TWI903380B - 包括經修飾之自然殺手細胞及抗原特異性t細胞之醫藥組成物、其製造方法及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本案提供一種製造用於治療癌症的醫藥組成物之方法，該方法藉由不進行CD3 ^-CD19 ^-CD14 ^-陰性篩選而提供較高的細胞產量。藉由投予該醫藥組成物，可經由細胞介導的免疫作用有效地抑制個體的癌細胞。

Description

包括經修飾之自然殺手細胞及抗原特異性T細胞之醫藥組成物、其製造方法及其使用方法

本揭示相關於包含經修飾之自然殺手（NK）細胞和抗原特異性T細胞的醫藥組成物。亦提供培養經修飾之NK細胞和抗原特異性T細胞的方法。

免疫監測在對抗癌症方面發揮關鍵作用並代表一種非常有吸引力的治療方法，尤其是考慮到傳統手術、放射和化學療法在癌症管理中的許多缺點。

人體對抗癌症的第一道防線是自然殺手（NK）細胞，其表型為CD3 ^-CD14 ^-CD19 ^-CD56 ⁺CD16 ⁺NGK2D ⁺CD11c ^dimHLA-DR ^-CD86 ^-CD83 ^-。NK細胞是細胞毒性淋巴細胞，其主動掃描身體中的異常細胞，在它們發展成真正的癌細胞之前將其消滅。當NK細胞在體內巡邏時，它們會使用其活化和抑制表面受體之陣列與多種類型的細胞相互作用。大多數癌細胞會與NK細胞上的活化受體結合，從而觸發其自然殺手反應。

US20210260115A1揭示同時具有NK細胞功能和樹突狀細胞功能兩者的經修飾NK細胞及其培養方法。當將經修飾NK細胞投予患有癌症的個體時，該經修飾NK細胞會殺死腫瘤細胞並向個體中的初始T細胞（naïve T cells）呈現腫瘤相關抗原（TAA），並在體內傳遞T細胞反應（圖1）。然而，在培養步驟之前需要進行CD3 ^-CD14 ^-CD19 ^-單核細胞之陰性篩選步驟，這導致由於細胞產量低而產生高成本和製造過程複雜的問題。儘管如此，經修飾NK細胞在體內誘導TAA-特異性CD8 T細胞的功效仍存在不確定性。

這些發現支持開發針對癌細胞之基於NK的療法和產生更多數量之有治療能力的NK細胞的培養方法，用於臨床應用，因為目前對癌症的有效治療及/或預防的需求仍然未得到滿足。本案提供包含經修飾自然殺手細胞和抗原特異性T細胞的醫藥組成物，及其製造方法。

鑑於本領域的迫切需要，本文提供一種製造在癌症治療中安全且有效的包含經修飾自然殺手（NK）細胞和抗原特異性T細胞的醫藥組成物之方法。此外，該經修飾之NK細胞和抗原特異性T細胞易於製造且成本低及產率高。

在一實施例中，本揭示提供一種製造用於治療癌症的醫藥組成物的方法，包含 從患有癌症的個體身上取得單核細胞； 將該單核細胞與含有IL-15、IL-12和IL-18的第一培養基接觸約1至6天，以獲得經培養細胞群；以及 與第一培養基接觸後，將該經培養細胞群與含有IL-15和IL-12的第二培養基接觸約1至6天； 其中在該接觸步驟之前不對單核細胞進行CD3 ^-CD19 ^-CD14 ^-陰性篩選。

在一實施例中，本案提供一種醫藥組成物，其包含具有表型為CD45 ⁺CD3 ^-CD19 ^-CD14 ^-之經修飾NK細胞；具有表型為4-1BB ⁺CD8 ⁺的抗原特異性T細胞；以及醫藥上可接受的載體或賦形劑。在一較佳實施例中，經修飾之NK細胞可進一步包含CD56 ^hiCD16 ^dimNKG2D ⁺CD11c ⁺CD86 ⁺HLA-DR ⁺CD83 ^-HLA-ABC ⁺之表型，即該經修飾之NK細胞可包含CD45 ⁺CD3 ^-CD19 ^-CD14 ^-CD56 ^hiCD16 ^dimNKG2D ⁺CD11c ⁺CD86 ⁺HLA-DR ⁺CD83 ^-HLA-ABC ⁺之表型。在一實施例中，抗原特異性T細胞可更包含CD25 ^hiCD27 ^-CD28 ^-表型。在另一實施例中，抗原特異性T細胞可包含Perforin ^dimGanzyme B ^dimCD107a ⁺TNF-α ⁺IFN-γ ^dim之表型。在一較佳實施例中，經修飾之NK細胞可更包含CD25 ^hiCD27 ^-CD28 ^-4-1BB ⁺Perforin ^dimGanzyme B ^dimCD107a ⁺TNF-α ⁺IFN-γ ^dim之表型。

一些實施例提供藉由本文所述之方法製造的醫藥組成物。

一些實施例提供一種治療癌細胞的方法，包含向有需要的個體投予有效量的本文所述之醫藥組成物。

在一較佳實施例中，該有效量可為每劑約l×10 ³至約l×10 ⁹個細胞。

在一較佳實施例中，經修飾之NK細胞或抗原特異性T細胞可為自體性或同種異體性。

在一較佳實施例中，經修飾之NK細胞或抗原特異性T細胞可源自周邊血液、臍帶血或骨髓。

在一較佳實施例中，該方法可更包含在體外擴增該具有抗原特異性T細胞之經修飾NK細胞。

在一較佳實施例中，該第一培養基和第二培養基可更包含造血細胞培養基，較佳為AIM-V培養基。

在一較佳實施例中，該第一培養基和第二培養基可更包含血清蛋白，較佳為人類血小板裂解物。

本文所描述的培養方法允許從固定量的樣本例如10 mL血液中分離出更高數量的經修飾NK細胞。

本發明的前述和其他態樣現在將以本文所述之其他實施例更詳細地描述。應理解，本發明可以不同的形式來實施，且不應被解釋為限於本文中闡述的實施例。相反地，提供這些實施例使得本發明充分和完整，且將本發明的範圍充分地傳達給所屬技術領域中具有通常知識者。

本文描述本發明時所使用的術語僅用於描述特定實施例的目的，並非旨在限制本發明。如本發明的描述和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式「一（a）」、「一個（an）」和「該（the）」也旨在包括複數形式，除非上下文明確地另有說明。

如本文所使用的，術語「包含（comprises）」、「包含（comprising）」、「包括（includes）」、「包括（including）」、「具有（has）」、「具有（having）」、「含有（contains）」、「含有（containing）」、「特徵在於」或其任何其他變化，旨在涵蓋非排他性內含，但須遵守明確指示的任何限制。例如，包含一系列要素的組成物、混合物、製程或方法不必僅限於那些要素，而是可包括未明確列出的或此類組成物、混合物、製程或方法所固有的其他要素。

過渡短語「由…組成」排除未指定的任何元件、步驟或成分。若在申請專利範圍中，這將使該請求項不再包含所列舉的材料以外的材料，但通常與其相關的雜質除外。當短語「由…組成」出現在一請求項之正文的條款中，而不是緊跟在序言之後時，它僅限制該條款中列出的要素；整個請求項不排除其他要素。

當申請人用諸如「包含」之類的開放式術語來定義發明或其一部分時，應容易理解的是（除非另有說明）該描述應當被解釋為也使用術語「由…組成」來描述本發明。

本文中的所有數字可被理解為被「約」修飾。如本文所使用的，術語「約」用於指示一數值包括例如測量裝置的誤差、用於確定該值的方法、或研究對象之間存在的變化的固有變化。通常，該術語意在涵蓋大約或小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19% 或20%的變化，根據具體情況。

申請專利範圍中的術語「或」的使用係用於表示「及/或」，除非明確指示僅指該選擇物，或選擇物之間是相互排斥的，儘管本發明支持僅指該選擇物且「及/或」的定義。

本文所使用的「個體」是指動物，包括例如被診斷出患有或懷疑患有或發展癌症的哺乳動物個體。在一實施例中，術語「個體」可指患有癌症的脊椎動物或被認為需要癌症治療的脊椎動物。個體包括溫血動物，例如哺乳動物，例如靈長類動物，且更佳為人類。非人類靈長類動物亦可為個體。術語個體包括家養動物，例如貓、狗、猿等，家畜（例如，牛、馬、豬、綿羊、山羊等）和實驗動物（例如，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等）。因此，本文涵蓋獸醫用途和醫學配方。

「投予（Administering）」或「投予（Administration）」在本文中是指向個體提供本申請案的NK細胞或醫藥組成物。舉例而言但不限於，投予可經由腸胃外、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、腹腔內、小腦內、腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸腔內、子宮內、膀胱內、推注、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內及經皮進行。例如，注射可藉由靜脈注射（ i.v.）注射、皮下（ s.c.）注射、皮內（ i.d.）注射、腹膜內（ i.p.）注射或肌肉（ i.m.）注射進行。可採取一或多種此類途徑。腸胃外投予可例如藉由推注注射或藉由隨時間逐漸灌注。替代地或同時地，可藉由口服途徑投予。

術語「治療（treating）」或「治療（treatment）」的使用在本文中是指向個體投予NK細胞或醫藥組成物，其目的是治癒、減輕、緩解、補救、預防或改善一病症、該病症的症狀、繼發於該病症的疾病狀態，或對該病症的傾向。當在申請專利範圍及/或說明書中使用時，術語「抑制」、「減少」或「預防」或這些術語的任何變體，包括任何可測量的減少或完全抑制，以達到期望的結果。

可藉由本申請案的醫藥組成物治療的「癌症」包括按部位分類的癌症，包括口腔和咽部的癌症（唇、舌、唾腺、口底、牙齦和其他口腔、鼻咽、扁桃體、口咽、下咽、其他口腔部位/咽部）；消化系統癌症（食道；胃；小腸；結腸和直腸；肛門、肛管，和肛門直腸；肝；肝內膽管；膽囊；其他膽道部位；胰臟；腹膜後；腹膜、網膜和腸繫膜；其他消化器官）；呼吸系統癌症（鼻腔、中耳、鼻竇；喉；肺和支氣管；胸膜；氣管、縱隔和其他呼吸器官）；間皮瘤癌症；骨骼和關節；和軟組織，包括心臟；皮膚癌，包括黑色素瘤和其他非上皮皮膚癌；卡波西氏肉瘤（Kaposi’s sarcoma）和乳癌；女性生殖系統癌症（子宮頸；子宮體；子宮、卵巢；陰道；外陰部和其他女性生殖器）；男性生殖系統癌症（前列腺；睪丸；陰莖；和其他男性生殖器）；泌尿系統癌症（膀胱；腎臟和腎盂；輸尿管；和其他泌尿器官）；眼癌和眼眶癌；腦和神經系統癌症（腦；和其他神經系統）；內分泌系統癌症（甲狀腺和其他內分泌系統，包括胸腺）；淋巴瘤（何杰金氏病和非何杰金氏淋巴瘤）、多發性骨髓瘤，及/或白血病（淋巴細胞白血病；骨髓性白血病；單核細胞白血病；和其他白血病）。

按組織學類型分類可為本申請案的治療組成物的合適標靶之其他癌症包括但不限於：腫瘤、惡性；癌症，未明確分類（NOS）；癌症，未分化，NOS；巨細胞癌和梭形細胞癌；小細胞癌，NOS；乳突狀癌，NOS；鱗狀細胞癌，NOS；淋巴上皮癌；基底細胞癌，NOS；毛髮基質癌；移行細胞癌，NOS；乳突狀移行細胞癌；腺癌，NOS；胃泌素瘤，惡性；膽管癌；肝細胞癌，NOS；合併肝細胞癌和膽管癌；小樑狀腺癌；腺樣囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性息肉症；實體癌，NOS；類癌瘤，惡性；細支氣管肺泡腺癌；乳突狀腺癌，NOS；嫌色癌；嗜酸性球癌；嗜酸腺癌；嗜鹼性球癌；透明細胞腺癌，NOS；顆粒細胞癌；濾泡性腺癌，NOS；乳突狀和濾泡狀腺癌；非包膜硬化性癌；腎上腺皮質癌；子宮內膜癌；皮膚附屬器癌；頂漿腺癌；皮脂腺癌；耵聹腺癌；黏液表皮樣癌；囊腺癌，NOS；乳突狀囊腺癌，NOS；乳突狀漿液性囊腺癌；黏液性囊腺癌，NOS；黏液腺癌；印戒細胞癌；浸潤性乳管癌；髓質癌，NOS；小葉癌；發炎性癌；佩吉特氏病（Paget’s disease），乳房；腺泡細胞癌；腺樣鱗狀細胞癌；腺癌伴隨鱗狀化生；胸腺瘤，惡性；卵巢間質瘤，惡性；卵泡膜瘤，惡性；顆粒細胞瘤，惡性；睪丸母細胞瘤，惡性；支持細胞癌；間質細胞瘤，惡性；脂質細胞瘤，惡性；副神經節瘤，惡性；乳外副神經節瘤，惡性；嗜鉻細胞瘤；皮膚絲球肉瘤；惡性黑色素瘤，NOS；無黑色素性黑色素瘤；表淺擴散性黑色素瘤；巨大色素痣中的惡性黑色素瘤；上皮樣細胞黑色素瘤；藍痣，惡性；肉瘤，NOS；纖維肉瘤，NOS；纖維組織細胞瘤，惡性；黏液肉瘤；脂肪肉瘤，NOS；平滑肌肉瘤，NOS；橫紋肌肉瘤，NOS；胚胎性橫紋肌肉瘤；肺泡狀橫紋肌肉瘤；間質肉瘤，NOS；混合瘤，惡性，NOS；米勒氏混合瘤；腎母細胞瘤；肝母細胞瘤；癌肉瘤，NOS；間葉瘤，惡性；布倫納瘤（Brenner tumor），惡性；葉狀腫瘤，惡性；滑膜肉瘤，NOS；間皮瘤，惡性；惡性胚胎瘤；胚胎癌，NOS；畸胎瘤，惡性，NOS；卵巢甲狀腺腫，惡性；絨毛膜癌；中腎瘤，惡性；血管肉瘤；血管內皮瘤，惡性；卡波西氏肉瘤；血管外皮細胞瘤，惡性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤，NOS；皮質旁骨肉瘤；軟骨肉瘤，NOS；軟骨母細胞瘤，惡性；間葉性軟骨肉瘤；骨巨細胞瘤；尤文氏肉瘤（Ewing’s sarcoma）；牙源性腫瘤，惡性；成釉細胞牙肉瘤；成釉細胞瘤，惡性；成釉細胞纖維肉瘤；松果體瘤，惡性；脊索瘤；神經膠質瘤，惡性；室管膜瘤，NOS；星狀細胞瘤，NOS；原生質星狀細胞瘤；纖維性星狀細胞瘤；星狀母細胞瘤；膠質母細胞瘤，NOS；寡突膠質細胞瘤，NOS；寡突膠質細胞瘤；原始神經外胚層；小腦肉瘤，NOS；神經節神經母細胞瘤；神經母細胞瘤，NOS；視網膜母細胞瘤，NOS；嗅神經源性腫瘤；腦膜瘤，惡性；神經纖維肉瘤；神經鞘瘤，惡性；顆粒細胞瘤，惡性；惡性淋巴瘤，NOS；何杰金氏病，NOS；何杰金氏病；副肉芽腫，NOS；惡性淋巴瘤，小淋巴細胞；惡性淋巴瘤，大細胞，瀰漫性；惡性淋巴瘤，濾泡性，NOS；蕈狀肉芽腫；其他特定的非何杰金氏淋巴瘤；惡性組織細胞增多症；多發骨髓瘤；肥大細胞肉瘤；免疫增殖性小腸疾病；白血病，NOS；淋巴球白血病，NOS；漿細胞白血病；紅血球白血病；淋巴肉瘤細胞白血病；骨髓性白血病，NOS；嗜鹼性粒細胞白血病；嗜酸性粒細胞白血病；單核細胞白血病，NOS；肥大細胞白血病；巨核母細胞白血病；骨髓肉瘤；以及毛細胞白血病。

本文所使用的「有效量」是指足以減輕癌症症狀和體徵的經修飾NK細胞或醫藥組成物的劑量，所述症狀和體徵包括但不限於體重減輕、疼痛，或可在臨床上作為可觸及腫塊或透過各種影像手段在放射學上偵測到的腫瘤塊。

在某些實施例中，希望能限制、減少或改善腫瘤或癌症病變的大小。當然，投予途徑將隨著病變或目標處的位置和性質而變化，並包括例如區域性、腸胃外、靜脈內、肌肉內及/或全身投予和配方。對於目標區域，特別考慮直接注射或注射到血管系統或往返於器官或組織內的血管中。局部、區域性或全身投予也可能是適當的。

在本文的揭示內容中，使用FACS/流式細胞儀分析的細胞表面抗原的表現量或表面密度在表1中定義。表1中各種表現量的解釋是定義細胞表面抗原表現量之一範例。需要注意的是，流式細胞儀訊號位準強度會隨著以下因素變化：流式細胞儀、軟體以及所用抗體的不同批次。

表1

符號	解釋
-	流式細胞儀訊號位準強度小於或等於10 0（即1）
+（Dim）	流式細胞儀訊號位準強度介於10 0至10 1
+	流式細胞儀訊號位準強度介於10 1至10 2
+（hi）	流式細胞儀訊號位準強度大於或等於10 2

除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本案所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的相同含義。本文引用的所有文獻、專利申請案、專利和其他參考文獻均藉由引用以其整體併入，以用於與其中呈現參考文獻的句子及/或段落相關的揭示。

經修飾之 NK 細胞與抗原特異性 T 細胞

天然存在的或常規NK細胞具有CD16 ⁺CD56 ⁺表型。在一實施例中，天然存在的或常規的NK細胞具有CD3 ^-CD14 ^-CD19 ^-CD56 ⁺CD16 ⁺NKG2D ⁺CD11c ^dim表型，如表2所示。天然存在的或常規的T細胞具有CD3 ⁺CD56 ⁺表型。在一實施例中，天然存在的或常規的T細胞具有CD3 ⁺CD14 ^-CD19 ^-CD56 ⁺表型，如表3所示。

在一實施例中，本申請案提供一種經修飾之NK細胞，其包含CD3 ^-CD19 ^-CD14 ^-CD56 ^hiCD16 ^dimNKG2D ⁺CD11c ⁺CD86 ⁺HLA-DR ⁺CD83 ^-細胞表型，如表2所示。本申請案之經修飾之NK細胞為非自然發生。該經修飾之NK細胞包含一或多種完全活化的樹突狀（DC）細胞表面抗原（例如，HLA-DR和CD86），並具有NK細胞功能和DC細胞功能以及增強的抗癌活性。

表2.常規NK細胞與經修飾NK細胞的表型比較

	常規NK	經修飾NK
CD3	-	-
CD14	-	-
CD19	-	-
CD56	+	hi
CD16	+	dim
NKG2D	+	+
CD11c	dim	+
HLA-DR	-	+
CD86	-	+
CD83	-	-

在一實施例中，本申請案提供一種抗原特異性T細胞，其包含CD3 ⁺CD14 ^-CD19 ^-CD56 ⁺CD25 ^hiCD27 ^-CD28 ^-4-1BB ⁺Perforin ^dimGanzyme B ^dimCD107a ⁺TNF-α ⁺IFN-γ ^dim表型，如表3所示。本申請案的抗原特異性T細胞是非天然存在的。該抗原特異性T細胞包含一或多種在天然存在的T細胞上不表現的標記物，例如4-1BB或CD25。

表3.常規T細胞與抗原特異性T細胞的表型比較

	常規T細胞	抗原特異性T細胞
CD3	+	+
CD14	-	-
CD19	-	-
CD56	+	+
TCRαβ	+	dim
TCRγδ	-	-
CD4	-	-
CD8	+	+
4-1BB	-	+
CD27	+	-
CD28	+	-
CD25	-	hi
CD69	dim	dim
IFN-γ	dim	dim
TNF-α	+	+
穿孔素	dim	dim
顆粒酶B	+	dim
CD107a	dim	+

具體地，本申請案提供包含CD16 ^dimCD56 ^hi表型的經修飾NK細胞，其中所述CD16 ^dimCD56 ^hiNK細胞不包含CD83細胞表面抗原（其具有CD16 ^dimCD56 ^hiCD83 ^-表型）。

在一實施例中，藉由將經修飾NK細胞或抗原特異性T細胞暴露於經螢光染料標記的特異性抗人類單株抗體（例如，CD86-PE（Beckman Coulter；目錄編號：IM2729U）或抗人類CD83-PE-Cy5（BioLegend；目錄編號：305310），之後使用流式細胞儀（如Navios，購自Beckman Coulter, Inc., USA）對經修飾之NK 細胞或抗原特異性T細胞進行分選，將細胞表面抗原之表現量或表面密度定量。

經修飾之NK細胞或抗原特異性T細胞可從單一個體產生，例如，自體或同種異體。

醫藥組成物

在一實施例中，本申請案提供醫藥組成物，其包含本文所述之經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞，以及醫藥上可接受的載體或賦形劑。在一實施例中，經修飾之NK細胞和抗原特異性T細胞是由單核細胞如周邊血液單核細胞（PBMC）一起製造的。

本申請案亦提供藉由向有需要的個體投予有效抑制癌細胞之量的醫藥組成物來抑制癌細胞的方法。不受任何特定理論的束縛，一般相信本案的醫藥組成物藉由抗原特異性T細胞和具有一或多種NK細胞/DC細胞功能之經修飾NK細胞來抑制癌細胞：增強細胞毒性、刺激癌症-特異性T淋巴球增生或IFN-γ分泌。

本案的醫藥組成物或經修飾NK細胞之投予途徑包括但不限於靜脈內、肌肉內、皮下、口服、局部、皮內、經皮、皮下、腸胃外、直腸、脊髓或表皮投予。在一實施例中，經修飾之NK細胞經由靜脈注射或輸注投予。

本申請案的醫藥組成物可製備為注射劑，不論是作為液體溶液或懸浮液，或作為適合在注射前溶解或懸浮於液體載體中的固體形式。

本案之經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞被配製成醫藥組成物，以遞送至哺乳動物個體中。該醫藥組成物係單獨投予，及/或與醫藥上可接受的載劑、賦形劑或載體混合投予。適當的載劑為例如生理食鹽水（例如一般生理食鹽水）、葡萄糖、甘油、富含血小板的血漿（PRP）或類似物，及其組合。此外，該載劑可含有少量輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑或佐劑。醫藥上可接受的載體可含有生理上可接受的化合物，其作用是例如穩定或增加或降低本申請案的醫藥組成物的吸收或清除率。生理學上可接受的化合物可包含例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚醣、抗氧化劑如抗壞血酸或穀胱甘肽、螯合劑、低分子量蛋白質、界面活性劑、脂質體載體、或賦形劑或其他穩定劑及/或緩衝劑。其他生理上可接受的化合物包含潤濕劑、乳化劑、分散劑或防腐劑。請參見例如，Remington's Pharmaceutical Science，第21版，Mack Publishing Company, Easton, Pa.（「Remington's」）。本申請案的醫藥組成物亦可包括輔助物質，例如醫藥試劑、細胞激素或其他生物反應修飾劑。

製備此類劑型的實際方法對於所屬技術領域中具有通常知識者來說是已知的或將是顯而易見的。請參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，第21版。

無論是用於預防或治療目的，本案的醫藥組成物可按照適合個體的年齡、體重和狀況、所用的特定組成物以及投予途徑，依時間表以單劑量治療或多劑量治療的形式投予一段時間。例如，在一實施例中，本申請案的醫藥組成物係每月一次、每月兩次、每月三次、每隔一週（qow）、每週一次（qw）、每週兩次（biw）、每週三次（tiw）、每週四次（qiw）、每週五次、每週六次、每隔一天（qod）、每天（qd）、每天兩次（bid）、每天三次（tid）或每天四次（qid）投予。

根據本申請案的醫藥組成物的治療持續時間，例如投予醫藥組成物的時間段，可根據多種因素（例如個體反應等）而變化。例如，該醫藥組成物可在一段時間範圍內投予，自約一或數秒至一或數分鐘、自一或數小時至一天至約一周、自約兩週至約四週、自約1個月至約2個月、自約2個月至約4個月、自約4個月至約6個月、自約6個月至約8個月、自約8個月至約1年、自約1年至約2年，或自約2年至約4年，或更長。

將胃腸外醫藥組成物配製為劑量單位形式對於易於投予和劑量均勻性是有利的。本文所使用的劑量單位形式是指適合作為待治療個體的單一劑量的物理上離散的單位；每個單元含有預定量的經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞，其與所需的醫藥載體結合，可產生所希望的治療效果。

從細胞培養測定和動物研究中獲得的數據，可用於配製用於人類的劑量範圍。在一實施例中，此類醫藥組成物的劑量落於包括具有很小毒性或無毒性的ED ₅₀的循環濃度範圍內。劑量可根據所採用的劑型和所採用的投予途徑在此範圍內變化。在另一實施例中，治療有效劑量可從最初細胞培養測定中估計。劑量可配製用於動物模型中，以達到包括在細胞培養物中測定的IC ₅₀（即，達到半-最大症狀抑制之經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞的濃度）之循環血漿濃度範圍。Sonderstrup, Springer, Sem. Immunopathol. 25: 35-45, 2003. Nikula et al, Inhal. Toxicol. 4(12j: 123- 53, 2000)。

醫藥組成物被配製為含有有效量的經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞，其中該量取決於待治療的動物和待治療的病症。對於任一特定個體的特定劑量取決於多種因素，包含特定經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投藥時間、投藥途徑、排泄率、藥物組合以及接受治療的特定疾病的嚴重程度。本申請案的醫藥組成物的治療或預防有效量的示例性、非限制性範圍為至少約每劑量l × 10 ³個細胞至約每劑量l × 10 ⁹個細胞。其他劑量也是可能的，包含但不限於每劑量1 × 10 ⁴、1 × 10 ⁵、1 × 10 ⁶、1 × 10 ⁷、1 x 10 ⁸或1 × 10 ⁹個細胞。

該醫藥組成物可單獨投予或與另一治療試劑（例如化療、放療或標靶治療或癌症疫苗）組合投予。

製造該醫藥組成物之方法

在一實施例中，製造經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞的方法如圖12所示。簡而言之，該方法包含至少以下步驟：取得單核細胞；將單核細胞與含有IL-15、IL-12和IL-18之第一培養基接觸約1至6天，以獲得經培養細胞群；與第一培養基接觸後，將經培養細胞群與含有IL-15和IL-12的第二培養基接觸約1至6天；其中在接觸步驟之前不對單核細胞進行CD3 ^-CD19 ^-CD14 ^-陰性篩選。

較佳地，本文中用於篩選或產生經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞的單核細胞為未進行CD3 ^-CD14 ^-CD19 ^-細胞陰性篩選之單核細胞，作為擴增培養的初始細胞群。

本揭示之一實施例提供用於從樣本中辨識初始細胞的方法，其不包含從所述樣本中的單核細胞耗盡一或多種以下細胞表面抗原的步驟：CD3、CD14或CD19。

包含IL-12之組成物的培養時間對於經修飾NK細胞的功能可能是關鍵的。在一實施例中，單核細胞可與IL-12例如人類IL-12一起培養1至12天，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天，以產生經修飾之NK細胞。在一實施例中，與IL-12一起培養3、6、9或12天的單核細胞會產生具有相似細胞產率和表型模式的經修飾NK細胞。在另一實施例中，延長暴露於IL-12的時間（例如12天），與暴露於IL-12較短時間（例如9天）的細胞相比，培養細胞的細胞毒性和抗原呈現細胞活性增強。

在一實施例中，用於培養細胞的組成物進一步包括IL-18。在一實施例中，IL-18的有效濃度為約1至300 ng/mL，例如50、100、150、200、250、300 ng/mL。在另一實施例中，IL-18的有效濃度為約10至約250 ng/mL，或在其中以10 ng/mL增加的任何數值或數值範圍（例如，約30 ng/mL、約220 ng/mL等）。

在另一實施例中，IL-18對經修飾NK細胞的表型模式和功能活性產生影響。長期暴露於IL-18可能會對細胞大小、表型和功能活性產生相反的影響。在一實施例中，單核細胞可與IL-18例如人類IL-18一起培養1至12天，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天，以產生經修飾之NK細胞。在一實施例中，與IL-18一起培養3、6、9或12天的單核細胞會產生具有各種表型的經修飾NK細胞。在另一實施例中，充分暴露於IL-18（例如6天），與暴露於IL-18較短時間（例如6天）的細胞相比，可能對經修飾NK細胞的細胞大小、表型和功能產生相反的影響。

在一實施例中，單核細胞與包含IL-18、IL-15及/或IL-12的培養組成物接觸。在另一實施例中，將單核細胞與實質上由造血細胞培養基（例如X-vivo 20）、IL-18、IL-15、IL-12和血清蛋白（例如人類血小板裂解物）組成的組成物混合。在另一實施例中，將單核細胞與實質上由X-vivo 20、IL-18、IL-15、IL-12和人類血小板裂解物組成的組成物混合。

在另一實施例中，該組成物更包含造血細胞培養基。造血細胞培養基的非限制性範例包含X-vivo 10、X-vivo 15、X-vivo 20（可購自Lonza, Switzerland）和AIM-V（可購自ThermoFisher Scientific, United States）。

在另一實施例中，該組成物更包含血清蛋白，例如人類血小板裂解物。在本申請案中，「血清蛋白」是存在於血液或血漿中的蛋白質，其具有許多不同的功能，包含細胞活性的運輸和調節。血清蛋白的非限制性範例包含酵素、補體成分、蛋白酶抑制劑、激肽前驅物、血清白蛋白、球蛋白及纖維蛋白原等。

用於培養細胞的組成物的非限制性範例包括 (a)造血細胞培養基+ IL-15 + IL-18；(b)造血細胞培養基+ IL-12 + IL-18；(c)造血細胞培養基+ IL-15 + IL-12 + IL-18；(d) X-vivo 20 + IL-15 + IL-18；(e) X-vivo 20 + IL-12 + IL-18；(f) X-vivo 20 + IL-15 + IL-12 + IL-18；(g) AIM-V + IL-15 + IL-18；(h) AIM-V + IL-12 + IL-18；(i) AIM-V + IL-15 + IL-12 + IL-18；(j)造血細胞培養基+ IL-15 + IL-18 +血清蛋白；(k)造血細胞培養基+ IL-12 + IL-18+血清蛋白；(l)造血細胞培養基+IL-15+IL-12+IL-18+血清蛋白；(m) X-vivo 20 + IL-15 + IL-18 + 血清蛋白；(n) X-vivo 20 + IL-12 + IL-18 + 血清蛋白；(o) X-vivo 20 + IL-15 + IL-12 + IL-18 + 血清蛋白；(p) AIM-V + IL-15 + IL-18 + 血清蛋白；(q) AIM-V + IL-12 + IL-18 + 血清蛋白；以及(r) AIM-V + IL-15 + IL-12 + IL-18 + 血清蛋白。

在一實施例中，培養基用於在37 °C、5% CO ₂存在下培養該經修飾之NK細胞和抗原特異性T細胞。

根據本申請案的一些實施例的方法，其不包括CD3 ^-CD14 ^-CD19 ^-的陰性篩選，增強經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞的產率。經修飾NK細胞的產率是透過FACS和活細胞計數的單核細胞純度來確定。用於細胞增殖的其他測定法是本領域眾所周知的，例如細胞群落形成測定法、代謝測定法和直接增殖測定法。

該單核細胞與培養基的接觸時間的示例性非限制性範圍為約1分鐘至約1小時、約1小時至約24小時、約1天至約3天、約1天至約6天、約1天至約9天、約1天至約12天、約3天至約6天、約3天至約9天、約3天至約12天、約6天至約9天、約6天至約12天、或至少1天。在一實施例中，該接觸時間為約3天。在另一實施例中，該接觸時間為約6天。

在一實施例中，該單核細胞與包含IL-15、IL-12和IL-18的第一培養基接觸；之後與含有IL-15和IL-12的第二培養基接觸。在另一實施例中，該第一和第二培養基更包含造血細胞培養基，例如AIM-V或X-vivo，及/或血清蛋白，例如人類血小板裂解物。

在一實施例中，經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞可藉由以下步驟製造： （a）將l×l0 ⁶/mL單核細胞與包含AIM-V培養基、HPL（濃度：4%w/w）、IL-15（濃度：30 ng/mL）、IL-12（濃度：3 ng/mL）和IL-18（濃度：50 ng/mL）之組成物在第0天接觸。 （b）收穫並下旋轉步驟（a）中的一半初始細胞，之後在第6天用含有AIM-V培養基、HPL、IL-15和IL-12之組成物重新懸浮細胞沉澱物。 （c）在第12天收集步驟（b）中的所有培養細胞。

選擇性地，用於培養細胞的組成物可分別在第0天和第6天、第3天和第9天更換為具有相同成分的新鮮培養基。例如，可如下培養初始細胞： （a）將l×l0 ⁶/mL單核細胞與包含AIM-V培養基、HPL（濃度：4%w/w）、IL-15（濃度：30 ng/mL）、IL-12（濃度：3 ng/mL）和IL-18（濃度：50 ng/mL）之組成物在第0天接觸。 （b）在第3天以含有AIM-V培養基、HPL、IL-15、IL-12和IL-18之組成物更換培養基。 （c）收穫並下旋轉步驟（b）中的一半培養細胞，之後在第6天用含有AIM-V培養基、4%w/w HPL、30 ng/mL之IL-15和3 ng/mL之IL-12之組成物重新懸浮細胞沉澱物。 （d）在第9天以含有AIM-V培養基、HPL、IL-15和IL-12的組成物更換培養基。 （e）在第12天收集步驟（d）中的所有培養細胞。

或者，用於培養細胞的組成物可分別在第0天和第6天、第3天和第9天更換為具有相同成分的新鮮培養基。例如，可如下培養初始細胞： （a）將l×l0 ⁶/mL單核細胞與包含AIM-V培養基、HPL（濃度：4%w/w）、IL-15（濃度：30 ng/mL）、IL-12（濃度：3 ng/mL）和IL-18（濃度：50 ng/mL）之組成物在第0天接觸。 （b）在第3天以含有AIM-V培養基、HPL、IL-15、IL-12和IL-18之組成物更換培養基。 （c）收穫並下旋轉步驟（b）中的一半培養細胞，之後在第6天用包含AIM-V培養基、4%w/w HPL、30 ng/mL之IL-15、3 ng/mL之IL-12和50 ng/mL之IL-18之組成物重新懸浮細胞沉澱物。 （d）在第9天以包含AIM-V培養基、HPL、IL-15、IL-12和IL-18的組成物更換培養基。 （e）在第12天收集步驟（d）中的所有培養細胞。

用於實施本發明的具體態樣之以下範例僅供說明性目的，並不旨在以任何方式限制本發明的範圍。

實施例

實施例 1 ：初始細胞之製備

從健康志願者收集40 mL的周邊血液到含有K ₂EDTA的真空管中。將血液樣本與等體積的預熱磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS）（Biological Industries, Israel）混合。將40 mL稀釋的周邊血液等分樣本置入50 mL離心管中，並載入10 mL預熱的Ficoll-Paque™ PREMIUM。將離心管在室溫下以2000 rpm離心30分鐘。收集界面層中的單核細胞並在PBS中洗滌一次。將細胞沉澱物重新懸浮至密度為10 ⁶個細胞/100 mL MACS緩衝液。

實施例 2: 經修飾 NK 細胞與抗原特異性 T 細胞的培養

將實施例1的單核細胞培養在含有4% HPL、hIL-15(第0、3、6、9天)、3ng/ml hIL-12(第0、3、6、9天)和hIL-18(第0、3、6天)之AIM-V培養基中12天。以台盼藍染料排除法測定總細胞計數和存活率。以下列公式計算絕對細胞數。

結果：如表4和圖3所示，先前技術中的富集步驟顯著減少用於製造的初始細胞的數量。雖然經修飾之NK細胞的純度較高，但先前技術的經修飾NK細胞的絕對細胞數僅為本案的經修飾NK細胞的五分之一。另一方面，利用本案的方法可製造顯著擴增的CD8 T細胞群，如圖4、5A和5B所示。

實施例 3 ：抗原特異性 CD8 T 細胞

將PBMC培養在含有4% HPL、30 ng/ml hIL-15（第0、3、6、9天）、3 ng/ml hIL-12（第0、3、6、9天）和50 ng/ml hIL-18（第0、3、6天）之AIM-V培養基中12天。產物係以下列單株抗體染色：CD45-ECD、CD56-APC-Alexa Flour 700、CD3-APC-Alexa Flour 750、CD14-APC-Alexa Flour 750、CD19-APC-Alexa Flour 750、CD8-Krome橘（Beckman Coulter）、TCRαβ-FITC、4-1BB-PE、CD25-PE、CD28-PerCp-Cy5.5、CD4-PE-Cy7、TCRγδ-APC、CD27-太平洋藍（Biolegend）。透過Navios流式細胞儀採集樣本並透過Kaluza 軟體（Beckman Coulter）進行數據分析。使用學生t檢定進行統計分析，若P＜0.05，則結果被認為是顯著的。ns：不顯著。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

結果：活化-誘發之標記物（AIM），包括CD25（ PLoS ONE, 2017, DOI: 10.1371/journal.pone.0186998）、CD69、4-1BB（CD137）、IFN-γ（ Sig Transduct Target Ther, 2021, DOI: 10.1038/s41392-021-00589-1）之上調，或CD27和CD28（ Med Microbiol Immunol, 2019, DOI: 10.1007/s00430-019-00608-7）之下調，係用於抗原特異性T細胞之辨識。如圖6和圖7所示，在如本案所述製造之經擴增CD8 T細胞群中，CD8 T細胞表現抗原特異性T細胞表型，例如活化-誘發標記物4-1BB和CD25之上調和活化-誘發標記物CD27和CD28之下調，指出CD8 T細胞的活化。與PBMC中的新鮮T細胞相比，AIM的表現增加約4至170倍。

實施例 4 ： CD8 T 細胞的脫顆粒

將PBMC在含有4% HPL、30 ng/ml hIL-15（第0、3、6、9天）、3 ng/ml hIL-12（第0、3、6、9天）和50 ng/ml hIL-18（第0、3、6天）之AIM-V培養基中培養12天。本案產物係以下列單株抗體染色：CD56-APC-Alexa Flour 700、CD14-APC-Alexa Flour 750、CD19-APC-Alexa Flour 750（Beckman Coulter）、穿孔素-FITC、4-1BB-PE、CD107a-PE/Dazzle 594、IFN-γ-PerCp-Cy5.5、TNF-α-PE-Cy7、顆粒酶B -太平洋藍、CD3-BV510（Biolegend）。透過Navios流式細胞儀採集樣本並透過Kaluza軟體（Beckman Coulter）進行數據分析。使用學生t檢定進行統計分析，若P＜0.05，則結果被認為是顯著的。ns：不顯著。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

結果：如圖8和圖9所示，在本案所述之製造過程中，CD8 T細胞被誘發遞送脫顆粒分子，例如穿孔素、顆粒酶B、CD107a、TNF-α和IFN-γ，其與PBMC中的新鮮T細胞相比增加約60倍。。

實施例 5: 執行抗腫瘤活性的醫藥組成物

從產物中分別分選出經修飾NK細胞和抗原特異性T細胞，藉由磁珠移除CD3 ⁺細胞和CD56 ⁺細胞。藉由PanToxilux套組（OncoImmunin, Inc.）評估經修飾之NK細胞和抗原特異性T細胞的細胞毒性。以人類上皮性卵巢癌（EOC）細胞為標靶細胞，用TFL4在最佳濃度下染色50分鐘。將經TFL-4標記的標靶細胞和經修飾NK細胞或抗原特異性T細胞與凋亡蛋白酶（caspase）受質在37°C下共靜置60分鐘。收穫細胞並以流式細胞儀測定TFL-4 ⁺受質 ⁺的訊號來分析細胞死亡。使用學生t檢定進行統計分析，若P＜0.05，則結果被認為是顯著的。ns：不顯著。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

結果：如圖10和圖11所示，凋亡蛋白酶陽性標靶細胞（僅具有經修飾之NK細胞或抗原特異性T細胞）的百分比分別為9.63%和10.14%，而凋亡蛋白酶陽性標靶細胞（具有本案的醫藥組成物）的百分比則為12.45%，與僅有經修飾NK細胞或僅有抗原特異性T細胞相比，至少增加22.7%。此結果表明，本案的醫藥組成物（由患者產生）展現出針對來自同一患者的原發性腫瘤細胞的殺腫瘤活性。

表5. 本案使用的試劑和套組

名稱	目錄編號	廠商
培養
磷酸鹽緩衝生理食鹽水，1 X，不含 Ca 2+和 Mg 2+	21-040-CV	Corning
Ficoll- paque Premium 1.077	17-5442-03	Cytiva
CTS ™ AIM V不含血清培養基	0870112DK	Gibco
GMP UltraGRO ™-Advanced（HPL）	HPCFDCGL10	AventaCell
重組人類IL-15 GMP	247-GMP-025	R&D SYSTEMS
MACS® GMP重組人類IL-12	170-076-174	Miltenyi Biotec
重組人類IL-18（不含載體）	592106	BioLegend
功能測定
毒殺測定套組（PanToxiLux ™）	PTL8028	OncoImmunin
第IV型膠原蛋白酶	C5138	Sigma-Aldrich
Dnase I	D5025	Sigma-Aldrich
透明質酸酶	H3757	Sigma-Aldrich
培養基199, Earle's鹽類	11150059	Gibco
MCDB 105培養基	117-500	Cell Applications
CellTrace ™ CFSE細胞增殖套組	C34554	Invitrogen
CD25生物素	302624	BioLegend
鏈黴親和素微珠	130-048-101	Miltenyi Biotec
CliniMACS PBS/EDFA緩衝液	700-25	Miltenyi Biotec
Ultra-LEAF ™經純化之抗人類CD3抗體	317326	BioLegend
Ultra-LEAF ™經純化之抗人類CD28抗體	302934	BioLegend
重組人類IL-2（不含載體）	791908	BioLegend
重組人類IL-15（不含載體）	570308	BioLegend
CD3 APC-Alexa Flour 750	A66329	Beckman Coulter
CD4 APC	317416	BioLegend
CD86 PE/Cy7	305422	BioLegend
CD8a太平洋藍	301023	BioLegend
表型
CD45 ECD	A07784	Beckman Coulter
CD3 APC-Alexa Flour 750	A66329	Beckman Coulter
CD14 APC-Alexa Flour 750	A86052	Beckman Coulter
CD19 APC-Alexa Flour 750	A78838	Beckman Coulter
CD56 APC-Alexa Flour 700	B10822	Beckman Coulter
CD16 PE/Cy7	6607118	Beckman Coulter
NKG2D（CD314）PE	A08934	Beckman Coulter
CD11c APC	301614	BioLegend
HLA-A,B,C太平洋藍	311418	BioLegend
HLA-DR Krome橘	B00070	Beckman Coulter
CD86 Alexa Fluor 488	305414	BioLegend
CD83 PE/Cy5	305310	BioLegend
TCR α/β FITC	306706	BioLegend
TCR γ/δ APC	331212	BioLegend
CD3 Brilliant Violet 510	300448	BioLegend
CD4 PE/Cy7	6607101	Beckman Coulter
CD8a APC	301014	BioLegend
CD8 Krome橘	B00067	Beckman Coulter
4-1BB（CD137）PE	309804	BioLegend
CD27太平洋藍	356414	BioLegend
CD28 PerCP/Cyanine5.5	302922	BioLegend
CD25 PE	302606	BioLegend
CD69太平洋藍	310920	BioLegend
PD-1（CD279）PerCP/Cyanine5.5	329914	BioLegend
CD107a PE/Dazzle™ 594	328646	BioLegend
穿孔素FITC	308104	BioLegend
顆粒酶B太平洋藍	515408	BioLegend
IFN-γ PerCP/Cyanine5.5	502526	BioLegend
TNF-α PE/Cy7	502930	BioLegend
小鼠IgG1 PE	IM0670U	Beckman Coulter
小鼠IgG1 PE/Cy7	6607099	Beckman Coulter
小鼠IgG1 Krome橘	A96415	Beckman Coulter
小鼠IgG2b, κ 同種型 Ctrl Alexa Fluor 488	400329	BioLegend
小鼠IgG2b, κ 同種型 Ctrl FITC	400310	BioLegend
小鼠IgG1, κ 同種型 Ctrl  PE	400112	BioLegend
小鼠IgG1, κ 同種型 Ctrl PerCP/Cyanine5.5	400150	BioLegend
小鼠IgG1, κ 同種型 Ctrl PE/Cy5	400116	BioLegend
小鼠IgG1, κ 同種型 Ctrl  PE/Cy7	400125	BioLegend
小鼠IgG1, κ 同種型 Ctrl APC	400122	BioLegend
小鼠IgG1, κ 同種型 Ctrl太平洋藍	400131	BioLegend

雖然已描述和說明本發明的具體態樣，但是這些態樣當被認為僅用於說明本發明，而非限制本發明，本發明僅由所附申請專利範圍解釋。本說明書中引用的所有文獻和專利申請案均出於所有目的藉由引用整體併入本文，如同每一單獨的文獻或專利申請案被具體且單獨地指示為出於所有目的藉由引用併入一樣。儘管為了清楚理解的目的，已藉由說明和範例的方式對前述發明進行相當詳細的描述，但是對於所屬技術領域中具有通常知識者而言，根據本案的揭示，在不脫離所附申請專利範圍的精神或範圍的情況下進行某些改變和修改是顯而易見的。

無須進一步詳細說明，一般相信所屬技術領域中具有通常知識者基於上述描述能夠最大限度地利用本發明。因此，以下特定範例應解釋為僅是說明性的，而不以任何方式限制本發明的其餘部分。本文引用的所有文獻均藉由引用併入。

無

以下結合下列附圖對本申請案的例示性實施例進行詳細說明：

圖1說明腫瘤相關抗原（TAA）在體內由經修飾NK細胞呈現給CD8 T細胞，如先前技術US20210260115A1中所述。經修飾之NK 細胞的接受性細胞轉移係介導NK-依賴性細胞毒性殺死腫瘤細胞，並導致腫瘤相關抗原（TAA）的釋放。同時，經修飾NK細胞也獲得腫瘤抗原，並向CD8 T細胞呈現全譜TAA，進而誘發多表位腫瘤特異性CD8 T細胞增殖和活化。這些腫瘤特異性T細胞可進一步遷移到腫瘤生長位點，在體內產生持久的抗腫瘤T細胞反應。

圖2示出腫瘤相關抗原（TAA）在體內由經修飾NK細胞呈現給CD8 T細胞，且該抗原特異性CD8 T細胞在體外擴增並進行接受性轉移回待治療的患者。此醫藥組成物包含經修飾之NK細胞和腫瘤特異性CD8 T細胞（即抗原特異性T細胞）。經修飾之NK細胞可透過抗原呈現細胞活性在體內活化腫瘤特異性CD8 T細胞，其可在製造經修飾之NK細胞的過程中進一步擴增。與圖1所描述者相比，本案的接受性細胞轉移保留經修飾NK細胞驅動多表位腫瘤特異性CD8 T細胞活化的原始特徵。此外，它亦透過在體外擴增的經修飾NK細胞驅動的CD8 T細胞來提供強大的抗腫瘤細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的細胞反應。此新穎的醫藥組成物的重複接受性細胞轉移可提供最新的抗腫瘤免疫反應。

圖3示出根據先前技術和本案方法培養的經修飾NK細胞的絕對細胞數。

圖4示出與新鮮周邊血液單核細胞（PBMC）相比，本案方法顯著擴增CD8 T細胞群。

圖5A和5B說明本案方法顯著擴增CD8 T細胞群並增加CD8與CD4的比率。

圖6示出本案方法誘發抗原(Ag)-特異性活化-誘發標記物(AIM) ⁺CD8 T細胞。

圖7示出本案方法誘發表現抗原特異性T細胞表型的CD8 T細胞。

圖8示出本案方法誘發CD8 T細胞脫顆粒。

圖9示出本案方法誘發CD8 T細胞遞送脫顆粒分子，包括穿孔素、顆粒酶B、CD107a、TNF-α和IFN-γ。

圖10和11說明根據本案方法製造的醫藥組成物展現出針對原發性上皮性卵巢癌（EOC）細胞的殺腫瘤活性。

圖12是製造該醫藥組成物的方法之一實施例的流程圖。

無

Claims (6)

1. 一種用於治療癌症的醫藥組成物，其包含 （a）具有CD3 ^-CD19 ^-CD14 ^-CD56 ^hiCD16 ^dimNKG2D ⁺CD11c ⁺CD86 ⁺HLA- DR ⁺CD83 ^-表型之經修飾自然殺手（NK）細胞； （b）具有表型為4-1BB ⁺CD8 ⁺之抗原特異性T細胞；以及 （c）醫藥上可接受之載體或賦形劑； 其中該經修飾NK細胞和該抗原特異性T細胞係藉由以下方法產生： 從患有癌症的個體身上取得單核細胞； 將該單核細胞與含有IL-15、IL-12、IL-18、AIM-V培養基以及人類血小板裂解物的第一培養基接觸1至6天，以獲得經培養細胞群；以及 與該第一培養基接觸後，將經培養細胞群與含有IL-15、IL-12、AIM-V培養基以及人類血小板裂解物的第二培養基接觸1至6天； 其中在接觸步驟之前不對單核細胞進行CD3 ^-CD19 ^-CD14 ^-陰性篩選。
2. 一種如請求項1所述之醫藥組合物用於製備治療癌症藥物之用途。
3. 如請求項2所述之用途，其中該藥物之有效量為每劑量l×10 ³至l×10 ⁹個細胞。
4. 如請求項2所述之用途，其中該經修飾NK細胞或該抗原特異性T細胞是自體性或同種異體性。
5. 如請求項2所述之用途，其中該經修飾NK細胞或該抗原特異性T細胞源自周邊血液、臍帶血或骨髓。
6. 如請求項2所述之用途，其中該癌症包含口腔和咽部的癌症；消化系統癌症 ；呼吸系統癌症；間皮瘤癌症；骨骼和關節的癌症；軟組織的癌症，包含心臟；皮膚癌，包含黑色素瘤和其他非上皮皮膚癌；卡波西氏肉瘤和乳癌；女性生殖系統癌症；男性生殖系統癌症；泌尿系統癌症；眼癌和眼眶癌；腦和神經系統癌症；內分泌系統癌症；淋巴瘤、多發性骨髓瘤，及/或白血病。