TWI828671B

TWI828671B - 用於純化重組蛋白質的全流通式方法

Info

Publication number: TWI828671B
Application number: TW108110547A
Authority: TW
Inventors: 迪德多斯; 席琳海默; 班歐特莫斯; 傑若姆佩西尼
Original assignee: 法商賽諾菲公司
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2024-01-11
Also published as: CA3095078A1; CN112189015B; IL277544A; IL277544B1; RU2020131568A; AU2019246328B2; KR102736920B1; BR112020019409A2; IL277544B2; MX2020010077A; TW201945385A; US12391728B2; JP7396997B2; AU2019246328A1; EP3546475A1; CN112189015A; ZA202005801B; JP2021519303A; SG11202009193VA; KR20200135371A

Abstract

本發明係關於用於純化蛋白質之方法，其包含以連續模式：一個涉及使用至少一種螯合劑之過濾步驟、涉及使用至少一個滲濾膜之交換步驟及涉及使用膜吸附器組合之精製步驟(polishing step)，其中該組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的。

Description

用於純化重組蛋白質的全流通式方法

本發明係關於用於小規模及大規模純化蛋白質、具體而言單株抗體之全流通式純化方法。

抗體純化可為生物生產之最昂貴態樣之一。通常使用三步驟、三樹脂層析製程且在每一步驟中使用至少一個特定緩衝系統來純化單株抗體(mAb)。此習用純化製程涵蓋捕獲步驟，之後為中間體純化步驟，且以精製步驟(polishing step)結束，且通常耗費3至5個工作日(包括儲存及開放階段)。在此等習用製程中，該三個步驟實施係以不同單元操作之順序實施，其不能以連續模式操作，此乃因需要在每一步驟之間調整pH、莫耳濃度及蛋白質濃度。因此，習用純化製程通常在每一中斷步驟及若干系統之間需要諸多不同緩衝液以及諸多儲存單元。因此，該等習用純化製程易於產生污染、技術故障及人為錯誤。另外，由於需要在每一步驟之間進行中斷以用於濃縮析出液、調整pH及電導率且在下一步驟之前儲存析出液，且由於一步驟不能在上一步驟完成之前開始，故此等習用純化製程尤為較長且昂貴。

習用製程之成本較高亦係由於通常使用蛋白質A基質作為純化之第一步所致。實際上，以往通常將最具選擇性之樹脂置於製程早期(即蛋白質A之情形)以去除儘可能多的雜質。然而，即使蛋白質A係用於單株抗體純化之最具選擇性之介質，製程中仍存在剩餘污染物。此步驟亦係整個製程中最昂貴的，同樣係由於其用作與大量污染物接觸之第一步。另外，剩餘污染物極難去除以符合醫藥規格。

隨著細胞培養滴定度增加且使用更大之細胞培養體積用於生產，下游處理被視為行業瓶頸。此對於單株抗體生產而言尤其相關，其中著重點已自批料體積轉移且轉向下游處理能力。此外，早期臨床前及臨床階段研究需要較大量可更快速生產之抗體。因此，行業內需要可以連續模式實施之更廉價製程，以用於蛋白質純化、尤其用於抗體純化，且用於減少獲得批料所耗費之時間，降低污染、技術故障及人為錯誤之風險並降低製程按比例放大之要求。

本發明者已發現用於純化蛋白質、尤其抗體之新穎方法，該方法僅包含連續全流通模式中之三個步驟，該等步驟均不涉及蛋白質A，且有利地僅使用一種緩衝液，同時仍容許獲得具有優良純度之高產量純化抗體。經純化蛋白質由此適用於醫學應用。因此，該方法可用於純化蛋白質以用於臨床試驗及/或製造包含該蛋白質之醫藥組合物。另外，此方法無需任一步驟間調整且由此可自收穫欲純化蛋白質至最終產物在閉合系統中實施。

簡言之，此方法僅包含三個相繼步驟，使用旨在去除大量污染物之較廉價技術作為第一步，用於第二步及第三步之技術愈來愈具有選擇性以去除少量剩餘污染物，且因此其使用量與在習用製程中之使用量相比更小。

因此，本發明之方法在連續模式中包含：一個涉及使用至少一種螯合劑之過濾步驟、涉及使用至少一個滲濾膜之交換步驟及涉及使用膜吸附器組合之精製步驟，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的。本發明之方法示意性地示於圖1中。該三個純化步驟有利地以此特定順序實施。另外已發現，在整個製程內僅需要使用一種緩衝液、即用於交換步驟之緩衝液。換言之，在精製步驟期間視情況使用之平衡緩衝液有利地與用於交換步驟之緩衝液相同。此緩衝液有利地包含Bis Tris、Tris、Tris-HCl、磷酸鹽及/或檸檬酸，例如與NaCl、乙酸及水組合。更特定而言，整個製程可僅使用一種緩衝液，從而確保所有步驟之間的相容性且使得能夠供應鏈製造及品質控制節約與降低儲存需要。

此外，本發明之方法容許取消開放階段(即打開純化系統以實施人工操作(例如，為新緩衝液準備層析管柱、稀釋樣品或調整其pH)之步驟)，藉此降低污染風險且使得可在分級較低之環境中工作。另外，由於本發明之方法有利地不涉及使用任何管柱且主要使用為可棄式且即用型之膜吸附器，因此不需要儲存或再使用驗證、無需管柱準備或填裝或相關之對照、無需清潔驗證及有限之硬體。因此製程週期時間得以縮短、製程按比例放大要求得以最小化且可降低操作及儲存費用。因此，本發明之方法容許批次之快速成本有效生產及減少純化系統之佔用時間二者。因此，其適於重組蛋白質自工作臺至工業規模之按比例放大及純化。

已針對兩種不同抗體來設定及實施具體方案。在此方案中，在第一過濾步驟結束時獲得的經過濾之蛋白質溶液直接在至少一個滲濾膜上方穿過，即不經歷諸如pH調整、緩衝液交換或稀釋等任何處理，且在交換步驟結束時獲得的滲餘物亦直接在至少兩個膜吸附器組合上方穿過，即不經歷諸如pH調整、緩衝液交換或稀釋等任何處理。此方案具有極快速(幾個小時)、產率高(超過70%)、純度與醫藥工業標準相容且使得能夠減少所用緩衝液及儲存設施二者之優點。此外，此製程具有極靈活及成本節省之優點，此乃因其不涉及使用蛋白質A基質，該蛋白質A基質通常係習用製程之最昂貴要素。另外，其可完全自動化，以連續模式運行，且其並不包括任一開放階段。此外，其已針對兩種不同抗體成功實施。

因此，本發明提供用於自溶液純化蛋白質之方法，其包含： (a) 過濾步驟，其包含： - 使該溶液以流通模式在至少一種螯合劑基質上方穿過， - 自該至少一種螯合劑基質之流通液回收經過濾之蛋白質溶液； (b) 交換步驟，其包含： - 使在步驟(a)結束時獲得的該經過濾之蛋白質溶液在至少一個滲濾膜上方穿過，使用僅一種緩衝液用於交換， - 回收該至少一個滲濾膜之經部分純化之含蛋白質之滲餘物； (c) 精製步驟，其包含： - 使在步驟(b)結束時獲得的該滲餘物以流通模式在膜吸附器組合上方穿過，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的，且該膜吸附器組合預先已經平衡緩沖液平衡，該平衡緩衝液與在步驟(b)中用於交換之該一種緩衝液相同， - 自該膜吸附器組合之流通液回收經純化之蛋白質；其中該純化方法不包括蛋白質A層析步驟。

本發明亦提供用於自溶液純化蛋白質之方法，其包含： (a) 過濾步驟，其包含： - 使該溶液以流通模式在至少一種螯合劑基質上方穿過， - 自該至少一種螯合劑基質之流通液回收經過濾之蛋白質溶液； (b) 交換步驟，其包含： - 使在步驟(a)結束時獲得的該經過濾之蛋白質溶液在至少一個滲濾膜上方穿過，使用僅一種緩衝液用於交換，該僅一種緩衝液與在精製步驟(c)期間使用之平衡緩衝液相同； - 回收該至少一個滲濾膜之經部分純化之含蛋白質之滲餘物； (c) 精製步驟，其包含： - 使在步驟(b)結束時獲得的該滲餘物以流通模式在膜吸附器組合上方穿過，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的，且該膜吸附器組合已預先經平衡緩衝液平衡， - 自該膜吸附器組合之流通液回收經純化之蛋白質；其中該純化方法不包括蛋白質A層析步驟。

本發明尤其提供用於自溶液純化蛋白質之方法，其包含： (a) 過濾步驟，其包含： (i) 使該溶液以流通模式在至少一種螯合劑基質上方穿過， (ii) 自該至少一種螯合劑基質之流通液回收經過濾之蛋白質溶液， (b) 交換步驟，其包含： (i) 使在步驟(a)結束時獲得的該經過濾之蛋白質溶液在至少一個滲濾膜上方穿過，使用僅一種緩衝液用於交換， (ii) 回收該至少一個滲濾膜之經部分純化之含蛋白質之滲餘物；及 (c) 精製步驟，其包含： (i) 使平衡緩衝液在膜吸附器組合上方穿過，其中該平衡緩衝液與在步驟(b)中用於交換之該一種緩衝液相同， (ii) 使自步驟(b)獲得的滲餘物以流通模式在膜吸附器組合上方穿過， (iii) 自該膜吸附器組合之流通液回收經純化之蛋白質；其中該純化方法不包括蛋白質A層析步驟。

在本發明之一個實施例中，在整個純化方法中使用僅一種緩衝液。在特定實施例中，該一種緩衝液包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸鹽及/或檸檬酸。在另一實施例中，該一種緩衝液包含以下各項或由以下各項組成：(i) Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii) 乙酸、(iii) 水及(iv) 視情況鹽。

在一個實施例中，過濾步驟之該至少一種螯合劑基質係選自活性碳、矽藻土、游離陽離子交換樹脂、游離陰離子交換樹脂及游離混合模式樹脂。在特定實施例中，該至少一種螯合劑基質係兩種不同螯合劑基質之組合。在更特定實施例中，該兩種不同螯合劑基質之組合係活性碳與游離陰離子交換樹脂之組合。在另一特定實施例中，該至少一種螯合劑基質係兩種以上(即三種、四種、五種或五種以上)不同螯合劑基質之組合。

在一個實施例中，交換步驟之該至少一個滲濾膜係單路徑切向流過濾(SPTFF)模組或切向流過濾(TFF)模組。在特定實施例中，交換步驟之該至少一個滲濾膜係呈盒、中空纖維或螺旋纏繞形式。在特定實施例中，將經過濾之蛋白質溶液在交換步驟期間濃縮。

在一個實施例中，精製步驟之膜吸附器組合係兩個膜吸附器之組合或至少兩個膜吸附器(例如三個、四個或至少四個膜吸附器)之組合。

在一個實施例中，膜吸附器組合之膜吸附器係選自由以下組成之群：陽離子交換膜吸附器、陰離子交換膜吸附器、多模式膜吸附器、疏水相互作用膜吸附器及其組合。在特定實施例中，精製步驟之膜吸附器組合係陽離子交換膜吸附器與陰離子交換膜吸附器之組合。

在一個實施例中，精製步驟之膜吸附器組合係至少兩種選自由以下組成之群之膜吸附器之組合：陽離子交換膜吸附器、陰離子交換膜吸附器、多模式膜吸附器及疏水相互作用膜吸附器。

在本發明之一個實施例中，該方法進一步在步驟(c)之後包含奈米過濾步驟且在該奈米過濾步驟之後視情況包含最終超濾及/或滲濾步驟。在本發明之另一實施例中，該方法進一步在步驟(c)之後、在奈米過濾步驟之後及/或在最終超濾及/或滲濾步驟之後包含低pH鈍化步驟。在本發明之一個實施例中，該方法在步驟(a)之前包含於液體培養基中、較佳地於生物反應器中進行細胞培養之步驟，以提供含有蛋白質之液體培養基。經培養細胞可為哺乳動物、細菌或酵母細胞。在較佳實施例中，經培養細胞可為哺乳動物細胞系(例如Vero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞、HEK293細胞等，包括該等細胞系之不同亞型)以及原代或已確立之哺乳動物細胞培養物(例如自淋巴母細胞、纖維母細胞、胚細胞、上皮細胞、神經細胞、脂肪細胞等產生)。

在本發明之一個實施例中，所純化之蛋白質係抗體。在另一實施例中，抗體係單株抗體。

因此，本發明亦提供自液體培養基產生經純化蛋白質之整合製程。

在本發明之某些實施例中，該一種緩衝液包含5 mM至40 mM (尤其20 mM) Bis Tris、15 mM至150 mM (尤其75 mM) NaCl，利用乙酸調整至包含於6與9之間(尤其7.5)之pH。

在本發明之某些實施例中，該一種緩衝液包含5 mM至40 mM (尤其20 mM) Tris或Tris-HCl、15 mM至150 mM (尤其75 mM) NaCl，利用乙酸調整至包含於6與9之間(尤其7.5)之pH。

在本發明之某些實施例中，該一種緩衝液包含5 mM至40 mM (尤其20 mM) Tris或Tris-HCl、15 mM至150 mM (尤其75 mM) NaCl，利用檸檬酸調整至包含於6與9之間(尤其7.5)之pH。

在本發明之某些實施例中，該一種緩衝液包含15 mM至150 mM (尤其75 mM) NaCl，利用Na₂ HPO₄ /NaH₂ PO₄ (較佳地10 mM / 90 mM Na₂ HPO₄ /NaH₂ PO₄ 至90 mM / 10 mM Na₂ HPO₄ /NaH₂ PO₄ )調整至包含於6與9之間(尤其7.5)之pH。

本發明提供套組，其包含至少一種螯合劑基質、至少一個滲濾膜及膜吸附器組合，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的；及一種緩衝液，其包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸鹽及/或檸檬酸，尤其包含以下各項或由以下各項組成：(i) Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii) 乙酸、(iii) 水及(iv) 視情況NaCl。在一些實施例中，該套組用於使用本發明之方法自溶液純化蛋白質。

本發明亦提供套組，其包含至少一種螯合劑基質、至少一個滲濾膜及膜吸附器組合，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的；及用於製備一種緩衝液之說明書，該一種緩衝液包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸鹽及/或檸檬酸，尤其包含以下各項或由以下各項組成：(i) Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii) 乙酸、(iii) 水及(iv) 視情況NaCl。在一些實施例中，該套組用於使用本發明之方法自溶液純化蛋白質。

本文亦提供藉由本文所闡述之任一方法獲得之經分離蛋白質、醫藥劑及醫藥組合物。

自以下詳細說明並結合隨附申請專利範圍將更全面地理解所揭示純化方法之該等及其他特徵及優點。應注意，申請專利範圍之範圍係由其中之敘述而非由說明書中所陳述特徵及優點之具體論述來界定。

在本發明之上下文中，除非另外註明，否則術語「包含(comprising)」、「具有(having)」、「包括(including)」及「含有(containing)」應解釋為開放性術語(即意指「包括(但不限於)」)。另外，術語「包含(comprising)」涵蓋「由……組成(consisting)」(例如，「包含(comprising)」 X之組合物可排他性地由X組成或可包括其他物項(例如X+Y))。

為簡化蛋白質純化製程且使其更便宜，本發明者已開發出新的純化製程，其係連續的、全流通式製程且不包括蛋白質A層析步驟。

本發明係關於用於自溶液純化蛋白質之方法，其包含： (a) 過濾步驟，其包含： - 使該溶液以流通模式在至少一種螯合劑基質上方穿過， - 自該至少一種螯合劑基質之流通液回收經過濾之蛋白質溶液； (b) 交換步驟，其包含： - 使在步驟(a)結束時獲得的該經過濾之蛋白質溶液在至少一個滲濾膜上方穿過，使用僅一種緩衝液用於交換， - 回收該至少一個滲濾膜之經部分純化之含蛋白質之滲餘物； (c) 精製步驟，其包含： - 使在步驟(b)結束時獲得的該滲餘物以流通模式在膜吸附器組合上方穿過，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的，且該膜吸附器組合預先已經平衡緩沖液平衡，該平衡緩衝液與在步驟(b)中用於交換之該一種緩衝液相同， - 自該膜吸附器組合之流通液回收經純化之蛋白質；其中該純化方法不包括蛋白質A層析步驟。

在交換步驟(b)中，表述「使在步驟 (a) 結束時獲得的該經過濾之蛋白質溶液在至少一個滲濾膜上方穿過，使用僅一種緩衝液用於交換 」意味著使該經過濾之蛋白質溶液及該一種緩衝液在至少一個滲濾膜上方穿過。

在特定實施例中，本發明之方法包含： (a) 過濾步驟，其包含： (i) 使該溶液以流通模式在至少一種螯合劑基質上方穿過， (ii) 自該至少一種螯合劑基質之流通液回收經過濾之蛋白質溶液， (b) 交換步驟，其包含： (i) 使用僅一種緩衝液使自步驟(a)獲得的該經過濾之蛋白質溶液在至少一個滲濾膜上方穿過， (ii) 回收該至少一個滲濾膜之經部分純化之含蛋白質之滲餘物；及 (c) 精製步驟，其包含： (i) 使平衡緩衝液在膜吸附器組合上方穿過，其中該平衡緩衝液與在步驟(b)中用於交換之該一種緩衝液相同， (ii) 使自步驟(b)獲得的滲餘物以流通模式在膜吸附器組合上方穿過， (iii) 自該膜吸附器組合之流通液回收經純化之蛋白質，其中該純化方法不包括蛋白質A層析步驟。

如上文所指示，本發明之上述方法僅包含三個步驟，該三個步驟均不為蛋白質A層析步驟。儘管本發明之方法僅包含三個步驟且無蛋白質A層析步驟，但其容許獲得適用於醫藥目的且尤其適於投與人類之經純化之蛋白質。

除在純化製程中不存在人為處置(且由此減少完成純化製程所需之總時間)以外，所揭示方法亦減少用於純化之緩衝液之量，且不存在蛋白質A層析步驟降低成本。除容許純化多種mAb外，所揭示之純化方法亦簡化mAb純化，改良總產率，並減少原材料、儲存設施、物質成本及製程時間。

與如上文所陳述之習用蛋白質純化方法相比，本文所揭示之方法使用一種獨特緩衝液，此獨特緩衝液用於交換步驟且在精製步驟中平衡膜吸附器。

如本文所使用，「本發明之緩衝液」係指包含Bis Tris、Tris、Tris-HCl、磷酸鹽及/或檸檬酸之緩衝液。Bis Tris、Tris或Tris-HCl係熟習此項技術者所熟知之化合物： - Bis Tris之IUPAC名稱係2-[雙(2-羥基乙基)胺基]-2-(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇，且其CAS編號係6976-37-0， - Tris係2-胺基-2-(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇，且CAS編號係77-86-1，且 - Tris-HCl係2-胺基-2-(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇鹽酸鹽，且CAS編號係1185-53-1。

本發明之此緩衝液可對應於交換緩衝液，且對應於平衡緩衝液。

更具體而言，本發明之此緩衝液可包含不同濃度之相同化學物質(其中之一者係Bis Tris、Tris、Tris-HCl、磷酸鹽及/或檸檬酸)，或由其組成。在特定實施例中，該緩衝液包含Bis Tris、Tris、Tris-HCl、磷酸鹽及/或檸檬酸。在特定實施例中，該緩衝液包含以下各項或由以下各項組成：(i) Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii) 乙酸及(iii) 水。在更具體實施例中，該緩衝液包含以下各項或由以下各項組成：(i) Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii) 乙酸、(iii) NaCl及(iv) 水。換言之，此緩衝液包含不同濃度之(i) Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii) 乙酸、(iii) NaCl及(iv) 水，或由其組成。

交換緩衝液可(例如)包含5 mM至40 mM (例如20 mM) Bis Tris及15 mM至150 mM (例如75 mM) NaCl或由其組成，利用乙酸調整至pH包含於6與9之間(例如7.5)。

交換緩衝液或者可包含5 mM至40 mM (尤其20 mM) Tris或Tris-HCl、15 mM至150 mM (尤其75 mM) NaCl或由其組成，利用乙酸調整至包含於6與9之間(尤其7.5)之pH。

交換緩衝液或者可包含5 mM至40 mM (尤其20 mM) Tris或Tris-HCl、15 mM至150 mM (尤其75 mM) NaCl或由其組成，利用檸檬酸調整至包含於6與9之間(尤其7.5)之pH。

交換緩衝液或者可包含15 mM至150 mM (尤其75 mM) NaCl或由其組成，利用Na₂ HPO₄ /NaH₂ PO₄ (較佳地10 mM / 90 mM Na₂ HPO₄ /NaH₂ PO₄ 至90 mM / 10 mM Na₂ HPO₄ /NaH₂ PO₄ )調整至包含於6與9之間(尤其7.5)之pH。

此等交換緩衝液尤其適用於交換步驟、尤其適用於TFF盒，但亦適於平衡膜吸附器、尤其平衡陽離子交換膜吸附器與陰離子交換膜吸附器之組合。

以上緩衝液調配物之優點包括能夠使mAb產物以更大之相容性通過該方法之三個步驟、尤其交換步驟及精製步驟，同時最小化不期望之相互作用、限制pH及電導率下降且相對於傳統純化方法促進產率增加。使用此緩衝液調配物使得能夠在該三個步驟(a)、(b)及(c)之間無任何中間儲存之情形下實施該方法。

因此，在特定實施例中，該方法在該三個步驟(a)、(b)及(c)之間不包含任何中間儲存。

當再使用精製步驟之膜吸附器時，可視情況使用消毒緩衝液。此一消毒緩衝液可至少包含NaOH、更佳地0.05 N至1 N (例如0.5 N) NaOH或由其組成。

如本文所使用之術語「多肽」或「蛋白質」係指： 1) 具有天然蛋白質之序列之分子，亦即a) 由天然且具體而言非重組細胞產生之蛋白質，或b) 由遺傳工程化或重組細胞產生之蛋白質，或 2) 因一或多種胺基酸之缺失、添加及/或取代及/或因至少一種轉譯後修飾(例如醣基化)而與天然蛋白質之序列有所不同之分子。

在上文段落1)中所提及之分子可稱為天然蛋白質。

在上文段落2)中所提及之分子係非天然蛋白質。

在某些態樣中，欲純化之蛋白質係抗體。

如本文所使用之術語「抗體」係指完整抗體或與完整抗體競爭特異性結合之其結合片段。結合片段包括(但不限於) F(ab)、F(ab')、F(ab')₂ 、Fv、單一結構域抗體(例如VHH抗體(奈米抗體))及單鏈抗體。術語「重鏈」包括具有足夠可變區序列以賦予抗原特異性之任一免疫球蛋白多肽。

如本文所使用之術語「重鏈」涵蓋全長重鏈及其片段。全長重鏈包括可變區結構域VH及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。VH結構域位於多肽之胺基末端處，且CH3結構域位於羧基末端處。

如本文所使用之術語「輕鏈」涵蓋全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區結構域VL及恆定區結構域CL。如同重鏈，輕鏈之可變區結構域位於多肽之胺基末端處。如本文所使用之術語「輕鏈」包括具有足夠可變區序列以賦予抗原特異性之任一免疫球蛋白多肽。

天然抗體結構單元通常包含四聚體。每一此四聚體通常由多肽鏈之兩個相同對構成，每一對具有一個全長輕鏈(通常具有約25 kDa之分子量)及一個全長重鏈(通常具有約50-70 kDa之分子量)。每一輕鏈及重鏈之胺基末端部分通常包括通常負責抗原識別之具有約100至110或更多個胺基酸之可變區。每一鏈之羧基末端部分通常界定負責效應功能之恆定區。人類輕鏈通常分類為κ及λ輕鏈。重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同種型分別定義為IgM、IgD、IgA及IgE。IgG具有若干亞類，包括(但不限於) IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有亞類，包括(但不限於) IgM1及IgM2。類似地，IgA再分為亞類，包括(但不限於) IgA1及IgA2。在全長輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區通常由約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約10個或更多個胺基酸之「D」區。

每一輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。可變區通常展現由三個超變區(亦稱為互補決定區或CDR)接合之相對保守框架區(FR)之相同通用結構。來自每一對之兩個鏈之CDR通常藉由框架區對準，此可使得能夠結合至特異性表位。輕鏈及重鏈可變區二者自N末端至C末端通常包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。通常根據以下文獻之定義來將胺基酸分配至每一結構域：Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Department of Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號。雙特異性或雙功能抗體通常係具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜合抗體。

F(ab)片段包含一個輕鏈及一個重鏈之CH1及可變區。F(ab)分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。F(ab')片段含有一個輕鏈及一個在CH1及CH2結構域之間含有多個恆定區之重鏈，從而使得可在兩個重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')₂ 分子。Fv區包含來自重鏈及輕鏈二者之可變區，但無恆定區。單鏈抗體係Fv分子，其中重鏈及輕鏈可變區由撓性連接體連結以形成單一多肽鏈，該單一多肽鏈形成抗原結合區。在某些實施例中，除「多特異性」或「多功能」抗體外之雙價抗體應理解為包含具有相同抗原特異性之結合位點。

可藉由所揭示方法純化之單株抗體(mAb)可藉由多種技術產生，包括習用單株抗體方法，例如業內熟知之標準體細胞雜合技術。儘管體細胞雜合程序較佳，但原則上可採用其他用於產生單株抗體之技術，例如B淋巴球之病毒或致癌性轉化。單株抗體可(例如)對應於鼠類、嵌合、人類化或全人類抗體。

可藉由本發明方法純化之抗體之非限制性實例亦包含：帕尼單抗(panitumumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、阿克蘇單抗(actoxumab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、阿福圖珠單抗(afutuzumab)、阿拉珠單抗(alacizumab)、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、阿裡羅單抗(alirocumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、阿納莫單抗(anatumomab)、阿普珠單抗(apolizumab)、阿替奴單抗(atinumab)、托珠單抗(tocilizumab)、巴息紫單抗(basilizimab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝利木單抗(belimumab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、比西單抗(biciromab)、卡那單抗(canakinumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、達克珠單抗(daclizumab)、登蘇單抗(densumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依法利珠單抗(efalizumab)、依芬古單抗(efungumab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木單抗(golimumab)、英利昔單抗(infliximab)、那他珠單抗(natalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗、帕妥珠單抗(pertuzumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托珠單抗(tocilizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、杜匹魯單抗(dupilumab)、撒裡路單抗(sarilumab)或夫蘇木單抗(fresolimumab)。

在某些態樣中，欲純化之蛋白質係酶。

可藉由本發明方法純化之酶之非限制性實例包含酸性α-葡糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙醯基葡糖胺-1-磷酸轉移酶、α-N-乙醯基半乳糖胺酶(α-半乳糖苷酶B)、酸性脂酶、溶酶體酸性神經醯胺酶、酸性鞘磷酯酶、β-葡糖苷酶、半乳糖神經醯胺酶、α-半乳糖苷酶A、酸性β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神經胺糖酸苷酶、己糖胺酶A或己糖胺酶B。

可藉由本發明方法純化之蛋白質之其他非限制性實例包含人類紅血球生成素、腫瘤壞死因子(例如TNF-α、TNF-β或TNF-K)、干擾素α或干擾素β。

含有欲純化之蛋白質之溶液可為培養基、較佳澄清培養基。含有欲純化之蛋白質之溶液係(例如)在灌注生物反應器或分批進料生物反應器中所獲得之培養基。

灌注生物反應器或分批進料生物反應器之實例揭示於美國專利申請案US 2014/255994、US 2015/232505、US 2015/183821及US 2017/218012及國際申請案WO2014/137903 (以全文引用的方式併入本文中)中。

術語「澄清培養基」意指自實質上不含(例如至少80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%不含)哺乳動物、細菌或酵母細胞之哺乳動物、細菌或酵母細胞培養基獲得之液體培養基。

在特定實施例中，本發明方法之第一過濾步驟可整合於用於在細胞培養物回收期間獲得澄清培養基之澄清步驟中，藉此該過濾步驟成為澄清步驟之一部分。

如本文所使用之片語「回收蛋白質」係指在使用所揭示純化方法之後收集蛋白質。

在本發明之上下文中，表述「螯合劑」係指任一種類之微粒吸附介質或固定化配體，例如活性碳、矽藻土、珠粒樹脂，其在純化製程中用作吸收劑來分離欲純化之目標分子與存在於混合物中之污染物分子。表述「螯合劑基質」不包括蛋白質A基質。

在本發明方法之某些實施例中，至少一種螯合劑基質係微粒吸附介質。

該至少一種螯合劑基質可呈管柱、過濾器形式或作為粉末添加至欲純化之產物中。在特定實施例中，將本發明之背景中使用之該至少一種螯合劑基質作為粉末添加至欲純化之產物中。

在所揭示方法之特定實施例中，該至少一種螯合劑基質係活性碳過濾器。在所揭示方法之其他特定實施例中，該至少一種螯合劑係樹脂。

該至少一種螯合劑基質、尤其活性碳過濾器或樹脂介質與污染物相互作用，從而高效去除雜質。使用螯合劑基質、尤其使用活性碳或樹脂之另一優點在於對單株抗體之低親和力。

在本發明之特定實施例中，過濾步驟之該至少一種螯合劑基質係選自由以下組成之群：活性碳、矽藻土、游離陽離子交換樹脂、游離陰離子交換樹脂及游離混合模式樹脂。在特定實施例中，該至少一種螯合劑基質係兩種不同螯合劑基質之組合。在更特定實施例中，該兩種不同螯合劑基質之組合係活性碳、尤其活性碳過濾器與游離陰離子交換樹脂之組合。

在所揭示方法之特定實施例中，活性碳過濾器係Zeta Plus 35SP (由3M商業化)、Zeta Plus 53SP (由3M商業化)、Millistak CR40 (由Millipore商業化)或Zeta Plus 55SP等級(由3M商業化)。

在所揭示方法之另一特定實施例中，游離陰離子交換樹脂係NH2-750F (由Tosoh商業化)或Emphaze AEX (由3M商業化)。樹脂NH2-750F之特性匯總如下。

在本發明之上下文中，表述「滲濾」係指使用超濾膜以自溶液完全去除、替代鹽或溶劑或降低其濃度之技術。

如本文所使用，「超濾」或「UF」係指基於UF膜中孔隙之粒徑及大小使用半滲透膜以物理方式且選擇性地自溶液去除顆粒及/或離子之過濾技術。

在一個實施例中，交換步驟之該至少一個滲濾膜係單路徑切向流過濾(SPTFF)模組或切向流過濾(TFF)模組。在特定實施例中，交換步驟之該至少一個滲濾膜係呈盒、中空纖維或螺旋纏繞形式。

在所揭示方法之特定實施例中，交換步驟之該至少一個滲濾膜係Ready To Process中空纖維柱30kDa (由GE商業化)。

在所揭示方法之特定實施例中，交換步驟之該至少一個滲濾膜係Cadence在線滲濾(由Pall商業化)。

在一個實施例中，交換步驟之該至少一個滲濾膜之前或之後為Cadence在線濃縮器(由Pall商業化)。

在所揭示方法之另一特定實施例中，交換步驟之該至少一個滲濾膜係Pellicon盒(由Millipore商業化)或Sartocon盒(由Sartorius商業化)。

交換步驟有利地容許純化且濃縮經過濾之蛋白質溶液二者。表述「濃縮經過濾之蛋白質溶液 」在本文中意味著蛋白質在經部分純化之滲餘物中之濃度與其在經過濾之蛋白質溶液中之濃度相比增加。

在本發明之上下文中，「膜吸附器」係指具有諸如親和性基團及離子交換基團等官能基之聚合物、尤其丙烯酸聚合物或纖維或非織造介質之平片。樹脂與膜之間的差異之一係流量分佈：樹脂藉由擴散且膜藉由對流。

在精製步驟中所使用之膜吸附器組合涉及使用至少兩種在作用機制方面正交之膜吸附器。

在本發明之上下文中，表述「在作用機制方面正交之膜吸附器」意指所使用之膜吸附器具有相反或不同之作用機制，例如陽離子交換及陰離子交換相互作用、多模式及陰離子交換相互作用、陽離子交換及疏水相互作用或陰離子交換及疏水相互作用，且作為單一整合型步驟，即其一起處理，如同其係單一過濾步驟一般。

實際上，本發明者顯示，使用此膜吸附器組合使得能夠在最小化所關注產物之吸附的同時捕獲雜質。

在其中在精製步驟之膜吸附器組合內使用兩個以上膜吸附器(即，對於總計三種、四種或四種以上膜吸附器，使用至少一種額外膜吸附器)之較佳實施例中，該至少一種額外膜吸附器係與在作用機制方面正交之兩個膜吸附器相比具有不同作用機制之膜；此總計兩個以上之膜吸附器仍視為單一整合型單一步驟。

作為非限制性實例，若在作用機制方面正交之兩個膜吸附器分別具有陽離子交換及陰離子交換相互作用，則該至少一種額外膜吸附器具有疏水性相互作用或多模式相互作用。

在本發明之背景中，將膜吸附器特別地組合為單一整合型步驟。因此，步驟及緩衝液之數量顯著減少。亦將調整及操縱去除，由此簡化全域製程。特定而言，在膜吸附器組合之一個膜吸附器與此膜吸附器組合之其他膜吸附器之間不存在溶析、調整或儲存步驟。

在特定實施例中，根據欲純化蛋白質之物理化學性質(例如pI、分子量......)確定精製步驟之膜吸附器之具體組合及操作條件(尤其pH、電導率及/或緩衝液)。

如熟習此項技術者將理解，精製步驟之最佳條件應容許獲得所關注蛋白質之最大產率，即應使所關注蛋白質與膜吸附器組合之相互作用最低，同時容許最大污染物去除，即同時使污染物與膜吸附器組合之相互作用最高而在膜吸附器組合之膜吸附器之間無需任何調整或溶析步驟。

確定用於精製步驟之兩個膜吸附器之最佳組合之實例例示於圖3上。在此實例中，使用Sartobind S與Sartobind STIC膜吸附器之組合獲得最佳之純化性能，其中污染物清除更高(更低之HCP及HMW)，同時使抗體產率最大化。此圖中亦顯示負載容量對產率及污染物去除之影響。

在本發明之背景中，為確定該等最佳條件，應將膜吸附器組合之膜吸附器視為單一實體或單一整合型步驟，即其一起處理，如同其係單一過濾步驟一般。舉例而言，在兩個膜吸附器之情形下，儘管在使用兩個膜吸附器時確定最佳條件之習用方式涉及確定用於第一膜吸附器之最佳條件，然後確定用於第二膜吸附器之最佳條件且然後在兩種最佳條件之間調整產物(例如pH調整、電導率調整或緩衝液調整)，但在本發明之背景中，該兩個膜吸附器視為僅一種且將對該兩個膜吸附器之分離行為確定折中，從而仍使得能夠獲得良好純化。

通常，在確定欲用於給定蛋白質之純化之最佳化緩衝液時，可利用中性緩衝液實施交換步驟且可手動調整包含滲餘物之溶液之pH及電導率以確定精製步驟期間純化之最佳條件。當確定最佳條件時，可使用適當緩衝液再次實施該製程以進行交換步驟，其將對應於用於精製步驟之平衡緩衝液。

根據用於精製步驟之兩個膜吸附器組合及所關注蛋白質之pI確定最佳緩衝液(例如緩衝液之電導率或pH)之實例例示於圖4上。在此實例中，使得能夠獲得有利純化(對應於HCP含量在50 ng/ml與500 ng/ml之間)之pH及電導率條件對應於每一圖之黑色區域。

在本發明之上下文中，用於平衡該至少兩個膜吸附器之該一種緩衝液與用於交換步驟之緩衝液相同。其容許欲純化之蛋白質直接流通以使產率最大化，同時保留大部分污染物。

在特定實施例中，藉由改變在交換步驟期間用於調節蛋白質之緩衝液之pH及電導率來使精製步驟最佳化。

在特定實施例中，精製步驟包含使用與陰離子交換膜吸附器基質組合之陽離子交換膜吸附器基質。在其他實施例中，精製步驟包含使用與陰離子交換膜吸附器基質組合之多模式(混合模式)膜吸附器基質。

膜吸附器基質之組合、尤其陽離子交換膜吸附器及陰離子交換膜吸附器之組合經由膜吸附器與污染物之間的相互作用起作用，從而高效去除雜質。與污染物之相互作用係由於若干種機制：離子性相互作用、疏水性相互作用、凡得瓦(van der Walls)相互作用及氫鍵相互作用。

在特定實施例中，陽離子交換膜吸附器係Sartobind S膜吸附器(Sartorius)、HD-C膜吸附器(Natrix)。在具體實施例中，陽離子交換膜吸附器係Sartobind S膜吸附器(Sartorius)。在特定實施例中，陰離子交換膜吸附器係Sartobind STIC膜吸附器(Sartorius)、Sartobind Q膜吸附器(Sartorius)或HD-Q膜吸附器(Natrix)。在具體實施例中，陰離子交換膜吸附器係Sartobind STIC膜吸附器(Sartorius)或Sartobind Q膜吸附器(Sartorius)。在其他實施例中，多模式膜吸附器係HD-Sb膜吸附器(Natrix)。在其他實施例中，疏水性相互作用膜吸附器係Sartobind Phenyl膜吸附器(Sartorius)。

在特定實施例中，膜吸附器組合係Sartobind S膜吸附器(Sartorius)及Sartobind STIC膜吸附器(Sartorius)之組合。

在本發明方法之精製步驟中使用膜吸附器而非管柱之主要優點匯總如下： - 在同等規模下，可以10倍於管柱之流速來使用膜吸附器，藉此顯著減少製程之持續時間。舉例而言，以1 ml/ min之流速來使用5 mL經樹脂填充之管柱，而以10 ml/ min之最低流速來使用相應5 mL膜吸附器。因此，在使用經樹脂填充之兩個管柱於2h30內實施針對精製使用兩個層析步驟之經典製程時，其可使用膜吸附器在少於15 min內完成。 - 即使其可再使用，膜吸附器亦係可棄式裝置，其可由此在一批之後丟棄且無需長期儲存。因此無需對其進行測試以確保長期穩定性。 - 使用膜吸附器因避免管柱成本、管柱填充及管柱儲存而較為便宜。

在特定實施例中，當膜吸附器組合係Sartobind S膜吸附器(Sartorius)及Startobind STIC膜吸附器(Sartorius)之組合時，該一種緩衝液具有在圖4上圖之黑色區域上所揭示範圍內之pH及電導率。

在另一特定實施例中，當膜吸附器組合係Sartobind S膜吸附器(Sartorius)及Startobind Q膜吸附器(Sartorius)之組合時，該一種緩衝液具有在圖4下圖之黑色區域上所揭示範圍內之pH及電導率。

本發明之純化方法係全流通式純化方法。

「全流通式純化方法」在本文中意指該方法之不同純化步驟均意味著僅結合雜質，而留下所關注蛋白質經歷純化步驟。

在一個實施例中，本發明之方法不包含在過濾步驟結束時調整經過濾蛋白質溶液之pH及/或在交換步驟結束時調整滲餘物之pH。

在特定實施例中，使在過濾步驟結束時獲得的經過濾之蛋白質溶液直接在滲濾膜上方穿過。更具體而言，然後並不在兩個步驟之間實施處理(例如pH調整、緩衝液交換或稀釋)。在此一方法中，滲濾膜可(例如)對應於Ready To Process 30 kD中空纖維模組或Cadence在線滲濾模組，之前或之後為(例如) Cadence在線濃縮器。另外，在特定實施例中，使在交換步驟結束時獲得的滲餘物直接穿過精製步驟之膜吸附器組合。更具體而言，然後並不在兩個步驟之間實施處理(例如pH調整、緩衝液交換或稀釋)。在此一方法中，滲濾膜可(例如)對應於Ready To Process 30 kD中空纖維模組及/或膜吸附器組合可(例如)對應於Sartobind S膜吸附器及Sartobind STIC膜吸附器之組合。

在此一方法中，完全不存在需要手動干預並打開純化系統之步驟間處理(例如稀釋、電導率調整及pH調整)。

因此，本發明之方法可在靈活自動化層析系統中實施，該層析系統包含多個幫浦及互連之感測器以及切換閥以用於3個純化步驟之依序或連續操作。

多操作系統之非限制性實例係具有適當修改之多管柱層析系統MCCS。

本發明之方法可以連續模式運行。換言之，本發明之方法可為自溶液純化蛋白質之連續方法。

術語「連續方法」或「呈連續模式之方法」意指經由至少一部分系統連續進給流體之方法。

術語「流體」在本文中意指任一液體，例如含有欲純化蛋白質之溶液、緩衝液或用於病毒鈍化之低或酸性pH溶液。

在特定實施例中，第一、第二及第三純化步驟係連續地進給流體。

術語「整合製程」意指使用協同發揮作用以達成特定結果(例如自液體培養基產生經純化蛋白質)之結構要素實施之製程。

此外，本發明之方法可在閉合系統中自方法之第一步驟至最後一步驟運行。換言之，本發明之方法較佳具有功能上閉合之流動路徑。特定而言，三個純化步驟及可選過濾步驟(例如，奈米過濾步驟及/或最終超濾及/或滲濾步驟)可在閉合系統中運行。在本發明方法之具體實施例中，使包含蛋白質之溶液逐份穿過三個純化步驟，每次穿過一部分溶液對應於一個試驗。然後收集並彙集在每一試驗結束時所回收之蛋白質。在此一方法中，純化步驟之膜吸附器使用若干次，且視情況使用(例如)如上文所定義之消毒緩衝液消毒，藉此使得能夠減少膜吸附器裝置及所需緩衝液之體積。舉例而言，可連續實施一系列3至50個試驗(例如3至30個試驗、5至25個試驗、10至20個試驗或15個試驗)。更具體而言，可以連續模式實施3、4、5、6、7或8個試驗，之後對膜吸附器實施消毒(例如使用消毒緩衝液)。此可重複(例如) 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次，如圖2上所圖解說明。

本文所揭示之方法可用於回收經純化之蛋白質。如本文所使用，「經純化」係指容許在活體外、離體或活體內有效使用蛋白質之純度。對於可用於活體外、離體或活體內應用中之蛋白質而言，其應實質上不含可干擾該蛋白質在此等應用中之使用或至少為所關注蛋白質不期望包括之污染物、其他蛋白質及/或化學物質。此等應用包括治療性組合物之製備、以治療組合物投與蛋白質及本文所揭示之其他方法。較佳地，如本文所提及之「經純化」蛋白係如下蛋白質：可藉由任一方法(即，藉由自天然來源直接純化、以重組方式或以合成方式)產生，且已自其他蛋白質組分純化從而使得該蛋白質佔給定組合物中總蛋白質之至少約70%重量/重量且更佳地佔給定組合物中總蛋白質之至少約80%或至少約85%、且更佳地至少約90%、且更佳地至少約91%、且更佳地至少約92%、且更佳地至少約93%、且更佳地至少約94%、且更佳地至少約95%、且更佳地至少約96%、且更佳地至少約97%、且更佳地至少約98%、且更佳地至少約99%重量/重量。

在特定實施例中，本發明之方法包含： (a) 過濾步驟，其包含： (i) 使溶液以流通模式在至少一種螯合劑基質上方穿過， (ii) 自該至少一種螯合劑基質之流通液回收經過濾之蛋白質溶液， (b) 交換步驟，其包含： (i) 使自步驟(a)獲得的該經過濾之蛋白質溶液及一種緩衝液在至少一個滲濾膜上方穿過， (ii) 回收該至少一個滲濾膜之經部分純化之含蛋白質之滲餘物；及 (c) 精製步驟，其包含： (i) 使平衡緩衝液在膜吸附器組合上方穿過，其中該平衡緩衝液與在步驟(b)中用於交換之該一種緩衝液相同， (ii) 使自步驟(b)獲得的滲餘物以流通模式在膜吸附器組合上方穿過， (iii) 自該膜吸附器組合之流通液回收經純化之蛋白質，其中該純化方法不包括蛋白質A層析步驟，其中該一種緩衝液包含以下各項或由以下各項組成： - 5 mM至40 mM (例如20 mM) Bis Tris及15 mM至150 mM (例如75 mM) NaCl，利用乙酸調整至pH在6與9之間(例如7.5)， - 5 mM至40 mM (例如20 mM) Tris或Tris-HCl、15 mM至150 mM (例如75 mM) NaCl，利用乙酸調整至pH在6與9之間(例如7.5)， - 5 mM至40 mM (例如20 mM) Tris或Tris-HCl、15 mM至150 mM (例如75 mM) NaCl，利用檸檬酸調整至pH在6與9之間(例如7.5)，或 - 15 mM至150 mM (例如75 mM) NaCl，利用Na₂ HPO₄ /NaH₂ PO₄ (較佳地10 mM / 90 mM Na₂ HPO₄ /NaH₂ PO₄ 至90 mM / 10 mM Na₂ HPO₄ /NaH₂ PO₄ )調整至pH在6與9之間(例如7.5)。

自溶液純化蛋白質之方法可在精製步驟之後包含至少一個額外最終過濾步驟，例如奈米過濾步驟、超濾步驟及/或滲濾步驟。在純化重組蛋白質以用於醫藥目的時，在精製步驟之後通常進行額外最終過濾步驟。因此，本發明之方法可進一步在步驟(c)之後包含奈米過濾步驟。可另外在奈米過濾步驟之後實施超濾及滲濾步驟。如本文所使用，「超濾」或「UF」係指基於UF膜中孔隙之粒徑及大小使用半滲透膜以物理方式且選擇性地自溶液去除顆粒及/或離子之過濾技術。如本文所使用，「奈米過濾」係指經由用於去除(例如)病毒顆粒之奈米過濾器來過濾溶液。如本文所使用，「滲濾」係指使用超濾膜以自溶液完全去除、替代鹽或溶劑或降低其濃度之技術。

本發明之方法亦可進一步包含至少一個病毒鈍化步驟。該至少一個病毒鈍化步驟可在本發明方法之任一階段實施，例如在步驟(a)之前、在步驟(a)之後、在步驟(b)之後、在步驟(c)之後、在奈米過濾步驟之後及/或在超濾及/或滲濾步驟之後。此一病毒鈍化步驟可通常係低或酸性pH鈍化步驟。如本文所使用，「低或酸性pH鈍化」係指使用酸性pH使病毒、尤其包膜病毒變性之病毒鈍化技術。通常，藉由將所回收之蛋白質在介於約3.0至5.0之間(例如介於約3.5至約4.5之間、介於約3.5至約4.25之間、介於約3.5至約4.0之間，例如4.0)之pH下培育至少15分鐘之時期(例如介於15分鐘至1小時之間的時期、介於約30分鐘至2小時之間的時期或介於約45分鐘至2小時之間的時期)來實施低或酸性pH鈍化步驟。舉例而言，藉由將所回收之蛋白質在pH為4下培育(例如) 30分鐘至2小時來實施低或酸性pH鈍化步驟。

本發明之方法亦可在步驟(a)之前包含提供已澄清以去除細胞且實質上不含細胞之含有欲純化蛋白質之液體培養基之步驟，其中將該液體培養基進給至至少一種螯合劑基質之上方。

舉例而言，自溶液純化蛋白質之本發明方法可包含： (a前) 提供已澄清以去除細胞且實質上不含細胞之含有欲純化蛋白質之液體培養基之步驟， (a) 過濾步驟，其包含： - 使步驟(a前)之該液體培養基以流通模式在至少一種螯合劑基質上方穿過； - 自該至少一種螯合劑基質之流通液回收經過濾之蛋白質溶液； (b) 交換步驟，其包含： - 使在步驟(a)結束時獲得的該經過濾之蛋白質溶液在至少一個滲濾膜上方穿過，使用僅一種緩衝液用於交換； - 回收該至少一個滲濾膜之經部分純化之含蛋白質之滲餘物；及 (c) 精製步驟，其包含： - 使在步驟(b)結束時獲得的該滲餘物以流通模式在膜吸附器組合上方穿過，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的，且該膜吸附器組合預先已經平衡緩衝液平衡，該平衡緩衝液與在步驟(b)中用於交換之該一種緩衝液相同； - 自該膜吸附器組合之流通液回收經純化之蛋白質；其中該純化方法不包括蛋白質A層析步驟。

最後，可將經純化蛋白質調配成適於儲存之組合物，及/或調配成尤其適於投與動物及/或人類之醫藥組合物。

所揭示方法之諸多優點之一係其容許獲得良好產率之高純蛋白質。利用本發明方法回收之經純化蛋白質可(例如)展現至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%或99.9%之純度。更特定而言，所揭示方法之諸多優點之一係其容許獲得含有減少量之污染DNA、高分子量(HMW)物質(其對應於蛋白質聚集物)及/或宿主細胞蛋白質(HCP)之高純蛋白質溶液。包含利用本發明方法回收之經純化蛋白質之溶液可(例如)展現少於0.4 ppb、少於0.3 ppb、少於0.2 ppb或少於0.1 ppb之污染DNA量。包含利用本發明方法回收之經純化蛋白質之溶液可(例如)展現少於0.6%、少於0.5%、少於0.4%、少於0.3%、少於0.2%或少於0.1%之HMW物質濃度。包含利用本發明方法回收之經純化蛋白質之溶液可(例如)展現少於500 ng/ml、少於100 ng/ml、少於90 ng/ml、少於85 ng/ml、少於80 ng/ml、少於75 ng/ml或少於70 ng/ml之HCP濃度。另外，本發明方法可容許以至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之產率回收經純化之蛋白質。

本發明進一步係關於套組，其包含以下各項或由以下各項組成： (a) 至少一種螯合劑基質、至少一個滲濾膜及膜吸附器組合，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的；及 (b) 一種緩衝液，其包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸鹽及/或檸檬酸，尤其包含以下各項或由以下各項組成：(i) Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii) 乙酸、(iii) 水及(iv) 視情況NaCl；及/或用於製備一種緩衝液之說明書，該一種緩衝液包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸鹽及/或檸檬酸，尤其包含以下各項或由以下各項組成：(i) Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii) 乙酸、(iii) 水及(iv) 視情況NaCl。

將藉由下文之圖及實例進一步說明本發明。

實例實例 1 ： 本發明之實驗室規模製程 本發明之方法用於進行人類化單株抗體mAb1之實驗室規模分批純化。

此實驗顯示在三個步驟之後在實驗室規模下獲得的雜質去除之結果。目標係去除聚集物(HMW)及宿主細胞蛋白質(HCP)，對於HMW低於1%且對於HCP低於500 ng/ml。

本發明者使用2種不同螯合劑、一個交換步驟及一對膜(Sartobind S及STIC或Sartobind S及Q)獲得成功。

實例 2 ：本發明之實驗室規模製程 本發明之方法用於進行人類化單株抗體mAb2之實驗室規模分批純化。此實驗顯示在三個步驟之後在實驗室規模下獲得的雜質去除之結果。目標係去除聚集物(HMW)及宿主細胞蛋白質(HCP)，對於HMW低於1%且對於HCP低於500 ng/ml。本發明者使用2種螯合劑、一個交換步驟及一對膜(Sartobind S及STIC或Sartobind S及Q)獲得成功。利用Sartobind S+STIC對獲得最佳結果，將裝載條件設定為pH 8.5及3 ms/cm。

實例 3 ：本發明之中試規模製程 本發明之方法用於進行mAb1之中試規模分批純化。

將與實例2中所揭示者相同之製程以中試規模按比例放大。目標係經由三個步驟、之後進行奈米過濾步驟純化10 g。

經由本發明方法之三個步驟及奈米過濾純化8 L澄清細胞培養上清液。將該8 L引入於20 L混合器中，相繼進行以下：250 ml Tosoh NH₂ -750F樹脂，然後攪拌13 min，160 g活性碳(Norit SA2等級)，然後攪拌14 min及30 g活性碳(Norit SA2等級)，然後攪拌10 min。

在開始交換步驟之前將產物過濾(Filtrox過濾器)。在過濾之後回收大約9 L產物(利用1 L無菌水將產物推至過濾器外部)。使用GE Uniflux上之中空纖維(790 cm² - 50 KD - Spectrumlabs)實施UF/DF。用於經由中空纖維滲濾產物之緩衝液係20 mM Bis Tris、適量乙酸pH 7.2緩衝液。

以6.9 g/L回收2.64 kg (18.2 g單株抗體)。然後推動2 L (14 g)經回收產物穿過兩個膜吸附器：75 ml Sartobind S 及200 ml Sartobind Q。該兩個膜串聯連接且使用GE AktaProcess以流通模式使用。

最後經由預過濾器(XOHC - Millipore)及Viresolve Pro過濾器(Millipore)對產物進行奈米過濾以獲得最終品質。

下表顯示習用製程與本發明方法之間的比較。

實例 4 ：本發明之全連續實驗室規模製程 本發明之方法用於以連續模式進行人類化單株抗體mAb1之實驗室規模分批純化。

該實驗之目的係使用連續模式自澄清批量收穫物純化mAb1，此意味著在每一步驟之間無中斷、儲存或調整。本發明者使用螯合劑(固定化AEX、活性碳CA)上之過濾、一個交換步驟(單程滲濾)及一對膜(Sartobind S及STIC)獲得成功。

經由本發明方法之三個步驟純化3 L澄清細胞培養上清液。經由固定化陰離子交換器(Emphaze AEX BV120)且然後活性碳過濾器(Millipore CR40 270 cm2)過濾產物。然後使產物直接直接流入單程滲濾膜(0.2 m2)中以進行濃縮及滲濾(交換步驟)。用於滲濾產物之緩衝液係20 mM Bis Tris、20 mM NaCl、適量乙酸pH 7.5緩衝液。

使直接自滲餘物側回收之滲濾產物穿過中間緩衝袋(surge bag)以適應隨後步驟之流動差異。然後進一步推動產物穿過兩種精製膜吸附器；1 ml Sartobind S及1 ml Sartobind STIC。該兩個膜串聯連接且使用GE Akta Pure以流通模式使用。每一單元步驟直接連接至另一者或經由緩衝袋且連續處理。

在膜吸附器上實施多個純化循環以處理整個體積之產物，如圖 5 上所示(膜上50個純化循環之提取物)。在製程結束時經由無菌過濾器回收整個產物庫。每5分鐘純化40 mg mAb，使得生產率為240 g mAb1/公升膜/小時(240 g/L/h)。

圖 1 顯示代表本發明之3步全流通式方法之方案。圖 2 顯示代表如實例4中所使用之本發明之3步全流通式方法之連續形式之方案。圖 3 顯示代表根據膜之容量(mg/ml)，利用4個膜吸附器組合(HD-C + HD-Q；HD-Sb + HD-Q；Sartobind S + Q；Sartobind S+STIC)獲得的產率(%)、HMW (%)及HCP (ng/ml)之比較之直方圖。圖 4 顯示根據平衡緩衝液之pH及電導率(mS/cm)兩個膜吸附器組合(上圖：Sartobind S + STIC；下圖：Sartobind S + Q)及欲純化蛋白質之3個pI (6；7.5及9)之甜蜜點圖。使得能夠獲得有利純化(對應於HCP含量在50 ng/ml與500 ng/ml之間)之pH及電導率條件對應於每一圖之黑色區域。圖 5 顯示在連續實驗室規模製程實驗期間在膜上之純化(U.V. 280 nm)之部分層析圖。

Claims

一種自溶液純化蛋白質之方法，其包含：(a)過濾步驟，其包含：使該溶液以流通模式在至少一種螯合劑基質上方穿過，自該至少一種螯合劑基質之流通液回收經過濾之蛋白質溶液；(b)交換步驟，其包含：使在步驟(a)結束時獲得的該經過濾之蛋白質溶液在至少一個滲濾膜上方穿過，僅使用一種緩衝液用於交換，回收該至少一個滲濾膜之經部分純化之含蛋白質之滲餘物；(c)精製步驟(polishing step)，其包含：使在步驟(b)結束時獲得的該滲餘物以流通模式在膜吸附器組合上方穿過，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的，且該膜吸附器組合預先已經平衡緩衝液平衡，該平衡緩衝液與在步驟(b)中用於交換之該一種緩衝液相同，自該膜吸附器組合之流通液回收經純化之蛋白質；其中該純化方法不包括蛋白質A層析步驟。
如請求項1之方法，其中使在步驟(a)結束時獲得的該經過濾之蛋白質溶液直接在該至少一種滲濾膜上方穿過，而不經歷pH調整、緩衝液交換或稀釋。
如請求項1或2之方法，其中使在步驟(b)結束時獲得的該滲餘物直接在該膜吸附器組合上方穿過，而不經歷pH調整、緩衝液交換或稀釋。
如請求項1或2之方法，其中該方法在該三個步驟(a)、(b)及(c)之間不包含任何中間儲存。
如請求項1或2之方法，其中該方法具有功能上閉合之流動路徑。
如請求項1或2之方法，其中在整個純化方法中僅使用一種緩衝液。
如請求項1或2之方法，其中該一種緩衝液包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸鹽及/或檸檬酸。
如請求項1或2之方法，其中該一種緩衝液包含以下各項或由以下各項組成：(i)Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii)乙酸及(iii)水。
如請求項1或2之方法，其中該過濾步驟之該至少一種螯合劑基質係選自由以下組成之群：活性碳、矽藻土、游離陽離子交換樹脂、游離陰離子交換樹脂及游離混合模式樹脂。
如請求項9之方法，其中該至少一種螯合劑基質係兩種不同螯合劑基質之組合。
如請求項10之方法，其中該兩種不同螯合劑基質之組合係活性碳與游離陰離子交換樹脂之組合。
如請求項1或2之方法，其中該交換步驟之該至少一個滲濾膜係單一路徑切向流過濾(SPTFF)模組或切向流過濾(TFF)模組。
如請求項1或2之方法，其中該交換步驟之該至少一個滲濾膜係呈盒、中空纖維或螺旋纏繞形式。
如請求項1或2之方法，其中將該經過濾之蛋白質溶液在該交換步驟期間濃縮。
如請求項1或2之方法，其中該精製步驟之該膜吸附器組合係至少兩個選自由以下組成之群之膜吸附器之組合：陽離子交換膜吸附器、陰離子交換膜吸附器、多模式膜吸附器及疏水相互作用膜吸附器。
如請求項1或2之方法，其中該精製步驟之該膜吸附器組合係陽離子交換膜吸附器與陰離子交換膜吸附器之組合。
如請求項1或2之方法，其在步驟(c)之後進一步包含奈米過濾步驟。
如請求項17之方法，其在該奈米過濾步驟之後進一步包含最終超濾及/或滲濾步驟。
如請求項1或2之方法，其中該蛋白質係單株抗體。
如請求項1或2之方法，其中該一種緩衝液包含：5mM至40mM Bis Tris、15mM至150mM NaCl，利用乙酸調整至pH在6與9之間，5mM至40mM Tris或Tris-HCl、15mM至150mM NaCl，利用乙酸調整至pH在6與9之間，5mM至40mM Tris或Tris-HCl、15mM至150mM NaCl，利用檸檬酸調整至pH在6與9之間，或15mM至150mM NaCl，利用Na₂HPO₄/NaH₂PO₄調整至pH在6與9之間。
如請求項1或2之方法，其進一步包含將該經回收之純化蛋白質調配成醫藥組合物之步驟。
如請求項1或2之方法，其中該一種緩衝液包含以下各項或由以下各項組成：(i)Bis Tris、Tris或Tris-HCl、(ii)乙酸、(iii)水及(iv)鹽。
一種套組，其包含以下各項或由以下各項組成：(a)至少一種螯合劑基質、至少一個滲濾膜及膜吸附器組合，其中該膜吸附器組合之兩個膜吸附器在作用機制方面係正交的；及(b)一種緩衝液，其包含Tris、Tris-HCl、Bis Tris、磷酸鹽及/或檸檬酸。