а 1 1 00 06 5 |Р в г п Ге Я Я НОЯ КОНЯ НОЯ КОНЯ Б п ге ПО Я НОЯ КОНЯ НОЯ КОНЯ КП п ге ПО Я НОЯ КОНЯ НОЯ КОНЯ НОЯ 71717701 А ім ГГ 717171 717 м ім ГГ 77717 7 п ім ГГ 1 ім ГГ її 1 1 А
ФА Її Її Її її 1 її мМ ни сте п я ПО ПИ НОЯ КОНЯ КН ни сте п я ПО ПНЯ НОЯ КОНЯ НОЯ варіанти ТА 1 51 51 Л 1 1 ЛА п Кт п Я ПО КОНЯ НОЯ КОНЯ Б п Кт п Я ПО КОНЯ НОЯ КОНЯ КП п КТ п Я НОЯ КОНЯ НОЯ КОНЯ НОЯ
МГ 7 71770171717177177117 А и ка По Я НОЯ ПОН НОЯ КОНЯ Б и ка По Я ПО ПОН НОЯ КОНЯ КН и ка По Я НОЯ КОНЯ ПОН КОНЯ НОЯ и ка По Я НОЯ ПОН НОЯ НОЯ КУА п Се и п НОЯ ПИ ПОН КОНЯ Б п Се и п НОЯ ПИ НОЯ КОНЯ Я п Се ПО п НОЯ ПОН ПОЛЯ КОНЯ НОЯ (9 її її її 1 1 А
Позиця --: ':.:./ | 1712 4.3 | 4 5 | 6 | 7 | 8 | 5 ши и а я Я Я ПО ПООЯ БЯ ши ши і я Я Я ПО ПОЛЯ КОНЯ ши п і я Я Я ПО ПОЛО ПСО ім ГГ 717171 717 м ім ГГ 77717 7 п ім ГГ 1
Варіанти ім ГГ її 1 1 А
ФА Її Її Її її 1 її мМ ни сте п я ПО ПИ НОЯ КОНЯ КН ни сте п я ПО ПНЯ НОЯ КОНЯ НОЯ
ТА Її Її Її ЇЇ її А п Кт п Я ПО КОНЯ НОЯ КОНЯ Б п Кт п Я ПО КОНЯ НОЯ КОНЯ КП пи Тл По я ПО КОНЯ ПОН КОНЯ НОЯ
7777... Позиця г | 1 | 2 | з | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 5
М 1 г її 11 1 А пи кл Я ПО ПОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ БИ пи кл Я ПО ПОН КОНЯ ПОН ОНИ Ж ПАН
Дт 1 7Г171717ї17ї11 1 4071 г 1 1 11 1 А -е0ИБКИАИШ8ВИАКЙИВНАШНИНН-- ния Ге ПИ ПО ПОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ НО
І 0 1 Її її її А
Більш довгі (подовжені) пептиди також можуть бути придатними. Можливо, щоб епітопи комплексу МН І класу, хоча вони мають зазвичай довжину 8-11 амінокислот, утворювались шляхом процесингу з більш довгих пептидів чи білків, які включають фактичний епітоп. Бажано, щоби бокові залишки фактичного епітопу не завдавали значного впливу на протеолітичне розщеплення, необхідне для презентації фактичного епітопу під час процесингу.
Пептиди за цим винаходом можуть бути подовжені аж до чотирьох амінокислот, тобто 1, 2, З або 4 амінокислоти можуть біти додані до будь-якого кінця у будь-якій комбінації між 4:0 і 04.
Комбінації подовжень за цим винаходом можуть бути проілюстровані у Таблиці 7. 10 .
Таблиця 7
Комбінації подовжень у пептидах за цим винаходом 24 77711110. |б,абої.абогабоЗабої4./:/ (7: т!:://////:/ с 24 77117110. |б,абої.абогабоЗабої4./-/:/ ///:::х /////:/:/г/С/С/:НС "
Амінокислотами для подовжень/елонгацій можуть бути пептиди вихідної послідовності білка або будь-яка інша амінокислота. Подовження може використовуватися для підвищення стабільності або розчинності пептидів.
Отже, епітопи відповідно цього винаходу можуть бути ідентичними природним пухлино- асоційованим та пухлино-специфічним епітопам або можуть включати епітопи, які відрізняються не більше ніж на чотири залишки від контрольного пептиду, за умови, що вони мають по суті ідентичну антигенну активність.
У альтернативному втіленні пептид є подовженим з будь-якого або з обох боків на більш ніж 4 амінокислоти, переважно до загальної довжини аж до 30 амінокислот. Це може привести до утворення пептидів, що зв'язуються з молекулами МНС ІІ класу. Зв'язування з молекулами МНС
ЇЇ класу може бути перевірено методами, відомими в цій галузі.
Відповідно, за цим винаходом також пропонуються пептидні епітопи і епітопи пептидних варіантів, що зв'язуються з молекулами МНС І класу, де згаданий пептид або його варіант має загальну довжину від 8 до 100, переважно від 8 до 30, та найбільш переважно від 8 до 14, а саме 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 амінокислот, а у випадку подовжених пептидів, що зв'язуються з молекулами НГА ЇЇ класу, вони можуть також досягати довжини 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 амінокислоти.
Зрозуміло, що пептид або його варіант за цим винаходом здатний зв'язуватися з молекулою
Зо головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або ІІ класу. Зв'язування пептиду або його варіанту з комплексом МНС може бути досліджено методами, відомими в цій галузі.
Переважно, коли Т-клітини, специфічні по відношенню до пептиду за цим винаходом, досліджують у порівнянні із заміщеними пептидами, причому концентрація пептиду, за якої заміщені пептиди досягають половини максимального росту лізису відносно фонових значень, є не більше ніж 1 мМ, переважно не більше ніж 1 мкМ, ще більш переважно не більше ніж приблизно 1 нМ, і ще більш переважно не більше ніж приблизно 100 пМ, і найбільш переважно не більше ніж приблизно 10 пМ. Переважно також, щоб заміщений пептид розпізнавався Т- клітинами, отриманими від більш ніж однієї особи, принаймні двох, і більш переважно трьох осіб.
У особливо переважному втіленні цього винаходу пептид складається або по суті складається з амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 385. «По суті складається 3» означає, що пептид за винаходом, на додаток до послідовності відповідно до будь якої послідовності від 560 ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО 385, чи його варіант, містить додаткові М- і (або) С-термінальні фрагменти послідовності амінокислот, які не обов'язково формують частину пептиду, що функціонує як епітоп для молекул МНС.
Проте ці фрагменти можуть бути важливими для забезпечення ефективного введення пептиду відповідно до цього винаходу в клітини. В одному з втілень цього винаходу пептид є частиною гібридного білка, який містить, наприклад, 80 М-термінальних амінокислот НІ А-ОВ- антиген-асоційованого інваріантного ланцюга (р33, надалі "Ії"), одержаного з МСВІ, інвентарний номер в генному банку (СепВапкК) Х00497. У інших злиттях пептиди за цим винаходом можуть бути злиті з антитілом, як описано в цьому документі, або з його функціональною частиною, зокрема з послідовністю антитіла, щоби бути специфічно націленими згаданими антитілами, або, наприклад, злиті з антитілом або з послідовністю антитіла, що є специфічним до дендритних клітин, як описано в цьому документі.
Крім того, пептид чи його варіант може бути додатково модифікований для поліпшення його стабільності і (або) зв'язку з молекулами МНС, щоб викликати сильнішу імунну відповідь.
Методи такої оптимізації пептидної послідовності добре відомі в цій галузі та включають, наприклад, введення реверсованих пептидних зв'язків чи непептидних зв'язків.
В реверсованому пептидному зв'язку амінокислотні залишки не з'єднуються пептидними зв'язками (-СО-МН-), а пептидний зв'язок реверсується. Такі ретро-інверсивні пептидні міметики можуть бути отримані методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в роботі
Мелієге і співавт. (1997) (Меглієге сеї а!., 1997), яка включена в цей документ шляхом посилання.
Такий підхід включає формування псевдо-пептидів, які містять зміни із залученням остова, а не орієнтації бокових ланцюгів. Автори Ме?іеге і співавт. (Ме?лієге єї а!., 1997) показують, що для відповіді МНС і Т-клітин-хелперів зазначені псевдо-пептиди є прийнятними. Ретро-інверсивні пептиди, які містять зв'язки МН-СО замість пептидних зв'язків СО-МН, набагато більш стійкі до протеолізу.
Непептидний зв'язок - це, наприклад, -СН2-МН, -СНе5-, -СНаСНе-, -«СН-СН-, -СОСН»-, -
СнН(ОН)СН»- та -СНо5О-. У патенті США 4 897 445 пропонується метод твердофазного синтезу непептидних зв'язків (-СН2-МН) в поліпептидних ланцюгах, що включає поліпептиди, синтезовані за допомогою стандартних методик, та непептидний зв'язок, синтезований шляхом реакції аміноальдегіду та амінокислоти в присутності МасСМВН»з.
Пептиди, що включають послідовності, описані вище, можуть бути синтезовані з додатковими хімічними групами, присутніми на їхніх аміно- і (або) карбоксильних кінцях, для посилення стабільності, біологічної доступності і (або) афінності пептидів. Наприклад, гідрофобні групи, такі як карбобензоксильні, данзильні чи трет-бутилоксикарбонільні, можуть додаватися до аміно-кінців пептидів. Подібним чином, на аміно-кінцях пептидів може розміщуватись ацетильна група чи 9-флуоренілметоксикарбонільна група. До карбоксильних кінців пептидів може бути додана також гідрофобна група, трет-бутилоксикарбонільна чи амідо- група.
Крім того, пептиди за винаходом можуть бути синтезовані для зміни їхньої просторової конфігурації. Наприклад, може використовуватися О-ізомер одного чи кількох амінокислотних залишків пептиду, а не звичайний І-ізомер. До того ж, принаймні один з амінокислотних залишків пептидів за винаходом може замінюватись одним з добре відомих амінокислотних залишків неприродного походження. Такі заміни можуть служити для підвищення стабільності, біологічної доступності і (або) здатності до зв'язування пептидів за винаходом.
Подібним чином, пептид чи його варіант за винаходом може модифікуватися хімічно, шляхом реакції окремих амінокислот до чи після синтезу пептиду. Приклади таких модифікацій добре відомі в цій галузі та узагальнені, зокрема, в роботі К. І ипабіад, Спетіса! Кеадепів ог
Ргоївіп Моаіїісайтоп, За еа. СВС Ргев5, 2004 (І ипаріад, 2004), яка включена в цей документ шляхом посилання. Хімічна модифікація амінокислот включає, але не обмежується ними, модифікацію шляхом ацилювання, амідинування, піридоксилювання лізину, відновлювального бо алкілування, тринітробензилювання аміногруп 2,4,6-тринітробензолсульфоновою кислотою
(ТМВ5), амідну модифікацію карбоксильних груп та сульфгідрильну модифікацію шляхом окиснення пермурашиною кислотою цистеїну в цистеїнову кислоту, формування похідних ртуті, утворення змішаних дисульфідів з іншими тіольними сполуками, реакцію з імідом малеїнової кислоти, карбоксиметилювання йодоцтовою кислотою чи йодацетамідом та карбамоїлування ціанатом при лужному рН, хоча способи модифікації не обмежуються наведеними тут. В цьому відношенні досвідчений фахівець може звернутися до Глави 15 публікації Сиггепі Ргоїосої5 Іп
Ргоївіп бсіепсе, Ед5. Соїїдап еї аї. (ойп Уміеу апа 5оп5 МУ 1995-2000) (Соїїдап еї а!., 1995), де докладно описано методику відносно хімічної модифікації білків.
Стисло, модифікація, наприклад, аргінільних залишків часто базується на реакції віцинальних дикарбонільних сполук, таких як фенілгліоксаль, 2,3-бутандіон і 1,2- циклогександіон, з утворенням адукту. Іншим прикладом є реакція метилгліоксалю з аргініновими залишками. Цистеїн може бути модифікований без супутньої модифікації інших нуклеофільних сайтів, таких як лізин та гістидин. В результаті велика кількість реагентів є доступною для модифікації цистеїну. Веб-сайти таких компаній, як Зідта-Аїагісн (перулумли.відта-аїІагісп.сот), надають інформацію щодо конкретних реагентів.
Селективне відновлення дисульфідних зв'язків також є поширеним. Дисульфідні зв'язки можуть утворюватися і окислюватися під час теплової обробки біофармацевтичних препаратів.
К-реагент Вудворда може використовуватися для модифікації деяких залишків глутамінової кислоти. М-(З-диметиламінопропіл)-М'-етилкарбодіїмід може використовуватися для утворення внутрішньомолекулярних зшивок між залишками лізину і глутамінової кислоти. Наприклад, діетилпірокарбонат є реагентом для модифікації гістидильних залишків у білках. Для модифікації гістидину може також використовуватися 4-гідрокси-2-ноненаль. Реакція залишків лізину та інших альфа-аміногруп є, наприклад, прийнятною для зв'язування пептидів до поверхонь або поперечного зшивання білків/пептидів. Лізин є сайтом для прикріплення поліетиленгліколю і головним сайтом модифікації при глікозилюванні білків. Метіонінові залишки у білках можна модифікувати, наприклад, йодацетамідом, брометиламіном і хлораміном Т.
Тетранітрометан і М-ацетилімідазол можуть використовуватися для модифікації тирозильних залишків. Поперечне зшивання шляхом утворення дитирозину може здійснюватися пероксидом водню/іонами міді.
У недавніх дослідженнях модифікації триптофану використовувалися М-бромсукцинімід, 2- гідрокси-о-нітробензилбромід або 3-бром-3-метил-2-(2-нітрофенілмеркапто)-ЗН-індол.: (ВМРЗ- скатол).
Успішна модифікація ПЕГ (поліетиленгліколем) терапевтичних білків та пептидів, що часто асоціюється з подовженням напівперіоду циркуляції при перехресному зшиванні білків із глутаральдегідом, поліетиленглікольдіакрилатом та формальдегідом, використовується для приготування гідрогелів. Хімічна модифікація алергенів для використання в імунотерапії часто досягається шляхом карбамоїлування ціанатом калію.
Пептид чи його варіант, де пептид є модифікованим або включає непептидні зв'язки, є переважним втіленням цього винаходу.
Інше втілення цього винаходу стосується пептиду неприродного походження, де згаданий пептид складається або по суті складається з амінокислотної послідовності від 5ЕО ІЮ Мо: 1 до
ЗЕО ІЮ Мо: 385 і був отриманий синтезом (наприклад, синтезований) у вигляді фармацевтично прийнятної солі. Способи синтетичного отримання пептидів добре відомі фахівцю у цій галузі.
Солі пептидів за цим винаходом суттєво відрізняються від пептидів за їхнім станом (їхніми станами) іп мімо, оскільки пептиди, які генеруються іп мімо, не є солями. Сольова форма пептиду неприродного походження опосередковує розчинність цього пептиду, особливо у контексті фармацевтичних композицій, які містять ці пептиди, наприклад, пептидні вакцини, як це розкрито тут. Достатня і принаймні суттєва розчинність пептиду (пептидів) є необхідною умовою для того, щоб ефективно доставити пептиди суб'єкту, якого належить лікувати. Переважно, щоб ці солі були фармацевтично прийнятними солями пептидів. Ці солі за винаходом включають лужні і лужноземельні солі, такі як солі із серії Гофмейстера, які містять аніони РО4У, 50427,
СНЗСОО, СГ, Вг, МОз, СіоОг, Г, ЗОМ: і катіони МН", Вр», КУ, Мах, С87, Гі, 7пе, Мр, Са, Ми?» би»м ії Ва". Переважно солі вибирають із (МНа)зРО», (МНагНРО», (МНа)НегРО», (МНаг)2550Ох,
МНАСНЗСОО, МНАСІ, МНаВг, МНаАМО», МНаСІОх, МНаЇ, МНаАЗСМ, АрзРОх, Ар2НРО», ВЬБНгРО»,
Вр2505, НБАСНЗСОО, АраСІ, ВБаВг, АБаМО»з, АБаСіІОз, АраІЇ, АБАЗСМ, КзРОх, КаНРО»х, КНегРО»,
К»5Ох, КСНЗСОО, КС, КВ, КМО»з, КСІОх, КІ, КО5СМ, МазРОх, МагНРО»х, МанНегРО», Ма2505, маснзоСоо, Масі, МаВг, МаМмоОз, МасСіОх, Маї, Мазсм, 2пСіІ» СвзРО»4, С52НРО»х, СвНеРоОх, С52505,
С5СНзСОО, 50, С5Вг, Се5МОз, СебСіОл, С5іІ, Сб55СМ, ГізРОх, П2НРО», ГІНегРО», 12505, бо ПСНзСОО, СІ, СВ, ГМО», ГіСІОя, СГ, 15СМ, бцигбОз, Маз(РОз)г, Мог2НРО», Ма(НегРоОз)»,
М9250х5, Моа(СНзСО0)2, МосіІг, МаВіг, Ма(МОз)2, Ма(СіОз)2, Мао!і», Моа(ЗСМ)», Мписіг, Саз(РоОх),,
СагНРО», Са(НгРОз)2, Сабо», Са(СНзСОО)», Сасі», СаВгг, Са(МОз)г, Са(СІОз4)», Са!», Са(5СМ)»,
Ваз(РОз)г2, Ваг?НРО», Ва(НгРОз4)2, ВабзО», Ва(СНзСО0)», Васі», ВавВгг, Ва(МОз)», Ва(СіІОл)», Ваї? і
Ва(ЗСМ)». Особливо переважними є ацетат МН, МосСі», КН»РО», Ма50О», КСІ, Масі їі Сасі»г, такі як, наприклад, хлоридні або ацетатні (трифторацетатні) солі.
Загалом, пептиди і їх варіанти (принаймні такі, що містять пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть бути синтезовані Етос-поліамідним методом твердофазного синтезу пептидів, як це розкрито у роботі І иКаз і співавт. (І иКаз еї аї!., 1981) і в посиланнях, що є в ній. Тимчасовий захист М-аміногрупи забезпечується /-9- флуоренілметилоксикарбонільною (Етос) групою. Повторювальне розщеплення цієї дуже нестійкої до дії луг захисної групи виконується за допомогою 2095 піперидину у М,М- диметилформаміді. Можна захистити функціональні групи бокових ланцюгів, такі як бутилові етери (у випадку серину, треоніну та тирозину), бутилові естери (у випадку глутамінової кислоти і аспарагінової кислоти), бутилоксикарбонільне похідне (у випадку лізину і гістидину), тритильне похідне (у випадку цистеїну) і 4-метокси-2,3,6-триметилбензосульфонільне похідне (у випадку аргініну). У сполуках, в яких С-термінальними залишками є глутамін або аспарагін, для захисту амідогруп бокових ланцюгів використовують 4,4"-диметоксибензгідрильну групу. Основою твердофазного носія є полідиметилакриламідний полімер, що складається з трьох мономерів: диметилакриламіду (каркасний мономер), біс-акрилоїлетилендіаміну (компонент для перехресного зшивання) і акрилоїлсаркозинметилового естеру (функціоналізуючий агент). Як агент, що утворює зв'язок пептиду і смоли, який піддається розщепленню, використовується нестійке до дії кислот похідне 4-гідроксиметилфеноксиоцтової кислоти. Всі амінокислотні похідні додають у вигляді заздалегідь синтезованих симетричних ангідридних похідних за винятком аспарагіну і глутаміну, які додають з використанням зворотної М,М-дициклогексилкарбодіїмід/1 - гідроксибезотриазол-опосередкованої реакції сполучення. Усі реакції сполучення і зняття захисту відслідковували за допомогою методів контролю з використанням нінгідрину, тринітробензолсульфонової кислоти і ізотину. Після завершення синтезу пептиди віддеплюють від смоли-носія з супутнім видаленням захисних груп бокових ланцюгів шляхом обробки 95965 трифтороцтовою кислотою, що містить 5095 суміші поглиначів. Зазвичай використовувані поглиначі включають етандитіол, фенол, анізол і воду, конкретний вибір залежить від амінокислотних складових пептиду, що синтезується. Для синтезу пептидів можливе також використання комбінації твердофазних і рідкофазних методик (див., наприклад, (ВгисКаопег єї а!., 2004) і посилання, наведені в цій роботі).
Трифтороцтову кислоту видаляють випаровуванням у вакуумі з подальшим подрібнюванням із діетиловим етером, що забезпечує отримання сирого пептиду. Будь-які поглиначі, які присутні в матеріалі, видаляються простою процедурою екстракції, яка після ліофілізації водної фази дозволяє отримати сирий пептид, вільний від поглиначів. Реагенти для синтезу пептидів, як правило, можна придбати, наприклад, у компанії СаІріоспет-Момабріоспет (Нотінггем, Велика
Британія).
Очищення може виконуватися за допомогою одного будь-якого методу або їх комбінації, таких як перекристалізація, ексклюзійна хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазна високоефективна рідинна хроматографія із градієнтним розділенням, наприклад, з використанням системи ацетонітрил/вода.
Аналіз пептидів може виконуватися за допомогою тонкошарової хроматографії, електрофорезу, зокрема, капілярного електрофорезу, твердофазної екстракції (ТФЕ), зворотно- фазної високоефективної рідинної хроматографії, амінокислотного аналізу після кислотного гідролізу та мас-спектрометрії із бомбардуванням прискореними атомами (ЕАВ), а також мас- спектрометричного аналізу МАО та Е5БІ-О-ТОБЕ.
Щоб вибрати надмірно презентовані пептиди, розраховується профіль презентації, який дозволяє оцінити медіану презентації у зразку, а також варіацію повторних вимірювань.
Профіль зіставляє зразки пухлини, що вивчається, з фоновим рівнем зразків нормальних тканин. Кожний із цих профілів можна потім консолідувати у показник надмірної презентації, підрахувавши р-значення за допомогою лінійної моделі змішаних ефектів (Ріпнеїго еїаї.,2015), з поправкою на багаторазове тестування за методом аналізу долі хибно-позитивних ідентифікацій (Вепіатіпі апа Носпбего, 1995) (порівняйте з Прикладом 1, Фігурою 1).
З метою ідентифікації і відносного кількісного визначення НІ А-лігандів методом мас- спектрометрії молекули НІГ А зразків тканин після шокової заморозки були очищені, і були виділені пептиди, що зв'язуються з молекулами НГА. Виділені пептиди були розділені, а їх бо послідовності були ідентифіковані методом рідинної хроматографії і мас-спектрометрії (РХ-МС)
у режимі реального часу з іонізацією у наноелектроспреї. Отримані пептидні послідовності були перевірені порівнянням шаблону фрагментації природних пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), записаного для зразків ХЛЛ (М - 17 А"02-позитивних зразків), із шаблонами фрагментації відповідних синтетичних контрольних пептидів із ідентичними послідовностями.
Оскільки було безпосередньо виявлено, що пептиди є лігандами молекул НІ А на клітинах первинних пухлин, ці результати надали прямі докази природного процесингу і презентації ідентифікованих пептидів на тканинах первинних ракових пухлин, отриманих від 16 пацієнтів, хворих на ХЛЛ.
Патентовані інформаційні канали з наукової розробки ХРЕЕБЗІОЕМТЄФ м2.1 (див., наприклад, заявку США 2013-0096016, яка таким чином включена в цей документ шляхом посилання в усій повноті) дозволяють ідентифікувати і виділяти відповідні кандидати у вакцини на базі надмірно презентованих пептидів, застосовуючи метод прямого відносного кількісного визначення рівнів
НІГ А-рестриктованих пептидів на ракових тканинах у порівнянні з декількома різними нераковими тканинами і органами. Цього вдалося досягти за рахунок розробки методу диференційного кількісного визначення на основі даних РХ-МС без використання ізотопної мітки, що були оброблені патентованими інформаційними каналами аналізу даних, в яких об'єднані алгоритми для ідентифікації послідовностей, спектральної кластеризації, підрахунку іонів, вирівнювання часу утримання, деконволюції за зарядовими станами і нормалізації.
Були встановлені рівні презентації, включаючи оцінку похибок для кожного пептиду і зразка.
Були ідентифіковані пептиди, що презентуються виключно на пухлинних тканинах, і пептиди, надмірно презентовані на пухлинних тканинах у порівнянні з нераковими тканинами і органами.
Комплекси НІ А-пептид, отримані із зразків тканин ХЛЛ, були очищені, і пептиди, зв'язані з молекулами НГА, були виділені і проаналізовані методом РХ-МС (див. приклади). Усі ТОМАР, включені у цю заявку, були за допомогою цього підходу ідентифіковані на зразках первинного
ХЛЛ, що підтвердило факт їх презентації на клітинах первинного ХЛЛ.
Ідентифіковані на багатьох пухлинних зразках ХЛЛ і на нормальних тканинах ТОМАР були кількісно визначені методом РХ-МС без застосування ізотопних міток з реєстрацією спектрів у режимі підрахунку іонів. Цей метод базується на припущенні, що площі піків РХ-МС пептиду корелюють з його кількістю у зразку. Усі сигнали, які залежать від кількості пептиду, у різних
Зо експериментах за методом РХ-МС, були нормалізовані на основі середніх значень, усереднені по зразках і злиті у гістограму, що має назву профілю презентації. Профіль презентації об'єднує дані різних методів аналізу, таких як пошук по базах даних для білків, спектральної кластеризації, деконволюції за зарядовими станами (розрядження) і вирівнювання часу утримання і нормалізації.
Крім того, патентовані інформаційні канали з наукової розробки Тесппідие ХРЕЕЗІОЕМТФ м2.х (див., наприклад заявки на патент РСТ/ЕР2011/056056 і РСТ/ЕР2015/079873) дозволяють провести пряме визначення абсолютних значень рівнів МНО-, переважно НІ А-рестриктованих пептидів на ракових та інших інфікованих тканинах. Стисло, загальне число клітин було розраховано з сумарного вмісту ДНК у зразку тканини, яку аналізують. Загальну кількість пептиду для ТОМАР у зразку тканини вимірювали методом наноРХ-МС/МС як співвідношення природного ТОМАР і відомої кількості версії ТОМАР із міченням ізотопом, так званим внутрішнім стандартом. Ефективність виділення ТОМАР була визначена методом введення стандартних добавок комплексів пептид-МНО всіх вибраних ТОМАР до тканинного лізату у найранішій можливій точці процедури виділення ТОМАР ії визначенням методом наноРх-МеС/МС, після чого відбувалося закінчення процедури виділення пептидів. Загальне число клітин і загальна кількість пептиду були розраховані з результатів трьох паралельних вимірювань на кожний зразок тканини. Ефективності виділення конкретних пептидів розраховували як середнє 10 дослідів введення стандартних добавок, кожну у трьох паралельних вимірюваннях (див.
Приклад 6 і Таблицю 12).
На додаток до надмірної презентації пептиду, була досліджена експресія ІРНК вихідного гена. Дані для ІРНК були отримані за методикою секвенування РНК (КМАзЗед) із нормальних тканин і ракових тканин (див. Приклад 2, Фігуру 3). Додатковим джерелом даних для нормальних тканин служила база даних експресії РНК, що є у вільному доступу, яка охоплює близько 3000 зразків нормальних тканин (Іопзааіє, 2013). Пептиди, отримані з білків, які кодуються ІРНК, що виявляє високі рівні експресії у раковій тканині, але дуже низькі або нульові рівні експресії у життєздатних нормальних тканинах, були включені як переважні у предмет цього винаходу.
Предметом цього винаходу є пептиди для лікування раку та інших пухлин, переважно ХЛЛ, які надмірно чи виключно презентують пептиди за цим винаходом. Ці пептиди, за даними мас- бо спектрометрії, презентуються природно молекулами НГА на зразках тканин первинного ХЛЛ людини.
Багато вихідних генів/білків (які також визначаються як «повнорозмірні білки» або «базові білки»), із яких отримані пептиди, як було показано, відзначаються високою надекспресією у ракових тканинах у порівнянні з нормальними тканинами - «нормальні тканини» у контексті даного винаходу означає або клітини здорової жирової тканини, надниркової залози, клітини крові, кровоносної судини, кісткового мозку, головного мозку, молочної залози, стравоходу, ока, жовчного міхура, серця, нирки, товстої кишки, печінки, легені, лімфатичного вузла, нерва, підшлункової залози, паращитоподібної залози, очеревини, гіпофіза, плеври, слинної залози, скелетного м'яза, шкіри, тонкої кишки, селезінки, шлунка, тимуса, щитоподібної залози, трахеї, сечоводу і сечового міхура або клітини інших нормальних тканин, що свідчить про високий ступінь зв'язку пухлин із вихідними генами (див. Приклад 2). Більш того, самі пептиди дуже надмірно презентуються на тканинах пухлини - «пухлинні тканини» у контексті даного винаходу означає зразок від пацієнта, що страждає на ХЛЛ, але не на нормальних тканинах (див.
Приклад 1).
Зв'язані з НА пептиди можуть розпізнаватися імунною системою, а саме Т-лімфоцитами. Т- клітини можуть руйнувати клітини, що презентують розпізнаний комплекс НіА/пептид, наприклад, клітини ХЛЛ, що презентують отримані пептиди.
Було показано, що пептиди за цим винаходом здатні стимулювати відповідь Т-клітин і (або) надмірно презентуються, і, таким чином, можуть використовуватися для отримання антитіл і (або) ТКР, таких як розчинні ТКР, за цим винаходом (див. Приклад 3, Приклад 4). Більш того, пептиди, якщо вони утворюють комплекси з відповідними молекулами МНС, також можуть використовуватися для продукції антитіл і (або) ТКР, особливо рТІКР за цим винаходом.
Відповідні способи добре відомі фахівцю у цій галузі, і їх описи можна знайти також у відповідній літературі. Отже, пептиди за цим винаходом можуть використовуватись для генерації імунної відповіді організму пацієнта, завдяки чому клітини пухлини можуть бути зруйновані. Імунна відповідь організму пацієнта може індукуватися прямим введенням пацієнту описаних пептидів або відповідних прекурсорних речовин (наприклад, подовжених пептидів, білків або нуклеїнових кислот, які кодують ці пептиди), ідеально в комбінації з агентом, що підвищує імунну реакцію (тобто ад'ювантом). Можна очікувати, що імунна відповідь, що виникає в результаті такої
Зо терапевтичної вакцинації, є високо специфічною по відношенню до клітин пухлини, оскільки цільові пептиди за цим винаходом не є присутніми на нормальних тканинах у достатній кількості копій, що попереджає ризик небажаних аутоїмунних реакцій проти нормальних клітин в організмі пацієнта.
Цей винахід також стосується Т-клітинних рецепторів (ТКР), що містять альфа- ланцюг і бета-ланцюг («альфа/бета ТКР»). Предметом цього винаходу також є пептиди за цим винаходом, здатні зв'язуватися з ТКР і антитілами, якщо вони презентуються молекулою МНС.
Цей опис стосується також нуклеїнових кислот, векторів і клітин-хазяїв для експресії ТКР і пептидів за цим описом і способів їх використання.
Термін «Т-клітинний рецептор» (скорочено ТКР) означає гетеродимерну молекулу, що містить альфа-поліпептидний ланцюг (альфа-ланцюг) і бета-поліпептидний ланцюг (бета- ланцюг), де гетеродимерний рецептор здатний зв'язуватися з пептидним антигеном, що презентується молекулою НГ А. Цей термін також охоплює так звані гамма/дельта ТКР.
В одному з втілень пропонується спосіб отримання ТКР, як описано у цьому документі, де згаданий спосіб включає культивування клітини-хазяїна, здатної експресувати ТКР за умов, прийнятних для сприяння експресії цих ТКР.
Цей винахід в іншому аспекті стосується способів за цим описом, де антиген навантажують на молекули МНС | або І класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген- презентуючої клітини або штучної антиген-презентуючої клітини шляхом контакту достатньої кількості антигену з антиген-презентуючою клітиною або антиген навантажують на тетрамери
МНЄе І або ІІ класу шляхом тетрамеризації мономерних комплексів антиген/мне І або ІІ класу.
Альфа- і бета-ланцюги альфа/бета ТКР і гамма- і дельта-ланцюги гамма/дельта ТКР взагалі вважаються як такі, кожний із яких має два «домени», а саме варіабельні і константні домени.
Варіабельний домен складається з послідовно розташованих варіабельного сегменту (М) і з'єднувального сегменту ()). Варіабельний домен може також включати лідерний сегмент (ГІ).
Бета- і дельта-ланцюги можуть також включати ЮО-сегмент. Альфа- і бета- константні домени можуть також містити С-кінцеві трансмембранні (ТМ) домени, які заякорюють альфа- і бета- ланцюги на клітинній мембрані.
Що стосується гамма/дельта ТКР, термін «гамма-варіабельний домен ТКР» у тому вигляді, в якому він використовується тут, означає зчеплення сегменту гамма М ТКР (ТКОМ) без лідерного бо сегменту (І) і сегменту ТКР гамма У (ТКО3)), а термін «константний домен ТКР гамма» означає позаклітинний сегмент ТКОС або С-кінцеву усічену послідовність ТКОС. Подібним чином, термін «дельта-варіабельний домен ТКР» означає зчеплення сегменту ТКР дельта М (ТКОМ) без лідерного сегменту (І) і сегменту ТКР дельта Б/) (ТКОО/ТКОУ)), а термін «константний домен ТКР дельта» означає позаклітинний сегмент ТКОС або С-кінцеву усічену послідовність
ТВОб.
ТКР за цим описом переважно з'єднуються з комплексом пептид-молекула НГіА зі спорідненістю (КО) приблизно 100 мкМ або менше, приблизно 50 мкМ або менше, приблизно 25 МКМ або менше, або приблизно 10 мкМ або менше. Більш переважними є високоафінні ТКР, які мають спорідненості приблизно 1 мкМ або менше, приблизно 100 нМ або менше, приблизно 50 НМ або менше, приблизно 25 НМ або менше. Приклади, що не мають обмежувального характеру, переважних діапазонів спорідненості для ТКР за цим винаходом включають від приблизно 1 нМ до приблизно 10 нМ, від приблизно 10 нМ до приблизно 20 нМ, від приблизно 20 НМ до приблизно 30 нМ, від приблизно 30 нМ до приблизно 40 нМ, від приблизно 40 нМ до приблизно 50 нМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 60 нМ, від приблизно 60 нМ до приблизно 70 нМ, від приблизно 70 нМ до приблизно 80 нМ, від приблизно 80 нМ до приблизно 90 нМ, від приблизно 90 нМ до приблизно 100 нМ.
В тому виді, в якому він використовується тут, у зв'язку з ТКР за цим винаходом, «специфічне зв'язування» та його граматичні варіанти використовуються для позначення ТКР, що має спорідненість (КО) для комплексу пептид-молекула НІ А 100 мкМ або менше.
Альфа/бета гетеродимерні ТКР за цим винаходом можуть мати введені дисульфідні зв'язки між їх константними доменами. Переважними ТКР цього типу включають такі, що мають послідовність константних доменів ТКАС і послідовність константних доменів ТЕВС1 або
ТКВС2, за винятком того, що Тпг 48 послідовності ТЕАС і бег 57 послідовності ТКВСІ1 або
ТКВС2 заміщені залишками цистеїну, причому згадані цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок між послідовністю константних доменів ТКАС і послідовністю константних доменів
ТАВСІ1 або ТКВС2 Т-клітинного рецептору.
З введеним згаданим вище міжланцюговим зв'язком або без нього, альфа/бета гетеродимерні ТКР за цим винаходом можуть мати послідовність константних доменів ТКАС і послідовність константних доменів ТЕВСІ1 або ТЕВС2, а послідовність константних доменів
Зо ТЕАС і послідовність константних доменів ТКВСТ або ТКВС2 Т-клітинного рецептору можуть бути з'єднані природним дисульфідним зв'язком між Субз4 екзону 2 у ТКАС ії Суз2 екзону 2 у
ТЕВС1 або ТКВС2.
ТКР за цим описом можуть включати детектовану мітку, вибрану з групи, що складається з радіонукліду, флуорофору і біотину. ТКР за цим описом можуть бути кон'юговані з терапевтично активною речовиною, такою як радіонуклід, хіміотерапевтичний препарат або токсин.
У одному втіленні ТКР за цим винаходом, що має принаймні одну мутацію в альфа-ланцюгу і (або) має принаймні одну мутацію у бета-ланцюгу, має модифіковане глікозилювання у порівнянні з немутованим ТКР.
У одному втіленні ТКР, що містить принаймні одну мутацію в альфа-ланцюгу і (або) у бета- ланцюгу ТКР, має спорідненість до і (або) напівперіод зв'язування з комплексом пептид- молекула НГА, які принаймні вдвічі вище таких для ТКР, що містить немутований альфа-ланцюг
ТКР ї (або) немутований бета-ланцюг ТКР. Підсилення афінності пухлино-специфічних ТКР та її застосування грунтується на існуванні «вікна» для оптимальної афінності ТКР. Існування такого вікна базується на спостереженнях, що ТКР, специфічні до патогенів, рестриктованих за молекулами НІ А-А2, мають значення КО, які, як правило, приблизно у 10 разів нижчі, якщо їх порівняти з ТКР, специфічних до «своїх» власних антигенів (аутоантигенів), рестриктованих за молекулами НІГА-А2. Зараз відомо, що хоча пухлинні антигени мають потенціал ставати імуногенними, оскільки пухлини виникають із власних клітин індивідуума, тільки мутовані білки або білки зі зміненою трансляційною модифікацією будуть сприйматися імунною системою як чужорідні. Антигени, які мають підвищену активність або надмірно експресуються (так звані аутоантигени), зовсім необов'язково викликають функціональну імунну відповідь на пухлину. Т- клітини, що експресують ТКР, які є високоактивними по відношенню до цих антигенів, будуть піддаватися негативному відбору у тимусі у процесі, відомому як центральна толерантність, що означає, що залишаться лише Т-клітини з низькоафінними ТКР до аутоантигенів. Таким чином, афінність ТКР або їх варіантів за цим описом до пептиду можна підвищити методами, добре відомими фахівцям у цій галузі.
Цей винахід також стосується способу ідентифікації і виділення ТКР відповідно до цього опису, причому згаданий спосіб включає інкубування МКПК, отриманих у НІ А-А"02-негативних здорових донорів, із А2/пептидними мономерами, інкубування МКПК з тетрамер-фікоеритрином бо (ФЕ) і виділення високоавідних Т-клітин методом флуоресцентного сортування клітин на аналізаторі ЕАСЗ Саїїриг.
Цей винахід також стосується способу ідентифікації і виділення ТКР відповідно до цього опису, де згаданий спосіб включає отримання трансгенної миші з цілими локусами генів людини
ТКРОбВ (1,1 ї 0,7 п. н.), Т-клітини якої експресують широкий спектр ТКР людини, які компенсують дефіцит ТКР у миші, імунізацію миші пептидом, інкубування МКПК, отриманих від трансгенної миші, з тетрамер-фікоеритрином (ФЕ) і виділення високоавідних Т-клітин методом флуоресцентного сортування клітин на аналізаторі ЕАС5 Саїїриг.
Згідно з одним аспектом винаходу, для отримання Т-клітин, що експресують ТКР за цим винаходом, нуклеїнові кислоти, які кодують ТКР-альфа і (або) ТКР-бета ланцюги за цим винаходом, клонують у вектори експресії, такі як гамма-ретровірус або лентівірус. Рекомбінантні віруси отримують, а потім перевіряють на функціональність, таку як специфічність до антигену і функціональну авідність. Аліквоту кінцевого продукту після цього використовують для трансдукції цільової популяції Т-клітин (як правило очищених від МКПК пацієнта), яку культивують перед введенням пацієнту.
У іншому аспекті, з метою отримання Т-клітин, які експресують ТКР за цим описом, синтезують РНК ТКР за методиками, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, використанням систем транскрипції іп міго. Синтезовані іп міго РНК ТКР потім вводять у первинні СОв8- Т- клітини, отримані від здорових донорів електропорацією для повторної експресії альфа- і (або) бета-ланцюгів ТКР, специфічних для пухлини.
З метою підвищення рівня експресії нуклеїнові кислоти, що кодують ТКР за цим описом, можна функційно зв'язати із сильними промоторами, такими як довгі кінцеві повтори ретровірусу (ТК), цитомегаловірусу (СММ), вірусу стовбурових клітин мишей (М5СМ) ОЗ, фосфогліцераткіназа (РОК), бета-актин, убіквітин і композиційний промотор мавпячого вірусу 40 (5М40)/2043, фактор елонгації (ЕБ)-їа і промотор вірусу некрозу селезінки (ЗЕЕМ). У переважному втілення промотор є гетерологічним по відношенню до нуклеїнової кислоти, що експресується.
На додаток до сильних промоторів, касети експресії ТКР за цим описом можуть містити додаткові елементи, які можуть посилити трансгенну експресію, включаючи центральний поліпуриновий тракт (СРРТ), який сприяє ядерній транслокації лентівірусних конструкцій
Зо (БоПеплі і співавт., 2000), посттранскрипційний регуляторний елемент вірусу гепатиту Вучук американських байбаків (мРЕКЕ), який підвищує рівень трансгенної експресії шляхом підвищення стабільності РНК (2иПегеу і співавт., 1999).
Альфа- і бета-ланцюги ТКР за цим винаходом можуть кодуватися нуклеїновими кислотами, розташованими у різних векторах, або кодуватися полінуклеотидами, розташованими у одному і тому ж векторі.
Щоб досягти високого рівня поверхневої експресії ТКР, необхідно, щоб як альфа-, так і бета- ланцюги ТКР введеного ТКР транскрибувалися на високому рівні. Щоб досягти цього, альфа- і бета-ланцюги ТКР за цим описом можуть бути клоновані у біцистронні конструкції в одному векторі, які, як було показано, здатні подолати цю перешкоду. Використання ділянки внутрішньої посадки рибосоми вірусу (ІКЕ5) між альфа- і бета-ланцюгами ТКР приводить до координованої експресії обох ланцюгів, оскільки альфа- і бета-ланцюги ТКР утворюються з одного транскрипту, який розділяється на два білки в ході трансляції, забезпечуючи утворення рівних молярних співвідношень альфа- і бета-ланцюгів ТКР. (Зсптій і співавт., 2009).
Нуклеїнові кислоти, що кодують ТКР за цим описом, можуть бути кодон-оптимізовані для підвищення рівня експресії клітиною-хазяїном. Надмірність генетичного коду дозволяє деяким кислотам кодуватися більш ніж одним кодоном, але певні кодони є менш «оптимальними» ніж інші внаслідок відносній наявності відповідних тРНК, а також інших факторів (Зиаїв55оп і співавт., 2004). Як було показано, модифікація послідовностей генів альфа- і бета-ланцюгів ТКР таким чином, щоб кожна амінокислота кодувалася оптимальним кодоном для експресії генів у ссавців, а також видалення мотивів нестабільності ІРНК або прихованих сайтів сплайсингу, значно підвищує експресію генів альфа- і бета-ланцюгів ТКР (ЗспокКеп і співавт., 2006).
Крім того, порушення парування між введеними і ендогенними ланцюгами ТКР може привести до набуття таких видів специфічності, які становлять значний ризик для аутоімунності.
Наприклад, утворення суміші димерів ТКР може знизити кількість молекул СОЗ, що доступні для утворення належнім чином спарених комплексів ТКР, і у такий спосіб може значно зменшити функціональну авідність клітин, які експресують введені ТКР (Кивагї! і співавт., 2007).
Для зменшення порушень парування, С-кінцевий домен ланцюгів введеного ТКР за цим описом можна модифікувати, щоб підвищити взаємодію між ланцюгами, у той же час зменшити здатність введених ланцюгів утворювати пари з ендогенним ТКР. Ці підходи можуть включати бо заміну С-кінцевих доменів альфа- і бета-ланцюгів ТКР їх мишачими двійниками (наближений до мишачого С-кінцевий домен), утворюючи другий міжланцюговий дисульфідний зв'язок у С- кінцевому домені шляхом введення другого залишку цистеїну як у альфа-ланцюги ТКР, такі у бета-ланцюги ТКР введеного ТКР (цистеїнова модифікація); перестановка взаємодіючих залишків С-кінцевих доменів альфа- і бета-ланцюгів ТКР («виступ-у-западину»); і злиття варіабельних доменів альфа- і бета-ланцюгів ТКР безпосередньо з СОЗСЄ (злиття СОЗО). (5сптій і співавт., 2009).
У одному втіленні клітина-хазяїн отримана методами генної інженерії з метою експресувати
ТКР за цим описом. У переважних втіленнях клітина-хазяїн є Т-клітиною людини або попередником Т-клітини людини. У деяких втіленнях Т-клітина або попередник Т-клітини отримані від хворого на рак пацієнта. У інших втіленнях Т-клітина або попередник Т-клітини отримані від здорового донора. Клітини-хазяї за цим описом можуть бути алогенними або аутологічними по відношенню до пацієнта, якого належить лікувати. У одному втіленні клітиною- хазяїном є гамма/дельта Т-клітина, трансформована для експресії альфа/бета ТКР. «Фармацевтична композиція» є переважно композицією, прийнятною для введення людині у медичній установі. Переважно, фармацевтична композиція є стерильною і виробляється відповідно до вимог належної виробничої практики (ЗМР).
Фармацевтичні композиції включають пептиди або у вільній формі, або у формі фармацевтично прийнятної солі (див. також вище). Термін «фармацевтично прийнятна сіль» в контексті цього винаходу означає похідну сполуку розкритих пептидів, в якій пептид модифікується шляхом створення кислої чи основної солі речовини. Наприклад, кислі солі готуються з вільної основи (як правило, де нейтральна форма лікарського засобу має нейтральну -МН2-групу), за участю реакції з прийнятною кислотою. Прийнятні кислоти для приготування кислих солей включають органічні кислоти, такі, наприклад, як оцтова кислота, пропіонова кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, щавлева кислота, яблучна кислота, малонова кислота, бурштинова кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, корична кислота, мигдальна кислота, метансульфокислота, етансульфокислота, п-толуолсульфокислота, саліцилова кислота і т. ін., а також неорганічні кислоти, наприклад, соляна кислота, бромистоводнева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота і т. ін. | навпаки, приготування основних солей
Зо кислотних компонентів, які можуть бути присутніми на пептиді, здійснюється з використанням фармацевтично прийнятної основи, такої як гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид амонію, гідроксид кальцію, триметиламін і тому подібні.
В особливо переважному втіленні фармацевтичні композиції містять пептиди у вигляді солей оцтової кислоти (ацетати), трифторацетатів або солей соляної кислоти (хлориди).
Переважно, лікарський засіб за цим винаходом є імунотерапевтичним засобом, таким як вакцина. Вона може вводитися безпосередньо пацієнту, в уражений орган або системно в/ш, в/м, п/ш, в/ч і в/в, або вноситися ех мімо у клітини, отримані від пацієнта, чи у клітинну лінію людини, котрі згодом вводяться пацієнту, або використовуватись іп мйго для селекції субпопуляції з імунних клітин, які отримані від пацієнта і які потім знов вводяться йому. Якщо нуклеїнова кислота вводиться у клітини іп міго, тоді може бути корисним, щоби клітини були трансфекованими, щоби спільно експресувати імуностимулюючі цитокіни, наприклад, інтерлейкін-2. Пептид може бути, по суті, чистим, або поєднаним з імуностимулюючим ад'ювантом (див. нижче), чи використовуватись в комбінації з імуностимулюючими цитокінами, або вводитися з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептиди також можуть бути кон'юговані з належним носієм, таким як гемоціанін фісурели (КІН) або маннан (див. патентну заявку УМО 95/18145 та роботу (І опаєпескКег евї аї., 1993)). Пептид також може бути міченим або бути злитим білком чи гібридною молекулою. Очікується, що пептиди, послідовності яких наведені у цьому винаході, стимулюють СО4 або СО8 Т-клітини. Проте стимуляція СО8Т-клітин є більш ефективною за умови сприяння з боку СО4 Т-хелперних клітин.
Таким чином, для епітопів МНС І класу, які ссимулюють СО8 Т-клітини, партнер по злиттю або сегменти гібридної молекули принагідно постачають епітопи, які ссимулюють СО4-позитивні Т- клітини. СО4- ії СО8-стимулюючі епітопи добре відомі фахівцям в цій галузі і включають епітопи, ідентифіковані в цьому винаході.
Згідно з одним аспектом винаходу, вакцина містить принаймні один пептид, який має амінокислотну послідовність від ЗЕО ІЮ МО:1 до 5ЗЕО ІЮ МО:385, і принаймні один додатковий пептид, переважно, від двох до 50, більш переважно, від двох до 25, ще більш переважно, від двох до 20, і найбільш переважно, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять або вісімнадцять пептидів. Пептид(и) може (можуть) бути виділений (виділені) з одного або більшої бо кількості специфічних ТАА і може (можуть) зв'язатися з молекулами МН І класу.
Згідно з ще одним аспектом винаходу пропонується нуклеїнова кислота (наприклад, полінуклеотид), що кодує пептид чи його варіант за винаходом. Полінуклеотид може бути, наприклад, ДНК, кКДНК, ПНК, СНК, РНК чи їх комбінацією, як одноланцюговою, так і (або) дволанцюговою, або природними чи стабілізованими формами полінуклеотидів, такими як, наприклад, полінуклеотиди з фосфоротіоатним скелетом; він може містити або не містити інтрони, за умови, що він кодує пептид. Звичайно, що тільки пептиди, що містять природно існуючі амінокислотні залишки, з'єднані природно існуючими пептидними зв'язками, можуть бути кодовані полінуклеотидом. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується вектор експресії, здатний експресувати поліпептид відповідно до винаходу.
Було розроблено багато способів зв'язування полінуклеотидів, особливо ДНК, з векторами, наприклад, за допомогою комплементарних липких кінців. Наприклад, можуть бути додані комплементарні гомополімерні хвости до сегменту ДНК, щоб бути вставленими у вектор ДНК.
Цей вектор і сегмент ДНК потім з'єднують водневим зв'язком між комплементарними гомополімерними хвостами з утворенням молекул рекомбінантної ДНК.
Синтетичні лінкери, що містять один або більше сайтів рестрикції, забезпечують альтернативний спосіб об'єднання фрагментів ДНК у вектори. Синтетичні лінкери, що містять різноманітні сайти впізнавання рестрикційних ендонуклеаз, комерційно доступні у декількох джерелах, включаючи компанію Іпіегпайопаї! Віотесппо!іодієз Іпс., Нью Хейвен, Конектикут, США.
У бажаному методі модифікації ДНК, що кодує поліпептид за винаходом, використовується полімеразна ланцюгова реакція, як це розкрито у роботі ЗаїКі КК і співавт. (ЗаїКі єї аї!., 1988).
Цей метод може використовуватися для введення цієї ДНК у відповідний вектор, наприклад, шляхом створення відповідних сайтів рестрикції, або його можна застосовувати для модифікації
ДНК у інший прийнятний спосіб, відомий фахівцеві у цій галузі. Якщо використовуються вірусні вектори, переважними є вектори на основі поксвірусу або аденовірусу.
Ця ДНК (або, у випадку ретровірусного вектора, РНК) може потім експресуватися у відповідному організмі-хазяїні, утворюючи поліпептид, що містить пептид або чи його варіант за винаходом. Таким чином, ДНК, яка кодує пептид чи його варіант за винаходом, може використовуватися відповідно до відомих методик, належним чином модифікованих виходячи з ідей, розкритих у цьому описі, для конструювання вектора експресії, який після цього
Зо використовується для трансформації відповідних клітин-хазяїв таким чином, щоб вони набули здатність експресувати і виробляти пептиди за винаходом. Ці методики включають такі, що розкриті, наприклад, у патентах США 4 440 859, 4530 901, 4582 800, 4 677 063, 4 678 751, 4 704 362, 4 710 463, 4 757 006,4 76607514 810 648.
Ця ДНК (або, у випадку ретровірусного вектора, РНК), яка кодує поліпептид, що є предметом цього винаходу, може бути з'єднана з широким спектром інших послідовностей ДНК для введення у відповідну клітину-хазяїна. Ця супутня ДНК буде залежати від природи хазяїна, способу представлення ДНК хазяїну, і від того, необхідне утримання в епісомальній чи інтегрованій формі.
Зазвичай ДНК вставляється у вектор експресії, такий як плазміда, у належній орієнтації і коректній рамці зчитування для експресії. Якщо необхідно, ДНК може бути зв'язаною з відповідними нуклеотидними послідовностями, що забезпечують координацію транскрипції і трансляції, що розпізнаються бажаним хазяїном, хоча такі контрольні елементи зазвичай містяться у векторі експресії. Вектор згодом вводиться хазяїну із використанням стандартних методик. Загалом, не всі хазяї трансформуються вектором. Отже, необхідно виділити трансформовані клітини-хазяї. Одна з методик виділення включає введення до складу вектора експресії такої послідовності ДНК із будь-якими необхідними контрольними елементами, яка кодує вибрану ознаку у трансформованій клітині, таку як резистентність до антибіотиків.
Як альтернатива, ген для такої вибраної ознаки може бути вбудованим в інший вектор, який використовується для спільної трансформації бажаної клітини-хазяїна.
Клітини-хазяї, які були трансформовані рекомбінантною РНК за винаходом, потім культивують протягом достатнього періоду часу у відповідних умовах, які відомі фахівцеві в цій галузі з точки зору ідей, розкритих тут, з метою дати можливість експресувати поліпептид, який потім може бути виділений.
Фахівцям відомі багато експресійних систем, включаючи бактерії (наприклад, Е. сої ії Васійи5 5,иБійй5), дріжджі (наприклад, Засспаготусеб5 сегемізіає), міцеліальні гриби (наприклад,
АзрегодіНи5 5рес.), клітини рослин, тварин і комах. Переважно, система може бути клітинами ссавців, таких як клітини СНО, які комерційно доступні від Американської колекції типових культур АТСС.
Типова векторна плазміда клітин ссавців для конститутивної експресії включає вірус СММУ бо або опромотор ЗМ40 з відповідним поліаденільним хвостом роїу(А)-їай і маркером резистентності, таким є неоміцин. Одним із прикладів є рем, доступний від компанії Ріагіттасіа,
Піскатеуей, Нью-Джерсі, США. Прикладом вектора індуцибельної експресії у ссавців є рРМ5О, також доступний від компанії Рпагтасіа. Корисними є плазмідні вектори дріжджів рК5403-406 і рАб413-416, які доступні від компанії Зігаїадепе Сіопіпд Зубіетв5, Ла Джола, Каліфорнія 92037,
США. Плазміди рК5403, рК5404, рКк5405 і рКк5406 є дріжджовими інтегруючими плазмідами (МІр) і включають дріжджові селективні маркери НІ5ЗЗ, ТКРІ, ГЕЦ2 ї ОКАЗ. Плазміди рК5413- 416 є дріжджовими плазмідами з центромерами (Уср). Вектори на базі промотору СММ (наприклад, від компанії бідта-АїЇдгісй) забезпечують тимчасову або стабільну експресію, цитоплазматичну експресію або секрецію і М-термінальне або С-термінальне мічення для різних комбінацій РГАС, ЗхХРГ АС, с-тус або МАТ. Ці злиті білки можна використовувати для виявлення, очищення і аналізу рекомбінантного білка. Злиття з використанням двох міток забезпечує гнучкість під час виявлення.
Сильна регуляторна область промотора цитомегаловірусу (СММ) людини підвищує рівні конститутивної експресії білка у клітинах лінії СО5 до таких високих значень, як 1 мг/л. У разі не таких активних ліній клітин рівні білка зазвичай становлять «0,1 мл/л. Присутність ділянки початку реплікації у фрагменті 5440 приводить до високих рівнів реплікації ДНК у пермісивних клітинах СО5. Вектори СМУ, наприклад, можуть містити РМВ1 (похідне рВК322) ділянку початку реплікації у клітинах бактерій, ген бета-лактамази для вибору резистентності бактерій до ампіциліну, роїу(А) гормону росту людини і ділянку початку реплікації Я. Вектори, що містять лідерну послідовність препротрипсину (РРТ), можуть направляти секрецію злитих білків РІГ АС в культуральному середовищі на очищення антитіл проти ЕГАсС, смол і планшетів. Інші вектори і експресійні системи також добре відомі у цій галузі для використанні у багатьох клітинах- хазяїнах.
В іншому втіленні два або більше пептидів або варіантів пептидів за винаходом кодуються і, отже, експресуються послідовно (подібно до конструкцій «вузли на мотузці»). При цьому пептиди або варіанти пептидів можуть бути зв'язані або злиті одне з одним фрагментами лінкерних амінокислотних послідовностей,такими, наприклад, які ГІ І, або можуть зв'язатися без будь-яких додаткових пептидів між ними. Ці конструкції можуть також застосовуватися для терапії раку і можуть індукувати імунну відповідь за участі як молекул МНС І класу, так і МНе Іі
Зо класу
Цей винахід також стосується клітини-хазяїна, трансформованої полінуклеотидною векторною конструкцією за винаходом. Клітина-хазяїн може бути або прокаріотичною, або еукаріотичною. Бактеріальні клітини можуть бути переважно прокаріотичними клітинами- хазяїнами у деяких обставинах, а зазвичай це штам Е. соїї, такий як, наприклад, штам ОН5 Е. соїї, доступний від компанії Ве(пезаа Кезеагесй І абогацогіез Іпс., Бетесда, Меріленд, США, і КК, доступний від Американської колекції типових культур АТСС, Роквіл, Меріленд, США (Номер
АТСС 31343). Переважні еукаріотичні клітини-хазяї включають клітини дріжджів, комах і ссавців, переважно клітини хребетних, такі як лінії фібробластних клітин і клітин товстої кишки від мишей, пацюків, мавп або людини. Дріжджові клітини-хазяї включають УРІН499, УРН5БОО і
УРН5БОЇ, які зазвичай доступні від компанії Зігаїадепе Сіопіпд Зузіет5, Ла Джола, 92037,
Каліфорнія, США. Переважні клітини-хазяї ссавців включають клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), доступні як штам АТСС ССІ161, клітини ембріонів швейцарської миші штаму
МІН/ЗТЗ, доступні з колекції АТСС СК. 1658, клітини СО5-1 з нирок мавп, доступні з колекції
АТСС СНІ 1650 і клітини 293 нирок ембріонів людини. Переважними клітинами комах є клітини 59, що можуть бути трансфековані векторами експресії бациловірусу. Огляд публікацій щодо вибору відповідних клітин-хазяїв для експресії можна знайти, наприклад, у підручнику: Рацшіїпа
Ваїбазх апа Агодеїїа І огепсе "Меїпод» іп МоїІесшіаг Віоюду Кесотбріпапі Сепе Ехргезвзіоп, Кеміем/5 апа Ргоїосої5," Ра Опе, бесопа Еадійоп, ІБВМ 978-1-58829-262-9, і інших літературних джерелах, відомих фахівцю у цій галузі.
Трансформація відповідних клітин-хазяїв за допомогою ДНК-конструкції за цим винаходом здійснюється добре відомими методами, вибір яких, як правило, залежить від типу вектора, що використовується. Щодо трансформації прокаріотичних клітин-хазяїв див., наприклад, Сопеп і співавт. (СоНеп еї аї., 1972) і (Стеєп апа ЗатргоокК, 2012). Трансформація дріжджових клітин описана в роботі Зпегтанп і співавт. (Зпептап сеї аі!., 1986) . Метод Ведоз (Ведов, 1978) також є корисним. Щодо клітин хребетних, реагенти, придатні для трансфекції таких клітин, наприклад, фосфат кальцію і ДЕАЕ-декстран або ліпосомні препарати, доступні від компанії бігаїадепе
СіІопіпд Зузіетв, або І Те Тесппоїіодієз Іпс., Гейтерсберг, Меріленд 20877, США. Електропорація також придатна для трансформації і (або) трансфекції клітин і відома в цій галузі як метод трансформації клітин дріжджів, клітин бактерій, клітин комах і клітин хребетних. бо Успішно трансформовані клітини, наприклад, клітини, що містять ДНК-конструкцію за цим винаходом, можуть бути ідентифіковані добре відомими методами, такими як ПлР.
Альтернативно, присутність білка у супернатанті можна виявити за допомогою антитіл.
Зрозуміло, що певні клітини-хазяї за винаходом здатні синтезувати пептиди за винаходом, наприклад, клітини бактерій, дріжджів і комах. Проте в певних терапевтичних методах можуть використовуватися інші клітини-хазяї. Наприклад, антиген-презентуючі клітини, такі як дендритні клітини, можуть принагідно використовуватися, щоби експресувати пептиди за винаходом, які можуть бути навантажені на відповідні молекули МНС. Отже, цей винахід також стосується клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту або вектор експресії за цим винаходом.
У переважному втіленні клітина-хазяїн є антиген-презентуючою клітиною, зокрема дендритною клітиною або антиген-презентуючою клітиною. Управління з контролю за харчовими продуктами та лікарськими засобами (ЕБА) США 29 квітня 2010 року схвалило застосування АПК, навантажених рекомбінантним злитим білком, що містить простатичну кислу фосфатазу (РАР), для лікування метастатичного НКРС (гормон-рефрактерного раку передміхурової залози), що протікає безсимптомно або з мінімально вираженими симптомами (сіпулейцел-Т) (Віпі еї аї., 2006; Зтаї! єї аї., 2006).
Згідно з ще одним аспектом винаходу пропонується спосіб отримання пептиду або його варіанту, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна і виділення пептиду з клітини- хазяїна або її культурального середовища.
В іншому втіленні пептид, нуклеїнова кислота або вектор експресії за винаходом застосовуються у медицині. Наприклад, пептид або його варіант може бути приготований для внутрішньовенного (в/в) введення, підшкірного (п/ш) введення, внутрішньошкірного (в/ш) введення, внутрішньочеревного (в/ч) введення, внутрішньом'язового (в/м) введення. Переважні способи введення пептиду - це п/ш, в/ш, в/ч, в/м і в/в. Переважними способами введення ДНК є в/ш, в/м, п/ш, в /ч і в/в. Можуть вводитись дози від 50 мкг до 1,5 мг, переважно від 125 мкг до 500 мкг пептиду або ДНК залежно від відповідного пептиду чи ДНК. Дози в цьому діапазоні успішно використовувались в попередніх дослідженнях (УМаїег еї аї., 2012).
Полінуклеотид, що застосовується для активної вакцинації, може бути по суті чистим або включеним в належний вектор чи в систему доставки. Нуклеїнова кислота може бути, наприклад, ДНК, кКДНК, ПНК, РНК чи їхньою комбінацією. Методи конструювання і введення
Зо такої нуклеїнової кислоти добре відомі фахівцям в цій галузі. Їх огляд наведений, наприклад, у роботі Тешеї! і співавт. (Тешєї єї а), 2005). Полінуклеотидні вакцини легко приготувати, але механізм дії цих векторів у виникненні імунної відповіді повністю не з'ясований. Прийнятні векторні системи і системи доставки включають вірусну ДНК і (або) РНК, такі як системи на базі аденовірусу, вірусу коров'ячої віспи, ретровірусу, вірусу герпесу, аденоасоційованого вірусу або гібридів, що містять елементи більш ніж одного вірусу. Невірусні системи доставки включають катіонні ліпіди та катіонні полімери, добре відомі в галузі засобів доставки ДНК. Також може використовуватись фізична доставка, наприклад, за допомогою «генної гармати». Пептид або пептиди, що кодуються нуклеїновою кислотою, може (можуть) бути злитим білком, наприклад, з епітопом, що стимулює Т-клітини щодо відповідних протилежних СОК, як відзначається вище.
Лікарський засіб за винаходом може також включати один або більше ад'ювантів. Ад'юванти є речовинами, які у неспецифічний спосіб підвищують або підсилюють імунну відповідь (наприклад, імунну відповідь на антиген, яку опосередкують СОв-позитивні Т-клітини і Т- хелпери (ТН), і, отже, можуть вважатися корисними для використання у лікарському засобі за винаходом. Відповідні адюванти включають, але не обмежуються ними, 1018 І55, солі алюмінію, АМРІ ІМАХФ, А5ЗІ15, ВСО, СР-870,893, СроО7909, СуаА, азі ІМ, флагелін чи ліганди
ТІК5, які походять з флагеліну, ліганд ЕІТ3, ЗМ-С5Е, ІСЗО, ІСЗ1, іміквімод (АГОАКАФ), резиквімод, ІтигРасі ІМР321, інтерлейкіни, такі як ІЛ-2, ІЛ-13, ІЛ-21, інтерферон-альфа чи -бета, або їхні пегільовані похідні, І5 Раїсі, ІЗ5, ІЗСОМАТЕЇХ, імуностимулюючі комплекси ІЗСОМ,
Уиміттипеф, ГіромМас, МАГР2, МЕ59, монофосфориловий ліпід А, монтанід ІМ5 1312, монтанід
ІЗА 206, монтанід ІЗА 5О0М, монтанід ІЗА-51, емульсії «вода у маслі» та «масло у воді», ОК-432,
ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОМТАК, О5рА, векторну систему Рертеїб, мікрочастинки на основі полілактиду когліколіду ІРІС| та декстрану, талактоферин, КІ 172, віросоми та інші вірусоподібні частинки, УЕ-17О0, МЕСЕ ігар, К848, бета-глюкан, Ратз3Сув, стимулон 0521 Адпиіїа, який виділяється з сапоніну, мікобактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також інші патентовані ад'юванти, наприклад, Оейх компанії Кібі, ОиіїЇ чи зЗирего5. Переважними є такі ад'юванти, як ад'ювант Фрейнда або ГМ-КОФ. Декілька імунологічних ад'ювантів (наприклад, МЕ59), специфічних до дендритних клітин, та способи їх приготування були описані раніше (АїЇЇїзоп апа Киттвеї!, 1995). Також можуть застосовуватися цитокіни. Окремі цитокіни були прямо співвіднесені з впливом на міграцію дендритних клітин до 60 лімфоїдних тканин (наприклад, ТМЕ-), прискорюючи дозрівання дендритних клітин до 5О0 ефективних антиген-презентуючих клітин для Т-лімфоцитів (наприклад, ГМ-КСФ, ІЛ-1 та ІЛ-4) (Патент США 5 849 589, конкретно включений в цей документ шляхом посилання в усій повноті) та діючі як імуноад'юванти (наприклад, ІЛ-12, ІЛ-15, ІЛ-23, ІЛ-7, ІФН-альфа, ІФН-бета) (Сабпомісн еї а!., 1996).
Також доповідалося про те, що імуностимулюючі Сро-олігонуклеотиди посилюють ефект ад'ювантів у складі вакцин. Якщо не вдаватися у подробиці теорії, Сро-олігонуклеотиди діють шляхом активації природної (не здобутої) імунної системи за допомогою ТоїІ-подібних рецепторів (ТІК), переважно ТІКУ. Активація ТІКУ, ініційована Сро, посилює антиген- специфічні гуморальні та клітинні реакції на широкий спектр антигенів, включаючи пептидні чи білкові антигени, живі або знищені віруси, вакцини на основі дендритних клітин, аутологічні клітинні вакцини та полісахаридні кон'юЮгати як в профілактичних, так і в терапевтичних вакцинах. Важливішим є те, що посилюється визрівання та диференціація дендритних клітин, що в результаті збільшує активацію ТНІ-клітин та інтенсивну генерацію цитотоксичних Т- лімфоцитів (ЦТЛ) навіть за відсутності підтримки з боку СО4 Т-клітин. Активація ТНІ, індукована стимуляцією ТІ КУ, зберігається навіть у присутності вакцинних ад'ювантів, таких як галун чи неповний ад'ювант Фрейнда (ІРА), котрі зазвичай сприяють активації ТН2. СрОо-олігонуклеотиди демонструють навіть більшу ад'ювантну активність, коли переводяться в лікарську форму або вводяться разом з іншими ад'ювантами чи в таких формах, як мікрочастинки, наночастинки, ліпідні емульсії або подібні композиції, особливо необхідні для індукування сильної відповіді, коли антиген відносно слабкий. Вони також прискорюють імунну відповідь та дозволяють зменшити дози антигену приблизно на два порядки в порівнянні з відповідями антитіл на вакцину в повній дозі без Сро, як спостерігалося в деяких експериментах (Кгієд, 2006). У патенті США 6406705 В1 описується комбіноване застосування Сро-олігонуклеотидів, ад'ювантів, що не містять нуклеїнові кислоти, та антигену для індукування антиген-специфічної імунної відповіді. Сро ТІ КУ-антагоністом є азіІМ (імуномодулятор із структурою типу дволанцюжкове стебло-петля) компанії Моіодеп (Берлін, Німеччина), котрий є переважним компонентом фармацевтичної композиції за цим винаходом. Також можуть використовуватись інші ТІ К-зв'язувальні молекули, наприклад, ТІ Р. 7, ТІ К 8 і (або) ТІ К 9, що зв'язуються з РНК.
Інші приклади прийнятних ад'ювантів включають, без обмежень, хімічно модифіковані Сро (наприклад, Срк, Ідега), аналоги длРНК, такі як полі(І:С) та їхні похідні (наприклад, АтріїбЗепФф),
НійопоїФ, полі-(ІСІ С), полі(ІС-К), полі(:С12)), бактеріальні ДНК або РНК, відмінні від Сро, а також невеликі імунологічно активні молекули та антитіла, такі як циклофосфамід, сунітиніб, бевацизумаб, целебрекс, МСХ-4016, сілденафіл, тадалафіл, варденафіл, сорафеніб, темозоломід, темзиролімус, ХІ -999, СР-547632, пазопаніб, МЕСЕ Тгар, 202171, А2О2171, анти-
СТІ А4, інші антитіла, націлені на ключові структури імунної системи (наприклад, анти-С040-, анти-ТоЕбета-, анти-ТМЕальфа-рецептори) та 5058175, які можуть діяти терапевтично і (або) як ад'юванти. Кількості та концентрації ад'ювантів та добавок, прийнятних в контексті цього винаходу, можуть бути легко визначені досвідченим фахівцем без зайвого експериментування.
Переважними ад'ювантами є анти-СО40-антитіла, іміквімод, резиквімод, «М-С5Е, циклофосфамід, сунітиніб, бевацизумаб, інтерферон-альфа, Сро олігонуклеотиди та їх похідні, полі-(І:С) та її похідні, РНК, сілденафіл і композиції з твердих мікрочастинок з РІ С або віросоми.
В переважному втіленні фармацевтичної композиції за винаходом ад'ювант вибирається з групи, що складається з колонієстимулюючих факторів, таких як Фактор стимулювання утворення колоній гранулоцитів-макрофагів (ГМ-КСФ, сарграмостим), циклофосфамід, іміквімод, резиквімод та інтерферон-альфа.
В переважному втіленні фармацевтичної композиції за винаходом ад'ювант вибирається з групи, що складається з колонієстимулюючих факторів, таких як Фактор стимулювання утворення колоній гранулоцитів-макрофагів (ГМ-КСФ, сарграмостим), циклофосфамід, іміквімод і резиквімод. У переважному втіленні фармацевтичної композиції за винаходом ад'ювантом є циклофосфамід, іміквімод чи резиквімод. Навіть більш переважними ад'ювантами є монтанід
ІМ5 1312, монтанід ІЗА 206, монтанід ІЗА 50М, монтанід ІЗА-51, полі-ІСЇ С (НійопоїФ) і моноклональні анти-СО040-антитіла або їх комбінація.
Ця композиція може застосовуватися для парентерального введення, наприклад, підшкірного, внутрішньошкірного, внутрішньом'язового або для перорального застосування Для цього пептиди і необов'язково інші молекули розчиняють або суспендують у фармацевтично прийнятному, переважно водному носієві. Крім того, композиція може містити допоміжні речовини, такі як буфери, зв'язувальні речовини, розпушувачі, розріджувачі, ароматизатори, антифрикційні речовини тощо. Пептиди можна також ввести разом із імуностимуляторами, такими як цитокіни. Великий перелік допоміжних речовин, які можна використовувати у такій 60 композиції, можна знайти, наприклад, у посібнику А. Кірре, Напароок ої РНагтасеціїсаї
Ехсірієпів (Кірбе, 2000). Ця композиція може застосовуватися для попередження, профілактики і (або) лікування аденоматозних або ракових захворювань. Приклади фармацевтичних композицій наведені, наприклад, у ЕР2113253.
Важливо розуміти, що імунна відповідь, ініційована вакциною за винаходом, спрямована проти ракових клітин на різних стадіях клітинного циклу і на різних стадіях розвитку пухлини.
Більш того, атака здійснюється на різні асоційовані з раковими пухлинами сигнальні шляхи. Це є перевагою над вакцинами, які направлені тільки на одну чи малу кількість мішеней, що може привести до легкої адаптації пухлини до атаки (уникання пухлиною). Більш того, не усі індивідуальні пухлини експресують одну й ту саму картину антигенів. Таким чином, комбінація декількох пухлино-асоційованих пептидів гарантує, що кожна окрема пухлина несе принаймні деякі з мішеней. Композиція була створена виходячи з того, що, як очікується, кожна пухлина експресує декілька антигенів і охоплює декілька незалежних сигнальних шляхів, необхідних для росту і розвитку пухлини. Таки чином, вакцину може легко використовувати у «готовому для застосування» вигляді для більшої популяції пацієнтів. Це означає, що попередній відбір пацієнтів, що потребують лікування цією вакциною, можна обмежити типуванням за НГА, не потребує будь-якого додаткового дослідження біомаркерів експресії антигенів, але все ж забезпечується одночасна атака декількох мішеней у вигляді індукованої імунної відповіді, що є важливим для ефективності (Вапспегеаи еї аї., 2001; УУанег еї а!ї., 2012).
Термін «каркас» в контексті цього винаходу означає молекулу, яка специфічно зв'язується з (наприклад, антигенною) детермінантою. В одному з втілень каркас здатний направляти об'єкт, до якого він приєднаний (наприклад, (другий) антиген-зв'язувальний елемент) до сайта-мішені, наприклад, до клітини конкретного виду пухлини або до строми пухлини, що несе антигенну детермінанту (наприклад, комплекс пептид-МНе відповідно до цього підходу). В іншому втіленні каркас здатний активувати сигнальний шлях через його антиген-мішень, наприклад, антиген комплексу Т-клітинного рецептора. Каркаси включають, але не обмежуються ними, антитіла і їх фрагменти, антиген-зв'язувальні домени антитіл, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, зв'язувальні білки, що містять принаймні один модуль анкіринового повтору і однодоменні антиген-зв'язувальні (З5ОАВ) молекули, аптамери, (розчинні) ТКР і (модифіковані) клітини, такі як алогенні або аутологічні Т-
Зо клітини. Щоб оцінити, чи буде молекула каркасом, що зв'язується з мішенню, можна провести аналіз зв'язування. «Специфічне» зв'язування означає, що каркас зв'язує досліджуваний комплекс пептид-МНО краще ніж інші природно існуючі комплекси пептид-МНС до такої міри, що каркас, споряджений активною молекулою, яка здатна знищувати клітину, що несе конкретну мішень, не здатний знищувати іншу клітину без конкретної мішені, але таку, що презентує інший(-ї) комплекс(-и) пептид-МНеО. Зв'язування з іншими комплексами пептид-МНС не має значення, якщо пептид, що бере участь у перехресній реакції, не зустрічається в природі, тобто не отриманий із пептидому НІ А. Тести для оцінки знищення клітин-мішеней добре відомі фахівцям в цій галузі.
Їх потрібно виконувати з використанням клітин-мішеней (первинних клітинних культур або клітинних ліній) із незміненою презентацією пептидів молекулами МНС, або клітин, навантажених пептидами, у такий спосіб, щоб були досягнуті природні рівні комплексів пептид-
МН.
Кожний каркас містить мітку, яка забезпечує можливість виявлення зв'язаного каркаса шляхом визначення присутності або відсутності сигналу, який генерує мітка. Наприклад, каркас може бути міченим флуоресцентним барвником або іншою застосовною маркерною молекулою клітини. Такі маркерні молекули добре відомі в цій галузі. Наприклад, флуоресцентне мічення, наприклад, флуоресцентним барвником, може забезпечити візуалізацію зв'язаного аптамеру за допомогою флуоресценції або лазерної сканувальної мікроскопії або проточної цитометрії.
Кожний каркас може бути кон'югованим із другою активною молекулою, такою як, наприклад, ІЛ- 21, антитіло проти СОЗ, антитіло проти СО28. Додаткову інформацію про поліпептидні каркаси див., наприклад, у розділі «Передумова створення винаходу» у заявці МО 2014/0719784А1 ї у посиланнях, наведених в ній.
Цей винахід також стосується аптамерів. Аптамери (див., наприклад, УМО 2014/191359 і посилання, наведені в цій роботі) є молекулами коротких одноланцюгових нуклеїнових кислот, які можуть складатися у певні тримірні структури і розпізнавати специфічні структури-мішені.
Вони, очевидно, є прийнятними альтернативами для розробки таргетної терапії. Було показано, що аптамери селективно зв'язуються з багатьма складними мішенями з високою афінністю і специфічністю.
Аптамери, що розпізнають розташовані на поверхні молекули, були ідентифіковані у бо минулому десятиріччі і забезпечують засоби для розробки діагностичних і терапевтичних підходів. Оскільки було показано, що аптамери майже не проявляють жодної токсичності і імуногенності, вони є перспективними кандидатами у речовини для біомедичних застосувань.
Справді, аптамери, наприклад, такі, що розпізнають простат-специфічні мембранні антигени, були успішно застосовані для таргетної терапії, і було показано, що вони виявляють ці функції в трансплантатних моделях іп мімо. Більш того, були ідентифіковані аптамери, які розпізнають конкретні лінії пухлинних клітин.
Можуть бути вибрані аптамери ДНК, що проявляють розпізнавальні властивості широкого спектру по відношенню до різних ракових клітин, особливо до таких, що отримані з солідних пухлин, у той час як непухлиногенні і первинні здорові клітини ними не розпізнаються. Якщо ідентифіковані аптамери розпізнають не тільки підтип конкретної пухлини, але скоріше взаємодіють з рядом пухлин, це надає аптамерам властивість бути застосовними в якості так званих діагностичних і терапевтичних засобів широкого спектру.
Далі, дослідження зв'язувальних властивостей по відношенню до клітин методом проточної цитометрії показало, що аптамери виявляють дуже добру позірну афінність, яка знаходиться у наномолярному діапазоні.
Аптамери можуть використовуватися для діагностичних і терапевтичних цілей. Далі, можна показати, що деякі аптамери поглинаються пухлинними клітинами і таким чином можуть використовуватися як молекулярні носії для цілеспрямованої доставки протиракових препаратів, таких як міРНК, у пухлинні клітини.
Аптамери можуть бути вибрані проти складних мішеней, таких як клітини і тканини і комплекси пептидів, що включають, переважно що складаються з послідовності відповідно до будь якої послідовності від ЗЕО ІЮ МО 1 до ЗЕО ІЮО МО 385 за цим винаходом із молекулою
МНС оз використанням методики ЗБЕЇЕХ (Систематична еволюція лігандів шляхом експоненційного збагачення).
Пептиди за цим винаходом можуть використовуватися для продукції і розробки антитіл, специфічних до комплексів МНС/пептид. Вони можуть застосовуватися для лікування, націлюючи токсини або радіоактивні речовини на хворі тканини. Іншим використанням цих антитіл може бути націлювання радіонуклідів на хворі тканини з метою формування зображень, таких як позитронна емісійна томографія (ПЕТ). Таке використання може виявляти невеликі
Зо метастази або визначати розмір і точну локалізацію хворих тканин.
Таким чином, в ще одному аспекті цей винахід стосується способу отримання рекомбінантного антитіла, яке специфічно зв'язується з головним комплексом гістосумісності (МНС) людини | або ІІ класу, який входить до складу комплексу з антигенами, обмеженими за
НА, причому спосіб включає: імунізацію клітинами ссавців нелюдського походження, отриманих методами генної інженерії що експресують згаданий головний комплекс гістосумісності (МНС) людини І або ІЇ класу із розчинною формою молекули МН І або ІІ класу, яка входить до складу комплексу зі згаданими антигенами, обмеженими за НІГА; виділення молекул ІРНК із клітин згаданих ссавців нелюдського походження, що продукують антитіла; отримання бібліотеки фагового дисплея, що містить фаги, які експонують молекули білка, який кодується згаданими молекулами іРНК; і виділення принаймні одного фага із згаданої бібліотеки фагового дисплея, причому згаданий принаймні один фаг експонує згадане антитіло, що специфічно зв'язується із згаданим головним комплексом гістосумісності (МНС) людини І або ІЇ класу, який входить до складу комплексу із згаданим антигеном, обмеженим за НГ А.
У ще одному аспекті цей винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язується з головним комплексом гістосумісності (МНС) людини І або І класу, який входить до складу комплексу з антигенами, рестриктованими за НіА, в якому антитіло переважно є поліклональним антитілом, моноклональним антитілом, біспецифічним антитілом і (або) хімерним антитілом.
Відповідні способи отримання таких антитіл і одноланцюгових головних комплексів гістосумісності (МНС) І класу, а також інших інструментів отримання цих антитіл розкриті в заявках УМО 03/068201, УМО 2004/084798, УМО 01/72768, ММО 03/070752 і статтях (Сопнеп еї аї., 200За; Сопеп еї а!., 20036; ЮРепкбего еї аї., 2003), які для цілей цього винаходу всі у прямій формі включені в цей документ шляхом посилання в усій повноті.
Переважно, антитіло зв'язується з спорідненістю на рівні нижче 20 наномолів, переважно нижче 10 наномолів, у комплекс, який також вважається «специфічним» у контексті цього винаходу.
Цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 385 або їхній варіант, який принаймні на 8895 є гомологічним (переважно ідентичним) послідовностям від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 385 або бо їхнього варіанту, що викликає перехресну реакцію Т-клітин із зазначеним пептидом, де зазначений пептид не є базовим повнорозмірним поліпептидом.
Цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 385 або їхній варіант, який принаймні на 8895 є гомологічним (переважно ідентичним) послідовностям від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО: 385, де зазначений пептид або його варіант має загальну довжину між 8 і 100, переважно між 8 і 30 і найбільш переважно між 8 і 14 амінокислот.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, які здатні зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або ЇЇ класу.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згадані пептиди складаються або по суті складаються з амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮО МО: 1 до ЗЕО ІЮО МО: 385.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є (хімічно) модифікованим і (або) включає непептидні зв'язки.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є частиною злитого білка, зокрема злитим із М-термінальними амінокислотами НІГА-ОК антиген- асоційованого інваріантного ланцюга (Ії), або де пептид є злитим із антитілом (або вбудованим в антитіло), наприклад, із антитілом, що є специфічним до дендритних клітин.
Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти, що кодує пептиди за цим винаходом за умови, що пептид не є повністю (цілковито) людським білком.
Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти за цим винаходом, яка являє собою ДНК,
КДНК, ПНК, РНК чи їх комбінацію.
Цей винахід також стосується вектора експресії що здатний експресувати нуклеїнову кислоту за цим винаходом.
Цей винахід також стосується пептиду за цим винаходом, нуклеїнової кислоти за цим винаходом або вектору експресії за цим винаходом для застосування в медицині, зокрема в лікуванні ХЛЛ.
Цей винахід також стосується клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту за цим винаходом або вектор експресії за цим винаходом.
Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, яка є антиген- презентуючою клітиною, і переважно дендритною клітиною.
Зо Цей винахід також стосується способу отримання пептиду за цим винаходом, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна за цим винаходом і виділення пептиду зі згаданого клітини-хазяїна або її культурального середовища.
Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген навантажують на молекули МНС І або ІЇ класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини шляхом контакту достатньої кількості антигену з антиген-презентуючою клітиною.
Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина містить вектор експресії, що здатний експресувати або експресує згаданий пептид, що містить послідовність від ЗЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮ МО: 385 або згаданий варіант амінокислотної послідовності.
Цей винахід також стосується активованих Т-клітин, отриманих згідно способу за цим винаходом, де згадані Т-клітини селективно розпізнають клітину, яка експресує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за цим винаходом.
Цей винахід також стосується способу знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить будь-яку амінокислотну послідовність за цим винаходом, причому спосіб включає введення в організм пацієнта ефективної кількості Т-клітин за цим винаходом.
Цей винахід також стосується застосування будь-якого пептиду, що описаний тут, нуклеїнової кислоти за цим винаходом, вектора експресії за цим винаходом, клітини за цим винаходом, або активованого цитотоксичного Т-лімфоцита за цим винаходом, як лікарського засобу або в процесі виробництва лікарського засобу. Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський засіб виявляє протиракову активність.
Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський засіб являє собою вакцину. Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський засіб виявляє протиракову активність.
Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де згадані ракові клітини є клітинами ХЛЛ або клітинами інших солідних або гематологічних пухлин, таких як гострий мієлогенний лейкоз, рак жовчних протоків, рак головного мозку, рак молочної залози, колоректальна карцинома, рак стравоходу, рак жовчного міхура, рак шлунка, гепатоцелюлярний рак, карцинома з клітин Меркеля, меланома, неходжкінська лімфома, недрібноклітинний рак бо легенів, рак яєчника, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, нирковоклітинний рак, дрібноклітинний рак легенів, рак сечового міхура і рак матки.
Цей винахід також стосується конкретних маркерних білків і біомаркерів на основі пептидів за цим винаходом, які у цьому документі іменуватимуться як «мішені», які можуть використовуватися в діагностиці і (або) визначенні прогнозу перебігу ХЛЛ. Цей винахід також стосується застосування цих нових мішеней для лікування раку.
Термін «антитіло» або «антитіла» використовується в тут у широкому сенсі і включає як поліклональні, так і моноклональні антитіла. На додаток до інтактних або «повнорозмірних» молекул імуноглобуліну, до терміну «антитіла» також входять фрагменти (наприклад, фрагменти СОК, Ем, Раб їі Ес) або полімери цих молекул імуноглобуліну і гуманізовані версії молекул імуноглобуліну, за умови, що вони виявляють будь-які з бажаних властивостей (наприклад, специфічне зв'язування (полі)пептидного маркера ХЛЛ, доставка токсину до клітини
ХЛЛ, що експресує ген-маркер раку легенів на підвищеному рівні, і (або) інгібування активності поліпептидного маркера ХЛЛ) відповідно до цього винаходу.
За найменшої можливості антитіла за винаходом слід закуповувати у комерційних підприємств. Антитіла за винаходом можуть бути отримані з використанням добре відомих методів. Кваліфікований фахівець зрозуміє, що для отримання антитіл за винаходом можуть бути використані як повнорозмірні поліпептидні маркери ХЛЛ, так і їх фрагменти. Поліпептид, який буде використовуватися для отримання антитіл за винаходом, може бути повністю чи частково очищеним компонентом природного джерела або може бути отриманий за допомогою технології рекомбінантних ДНК.
Наприклад, кКДНК, що кодує пептид за цим винаходом, такий як пептид з послідовністю від
ЗБЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 385 або його варіант чи фрагмент, може експресуватися в прокаріотичних клітинах (наприклад, бактерій) або еукаріотичних клітинах (наприклад, клітинах дріжджів, комах або ссавців), після чого рекомбінантний білок можна очистити і використати для отримання препарату моноклональних або поліклональних антитіл, які специфічно зв'язують поліпептидний маркер ХЛЛ, що був використаний для отримання антитіл за цим винаходом.
Фахівцю ов цій галузі відомо, що отримання двох або більше різних комплектів моноклональних або поліклональних антитіл максимально збільшує ймовірність отримання антитіла, що буде мати специфічність та афінність, необхідні для використання за призначенням (наприклад, для ЕГІ5А, імуногістохімічних методів, візуалізації іп мімо, лікування імунотоксинами). Антитіла досліджують на бажану активність добре відомими методами, відповідно до цілей, у яких мають використовуватися антитіла (наприклад, ЕГІ5А, імуногістохімічні методи, імунотерапія тощо; додаткові відомості щодо отримання і перевірки антитіл див., наприклад, Сгеепієїа, 2014 (Стеепіїєїд, 2014)). Наприклад, антитіла можуть бути досліджені методами ЕГІЗА, Вестерн-блотингу, імуногістохімічним забарвлюванням фіксованих формаліном зрізів ракової тканини або заморожених зрізів тканини. Після попередніх досліджень іп міго антитіла, які мають використовуватися для терапевтичних цілей або для діагностики іп мімо, досліджують з використанням відомих методів клінічного дослідження.
Термін «моноклональне антитіло» в тому виді, в якому він використовується тут, означає антитіло, отримане із по суті гомогенної популяції антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком мутантних форм, що спостерігаються в природі, які можуть бути присутніми в незначній кількості. Моноклональні антитіла за цим патентом конкретно включають «химерні» антитіла, у яких частина важкого і (або) легкого ланцюга ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, отриманих із окремого виду, або які належать до окремого класу чи підкласу антитіл, в той час як решта ланцюга (ланцюгів) ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, отриманих із іншого виду або які належать до іншого класу чи підкласу антитіл, а також фрагментів таких антитіл, за умови, що вони виявляють бажану антагоністичну активність (Пат.
США 4 816 567, включений в цей документ шляхом посилання в усій повноті).
Моноклональні антитіла за винаходом можуть бути отримані гібридомними технологіями. У гібридомних технологіях мишу або іншу прийнятну тварину-хазяїна, як правило, імунізують імунізуючим агентом для створення лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які специфічно зв'язуються з імунізуючим агентом. Альтернативно, лімфоцити можуть бути імунізовані іп міїго.
Моноклональні антитіла можуть також бути створені технологіями рекомбінантних ДНК, такими як описані в патенті США 4816567. ДНК, що кодує моноклональні антитіла за винаходом, можна легко виділити і секвенувати з використанням традиційних методик (наприклад, використовуючи олігонуклеотидні зонди, здатні специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіл миші). 60 Методи Іп міго також придатні для створення одновалентних антитіл. Розщеплення антитіл з метою отримання їх фрагментів, зокрема, Рар-фрагментів, можна провести з використанням стандартних методик, відомих у галузі. Наприклад, розщеплення можна виконати за допомогою папаїну. Приклади розщеплення за допомогою папаїну описані у заявці УУО 94/29348 і в патенті
США 4 342 566. При розщепленні антитіл за допомогою папаїну, як правило, утворюються два ідентичних антиген-зв'язувальних фрагменти, які звуться Гар-фрагментами, кожний з одним антиген-зв'язувальним сайтом, і залишковим Ес фрагментом. Обробка пепсином дає фрагмент
Кіабр)2 ї фрагмент рес.
Фрагменти антитіл, чи то з'єднані з іншими послідовностями, чи ні, можуть також включати вставки, делеції, заміни або інші вибрані модифікації окремих частин або амінокислотних залишків за умови, що активність фрагмента не є значно зміненою або пошкодженою у порівнянні з немодифікованим антитілом або фрагментом антитіла. Ці модифікації можуть надати деякі додаткові властивості, такі як видалити/додати амінокислоти, що здатні до дисульфідного зв'язування, підвищити біологічну довговічність, змінити секреторні властивості тощо. У будь-якому випадку, фрагмент антитіла має виявляти біологічну активність, таку як зв'язувальна активність, регулювання зв'язування у зв'язувальному домені тощо. Функціональні або активні центри антитіла можуть бути ідентифіковані шляхом мутагенезу конкретної ділянки білка, який супроводжується експресією і перевіркою експресованого поліпептиду. Такі методи є цілююм очевидними для фахівця у цій галузі і можуть включати сайт-специфічний мутагенез нуклеїнової кислоти, що кодує фрагмент антитіла.
Антитіла за винаходом можуть додатково включати гуманізовані антитіла або людські антитіла. Гуманізованими формами антитіл нелюдського походження (наприклад, мишачі) є химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їх фрагменти (такі як Ем, Раб, Рар' та інші антиген-зв'язувальні послідовності антитіл), які містять мінімальну послідовність, отриману з імуноглобуліну нелюдського походження. Гуманізовані антитіла включають імуноглобуліни людини (антитіло-реципієнт), в яких залишки від комплементарної детермінантної групи (СОК) реципієнта заміщені залишками від СОК нелюдського походження (антитіло-донор), такого як від миші, пацюка або кроля, що має бажану специфічність, афінність і зв'язувальну здатність. У деяких випадках Ем каркасні (ЕК) залишки імуноглобуліну людини є заміщеними відповідними залишками нелюдського походження. Гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не
Зо були виявлені ні в антитілі-реципієнті, ні в імпортованих СОК або послідовностях каркаса. Як правило, гуманізоване антитіло буде містити по суті всі з принаймні одного, а зазвичай двох варіабельних доменів, в яких всі або по суті всі із діллнок СОК відповідають ділянкам імуноглобуліну нелюдського походження і всі або по суті всі із ділянок ЕК є ділянками консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. Оптимально, якщо гуманізоване антитіло містить також принаймні частину константної ділянки імуноглобуліну (Ес), зазвичай ділянку імуноглобуліну людини.
Методи гуманізації нелюдських антитіл добре відомі фахівцю у цій галузі. Загалом, гуманізоване антитіло має один або більше амінокислотних залишків, введених в нього з джерела, яке є нелюдського походження. Ці амінокислотні залишки нелюдського походження часто називають «імпортними» залишками, які зазвичай беруть із «імпортного» варіабельного домену. Гуманізацію можна по суті провести шляхом заміщення СОК або послідовностей СОМ гризунів відповідними послідовностями людського антитіла. Відповідно, такі «гуманізовані» антитіла є химерними антитілами (патент США 4 816 567), в яких суттєво менша частина ніж інтактний варіабельний домен людини була заміщена відповідною послідовністю біологічних видів, відмінних від людини. На практиці гуманізовані антитіла є зазвичай людськими антитілами, в яких деякі залишки СОК і, можливо, залишки ЕК є заміщеними залишками з аналогічних сайтів антитіл гризунів.
Можуть використовуватися трансгенні тварини (наприклад, миші), які після імунізації набувають здатність продукувати повний спектр людських антитіл в умовах відсутності виробки ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, було описано, що гомозиготна делеція гена, що кодує ділянку з'єднання важких ланцюгів антитіла, у химерних клітин і лінії клітин зародків мутантних мишей приводить до повного інгібування виробки ендогенних антитіл. Перенесення генної матриці імуноглобуліну клітин зародків людини у лінію клітин зародків мутантних мишей приводить до виробки людських антитіл після антигенної стимуляції. Людські антитіла можуть також бути виділені методом фагового дисплея з комбінаторної бібліотеки.
Антитіла за винаходом переважно вводять суб'єкту у фармацевтично прийнятному носієві.
Як правило, для надання фармацевтичній композиції ізотонічності використовують відповідну кількість фармацевтично прийнятної солі. Приклади фармацевтично прийнятного носія включають фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин глюкози. рН розчину переважно має 60 становити приблизно від 5 до 8, і більш переважно приблизно від 7 до 7,5. Додатково пропонуються носії, що включають препарати з тривалим вивільненням, такі як напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, які містять антитіла, причому ці матриці мають вигляд сформованих предметів, наприклад, плівок, ліпосом або мікрочастинок. Фахівцю в цій галузі зрозуміло, що певні носії можуть бути більш переважними, залежно від, наприклад, способу введення і концентрації антитіла, що вводиться.
Антитіла можна вводити суб'єкту, пацієнту або в клітину шляхом ін'єкції (наприклад, внутрішньовенної, внутрішньочеревної, підшкірної, внутрішньом'язової) або іншими методами, такими як інфузія, яка гарантує їх доставку у кровотік у ефективній формі. Антитіла можуть також бути введені внутрішньопухлинним або перитуморальним шляхом з метою отримати місцевий, а також системний терапевтичний ефект. Кращими є місцеве або внутрішньовенне введення.
Ефективні дози і режими дозування для введення антитіл можна визначити емпіричним шляхом, такі визначення знайомі фахівцю в цій галузі. Фахівцю в цій галузі зрозуміло, що дози антитіл, які необхідно вводити, залежать, наприклад, від суб'єкта, який отримує антитіла, шляху введення, конкретного типу використовуваних антитіл та інших лікарських препаратів, які вводяться. Типова добова доза при монотерапії антитілами може становити від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг маси тіла або більше на добу, залежно від вищезгаданих факторів. Після введення антитіл, переважно з метою лікування ХЛЛ, ефективність терапевтичної дії антитіл можна оцінити різними способами, відомими фахівцю в цій галузі. Наприклад, розмір, кількість і (або) розповсюдження раку в організмі суб'єкта, що отримує лікування, можна контролювати за допомогою стандартних методик візуалізації пухлин. Введене з терапевтичними цілями антитіло, яке затримує ріст пухлини, приводить до скорочення пухлини і (або) запобігає розвитку нових пухлин у порівнянні з перебігом захворювання, який би спостерігався за відсутності введення антитіла, є ефективним антитілом для лікування гліобластоми.
У ще одному аспекті цей винахід стосується способу отримання розчинного Т-клітинного рецептора (рТКР), що розпізнає конкретний комплекс пептиду і МНС. Такі розчинні Т-клітинні рецептори можуть бути отримані зі специфічних клонів Т-клітин, і їх спорідненість можна підвищити мутагенезом, націленим на комплементарні детермінантні групи. З метою вибору Т- клітинних рецепторів може використовуватися метод фагового дисплея (Заявка США
Зо 20100113300, (ГПідау еї аї.,, 2012)». З метою стабілізації Т-клітинних рецепторів у процесі фагового дисплея і у разі застосування як лікарського препарату альфа- і бета-ланцюги можуть буди зв'язані, наприклад ненативними дисульфідними зв'язками або іншими ковалентними зв'язками (одноланцюговий Т-клітинний рецептор) або доменами димеризації (ВошНег єї аї., 2003; Сага єї аї!., 2004; М/йсох єї аїЇ., 1999). Т-клітинний рецептор може бути зв'язаний з токсинами, лікарськими препаратами, цитокінами (див., наприклад, заявку США 2013/0115191), доменами, що залучають ефекторні клітини, такі як домени антитіл проти СОЗ тощо, щоб виконувати конкретні функції на клітинах-мішенях. Більш того, він може експресуватися у Т- клітинах, що використовуються для адоптивного переносу. Додаткову інформацію можна знайти у заявках УМО 2004/033685А1 і УМО 2004/074322А1. Комбінація рРТКР описана у заявці М/О 2012/056407А1. Інші способи отримання розкриті у заявці УМО 2013/057586А1.
Крім того, пептиди і (або) ТКР, або антитіла, або інші зв'язувальні молекули за цим винаходом можуть використовуватися для підтвердження діагнозу «рак», поставленому патоморфологом на основі дослідження біоптату.
Ці антитіла або ТКР можуть використовуватися також для діагностики іп мімо. Зазвичай антитіла мітять радіонуклідами (такими як "и, 99Тс, 120, 191|, ЗН, 82 Р або 955), щоб пухлину можна було локалізувати, використовуючи імуносцинтіграфію. В одному з втілень антитіла або їх фрагменти зв'язуються з зовнішньоклітинними доменами двох або більше таких мішеней білка, вибраного з групи, що складається з вищезгаданих білків., із константою зв'язування (Ка) меншою ніж 1х10 мкМ.
Антитіла для діагностичного застосування можна мітити зондами, що підходять для виявлення різними методами візуалізації Методи виявлення зондів включають, але не обмежуються ними, флуоресценцію, світлову, конфокальну і електронну мікроскопію, магнітно- резонансну візуалізацію і спектроскопію, флуороскопію, комп'ютерну томографію та позитронну емісійну томографію. Відповідні зонди включають, але не обмежуються ними, флуоресцеїн, родамін, еозин та інші флуорофори, радіоїзотопи, золото, гадоліній та інші лантаноїди, парамагнітне залізо, фтор-18 та інші радіонукліди, що випромінюють позитрони. Крім цього, зонди можуть бути бі- або багатофункціональними і виявлятися більш ніж одним із зазначених методів. Ці антитіла можуть бути безпосередньо або опосередковано мічені вищезгаданими зондами. Прикріплення зондів до антитіл включає ковалентне зв'язування зонда, включення бо зонда в антитіло і ковалентне прикріплення хелатуючої сполуки для зв'язування зонда, серед інших методів, добре відомих фахівцю у цій галузі. У разі імуногістохімічних методів зразок хворої тканини може бути свіжим чи замороженим або може бути залитим у парафін і фіксованим за допомогою консерванту, такого як формалін. Фіксовані або залиті зразки зрізів тканин приводять у контакт із міченим первинним антитілом і вторинним антитілом, де антитіло використовується для виявлення експресії цих білків іп 5йи.
Згідно з іншим аспектом цього винаходу пропонується спосіб отримання активованих Т- клітин іп мійго, причому спосіб включає контактування іп мійго Т-клітин із навантаженими антигеном молекулами МНС, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації Т-клітини шляхом набуття нею специфічності до антигену, де згаданий антиген є пептидом за винаходом. Переважно з антиген-презентуючою клітиною використовують достатню кількість антигену.
Переважно клітина ссавців не має пептидного транспортера ТАР чи має його знижений рівень або знижену функціональну активність. Відповідні клітини з дефіцитом пептидного транспортера ТАР включають клітини Т2, КМА-5 і клітини дрозофіли. ТАР є транспортером, асоційованим із процесингом антигену.
Лінія людських клітин з недостатністю Т2, на які завантажуються пептиди, доступна для придбання у Американській колекції типових культур АТСС за адресою 12301 РагКіІам/п Огіме,
КоскКміїе, Магуїапа 20852, США, номер за каталогом СК. 1992; лінія клітин дрозофіли Зсппеїдег 2 доступна для придбання в АТСС, номер за каталогом СК 19863; клітинна лінія миші ЕМА-5 описана у Ципдаогеп і співавт. (І їипддгеп апа Каїте, 1985).
Переважно, клітина-хазяїн до трансфекції не експресує суттєвої кількості молекул МНС І класу. Також переважно клітина-стимулятор експресує молекулу, яка є важливою для забезпечення додаткового стимулюючого сигналу для Т-клітин, таку як будь-яка з молекул В7.1,
В7.2, ІСАМ-1 ії БА 3. Послідовності нуклеїнових кислот багатьох молекул МНС І класу і костимуляторних молекул є у вільному доступі в базах даних СепВапк і ЕМВІ.
У випадку, коли роль антигенів відіграють епітопи комплексу МНС І класу, Т-клітини є СО8- позитивними Т-клітинами.
Якщо антиген-презентуючи клітину трансфекують для експресії такого епітопу, клітина переважно містить вектор експресії, здатний експресувати пептид, що містить послідовності від
Ко) ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 385, або варіант його амінокислотної послідовності.
Ряд інших способів може використовуватися для отримання Т-клітин іп міго. Наприклад, для отримання ЦТЛ можуть використовуватися аутологічні лімфоцити, які інфільтрують пухлину.
Ріебапзкі і співавт. (Ріерап:хкі еї а!., 1995) використовували аутологічні лімфоцити периферійної крові (РІВ) для отримання Т-клітин. Більш того, можливе створення аутологічних Т-клітин шляхом обробки дендритних клітин пептидом або поліпептидом або інфікуванням рекомбінантним вірусом. Для отримання аутологічних Т-клітин можуть також використовуватися
В-клітини. Крім того, для отримання аутологічних Т-клітин можуть використовуватися макрофаги, оброблені пептидом або поліпептидом або інфіковані рекомбінантним вірусом. 5.
Умацег і співавт. (У/аег еї а!., 2003) описують примування Т-клітин іп міго за допомогою штучних антиген-презентуючих клітин (штучні АПК), що також є прийнятним способом отримання Т- клітин проти вибраного пептиду. В цьому винаході штучні АПК отримували шляхом прикріплення заздалегідь сформованих комплексів МНС-пептид до поверхні полістирольних частинок (мікрогранул)у за допомогою системи біотин-стрептавідин. Ця система забезпечує точний контроль щільності МНС на штучних АПК, що дозволяє селективно викликати високо- або низькоавідні специфічні до антигену відповіді Т-клітин з високою ефективністю для зразків крові. Окрім комплексів МНО-пептид, штучні АПК мають нести інші білки з костимулювальною активністю, такі як антитіла проти СО28, прикріплені до їхньої поверхні. До того ж такі системи на базі штучних АПК часто вимагають додавання відповідних розчинних елементів, наприклад, цитокінів, таких як інтерлейкін-12.
Алогенні клітини також можуть використовуватися для отримання Т-клітин, і відповідний спосіб докладно описаний у заявці М/О 97/26328, яка включена в цей документ шляхом посилання. Наприклад, окрім клітин ЮОго5орпйа і клітин Т2, інші клітини можуть використовуватися для презентації антигенів, такі як клітини СНО, інфіковані бациловірусом клітин комах, бактеріальні, дріжджові клітини та клітини-мішені, інфіковані коров'ячою віспою.
Крім того, можуть використовуватись віруси рослин (див., наприклад, роботу Рога і співавт. (Ропа єї аї., 1994), в якій описується розробка мозаїчного вірусу вігни як високопродуктивної системи для презентації чужорідних пептидів.
Активовані Т-лімфоцити, які спрямовані проти пептидів за винаходом, є корисними в терапії.
Отже, згідно з ще одним аспектом винаходу пропонуються активовані Т-клітини, які можна 60 отримати за допомогою вищезгаданих способів за винаходом.
Активовані Т-клітини, які отримані вищезгаданим способом, селективно розпізнають клітину, яка аберантно експресує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО 385.
Переважно, Т-клітина розпізнає цю клітину шляхом взаємодії свого Т-клітинного рецептора з комплексом НІ А/пептид (наприклад, зв'язуванням). Т-клітини є корисними у способі знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за винаходом, за яким пацієнту вводиться ефективна кількість активованих Т-клітин. Ці Т-клітини, що вводяться пацієнту, можуть бути виділені з організму пацієнта і активовані як описано вище (тобто вони є аутологічними Т-клітинами). Як альтернатива, ці Т-клітини одержуються не з організму пацієнта, а від іншої людини. Зрозуміло, що переважно ця людина є здоровою людиною. Під терміном «здорова людина» автори винаходу мають на увазі, що людина має хороший загальний стан здоров'я, переважно має адекватну імунну систему та, ще більш переважно, не страждає від якогось захворювання, на яке її можна легко перевірити і виявити.
Іп мімо, клітини-мішені для СО8-позитивних Т клітин за цим винаходом можуть бути клітинами пухлини (які іноді експресують МНС ЇЇ класу) і (або) клітинами строми, що оточують пухлину (пухлинні клітини) (які іноді також експресують МНС Ії класу; (Оєпа/є! еї а!., 2006)).
Т-клітини за цим винаходом можуть використовуватися як активні інгредієнти терапевтичної композиції. Отже, предметом цього винаходу також є спосіб знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за винаходом, причому спосіб включає введення пацієнту ефективної кількості Т-клітин згідно визначеному вище.
Під терміном «аберантно експресовані» автори винаходу мають на увазі, що поліпептид є надмірно експресованим у порівнянні з рівнями експресії нормальних тканин або що ген є «мовчазним» у тканині, з якої походить пухлина, але він експресується в пухлині. Під терміном «надмірно експресований» автори винаходу мають на увазі, що поліпептид присутній на рівні, що принаймні у 1,2 рази вищий за рівень у нормальній тканині, переважно принаймні у 2 рази, та більш переважно принаймні у 5 або 10 разів вищий за рівень у нормальній тканині.
Т-клітини можуть бути отримані способами, що відомі в галузі, наприклад, тими, що описані
Зо вище.
Протоколи для цього так званого адоптивного перенесення Т-клітин добре відомі в цій галузі. Огляди можна знайти, наприклад, у роботах Ссайціопі і співавт. і Могдап і співавт. (Саціпопі еї а!., 2006; Могдап еї а)ї., 2006).
У ще одному аспекті цей винахід стосується застосування пептидів, які входить до складу комплексу з МНС, для отримання Т-клітинного рецептора, нуклеїнова кислота якого клонована і введена у клітину-хазяїн, переважно Т-клітину. Ця отримана методами генної інженерії Т- клітина може потім бути перенесена в організм пацієнта для лікування раку.
Будь-яка молекула за винаходом, тобто пептид, нуклеїнова кислота, антитіло, вектор експресії, клітина, активована Т-клітина, Т-клітинний рецептор або нуклеїнова кислота, яка її кодує, є прийнятною для лікування захворювань, для яких є характерним те, що клітини уникають імунної відповіді. Таким чином, будь-яка молекула за цим винаходом може застосовуватися як лікарський засіб або в процесі виробництва лікарського засобу. Згадана молекула може використовуватися сама по собі або у комбінації з іншою молекулою (іншими молекулами) за винаходом або відомою молекулою (відомими молекулами).
За цим винаходом також пропонується комплект, що включає: (а) контейнер, який містить фармацевтичну композицію як зазначено вище, у розчині або у ліофілізованій формі; (б) необов'язково, другий контейнер, що містить розріджувач або розчин для відновлення ліофілізованої композиції, і (в) необов'язково, інструкції із (ї) застосування розчину або (ії) відновлення і (або) застосування ліофілізованої композиції.
Комплект може додатково включати один або більше (ії) буферів, (ім) розріджувачів, (м) фільтрів, (мі) голок або (мії) шприців. Контейнер є переважно пляшкою, флаконом, шприцом або пробіркою; і він може бути контейнером багаторазового застосування. Фармацевтична композиція є переважно ліофілізованою.
Комплекти за винаходом, переважно, включають ліофілізовану композицію за цим винаходом в належному контейнері та інструкції з її відновлення і (або) застосування. Належні контейнери включають, наприклад, пляшки, флакони (наприклад, двокамерні флакони), шприци (такі як двокамерні шприци) і пробірки. Контейнер може бути виготовленим із багатьох видів бо матеріалів, таких як скло або пластмаса. Переважно, комплект і (або) контейнер містить(ять)
інструкції із застосування контейнера або пов'язані з контейнером, які містять вказівки щодо відновлення і (або) застосування. Наприклад, на етикетці може вказуватися, що ліофілізована лікарська форма має бути відновлена до таких концентрацій пептидів як зазначено вище. На етикетці, крім того, може бути зазначено, що лікарська форма є прийнятною для або призначена для підшкірного введення.
Контейнер із лікарською формою може бути флаконом багаторазового застосування, котрий дозволяє робити повторні введення (наприклад, від 2 до 6 введень) відновленої лікарської форми. Комплект додатково може включати другий контейнер, що містить прийнятний розріджувач (наприклад, розчин бікарбонату натрію).
Після змішування розріджувача та ліофілізованої форми остаточна концентрація пептиду у відновленій формі переважно становить принаймні 0,15 мг/мл/пептиду (-75 мкг) та переважно не більше З мг/мл/пептиду (51500 мкг). Комплект додатково може включати інші матеріали, бажані з комерційної точки зору та з точки зору користувача, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци та вкладиші в упаковку з інструкціями із застосування.
Комплекти за цим винаходом можуть включати один контейнер, який містить лікарську форму фармацевтичних композицій відповідно до цього винаходу з іншими компонентами чи без них (наприклад, інші сполуки або фармацевтичні композиції цих інших сполук) чи включати окремі контейнери для кожного компоненту.
Переважно, комплекти за винаходом включають композицію за винаходом, упаковану для використання, в комбінації з одночасним введенням другої сполуки, такої, як ад'юванти (наприклад, ГМ-КСФ), хіміотерапевтичний агент, природний продукт, гормон чи антагоніст, анти- ангіогенезний агент чи інгібітор, апоптоз-індукуючий агент або хелатор) чи їхню фармацевтичну композицію Компоненти комплекту до введення пацієнту можуть бути завчасно змішані, чи кожний компонент може бути в окремому контейнері. Компоненти комплекту можуть бути надані в одному чи кількох рідких розчинах, переважно, водному розчині, більш переважно, стерильному водному розчині Компоненти комплекту також можуть надаватись як речовини у твердому стані, які можуть бути переведені на рідини шляхом додання прийнятних розчинників, котрі переважно містяться в іншому окремому контейнері.
Контейнер терапевтичного комплекту може являти собою флакон, пробірку, колбу, пляшку,
Зо шприц або будь-який інший засіб для вміщення твердої речовини чи рідини. Зазвичай, коли є більш ніж один компонент, комплект включає другий флакон чи другий контейнер, який дозволяє окреме дозування. Комплект може також включати інший контейнер для фармацевтично прийнятної рідини. Переважно, терапевтичний комплект буде включати апарат (наприклад, одну чи кілька голок, шприци, очні піпетки, піпетку та ін.), який робить можливим введення речовин відповідно винаходу, що є компонентами цього комплекту.
Ця лікарська форма є формою, прийнятною для введення пептидів будь-яким зручним способом, наприклад, пероральним (ентеральним), назальним, очним, підшкірним, внутрішньошкірним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним або трансдермальним. Переважно, введення може здійснюватися підшкірно, та найбільш переважно, внутрішньошкірно інфузійним насосом.
Оскільки пептиди за винаходом були виділені з клітин ХЛЛ, лікарський засіб за винаходом переважно застосовується для лікування ХЛЛ.
Цей винахід також стосується способу отримання персоналізованого фармацевтичного засобу для застосування для конкретного пацієнта, який включає виготовлення фармацевтичної композиції, яка містить принаймні один пептид, вибраний із «сховища» заздалегідь «просіяних» ТИОМАР, в якому щонайменше один пептид, використаний у фармацевтичній композиції, вибраний таким чином, щоб підходити конкретному пацієнту. В одному з втілень фармацевтична композиція є вакциною. Спосіб може також бути пристосованим для отримання клонів Т-клітин для подальшого використання, такого як виділення ТКР, або розчинних антитіл та інших варіантів лікування. «Персоналізований фармацевтичний засіб» означає засоби лікування, спеціально адаптовані для конкретного пацієнта, які будуть застосовані для лікування лише цього конкретного пацієнта, включаючи активно персоналізовані протиракові вакцини і засоби адоптивної клітинної терапії з використанням аутологічних тканин, отриманих від пацієнта.
Термін «сховище» в контексті цього винаходу означає групу або набір пептидів, які заздалегідь пройшли «просіяння» (скринінг) на імуногенність і (або) надмірну презентацію у конкретному виді пухлин. Термін «сховище» не означає, що конкретні пептиди, що входять до складу вакцини, були заздалегідь виготовлені і зберігалися у фізичному об'єкті, хоча така можливість мається на увазі. Прямо передбачається, що пептиди можуть бути виготовлені де бо помо для кожної отриманої персоналізованої вакцини або вони можуть бути виготовлені бо заздалегідь і зберігатися. «Сховище» (наприклад, у формі бази даних) складається з пухлино- асоційованих пептидів, що були високо експресовані тканинами пухлин хворих на ХЛЛ пацієнтів із різними алелями НІГА-А, НІ А-В і НГА-С. Воно може містити пептиди, що зв'язані з молекулами МНС І класу і з молекулами МНС ІІ класу або подовжені пептиди, що зв'язані з молекулами МН І класу. На додаток до пухлино-асоційованих пептидів, отриманих із декількох тканин ХЛЛ, сховище може містити маркерні пептиди, що зв'язані з НГА-А"02 і НІ А-А"24. Ці пептиди дозволяють кількісно порівняти інтенсивність Т-клітинної відповіді, індукованої ТОМАР, і таким чином дозволяє зробити важливий висновок відносно здатності вакцини викликати протипухлинну відповідь. По-друге, вони виконують функцію важливих пептидів позитивного контролю, отриманих з «не-свого» антигену, у випадку, якщо у пацієнта не спостерігаються жодні вакцино-індуковані Т-клітинні відповіді на ТОМАР, отримані зі «своїх» власних антигенів пацієнта. І по-третє, воно дозволяє зробити висновки щодо стану імунокомпетентності пацієнта.
ТОМАР для «сховища» ідентифікуються за допомогою підходу інтегрованої функціональної геноміки, що поєднує аналіз генної експресії, мас-спектрометрію і Т-клітинну імунологію (ХРгезідепіФф). Цей підхід гарантує, що тільки ТОМАР, насправді присутні у великому відсотку пухлин, але не взагалі неекспресовані або лише мінімально експресовані на нормальних тканинах, будуть вибрані для подальшого аналізу. Для первинного вибору пептидів зразки ХЛЛ пацієнтів і зразки крові від здорових донорів аналізували з використанням поетапного підходу: 1. НІ А-ліганди зі злоякісного матеріалу ідентифікували методом мас-спектрометрії. 2. Аналіз експресії інформаційної рибонуклеїнової кислоти (ІРНК) в усьому геномі використовували для ідентифікації генів, що надмірно експресовані у злоякісній тканині (ХЛЛ) у порівнянні з рядом нормальних органів і тканин 3. Ідентифіковані НІ А-ліганди порівнювали з даними генної експресії. Пептиди, надмірно або селективно презентовані на пухлінній тканині, переважно такі, що кодуються селективно експресованими або надмірно-експресованими генами, як було визначено на етапі 2, вважали прийнятними ТОМАР-кандидатами для включення до складу мультипептидної вакцини. 4. Пошук літератури був проведений для ідентифікації додаткових свідоцтв, що підтверджують доречність використання ідентифікованих пептидів як ТОМАР. 5. Доречність надмірної експресії на рівні ІРНК була підтверджена повторним виявленням
Зо вибраних ТОМАР етапу З на пухлинній тканині і їх відсутністю (або рідким виявленням) на здорових тканинах. 6. Для оцінки того, чи є здійсненною індукція вибраними пептидами Т-клітинної відповіді іп мімо, був проведений аналіз імуногенності іп міго з використанням Т-клітин людини, отриманих від здорових донорів, а також від пацієнтів, хворих на ХЛЛ.
В одному з аспектів пептиди проходять попередній скринінг на імуногенність перед тим, як їх включать до «сховища». Як приклад, що не має обмежувального значення, імуногенність пептидів, доданих до «сховища», визначають методом, що включає примування Т-клітин іп міго шляхом повторних стимуляцій СО8- Т-клітин від здорових донорів клітинами, що презентують штучний антиген, навантаженими комплексами пептид/МНе і антитілами проти СО28.
Цей метод є переважним для видів раку, що рідко спостерігаються, і для пацієнтів з рідкісними профілями експресії. На відміну від мультипептидних коктейлів зі сталим складом, які у даний час вже розроблені, «сховище» дозволяє забезпечити значно кращий збіг з вакциною реальної експресії антигенів у пухлині. Вибрані «готові для застосування» індивідуальні пептиди або комбінації декількох пептидів будуть використані для кожного пацієнта у багатоцільовому підході. Теоретично, підхід, який базується на виборі, наприклад, 5 різних антигенних пептидів із бібліотеки з 50 пептидів, вже мав би привести приблизно до 17 мільйонів можливих складів лікарських препаратів (ЛП).
В одному варіанті винаходу пептиди вибираються для включення до складу вакцини на основі їхньої прийнятності для конкретного пацієнта на основі способу за цим винаходом як вже описано в цьому документі або як викладено нижче.
З матеріалу пухлини і зразків крові пацієнта будуть зібрані дані щодо фенотипу НГА, транскриптомного і пептидомного аналізу з метою ідентифікувати найбільш прийнятні для кожного пацієнта пептиди «сховища» і унікальні для пацієнта (тобто мутовані) ТОМАР. Будуть вибрані ті пептиди, які селективно або надмірно експресуються в пухлинах пацієнтів і, де можливо, демонструють сильну імуногенність іп мйго, якщо вони були досліджені на зразках
МКПК індивідуальних пацієнтів.
Переважно, пептиди, що входять до складу вакцини, ідентифіковані методом, що включає: (а) ідентифікацію пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від конкретного пацієнта; (б) порівняння пептидів, ідентифікованих в (а), зі сховищем (базою бо даних) пептидів як зазначено вище; і (в) вибір принаймні одного пептиду зі сховища (бази даних), який корелює з пухлино-асоційованим пептидом, ідентифікованим у пацієнта.
Наприклад, ТОМАР, які презентуються зразком пухлини, ідентифікуються за допомогою: (а1) порівняння даних експресії зі зразка пухлини з даними експресії зі зразка нормальної тканини, що відповідає типу тканини зразка пухлини, для ідентифікації білків, які надмірно експресуються або аберантно експресуються у зразку пухлини; і (а2) проведення кореляції даних експресії з послідовностями лігандів МНС, зв'язаних із молекулою МНС І класу і (або) ІІ класу, в зразку пухлини для ідентифікації лігандів МНС, отриманих із білків, що надмірно експресуються або аберантно експресуються пухлиною. Переважно, послідовності лігандів МНС ідентифікуються елююванням зв'язаних пептидів із їхніх комплексів із молекулами МНС, виділених із зразка пухлини, і секвенуванням елюйованих лігандів. Переважно, зразок пухлини і нормальна тканина отримані від того самого пацієнта.
На додаток до (або як альтернатива йому) вибору пептидів з використанням моделі «сховища», ТОМАР можуть бути ідентифіковані у пацієнта де помо і потім введені до складу вакцини. Як один приклад, ТОМАР-кандидати можуть бути ідентифіковані у пацієнта шляхом (а1ї) порівняння даних експресії зі зразка пухлини з даними експресії зі зразка нормальної тканини, що відповідає типу тканини зразка пухлини, для ідентифікації білків, які надмірно експресуються або аберантно експресуються у зразку пухлини; і (а2) проведення кореляції даних експресії з послідовностями лігандів МНС, зв'язаних із молекулою МНС І класу і (або) ЇЇ класу, в зразку пухлини для ідентифікації лігандів МНС, отриманих із білків, що надмірно експресуються або аберантно експресуються пухлиною. Як інший приклад, білки можуть бути ідентифіковані як такі, що містять мутації, які є унікальними для зразка пухлини, по відношенню до відповідної нормальної тканини конкретного пацієнта, а ТОМАР можуть бути ідентифіковані як такі, що специфічно націлені на цю мутацію. Наприклад, геном пухлинної клітини і геном клітин відповідної нормальної тканини можливо секвенувати методом повногеномного секвенування: для викриття несинонімічних мутацій у білок-кодуючій ділянці генів геномні ДНК і
РНК екстрагують із пухлинних тканин, а нормальну немутовану геномну ДНК лінії зародкових клітин екстрагували з мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК). Використаний метод секвенування нового покоління (МО5) зводиться до повторного секвенування білок-кодуючих ділянок (ресеквенування екзому). З цією метою екзонну ДНК із зразків людини уловлюють за допомогою комплектів збагачення цільовими фрагментами, придбаних у постачальника, з наступним секвенуванням, наприклад, за допомогою Нізед2000 (Шиптіпа). Крім цього, ІРНК пухлинних клітин секвенують для прямого кількісного визначення генної експресії і підтвердження того, що мутовані гени експресуються у пухлинах пацієнтів. Отримані мутації послідовностей зчитування обробляють з використанням програмно-реалізованих алгоритмів.
Таблиця результатів містить мутації і показники генної експресії. Пухлиноспецифічні соматичні мутації визначають шляхом порівняння з варіаціями зародкових ліній, що походять від МКПК, і розміщують у відповідності до пріоритету. Ідентифіковані де помо пептиди можуть згодом бути досліджені на імуногенність як викладено вище для «сховища», а і ТОМАР-кандидати, що мають прийнятну імуногенність, вибирають для включення до складу вакцини.
В одному з прикладів втілень пептиди, що входять до складу вакцини, ідентифікуються таким чином: (а) ідентифікацією пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від конкретного пацієнта описаними вище методами; (б) порівнянням пептидів, ідентифікованих в а), зі сховищем пептидів, які пройшли попередній скринінг на імуногенність і на надмірну експресію у пухлинах у порівнянні з відповідною нормальною тканиною; (в) вибором принаймні одного пептиду зі сховища, який корелює з пухлино-асоційованим пептидом, ідентифікованим у пацієнта, і г) необов'язково, вибором принаймні одного пептиду, ідентифікованого де помо в (а) і підтвердженням його імуногенності.
В одному з прикладів втілень пептиди, що входять до складу вакцини, ідентифікуються таким чином: (а) ідентифікацією пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від конкретного пацієнта; і (б) вибором принаймні одного пептиду, ідентифікованого де помо в (а) і підтвердженням його імуногенності.
Після вибору пептидів для персоналізованої вакцини на основі пептиді виготовляється вакцина. Ця вакцина переважно є рідкою лікарською формою, що складається з окремих пептидів, розчинених у ДМСО концентрацією від 20 до 4095, переважно приблизно від 30 до 3595, такій як приблизно 3395 ДМСО.
Кожен пептид, який належить включити до композиції, розчиняють у ДМСО. Концентрацію розчинів окремих пептидів необхідно вибирати залежно від кількості пептидів, які належить включити до складу продукту. Розчини окремих пептидів у ДМСО змішують у рівних частинах, щоб отримати розчин, який містить усі пептиди, які належить включити до складу продукту, з бо концентрацією 2,5 мг/мл для кожного пептиду. Змішаний розчин потім розводять у співвідношенні 1:3 водою для ін'єкцій з метою досягти концентрацію 0,826 мг/мл для кожного пептиду у 3396 ДМСО. Розведений розчин фільтрують через стерильний фільтр із розміром пор 0,22 мкм. Отримують нерозфасований кінцевий розчин.
Нерозфасований кінцевий розчин розливають по флаконах і зберігають при температурі - 20"С аж до використання. Один флакон вміщує 700 мкл розчину, що містить 0,578 мг кожного пептиду. 500 мкл цього розчину (приблизно 400 мкг кожного пептиду) будуть використані для внутрішньошкірної ін'єкції.
На додаток до можливості використання для лікування раку, пептиди за цим винаходом можуть також використовуватися як діагностичні реактиви. Оскільки пептиди генерувалися з клітин ХЛЛ і оскільки було визначено, що ці пептиди не є присутніми у нормальних тканинах або присутні у низькій кількості, ці пептиди можуть використовуватися для діагностики наявності раку.
Присутність пептидів за цим винаходом на біоптатах тканин у зразках крові може допомогти патоморфологу в діагностуванні раку. Виявлення певних пептидів за допомогою антитіл, мас- спектрометрії або інших методів, відомих фахівцям у цій галузі, може надати патоморфологу інформацію, чи є тканина зразка злоякісною або запаленою або взагалі ураженою хворобою, або може використовуватися як біомаркер ХЛЛ. Наявність груп пептидів може дозволити віднести хворі тканини до певного класу чи підкласу.
Виявлення пептидів на зразках хворої тканини дає можливість прийняти рішення відносно користі від методів лікування за участю імунної системи, особливо якщо відомо або передбачається, що Т-лімфоцити причетні до механізму дії. Втрата експресії МНС є добре відомим механізмом, за яким інфіковані або злоякісні клітини уникають імунного контролю.
Отже, наявність пептидів свідчить про те, що цей механізм не використовується клітинами, що аналізуються.
Пептиди за цим винаходом можливо використовувати для аналізу відповіді лімфоцитів на дію таких пептидів, такої як реакція Т-клітин або відповідь антитіл на пептид або комплекс пептиду і молекул МНС. Ці відповіді лімфоцитів можливо використовувати як прогностичні маркери для прийняття рішень щодо наступних терапевтичних дій. Ці відповіді можна також використовувати як сурогатні маркери в імунотерапевтичних підходах, що мають на меті
Зо викликати відповіді лімфоцитів у різний спосіб, наприклад, вакцинацією білками, нуклеїновими кислотами, аутологічними матеріалами, адоптивним перенесенням лімфоцитів. В закладах, де застосовують генну терапію, для оцінки побічних ефектів рекомендується проаналізувати реакції лімфоцитів на пептиди. Моніторинг реакцій лімфоцитів може також бути цінним інструментом під час обстеження при подальшому спостереженні після трансплантації, наприклад, для виявлення реакцій «трансплантат проти хазяїна» та «хазяїн проти трансплантата».
Цей винахід буде проілюстрований наведеними нижче прикладами, які описують його переважні втілення, з посиланнями на супроводжувальні фігури, але не обмежуються наведеними тут. Для цілей цього винаходу всі цитовані джерела включені в цей документ шляхом посилання в усій повноті.
ФІГУРИ
На Фігурах 1А - М показана надмірна презентація різних пептидів у нормальних тканинах (білі стовпчики) і тканинах ХЛЛ (чорні стовпчики). Фігура 1А) Ген: ІСНМ, пептид: А НЕРОМУМІ. (ЗЕО ІО МО.: 2). Тканини зліва направо: 2 жирові тканини, З надниркові залози, 4 зразки клітин крові, 10 кровоносних судин, 6 кісткових мозків, 7 головних мозків, б молочних залоз, 2 хрящі, 2ока, З жовчних міхури, б сердець, 14 нирок, 19 товстих кишок, 20 печінок, 45 легенів, б лімфатичних вузлів, 7 нервів, З яєчника, 10 підшлункових залоз, З паращитоподібні залози, 1 очеревина, 5 гіпофізів, б плацент, З плеври, З передміхурові залози, 7 слинних залоз, 5 скелетних м'язів, 6 зразків шкіри, 4 тонкі кишки, 9 селезінок, 5 шлунків, 6 сім'яників, 2 тимуси,
З щитоподібні залози, 9 трахей, З сечоводи, 6 сечових міхурів, 2 матки, 6 стравоходів, 17 зразків хронічного лімфоцитарного лейкозу. Цей пептид був додатково виявлений у 2 із 21 зразка неходжкінської лімфоми. Фігура 18) Ген: ІСНМ, пептид: МАЕ РРКМ (ЗЕО ІО МО.: 3). Тканини зліва направо: 2 жирові тканини, З надниркові залози, 4 зразки клітин крові, 10 кровоносних судин, 6 кісткових мозків, 7 головних мозків, б молочних залоз, 2 хрящі, 2 ока, З жовчних міхури, б сердець, 14 нирок, 19 товстих кишок, 20 печінок, 45 легенів, б лімфатичних вузлів, 7 нервів,
З'яєчника, 10 підшлункових залоз, З паращитоподібні залози, 1 очеревина, 5 гіпофізів, б плацент, З плеври, З передміхурові залози, 7 слинних залоз, 5 скелетних м'язів, 6 зразків шкіри, 4 тонкі кишки, 9 селезінок, 5 шлунків, б сім'яників, 2 тимуси, З щитоподібні залози, 9 трахей, З сечоводи, б сечових міхурів, 2 матки, 6 стравоходів, 17 зразків хронічного бо лімфоцитарного лейкозу. Цей пептид був додатково виявлений у 5 із 21 зразка неходжкінської лімфоми і у 1 із 90 зразків раку легенів. Фігура 1С) Ген: ІСНМ, пептид: МАЕГРРКМУ5М (ЗЕО І
Мо.: 4), тканини зліва направо: 2 жирові тканини, З надниркові залози, 4 зразки клітин крові, 10 кровоносних судин, 6 кісткових мозків, 7 головних мозків, б молочних залоз, 2 хрящі, 2 ока,
З жовчних міхури, 6 сердець, 14 нирок, 19 товстих кишок, 20 печінок, 45 легенів, 6 лімфатичних вузлів, 7 нервів, З яєчника, 10 підшлункових залоз, З паращитоподібні залози, 1 очеревина, 5 гіпофізів, б плацент, З плеври, З передміхурові залози, 7 слинних залоз, 5 скелетних м'язів, б зразків шкіри, 4 тонкі кишки, 9 селезінок, 5 шлунків, б сім'яників, 2 тимуси, З щитоподібні залози, 9 трахей, З сечоводи, 6 сечових міхурів, 2 матки, 6 стравоходів, 17 зразків хронічного лімфоцитарного лейкозу. Фігура 10) Ген: МОР210, пептид: КІ МЕЇІТПІЕМ (5ЕО ІО Мо.: 121). Зразки зліва направо: 1 культура МКПК, 1 доброякісна передміхурова залоза, 8 нормальних тканин (З легені, 4 селезінки, 1 трахея), 49 ракових тканин (2 раки головного мозку, 2 раки молочної залози, 1 рак товстої кишки, 13 раків лейкоцитів, 13 раків легенів, 8 раків лімфатичних вузлів, 1 рак мієлоїдних клітин, 4 раки яєчника, 2 раки шкіри, 1 рак сечового міхура, 2 раки матки).
Розбіжність між списками видів пухлин на Фігурі1О і у таблиці4 можна пояснити більш суворими критеріями вибору, застосованими щодо таблиці 4 (докладну інформацію див. у таблиці 4). Панель досліджених нормальних тканин і ліній ракових клітин і ксенотрансплантатів були такими самими, як на Фігурах Т1А-С. Фігура 1Е), Ген: СОВКАТ, пептид: АГІ КІ І РОЇ. (5ЕО І
Мо.: 14). Зразки зліва направо: 1 лінія клітин, 11 ракових тканин (1 рак молочної залози, 1 рак товстої кишки, 1 рак голови та шиї, 2 раки лейкоцитів, 1 рак печінки, 1 рак легенів, 2 раки лімфатичних вузлів, 1 рак мієлоїдних клітин, 1 рак шкіри). Фігура 1Р), Ген: КІААО226Ї,, пептид:
СПОС5РКЕГ (ЗЕО ІО Мо.: 62). Зразки зліва направо: 2 нормальні тканини (1 лімфатичний вузол, 1 селезінка), 18 ракових тканин (2 раки товстої кишки, 9 раків лейкоцитів, 6 раків лімфатичних вузлів, 1 рак прямої кишки). Фігура 1С), Ген: ООХЗХ, пептид: СІ ЮООРБАСІ ОЇ (5ЕО ІО Мо.: 68).
Зразки зліва направо: 1 лінія клітин, 2 первинні культури, 21 ракова тканина (1 рак жовчних протоків, 1 рак головного мозку, 1 рак молочної залози, 1 рак голови та шиї, 2 раки нирки, З раки лейкоцитів, 2 раки печінки, 2 раки легенів, 2 раки лімфатичних вузлів, З раки яєчника, 1 рак прямої кишки, 1 рак шкіри, 1 рак матки). Фігура 1Н), Ген: ГІС1, пептид: КТ ОМОАТТУЕЇ (ЗЕО І
Мо.: 112). Зразки зліва направо: 2 лінії клітин, 1 первинні культура, 13 ракових тканин (1 рак стравоходу, 2 раки лейкоцитів, 1 рак печінки, З раки легенів, 2 раки лімфатичних вузлів, 2 раки
Зо яєчника, 1 рак шкіри, 1 рак матки). Фігура 1І), Ген: ЗМСНОТ, пептид: ЗНЕСРІЇКІ (5ЕО ІО Мо.: 146). Зразки зліва направо: 14 ракових тканин (1 рак голови та шиї, З раки лейкоцитів, 6 раків легенів, 1 рак лімфатичних вузлів, 1 рак яєчника, 2 раки сечового міхура). Фігура 1), Ген:
ММ522І, пептид: БІГЕТМАТІ (5ЕО ІЮ Мо.: 147). Зразки зліва направо: 1 первинна культура, 11 ракових тканин (1 рак товстої кишки, 4 раки лейкоцитів, 1 рак легенів, З раки лімфатичних вузлів, 1 рак мієлоїдних клітин, 1 рак шкіри). Фігура 1К), Ген: ЕСКІ 3, пептид: БІГ АБ ННМІ. (5ЕО
ІО Мо.: 153). Зразки зліва направо: 1 лінія клітин, 9 нормальних тканин (1 лімфатичний вузол, 1 пряма кишка, 7 селезінок), 27 ракових тканин (1 рак молочної залози, 1 рак нирки, 10 раків лейкоцитів, 14 раків лімфатичних вузлів, 1 рак шкіри). Фігура 1), Ген: ЕБАМ126А, пептид:
ЗІ ОБЕКИММ (ЗЕО ІО Мо.: 159). Зразки зліва направо: 2 лінії клітин, 23 ракові тканини (5 раків головного мозку, 1 рак молочної залози, 1 рак стравоходу, З раки голови та шиї, 2 раки лейкоцитів, 5 раків легенів, З раки лімфатичних вузлів, 1 рак шкіри, 2 раки сечового міхура).
Фігура ІМ), Ген: НМАКМРС, пептид: ЗМНКОБАРМ (5ЕБО ІЮО Мо.: 164). Зразки зліва направо: 10 ліній клітин, 1 первинна культура, 1 нормальна тканина (1 надниркова залоза), 36 ракових тканин (12 раків головного мозку, 1 рак товстої кишки, 2 раки голови та шиї, 2 раки нирки, З раки лейкоцитів, 1 рак печінки, 5 раків легенів, 1 рак мієлоїдних клітин, 1 рак яєчника, 1 рак прямої кишки, 1 рак шкіри, 2 раки шлунка, 2 раки сечового міхура, 2 раки матки). Фігура 1М), Ген:
КАБОКЕ1, пептид: ТІ ОТ5КІ ММ (5ЕБО ІЮ Мо.: 167). Зразки зліва направо: 13 ракових тканин (Ірак головного мозку, 8 раків лейкоцитів, 4 раки лімфатичних вузлів). Фігура 10), Ген:
КАБОКЕ1, пептид: М 0ОБЕММ (5ЕО ІЮО Мо.: 168). Зразки зліва направо: 16 ракових тканин (10 раків лейкоцитів, 6 раків лімфатичних вузлів). Фігура 1Р), Ген: ЕМЕ213, пептид: МОЄЕМСТІ І. (ЗЕО ІО Мо.: 192). Зразки зліва направо: 2 лінії клітин, 18 ракових тканин (1 рак товстої кишки, 1 рак голови та шиї, 1 рак нирки, 4 раки лейкоцитів, 5 раків легенів, З раки лімфатичних вузлів, 1 рак мієлоїдних клітин, 1 рак шлунка, 1 рак сечового міхура). Фігура 10), Ген: ОСК, пептид:
МГОЄБМРІСТІ. (5ЕО ІО Мо.: 197). Зразки зліва направо: 11 ракових тканин (5 раків лейкоцитів, 4 раки лімфатичних вузлів, 71 рак шкіри, 1 рак матки). Фігура 1К), Ген: ЕЇІЕЗН, пептид:
УМЕЕЕМРІМІ (5ЕБЕО ІО Мо. 200). Зразки зліва направо: 4 лінії клітин, 2 первинні культури, 34 ракові тканини (1 рак жовчних протоків, 2 раки молочної залози, 1 рак товстої кишки, 1 рак стравоходу, 1 рак жовчного міхура, 5 раків голови та шиї, 2 раки лейкоцитів, 2 раки печінки, 9 раків легенів, 4 раки лімфатичних вузлів, 2 раки яєчника, 1 рак прямої кишки, 2 раки шкіри, 60 1 рак сечового міхура). Фігура 15), Ген: ОВІ СРІ, пептид: ГІОМКРІ СМ (5ЕО ІО Мо.: 211). Зразки зліва направо: З лінії клітин, 23 ракові тканини (5 раків головного мозку, 1 рак молочної залози, 1 рак стравоходу, 1 рак голови та шиї, 1 рак нирки, З раки лейкоцитів, 2 раки печінки, 2 раки легенів, 4 раки лімфатичних вузлів, 1 рак яєчника, 1 рак передміхурової залози, 1 рак шкіри).
Фігура 17), Ген: ТМСОб, пептид: ОГІ РМЗБМММБЗМ (ЗЕБЕО ІЮ Мо. 256). Зразки зліва направо: 2 первинні культури, 13 ракових тканин (2 раки голови та шиї, З раки лейкоцитів, 1 рак печінки, 2 раки легенів, 4 раки лімфатичних вузлів, 1 рак яєчника). Фігура 103), Ген: МУО10, пептид:
ГСММ5ТОРТІ (5ЕБЕО ІО Мо. 312). Зразки зліва направо: 1 лінія клітин, 2 первинні культури, 14 ракових тканин (1 рак товстої кишки, 4 раки лейкоцитів, 2 раки легенів, 5 раків лімфатичних вузлів, 1 рак яєчника, 1 рак сечового міхура). Фігура 1М), Ген: РІМІ, пептид: МЕ СРОЕТАБЕЇІНІ. (ЗЕО ІО Мо.: 328). Зразки зліва направо: З первинні культури, 27 ракових тканин (1 рак молочної залози, 1 рак товстої кишки, 5 раків лейкоцитів, 5 раків легенів, 7 раків лімфатичних вузлів, 2 раки яєчника, 2 раки шкіри, 1 рак шлунка, З раки сечового міхура).
На Фігурах 2А - О показані типові профілі експресії вихідних генів за цим винаходом, які дуже надмірно або виключно експресуються при ХЛЛ, у панелі нормальних тканин (білі стовпчики) і у 17 зразках ХЛЛ (чорні стовпчики). Тканини зліва направо: 6 артерій, 1 зразок клітин крові, 71 головний мозок, 1 серце, 2 печінки, 2 легені, 2 вени, 1 жирова тканина, 1 надниркова залоза, 6 кісткових мозків, 1 хрящ, 1 товста кишка, 1 стравохід, 2 ока, 2 жовчних міхури, 1 нирка, б лімфатичних вузлів, 5 підшлункових залоз, 2 гіпофізи, 1 пряма кишка, 1 слинна залоза, 1 скелетний м'яз, 1 шкіра, 1 тонка кишка, 1 селезінка, 1 шлунок, 1 щитоподібна залоза, 7 трахей, 1 сечовий міхур,! молочна залоза, 5 яєчників, З плаценти, 1 передміхурова залоза, 1 сім'яник, 1 тимус, 1 матка, 10 зразків хронічного лімфоцитарного лейкозу. Фігура 2А)
Символ гена: ЕСЕК2; Фігура 28) Символ гена: КІААО226І: Фігура 2С) Символ гена: РАХ5Б;
Фігура 20) Символ гена: СІ ЕС17А.
На Фігурі З показані типові дані дослідження імуногенності: результати проточної цитометрії після пептид-специфічного мультимерного забарвлювання. СО8-позитивні Т-клітини були примовані з використанням штучних АПК, навантажених моноклональними антитілами проти с028 їі НІ А-А"02 у комплексі з пептидом з послідовністю 5ед ІЮ Мо 1 (С, ліва панель), зедіЮ Мо 5 (ФО, ліва панель), ЗедіЮ Мо 32 (Е, ліва панель) і ЗедіЮ Мо 220 (Е, ліва панель), відповідно.
Після трьох циклів стимуляції були проведене визначення клітин, що реагують із пептидом, за
Зо допомогою подвійного забарвлювання мультимерів з А"02/зедію Мо 1 (С), А"02/5ед4ІЮ Мо 5 (0),
А"02/56е9ІЮ Мо 32 (Е) або А"02/5едіЮ Мо 220 (Р). На правих панелях (С, 0, Е ї РЕ) показане контрольне забарвлення клітин, стимульованих невідповідними комплексами А"02/пептид.
Проводили «гейтування» життєздатних поодиноких клітин на належність до СО8-- лімфоцитів.
Булеві гейтування допомогли виключити хибнопозитивні відповіді, виявлені за допомогою мультимерів, специфічних до різних пептидів. Наведені частоти виявлення специфічних мультимер-позитивних клітин серед СО8-- лімфоцитів.
ПРИКЛАДИ
ПРИКЛАД 1
Ідентифікація і кількісне визначення рівнів пухлино-асоційованих пептидів, презентованих на поверхні клітин
Зразки тканин
Зразки тканин пухлин пацієнтів були отримані з: РгоїеосСепех Іпс. (Калвер Сіті, Каліфорнія,
США); лікарні Університету Бонна (Бонн, Німеччина); лікарні Університету Тюбінгена (Тюбінген,
Німеччина).
Нормальні тканини були отримані з Авіегапа (Детройт, Мічиган, США і Ройстон,
Хартфордшир, Велика Британія); Віо-Орійпв Іпс. (Брі, Каліфорнія, США); Віозегме (Белтевілл,
Меріленд, США); Сарйа! Віобзсіепсе Іпс. (Роквілл, Меріленд, США); Сепеїсіві Іпс. (Глендейл,
Каліфорнія, США); Медичного університету префектури Кіото (КРИМ) (Кіото, Японія);
Ргоїеосепех Іпс. (Калвер Сіті, Каліфорнія, США); Тізвце ЗоЇІшіоп5 Ца (Глазго, Велика Британія); лікарні Університету Женеви (Женева, Швейцарія); лікарні Університету Гейдельберга (Гейдельберг, Німеччина); лікарні Університету Мюнхена (Мюнхен, Німеччина); лікарні
Університету Тюбінгена (Тюбінген, Німеччина).
До хірургічного видалення тканин або аутопсії була одержана письмова інформована згода від усіх пацієнтів. Тканини були заморожені шоковим способом безпосередньо після вирізування та зберігались до виділення ТОМАР при температурі -707С або нижче.
Виділення пептидів НГА із зразків тканин
Пули пептидів НГА із заморожених шоковим способом зразків тканин були одержані імунним осадженням із твердих тканин відповідно до незначно зміненого протоколу (гаїК еї аї., 1991; зЗеедег єї а!Ї., 1999) з використанням НІ А-А"02-специфічного антитіла ВВ7.2, використанням бо НІА-А, -В, С-специфічного антитіла УМУб/32, використанням СМВг-активованої сефарози,
кислотної обробки та ультрафільтрації.
Аналіз методом мас-спектрометрії
Одержані пули пептидів НІГА розділялися відповідно до їхньої гідрофобності із використанням зворотно-фазної хроматографії (папоАсдийу ШРІС зуєїет, УмМаїегв), та елюйовані пептиди були проаналізовані на гібридному мас-спектрометрі ГТО-уєЇо5 (ТпегптоЕїПІесігоп) з джерелом іонів типу електроспрей (Е5І). Пептидні пули були завантажені безпосередньо на аналітичну мікрокапілярну колонку з плавленого кварцу (7/5 мкм в. д.х 250 мм), заповнену зворотно-фазним сорбентом С18 розміром 1,7 мкм (Умаїег5), із застосуванням швидкості потоку 400 нл на хвилину. Згодом пептиди були розділені з використанням двоетапного 180-хвилинного бінарного градієнту з 1095 до 3395 розчинника В при швидкості потоку 300 нл на хвилину. Градієнт був забезпечений розчинником А (0,195 мурашиної кислоті у воді) та розчинником В (0,195 мурашиної кислоті в ацетонітрилі). Був використаний скляний капіляр із золотим покриттям (РісоТір, Мем ОБіесіїме) для введення в джерело іонів нано-ЕБ5І. Мас-спектрометри ГТО-Огрігар працювали в інформаційно-залежному режимі з використанням стратегії ТОР5. Стисло, цикл сканування був ініційований з повним скануванням при високій точності маси на Огрйгар (К - 30 000) з наступними сканами МС/МС також на Огрйгар (К - 7500) на 5 найбільш поширених прекурсорних іонах з динамічним виключенням раніше вибраних іонів. Тандемні мас-спектри були інтерпретовані програмою
ЗЕОШЕЗТ з додатковим контролем в ручному режимі. Ідентифікована пептидна послідовність була підтверджена порівнянням генерованої моделі фрагментації природного пептиду з моделлю фрагментації синтетичного контрольного пептиду з ідентичною послідовністю.
Відносне кількісне визначення на основі даних РХ-МС без використання ізотопної мітки здійснювалось підрахунком іонів, тобто екстракцією і аналізом компонентів РХ-МС (Миеїег еї аї., 2007). Цей метод базується на припущенні, що площі піків РХ-МС сигналів пептиду корелюють з його кількістю у зразку. Екстраговані компоненти були потім піддані обробці методами деконволюції за зарядовими станами і вирівнювання часу утримання (Миеїег еї аї., 2008; 5їШтт еї а!., 2008). Нарешті, компоненти РХ-МС були піддані обробці методом перехресних посилань з результатами ідентифікації послідовностей з метою об'єднати кількісні дані різних зразків і тканин у профілі презентації пептидів. Кількісні дані пройшли двоярусну нормалізацію відповідно до основної тенденції, з урахуванням варіабельності технічних і біологічних повторних вимірів. Отже, кожний ідентифікований пептид можна зв'язати з кількісними даними, що дозволяє провести відносний кількісний аналіз між зразками і тканинами. Крім того, усі кількісні дані, отримані для пептидів-кандидатів, були перевірені вручну для забезпечення погодженості даних і перевірки точності автоматичного аналізу. Профілі презентації були розраховані для кожного пептиду, які дозволяють оцінити середній рівень презентації у зразку, а також варіацію повторних вимірювань. Профіль зіставляє зразки ХЛЛ з фоновим рівнем зразків нормальних тканин. Профілі презентації типових надмірно презентованих пептидів показані на
Фігурі 1. Показники презентації типових пептидів наведені у Таблиці 8.
Таблиця 8. Показники презентації. У таблиці наведений перелік пептидів, які надзвичайно надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (ж), в значній мірі надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (їі або надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (Ж). У склад панелі нормальних тканин, які вважалися відповідними для порівняння з пухлинами, входили: жирова тканина, надниркова залоза, клітини крові, кровоносна судина, кістковий мозок, головний мозок, молочна залоза, стравохід, око, жовчний міхур, серце, нирка, товста кишка, печінка, легеня, лімфатичний вузол, нерв, підшлункова залоза, паращитоподібна залоза, очеревина, гіпофіз, плевра, слинна залоза, скелетний м'яз, шкіра, тонка кишка, селезінка, шлунок, тимус, щитоподібна залоза, трахея, сечовід, сечовий міхур. 7111116 ФАТІЕОЮМТІ 7 Ї7111111111сян11СсС2С 11110811 ФАААБАЇРАІМГ/Г/Г////777777/Ї771111111171сяні11сСсС2С 10118 ФАСОТШТМ1171Ї111111111111ян111С2
11160 |РМЮНЕОСІМ 7 Її 711111 н)-Н 1.66 |ЗАССІШЮЮМКАЇ 777777 Ї77777771717171717171ся-н1 11.68 |СШООРАСІОЇ 77777777 Ї7777777117171717171ся-ні11 111.69 |СІНОВЕ 717 11111111
111180 |ЇМШЕОЕЕЕЄ 7 Ї7777111171717171711ся-н11 1111186 |НШУРОАМИЇ 7/1 1117898 МвБетРоє 7 11111111 ян 11180 |МАВІСНШАМ 7 Ї1111111111ся-ні11 11186 МшоКТВМ 71111111 11111111 111288 ІЗШКУМ 11171111 11189 ЙШЕНВМАЄ 71111111
ПРИКЛАД 2
Профілі експресії генів, що кодують пептиди за винаходом
Надмірна презентація або специфічна презентація пептиду пухлинних клітинах у порівнянні з нормальними клітинами є достатньою для можливості його використання в імунотерапії, а деякі пептиди є пухлино-специфічними незважаючи на те, що їхній вихідний білок зустрічається також у нормальних тканинах. Все ж, отримання профілю експресії ІРНК додає додатковий рівень безпеки у виборі пептидних мішеней для імунотерапії. Це особливо важливо для варіантів терапії з високим ризиком для безпеки, таких як ТКР із дозрілою афінністю, де ідеальний пептид буде отриманий з білка, унікального для пухлини і який не виявлений у нормальних тканинах.
Джерела та приготування РНК
Зразки тканин, видалені хірургічним шляхом, були придбані у зазначених вище джерел (див.
Приклад 1) після одержання письмової інформованої згоди від кожного пацієнта. Зразки пухлинної тканини були миттєво заморожені в рідкому азоті безпосередньо після хірургічної операції та пізніше гомогенізовані з використанням ступки та товкача під рідким азотом.
Тотальна РНК була приготована з цих зразків з використанням реактиву ТКІ (Атріоп,
Дармштадт, Німеччина), з наступним очищенням за допомогою КМеазу (ОІАСЕМ, Хільден,
Німеччина); обидві методики виконувались за протоколом виробника.
Тотальну РНК із здорових тканин людини для експериментів із секвенування РНК отримували із таких джерел:
Азіегапа (Детройт, Мічиган, США і Ройстон, Хартфордшир, Велика Британія); ВіоСаї єтрн (Гейдельберг, Німеччина); Віобегме (Белтсвілл, Меріленд, США); Сепеїїсібї Іпс. (Глендейл,
Каліфорнія, США); інститут ІЗЇйШОо Маіопаіе Титогі «РазсаЇе» (Неаполь, Італія); Ргоїеосбсепех
Іпс. (Калвер Сіті, Каліфорнія, США); лікарня Університету Гейдельберга (Гейдельберг,
Німеччина).
Тотальну РНК із пухлинних тканин людини для експериментів із секвенування РНК отримували із таких джерел: Тіззце БоЇшіоп5 Ча (Глазго, Велика Британія); лікарні Університету
Бонна (Бонн, Німеччина).
Зо Якість та кількість усіх зразків РНК були оцінені на біоаналізаторі Адіїепі 2100 (Адіепі,
Вальдброн, Німеччина), з використанням комплекту ЕМА 6000 Рісо І арсСпір Кії (АдіїепО).
Експерименти з секвенування РНК
Аналіз генної експресії зразків РНК пухлинних і нормальних тканин був виконаний за методикою секвенування «наступного покоління» (КЕМАзед) компанією Сесбат (Тюбінген,
Німеччина). Стисло, бібліотеки секвенування готують з використанням набору реагентів Шитіпа
Нізед м4 відповідно до протоколу виробника (Шитіпа Іпс, Сан-Дієго, Каліфорнія, США), який включає РНК- фрагментацію, конверсію у кДНК і додавання адаптерів секвенування. Бібліотеки, отримані із багатьох зразків, змішували у еквімолярних співвідношеннях і секвенували на секвенаторі Шитіпа Нібед 2500 відповідно до інструкцій виробника, виконуючи зчитування
БОп.н. з одного кінця. Оброблені зчитування картували на геном людини (ОКСП38) з використанням програми 5ТАК. Дані з експресії отримані на рівні транскриптів у вигляді КРКМ (кількість зчитувань на кілобазу, у перерахунку на мільйон картованих зчитувань, отримана за допомогою програми СийіпК5) і на рівні екзонів (загальна кількість зчитувань, отримана за допомогою програми Весдійооі5), на основі ідентифікації за базою даних епзетрі щодо послідовностей (Епзетбрі/7). Зчитування за екзонами нормалізують за довжиною екзону і розміром вирівнювання для отримання значень КРКМ. Типові профілі експресії вихідних генів цього винаходу, які в значній мірі надмірно або виключно експресуються при ХЛЛ, показані на
Фігурі 3. Показники презентації додаткових типових генів наведені у Таблиці 9.
Таблиця 9. Показники презентації У таблиці наведений перелік пептидів, які отримані з генів, що надзвичайно надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (ї-ї), в значній мірі надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (їж) або надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (ж). Базовий рівень для цього показника розраховували, виходячи з результатів вимірювань для наступних відповідних нормальних тканин: Базовий рівень для цього показника розраховували, виходячи з результатів вимірювань для наступних відповідних нормальних тканин: жирова тканина, надниркова залоза, артерія, клітини крові, кістковий мозок, головний мозок, хрящ, товста кишка, стравохід, око, жовчний міхур, серце, нирка, печінка, легеня, лімфатичний вузол, підшлункова залоза, гіпофіз, пряма кишка, слинна залоза, скелетний м'яз, шкіра, тонка кишка, селезінка, шлунок, щитоподібна залоза, трахея, сечовий міхур і вена.
У випадку, якщо були наявні дані для декількох зразків одного й того самого типу тканини, для розрахунків використовували середнє арифметичне значення для всіх відповідних зразків.
00009111 ФАСОТИТМ1111111111Ї1111111сняюс71 7771717171И.66 |5ІАССОШЮМКАЇГ///77777777771Ї1111111сня7ссСс2С 11111011861111110 ІНІУРЕАМТІЇГ/////77771111171Ї11111сня1с1 11001960 ПшШоКТяЕМ11111111111111111Ї11111111111сняюс1 1000298 1110 І8ШКУВІМС////11111171Ї111111111сня1
ПРИКЛАД З
Імуногенність Іп міго презентованих МН І класу пептидів
Щоб отримати інформацію стосовно імуногенності ТОМАР за цим винаходом, автори винаходу провели дослідження з використанням примування Т-клітин іп мійго на основі повторної стимуляції СО8- Т-клітин штучними антиген-презентуючими клітинами (штучними
АПК), навантаженими комплексами пептид/МНе і антитілами проти СО28. У такий спосіб була показана імуногенність ТОМАР за цим винаходом, рестриктованих за НІ А-А"О201, що продемонструвало, що ці пептиди є епітопами Т-клітин, проти яких в організмі людини існують попередники СО8-- Т-клітин (Таблиця 10).
Примування СОВ8 я Т-клітин іп міго
Для проведення стимуляцій іп міго штучними антиген-презентуючими клітинами, завантаженими комплексом пептид-МНС (рмМмнНео) та антитілами проти СО28, спочатку були виділені СО8-- Т-клітини зі свіжих продуктів лейкаферезу НІ А-А"02 шляхом позитивного відбору з використанням анти-СО8 мікрогранул (Міпепуї Віоїес, Бергіш-Гладбах, Німеччина) здорових донорів, отриманих із Клініки Університету міста Мангейм, Німеччина, після одержання інформованої згоди.
МКПК і виділені СОв--лімфоцити інкубували аж до використання в Т-клітинному середовищі (ТОМ), що складається з ЕРМІ-СІшатах (Іпийтодеп, Карлсрує, Німеччина) з додаванням 1095 термічно інактивованої АВ-сироватки людини (РАМ-Віоїесі, Ейденбах, Німеччина), 100 Од/мл пеніциліну/100 мкг/мл стрептоміцину (Сатргех, Кельн, Німеччина), 1 мМ пірувату натрію (СС
Рго, Обердорла, Німеччина), 20 мкг/мл гентаміцину (Сатбгех). Цитокіни у концентраціях 2,5 нг/мл ІЛ-7 (РготосСеїЇ, Гейдельберг, Німеччина) та 10 Од/мл ІЛ-2 (Момапів РНагпта,
Ноюрнберг, Німеччина) також додавалися до ТСМ на цьому етапі культивування.
Приготування мікросфер, покритих рМНе і антитілами проти СО28, Т-клітинні стимуляції та зчитування виконувалися у добре вивченій системі іп міго з використанням чотирьох різних молекул рМНеС для кожної стимуляції і 8 різних молекул РМНС для кожної умови зчитування.
Очищені костимулювальні антитіла мишачого ЇдсС2а проти СО28 людини АБ 9.3 (ипа еї аї., 1987) були хімічно біотинільовані за допомогою сульфо-М-гідроксисукцинімідобіотину, як рекомендовано виробником (Регбіо, Бонн, Німеччина). Використовували полістирольні гранули діаметром 5,6 мкм, покриті стрептавідином (Вапоз І арогайогіе5, Іллінойс, США). рМНС, використаними як позитивний і негативний контроль, були А"0201/МІ А-001 (пептид
ЕГАСІСИ ТМ (5ЕО ІО МО. 523) з модифікованого Меїап-А/МАВТ-1) та А"0201/00Х5-001 (У РАЇМНІ з 0ОХ5 (5ЕО ІО МО. 524), відповідно.
В 96-лункові планшети вносили 800 000 мікрогранул/200 мкл у присутності 4х12,5 нг різних біотинільованих комплексів РІМНС, промивали та додавали 600 нг біотинільованих антитіл проти СО28 в об'ємі 200 мкл. Стимуляція була проведена в планшетах на 96 лунок шляхом спільного інкубування 1х109 СО8-- Т-клітин із 2х105 промитих мікрогранул з покриттям у 200 мкл
ТОМ з доданням 5 нг/мл ІЛ-12 (РготосСеїІ) протягом З днів за температури 37"С. Половина середовища була потім замінена свіжим ТОМ з доданням 80 Од/мл ІЛ-2, та інкубування продовжували 4 дні за 37"С. Цей цикл стимуляцій був виконаний загалом три рази. Для зчитування з РМНОС-мультимерів з використанням 8 різних молекул РМНС для кожної умови зчитування застосовувалося двомірне структурне кодування як описано раніше (Апаегзеп 6ї аї., 2012) з невеликими модифікаціями, які стосуються зв'язування з п'ятьма різними флуорохромами. Нарешті, був проведений аналіз мультимерів за допомогою забарвлювання клітин барвником для визначення їхньої життєздатності І іме/Ядеай у ближньому ІК-діапазоні (Іпмігодеп, Карлесрує, Німеччина), клону антитіл СО8-РІТС 5КІ1 (ВО, Гейдельберг, Німеччина) і флуоресцентних РМНОС-мультимерів. Для аналізу використовували цитометр ВО І ЗКІІ БОКР, обладнаний відповідними лазерами і фільтрами. Пептидо-специфічні клітини були розраховані як відсоток від загальної кількості СО8-позитивних клітин. Оцінка результатів мультимерного аналізу була виконана за допомогою комп'ютерної програми Ріомл)о (Тгее Заг, Орегон, США).
Примування іп міго специфічних мультимер-позитивних СО8- лімфоцитів було визначене
Зо порівнянням зі стимуляціями негативних контролів. Імуногенність для даного антигену визначалася, якщо було виявлено, що принаймні одна оцінювана іп міго стимульована лунка одного здорового донора містить специфічні СО8- Т-клітини після стимуляції іп міго (тобто коли ця лунка містила хоча б 195 специфічних мультимер-позитивних серед СОбвя- Т-клітин та відсоток специфічних мультимер-позитивних клітин був принаймні в 10 разів більше медіанного значення стимуляцій відповідних негативних контролів).
Імуногенність іп міго для пептидів у хворих на ХЛЛ
Для перевірених пептидів НГА | класу імуногенність іп міго можна продемонструвати генерацією пептидо-специфічних Т-клітинних ліній. Типові результати цитометрії після ТОМАР- специфічного мультимерного забарвлення для двох пептидів за винаходом показані на Фігурі З, разом із відповідними негативними контролями. Результати для двох пептидів за винаходом зведені у Таблиця 10А, інші результати - у Таблицю 105.
Таблиця 10А. Імуногенність іп міго пептидів НГА І класу за винаходом
Типові результати експериментів по визначенню імуногенності іп міго, проведених подавцем заявки, для пептидів за винаходом. «2095 ---; 2090 -49 Уо--; 5090 -69 Фо-а-; »- 70 Чо
Таблиця 10Б. Імуногенність іп міго додаткових пептидів НГ А класу І за винаходом
Типові результати експериментів по визначенню імуногенності іп мійго , проведених подавцем заявки, для пептидів за винаходом, рестриктованих за НГІА-А"02. Наведені результати експериментів по визначенню імуногенності іп міїго. Відсоткові долі позитивних лунок і донорів (серед оцінюваних) зведені як зазначено: «2095 --; 2095 -49Уо---5 5095 -6990-----к; з- 70 Уб--ь
71117169 (ановЕт 7 Їж 11111086 (НІМРОАМИЇГ/Г//////// Їж 1101196 ПшШоКТЗМ 11!
ПРИКЛАД 4
Синтез пептидів
Усі пептиди були синтезовані стандартним і широко використовуваним методом твердофазного синтезу пептидів за стратегією Етос. Ідентичність і чистоту кожного окремого пептиду визначали методами мас-спектрометрії і аналітичної ЗФ-ВЕРХ. Пептиди одержували у вигляді білих або брудно-білих ліофілізатів (солей фторацетатів) чистотою »5095. Усі ТОМАР переважно вводять у вигляді трифторацетатних солей або ацетатних солей, використання інших солей також можливе.
ПРИКЛАД 5
Аналіз зв'язування з МНС
Пептиди-кандидати для Т-клітинної терапії за цим винаходом були додатково перевірені на здатність зв'язуватися з МНС (афінність). Окремі комплекси пептид-МНСО були отримані УФф- індукованим обміном лігандів, за якого УФ-чутливі пептиди розщеплюються під дією Уф- випромінювання, і аналізується продукт обміну з пептидом, що вивчається. Тільки пептиди- кандидати, які здатні ефективно зв'язуватися з пептид-сприйнятливими молекулами МНС і стабілізувати їх, попереджають дисоціацію комплексів із МНС. Для визначення виходу реакції обміну проводили аналіз методом ЕЇІ5А на основі виявлення легких ланцюгів (В2т) стабілізованих комплексів із МНС. Аналіз проводили згідно з загальним описом у роботі
Кодепко і співавт. (Кодепко еї а!., 2006). 9б-лункові планшети МАХІЗогр (МОМС) були покриті протягом ночі розчином 2 мкг/мл стрептавідину у РВЗ при кімнатній температурі, 4 рази промиті і блоковані протягом 1 год. при 37"Сб у 295 розчині БСА, що містить блокувальний буфер. Ренатуровані мономери НІіА-
А"02:01/МІ А-001 використовувались як стандарти, охоплюючи діапазон 15-500 нг/мл.
Мономерні комплекси пептид-МНСОС, продукти реакції обміну, що протікає під дією Уф-
випромінювання, розводили у 100 разів у блокувальному буфері. Зразки інкубували протягом 1 год за температури 37"С, промивали чотири рази, інкубували з 2 мкг/мл кон'югованих із пероксидазою хріну антитіл проти В2т протягом 1 год. за температури 37"С, знову промивали і визначали з розчином ТМБ, реакцію зупиняли за допомогою МНаг5О». Поглинання вимірювали при 450 нм Пептиди-кандидати, що демонстрували високий вихід реакції обміну (переважно вище 5095, найбільш переважно вище 7595) є зазвичай переважними для синтезу і продукції антитіл або їх фрагментів і (або) рецепторів Т-клітин або їх фрагментів, оскільки вони показують достатню авідність до молекул МНС і попереджають дисоціацію комплексів МНС.
Таблиця 11. Показники зв'язування з молекулами МНС І! класу Зв'язування пептидів, рестриктованих за молекулами НГА І класу, з НІ А-А"02 було класифіковане за виходом реакції обміну пептидів: 210905 --; »2090 -----; 25090 ----; 2759 -Н 11116 ФАШТЕООМТІ 77777711 чнниСсСс2С пи и СТ Тит ня НО о 7179 ФАССОТИТМ 77711111 чн
160 ф|ЕМЕОНЕОсСІМе 77777111 ля 66 |БАССЮЮМКАЇГ/////777777777777711111171Ї1111с ян 68 |6бШООгАСІО. 77/71/1111 169 |6ЩНОВЕ. 77777771 ля 11080 |МОЕОЕЕЕС 77777771 як 11186 |НІХЖРОАМИЇ//7777771111111111171Ї1111111с ж 89 МШРаТРОС 71111111 ж 190 |МАБІЯНВМ 77777711 ля 96 МшШоКТаМ 11111111 98 І5ИКУМАМ 11111111 199 ПШЕНВМАЄ 77771111 ля
ПРИКЛАД 6
Абсолютне кількісне визначення рівнів пухлино-асоційованих пептидів, презентованих на поверхні клітин
Отримання зв'язувачів, таких як антитіла і (або) ТКР, є трудомістким процесом, який можна провести лише для обмеженої кількості вибраних мішеней. У випадку пухлино-асоційованих і пухлино-специфічних пептидів критерії вибору включають, але не обмежуються ними, винятковість презентації і щільність пептиду, презентованого на поверхні клітини. На додаток до виділення і відносного кількісного визначення пептидів, як описано у ПРИКЛАДІ 1, автори цього винаходу проаналізували абсолютну кількість копій пептиду на одну клітину, як описано у патенті х . Підрахунок числа копій пептиду ТОМАР на одну клітину в зразках солідних пухлин потребує абсолютного кількісного визначення виділеного пептиду ТОМАР, визначення ефективності виділення ТОМАР і числа клітин на зразку тканини, що аналізується. Огляд експериментального підходу авторів винаходу наведений на Фігурі 4, етапи експерименту описані нижче.
Кількісне визначення пептидів методом наноРх-МС/МС
Для точного кількісного визначення пептидів методом мас-спектрометрії для кожного пептиду була побудована калібрувальна крива з використанням методу внутрішнього стандарту. Внутрішнім стандартом є подвійно мічений ізотоп версії кожного пептиду, тобто дві мічені ізотопом амінокислоти були введені під час синтезу ТОМАР. Він відрізняється від пухлино-асоційованого пептиду лише своєю масою, але не має відмінностей у інших фізико- хімічних властивостях (Апаегзоп еї аї., 2012). Внутрішній стандарт вводили як стандартну добавку у кожний зразок для МС, і усі МС сигнали були нормалізовані відносно МС сигналу внутрішнього стандарту для згладжування можливих технічних флуктуацій між результатами
МС вимірювань. Калібрувальні криві були зняті принаймні у трьох різних матрицях, тобто елюатах пептиду НІ А з природних зразків, подібних до звичайних зразків для МС, і кожний препарат пройшов вимірювання у двох прогонах на мас-спектрометрі. Для оцінки МС сигнали були нормалізовані відносно сигналу внутрішнього стандарту, а калібрувальну криву розраховували методом логістичного регресійного аналізу. Для кількісного визначення пухлино- асоційованих пептидів із зразків тканини у відповідні зразки вводили внутрішній стандарт як стандартну добавку; здійснювали нормалізацію МС сигналів відносно сигналу внутрішнього стандарту і кількісне визначення за допомогою калібрувальної кривої пептиду.
Ефективність виділення комплексів пептид/МНСО
Як і для кожного процесу очищення білків, виділення білків із зразків тканини пов'язано з певними втратами білка, що вивчається. Для визначення ефективності виділення ТОМАР були отримані комплекси пептид-МНОС для всіх пептидів ТОМАР, вибраних для абсолютного кількісного визначення. Щоб розрізнити комплекси пептид-МНС, до яких вводили стандартні добавки, і комплекси з природними пептидами, були використані версії ТОМАР із однократним міченням ізотопом, тобто одна мічена ізотопом амінокислота була введена під час синтезу
ТОМАР. Ці комплекси були додані як стандартні добавки до свіжеприготованих лізатів тканин, тобто у найранішій можливій точці процедури виділення ТОМАР, а потім уловлені у вигляді комплексів природний пептид-МНС у подальшому афінному очищенні. Таким чином, вимірювання ступеня вилучення однократно мічених ТОМАР дозволяє зробити висновки щодо ефективності виділення індивідуальних природних ТОМАР.
Ефективність виділення аналізували на низькій кількості зразків, і її значення були зіставні для цих зразків тканин. Навпаки, ефективність виділення індивідуальних пептидів є різною. Це наводить на думку, що ефективність виділення, хоча й визначена лише у невеликій кількості зразків тканин, можна екстраполювати на будь-який інший тканинний препарат. Однак є необхідним аналізувати кожний ТИОМАР індивідуально, оскільки ефективність виділення неможливо екстраполювати з одного зразка на інші.
Визначення числа клітин у твердій замороженій тканині
Щоб визначити число клітин у зразках тканин, для яких проводили підрахунок абсолютної кількості пептиду, автори винаходу застосували аналіз вмісту ДНК. Цей метод є застосовним до широкого діапазону зразків різного походження і, що найбільш важливо, до заморожених зразків (АІсобег еї аїЇ.,, 2011; Рогхеу апа Спацавигі, 2009; 5іма еї аї., 2013). Під час стандартної процедури виділення пептидів із зразка тканини отримували гомогенний лізат, із якого відбирали невелику аліквоту. Аліквоту ділили на три частини, із яких виділяли ДНК (набір
ОіаАтр ОМА Міпі, Оіадеп, Хільден, Німеччина). Сумарний вміст ДНК у кожному зразку виділеної
ДНК кількісно визначали флуоресцентним методом кількісного визначення ДНК (набір для кількісного визначення ОцбБії азхоОМА Н5, І Ме ТесппоЇодіех, Дармштадт, Німеччина) щонайменше у двох повторних вимірюваннях.
Для розрахунку кількості клітин будували стандартну криву для ДНК на основі аліквот індивідуальних здорових клітин крові, з діапазоном визначених кількостей клітин. Стандартну криву використовували для розрахунку загального вмісту клітин із сумарного вмісту ДНК у кожному зразку виділеної ДНК. Середнє значення загального числа клітин у зразку тканини, який використовували для виділення пептидів, екстраполювали з урахуванням відомого об'єму аліквот лізату і загального об'єму лізату.
Кількість копій пептиду на одну клітину
Використовуючи дані згаданих вище експериментів, автори винаходу розрахували кількість копій ТОМАР на одну клітину, розділивши загальну кількість пептиду на загальне число клітин у зразку, з наступним діленням на ефективність виділення. Кількість копій клітин для вибраних пептидів наведена у Таблиці 12.
Таблиця 12. Абсолютні кількості копій. У таблиці наведені результати абсолютного бо кількісного визначення у зразках пухлин НДРЛ. Медіанні кількості копій на клітину наведені для кожного пептиду: «100 --5 5-100 ---;5 5-1000 я- 5-10 000 ----. Наводиться кількість зразків, для яких є в наявності оцінювані високоякісні дані МО.
Таблиця 12
Абсолютні кількості копій кількісному визначенню
Список посилань
АЇІзоп, у). Р. егаі., Зсієпсе 270 (1995): 932-933
Апаегзеп, В. 5. еї а!., Маї. Ргоїос. 7 (2012): 891-902
Аррау, М. єї аї., Єиг.У Іттипої!. 36 (2006): 1805-1814
ВапснНегеаи, 5. єї аї., Сеї! 106 (2001): 271-274
Веацу, а. єї а!., У Іттипої 166 (2001): 2276-2282
Ведазв, «4. 0., Маїшге 275 (1978): 104-109
Вепіатіпі, М. єї аї., Чоштаї! ої Ше Воуаї! 5аїївіїса! босівеїу.бегієв В (Меїподоіодісаї), Моі!.57 (1995): 289-300
Воипег, у. М. еї а!., Реоївїп Епод 16 (2003): 707-711
Вгаштипет", Н. еї аї., Маїиге (2013)
Вгоззані, Р. єї а!., Віоса 90 (1997): 1594-1599
Вгпискаогтетг", Т. егаі!., Сит.РНагт.Віоїеснпої. 5 (2004): 29-43
Сага, К. РЕ. єї а)., Сапсег Іттипої! ІттипоїНег. 53 (2004): 345-357
СНапоск, 5. У. еї аіІ., Нит.Іттипої. 65 (20043: 1211-1223
Сопеп, С. У. єї аї., У Мої Весоопії. 16 (200За): 324-332
Сопеп, С. У. єї аї., У Іттипої 170 (200360): 4349-4361
Сопеп, 5. М. еї а!., Ргос.Маї.Асай.5сі.0.5.А 69 (1972): 2110-2114
Соїїдап, 4. Е. еї аіІ., Ситепі Ргоїосоїв іп Ргоївіп Зсієпсе (1995)
СоІотрбенцйі, 5. єї аї., У Іттипої. 176 (2006): 2730-2738
Оепаіеї, «у. єї аї., Сіїп Сапсег Нез 12 (2006): 4163-4170
ОепкКбрего, а. єї аї., У Іттипої 171 (2003): 2197-2207 еак, К. еї а!ї., Майте 351 (1991): 290-296
Еопа, Г. єї аї!., Ргос.Маїй.Асай.5сі.0.5.А 98 (2001): 8809-8814
Сабтомісн, 0. І. ега!., Маї Мед. 2 (1996): 1096-1103
Зо Саціпопі, І. єї а)., Маї Вем.Іттипої! 6 (2006): 383-393
Спіаїйс, 5. еї а), Ргос Маї.Асад.5сі.0.5.А 100 (2003): 8862-8867
СюоакКій, А. єї аї., Ії Іттипої 9 (1997): 905-911
Стееп, М. В. еї аї!., МоїІесшіаг Сіопіпу, А ІГарогаїюгу Мапиаї 4 (2012)
Стеепів!а, Е. А., Апіїродієв: А І арогаюгу Мапиаї 2па (2014)
Нулапа, М. Г. еї аї., У Іттипої. 179 (2007): 5829-5838
Уипо, С. єї аї., Ргос Маї! Асай 5сі 0 5 А 84 (1987): 4611-4615
Кірре, А. Н., НапароокК ої Рпаптасецшіїса! Ехсірієпів га (2000)
Кіїєд, А. М., Маї Нех.Огпа бівсоу. 5 (2006): 471-484
Паау, М. єї аї., Маї Мед. 18 (2012): 980-987
Циподгеп, Н. С. еї аї., У Ехр.Меад. 162 (1985): 1745-1759
Ї опдепескег, В. М. еї аї!., Апп М.М.Асайд.5сі. 690 (1993): 276-291
Ї опзааге, 9., Маї.Сепеї. 45 (2013): 580-585
І иКа»в, Т. у. еї аі., Ргос.Маї!.Асайд.5сі.0.5.А 78 (1981): 2791-2795
Ї опабіад, В. І, Снетіса! Неадепів ог Ргоївіп Маоаіїісайоп Зга (2004)
Мегівге, С. еї а!., У Іттипої 159 (1997): 3230-3237
Могаап, В. А. вії а!., 5сіепсе 314 (2006): 126-129
Моті, М. еї аї., Тгапзріапіайоп 64 (1997): 1017-1027
Мопага, І. єї аї., Сіїп Сапсег Вев. 12 (2006): 3435-3443
Миеї!ег, Ї.. М. єї аї., У Реоїєоте.Нез 7 (2008): 51-61
Миеї!ег, Г.. М. єї а!., Ргоїєотісв. 7 (2007): 3470-3480
Митрего, 0. єї аї., Ргос.Маї.Асайд.5сі.0.5.А 96 (1999): 8633-8638
Ріпнеїго, «. еї аї., піте: І іпеаг апа Мопіїпеаг Міхей ЕпПесіб Моаде!5; А!йдиві 19, 2015. Мегвіоп
3.1-122. (2015)
Ріебап:»кі, М. еїа!., Єик.у Іттипої 25 (1995): 1783-1787
Ропа, С. єї а!., Мігоїоду 202 (1994): 949-955
Ваттепзев, Н. а. єї аї!., Іттиподепеїїсв 50 (1999): 213-219
Віпі, В. І. еї аІ., Сапсег 107 (2006): 67-74
Воск, К. Ї. єї а)., 5сіепсе 249 (1990): 918-921
Водепко, В. еї а!., Маї Ргоїос. 1 (2006): 1120-1132 заїкі, В. К. егаІ., Зсієпсе 239 (1988): 487-491 зЗеедег, КЕ. Н. евї а!., Іттиподепеїйсзв 49 (1999): 571-576
ЗПпептанп, РЕ. еї а!., арогаїюгу Сошгзе Мапиаї ог Меїнод3з іп Меазі Сепеїїісв (1986) зЗіпдйп-Уавзціа, Н. еї аї., Сапсег Іттипої.ІттипоїНег. 53 (2004): 187-195 зтаї,, Е. ». еї аї., У Сіїп Опсої. 24 (2006): 3089-3094
ЗіШпт, М. еї а!., ВМСО.Віоіптоптаїісв. 9 (2008): 163
Тешеї, В. еї аї., СеїЇ Мої те 5сі. 62 (2005): 1755-1762
Тгап, Е. вії аї., Зсієпсе 344 (2014): 641-645
Муапнетг, 5. еї аї., У Іттипої 171 (2003): 4974-4978
Муапнег, 5. еї а!., Маї Мед. 18 (2012): 1254-1261
М сох, В. Е. єї а!., Ргоївіп 5сі. 8 (1999): 2418-2423 7агетрва, 5. єї аіІ., Сапсег Вев. 57 (1997): 4570-4577.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«105 Пшнатіся Біотеснпоїодієв ожоН «ій» Нові пептиди та комбінації пептидів для застосування для імунотерапії ХЛЛ та інших видів раку «1302 13293540 «Т5йж 5 БАИ2е5,в15 «453» 2015-12-10 «1505 св1521746.6 «151х 2015-15-10 «1605 594 «170» Раїтапстп Ууегзіопй 3.5 кеКх 1 «115 Лі «е12х РЕК к?із» Ното зарієй» «4002: 1
Аїа її рго Рго Чег РНе АЗа бег хе Ре вн ї 5 10 «Ох «21ї2 З «кій» РЕК хеії5х Нот 5арівнз «4005 2 діа цечц ні агуу Рго Азромаї Тув гей 1 5 «102 З «211 9 «212з РЕК «2135 Ното зарівй5 «з0- 3 маї її Аа бій фей о рго рго гу маї ї я «210з 4 «кеіїх З каїй» РЕК «213» Ном зарієпе «З0йх 4
Уа! тіе АЇа бій бецч рго Рго їуз ма! 5аг Узі ї 5 10 «М 5 «віх 9 «ех РЕК «213» Ното заріепе -40025 5
Аа цен птіе вне су те Аїа зег АТа
З кві» б «її 11 «42» РЕК «213» Нощо зарівпе «4005 5
А1а гей Ар тТНг Сен сій Азр обр Мет Тк ОМе 1 5 їо0 ке» 7 кг а «212 РКК «г13х Вощо тарівєй»5 «00» 7
Аїа сеи їеу 010 Абу вс оЗіу Тує ТНг бе 1 З 10 «іх 8 кеіїх З1 «212з КЕ «ей13» Ното 5зарівпь «вх В
Аїа Сен АТа АТа бек Аїя Гей его АТа зец ма!
ї 5 10 «210» 9 хіх 9 «212» РЕК «213» Ното заріеп5 «йцО0ж 9 513 Мен Суз АзротТпг Ге) ї1е тег Уа! 1 я «210» 10 «в1ї» 9 хеїйУ РКЕТ «2135 Номо зарієпе «юЮх 10
Рне Уа! Туг с0Ту б1ц бек уаї сн зем 1 5 «? Мт 11 «21і» 10 «12 РТ «2132 нНоМжо зарієпьз «80053
А1їа зей Рє Те Рпе Бек Рго їги тре Уві 1 5 10 хаїй» 125 «й 95 «122 РЕК кгі3» Нотжо зарівп5 «3002 12 діа ги 1у и Ар «ій ів те ей 2 «210» 15 «211» 9 «2125 РЕК «г13м Ното зарієепь5 «400» 1
Уаі Маї Ав біу Мек о рРго Рго с1у чаї і Кї «кіз 14 «21їх а «212 РЕК «2і3» Ното 5арієпе «Ой» 14
АТа бе Бен де бец бе) Ргро с1х Ген 1 5 «2 15 «г1їх 9 «хрійх РЕК «13 Нота зарієпа «4005 15 ма Гей го си Уа! Зег Уа! би АТа «21» 16 «315 11 «г12ю РЕК хг|ї» нот зарівпх «400: 15
АТа гей Рго біу с1у Аїа АЗа ха! АЛа лів ма ї 5 о ке1йх 17 «2115 З «кійм РЕК «213» Ното «арієп»5 «4005 17
Аа їеи тйк обу Тпг Ап ім біт гей 1 5
«ох 18 «Киї» З «В12» РЕК х?іїх ото 5арієпе «4005 18 теч о ггеч 01у Б6Їш бе хег тів їух Меї ї 5 «310» 19 «г» 9 «212з ВЕК «213» Ното заріеп5 «Ох 19 оп Уаї Меє сій вуз Іеи Аїз Аїа ха!
Я з «210 20 «211» 11 «каз х РЕК «2132 Ното 5арієпе «йО0х 70
Аїа ген ма1і Ар оРго бі Рго Азр РВе Ууаї Ма ї 5 10 «210: 21 «1ї 9 хгіс» РЕК «13» Ното зарієпе «005 21 діа ен Тер АТа су Ген ген тир бе 1 5 «2 22 «из 9 «21?» РЕК «213» Мошжо зарієйх «4005 22 діа мен Тер а5р Рго чаї тів бій Кей «кім 2 сії З «2122 РЕК «г13м Нота зарієп5 «МНК 2
Аа уец тук бец ті бій маї РНе бе ї 5 «830» 24 «іх 8 «2123 РЕК «2132 Ното зарієепе5 «Ос» 24 діа Мес Аїа 51уУ А5р Ма) МУаї Туг АТа і 5 «Ох 025 «к2і3їм 11 «гМ1йж РЕК «и13з Ното заріепе «400» 25
Аїа Тиготугє зає бі Ме) біб зекосій Бас Уві і 5 10 «2105 26 «ії» 9 «г1г» РЕТ «2135 Ното зарієпа «А00О» 25
АЗїа ма! еп бецп уаї сен Рго їецп Ма! 1 5 ке 27 «112 З
«г12х РВЕ х?1і3х Ното заріепу «400» 27 діа чаї ем бТу еп Уа! тер гей їв «230» 28 «1 З «віх РЕК «13 Ното харівпе «00» 78
Аїа ма! їеци Ні Ген гей іецз 5ег Ма! 1 5 «е10х 28 «21ї» 8 «2і2з РЕК «213ю» нот зарієеп5 «400» 29
Аіа уві їво 1 да ма| Те АТа ма! ї «2ії0з 30 ке1їх 10 «2125 ВЕК «213» Ното зарієпе «кх 50 зіз Теги бе бід біу зег сій ї118 туго бец ї 5 хе «2105 1 «ож 9 «210 РЕК «213» Ното зартіеп5 «Зх зі із гей мет Ні бі мзі Аїз с1х Уа 1 5 «215 32 кеіїж З сід» РЕ «13» Ноте 5аріепе «400х 32 пре тів Ачр уз Ре ТАкорко вро Уа 5 «Ки» 33 «вії» 10 «біг РВК «213» Ноедо заріспе «4005 353
Рпе ті тІє дей бек Бек Ав Т1і6 Ре Гей 1 5 10 «еійх 34 «115 9 ке м РЕК «213» Ното зарівпз» «4005 34
Тук цем рРко туг ге впе Рко Азп оте ї ке 35 «211» З сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе5 «а 35
Рпе хів еп Рго зег о бег гей туго бен 1 5 сій» 36 кої» 9 «2125 РЕК
«гіїх ото зарівп5 «ай» 36 й
Рйе лів ей тТпг нів ма! Азю бій гей ї 5 «1» 37 «г3іх 10 «їй РЕК «ві3х Нощо зарівене «Кр 37 Й -
Ре тів мет бій біу біу 413 Мет уа!ї вен і В о «2302 38 к21іїх о кхаії» РК «2132 Ношщо зарієпе «00» 38 вне тів мет січ обі бі дія Мек маї 1 З «25 39 «ії» 9 хеїгх РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «4005 39 рве Сем Азр АТа еп ен тТйг о Азр ма!
З
«г» 4 «211» 5 «взї2з РЕК «21їх Ното зарієпв «4002: 40 ге зи Ар бі Ар оАер Мет Берг г ей «е40х 41 ки» 10 «2125 РКК «гі3» Ното зарівейб5 «400 41
Рпе еп А5р о бго 5егоїеи Ар Рго бен Бен ї 5 10 «20» 42 ке1іх 1 «й12з РЕК «213» Нота зарівп5 «Ор й
Ре ксу сіб сій оїу бту уаї уаї тик чаї 1 5 10 «й10х 43 «г1ї» 41 к«еігм РТ «й132 Ново заріепе «а00х 43
Рке (ец гїем сТу Рго 215 діа їец зве РНе лід ії 5 10 кам 44 «ії» 9 «ей М РЕК «13» ново зарієпье «4002 44 ге Ген їец 5ег пе АП А5рВ РН 1 ви «ех 45 «2115 11 «12 РЕК «213х Ното 5арівєне «4005 45
Рне Гей рРго СТ геи Рго діа д5р гей 01 Аїа ї 5 10 «М: аб «211 5 «аїл» РЕК «21ї1ж Ношо зарієпь «4005 46
Туг тів Те дор Зег Аїа 5іп Ата Уа! ї 5 «аю» А кеіїіїх 10 «2122 РЕК «213» Ното зарієпо «КК 47
Ре Ге бек Ар об5іп Рго 613 Рко Туг ієц 1 5 10 «из: 48 «31 10 «2192 РКЕТ «сеіЗ» Ното зарієпе «Ох 48
Ре се чек яго зійп бій рго вро фей зей ї 5 10 «2105 49 «вії» З кгзйю ВЕК «213» Ношо зарієпе «4005 49
РБе цен ПР Азр меч РНе дів сів веги ії 5 «230» 50 «8115 11 «езЙйхм РЕК ках» Ното б5арівпь «4005 50
Рпе їеи рРпе бі) Бго маі Маї з1у5з АЯа Ре тен ї 5 ло «10х 51 «ії» 41 «вій РКК «213» Ното зарівп5 «Як» 51
Ре еп маї бій Аїа Рго Ні АбротКо АБО гей ї 5 10 «83102 52 «г13іх 10 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «Ох 572
Рпе Ге Уа! бій отв фу ре ген Нів Уаї і 5 10 «Й» 53 «е1ї» 10 кози РКК «віз» Ноща 5арієпе5 «ах 53
Рпе їеу Тер ооТа Ні Уві! біб бен ма! зей і 5 10 «М 5А «ії» 10 кеїгх РН «2135 нНото зарієп» «41005 54
РНе ем Тут Рго РНе вго гц АТа ген Ре 1 5 10
«М 55 «її» З «е1йх РЕК «2135 Мото зарієпуз «41002» 55
РНе Ммек 5зіш Рго ТНг Ген їв меж грец 1 5 «М. 56 «2115 5 «гії?» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4002 56 вне жа! Ре б Аїд вго Туг Те Гей 1 5 км 57 казк 5 «2122 РЕК «г13х Ното зарівнп5 «40025 57 сту ви Бек би Те зЗег без Аго ви 1 5 «Ех 58 «211» 9 «10 РЕК «2135 Ното 5аріепо5 ках» 58
Тут її сів оп бі їТе РНе 5вг Ууаї і З «250: 55 «Ті» 12 «1» РЕК «2135 Ношто 5зарієпе «А00х 59
Рпе маї Ре сіу Азр обіш деп с1у Те маї бБег Бенй і 5 10 «іт» ва «й1їз 11 «12М РЕК «213 ново зарієепа: «400» 50
Ре ма! цей Ар Ні чіб Ар о біу Бей двп о їен ї 5 10 «ех ві «2115 5 «Кіз РЕК хеіїх Но 5арівп5 «00 61 гне ма! тує Ре тів маі дко с1и Уаї 1 5 «еЩйм Б кг1їх 9 «122 РКК «213» Но 5арівпв «ФО» 82 сім їтТе 1128 дер б1у бЗег вро Ага сей 1 5 «2102: 63 «е1ї1» 10 «210 РКК «віз» Ното зарівп5 «Щ00х 83 бЗег Ген АТа Ні Ма! їз 01у Суз он 1ец і 5 10 «Мі: 64
«їх 9 хйїбх РЕК «2132 Ното 5арієеп5 «Ох о4
Гуз Ген тен ой зег Уві дія чек Аа 1 т «Й» 65 «віїх З «ех РЕ «2133 ношМо зарієпь «400» 65 ту Сей Азр Азр Мет Гу діа Азпор ем кг» аб «її 11 ке» ВЕК кД1з» Мото зарівпае «800: 56
Бек цей АТа біу ау ієц А5р Ар Мет 1у5 АЇїа ї 5 10 хх б «2115 5 «кій РЕК хг13» Нопюо «дрівпе «4005 67
ЛУ Геи Ар Ар т! тасомаї Ти маї «2105 68 «г1іх 11 «2и10з РЕК «213» Ното зартеп5 «ЗК» 68 с«іУ тей Азробіп біп Рйе Аа біу Бей Абр Ген 1 5 то кіз 69 «1» З «2122 РЕК «г13м Ното зарієп5 «00: 69
ЗУ цец Нніз біп дго бій ті РНе Бе ї 5 «в3оз 70 «іх 8 «2123 РЕК «2132 Ното зарієепе5 «ОО о
Ре уві Рго Азротйт рРго маї б1х маї і 5 «Оз 7 «к«21їх 9 «гМ1йж РЕК «и13з Ното зарієепе «400» 71 сіу бен гу5 Ні АБрої1е діа дго ха і З «210» 07й «вії» 10 ке1г» РЕК «2135 нНошо зарієпа «Ах 72 сіу ей теп др Аа с1у Гує Мек їТуг УудВі 1 5 16 хе 73 «11: 1
«г12х РВЕ х?1і3х Ното заріепу «400» 73 сіу ген о бем би ма! Тіє зер АТа бен ой Тен і 5 но «г3Ох 74 «іх З «віх РЕК «13 Ношо харівпе «з 074 сім їги їеу аго А1а Зег Ре зец гей 1 5 «е10х 75 кгії» 41 «2і2з РЕК «213ю» нот зарієеп5 «4 75 сі це бар їТе Рпе АТа бій Ар гей Аго Гей ї 5 10 «иі0з 76 хеі1зїх З «2125 РЕК «213» Ното зарієпе «Кк 76 5іУ бе бен Аго їіе Хе рго Тук Гей 1 і «2207? «31 9 «вза ж РЕК «513 Номо заріспя «А» 77 сіу Ген рем Ага їец Таб тер ве ги ії 5 к»10т 78 «211» 95 хеїрж РЕК «213» Мото зарієпе «400х 78 пу Сен его Зег Ре Гцец тк Фін маї
«КИМ т «2115 З «біг РЕЖ «213» Нед заріспе «4005 79 пу сени бій АТа уз ті бій бім Ата
5 «гій» во «ії» 10 ком РЕК «213» Ното зарівпз5 «4005 80 й маї тен ї1е біз Азр о аіц їецч біч сш без 1 5 10 кам 81 «211» З сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе «ще 81. , : тер осей ма1ї бі сіп сій ве бій Бей 1 5 сеї» 82 кої» 10 «2125 РЕК
«Фіїх ото зарівп5 «400 82 сім теги бій бек обі ма! Ар тів о1у Уа ї 5 10 «2100» 83 «г1іж 5 «їй РЕК «ві3х Нощо зарівене «йо 83 й й Й оіу бів с1іу Ти чаї Ге маї Тугк Уаї а «230: 84 к21іїх о кхаії» РК «2132 Ново зарієпе «00» 84 біу ма! мет Азр Ма! А5а пг АТа ем 1 5 «25 85 «ії» 9 хе РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «4005 85 нів Сем мек бен ніз Тпг АЗа АТа ем
З
«21» 86 «211 5 «12» РЕК «21їх Ното зарієпв «4005 86 те Бей Тук о Бго спіу Аїа ма! тс Пе «е410х 87 к»1ї» 11 «2125 РКК «гі3» Ното зарівейб5 «400 87 нт сів Тіз бій АЗа ма) Азробім б1ш біб їєей ї З 10 «210» 88. «е1їх 41 «й12з РЕК -233» Нощо «арівпе «00» 85
ІТе кеу Абзрооій їїе б1у Аїд дзроуа! іп Аа 1 5 10 «й10х 95 «г1ї» 9 к«еі2гм РТ «й132 Ново заріепе «400» 89
Те Сен Азр Ре оїу ТНгоРйе спо ги 5 кот 90 «2їїз 10 «ей М РЕК «13» мово зарієпье «4002 90 чаї Іі Аїа д5р ів сту івн те Акоу маї 1 5 10 «ех 91 «2115 З «12 рег «213х Ното 5арівєне «400: 91 те Сем А5р Гец деп ТНе тук азп чаї хх О9и «2112 8 «212» РЕК «24ї3ж Ното зарієпь «4005 92 тТіе ге о1ш Рго сей Ап РКО фей гей ї 5 «2305 93 хеїіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «КІ 83 те Се вне Аза так іп їі2 Ав те
Я її «10: 94 «їх 8 «2192 РК «сеіЗ» Ното зарієпе «Зх 94 т1е Се а вго рей бго Ре тар їгй ї 5 «й «ії» 11 «кгзйж РКК «213» Ношо зарієпе «4005 95
І1їе сен сіу тує Меї Аїв Ні сін ні уз Уві ї 5 10 «230» 096 «2115 98 «езЙйхм РЕК хз» Ното 5арівпь «4002: 96 те ен 112 Ар су Твго5ес рве ма! «10х 97 «2112 З «вій РКК «213» Ното зарівп5 «з 57
Кеш ей Ре АТа тТиг осів хів ТВе сви ї 5 «210» 98 «Р1їх 9 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «щи 958 зег Сеш ТТе був Туг Ре Гец Ре Ма!
Я й «и» 99 «гії» З козйх РКК «ві3з ноша 5арієпе5 «а(Одх 95
Т1іе ген Іі Ре Ні5 Бек Уа! Аа рен і з «25: 100 «Кії»х 9 кеїгх РН «2135 Ното зарієп» «4005 100 те Мем А5а АБИ Зв чаї Ре Аа Те
«Киї: лаї «її» З хезійх РЕК «2135 Мото зарієпу5 «400» 101 тіе їен маі Ма! Хі сі Рго гей вец ї 5 «МК 102 «2115 5 «гії?» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4005 302 ліе іп А5р Ага Аїяа маії Рко бер Гей ї 5 ке» 103 казк 5 «2122 РЕК «15» Ното зарівпе5 «0025 103
ГУ ви у бу ТР оРго Аїа Рго А1їя 1 5 «віх 104 «211» 11 «10 РНК «2135 Ното 5аріепо5 «НИ» 104 уз Ге Же гей оіец Авр їВг о Вго бен Ре 1ей і З 16 «25305 105 «Ті» 9 «1» РЕК «2135 Ношо 5зарієпе «аО0х 105 | й їм5 Мен Меї Адзп Азр о ї3е АЗа АЗр тів ії 5 «Б - 106 «ії» 58 «12М РЕК «213 ното зарієпа: «4005 106 спе мех Аа бек Ні цен Ар Туг рей «ех 107 «2115 9 «Кіз РЕК хеіїх Но 5арівп5 «4005 107 тів Ге тує дв без туг Азрівн і ви 1 5 «20Ом 108 «її» З «122 РКК «213» Нощто зарівпв «ФО» 108
Уа жів Туг ТиКоїєн їв нії Тук ї1е 1 5 «вій» 109 «е1ї1» 10 «2125 ЕТ «віз» Ното зарівп5 «щОх 109
Гуз Ген Тер о оТиоо1у гбеш Те осн івен ма? ії 5 10 «Ме Іо
«іх 1 хйїбх РЕК «2132 Ното зарієеп5 к«цОпх 310
Гец ген Ре Ар ні5 цен бі го Мет отв їеч 1 ч «М 131 «віїх 11 «ех РЕ «2133 вОошМо зарієпь «400» 111
Гуз Гец Тер ази Уаї Аїз Аіа го грец тує Гей ї 5 10 кій» 412 «її 11 ке» РЕК кД1з» Мото зарівпае «а00з 112 їу5 ТАгогем Ар оуа! Адярд діа тиг тує сів тів 1 5 то ке 113 «2115 1 «кій РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 113 іме Маї Рго Аїя біз «їі о Маї гей Уаї Аза ма! ї 5 о «2105 14 «ож З «210 РЕК «213» Ното зартіеп5 «МК» 114 цен їТе Рго Біц обі Рго Рко сів Уаї 1 5 «2105 115 кеіїж З «21» РЕК «13» Нота 5аріепе «400х 115 (ев Сеч ве Азр рух це туго їец ен «ій» 116 «2115 З «біг РЕЖ «213» Ноедо заріспе «-4005 115 цеи іеи тів бі Аїа ТНК омех біз Уві! 5 «їх 117 «235 9 ке м РЕК «213» Ното зарівпз5 «4005 17 Й
Ген тен пів ге бі Ав пів'єцн гей ї «е10х 1158 «131» 10 сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе5 «ащь 118 : де огей Кей хів бейш сій Ази 12 Бей бев 1 5 10 евід» 119 ке 9 «2123 РЕК
«гіїх Нощо зарівп5 «4005 119
Уа! Гей рРко АТа вів ве вве б1и чаї ї 5 «2300» 129 «г1іж 9 «212 ВЕК «ві3х Нощо зарівене кавою с Й вів Т1е Авр АТа АТа геи Те бег Уаї а «2 121 к21іїх о ка12» РЕТ «2132 Ново зарієпе «00» 171 дгу Сей Туб січ ЖжТе таб тів сін ма 1 5 «25 122 «ії» 9 хе РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «4005 122
Ген Сем їТє Рго уаї Уа! Рго су ма!
КЕ З
«21 123 «г11з 11 «взї2з РЕК «21їх Но зарієпв «4002 123
Ген цен їв ія сів Аа бій зей іву тб і ви 3 5 т «10х 1724 к»1ї» 11 «2125 РЕК «гі3» Ното зарівейб5 «4002 12
Сем сей бен бій зіц тс біз уз б1п Аїа мазі ї З 10 «230» 125 «ої» 13 «йї2з РЕК «213» Нотще зарівп5 «ВО» 185
ГСец Кеу гей сій ї16 б1іу біз уаї Ту уз Гей РБе Уа! ї 5 10 «й10х 126 «21ї» 340 «а12» РЕ «й132з Номо заріепе «ах 175
Сан сец бко би ої б1у ї1Зів тпг АТа хіє ії 5 10 ко 127 «аї1їз 9 «ей М РЕК «13» Мово зарівпе «й002 127 (ев Сем вко тТВг діа ре Тв оте ма «210х 128 «2115 З «12 рег «213х Ното зарівєне «4005 128
Гео Ген бек би зі сії тує ніх ей ких 129 «21125 З «212» РЕК «24ї3ж Ното зарієпь «400» 129
Ген гей уаі біу тТиг Гей дзов маї Уа! 1 5 «2» 130 хеіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «КІ 130 і ви без чаї еп те Бго Уаї Тук (ен
Я З
«210: 131 «їх 8 «219» РЕК «сеіЗ» Ното зарієпе «вх 131
Гей бів АТа зей ооіц ма1ї Сез губ тів ії 5 «2105 132 «її» 9 «кгзйю РКК «213» Ношо зарієпе «4й00х 132.
Мен уаї Туб біз Аїд їїе тів Меї: ма ї 5 «210» 133 «2115 10 «езЙйхм РЕК ких» Ното 5арівпь «4002: 133
Туг їеч ївеи его с1у Азр ов беє Ли Ав ї 5 чо «210х 134 «ії» 10 «вій РКК «213» Ното зарівп5 «з 134 мет сей бе бій ніє сту жі Тк огви Уві 1 5 10 -210з 155 к?іїх 1х «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «хх 135
Мет твг Аія біу Рпе бег їВг ї12 Аа біу бег Ума 1 5 10 «и» 136 «г1ї» 9 козйх РКК «віз» Нота 5арієпе5 «ах 136
Азп овен АБ гм еп ТгротВг ген ма 1 вй «215 137 «Кії»х 9 кеїгх РН «2135 нНошо зарієп» «41005 137 деп Сем Пе їу5 Те чаї хів їм гей
«йМтх 138 «її» 11 хезїйх РЕК «2135 Мото зарієпуз -4002 138
Авпосен о веч Ар же Ар о АЇа Рго Ма! тег Уа 1 5 10 «2» 139 «2115 5 «гії?» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4005 139
Азпоіеи Те оАзрома!ї маі оіц їуз Бей ї 5 «г» 15 к»зКк 410 «2122 РЕК «г13х Нощо зарівнп» «40025 1Ао сіп ї1ї2е Аїа бій фец рго Аїа тТВгобЗег ма! 1 5 10 «ех 141 «211» 8 «10 РЕК «2135 Ното 5аріепо5 ко 141 біп ї1е ген бег б1цй ї1Те маї сін Аїа ії 5 «25305 142 «Ті» 9 «1» ВЕК «2135 Ношо 5зарієпе «ах 145 бів сен Азр бій Рго Аїа Рго с1в маї ії 5 «ат» 143 «ії» 58 «12М РЕК «213 ното зарієепа: «400» 143 сів Сем сей Ар пе Тут Ре Тиг гей кох 144 «2115 9 «Кіз ВЕК хеіїх Но 5арівп5 «00 Ай «іп ви Рго бро Ра го АКО СІ ей 1 5 «ем 145 «її» З «122 РКК «213» ото зарівпв «а00» 145
Зег АТа ей дер тік їіе їТВе о тТвВе ма! 1 5 «212: 1 «е1ї1» 10 «2102 РКК «віз» Ното зарівп5 «оо» 146 бег Те Пе 01051 рРго 116 їШ6 їуб5 їец ії 5 10 «М 147
«1їх 9 «йи1їйх РЕТ «2132 Ното 5арієеп5 «Ох 147 зек тіє бен ой те Уві Аїа ТНК гей ї ч «й 148 «в3їх З «1 РТ «2133 нНошМо зарієпь «а00» 148 зек хіе ма1і АТа бек Гец ті Тг ма кій» 149 «ії» 95 «2г12х ВЕК кД1з» Мото зарівпае «а00з 149 зе меч Ар А5п а1у сіу тук туг Ле
К 5 кох 156 «21125 за «12 РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 150 зек Геи Ре А5розіп Рго Ген бек тТ1іе тів ї 5 То «2105 151 «ож 9 «210 РЕК «213» Ното зартіеп5 «МК 151 бек івеи рРНе Ар б5ег діа тує СІх Аа 1 5 «2135 152 кеіїж З сід» РЕ «13» Ноте 5аріепе «400х 152 зет Сен Па. Ага те Гцец піп тер от1в «й» 153 «2115 З «біг РЕЖ «213» Нео заріспе «-400з 153
Зек іем їец АТа боб Сец нія ма! фей 5 «гійх 154 «ії» ком РЕК «213» Ното зарівпз5 «4005 154 Й ет тен бе іа сіб Ген нія Ма1ї ге Тег Уа ї 5 16 «210» 155 «211» З сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе5 «4005 155 5ег рей Мет єм бій ма)! Рго А1а гей 1 5 сеї» 1565 кої» 9 «2125 РЕК
«гіїх Нощо зарівп5 «400и 155 его оїги Ап їїе о1у Азр'маї б1п гей ї 5 «2100» 157 «г1іж 9 «212 РНК «ві3х Нощо зарівене «(ох 157 й й бег Ген Ап тів Аг д5р РНе ТНг Мет і З «2305 0158 к2іїх о ка12» РЕТ «2132 Ношо зарієпе «00» 155 бак Сен вро бі АТа Рго Сен Азрв ма 1 5 «2 159 «кії» 10 хе РЕК «2135 Нощо зарієпе «400: 159 зак огеч зіпй би аю Суб ген 116 Туг уд! ї 5 10 «210 150 «211» 5 «взї2з РЕК «21їх Ното зарієпв «4005 1650 зег бе бек вНе ен ма| Рко ваг ву «ех 161 ха» 9 «2125 РЕК «гі13» Ното зарівейб5 «4а00- 161
Зег Меї АБроА5розіу Меж тів деп маї ї З «вх 1652 «ої» 9 «йї2з РНК «213» Ноще зарівп5 «00» 165 чег Меб губ дер АЗроцен бів дев ма 1 5 «й10х 163 «е1ї» 31 «азї2» РЕ «й1325 Ново заріепе «й00х 163
Звробіп гем АдЗроЇТіе Заг обі бго Туг і уз Ма! ії 5 10 ком 164 «а1їз 9 «ей М РЕК «13» Мото зарівпе «аз 154 зег Ма! нів ув пу вне Аіа Рпе Уа «210» 165 «2115 З «12 рег «213х Ното зарівєне «400: 165
Тит Сем Ар АБр дер іен Ар о твг ма «Ох 156 «2115 З «212» РЕК «24ї3ж Ношто зарієпь «4005 186 й й
Тиг о Ггц АбЗроРго АЗИ аій Ма! бек вий ї 5 «г10х 167 хеїіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «а» 167 те бе) Ар Те о5ек гуз це) Туг чаї
Я її «йо: 168 «їх 8 «219» РЕК «сеіЗ» Ното зарієпе «ВО» 168 ту Сеч бен Ахро5ІпоБег ре ма! Мет «й 163 «ії» 9 кгзйю РКК «213» Ношо зарієпе «4005 1659
ТВг бен бем зей бу Ген тк сін ма ї 5 «2» 170 «2115 8 «езЙйхм РЕК хз» Мото 5арівпь «4002: 170 те еп тие вне го маї зі таб ма! «10х 371 «ії» 41 «вій РКК «213» Ното зарівп5 «а» 171
Твгорги маї Рбго Рго АТа Аїа зей т1іе бек те ї З 10 «8105 172 «Р1їх 9 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «МИ 172
Те Сец Тук дер Мет Ге Аа 5ек Пе
Я й «ЙО» 173 «г1ї» 9 козйх РКК «ві3з ноша 5арієпе5 «й0Ойх 173
Тнгоуа! ті Ті Азпоїт1е нів тиг ле і ї «2105 174 «вії» 10 кеїгх РЕ «2135 нНошто зарієп» «41005 174 чаї ем Аа біш без бго хів Те ма! Уаї 1 5 10
«ЙМтх 175 «її» З «е1йх РЕК «2135 Мото зарієпуз «4100» 175
РНе ти маі Рго Аго уаї ма! Аїа ма 1 5 «210» 176 «21ї1з 11 «гії?» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4002 178 маї ем АТа бі аіп дев Ті 112 Рго чЗег Аїа ї 5 не «21йх 177 казк 5 «2122 РЕК «г13х Ното зарівнп5 «002 177 . ма! ви А5Ва Ар Аг сій без бен бе 1 КІ «Ех 178 «гії» 9 «10 РЕК «2135 Ното 5аріепо5 ко 178
Уаї Се) вне Ре Азпомаї сів сів Уаї ії 5 «105 179 «Ті» 9 «1» ВЕК «2135 Ношо 5зарієпе «4а00х 179 чаї мен ви ЗТу бецйц біб мес тир оїем 1 5 «ат» 180 «ії» 10 «12М РЕК «213 ното зарієепа: «4005 180
Сен ген ух Ар сі1у вго сін ті бу і ецз ї 5 16 «Ох 181 «2115 10 «Кіз ВЕР хеіїх Но 5арівп5 «400 181
Ууаї ви Сей баг тів вго ре ма! бак ма! 1 5 10 «е10м 182 «гії» 10 «122 РК «213» ото 5арівпв «400» 82
Уаї ее) реп бек ма! Рго 51у Рго Рго ма! ї З 10 «вій: 183 кез1їх 1 «2102 РЕК «віз» Ното зарівп5 «Ох 183
Уаї Ген мет Рго їй о Уаї туго сів ота оту Ма! і 5 10 «М л84
«їх 9 хйїбх РЕК «2132 Ното 5зарієеп5 «Ох 184
Маї Гец бак нів д5п гей Туг тНе ха ї т «М» 185 «віїх З «ех РЕ «2133 нНОото зарієпь «400» 185 та! Мег Ар др іп Аго Ар огец Те кій» 186 «ії» 95 ке» ВЕК кД1з» Мото зарівпае «а00з 1885
Уа! Ме Ар Рго ТПг о цув їв бем Ме
К 5 ке 157 «2115 5 «кій РЕК хг13» Нопюо «дрівпе «4005 187 ув! Меї Або тик нів Гепомаії Аа те «2105 188 «орі 9 «210 РЕК «213» Ното зартеп5 «400» 188 маі Меє сіу д5р їі Рго Аїз Аїа Уа! 1 5 «2105 189 кеіїж З «21» РЕК «13» Ноте 5аріепе «400х 1859 ув! мес бен би Мет тк о рго бій ен «й «2115 З «біг РЕЖ «213» Нео заріспе -4002: 195 уа! ма! мех оту тик оУуа! Рго Аго ем 5 «іах 19 «йЗіз 10 ком РЕК «213» Ното зарівпз5 «4005 181 Й І й
Тук ті РМпе дзр о сіу чего А5р о б1іу Є1у Уві ї 5 16 «210 192 «131» 9 сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе «а» 192 тук жів бБіп біш тТуг гей Те зе Бей 1 5 сеї)» 193 ке 9 «2123 РЕК
«гіїх Нощо зарівп5 «а0б0х 193
ТУР Геи АбОЮ гей зег Ап Азп Агу гей 1 5 «а» 194 «г1іж 9 «12 РНК «ві3х Нощо зарівене «к(х 194 туго Мец Або д5п ма! без Аїва сін вен ії 5 «205 1985 к21іїх о к?ій» РЕК «2132 Ново зарієпе «00» 195
Тук цен сі оТу Рипе аїа Сен обег ма 1 5 «2 196 «ії» 9 хе РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «400» 196
ТУ Сем їм Бен біп тпготує ма! геч
КЕ З
«гм» 197 «211» 10 «12» РЕ «21їх Ното зарієпв «4005 197
Тук сей іп біш маї вго 118 їеи ТНК ог ев ї 5 то «10х 198 ха» 9 «2125 РЕК «гі3» Ното зарівейб5 «00» 198 тут реп Те оРлпе без Рго АТа сти маї ї 5 «Ох 199 «ої» 9 «йї2з РНК -813» Ноще з«арівпе «ВО» 199
Туг Кеу чаї бій їец Зег чаг фей їв
І 5 «10 200 «21ї» 40 «азї2» РЕ «2135 Номо заріепе «й00х 200 тТуг Мек те сТи оп Уаі Рсо ї1іе ма! 71 ії 5 10 ко 201 «її» 10 «12 РЕК «13» Момо зарівпе «й00з 201 тує біп ге бю ее» ні бі іє би зе 1 5 10 «210 205 «2115 З «12 рег х?13х Ното зарієп» «4005 209
ТУк ма! Азр дБр ув! РНЕєЄ Ген дго ма! хх 203 «2112 5 «212» РЕК «24ї3ж Ноо зарієпь «4005 203
АТа їеи фе бек чек сіп Гей АТа гей ї 5 «Р10х 204 кеіїіїх 11 «21223 РЕК «213» Ното зарієпо «КІ 04 о1у ген їн оп 116 Ап Авр Гуз Ш1іе Аа їей ї 5 10 «2102 205 «11х 9 «219» РЕК «сеіЗ» Ното зарієпе кох 205 сту їеу зер зп АТа б5п о РНе Тагогей «21 206 «ії» 9 кгзйю ВЕК «213» Ношмо зарієпе «4005 205 й
Ніз мек 5іп дзр МаЇ Ако маї Бей ги ї 5 «210» 207 «2115 12 «езЙйхм РЕК ках» Ното 5арівпь «4002 207
ТТе їі АТа ар гей Азр ог Тйб жхТе Мех Ре Аїа ї 5 то «210м 208 «ії» 410 «вій РКК «213» Ното зарівп5 «ак» ОВ
Ті Кей фей бує тиг осі біу 118 АБИ Бе ї 5 10 «в310з 209 «Р1їх 9 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «Кр 209 те цеш сів АТа оц Геї Рко 5ек ей
Я й «й 210 «г1ї» 9 козйх РКК «ві3з Нота 5арієпе5 «дОйх 210 їу5 Ген о їем Ма! оп Азр о Рбя Ре рен ії ї «2105 211 «Кії»х 9 кеїгх РН «2135 нНошо зарієп» «400 211
Ген Ів Азр Уві Сив Вго іец о1у Ма!
«их 212 «її» 11 хай РЕК «2135 Мото зарієпуз -й00» 212
Азп тів ті сти Аа їі А5п бій фей фер Уа! 1 5 10 «ТМ 213 «2115 5 «12» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4002 213
Ага ей ем тус 4іп Сен маї РВе ге ї 5 «210М 214 казк 5 «2122 РЕК «15» Ното зарівпе5 «4002 214
Ага сви боїв би вец Тагосїз вуз ви 1 5 «410 215 «211» 9 «10 РЕК «2135 Ното 5аріепо5 ках» 215
Уві Меї сів др ї1е ма! тТуг іуб5 їв ії 5 «Оз 216 «Ті» 9 «1» РЕК «2135 Ношо 5зарієпе «йпюх 716
Теросен АТа сТу Азр уві Рго АЛа Аа ї 5 «ие 21У «ії» 10 «12М РЕК «213 ново зарієепа: «00» 217 й
Аїа гей Азр б бро Вго Туг мец ТВ Уаї ї 5 10 «Ох 218 «2115 1 «Кіз ВЕР хеіїх Но 5арівп5 «005 218
АТа ге о1у бі» сів терогуз С1у туго маї ма 1 5 10 «ем 219 «11 З «122 РКК «213» Но 5арівпв «ФО» 219 діа їеу ве) деп івеи ген боїв бег Аа 1 5 «2102 223 «211» 10 «2125 ЕТ «віз» Ното зарівп5 «00 0220
А1іа ген вго ой ї1е ге Ре Аїа їуб5 Уа ії і 10 «МІ 221
«їх 9 хйїбх РЕК «2132 Ното 5зарієеп5 «Ох 21 діа гец ма1ї 5ег те 116 ті Мех ха! ї ч «ЙМх 222 «віїх З «ех РЕ «2133 нОото зарієпь «А00х 222 діа Сец Тер о бТй без бек ген гу Те каЗМ» га «2112 10 ке» ВЕК кД1з» Мото зарівпае «а00з 223
Аїа їей Тер ма! зек сів Рго Рго бім їїе ї 5 зо хе гий «2115 5 «кій РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 224 мів Меї и Аїа Сен чаї маї бін Уаї «2105 225 «г1іх 10 «2и10з РЕК «213» Ното зартіеп5 «ЗК» 225 тІіе гей Сів біц Аго зі) Те фей Рго хаї 1 5 10 «2105 225 кеіїж З «21» РЕК «13» Ноще 5аріепе «400х 226 аа Мек Ап о тТе 5ег ха Рго сп Уа! «й» 287 «135 1 «біг РВК «213» Нео заріспе «40025 297
РНе ец Аїа ої АЇя бек ома! Ме те сти ген 1 5 10 «іх 228 «235 9 ке м РЕК «213» Ното зарівпз» «4005 228 І й
Реве тен о1у бу свв чего рРго біу Уаї ї х «ах 279 «131» 10 сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе5 «Ще 299 :
Ре еп фей доп сей сів Ази Суз Ніз бен 1 5 10 сеї 230 кезіїх 10 «2123 РЕК
«гіїх оо зарівп5 «ах 230
Рйе їги бій Ар чер огуз ма! 12 РБе маї ї 5 10 «30» 231 «г1іж 9 «й1йх РЕК «ві3х Нощо зарівене «йод 231 ре Ген Тук тіє Аку бій тез Аїа тв і КІ «22 0232 к21іїх о кхаії» РК «2132 Ново зарієпе «400» 235 вне мес нія сіп хів І11є дер сів ма 1 5 «2» 933 «ії» 9 хе РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «400» 233 у Іі пе А5р 16 дев Ма! Аго бе і 5 «г» 234 «211» 5 «12» РЕ «21їх Ното зарієпв «40025 234 су цеп Аза вро Аїа сій тує АТа г ви «е41й0х 235 ха» 9 «21225 РКК «гі3» Ното зарівейв5 «00» 215 сіу цей Яр Ар Сей їеи Ген РНе ей ї З «20» 235 «ої» 1 «й12з РЕК «813» Ноще «арівпе «ВО 236 біу ву ен) оїй Зег біу Ару Ні Тур ій і 5 10 «й10х 237 «г1ї» 40 к«еігм ВН «2135 Ново заріепе «й00х 237 сі Ген бій бТи Абп о СеноАвро ма! Ммаї ма і 5 10 ко 238 «еїїз З «ей М РЕК «13» мово зарієпь «4002 238 пу ем ма1 сту Те сії бен бій реи «КІіх 239 «2115 9 «12 рег хг13х Ното зарівне «4005 279 те сен Аа Ту Зв Мет ген бек ма! хх 240 «21125 З «212» РЕК «24ї3ж Ното зарієпь «4005 240 тТ1іє гей АТа Ага АзроТіє Гей б1и К1е ї 5 «гм 241 хеїіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «Кр». 241 те Се Лу Ар те їеи ву уз ма
Я З
«йи102: 242 «їх 8 «219» РЕК «сеіЗ» Ното зарієпе «Ох 245 те Сеч бен Ту ТТе біп бів бен гей «2105 7243 «її» 11 «кгзйю РКК «213» Ношо зарієпе «4005 243 Й
ТІТе бен вго Те без бін Гуз сін бен вве тей ї 5 10 «М» 244 «2115 98 «езЙйхм РЕК хх» Ното 5арівпь «4002 2448 те ги ол 18 єв Аїа ма! ніз гец «10х 245 «ії» 41 «вій РКК «213» Ното зарівп5 «ак» 245 уз Ііе Меї Ар туго чего грец бе ви бі ма! ї 5 10 «8302 245 «Р1їх 9 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «МК 246 о цу цезар б Твг су Уві АЇа ей
Я й «Й» 247 «г1ї» 9 козйх РКК «віз» ноша 5арієпе5 «(Ох 247 їх ей бує АЗроАгО бе) Рго хег Те ії з «2 248 «кії»х 10 кеїгх РЕ «2135 нНошо зарієп» «4005 248
Се тТигомаЗ бі Бго вБго ті бек обіл уаї 1 5 10
«Мр 289 «її» З «їх РЕК «2135 Мото зарієпз «400» 2
Гей бен обро Таг о сіу уаї Ре бій Ма 1 5 «й 250 «21ї1з 11 «гії» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4005 250
Сезон о маі бТл ав его А5робіу Бей Меб У ї 5 то «210хМ 251 казк 5 «2122 РЕК «г13х Ното зарівнп» «0025 251 ем геи Тук дар дви чаі Рко 1у А1а 1 КІ «віх 252 «211» 11 «10 РЕ «2135 Ното 5аріепо5 ках 252
Азпо Ге) ін дер орго оту бег бер Туг іч Гей ії 5 10 «255 253 «її» 11 «1» РЕК «2135 Нощо 5зарієпе «й00хм 2753
А5п о Мбен Тер о5еб маї А5робіу сн ма! те ув! ії 5 10 «Бе 254 «ії» 95 «12М РЕК «213 ножо зарієепа: «40025 254 сів Пен ї1Те рго Гуз Ген їі Ре гей «Ох 255 «2115 9 «Кіз РЕК хеіїх Но 5арівп5 «4005 255 туго реи РНе 010 сіб дта лів беб чех 1 5 «810х 256 «гії» 31 «122 РКК «213» Нощто зарівпв «400» 256 сіп ее) фе) Рго ма! 5Зег Ази чаї Уаї 5ек ма 1 З 10 «вій» 257 «і» 10 «2102 РКК «віз» Ното зарівп5 «400» 257 ага їїе Пе абмпооіу ї1е їі їТІе 5ег мді ії 5 10 «М 258
«1їх 9 хйїбх РЕК «2132 Ното 5арієеп5 «фр 258
АгФ Ген АЗоОотуг те тигоАїа сін те ї ч «Й 259 «в3їх 10 «1 РТ «2133 нОошМо зарієпь «400» 259
Ако Гей греч Азр біз бів Ре АТа ма! Кед ї 5 10 к2Мі» 260 «гії» 10 ке» ВЕК кД1з» Мото зарівпае «а00з 250
Берк Гей Ар Ар Уа! сій сбіу мес бек Уді ї 5 то хо 261 «211: 10 «кій РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 261 5егоТги ма1і 0100 АТа сій зіу Тгробеу Уаї ї 5 о «2105 252 «ож З «210 РЕК «213» Ното зартіеп5 «00» 252 5ег еп Тер деп АЇа сіу Те бег Уа! 1 5 «2105 263 кеіїж З «21» РЕК «13» Нотео 5аріепе «400х 253 зет спів Тер Ті зр тів ніб ма1ї Уа «1» 2654 «2115 З «біг РЕЖ «213» Нео заріспе «-400з 254 те Ії фем ар тук Т16 Ап ота! Уа! 5 «еійх 265 «ії» 4 ке м ВЕК «213» Ното зарівпз» «4005 265. І
Твгоїен гей ва Авр дзроіен бій тів гу5 1 ен ї 5 10 «ем 256 «131» 0 сеі22 РЕК жке13» Ношто зарієнпе «К- 266
Те обей фей дер сій гей АзротТвВе біл ев 1 5 10 сеї 257 кої» 9 «2123 РЕК
«гіїх оо зарівп5 «400 267
Тк гей їеи Азро тер сій Ар бек гей 1 5 «а» 258 «г1іж 9 «й1йх РЕК «ві3х Нощо зарівене «ках 258 й те меш Бен бів Ма! рве нів бен ген а «2302 0 269 к2іїх о кхаії» РК «2132 Ношо зарієпе «400» 259
ТБт бен Тг о Азрооіч бій Рбя бен ма 1 З «2 27а «кії» 10 хе РЕК «2135 Нощо зарієпе «4й00х 270
Те Ома! ем Рго Уві Рго рРго ген бег Уді ї 5 10 «Мі. 271 «211» 5 «взї2з РЕК «21їх нот зарієпв «40025 271
Уа! ті Ага А5п те ма! зії Ма Аа «ех 272 ха» 9 «2125 РКК «гі3» Ното зарівейв5 «400 272 ма! бе Ав біц Бей бго Ро бен їв ї З «Ох 273 «ої» 9 «йї2з РНК -233» Нощо «арівпе «ВО» 273
Уві мен Ф1У оц тТуг бог тук фей ву
Її ій «10 274 «г1ї» 40 к«еігм РН «й132 Номо заріепе «й00х 274
Уаї їеч бем бТи Тук Ні 11 Аїа Туг і ец ії 5 10 хо 2у5 «еїїз З «ей М РЕК «13» Мово зарієпье «4002275. та! Геч гец РБе пе Фін Ні бек ма! «іх 276 «2115 З «12 рег «213х Ното 5арівєне «4005 276 уа! Сем Ал АБр чу Аїа Рго й5а Ма)
ОО
«2115 З «212» РЕК «24ї3ж Ношто зарієпь «4005 277 маї мех ті беи Сує Гец о Рко РВе гей ї 5 «Р10х 278 хеїіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «а» 278 тує Се) Ар Ар гей тем Рго губ Сен
Я З
«йи102 279 «їх 8 «2192 РК «сеіЗ» Ното зарієпе кб 279 тус мес АТа Рго оіц маї Уаї Сн АТа ії 5 «21 280 «ії» 10 «кгзйю РКК «213» Ношо зарієпе «4005 280 Й туго Тс обем Ар о бегоїен тує Тер бев уд ї 5 10 «хх 281 «8115 1 «езЙйхм РЕК хх» Ното б5арівпь «4002: 281
Азпоіеч ій Ар Ар Агу б1іу Ме Тк Ав Тен ї 5 чо «210хм 2872 «21125 З «вій РКК «213» Ното зарівп5 «ай» 282
Кен ей Аго Ар осіу тт біз зей тУаї ї З ей 283 «Р1їх 9 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «Кр 883 те Гец сів Рго Мет Ар їі нів ма!
Я й «и» 284 «гії» 10 кози РКК «віз» Нота 5арієпе5 «й00х 254 іш їеу чег АТа АТа б! Рго ма! Вго Аа ії з 10 «215 о28а «кіїмх 11 кеїгх РН «2135 нНото зарієп» «4005 285 сіу ма! АТа тг о АТа ау Суб ма! Ази 1 ма
Її 5 10
«йМх 286 «211» 10 хай РЕК «2135 Мото зарієпу5 «400» 285
РНе бен ге СТИ Ар оГен бек бій гу5 ге) 1 5 10 «ТМ 287 «її 0 «гії?» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4005 2587
Ве сен Ткр бю ав Гуз Ре АЗпобек гц ї 5 юю «210» 285 казКк 1 «2122 РЕК «г13х Ното зарівнп» «0025 88 су ви Аїа бій 5ек о лйг о сіу зей гей АЇа ма 1 5 10 «Ех 289 «211» 11 «10 РЕ «2135 Ното 5аріепо5 кв 289 те ге сін бий 5іп рРго Меї А5р Мет іец ей ії 5 10 «05 2590 «їі» 9 «1» ВЕК «2135 Ношо 5зарієпе «Юм 790
Га АіЗа АзпоРго Ні біш Сецоб5ег рем ї 5 «20 291 «й1їз 11 «12М РЕК «213 ното зарієепа: «00» 291
Тіє ген гей ад5п біз Ар Ар оїец Ма! Тк Те ї 5 10 «Ох 295 «2115 9 «Кіз РЕК хеіїх Но 5арівп5 «005 0292
АТа АТа Ма бен ті ї1Те ні5 віз Уаї 1 5 «810м 293 «зії З «122 РКК «213» Но зарівпв «400» 293 та їеи Або у1е Мес її Вко мет Уа! 1 5 «2102 294 «ії» 10 «210 РКК «віз» Ното зарівп5 «00» 294 іа ген ген А5робіп ге) Ні ТрРіви зе ії 5 10 «М 295
«1їх 9 «йи1їйх РЕТ «2132 Ното 5зарієеп5 хар 295
Аїа ген тен віп уз ей біп сів і ги ї т «ЩІ 296 «в3їх З «1 РТ «2133 ношМо зарієпь «а00» 295 рпе хі АТа Рго пе о б1у Ні Зег ем «к2Мі» 297 «гії» 11 «2г12х ВЕК кД1з» Мото зарівпае «003 257
Рпе ген маї біш Рго сів бін А5р тТиг Ага ген ї 5 то хх 298 «2115 5 «125 РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 298 те І1ї2 їв Рго т! «ій маї с1и Уаї «2105 299 «орі З «210 РЕК «213» Ното зартіеп5 «30 2 тів еп бін Бій А5п о тіе Рко Ууаї Бей 1 5 «105 00 кеіїж 11 сід РКК «13» Ноте 5аріепе «400х 300 тІ1е Сен бен дп Рга Аїяа туго Азрома! Тук Теги 1 5 10 «ій» 301 «2115 З «біг РЕЖ «213» Нео заріспе -400з: 301 діа Аіа 5ег Рго Хі тіє тТаг ем Уві 5 «еійх 302 «ії» 10 ком РЕК «213» Ното зарівпз5 «4005 302 те тен біл ар оієц Тйг о Рве маї нів без ї 5 ї6 «210 303 «211» З сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе5 «а 303 тів Кей Бек біп Рго Твг орга 5егобей 1 5 сеї» З04 кої» 9 «2125 РЕК
«Фіїх оо зарівп5 «400» 304 їей Аїа Те Уа! го ма! Ази тНе гей ї 5 «о» 305 «231їж 1 «212 РНК «ві3х Нощо зарівене «(р 305 й
Мец бен Ре го біпоїіе біз сію тів зуз тіє 1 В Ів) «23105 зов к2іїх о ка1й» РЕК «2132 Ношо зарієпе «400» 306 чаї ма! АЇа січ би Мбеб бін Ап Ма 1 5 «210» 307 «ії» 9 хе РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «400 307
Ген Сем гемо Твгобуз Рго Те си АТа
КЕ З
«2 ОВ «211» 10 «12» РЕ «21їх Ното зарієпв «40025 308
Бег іги Тук др оуаї 5ег Акб Меє Тук о Уаї 1 5 то «10х 309 ха» 9 «2125 РЕК «гі3» Ното зарівейб5 «00» 309
ЖХіе меип Туг о біу Тк осів рРБе Уаї Бей 1 З «230» 330 «ої» 9 «йї2з РНК -233» Нощо «арівпе «ОО 310
Гец беу сек так огец нії Гез гей Уа! 1 5 «й10х 11 «21ї» 89 «а12» РЕ «й132 Ново заріепе «ах 1 си Сен Ма! А5р Уа! сі Рго гу ма! ком 3152 «її 10 «ей М РЕК «13» Мошмо зарівпе «ейО0з 312
Ген оїем Туг Ази бег ТР о АЗв о Рго Тк рез 1 5 10 «ех 313 «2115 10 «12 РЕК «213х Ното зарівєне «4005 313
Гей Мет АЇа Брови бі біу гей нНіз без ї 5 10 хх 314 «211 5 «212» РЕК «24ї3ж Ноо зарієпь «0» 14
Ге мет уз Ар Суб сій АТа сту маї ії 5 «210х 315 хеїіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «а» 315 і ем Уві Тук й Аза рго із тНк чаї
Я З
«из ЗІ «їх 8 «219» РЕК «сеіЗ» Ното зарієпе кох 316 чес Сеч бен ой нія б5іу Х1іе Твгогей «й 317 «вії» 9 кгзйю ВЕК «213» Ношо зарієпе «й 3 Й
АзпоСен бем АТа нів їїе Тер АТа їв ії 5 «230» 318 «2115 98 «езЙйхм РЕК хх» Мото 5арівпь «4100» 318 дво їеч ба та нт сій рко тТие ма! «10х 319 «2112 З «вій РКК «213» Ното зарівп5 «й» 319 сіп маії 112 его зіп о беи оїй Те Уаї ї З «8105 325 «Р1їх 9 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «а0йх 320 Й
Твпг Ііе АЇя Рго ма! тргоУді АЇа ма ї 5 «и» 321 «гії» 10 кози РКК «ві3з Ноща 5арієпе5 «Ох 321 дго бен бем Ти РНе біб їез Аа оп ей 1 5 10 «25 392 «Кії»х 89 кеїгх РН «2135 нНото зарієп» -4005 322 зе ем Аїа баг те Ніє маї Рго гей
«их 383 «її» З хезійх РЕК «2135 Мото зарієпуз «400» 323
Берг бен дер гей ре деп Су бій Уа ї 5 «ТМ 324 «2115 5 «12» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4002 324 ар оїем Тук обег Аїв Сен ооіп б1п АТа ї 5 «210х 375 казк 9 «122 РЕК «15» Ното зарівпе5 «4002 325
Те сви б10 депо зіу ма) Рго Су ма 1 5 «вх 328 «гії» 95 «10 РЕК «2135 Ното 5аріепо5 ках» 326
УВаі Се) Аа Рае іец маї ні сін ген ії 5 «105 327 «Ті» 9 «1» РЕК «2135 Ношо 5зарієпе «а00х 327 чаї мен Пе зу ткр о рРНе Рго с!н маї 1 5 «ие 328 «ії» 19 «12М РЕК «213 ното зарієепа: «400» 328 маї сем ей рго біподбів Тве Аа бій хїе нів ген ї 5 10 «ох 329 «2115 9 «Кіз РЕК хеіїх Но 5арівп5 «800 3295
Ууаї ви мех др сіу зег ма! зуз і ви 1 5 «ке10м 230 «11» З «122 РКК «213» цощто зарівпв «400» 330
Ма! їеу мет Тер обі їіїе Тук бер овбеу ї 5 «ві0з 331 «їх 11 «2102 РЕК «віз» Ното зарівп5 «00х 331
Уві ген Тер оТй бец Аїд Ні Бен бро ТЬг ей і 5 10 «М 332
«1їх 9 хйїбх РЕК «2132 Ното 5зарієеп5 «ЗХ 332 ма1ї мес тів сп ні5 Уві біз дп гей ї ч «»Мх з «в3їх 11 «1 РТ «2133 ното зарієпь «400» 353 чаї тик реч би Ре овко бій іеч Тіе Аку ув! ї 5 10 «Мі» 334 «гії» 10 ке» ВЕК «Ді» Мото зарівпае «а00з 338
ТуУук цен рем бій 01» Гуз їів Аза бетг без ї 5 то кох 335 «2115 95 «кій РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 335 т ги тук бТп біч сів тує РНе І1е «2105 335 «ож 9 «210 РЕК «213» Ното зартеп5 «400» 335 тут Меї АТа ма! тт о тйгобіп сій Уа! 1 5 «2105 З3У кеіїж З «21» РЕК «13» Нота 5аріепе «400х 337 тує Мес Туг ЄТи бух ої бек осі Кен «й» 338 «2115 З «біг РЕЖ «213» Немо заріспе «-400з: 338 рне іеи Азр Меї ТНК АБО ТеВ Аба ви 5 «ах 339 «ії» 9 ке м РЕК «213» Ното зарівпз» «4005 338 зі Тем Тко бу їв маі маї Аз» хе ї ке 340 «13» 9 сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе5 «4ащь- Зо | й бує еп еп бій сій Те су дп бен 1 5 сах ЗА ке1іїх 113 «2123 РЕК
«Фіїх ото зарівп5 «00-х зА1 їей ї2ги Аїа біо гей бго діа бер оуаї Ні Аїа ї 5 10 «10» 315 «г1іж 9 «й1йх РЕК «ві3х Нощо зарівене «(Кр 342 Й
Зег Ген Те ТК оРго Ге біл Аїа уаї і З «210: 343 кіїх о кхаії» РК «2132 Ношо зарієпе «400» 343
ТБг бен бен оЇч АТа Мен дер Сув ТВ 1 5 «25 зЗАА «ії» 9 хе РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «4005 344 ха! Сем АТа Ре б деп Рго с1й ма!
З
«МІ». 345 «211» 12 «взї2з РЕК «21їх нНото зарієпв «4005 345
Тук ги п12е біш Рго Ар ома! о1й гей сій Аго тів ї 5 то «ке0х 3 ха» 5 «2125 РКК «гі3» Ното зарівейб5 «4002 345 ма! бе маї біп ма! 5Зег о рго бек бен ї З «вій» 347 «г1їж 9 «йї2з РНК «213» Ноще зарівп5 «800» 347
Тут кеу с1у вго ма! чЗег рро бер їв 1 й «10 зав «е1ї» 40 к«еігм РН «й132з Номо заріепе «ах За діа ген АТа ім5 Рго Рго Уаї Ма! Зег мді ії 5 10 к2 ще 349 «ії» 9 «ей М РЕК «13» Мово зарієпье «4002 З дів Сем АТа твВг нів Її ен Зек ви «ех 350 «2115 З «12 рег «213х Ното зарівєне «4005 зо
Дія ем сш Ар ага Уа! Тер Їм вем «10х 351 «211 5 «212» РЕК «24ї3ж Ното зарієпь «400» з51
АТа гей бек бій бує сей АТа Агу ей 1 5 «2305 352 хеїіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «В» 352 ів йеш Уа! Ре 51 ге нів Туг маї
Я З
«100: 353 «11х 9 «219» РЕК «сеіЗ» Ното зарієпе «400» 353
А1їа тик вго МмекоРко тиг о рго хег Уа ії 5 «й З5А «йї3ї25 12 «кгзйю РЕК «213» Ношо зарієпе «4005 354 Й
РНе тів Ме Азр А5р Рго дів сб1У АБ бас туго бен ії 5 10 «2» З «2115 98 «езЙйхм РЕК хх» Мото 5арівпь «4100» 355 ене їі Ткр вро мех ген їів віз Те «10х 356 «2112 З «вій РКК «213» Ното зарівп5 «ай» 355
Рйе гей ні Ар Ні сіб А1З3 си ви і 5 «2105 357 «11» 9 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «00» 357 й ве йеш Те 610 оіц жтіє цу5 Тк ей
Я й «Й» 358 «ЇМ З козйх РКК «віз» ноша 5арієпе5 «ах 358
Ре еп ТПг о АЗротує бе) деп йвроген 1 Бй «215 359 «вії» 10 кхеї2гх РВЕ «2135 нНошо зарієп» -400з 350
Рие Мек о біІп др Бго Меє бі ма! вве уаї 1 5 НЕ
«йМтх зо «211» 10 хезйх РЕК «2135 Мото зарієпуз «-4002 3650
Нів бен їі д5р тТНг Аза гу тів сЇп ге) 1 5 10 «210 361 «2115 5 «гії?» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4005 зб ліе гм я о Но сін бег гу Гей ї 5 ке» 362 к»зКк 10 «2122 РЕК «г13х Нощо зарівнп» «40025 362 іє сви Тк обі фец сіу сіу РБе біш ма! 1 5 10 «КО» 3653 «21ї1х» 11 «10 РНК «2135 Ното 5аріепо5 кох 363
Те їбг отак обїи ма! ма? Ап сів бен Тує ма! ії 5 15 «Оз Ба «їі» 9 «1» РЕК «2135 Ношто 5зарієпе «й0юх 364 їм Мет Азр тер оЗіе рРБе Ніб тиг о тІе ї 5 «202 365 «ії» 98 «12М РЕК «213 ново зарієепа: «400» 355
Сез тів бек рРго без сен іецн о рРго Уві ї 5 «Ох 306 «2115 9 «Кіз РЕК хеіїх Но 5арівп5 «4005 зб
Гей огец век 010 тб осСує маї тб т1е 1 5 «810х 367 «її» З «122 РКК «213» Но 5арівпв «00» 367
Ази оїеу тро обекогви ма! АТа уз Ма 1 5 «2102: 368 кез1їх 1 «2102 РЕК «віз» Ното зарівп5 «00» 358 біпоген сп Рго вт дер Афа ген оігн су Ма! ї 5 10 «М 3659
«е1їх 12 хйїбх РЕК «2132 Ното 5зарієеп5 «ЗК 369
Агов ген АЗр гей ою Ав чері ен ей зіу гей ї т «Й 370 «в3їх З «1 РТ «2133 нОото зарієпь «400» 370 зек хі ле АТа бек рго бін Зег ма «Мі» 371 «ії» 11 ке» ВЕК кД1з» Мото зарівпае «а00з 371
Бек цей АТа Ар Авр ек Ма! мем сім ага Ген ї 5 то хіх 37 «2115 14 «кій РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 00379 зег теи РНе біу Рго Гей рко б1м Рко сіу Рго Аїа гей ча! 1 5 То «2105 373 «г1іх 1 «210 РЕК «213» Ното зартіеп5 «0» 37
ТЕ еп бен Аа АБросів біу сій шІ1е Ак ма! 1 5 10 «15 Зий кеіїж З «21» РЕК «13» Ноще 5аріепе «4й00х 374 ув! цеч черг Уа! ХТе тк осів Фів бен 5 «й» 375 «2115 З «біг РЕЖ «213» Нео заріспе «-400з: 375 та! Гей тко вне уз Рго Уаі бім рей 5 «еійх 376 «ії» 10 ком РЕК «213» Ното зарівпз» «4005 375 й й маї еп Тук дп сіп дго маї б б1ш тів ї 5 16 «ке 377 «13» 9 сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе5 «а 377 Й . чаї ма! Абр обі тТнгоСух маї А1а Уа 1 5 сеї» 378 ке 9 «2123 РЕК
«гіїх оо зарівп5 «400» 378 тут лів ївеи Оу Гуз ве Ре А1а гей 1 5 «10» 379 «г3їіх 10 «12 РНК «ві3х Нощо зарівене «(р 379 й й туго Мен Аїя бій їецй о маі Те овго тів о бец 1 З Ів) «23105 зво к21іїх о к?ій» РЕК «2132 Ношо зарієпе «00» 380
Тут Сей Ар Ага буз МСеу Сен отиг рем 1 5 «КІ З81 «кії» 10 хе РЕК «2135 Нощо зарієпе «400» 381 тТУук гемо ї2гм СТ бій А5а губ 116 і уз і ец ї 5 о «МУ 382 «211 5 «12» РЕ «21їх нНото зарієпв «4005 382 па Сецп ге рго цем Сей зіп Агд ви «210х 383 ха» 9 «2125 РЕК «гі3» Ното зарівейв5 «00» за3 Й тут еп Беп о Аго зії Тгр Маї Аза Бей ї З «Ох Ва «ої 11 «й12з РЕК -233» Нощо «арівпе «800» 355
Тут Маї Ше о1у Зег бі Уа! СТУ АП тує тей
І ій о «210 з85 «г1ї» 9 «а12» РЕ «й132 Ново заріепе «й00х 385
Туг Тг Ле рго Гец Аїв їів зу ги коми. 386 «аї1їз 9 «ей М РЕК «13» Мово зарієпье «4002: ЗВ ге бен о1у др їх У Бін Аа рем «210» 387 «2115 З «12 рег х?13х Ново зарієп» «4005 387
ТУк цен піе кеи ех Зек нія 5іп Гбем «10х 388 «211 З «212» РЕК «24ї3ж Ноо зарієпь «400» за сіу гей фей бег Аїа сей сій деп Уаї і 5 «210х 389 хеіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «РО» 389 о1У Ге) АТа АТа їец Аїа маї Ні Ген
Я З
«из 390 «11х 9 «219» РЕК «сеіЗ» Ното зарієпе «400» 396 сту це сш сій Агу бе тує Тег АТа «2 З «її» 9 кгзйю ВЕК «213» Ношо зарієпе «4005 391
Ре цен бем сій АК бі бія Бей о веги ії 5 «230» 392 «ії» 10 «езЙйхм РЕК хз» Мото 5арівпь «4100» 392 не їгеи Ткр бі» Агу вго тйг зей бе Уа ї 5 то «210х 393 «ії» 10 «вій РКК «213» Ното зарівп5 «Ой» 393
Рпе маї мех бій Фі зи Рко Рко гж5 Бец і З 10 «210 394 «11» 9 «212 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «00» 394 й те Сец бек Так ооіц тіе Рбе сіх ма!
Я й «йо» 395 «ЇМ З козйх РКК «віз» ноша 5арієпе5 «ах 395 діа ей Туг Ту бух бе) ге) фу бен 1 х «2105 396 «віїх 8 кхеї2гх РВЕ «2135 нНото зарієп» -4005 395
Тв Сем гц бу Сив аї1в Уа! таб гей
«ЙМх 397 «її» 11 «ех РЕК «2135 Мото зарієпуз «400» 397
РНе бен оРро Рго сі Ні ТВг оті Ма! тук іє 1 5 10 «ТМ 398 «21ї1з 11 «гії?» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4005 398 вне ги АТа бі без вго бі бер грец бер ген ї 5 не «210» 399 казКк 1 «2122 РЕК «г13х Ното зарівнп» «005 399
Аа ви Аїа Аа Рго Азротіе уаї Рго АЇв їей ї 5 10 «вх 400 «гії» 10 «10 РЕК «2135 Ното 5аріепо5 ках» 200
Аїа ге) вне бій рго ні Ге ї16 Ап маї ії 5 10 «Оз 401 «її» 10 «1» ВЕК «2135 Ношо 5зарієпе «Юм 401. діа Мес АЇїа Ар Муз Меї Ар Мет 5ег зей 1 5 10 «і 02 «ії» 10 «12М РЕК «213 ново зарієепа: «4002 402 без сем маЗ бег А5посен Ар Ре бу Уаї ї 5 16 «Ох 403 «2115 13 «125 ВЕР хеіїх Но 5арівп5 «400 403
Епе ІТ2 мех Рго діа їйгомаї Аїа ар Аїя твг Аа ма! ї 5 10 «ем 404 «11» З «122 РКК «213» Но 5арівпв «ФВ»
Рйе ї2гу сів бро Ар Ген АЮ бек обец 1 5 «еі0з 405 «е1ї1» 10 «210 РКК «віз» Ното зарівп5 «хх 4305
Ре ген маї ой уз бій рРго веб Та маї і 5 10 «Ме Об
«1їх 9 «йи1їйх РЕТ «2132 Ното 5арієеп5 «а00х 406 ре ген тео РгО уз оіш Ууаї сн гей ї т «Й 407 «їх 11 «1 РТ «2133 ното зарієпь «00» 407
Ре мес Пе а5р АЇТа бег Уа! нів Ркго ТК ей ї 5 10 «2» 08 «ії» 11 «2г12х ВЕК кД1з» Мото зарівпае «8002 408
Рипе мат узі А5р Ап сі Аїа т1іе туго АБО тів ї 5 то кої» 09 «2115 5 «125 РЕК хг13» Нопюо «дрівпе «43005 0403 пу ги Або АВ ма твс Аїа те Уаї «2105 415 «г1іх 10 «210 РЕК «213» Ното зартіеп5 «4005 410 сім гей Рпе азр Я41у ма! Рко тас твг Аїв 1 5 10 «кіз А
Фаії» 13 «125 РЕК «г13м Ното зарієп5 «005 1
ЗУ мбец РНе бій Ар ома! те бій Рго біу пів веи бец 1 5 10 «830» 412 «ім 1 «2123 РЕК «2132 Ното зарієепе5 «дО» 415
Ів се) сіу тс озій Азр оса) Ті маї 5 ма! і 5 10 «оз 413 «к2і3їм 11 «гМ1йж РЕК «132 Ното заріепе хаос. 413
ІТе їеу Бей оц ні сіу АТа Ар о Рго депо ец 1 5 10 «ей Аа «г1ї» 9 «2125 ЕТ «віз» Ното зарівп5 «00х 414 те Кен бег ма! ма! яп оЗек сів ів «М 415
«1їх 9 «йи1їйх РЕТ «2132 Ното 5зарієеп5 «00 415 т11іе еп маї таг зег 116 Рпе РНе гей ї ї «М 416 «в3їх З «1 РТ «2133 ношМо зарієпь «00» 415 пе Ммек біч Азр їТе їі Ген ТК бе «2» 417 «гії» 11 «2г12х ВЕК кД1з» Мото зарівпае «8002 417 тів сів тіє сім сію сій тВг ма! Те тиг Уа 1 5 то хкеїйх 18 «2115 5 «125 РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 418 те маї тк пе Ііе бек б1ш те «2105 419 «ож З «210 РЕК «213» Ното зартіеп5 «МК 419 цен еп Аза біц зів те біз сів Уаї 1 5 «105 420 кеіїж 12 сід РК «13» Ноте 5аріепе «400х 4270
Сиз Сен Пе Ар оАЗробійп Абр Ті Зег т1е бегореу 1 5 10 «їй» 421 «135 11 «біг РВК «213» Нед заріспе «4002 А21
Су Ген Тер отвг об1уУ пі бен Аз; АЗИ ТК Ома 1 5 10 «ім 4 «115 9 ке м РЕК «213» Ното зарівпз5 «4005 422 Й й
Іув5 бів РМйе би вх Твеомаї бЇм хХ1е ї «ех 423 «211» З сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе «ав 423 Й
Мем оіеи ЇТ1е біу тнг о АБрома! бег обен 1 5 сеї 424 кеїіїх 11 «2123 РЕК
«Фіїх Нощо зарівп5 «400» ага їей їги РКО ро Бей сф бегоїец АТа ТНг ма ї 5 10 «30» 425 «г1іж 9 «12 РНК «ві3х Нощо зарівене «ках ад5 й й ем Геї ак дер чаї дга РНе Уа! еп а «230: 425 кіїх о к?ій» РЕК «2132 Ново зарієпе «00» 425
Гяч Сей Тер оту АЗИ Мен Рго сн те ї 5 «КІ» 427 «ії» 9 хе РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «400 427
Ген Сем Туг А5р Аа Уа! ні Ле ма!
КЕ З
«М 0428 «211» 5 «12» РЕК «21їх Но зарієпв «4005 428 цен Меї Тук о бго тує тів Тук ніз Уа! «ех 429 ка» З «2125 РЕК «гі3» Ното зарівейв5 «00» 429
Ази обец еп бій ТК огуз ем бів ей ї З «200» 430 «ої» 9 «йї0з РЕ -813» Нощо «арієйе «00» 430 біп кеу бе ой уч Ап о ткр Бен їв і й «10 431 «г1ї» 9 «азї2» РН «2135 Ново заріепе «ах 431 до мек Ма! АТа оп Ії сіп Азп маї 5 ком 42 «аї1їз 9 «ей М РЕК «13» Мошмо зарівпе «4002 432 зе Аїа ма1 дер сне ї1е Ага теор еи «ех аз «2115 10 «12 РЕК х?13х Ното зарієп» «405 3 зак тів гем Ар аку Азр Аз тіе Рпе Уа! ї 5 10 «Мах 434 «211 11 «аїл» РЕК «21ї1х Ношо зарієпь «4005 азА зег тів бій біп бек тіє 5іч Агро Бей без ма! ї 5 10 «2» 435 хеїіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «КІ» 435 зе Ге вне Ап іп ом уаї с1в Пе
Я З
«10: 436 «211 13 «2192 РК «сеіЗ» Ното зарієпе «ЗО» 435
Бег (Ге Бе 5ег 5егоїе) біз го сій ті бій Рко Уа! ії 5 10 «М» 43У «вії З кгзйю ВЕК «213» Ношо зарієпе «005 437
Зекоцеч бі Бго біп її бія вро ма ії 5 «210» 438 «8115 її «е42м РЕК каз» Ното 5арівпь «4005 438 5егіги Рне їі З1у сін іуз АТа ма! гез їен ї 5 ло «10х 439 «21125 З «вій РКК «213» Ното зарівп5 «а» 435
Зег еп їни дер бен нНі5 те о гу5 Уаї ї 5 -В10з 440 кіїх 1Х «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «щх мо чег Ген Бен бій 5іп біу Гуз бІ Рго Тер мет Уві і 5 10 «из 441 «гії» 11 кози РК «віз» ноша 5арієпе5 «Ох 441 аг о геп їен ЗТ Маї Азп о біб АЇа Зег бек уві і їх 10 «2 442 «кіїх 172 кеїгх РЕ «2135 нНошо зарієп» -400з 442 бер отем дп ар еп ПТН 1ує Азр ма! Меї їн бен
Її 5 10
«Мр Аз «211» 10 хай РЕК «2135 Мото зарієпу5 «400» 443
Бек бен тйг ХТе А5росіу тів туг Тук Уві 1 5 10 «ТМ 444 «2115 5 «гії?» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4002 444 аромат бек бім Тк о Ааросіп ча! Кей ї 5 ке» 445 «зх 41 «2122 РЕК «15» Ното зарівпе5 «40025 445 ма) хтів їт1з був бі беи біз бін тів тв ма! 1 5 10 «вх 445 «211» 9 «10 РЕК «2135 Ното 5аріепо5 кох 446
Маї те фен Твг о 5ег бег рго ВНе і ен ії 5 «105 447 «Ті» 9 «1» РЕК «2135 Ношо 5зарієпе «Ох 447
Уаї мен Азр Ар бек Ї1е Тук бен ма1 1 5 «2 448 «ії» 98 «12М РЕК «213 ното зарієепа: «400: 448 ха! Мак Азл. Ар во сен Туг Аа те кох 45 «2115 9 «Кіз ВЕК хеіїх Но 5арівп5 «4005 449
Ген геи Абр Аїа Мес дп туго віз г ви 1 5 «ем 450 «11» З «122 РКК «213» Нощо зарівпв «ФО» 450
Ма! їеу б1у Ро бу Рго Вро Рго сей ї 5 «війз 451 «іх 9 «2102 РЕК «віз» Ното зарівп5 «00х 451 ха! бен Пе о Туг дбп рРНе ек Пе «2 42
«їх 9 хйїбх РЕК «2132 Ното 5арієеп5 «а 452
Маї Ге тен 5ег ец тем бі Був чаї ї т «М ав «віїх З «ех РЕ «2133 ношМо зарієпь «400» 453 Й зек Сец реч Рго Ге Уа! Тер гу Те «ВМ» 454 «її 11 ке» ВЕК кД1з» Мото зарівпае «8002 454 маії еп меж Ар а» сіу Аїа маї бем тТиг цен ї 5 то «10» 455 «2115 11 «кій РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 455
Узі Геи Рго Ар оБго ЯВИ маї гей бій Аїа ді ї 5 о «2105 455 «г1іх 10 «2и10з РЕК «213» Ното зартеп5 «ВК» 455 тут АТа Аїа Рго бі сіу їви їі 01у ма! 1 5 10 «2105 457 кеіїхж 11 «21» РЕК «13» Нота 5аріепе «400х 457 тує Ті мех Ти Рка бек тів Ррбе Ап те їеи і 5 10 «ій» 458 «2115 З «біг РЕЖ «213» Нео заріспе «-400з 458
ТУг Іфе ба оїш ніз сеу ген бів т1е 5 «їх 49 «235 9 ке м РЕК «213» Ното зарівпз5 «400» 459
Тугк бе а5р Ре дек АБ АЗп Аго Гей 1 «10х 460 «1» З сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе «ащь. 480 , Й . тук сей бій дер сі ве діа тує Уа 1 5 евід» 4Б1 кезіїх 10 «2123 РЕК
«гіїх Ното зарівп5 «400» 4681
ТУР Гей іївеи дп рей Ази Ні зей б1у гей ї 5 10 «Оз 457 «г3їіх 10 «12 РНК «ві3х Нощо зарівене «(юр 452 Й туго МаЗі Бен овго ої уз бе туго Уа! суб вец і З о «з 463 кіїх о ка12» РЕТ «2132 Ношмо зарієпе «00» 463 діа Сей мет АТа ма! маї чего с1іу ем 1 5 «2 464 «ії» 19 хе РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «400 464 діа Ген 5ег Азр бій ТпгоГуб АзпоАзп тро ін маї ї 5 10 «210 455 «г11їз 12 «взї2з РЕК «21їх Ното зарієпв «4005: 465 вне їеи Тук др сін тів зії Аза бід Маї деп рен ї 5 то «ех 456 ка» 10 «2125 РЕК «гі3» Ното зарівейб5 «4002 265
Ре сей Тук о А5розіц їіе біз АТа бій ха! ї З 10 «230х 457 «ої 11 «й12з РЕК «213» Ноте зарівп5 «00» 457
І1е Меї сій др Рв РО д1в сів 16 па ви 1 5 10 «10 468 «г1ї» 9 «азї2» РН «й1325 Ново заріепе «й00х 4658
Гуз ІЗе спа оТю уТе Себ таб сіп ма! ко. 4659 «аї1їз 9 «ей М РЕК «213» МНожо зарієепь «й002 459 зег Ген Азр СТУ Те Фін їв бій ви «іх 4/0 «2115 9 «12 рег «213х Ното 5арівєне «а а7о
Тит цей пк АБИ пе тів нія А5п рем ких 471 «2115 10 «212» РЕК «24ї3ж Ното зарієпь «4005 471
Уаї гей їеи Аа Аїа сфу Рко бек А1а Аа ї 5 10 «аю» Ат кеіїіїх 10 «21223 РЕК «213» Ното зарієпо «КІ 47 тус бен вне оіц 5ек бі біу ін ма! ієц ї 5 10 «из 473 «31 10 «2192 РК «сеіЗ» Ното зарієпе «Ох 473
А1а ген Аїа Ар оАвр д5р о РВе гей тн ма? ї 5 10 «им: 474 «її» 12 «кгзйю РКК «213» Ношо зарієпе «4005 474 Й Й
А1їа сен АТа Ар еп її бін руб он ї2ц баг чаї ї 5 10 «М» 475 «2115 98 «езЙйхм РЕК хз» Ното 5арівпь «4005 475 дв іїеч Азо Ар мех ІїТ2 5Зег Тнеб гей «іх 475 «21125 З «вій РКК «213» Ното зарівп5 «ай» 476 та гей т1е тагозіц ма! маї Ак ви ї З «2105 477 хк1іх 14 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «ще 477 Й діа Мен ей дер зіп тргогу5 Те Бей іа бій бег АЇа ген
Я й ії, «й» 478 «гі» 11 козйх РКК «віз» Ноща 5арієпе5 «(Ох 478 лід Мет бе бТи 5егобЗес біп йзп ма! зїез їв 1 5 10 «2 479 «Кії»х 8 кеїгх РН «2135 нНошо зарієп» «4005 479
Тут мем АТа нНіз сне теє бів о1у гей
«М я «211» 10 «їх РЕК «2135 Мото зарієпуз «АЮ» 480
РНе бен Аїа СТИ Ар Рго гу Ма! тТиг гео 1 5 10 «2 81 «2115 5 «гії?» РЕК хеїхУ Ножо зарівєнпь «4005 ВІ
Рве ги Те Ар о ТНгобег діа бБег Мет 1 5 ке» 482 к»зКк 10 «2122 РЕК «г13х Нощо зарівнп5 «40025 482
Ре сви Тк одер обец сій Ар фей ТНгобев 1 5 10 «10 483 «гії» 9 «ій» РЕК «2135 Ното 5аріепо5 ках лаз
Ре ге Тк оби Мет маї ніз вне їв і З «Оз 484 «її» 10 «1» ВЕК «2135 Ношто 5зарієпе «а00х 484
Ре мен маі АБ бі рРго дго ма1! ой зей і 5 10 «20 485 «135 9 «12М РЕК «213 ново зарієепа: «400» 485 ву Пен сей др Суз Вго їі Ре гей «гм 4856 «2115 11 «віз ВЕР хеіїх Но 5арівп5 «4005 485 сім Геи фей др обец вго рРБе Ага маї с1у ма 1 5 10 «ем 487 ке1їх З «122 РКК «213» Но 5арівпв «ФО» ав сім у его дер б1у Аза» оВго бек ей 1 5 «вій: 488 «ії» 10 «2102 РКК «віз» Ното зарівп5 «ВЩООх 488 о1у чаї Туг А5робіу бю бів Ні 5ег ма! і 5 10 «М 489
«1їх 9 «йи1їйх РЕТ «2132 Ното 5зарієеп5 «(хіх 489 нНіз ген АЇа зп те Уві біз АгяЯ гей ї ч «ЩІ а9о «в3їх З «1 РТ «2133 ношмо зарієпь «800» 490 пе Сей Азр бій їз рко Уаї 11е Те кг» 191 «211» 19 «2г12х ВЕК кД1з» Мото зарівпае «8002 491 те ен РБе бег піц дер о Зег тТиг Гуз без вне узі 1 5 то ках 495 «2115 11 «12 РЕК хг13» Нопю «дрівпе «4005 492
І1є Теги гей АБ5родвр АБ Меї б1іп т11е Ага ги ї 5 То «2105 495 «г1іх 10 «210 РЕК «213» Ното зартіеп5 «40 493 цен їТе ТІ д5розіп Аа АЮ ї1е Туг бен 1 5 10 «215 494 кеіїж З сід» РЕ «13» Нота 5аріепе «400х 494 (ев Сен 1 Ар зеє Бек Рипе вне ен 5 «ій» 495 «вії 1 «біг» РВК «213» Немо заріспе «-400з Щ 495
Мец ен їеи Азр біб ої бі таб Ре бег ген 1 5 10 «іах 6 «ії» у ке м ВЕК «213» Ното зарівпз» «4005 496 Й
Ген бен ма! бі сіп вго Рко зей Аїа сіє та ї 5 16 ке» 497 «211» 10 сеі22 РЕК жке13» Нощо зарієнпе «ще 7 Й
Мен оіеи Терор ма! вго діа рРго бегобец 1 5 10 сеї ЛОВ кеїіїх 31 «2125 РЕК
«Фіїх Нощо зарівп5 «аб» 498 цей тТВг о АТа вро го сій діа зе гей Мес ма! ї 5 10 «2100» 499 «г1іж 9 «12 РНК «ві3х Нощо зарівене «ках 499 й й
Авп без Мет бій мет ма! А1в сіп їн ії 5 «2305 500 к21іїх о ка12» РЕТ «2132 Ново зарієпе «400» 500 біп тіа Пе таб беєомаї мУаї зег Ма 1 5 «25 501 «ії» 9 хе РЕЖ «2135 Нощо зарієпе «400 501 вв Сем АТа бен гу Уа! 514 сТу ма!
КЕ З
«М 502 «г11з 11 «взї2з РЕК «21їх Ното зарієпв «40025 502 сіп цес їви др оаіц 1вго5ев АТа ї11е те 1 ен ї 5 т «410х 503 ки» 10 «2125 РЕК «гі3» Ното зарівейв5 «4002 503 бій беп тує бій 5зіц го Азротве бу бев ї З 10 «Ох 504 «ої 11 «й12з РЕК «213» Ноте зарівп5 «00» 504
Ага ву Тук о бег о1іу її заг СТ бей оц їей ї 5 10 «2105 505 «е1ї» 31 «азї2» РЕ «й1325 Ново заріепе «й00х 505
Ага маі фем бін Уаї сіу Аїд їєц оп Аа Уа! ії 5 10 ком 506 «її» 1 «ей М РЕК «13» Момо зарієпье «й002 506
Бек ем геу Рго ее) дер о АбЗр тів Уа) Ага ма 1 5 10 «210х 507 «2115 11 «12 РЕК «213х Ното 5арівєне «4005 0507 заг сен ем ТВг обі сів Азв гей ткр оте Уа! ії 5 10 хх 508 «2115 З «212» РЕК «24ї3ж Ното зарієпь «4005 508
Зег оуді дер бег Аїа вго Аіїа АТа ма ї 5 «21» 509 хеіїх З «212 РЕК «213» Ното зарієпо «а» 0 509 те Сен с1п оц ма чаї тТве о с1х хаї
Я З
«йог 510 «їх 8 «2192 РК «сеіЗ» Ното зарієпе кох 510
Тк Уві Азоб ма! АтТа те о рРго чего Уа ї 5 «2105 511 «її» 9 кгзйю ВЕК «213» Ношо зарієпе «4005 511
Уаї беч АТа тує РБе Ген о Рго сн АТа ї 5 «210» 512 «2115 98 «езЙйхм РЕК хз» Мото 5арівпь «4002: 512 ха! ен 12 5ег у сен біп АТа 112 «2100м 513 «ії» 41 «вій РКК «213» Ното зарівп5 «ай» 513 тує реи 118 Рго Ре тйгосіу 1128 уаї піу бец ї 5 10 ей 514 «г1іх 10 «12 РЕК «213» Ното 5арієеп5 «Мр 514 тут уеп Без Ар А5р о1у тк оїен Уа! Уа! 1 5 15 «Й» 515 «г1ї» 9 козйх РКК «віз» ноша 5арієпе5 «Ох 515
Тугк Ген Мет Рго бТу Ре тТіє нів ен і ї «210: 516 «кії»х 11 кеїгх РН «2135 нНото зарієп» «4005 515
Тур Гем Рго д5р Хе тів ух Азробіл зуз АТа 1 5 10
«210-517 «її» 9 кеіг» РЕК «21325 МНощо заріспе «й0х 517
Тук цен сій веш Зрт сів его сім ец 1 «30» 518 «2115 10 «Ф12х РЕК «13 Ното зарієпеь «40050518 Я
Тук ес Тс обі) маї вне іец ні Маї Уа! і 5 10 «ке» 519 «Б1ї» 9 «212з РЕК «213» Нот 5арієп5 «ах 519 туго ме Уа! си ФУ Ага ре Заг Уа! ї «2102 57270 ке1ї» 9 «2125 ВЕК «еїі3» Ното 5арівепе «400» 520 туго Се ма1ї Туг 512 ги д5п сні ген 1 З «2102 521 сеїііз 10 «еїйхж РК «2135 Нота 5аріеп5 «4005 591. тує геп тує сту біп так тр отТикК Туг бе 1 5 10 «М За «11» 9 «12» РЕК «213» НоОжо зарівйв «400» 522 тут маії їй твгобіп вго Рго баг Уві ї 5 «210» 523 «ії» 10 «2122 РЕЖ «дг13» Нощо зарівей?5 «4002 523 біц ке) Аїа біу зів сту 318 фей тик ха! ї 5 10 «230» 324 жо1їх 9 «212» КЕ «13» Нощо зарівпе «400» 554
Туг бен бен Вго Аза її уаї Ніз ї1е

Claims (33)

3 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Пептид довжиною до 30 амінокислот, що містить амінокислотну послідовність вибрану з групи, що включає 5ЕО ІО МО: 62, 63 та 64, або його фармацевтично прийнятна сіль.
2. Пептид за п. 1, що має загальну довжину до 16 амінокислот.
3. Пептид за п. 1 або п. 2, де пептид є модифікованим і/або включає непептидні зв'язки.
4. Пептид за будь-яким з пп. 1-3, де згаданий пептид є частиною злитого білка, зокрема який містить М-термінальні амінокислоти антигенасоційованого інваріантного ланцюга (Ії) НСА-ОВ.
5. Пептид за п. 1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 62, 63 та 64.
6. Т-клітинний рецептор - ТКР, що реагує з лігандом НГА, де згаданий ліганд складається з амінокислотної послідовності, вибраної з групи, що включає ЗЕО ІО МО: 62, 63 та 64.
7. Т-клітинний рецептор за п. 6, у якому зазначений ліганд є частиною комплексу пептид-МНО.
8. Т-клітинний рецептор за п. 6 або п. 7, який є розчинним або зв'язаним з мембраною.
9. Т-клітинний рецептор за будь-яким з пп. 6-8, який має додаткову ефекторну функцію, таку як імуностимулюючий домен або токсин.
10. Нуклеїнова кислота, що кодує пептид за будь-яким з пп. 1-5 або ТКР за будь-яким з пп. 6-9.
11. Нуклеїнова кислота за п. 10, яка зв'язана з гетерологічною послідовністю промотору або вектор експресії, здатний експресувати вказану нуклеїнову кислоту.
12. Рекомбінантна клітина-хазяїн, що містить пептид за будь-яким з пп. 1-5 або нуклеїнову кислоту, або вектор експресії за п. 10 або п. 11.
13. Рекомбінантна клітина-хазяїн за п. 12, яка є антигенпрезентуючою клітиною, переважно дендритною клітиною.
14. Пептид за будь-яким із пп. 1-5, нуклеїнова кислота або вектор експресії за п. 10 або п. 11, або клітина за п. 12 або п. 13 для застосування в медицині.
15. Спосіб отримання пептиду за будь-яким з пп. 1-5 або Т-клітинного рецептора за будь-яким з пп. 6-9, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 12 або п. 13, яка презентує пептид за будь-яким з пп. 1-5 або яка експресує нуклеїнову кислоту або вектор експресії за п. 10 або п. 11, і виділення пептиду або згаданого Т-клітинного рецептора з клітини-хазяїна або її культурального середовища.
16. Активована Т-клітина, одержана способом, який включає контактування /л уйго Т-клітин з навантаженими антигенами молекулами МНС людини І або Ії класу, експресованими на поверхні придатної антигенпрезентуючої клітини, протягом періоду часу, достатнього для активації згаданих Т-клітин шляхом набуття ними специфічності до антигену, де згаданий антиген є пептидом відповідно до п. 1 або п. 4, який селективно розпізнає клітину, що презентує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, визначену в будь-якому з пп. 1 або 4.
17. Застосування пептиду за будь-яким з пп. 1-5, ТКР за будь-яким з пп. 6-9, нуклеїнової кислоти або вектора експресії за п. 10 або п. 11, клітини за п. 12 або п. 13, або активованої Т-клітини за п. 16 в діагностиці та/або лікуванні раку або у виробництві лікарського засобу проти раку.
18. Застосування за п. 17, де згадана хвороба на рак вибрана з групи, що складається з гострого мієлогенного лейкозу, раку жовчних протоків, раку головного мозку, раку молочної залози, колоректальної карциноми, раку стравоходу, раку жовчного міхура, раку шлунка, гепатоцелюлярного раку, карциноми з клітин Меркеля, меланоми, неходжкінської лімфоми, недрібноклітинного раку легенів, раку яєчника, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, нирковоклітинного раку, дрібноклітинного раку легенів, раку сечового міхура і раку матки, ХЛЛ та інших пухлин, які виявляють надмірну експресію білка КІААО226І, з якого походить пептид з послідовністю, вибраною з групи, що включає 5ЕО ІО МО: 62, 63 та 64.
19. Комплект, що містить контейнер, який містить фармацевтичну композицію, що містить пептид(и) за будь-яким з пп. 1-5, ТКР за будь-яким з пп. 6-9, нуклеїнову кислоту(и) або вектор(и) експресії за п. 10 або п. 11, клітину(и) за п. 12 або п. 13, або активовану Т-клітину за п. 16 у розчині або у ліофілізованій формі.
20. Комплект за п. 19, який додатково містить другий контейнер, що містить розріджувач або розчин для відновлення ліофілізованої композиції.
21. Комплект за п. 19 або п. 20, який додатково містить принаймні ще один пептид, що містить послідовність, вибрану з групи від зЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 522.
22. Комплект за будь-яким з пп. 19-21, який додатково містить інструкції із (ї) застосування розчину або (ії) відновлення і/або застосування ліофілізованої композиції.
23. Фармацевтична композиція, що містить принаймні один активний інгредієнт, вибраний з групи, що складається з: а) пептиду, вибраного з групи, що включає 5ЕО ІО МО: 62, 63 та 64; б) Т-клітинного рецептора, що реагує з пептидом і/або комплексом пептид-МНЄС за а); в) злитого білка, що містить пептид за а) і М-термінальні амінокислоти від ї до 80 НІГ А-ОВ антигенасоційованого інваріантного ланцюга (ЇЇ); г) нуклеїнової кислоти, що кодує будь-що від а) до в), або вектора експресії, що містить згадану нуклеїнову кислоту; д) клітини-хазяїна, що містить вектор експресії за г); е) активованої Т-клітини, отриманої згідно зі способом, що включає контактування Т-клітин /л уйго з пептидом за а), експресованим на поверхні відповідної антигенпрезентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації згаданої Т-клітини шляхом набуття нею специфічності до антигену, а також способу перенесення цих активованих Т-клітин в організми аутологічних або інших пацієнтів; є) розчинного Т-клітинного рецептора, що реагує з пептидом і/або комплексом пептид-МНС за а) і/або клітини, що презентує пептид за а), і потенційно модифікованої злиттям з, наприклад, імуноактивуючими доменами або токсинами; ж) аптамеру, який розпізнає пептид, вибраний з групи, що включає 5ЗЕО ІЮО МО: 62, 63 та 64, іабо комплекс пептиду, вибраного з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 62, 63 та 64 з молекулою 60 МН;
3) кон'югованого або міченого пептиду або каркаса за будь-яким з пунктів від а) до ж), і фармацевтично прийнятний носій.
24. Фармацевтична композиція за п. 23, яка додатково містить фармацевтично прийнятну допоміжну речовину і/або стабілізатор.
25. Спосіб отримання персоналізованої протиракової вакцини для терапії на основі сполук та/або клітинної терапії для застосування для конкретного пацієнта, причому спосіб включає: а) ідентифікацією пухлиноасоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від згаданого конкретного пацієнта; б) порівняння пептидів, ідентифікованих на етапі а), зі сховищем пептидів, яке пройшло попередній скринінг на імуногенність та/або на надмірну презентацію у пухлинах у порівнянні з нормальними тканинами; в) вибір принаймні одного пептиду зі сховища, який відповідає ТОМАР, ідентифікованому у пацієнта; і г) виробництво та/або приготування персоналізованої вакцини або препарату для терапії на основі сполук або клітинної терапії на базі етапу в); при цьому згаданий пептид зі сховища являє собою пептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 62, 63 та 64, за будь-яким з пп. 1-3 і 5.
26. Спосіб за п. 25, де згадані ТОМАР ідентифікують за допомогою: а!) порівняння даних експресії зі зразка пухлини з даними експресії зі зразка нормальної тканини, що відповідає типу тканини зразка пухлини, для ідентифікації білків, які надмірно експресуються або аберантно експресуються у зразку пухлини; і аг) проведення кореляції даних експресії з послідовностями лігандів МНС, зв'язаних із молекулою МНС І класу та/або Ії класу, в зразку пухлини для ідентифікації лігандів МНС, отриманих із білків, що надмірно експресуються або аберантно експресуються пухлиною.
27. Спосіб за п. 25 або п. 26, де послідовності лігандів МНС ідентифікують елююванням зв'язаних пептидів із молекул МНС, виділених із зразка пухлини, і секвенуванням елюйованих лігандів.
28. Спосіб за будь-яким із пп. 25-27, де нормальна тканина, що відповідає типу тканини зразка пухлини, отримана від того самого пацієнта.
29. Спосіб за будь-яким із пп. 25-28, де пептиди, додані до сховища, ідентифікують на основі таких етапів: аа) проведення аналізу експресії інформаційної рибонуклеїнової кислоти (ІРНК) в усьому геномі методами з високим ступенем паралелізму, такими як методи отримання профілю експресії на базі мікрочіпів або на основі секвенування, що включають ідентифікацію генів, які надмірно експресуються у злоякісній тканині у порівнянні з нормальною тканиною або нормальними тканинами; аб) вибір пептидів, що кодуються селективно експресованими або надмірно експресованими генами, як було визначено на етапі аа); і ав) оцінка індукції вибраними пептидами Т-клітинної відповіді /л7 у//0, що включає аналіз імуногенності /л мйго з використанням Т-клітин людини від здорових донорів або згаданого пацієнта; або ба) ідентифікація НІ А-лігандів із згаданого зразка пухлини за допомогою мас- спектрометрії; бб) проведення аналізу експресії інформаційної рибонуклеїнової кислоти (ІРНК) в усьому геномі методами з високим ступенем паралелізму, такими як методи отримання профілю експресії на базі мікрочіпів або на основі секвенування, що включають ідентифікацію генів, які надмірно експресуються у злоякісній тканині у порівнянні з нормальною тканиною або нормальними тканинами; бв) порівняння ідентифікованих лігандів НІ А з даними експресії згаданих генів; бг) вибір пептидів, що кодуються селективно експресованими або надмірно експресованими БО генами, як було визначено на етапі бв); бд) повторне виявлення вибраних ТОМАР етапу бг) на пухлинній тканині і їх відсутності або рідкого виявлення на здорових тканинах і підтвердження доречності надмірної експресії на рівні ІРНК; і бе) оцінка індукції вибраними пептидами Т-клітинної відповіді /л7 уУ//о, що включає аналіз імуногенності /л мйго з використанням Т-клітин людини від здорових донорів або згаданого пацієнта.
30. Спосіб за будь-яким із пп. 25-29, де імуногенність пептидів, доданих до сховища, визначають методом, що включає аналіз імуногенності іп міго, контроль імунного статусу пацієнта щодо зв'язування індивідуальних пептидів з молекулами НА, забарвлювання МНСОС-мультимерами, бо аналіз методом ЕГІЗРОТ та/або внутрішньоклітинне забарвлювання цитокінів.
31. Спосіб за будь-яким із пп. 25-30, де згадане сховище містить велику кількість пептидів, що містять послідовність, вибрану з групи, що включає від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 522.
32. Спосіб за будь-яким із пп. 25-31, що додатково включає ідентифікацію принаймні однієї мутації що є унікальною для зразка пухлини, відносно відповідної нормальної тканини конкретного пацієнта, і вибір пептиду, який корелює з мутацією, для включення до складу вакцини або для отримання засобів клітинної терапії.
33. Спосіб за п. 32, де згадану принаймні одну мутацію ідентифікують методом повногеномного секвенування. ФігувалА І Пептид:ДГ НЕРБУХІ АКО2І ВЕС МО: т Е Ж 5 пе о В Я ж в Ф е ПОДОНННН НН ни ПН го 269:нормальних тканин 17 зразків т 2 жирові тканини; З надниркові залози, 4 зразки клітин крові, 10 кровоносних судин, ХПЛ й в кісткових мозків, 7 головних мозків,б молочних залоз, 2 хрящі, 2 ока; З жовчних міхури, 6 сердець, 14 нирок, 19 товстих кишок, 20. печінок, 45 легенів, б лімфатичних вузлів; 7 нервів,
З. яєчника, 10 підшлункових залоз, З паращитоподібні залози, ї очеревина, 5 гіпофізів, б плацент; З плеври, З передміхурові залози, 7 слинних залоз, 5 скелетних м'язів, б зразків. шкіри,.4. тонкі кишки; 9 селезінок, 5:шлунків, б сім'яників, 2 тимуси, 3. щитоподібні залози, 9 трахей, З сечоводи, б. сечових міхурів, 2 матки, Є стравоходів Фігура ІВ Пептид 1 АЕТРРКМ (АТЗ) ЗЕСЛІВ МО: З ЕЕ; х га В о - Х
Ж г. І 2 В А Ж 6 6 6Я « 6 Ж- 4 -- - - /.- - : 2 - л 6 6 2 4 4 Б -:Я : Ф б БЮ 2 2 2 Є К Бє 222 - :-
ві. 269 нормальних тканин 17 зразків 5 2 жирові тканини, З надниркові запози, 4 зразки клітин крові, 10 кровоносних судин, ХЛ й б кісткових мозків; 7 головних мозків, б молочних залоз, 2 хрящі, 2 ока, З жовчних міхури; їй б сердець, 14 нирок, 19 товстих кишок, 20 печінок, 45 легенів, 6 лімфатичних вузлів, 7.нервів, З печника, 10 підшлункових залоз, З парашщитоподібні залози, 1 очеревина, 5 гіпофізів, б плацент, З плеври, З передміхурові залози, 7 слинних залоз, 5 скелетних м'язів. б зразків шкіри, 4 тонкі кишки, 9 селезінок, 5 шлунків, б сім'яників, 2 тимуси, З щитоподібні залози, 9 трахей, 3 сечоводи, 5 сечових міхурів, 2 матки, б стравоходів.
Фігура 12 Пептид: МІДЕЇ РРКУЗУ(АО2) «ЕОІЮ МО: А - х Е тк. Ф Ж с 2
2 . К:Я Е 4 ія ГНН Ж Ж В 259 нормальних тканин 717 зразків г 2 жирові тканини, З надниркові залози, 4 зразки клітин крові, 10 кровоносних судин, хлп їй б.кісткових мозків, 7 головних мозків, 8 молочних залоз, 2 хряїці, 2'бка, З жовчних міхури, б сердець, 14:нирок, 15 товстих кишок, 20 печінок, 45 легенів, б: лімфатичних вузлів, 7 нервів, З яєчника, 10 підшлункових залоз, З паращитоподібні залози, 1 очеревина, 5 гіпофізів, 6 плацент, З плеври, З передміхурові залози; 7 слинних: залоз; 5:скелетних м'язів, 5 зразків. шкіри, 4 тонкі кишки, 9 селезінок; 5 шлунків, б сім'яників, 2 тимуси, З щитоподібні залози, 9 трахей, з сечоводи, б сечових міхурів; 2 матки, б стравоходів Фігура 1) Пептид: ВІЖЕНТТЕМ (А"О2) ЕС ІОЛУО: Та г з ї Ж (-Я о. З ш о м Е н . Кк : Е В
Е . - -
є. 7 БУ . в Ге Ц ї ї : Ф я з : в м г. БУ ї- - '( А АїТїТ- Д 6 а. 8 66НУЮЗЧО,. »Я ТТ М -5: 5: - 33333333- 8 Лінії Нормальні Ракові тканини шї клітин тканини: ря щі Пептид, виявлений на: 1 культурі МКПК, 1 доброякісній передміхуровій залозі, 8 нормальних тканинах (З легені, 4 селезінки, ї трахея), 49 ракових тканинах: (2 раки головного мозку; 2 раки молочної залози, 1 рак товстої кишки, 13 раків лейкоцитів, 13 раків легенів, 8 раків-пімфатичних вузлів, 1 рак мієлоїдних клітин, 4 раки яєчника, 7 раки шкіри, 1 ракссечового міхура, 2 раки матки) (зліва направої тФігурз1ї Пептид АМ.ВІДРОЇ ГАОЗ) БЕО 0 МО: 14 Ж Е щ В й іч їз ня ї г ше е х а о є. в ех ня - - ! у Й Е ШЕ х ч ПММ в як я - я ж - я - ш и Еоооопопопопиаппапипаиаиппппоооооооопоопопопппппппппп Лінії клітині Ракові тканини первинні культури Пептид, виявлений на: 1 лінії клітин, 1А ракових тканинах 1 ракмолочної залози, 1 рак товстої кишки, 7 рак голови та шиї,
2. раки лейкоцитів, 1 рак печінки, 1 рак легенів, 2 раки лімфатичних вузлів, 1 ракмієлоїдних клітин, 1 рак. шкіри) (зліва направо) Фігупа ІК Пептид- ПОРВАВ ТА"ОЗ 5ЕОЛО МО: 82 ЕЇ Е - ш Н Е : 5 ! юю Н і : х " я як е Кк г зе 2» гу ех є : Е Кк 1 т с нк : -х Е І 9 що чу. о Ірен й ще А ше пи І Й ШиШши Нормальні Ракові тканини тканини Пептид, виявлений на: 2:нормальних тканинах (1 лімфатичний вузол, 1 селезінка), 18 ракових тканинах (2 раки товстої кишки, 5 раків пейкоцитів, б раків лімфатичних вузлів, 1 ракпрямої кишки) (зліва направо)
Фігура 10 Пептидла ЗОДЕАОМ Тахо) БЕО 0 МО: 68 З х Тв - а х І о
2
2. - в3 : г : Ко Н еЕ Н ж : в ге й не Ф Н а я ях : е й : ш х о с. си я ІВ а Ши Шаше І | Мк Й шк «Мои Й Й сх ик Й о ооо. г. ИЙ М. | ЗМ сім МИ ий ЯН МИ, й г Є дн ьЬ о Я Я Я --- « - 'О « Я « « « « « « « « - Лінії клітині Ракові тканини первинні культури: Пептид, виявлений на:
1. лінії клітин, 2 первинних культурах, 21 раковій тканині (1 ракжовчних протоків,1 рак головного мозку, 1 рак молочної залози, 1 рактголови та шиї, 2 раки нирки, З раки лейкоцитів, 2 раки печінки; 2 раки: пегенів, 2 раки лімфатичних вузлів; З раки яєчника, 1 ракпрямої кишки, 1 рак шкіри, 1 рак матки) (зліва. направої "Фігура ТН: Пептид; КТ ОУВАТУЕНАТОгІ ВЕС МО: 112 т - З ше х Е ч 2 ле їй г Га ж май - нок ех се е : не джжж роя КО г сих х : 2 Н й не є их : Й і Йнй І я ХХХ н ше ШИ КУ ПЕНІ Моди Лінії клітині : первинні культури Ракові тканини Пептид, виявпений на: 2 лініях клітин, 1 первинній культурі, 13 ракових тканинах її рак стравоходу, 2 раки лейкоцитів, 1 рак. печінки, З раки: легенів, 2 раки лімсератичних вузлів, 2 раки-яєчника, 1 рак шкіри, 7 рак матки) (зліва направо)
Фігура її Певтид; ЗНЕЄРИКІ АТО2І вЕО10 МО: 146 КЗ х З но З я 2 я г о З ша є : І й г е х те Б я ж р ех й 1 їх : , Й Й , І у са : і т І м Й : і ш І. ри ВК па клала Ї.. вні о ІВ, і Ракові тканини Пептид, виявлений на: 14 ракових тканинах (1 ракголови та: шиї, З раки лейкоцитів, 6 раків.легенів, 1 рак лімфатичних вузлів, 1 рак яєчника, 2 раки сечового міхура) (зліва направо) Фігупва ПЕ Пептид: ЗЕТМАТІ ГАХО2) ЗЕСМІО МО: 147
В т. зо - о т ш о 2 - - піч В се ж : ни » Н : а : : пеня - Н : Ге : ше ше ТЗ Н є ших : ний пло : шк Й ох МИ... шах ЩА Пінії клітині Ракові тканини. первинні культури Пептид, виявлений на:
1.первинній культурі, 71 ракових тканинах (1 рак товстої кишки, 4 раки лейкоцитів, рак легенів, З раки лімфатичних вузлів, 7 рак міслоїдних клітин, 1 рак шкіриу (зліва направо)
Фігура 16: Пептид, ЗІАЕЕНМІ ГАМОЗ2) ЗЕ ІС МО: 183. Ж : т : - М щі - -х Е ж - : - ї я ї но . : З маша : я ра ї їх - Н ге . : Ге Я - ІВ -е ПЕ ї й : 80 рю В ОВ ш-- гі ГК ії І ч пу 0 Лінібклітин/ Нормальні Раконі тканини г первинні тканини культури Пептид, виявлений на:
1. лінії клітин, 8.'нормальних тканинах (1 лімератичний вузол, 1 пряма кишка; 7 селезінок), 27 ракових тканинах (1 рак молочної залози, 1 ракнирки, 10 раків лейкоцитів, 14. раків лімфатичних вузлів, 1 рак шкіри) (зліва направо) Фігура ії. Пептид: ЗІЗЕЕКЦУМ (АТО2) ЗЕСІО МОс158 з ї Тк ч о пе 8 ї 2: Ж з кх ШИ, Ф ПЕН - Сх КО чу ПЕ Що 2: ПМ т Є Кс Щі : рик є ПЕКИ -- вв а вх м ще о МНН. Є нє сах ад ан Тож жи НК НЙ ВК жк М МА Й М о піок жі Н ох пово іх НАЙ Й НА ох бо іх ВА, ш- ШНВИША-НШЯ 00010101 й ст Лінії клітині Ракові тканини первинні культури. Пептид, виявлений на: 2 лініях клітин, 23 ракових тканинах (5 раків головного мозку, рак молочної залози, 1 рак стравоходу, З раки голови. та шиї, 2 раки лейкоцитів, 5 раків:легенів; З'раки лімфатичних вузлів, 1 рак шкіри, 2 раки сечового міхура) (зліва направо)
Фігура ЇМ Пептид:ЗУНКОРАРИ АТО 5ЕФІЮ МО: 764 - З Е жк ч г ЖЕ і Е ! я Е г г - В - Е і; : І Ж й й 8 І ам що мн - й . Е ЕН шен НИ М ЕН КЗ інно й Лінії клітин/ Ракові тканини первинні культури Пептид, виявлений на: 10 лініях клітин, 1 первинній культурі, ї нормальній тканині (1 надниркова залоза), 36 ракових тканине 112:раків головного мозку, 1 рак товстої кишки, 2:раки голови та шиї, 2 раки нирки, З раки лейкоцитів». 1 рак печінки, 5.раків легенів, 1 рак мієлоїдних клітин, 1 рак яєчника; 1 рак прямої кишки, 1 ракшкіри, 2 раки шлунка, 2 раки сечового міхура, ? раки матки) (зліна направо) "Фігура 1 пептид: ТСОТеКІЖИ (АТОгІ ЗЕСІЮ МО: 167 З 2 ЕЕ : т : З пЕ та шлю о Ще " Е Е З З я ма й Е й Ша - ! Е | с : | м Й и : | ш г 1 : пнтх В в І й ; ж. й ЛИШ. мипии. | мл.
Поп Ракові тканини Пепгтид, виявлений на: 13 ракових тканинах (1 рак головного мозку, 8 раків лейкоцитів, 4 раки лімфатичних вузлів) (зліва направо)
Фігура 10. Пептид: М БО ИМААОІ ЗЕ МО: 168 Е р х ач 8 щі - т : : ж ! Е : -е 2 ї 5 : я : ме ГЗ ; : 5 - т КК ш. : - ї кажан і г. в не ї : Я Ракові тканини Пептид, виявлений на: 16 ракових тканинах (10 раків лейкоцитів, 5 раків лімфатичних вузлів) (зліва направо) Фігура ІРР Пептид: ОЕМ ТІ А ОХІ ЗЕСОЇО МО: 152 Е Е З я г г ля Е - пя г Е ще ш -х -- : у : Й у у в КУХНЯ - КК -е 2 ЕН - не І З ГК чан жннннкх ЩІ пог ЗВВВВЙЙ, МИ. чим З Я НТ С Кк і ЗВжі- 25226 2 6ж (4 Є Є Є З Є-.2- 5 Є Є Є Є Ж 2 1 2 2 2 2.5 -2 ЯЗ ; ? 2е З Л КР 53 ш Лінії клітині Ракові тканини я первинні 7 культури Пептид, виявлений на: 2 лініях клітин, 19 ракових тканинах (1 рак товстої кишки, 1 рак голови та шиї; 1 рак нирки, 4 раки лейкоцитів, 5 раків: легенів, З раки лімфатичних вузлів, 1 рак мієлоїдних клітин, 1 рак шлунка; 1 рак сечоного міхура) (зпіва напраної
ФіураїО Пептидг У ЗДЕМРИТЦА"О2І ЕС ІСМО: 197 Ж че Ех - о КУ в о Е - ле ша е з ян ї Е Ех 8 сх е пет Ракові тканини Пептид, виявлений на: 7Т1 ракових тканинах (5 раків лейкоцитів, 4 раки лімфатичних вузлів, 1 рак шюри, 1 рак матки) їзліва; направо) Фиураїв Пептид! УМЕРЕЕМРІМЦАТО2) ЗЕ МО: 200 п Ж ш 5 2 ЧЕ їй - ї Кз - ЕІ - Е 1 Ф в . ї- і Ї пу І 57 І . . ; - 00 оеодоосоооіс вне Й сіно А Р шк ГИ ся 5 Ж « « « о «ЬЬ« Я Ж 5 -- - Ж А 5 -- -- - -- - -- - х - - шт ГІ Лінії клітин/ Ракові тканини первинні культури Пептид, виявлений на: 4 лініях клітин, 2 первинних культурах, 34 ракових тканинах (1 ракжовчних протоків, 2 раки молочної лапози, 1 рактовстої кишки, 1 рак стравоходу, 1 рак жовчного міхура, 5 ракін голови та шиї, 7 раки пейкоцитів, » раки печінки, 9 раків легенів, 4 раки лімфатичних вузлів, 2 раки яєчника, ї рак прямої кишкі 2 раки шкіри, 1 рак сечового міхура) (зліва направо)
Фігура ї5 Пептид: НОУКРІСМ (АТО) ЗЕФІЮ МОЗ211 Ж - ЕЗ - Ж с і ле а о І - і З -- не т - - па Є е т ю ш в. ПЕ - х є сх НЕ В т Я є ЖЕК не ск ШИ т 5 І В "ШІ я т . Лінії клітині: Ракові тканини первинні культури Пептид, виявлений на: З лініях кпітин, 23 ракових тканинах (5 раків головного мозку, 1 рак молочної залози, 1 рак стравоходу, Тракгопови та шиї, ї ракнирки, З раки лейкоцитів, 2 раки печінки; 2 раки легенів, 4 раки лімфатичних вузлів, 7 рак яєчника, 1. рак передміхурової залози, ї рак шкіри) (зліва направо) ФіграїТ Пептид: ФІРУЄМУУВУ (АТО) БЕО 0 МО: 256 Ж т ж в : ів ї лЕ г сл о 1
Ж. : ше ї щ І І т е КІ ї 5 : - г : дн в. : - е ї ; и т пит Е З Й Й Й й ш р. Лінії клітин. "Ракові тканини первинні культури Пептид, виявлений на: 2 первинних культурах, 13 ракових: тканинах (2 раки голови та шиї, З раки лейкоцитів, 1 рак печінки, 2 раки легенів, 4 раки лімфатичних вузлів, 1 рак яєчника) (зліва направо)
Фігура ЦІ Пептид: ЦУМУТОРТ АТО) БЕОООМО: 312 ж ж яю Б Н їз ї ч : о ї ж : чт р 1 о 1 2 : - е : КО ТІ Е : ШИМИ : гу ПЕН ПИ ШШНН : с ПЕШКНННИ ПНІ ШИ т :
со. ПЕШКНННИ ПНІ ШИ : ци ЕЗ ПЕШКНННИ ПНІ ШИ о ПЕЕШШШИ ПИПИШИМИ ПИШЕ о ПЕНЕИНКИ ПН ПИШНИЙ но ж фе Й -- ший || ш Лінії клітині Ракові тканини ; первиннікультури. Пелтид, виявлений на:
1.лінії клітин, 2 первинних культурах, 14 ракових тканинах 1 рак товстої кишки, 4 раки лейкоцитів, 2. раки легенів, 5. раків-лімфатичних вузлів, 1 рак яєчника, 1 рак сечового: міхура) (зліва направо) Фігураїу Пептид: МГ РОЄЕТАЕБІНІ (АТО) ЗЕ ІВ МО: 328 я - У з : ї : Ж : (Я :
9 г. х пох і ш ШІ а о ШІ : Е ША : т Ще Я ШО її ШІ - Б ШЕШЕ БУ Ех ЩО 4 ШЕШЕ з ШЕ - ДА у пи Н й а ШІ Н а їх і-й ПИ Й - -х шовк В що що ШЕ шк. -о х се Й Що Ті ШЕ й а з з ї рн а Шийка й. «НИ . йе - | І Я. т ВЖК і - пого ВІЙ НК А ЖЕ Лінії клітині Ракові тканини первинні культури Пептид, виявлений на: З первинних культурах, 77 ракових тканинах 1 рак молочної залози, 1 рактовстої кишки; 5 раків лейкоцитів, 5 раків легенів, 7 раків лімфатичних вузлів; 2 раки яєчника, 2 раки шкіри, 1 рак шлунка, З раки сечового міхура) (зліва направо)
Фігура?їА Ген: ЕСЕБО (Пептид: АГ МАСТІ, ЗЕВС І МО: що! і і Ї т шо! Е Н шЕ Н Ї НЕ, 8: ! я б. й Ко ВН й МЕН ої й Кр г: В й ІНН о: й ІНН Ж Н Ї НИ ШН ЕЕ ОН о НН і, Но НЕ ее ме тілу ЩЕ се - я В і « с 1 2 0 у Зразки нормальних тканин (кожний зразок'являє собою пул-нід декількох 19 зразків: ХПЛ. донорів): 6 артерій, 1 зразок клітин крові, ї головний мозок, 7 серце, 2 печінки, 7 легені, ? вени, 1 жирова тканина, 1 надниркова залоза, б кісткових мозків, 1 хрящ, 1 товста кишка, 1 стравохід, 2 ока, 2 жовчних міхури, ! нирка, 5 лімфатичних вузлів, 5 підшлункових запоз, 7? піпофізи, і пряма кишка, 1 слинна залоза, Я скелетний м'яз, 1 шкіра, ї тонка кишка, ї сепезінка, 1 шлунок, щитоподійна Запоза, 7 трахей, 1 сечовий міхурі молочна запоза, 5 ясчників, З плаценти; 1 передміхурова запоза, 1 сім'яник, 1 тимус, ї матка (зліва направо). Фігура 28. Ген: СІ ЕС1?7А (Пептид: ЗІКНЕЛАКМ, ЗЕО ІБ МО: 71 щі б: й ГЕ І-3 Н е Й ж . В: ті шо НЕЯН ГЕН ЕЕЯН о 1 ЕН ЕЕ щі шо НН ! 4 ет Ппоооя ІНН СТ Зразки нормальних тканин (кожний зразок являє собою пул від декількох 19 зразків ХЛЛ донорів): 6 артерій, 1 зразок клітин крові, 1 голонний мозок, 1 серце, 2 печінки, 2 легені, 2 вени, їжирона тканина, і надниркова залоза, б кісткових мозків, 1 хрящ, і товста кишка, 1 странохід, 2 ока, 7 жончних міхури, 1 нирка, б лімфатичних нузлів, 5 підшлункових Залоз, 7 гіпофізи, ї пряма кишка, ї слинна залоза, 1 скелетний м'яз, 1 шкіра, ї тонка кишка, 1 сепезінка, 1 шлунок, 1 щитоподібна залоза, 7 трахей, 1 сечовий міхур;ї молочна запоза, 5-яєчників, З плаценти; 1 передміхурова запоза, 1 сім'яник, 1 тимус, 1 матка (зліва направої
Фігура 2 Ген: РАХ5 (Пептид: «ГОМ КАМЕ БЕО 10 ЧО: б і Що і НН НЕ: шо | НН - | НН НН с НЕ НН в | а Я
8. Ще ЯН о і м Я ПЕ СЯ ЩЕ і ТЕ ЯН Н в ж НН і їн т п. т" - р НН і НН НН - нія НЕ А я ВВЕЕЕНННЕ в о В НИ в в див у я век на М ї 10 зразків ХЛ Зразки нормальних тканин (кожний зразок янляє собою: пул від декількох 'р: донорів): б артерій, 1 зразок клітин крові, ?ї гоповний мозок, 7 серце, 2 печінки, 2 пегені, 2 вени, іжирова тканина, 1 надниркова залоза, б кісткових мозків, 1 хрящ, 4 товста кишка, 1 стравохід, 2 ока, 2 жовчних міхури, 1 нирка, б лімфатичних: вузлів, 5 підшлункових залоз, 2 гіпофізи, ії пряма кишка, 1 слинна залоза; 1 скелетний м'яз, 1 шкіра, 1 тонка кишка, 1 селезінка, ї шлунок, 1 щитоподібна. залоза, 7 трахей, 3 сечовий міхур, молочна залоза, 5яєчників, З плаценти, 1 передміхурона залоза, ії сім'яник, 1 тимус, 1 матка (зпіва направої Фихюох ЇВ Ген КІВАВО (Піелтяд, СІК, ВЕС МО ЗІ т ! ! Н Н дк і я Е | НН Я. ЕЕ НН і 5 Н з З: Ж: з |! я КТ 8 |і ЩЕ ЗНА я | ПК п НА 1: НЕННЯ Н -т НЕКНЕНННН Н можли кіУмі НН щ т: ЗННННЕНННН ке и ВИ а ЕВ а НН В, фудлллятттттттттттттттттттт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт тт діт Зизоки вормальнях тоанин іксзми здхоск являє собак увул во дехитьках. 33 зумазжів КАЛ донкорівх бартеріМ, ії зразок клітин кров, З коповний козок, 7 серце, З печінки, 2 пегені, вен, іжшироБа ткжнина. З надннуркава залоза, біпткових влозяв, З хр іхзнста Жижшка, Її стравехід, 2 яна, жовчних міхури, З миржа, 5 лимезтячних вухців, п піднетуюкатвих заясз, біпюафіав, пряма вишка, їсликна запоая, фекелетнмк вия З із, З тонка кмшка. З сепезінка, ішлувох, З шитолодіня Здиясва. їй трахей, З сечовий міжур.ї молочна ззваза, 5ясчнимів. Зплавентя і передиіхурови залог, і сіяних, З тимус, матка зліва налравої
Фігураз Стимуляція стимуляція ес НЕАчАТОЛЮВКМОЇ-002 НІ А-А"Огнегатив. контроль - т і і нео і Го; Н Н : Її : Р ЩЕ / й ШО -/ Е ! о І ШИ, 5-4 й ее : ще ше ! ! І слой т Е осо СО сто : Осо і пе Ши ни : рол шо Я
В. ; РЕ АД МОБТАЮ2 Стимуляція Стимуляція НЕАСАчО2АКЗУ ОСІ НА-Атг негатив, контроль: В чт - Пух Ду -2 Я НН Кок о НН і оо ГУ ЩЕ і НЕ і : 5 ИН кн ВИ ВИ Ал ДИ ШЕ НН р ов НЕ ті шин ее ей НН Не п ес СБ ї ОО Є ! дет НИ ЗБ : РОТОМ Я Конт ни вуЯо4: АхОгАЗВІКя ОС «рісура З В Стимуляція Стимуляція НЬА-АТОгВЕЗЮ Ме 1 НЕАсдторнегатив. контроль Ж ! ; й і де 51 ШЕІЯНе ї ЕЕ 0О0бо . і ; і ві і ; і БІ ж ШИ Го й Ж Ко ллятттинтя Я Енн у | ж НИ гас н ЖИМ "ОН у 5 | БОМ с: хо ВВА І Я сте ншшш они РЕ-СУ"АИВаЕОНЮ МОЇ ві Стимуляція Стимуляція шо НЕА-АТО2 Ве МО 5 НІ АД тогінегатив. контроль 81 ТЗ5Я3Е Гб) 51, іа і СН ЕНН син под тт І ЩЕ ви КН схов Ехо ШИ ІБ хе во | РО ЕК ся; І ПОХМЩИЖМ ТВ ОТ КМШХ Як ї В РЕ-Суу: А'ОЗІВВЯЮ МО В
Фігура З р Стимуляція Стимуляція - НЕАЗА о лЗеціЮ Мо 32 НЕАСАТОгІнегатив. контроль хі ! ОО И Н То
8. ТВО | ши ем не | | Е Гай ЩЕ ние Й ой Я ; - Ко М КК дит і не Пн іо Нй ЩЕ ей ! оп и Е ад : ЛИТИХ. ЩІ Н Пола з - Код БАХ мс. й Н щоОА ! ББК . с ВО Е Мн Ше 1 . ВОНО: Е екі го лавин | ОК Е вай ЩО і : Е щ КО днини фусллянннянанячанячянячнянанянаннняннннннннн АРШЕАОІВеЧіЮМОоЗ2 Е Стимуляція Стимуляція - НЕА-АТО2ІБацЮ Мо 2920 НЕА-Аргнегатив. контроль є ЖЕ ши яви г вої ОБЛ г : т в Ше Щ м ме Ф і ПАМ Н НУ «еп Н І с і ЩІ Мей і ги ї Ше Я і НІ УМ. і з ше «| І кол ! - | і По і с ро і БО Ся. тт Бод РЕ:АТОМВеці Мо 220
UAA201803219A 2015-12-10 2016-11-24 Пептид для лікування раку UA124575C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562265615P 2015-12-10 2015-12-10
GBGB1521746.6A GB201521746D0 (en) 2015-12-10 2015-12-10 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers
PCT/EP2016/078718 WO2017097602A1 (en) 2015-12-10 2016-11-24 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cll and other cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124575C2 true UA124575C2 (uk) 2021-10-13

Family

ID=55274485

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201803219A UA124575C2 (uk) 2015-12-10 2016-11-24 Пептид для лікування раку

Country Status (25)

Country Link
US (14) US10064928B2 (uk)
EP (1) EP3387008A1 (uk)
JP (2) JP7053457B2 (uk)
KR (1) KR20180086190A (uk)
CN (1) CN108602867A (uk)
AR (1) AR106920A1 (uk)
AU (3) AU2016368981B2 (uk)
BR (1) BR112018007206A2 (uk)
CA (1) CA3005813A1 (uk)
CL (6) CL2018001532A1 (uk)
CO (1) CO2018004865A2 (uk)
CR (6) CR20200592A (uk)
EA (1) EA201891074A1 (uk)
GB (1) GB201521746D0 (uk)
HK (1) HK1259376A1 (uk)
IL (1) IL259304A (uk)
MA (2) MA43399A (uk)
MX (1) MX2018005372A (uk)
PE (1) PE20181075A1 (uk)
PH (1) PH12018500848A1 (uk)
SG (3) SG10202111398UA (uk)
TW (2) TWI730306B (uk)
UA (1) UA124575C2 (uk)
WO (1) WO2017097602A1 (uk)
ZA (1) ZA201801752B (uk)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3374399A1 (en) 2015-11-11 2018-09-19 Opi Vi- IP Holdco LLC Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
GB201521746D0 (en) * 2015-12-10 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers
GB201604490D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
GB201609193D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides as targets for use in immunotherapy against gallbladder cancer and cholangiocarcinoma and other cancers
JP7075125B2 (ja) 2016-05-25 2022-05-25 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 標的としてのおよび胆嚢がんおよび胆管がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチド、ペプチド組み合わせ
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
EP4317432A3 (en) 2016-12-08 2024-04-17 Immatics Biotechnologies GmbH T cell receptors with improved pairing
EA201992416A1 (ru) 2017-04-10 2020-02-25 Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх Пептиды и комбинации пептидов для применения в иммунотерапии лейкозов и других видов рака
CN111533799A (zh) 2017-04-10 2020-08-14 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于白血病和其他癌症免疫治疗的肽和肽组合物
ES2871146T3 (es) 2017-07-14 2021-10-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Molécula de polipéptido con especificidad dual mejorada
DE102017127984B4 (de) 2017-11-27 2019-12-05 Immatics US, Inc. Verfahren für die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen
CN108079285B (zh) * 2018-02-06 2021-01-01 昆明龙津药业股份有限公司 用于蛇毒酶制剂的门冬氨酸稳定剂及制备方法
JP7470640B2 (ja) 2018-02-09 2024-04-18 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． Ｔ細胞を製造する方法
DE102018108612A1 (de) 2018-03-21 2019-09-26 Immatics US, Inc. Verfahren zur erhöhung der persistenz von adoptiv infundierten t-zellen
US20200297768A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Immatics US, Inc. Cd28 t cell cultures, compositions, and methods of using thereof
PH12021552979A1 (en) 2019-05-27 2023-10-09 Immatics Us Inc Viral vectors and their use in adoptive cellular therapy
US20200384028A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Sorting with counter selection using sequence similar peptides
BR112022000133A2 (pt) * 2019-07-05 2022-04-12 Enara Bio Ltd Antígenos de câncer e métodos
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
MX2022010461A (es) 2020-02-24 2022-12-13 Immatics Us Inc Metodos para expandir linfocitos t para el tratamiento de cancer y neoplasias malignas asociadas.
DE102020111571A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
DE102020106710A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
US20230158132A1 (en) * 2020-04-14 2023-05-25 Universite De Montreal Novel tumor-specific antigens for acute lymphoblastic leukemia (all) and uses thereof
EP3907284A1 (en) * 2020-05-06 2021-11-10 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Peptides and combinations of peptides for use in immunotherapy against hematologic neoplasms and other cancers
US20220056411A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Immatics US, Inc. Methods for isolating cd8+ selected t cells
WO2022147029A2 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Immatics US, Inc. Cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
US12162940B2 (en) 2021-05-05 2024-12-10 Immatics Biotechnologies Gmbh BMA031 antigen binding polypeptides
WO2023025851A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Immatics US, Inc. Selection of immune cells using peptide mhc complexes generated by conditional ligand exchange
WO2023044488A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Immatics US, Inc. Monocyte depletion of t cells populations for t-cell therapy
EP4448108A1 (en) 2021-11-08 2024-10-23 Immatics Biotechnologies GmbH Adoptive cell therapy combination treatment and compositions thereof
EP4514834A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Immatics US, Inc. Dominant negative tgfbeta receptor polypeptides, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
US20240066127A1 (en) 2022-04-28 2024-02-29 Immatics US, Inc. Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
JP2025516189A (ja) 2022-04-28 2025-05-27 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． 膜結合型ｉｌ－１５、ｃｄ８ポリペプチド、細胞、組成物、およびそれらの使用方法
EP4519418A1 (en) 2022-05-05 2025-03-12 Immatics US, Inc. Methods for improving t cell efficacy
WO2024223849A1 (en) * 2023-04-27 2024-10-31 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Neoepitope immunogenic peptides for cancer treatment and diagnosis
TW202506719A (zh) 2023-07-27 2025-02-16 德商艾瑪提克生物技術有限公司 針對mageb2之抗原結合蛋白
WO2025021979A1 (en) 2023-07-27 2025-01-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel t cell receptors targeting melanoma-associated antigen (mage) b2 and immune therapy using the same
US20250134931A1 (en) 2023-11-01 2025-05-01 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0756604A1 (en) 1994-04-22 1997-02-05 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Melanoma antigens
US20040005561A1 (en) * 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
DE10225144A1 (de) 2002-05-29 2003-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
US20040000556A1 (en) * 2003-01-25 2004-01-01 Harris Jennifer Hope Trash receptacles that use plastic grocery bags as liners and methods of advertising
EP1627076A4 (en) 2003-03-14 2008-07-02 Ppd Biomarker Discovery Scienc BIOLOGICAL MARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF RHEUMATOID ARTHRITIS
US7811828B2 (en) * 2004-01-28 2010-10-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for identifying and quantifying of tumuor-associated
DE602004019215D1 (de) 2004-10-02 2009-03-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunogene T-Helfer Epitope von menschlichen Tumorantigenen und deren Verwendung in immunotherapeutischen Methoden
US7608413B1 (en) * 2005-03-25 2009-10-27 Celera Corporation Kidney disease targets and uses thereof
US20070292869A1 (en) 2006-03-02 2007-12-20 Ppd Biomarker Discovery Sciences, Llc Compositions and Methods for Analyzing Renal Cancer
US20080107668A1 (en) * 2006-08-30 2008-05-08 Immunotope, Inc. Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
CA2991175A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Hla-dr binding peptides and their uses
PT2119726E (pt) * 2008-05-14 2015-03-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Novos e poderosos peptídeos para mhc classe ii derivados de survinina e neurocano
US20110151494A1 (en) 2008-06-30 2011-06-23 H. Lee Moffit Cancer & Research Institute Methods and materials for monitoring myeloma using quantitative mass spectrometry
DK2172211T3 (en) * 2008-10-01 2015-02-16 Immatics Biotechnologies Gmbh Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of glioblastoma (GBM) and other cancers
WO2011027311A2 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Koninklijke Philips Electronics N.V. Novel tumor markers
WO2011027308A1 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Koninklijke Philips Electronics N.V. Novel tumor markers
EP2330122A1 (en) * 2009-12-02 2011-06-08 Asklepios Kliniken Hamburg Gmbh OFA/iLRP derived modified peptide
WO2011073905A1 (en) * 2009-12-14 2011-06-23 Koninklijke Philips Electronics N.V. Novel tumor markers
GB201004551D0 (en) * 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201014033D0 (en) * 2010-08-20 2010-10-06 Ucb Pharma Sa Biological products
CA2821582A1 (en) * 2010-12-14 2012-06-21 Immatics Biotechnologies Gmbh Hla-binding peptides derived from prostate-associated antigenic molecules and methods of use thereof
WO2013019634A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Alpha toxin detection of gpi anchored proteins
EP2756308A1 (en) * 2011-09-16 2014-07-23 PamGene B.V. Method for predicting response to endocrine therapy
JP2015528443A (ja) * 2012-08-15 2015-09-28 ユニヴェルシテ・ドゥ・モントリオール 新規マイナー組織適合抗原を同定するための方法
TWI819228B (zh) 2013-08-05 2023-10-21 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物（八）
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
GB201408255D0 (en) 2014-05-09 2014-06-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML)
GB201511546D0 (en) * 2015-07-01 2015-08-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
MA42294B1 (fr) * 2015-07-01 2020-11-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers
GB201521746D0 (en) * 2015-12-10 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers

Also Published As

Publication number Publication date
CL2020001988A1 (es) 2020-12-11
CR20200594A (es) 2021-01-20
AU2020281108A1 (en) 2021-01-07
US11260115B1 (en) 2022-03-01
WO2017097602A1 (en) 2017-06-15
US10117916B2 (en) 2018-11-06
JP2022058349A (ja) 2022-04-12
US10238725B2 (en) 2019-03-26
AU2016368981B2 (en) 2020-12-10
MX2018005372A (es) 2018-06-06
US20220226450A1 (en) 2022-07-21
JP7053457B2 (ja) 2022-04-12
ZA201801752B (en) 2019-01-30
US10722566B2 (en) 2020-07-28
HK1259376A1 (zh) 2019-11-29
AU2016368981A1 (en) 2018-04-12
SG10202111398UA (en) 2021-11-29
US20170165337A1 (en) 2017-06-15
EA201891074A1 (ru) 2018-10-31
CL2020001987A1 (es) 2020-12-11
TW201720842A (zh) 2017-06-16
US11083784B2 (en) 2021-08-10
US10335474B2 (en) 2019-07-02
AU2022200616A1 (en) 2022-02-24
CN108602867A (zh) 2018-09-28
US20170165340A1 (en) 2017-06-15
MA43399A (fr) 2018-10-17
CR20200596A (es) 2021-01-20
AR106920A1 (es) 2018-02-28
US10653761B2 (en) 2020-05-19
US10398766B2 (en) 2019-09-03
US10064928B2 (en) 2018-09-04
CR20180295A (es) 2018-09-04
SG11201801670YA (en) 2018-06-28
US20180353584A1 (en) 2018-12-13
TWI730306B (zh) 2021-06-11
PE20181075A1 (es) 2018-07-04
AU2020281108B2 (en) 2022-02-24
US10653762B2 (en) 2020-05-19
EP3387008A1 (en) 2018-10-17
MA42072A1 (fr) 2018-12-31
US20170173131A1 (en) 2017-06-22
CL2020001989A1 (es) 2020-12-11
GB201521746D0 (en) 2016-01-27
BR112018007206A2 (pt) 2018-10-16
US20180353583A1 (en) 2018-12-13
US20180353586A1 (en) 2018-12-13
CR20200595A (es) 2021-01-20
US10238726B2 (en) 2019-03-26
JP2019502360A (ja) 2019-01-31
US20190314476A1 (en) 2019-10-17
CL2020001986A1 (es) 2020-12-11
CR20200592A (es) 2021-01-20
US20190314475A1 (en) 2019-10-17
SG10202005498VA (en) 2020-07-29
PH12018500848A1 (en) 2018-10-01
TW201936210A (zh) 2019-09-16
US20200054727A1 (en) 2020-02-20
US20180353585A1 (en) 2018-12-13
CR20200593A (es) 2021-01-20
CO2018004865A2 (es) 2018-11-30
KR20180086190A (ko) 2018-07-30
US20180344825A1 (en) 2018-12-06
CL2020001985A1 (es) 2020-12-11
US10238724B2 (en) 2019-03-26
CA3005813A1 (en) 2017-06-15
CL2018001532A1 (es) 2018-07-13
IL259304A (en) 2018-07-31
TWI658050B (zh) 2019-05-01
US20240285738A1 (en) 2024-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA124575C2 (uk) Пептид для лікування раку
TWI689516B (zh) 用於對抗多種癌症的免疫療法的新胜肽及胜肽組合
TWI641617B (zh) 用於膀胱癌和其它癌症免疫治療的肽、肽組合物和基於細胞的藥物
UA124519C2 (uk) Пептид, здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (mhc) людини i класу
TWI771694B (zh) 子宮癌治療
UA125816C2 (uk) Пептид, придатний для лікування та/або діагностики раку
CN109734777B (zh) 用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架
JP2020198875A (ja) 上皮性卵巣がんおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ
CN108713024A (zh) 用于nhl和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
UA124577C2 (uk) Пептид для лікування раку
UA123941C2 (uk) Пептид та його застосування для лікування раку
TWI781104B (zh) 新型肽、肽組合物作為靶標以及用於膽囊癌、膽管癌和其他癌症免疫治療
CN108602855A (zh) 用于乳腺癌和其他癌症免疫治疗的肽和肽组合物
UA123392C2 (uk) Пептид, здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (mhc) людини i класу, та його застосування для лікування раку
TW201841937A (zh) 用於白血病和其他癌症免疫治療的新穎肽和肽組合物
UA124139C2 (uk) Пептид, який здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (мнс) людини і класу
UA124411C2 (uk) Фармацевтично прийнятна сіль пептиду та її застосування для лікування раку
TW201841934A (zh) 用於治療癌症免疫治療的新穎肽及其肽組合物
AU2022204032B2 (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various cancers
TW202019955A (zh) B*07 限制肽和肽組合的抗癌免疫治療和相關方法
TW201738266A (zh) 用於aml和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物
CN111533799A (zh) 用于白血病和其他癌症免疫治疗的肽和肽组合物
WO2020023845A2 (en) Methods for identifying rna editing-derived epitopes that elicit immune responses in cancer
TW202019462A (zh) A*03限制肽在抗癌免疫治療和相關方法中的用途
TWI782375B (zh) 用於 aml 和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物