[go: up one dir, main page]

TWI821091B - 奈米球體及其應用 - Google Patents

奈米球體及其應用 Download PDF

Info

Publication number
TWI821091B
TWI821091B TW111150893A TW111150893A TWI821091B TW I821091 B TWI821091 B TW I821091B TW 111150893 A TW111150893 A TW 111150893A TW 111150893 A TW111150893 A TW 111150893A TW I821091 B TWI821091 B TW I821091B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
ceo
nanospheres
nanosphere
group
oxide hollow
Prior art date
Application number
TW111150893A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202425954A (zh
Inventor
賴瑞陽
楊佳蓉
Original Assignee
長庚大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 長庚大學 filed Critical 長庚大學
Priority to TW111150893A priority Critical patent/TWI821091B/zh
Priority to US18/204,780 priority patent/US20240216286A1/en
Application granted granted Critical
Publication of TWI821091B publication Critical patent/TWI821091B/zh
Publication of TW202425954A publication Critical patent/TW202425954A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/221—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin with compounds having an amino group, e.g. acetylcholine, acetylcarnitine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/53—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with three nitrogens as the only ring hetero atoms, e.g. chlorazanil, melamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/34—Copper; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本發明揭示一種奈米球體以及一種包含有該奈米球體的藥物遞送載體。本發明亦揭示該藥物遞送載體可被用來治療眼前段疾病。

Description

奈米球體及其應用
本發明是有關於一種奈米球體(nanosphere)以及一種包含有該奈米球體的藥物遞送載體(drug delivery carrier)。本發明亦有關於使用該藥物遞送載體來治療眼前段疾病(anterior segment eye disease)。
當眼表面(ocular surface)接觸到化學物質、灼熱物質或病原體時會導致眼前段組織(anterior segment eye tissue)[包括角膜(cornea)、鞏膜(sclera)、虹膜(iris)、睫狀體(ciliary body)以及晶狀體(crystalline lens)]受到傷害，進而引起角膜炎(keratitis)、葡萄膜炎(uveitis)、結膜炎(conjunctivitis)以及眼內炎(endophthalmitis)等眼前段疾病(anterior segment eye disease)。若未給予及時治療，嚴重者會進一步發展成白內障(cataract)以及視網膜損傷(retinal damage)，甚至是失明。
臨床上主要藉由非侵入性治療方法--局部滴注(topical instillation)來治療眼前段疾病，然而眼睛組織屏障[例如角膜不滲透性(cornea impermeability)、淚液稀釋(tear dilution)以及淚腺排出(lacrimal drainage)]以及角膜反射(corneal reflex)[又被稱為眨眼反射(blink reflex)]不僅會阻止微生物或雜質由眼表面進入，還會限制眼睛藥物(ophthalmic drug)的滲透，使得藥物難以遞送至眼前段組織，進而大幅降低藥物的生物可利用性(bioavailability)以及治療效果。因此，本領域的相關研究人員皆致力於去發展出一種能夠將眼睛藥物順利地遞送到眼前段組織的遞送載體。
在申請人先前的專利TW I764564中揭示一種接枝有ZM241385與幾丁聚糖(chitosan)之雙官能基化的氧化鈰中空奈米球體(dual functionalized ceria hollow nanospheres)，其能夠將藥物遞送到眼內。
雖如上所述，本技藝中仍然存在有一需要去開發出一種不僅能夠將藥物遞送到眼內，並且能夠將藥物準確地釋放於眼前段組織中來發揮療效的遞送載體。
發明概要
於本發明中，申請人經實驗而發現到，表面接枝有聚-L-組胺酸(poly-L-Histidine)的氧化鈰中空奈米球體(ceria hollow nanospheres)具有優異的角膜(cornea)滲透能力，而可將所包覆的藥物遞送至眼前段組織(anterior segment eye tissue)中，並且能夠達到快速釋放該藥物的效用。
於是，在第一個方面，本發明提供一種奈米球體(nanosphere)，其包含有： 一金屬氧化物中空奈米球體，其中該金屬氧化物是選自於由下列所構成的群組：CeO 2、Al 2O 3、CuO、TiO 2、Na 2O、ZnO、AuO、Fe 3O 4，以及它們的組合；以及 接枝於該金屬氧化物中空奈米球體的表面的聚-L-組胺酸。
在第二個方面，本發明提供一種藥物遞送載體(drug delivery carrier)，其包含有一如上所述的奈米球體以及一眼睛藥物。
在第三個方面，本發明提供一種如上所述的藥物遞送載體供應用於製備一用來治療眼前段疾病之醫藥品的用途。
在第四個方面，本發明提供一種用於治療一具有或被懷疑具有眼前段疾病之個體的方法，其包括對該個體投予一如上所述的藥物遞送載體。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種奈米球體(nanosphere)，其包含有： 一金屬氧化物中空奈米球體，其中該金屬氧化物是選自於由下列所構成的群組：CeO 2、Al 2O 3、CuO、TiO 2、Na 2O、ZnO、AuO、Fe 3O 4，以及它們的組合；以及 接枝於該金屬氧化物中空奈米球體的表面的聚-L-組胺酸(poly-L-Histidine)。
較佳地，該金屬氧化物是CeO 2。
依據本發明，該金屬氧化物中空奈米球體可具有一範圍落在20 nm至150 nm內的粒徑。
較佳地，該金屬氧化物中空奈米球體可具有一範圍落在40 nm至100 nm內的粒徑。
更佳地，該金屬氧化物中空奈米球體是粒徑約為75 nm的氧化鈰中空奈米球體。
依據本發明，該氧化鈰中空奈米球體可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術而被製得。在此方面，可以參考，例如，Strandwitz N.C. and Stucky G.D. (2009), Chem. Mater., 19:4577-4582。
依據本發明，適用於製備本發明的氧化鈰中空奈米球體的模板(template)包括，但不限於：四乙基正矽酸鹽(tetraethyl orthosilicate, TEOS)、葡萄糖(glucose)，以及蔗糖(sucrose)。在本發明的一個較佳具體例中，該模板是TEOS。
依據本發明，聚-L-組胺酸可以是商業上可購得的產品，亦可為藉由熟習此項技藝者所詳知且慣用的聚合物合成(polymer synthesis)技術而被製備。
依據本發明，該奈米球體是藉由使用1：0.25 (w/w)至1：1 (w/w)的金屬氧化物中空奈米球體與聚-L-組胺酸進行接枝反應(grafting reaction)而被製得。較佳地，該奈米球體是藉由使用1：1 (w/w)的金屬氧化物中空奈米球體與聚-L-組胺酸進行接枝反應而被製得。
依據本發明，該接枝反應可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。在此方面，可以參考，例如，Ostadhossein F. et al. (2018), Bioconjug. Chem., 29:3913-3922。
較佳地，在進行該接枝反應前，該金屬氧化物中空奈米球體的表面有被進行聚乙二醇修飾[polyethylene glycol (PEG) modification]。
可瞭解到的是，有關該接枝反應的操作條件會進一步隨著所使用的金屬氧化物中空奈米球體與聚-L-組胺酸的種類與用量等因素而被變動，以便達致最佳的反應效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。
依據本發明，該接枝反應是在一範圍落在16℃至26℃的溫度下被進行歷時18至24小時。在本發明的一個較佳具體例中，該接枝反應是在25℃下被進行歷時24小時。
本發明亦提供一種藥物遞送載體(drug delivery carrier)，其包含有一如上所述的奈米球體以及一眼睛藥物(ophthalmic drug)。
依據本發明，該奈米球體與該眼睛藥物的用量比可介於1：0.5 (w/w)至1：10 (w/w)之間。較佳地，該奈米球體與該眼睛藥物的用量比是1：0.6 (w/w)。較佳地，該奈米球體與該眼睛藥物的用量比是1：1 (w/w)。
依據本發明，該眼睛藥物可選自於由下列所構成的群組：氯化乙醯膽鹼(acetylcholine chloride, Ach)、SB431542、妥布黴素(tobramycin)、青黴素(penicillin)、四環素(tetracycline)、地塞米松(dexamethasone)、皮質醇(hydrocortisone)、乙酸皮質醇(hydrocortisone acetate)、安西奈德(amcinonide)、培他米松(betamethason)、鹵米松(halometasone)、氯倍他松-17-丁酸酯(clobetasone-17-butyrate)、抗壞血酸(ascorbic acid)、透明質酸(hyaluronic acid)，以及它們的組合。較佳地，該眼睛藥物可選自於由下列所構成的群組：氯化乙醯膽鹼、SB431542、地塞米松，以及它們的組合。更佳地，該眼睛藥物是氯化乙醯膽鹼以及SB431542的組合。
基於本發明的藥物遞送載體經由動物實驗而被證實能夠有效地改善角膜鹼灼傷(corneal alkali burn)所造成之大鼠的眼睛的結構性損傷及發炎性損傷，因而被預期可供應用於製備一用來治療眼前段疾病(anterior segment eye disease)之醫藥品的用途。此外，本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有眼前段疾病之個體的方法，其包括對該個體投予一如上所述的藥物遞送載體。
依據本發明，該眼前段疾病可選自於由下列所構成的群組：眼灼傷(ocular burn)[例如化學性眼灼傷(ocular chemical burn)以及熱源性眼灼傷(ocular thermal burn)]、角膜炎(keratitis)[例如細菌性角膜炎(bacterial keratitis)]、葡萄膜炎(uveitis)、結膜炎(conjunctivitis)、乾眼症(xerophthalmia)、眼內炎(endophthalmitis)、瞼板腺阻塞(obstruction of meibomian gland)，以及它們的組合。較佳地，該眼前段疾病可以是一選自於由下列所構成之群組中的化學性眼灼傷：鹼灼傷(alkali burn)以及酸灼傷(acid burn)。
如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指預防(preventing)、減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)、或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類動物，諸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheep)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於眼內(intraocular)投藥的劑型。
依據本發明，該醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)(諸如無菌水)、緩衝液(buffer)[諸如眼科均衡鹽溶液(ophthalmic balanced salt solution)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、林格氏液(Ringer’s solution)以及漢克氏溶液(Hank’s solution)]、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、pH調整劑(pH adjusting agent)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、防腐劑(preservative)、稀釋劑(diluent)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)、潤滑劑(lubricant)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
較佳地，該醫藥品被製造成適合於眼內滴注(intraocular instillation)的劑型，這包括，但不限於：滴劑(drop)、乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、噴霧(spray)、微胞(micelle)以及懸浮液(suspension)。
另擇地，該醫藥品可被製造成適合於眼內注射(intraocular injection)的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)、分散液(dispersion)或乳劑]。
依據本發明，適用於本發明的眼內注射包括，但不限於：結膜下注射(subtenon injection)、玻璃體內注射(intravitreal injection)、前房內注射(intracameral injection)、視網膜內注射(intra-retinal injection)、視網膜下注射(subretinal injection)，以及脈絡膜上腔注射(suprachoroidal injection)。
依據本發明的藥物遞送載體的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性、投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的醫藥品可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被投藥。 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1.  下列實驗材料是購自於Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)：硝酸鈰(cerium nitrate)、四乙基正矽酸鹽(tetraethyl orthosilicate, TEOS)、乙醇(ethanol)、乙二醇(ethylene glycol)、氫氧化銨(ammonium hydroxide)(28% NH 3配於H 2O中)、氫氧化鈉(sodium hydroxide)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, EDC]、聚-L-組胺酸(poly-L-Histidine)、茚三酮(ninhydrin)、脂多醣(lipopolysaccharide, LPS)、氯化乙醯膽鹼(acetylcholine chloride, Ach)、SB431542 {其為似激活素受體激酶受體[activin receptor-like kinase (ALK) receptors]抑制劑}以及ZM241385 [其為腺苷A2A受體拮抗劑(adenosine A2A receptor antagonist)]。 2.  下列實驗材料是購自於Specific Polymers (Castries, France)：磷酸酯-聚乙二醇(PEG)-COOH [Phosphonate-polyethylene glycol (PEG)-COOH, PO-PEG-COOH](MW 1200 g mol -1; ref. SP-1P-10-001)。 3.  下列實驗材料是購自於Fluka (Milwaukee, WI, USA)：幾丁聚糖(chitosan)(Cat. No. 28191)。 4.  實驗動物：
在下面實施例中所使用的雄性Sprague Dawley (SD)大鼠(5至8週大，體重約為150至250 kg)是購自於樂斯科生物科技股份有限公司(BioLasco Taiwan Co., Ltd)。所有的實驗動物被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、溫度維持在20至24℃以及濕度維持在55至65%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的飼養環境、處理以及一切實驗程序均符合長庚紀念醫院的動物實驗照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)以及視覺與眼科學研究協會(Association for Research in Vision and Ophthalmology)的準則。 5.  兔子角膜上皮細胞(rabbit corneal epithelial cells, RCECs)以及兔子角質細胞(rabbit corneal keratocytes, RCKs)的分離與培養：
在下面實施例中所使用的RCECs細胞以及RCKs細胞大體上是參考Lai J.Y. et al.(2012), Int. J. Nanomed., 7:1101-1114當中所述的方法而從紐西蘭白兔的角膜組織(corneal tissue)中被分離出，並以添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、10,000 U/mL青黴素(penicillin)、10 mg/mL鏈黴素(streptomycin)以及25 μg/mL雙性黴素B (amphotericin B)的杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)/F12 [1:1 (v/v)](廠牌為Gibco)來進行培養(37℃、5% CO 2)。 一般實驗方法： 1.  統計學分析(statistical analysis)：
在下面的實施例中，實驗數據是以“平均值(mean)±標準差(standard deviation, SD)”來表示。所有的數據是藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance, ANOVA)，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是 p＜0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 製備本發明的氧化鈰中空奈米球體 (ceria hollow nanosphere) A. 氧化鈰中空奈米球體的合成：
首先，將8 mL的TEOS與280 mL的乙醇混合並攪拌均勻，繼而對所形成的混合物添加56 mL的去離子水以及8.4 mL的氫氧化銨，並於室溫下進行攪拌歷時24小時。之後，以10,000 rpm來進行離心歷時10分鐘，接著移除上澄液並將所得到的沉澱物(pellets)重新散浮於99%乙醇中，然後置於一溫度被設定為65℃的烘箱中進行乾燥歷時6小時，藉此而得到氧化矽奈米粒子(silica nanoparticles, silica NP)。
之後，將300 mg的氧化矽奈米粒子添加至45 mL的乙二醇中，並進行超音波處理(ultra-sonication)歷時30分鐘以避免奈米粒子的聚集，藉此而得到氧化矽分散液(silica dispersion)。接著，將2.25 mL的1 M硝酸鈰添加至該氧化矽分散液中並予以攪拌歷時10分鐘，所得到的混合物被置於一溫度被設定為130℃的高壓釜(autoclave)中進行加熱歷時6小時以形成氧化矽核-氧化鈰殼(silica-ceria core-shell)的結構。待冷卻至室溫之後，以22,000 rpm來進行離心歷時10分鐘，接著移除上澄液並以99%乙醇予以清洗所得到的沉澱物，藉此而分離出氧化矽核-氧化鈰殼奈米粒子(silica-ceria core-shell nanoparticles)(以下簡稱為SiO 2-CeO 2-NP)。
接著，以8 N的氫氧化鈉溶液作為蝕刻劑(etchant)來對該SiO 2-CeO 2-NP進行蝕刻(etching)歷時48小時，並在進行蝕刻的第24小時之時有更換新鮮的蝕刻劑，俾以移除氧化矽核(silica core)。之後，以10,000 rpm來進行離心歷時10分鐘，接著移除上澄液並將所得到的沉澱物重新散浮於99%乙醇中，然後予以風乾，藉此而得到帶有負電荷的氧化鈰中空奈米球體(ceria hollow nanospheres)(以下簡稱為CeO 2-HNS)。 B. CeO 2-HNS 的官能基化 (functionalization) ：
將CeO 2-HNS與PO-PEG-COOH以一為1：10的重量比進行混合，繼而散浮於等量的去離子水中，並以1 N的鹽酸將所形成的混合液的pH值調整至3，然後使用超濾盤(ultrafiltration disc)(Milipore，30 kDa NMW，Cat. No. PLTK07610)來進行超過濾(ultrafiltration)以移除液體，而得到經PEG修飾的CeO 2-HNS。
之後，將1 mg之該經PEG修飾的CeO 2-HNS散浮於去離子水中，接而添加至含有0.26 mg之EDC的MES緩衝液(5 mL)中並予以攪拌歷時6小時，繼而分別混合以含有0.25 mg、0.5 mg以及1 mg之聚-L-組胺酸的MES緩衝液(5 mL)，藉此得到混合物1至3。有關混合物1至3的經PEG修飾的CeO 2-HNS與聚-L-組胺酸之用量如下面表1所示。於室溫下進行接枝反應(grafting reaction)歷時24小時之後，該等混合物1至3分別被置於50℃下進行沉澱，以移除未鍵結的聚-L-組胺酸，繼而收集沉澱物並以去離子水予以清洗3次，然後散浮於去離子水中並以22,000 rpm來進行離心歷時10分鐘，移除上澄液，而所得到的沉澱物即為聚-L-組胺酸之官能基化的氧化鈰中空奈米球體(poly-L-Histidine functionalized ceria hollow nanospheres)(以下簡稱為His-CeO 2-HNS)。最後，於-50℃下進行冷凍乾燥歷時24小時，而得到呈凍乾粉末(lyophilized powder)之3種本發明的His-CeO 2-HNS，亦即由混合物1至3所得到的His-CeO 2-HNS1至3。 表1. 混合物1至3中CeO 2-HNS與聚-L-組胺酸的用量
混合物 各個組分的用量(mg)
CeO 2-HNS 聚-L-組胺酸
1 1 0.25
2 1 0.5
3 1 1
另外，在Dai S. et al.(2018), New J. Chem., 42, 18159-18165中，亦有揭示使用聚-L-組胺酸來製備氧化鈰奈米粒子，因此，申請人參照其中所述的方法來製備1種聚-L-組胺酸之官能基化的氧化鈰奈米粒子(poly-L-Histidine functionalized ceria nanoparticles)(以下簡稱為His-CeO 2-NP)，以供比較之用。 實施例 2. 本發明之氧化鈰中空奈米球體的物化性質分析
在上面實施例1當中所得到的氧化鈰中空奈米球體CeO 2-HNS以及His-CeO 2-HNS1至3被拿來進行下列物化性質的分析。此外，在上面實施例1當中所得到的His-CeO 2-NP亦有被拿來進行下面第C至E點的分析。 A. 傅立葉轉換紅外線光譜 (Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR) 分析：
使用一FT-730 ATR/FTIR光譜儀(FT-730 ATR/FTIR spectrophotometer)(Horiba, Japan)來對CeO 2-HNS以及His-CeO 2-HNS1至3進行FTIR分析，並記錄在解析度(resolution)為8 cm -1時所測得之波數範圍落在600-4000 cm -1內的FTIR光譜(FTIR spectra)。另外，為供比較，申請人使用聚-L-組胺酸來進行相同的實驗。而所得到的結果被顯示於圖1中。
從圖1可見，His-CeO 2-HNS1至3與聚-L-組胺酸一樣皆在波數為3423 cm -1處有出現特徵峰(characteristic peak)，而CeO 2-HNS則沒有出現此特徵峰，這表示His-CeO 2-HNS1至3確實具有聚-L-組胺酸官能基。 B. ζ 電位 (zeta potential) 的測定：
將適量之CeO 2-HNS以及His-CeO 2-HNS1至3分別溶於10 mM的磷酸緩衝液(phosphate buffer, PB)(pH 7.4)中以作為待測樣品，繼而使用一Zetasizer Nano ZS分析儀(Zetasizer Nano ZS analyzer)(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)來對該等待測樣品進行ζ電位的測定。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。而所得到的結果被顯示於圖2中。
從圖2可見，CeO 2-HNS的ζ電位呈現負值，而His-CeO 2-HNS1至3的ζ電位皆呈現正值。由此可見，CeO 2-HNS表面所帶有的電荷會因聚-L-組胺酸的官能基化而從原本帶有的負電荷轉變成帶有正電荷。 C. 粒徑的測定：
使用一Zetasizer Nano ZS分析儀(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)來對CeO 2-HNS、His-CeO 2-HNS1至3以及His-CeO 2-NP進行動態光散射儀(dynamic light scattering, DLS)的測定，繼而計算出各個氧化鈰中空奈米球體以及氧化鈰奈米粒子的粒徑大小。
結果顯示，CeO 2-HNS與His-CeO 2-HNS1至3的粒徑皆落在40 nm至100 nm的範圍內(平均粒徑約為75 nm)，而His-CeO 2-NP則是落在5 nm至20 nm的範圍內(平均粒徑約為11 nm)。由此可見，氧化鈰中空奈米球體的粒徑是明顯大於氧化鈰奈米粒子所具者。 D. 電子顯微鏡觀察：
使用一穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)(購自於JEOL, Ltd，型號為JSM-1200EX II)來對CeO 2-HNS、His-CeO 2-HNS1至3以及His-CeO 2-NP進行觀察與拍照。而所得到的結果被顯示於圖3中。
從圖3可見，His-CeO 2-HNS1至3與CeO 2-HNS皆具有中空的結構，相對地，His-CeO 2-NP則不具有中空的結構。 E. 滲透係數 (permeability coefficient) 分析：
首先，將適量的CeO 2-HNS、His-CeO 2-HNS1至3以及His-CeO 2-NP分別溶於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline, PBS)中，而得到濃度為1 mg/mL的試驗溶液。
接著，將依據上面“一般實驗材料”的第4項當中所得到的RCECs細胞分為5組，其中包括1個正常對照組、1個比較實驗組以及3個實驗組(亦即實驗組1至3)。將各組的RCECs細胞以一為1×10 5細胞/井的數量分別接種至含有0.6 mL的DMEM/F12培養基之Transwell嵌入皿(Transwell inserts)(Corning Inc.)[其具有0.4 μm之孔洞的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)]中，繼而將該等嵌入皿置於含有1 mL的DMEM/F12培養基之6-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO 2)中進行培養歷時24小時。接著，對比較實驗組的RCECs細胞處理以1 mL之含有CeO 2-HNS的試驗溶液，以及對實驗組1至3的RCECs細胞處理以1 mL之含有His-CeO 2-HNS1至3的試驗溶液。至於正常對照組的RCECs細胞則不作任何處理。然後將該等嵌入皿放置於另一個預先接種以RCKs細胞且含有1 mL的DMEM/F12培養基之6-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO 2)中分別進行共培養(co-culture)歷時0.5以及4小時。
接著，移除該等嵌入皿，並在移除該6-井培養盤的各井中的液體之後，以PBS洗滌各井中的RCKs細胞，然後加入500 μL的PBS並予以混合均勻。接著，對所形成的混合液取50 μL並藉由感應耦合電漿放射光譜儀(inductively coupled plasma-optical emission, ICP-OES)(廠牌為Agilent，型號為Varian-710-ES)來測定氧化鈰中空奈米球體的濃度，繼而予以換算出氧化鈰中空奈米球體的總量。然後使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)來對RCKs細胞進行染色並使用ImageJ軟體來計算經DAPI染色的面積。
之後，將在共培養歷時0.5以及4小時下所測得之各個氧化鈰中空奈米球體的總量、經DAPI染色的面積以及所使用之各個試驗溶液的初始密度代入下列公式(1)來計算出各組角膜上皮細胞的滲透係數： 公式 (1) ： A ＝ (B/C)/( D × E )其中：A＝滲透係數(cm/s) B＝各個氧化鈰中空奈米球體的總量(mg) C=共培養時間(s) D＝經DAPI染色的面積(cm 2) E＝各個試驗溶液的初始密度(約為1 mg/cm 3)
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果如圖4所示，從圖4可見，實驗組1至3的角膜上皮細胞的滲透係數皆顯著高於正常對照組以及比較實驗組的角膜上皮細胞所具者，特別地，在共培養歷時4小時之時，實驗組1至3的角膜上皮細胞的滲透係數皆可達到2×10 -6cm/s以上，而正常對照組以及比較實驗組的角膜上皮細胞的滲透係數則仍低於0.5×10 -6cm/s，這表示：表面接枝有聚-L-組胺酸的His-CeO 2-HNS1至3能獲得優異的角膜細胞滲透能力。
此外，申請人亦有將His-CeO 2-NP拿來進行相同的分析，而所測得的角膜上皮細胞的滲透係數低於0.2×10 -6cm/s，與正常對照組無明顯的差異，這表示：His-CeO 2-NP不具有角膜細胞滲透的能力。 實施例 3. 本發明之氧化鈰中空奈米球體對於藥物的包覆性質 (encapsulation property) 之分析
在本實施例中，申請人使用Ach以及SB431542作為藥物範例來測量本發明之氧化鈰中空奈米球體的藥物包覆性質。
首先，將適量之依據上面實施例2第E項當中所得到之含有CeO 2-HNS以及His-CeO 2-HNS1至3的試驗溶液分別混合以0.1 μM的Ach溶液[氧化鈰中空奈米球體與Ach的用量比約為1：0.6 (w/w)]，繼而分別加入至含有1.5 mL均衡鹽溶液(balanced salt solution, BSS)的小瓶(vials)中，並適時地添加以HCl溶液來將pH值控制在6。所得到的混合物被進行一音波處理(sonication)歷時2小時，然後在室溫下進行攪拌歷時24小時，繼而以NaOH溶液來將pH值調整至7.4，並且持續進行攪拌歷時12小時。接著，以15,000 rpm來進行離心歷時10分鐘並取出上澄液。
之後，藉由高效能液相層析(high performance liquid chromatography, HPLC)分析來測定各個上澄液中未被包覆的Ach含量。所使用的HPLC分析儀器如下：Hitachi高效能液相層析系統(Hitachi high performance liquid chromatography system, Tokyo, Japan)、UV偵測器(L2400, Hitachi)，而有關HPLC的操作參數與條件被顯示於下面的表2中。 表2. HPLC的操作參數與條件
分析管柱 Mighty RP-18 (Kanto Chemical)
管柱規格 250 mm × 4.6 mm
偵測波長 UV-216 nm
移動相 5%磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate)/甲醇(methanol)，85：15 (v/v)
流速(mL/分鐘) 0.7
此外，為供比對，使用不同濃度的Ach (10 -3μM-10 μM)來作為對照標準品(control standard)並進行相同的HPLC分析。
之後，將所使用的Ach溶液中所含有之Ach初始量以及所測得之未被包覆的Ach剩餘量代入下列公式(2)來計算出各種氧化鈰中空奈米球體的Ach承載量： 公式 (2) ： E ＝ F-G其中：E＝各種氧化鈰中空奈米球體的Ach承載量(g) F＝Ach初始量(g) G＝未被包覆的Ach剩餘量(g)
各個氧化鈰中空奈米球體的藥物承載百分比是藉由將所使用的各種氧化鈰中空奈米球體的用量及其Ach承載量代入下列公式(3)而被計算出： 公式 (3) ： H ＝ (E/I) × 100其中：H＝藥物承載量百分比(%) E＝各種氧化鈰中空奈米球體的Ach承載量(g) I＝各種氧化鈰中空奈米球體的用量(g)
另外，申請人大體上參照上面針對Ach所描述的方式來進行各個氧化鈰中空奈米球體對於SB431542的藥物承載量百分比的測定，不同之處在於：以260 μM的SB431542溶液來代替0.1 μM的Ach溶液，以及使用不同濃度的SB431542 (50 μM-10 3μM)來作為HPLC分析的對照標準品。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
圖5至6分別顯示承載有Ach或SB431542之各個氧化鈰中空奈米球體的藥物承載百分比(%)。從圖5至6可見，His-CeO 2-HNS1至3的藥物承載百分比皆是顯著地高於CeO 2-HNS所具者，其中又以His-CeO 2-HNS3具有最高的藥物承載百分比。這個實驗結果顯示：本發明之氧化鈰中空奈米球體能夠有效地承載眼睛藥物，特別是以1：1 (w/w)的CeO 2-HNS與聚-L-組胺酸所製得的氧化鈰中空奈米球體。
各個氧化鈰中空奈米球體的藥物包覆率是藉由將各種氧化鈰中空奈米球體的Ach承載量或SB431542承載量、所使用的各種氧化鈰中空奈米球體的用量以及Ach或SB431542的初始量代入下列公式(4)而被計算出： 公式 (4) ： J ＝ [E/( I+F )] × 100其中：J＝藥物包覆率(%) E＝各種氧化鈰中空奈米球體的Ach承載量或SB431542承載量(g) I＝各種氧化鈰中空奈米球體的用量(g) F＝Ach或SB431542的初始量(g)
圖7顯示承載有Ach或SB431542之各個氧化鈰中空奈米球體的藥物包覆率。從圖7可見，His-CeO 2-HNS1至3的藥物包覆率皆是顯著地高於CeO 2-HNS所具者，其中又以His-CeO 2-HNS3具有最高的藥物包覆率。這個實驗結果顯示：本發明之氧化鈰中空奈米球體能夠有效地包覆眼睛藥物，特別是以1：1 (w/w)的CeO 2-HNS與聚-L-組胺酸所製得的氧化鈰中空奈米球體。 實施例 4. 本發明之氧化鈰中空奈米球體的藥物遞送標的位置 (drug delivery target site) 之評估 實驗材料： 1.  試驗溶液的製備：
為供比較，申請人參照專利案TW I764564當中所述的方法來製備一接枝有ZM241385以及幾丁聚糖之雙官能基化的氧化鈰中空奈米球體(dual functionalized ceria hollow nanospheres)(以下簡稱為DF-CeO 2-HNS)，繼而將適量的DF-CeO 2-HNS溶於PBS中，而得到濃度為1 mg/mL的試驗溶液。 實驗方法：
首先，將SD大鼠隨機地分成2組(每組n=10)，其中包括1實驗組以及1個比較組，繼而以舒泰(Zoletil, Virbac, Carros, France)(劑量為2.5 mg/kg體重)與鹽酸賽拉嗪(xylazine hydrochloride)(劑量為1 mg/kg體重)的肌肉內注射(intramuscular injection)而被麻醉，然後將50 μL之依據上面實施例2第E項當中所得到之含有His-CeO 2-HNS3的試驗溶液滴注(instillation)至實驗組的大鼠的眼表(ocular surface)中，以及將20 μL之依據上面“實驗材料”當中所得到之含有DF-CeO 2-HNS的試驗溶液滴注至比較組的大鼠的眼表中。
在進行滴注之後的第4天，藉由CO 2來犧牲大鼠並使用手術刀片而從各組大鼠的眼睛中取出大約0.5 mg的角膜組織(corneal tissue)，繼而以液態氮予以磨碎。然後加入600 μL的RIPA溶解緩衝液(RIPA lysis buffer)(廠牌為Santa Cruz，貨號為sc-24948)並予以混合均勻。接著，將所形成的混合物溶於去離子水中以配製成一具有一濃度為1 mg/mL的待測溶液樣品，並藉由ICP-OES (廠牌為Agilent，型號為Varian-710-ES)來測定Ce的濃度。有關各組的Ce的相對含量是藉由將所測得的Ce濃度代入下列公式(5)而被計算出： 公式 (5) ： K ＝ L/M其中：K＝Ce的相對含量 L＝各組的Ce濃度 M＝比較組的Ce濃度 結果：
所得到的結果被顯示於圖8中。從圖8可見，實驗組以及比較組的大鼠的角膜組織皆有測得Ce，並且實驗組的大鼠的角膜組織所測得Ce的相對含量是顯著高於比較組所具者。這表示：本發明之氧化鈰中空奈米球體在遞送藥物至角膜組織上能夠展現出優異的效用。 實施例 5. 本發明承載有眼睛藥物之氧化鈰中空奈米球體對於角膜鹼灼傷 (corneal alkali burn) 所造成的結構性損傷的治療效用之評估 實驗材料： 1.  製備含有Ach與SB431542的藥物組合溶液：
將適量之Ach與SB431542以1：1的重量比予以混合，而得到一含有Ach與SB431542的藥物組合溶液。 2.  製備承載有Ach與SB431542之藥物組合的His-CeO 2-HNS3：
將適量之依據上面實施例2第E項當中所得到之含有His-CeO 2-HNS3的試驗溶液與含有Ach與SB431542藥物組合溶液以1：1 (w/w)的用量比予以混合，繼而分別加入至含有1.5 mL BSS的小瓶中，並適時地添加以HCl溶液來將pH值控制在6。所得到的混合物被進行一音波處理歷時2小時，然後在室溫下進行攪拌歷時24小時，繼而以NaOH溶液來將pH值調整至7.4，並且持續進行攪拌歷時12小時。接著，以15,000 rpm來進行離心歷時10分鐘，取出上澄液，而所得到的沉澱物以BSS予以清洗3次，藉此而得到承載有Ach與SB431542之藥物組合的His-CeO 2-HNS3。 實驗方法與結果： A. 角膜鹼灼傷的誘發 ：
將圓形濾紙(直徑約為4 mm)浸泡於1 N的NaOH溶液中，然後將之覆蓋於SD大鼠中心角膜表面(central corneal surface)上歷時30秒，繼而使用30 mL的無菌生理食鹽水予以清洗，俾以誘發角膜鹼灼傷的發生。 B. Ach 與 SB431542 組合之 投藥：
首先，將30隻之依據上面第A項當中所述的方法來進行角膜鹼灼傷的SD大鼠隨機地分成2組(每組n=10)，其中包括1個病理對照組以及1個實驗組，繼而參照上面實施例4 “實驗方法”當中所述的方法而被麻醉，然後將依據上面“實驗材料”的第1項當中所得到之承載有Ach與SB431542之藥物組合的His-CeO 2-HNS3 (劑量為20 μL/隻)滴注至實驗組的大鼠的眼表中。至於病理對照組的大鼠則不作任何處理。
另外，以沒有進行角膜鹼灼傷以及眼內給藥之正常的SD大鼠作為正常對照組(n=10)。 C. 角膜混濁度 (corneal haziness) 評估 ：
在眼內給藥之後的第4天，藉由CO 2來犧牲大鼠並使用手術刀片而從各組大鼠的眼睛中取出角膜組織，然後將各組大鼠的角膜組織放置於一標示有字母A的打字稿(typescript)上，並藉由使用一裂隙燈生物顯微鏡(slit lamp biomicroscope)(Topcon Optical)來對各組大鼠的角膜組織進行觀察以及拍照。
所得到的結果被顯示於圖9中。從圖9可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的角膜混濁度明顯提升，這表示角膜鹼灼傷降低了角膜的透明度。而與病理對照組相較之下，實驗組的角膜混濁度有明顯降低並且趨近於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：表面接枝有聚-L-組胺酸的His-CeO 2-HNS3能有效地包覆眼睛藥物並將之遞送至角膜組織，進而達到改善角膜鹼灼傷所造成的角膜混濁的功效。 D. 組織病理學評估：
對上面第C項所得到之各組大鼠的角膜組織各取大約50 mg的組織樣品，並在室溫下以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)(配於PBS中)來進行固定(fixation)歷時30分鐘，繼而將經固定的組織樣品以石蠟(paraffin)予以包埋(embedding)，然後進行切片處理，藉此而得到具有一厚度為5 μm的組織切片(tissue sections)。
之後，所得到的組織切片藉由使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)並且依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行染色，繼而使用一光學顯微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)並在一為10倍的放大倍率下，隨機地從該組織切片中選出1個區域來進行拍照並觀察角膜組織的變化。
所得到的結果被顯示於圖10中。從圖10可見，病理對照組的角膜組織皆呈現出具有高度破壞完整性以及腫脹基質層(swollen stromal layer)的多層組織微結構(multilayered tissue microstructures)，這表示角膜鹼灼傷破壞了角膜組織的結構。相對地，正常對照組與實驗組的角膜組織則皆沒有出現此結構。這個實驗結果顯示：表面接枝有聚-L-組胺酸的His-CeO 2-HNS3能有效地包覆眼睛藥物並將之遞送至角膜組織，進而達到改善角膜鹼灼傷所造成的角膜組織結構損傷的效用。 E. 楊氏係數 (Young’s modulus) 的測定：
使用一萬能試驗機(universal testing machine)(Instron, Canton, MA, USA)並以0.5 mm/min的十字頭速度(crosshead speed)來對上面第D項所得到之各組的組織切片進行楊氏係數的測定。若所測得的楊氏係數越高，代表角膜組織的張力越佳。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
所得到的結果被顯示於圖11中。從圖11可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的楊氏係數皆顯著降低，這表示角膜鹼灼傷降低了角膜組織的張力。而與病理對照組相較之下，實驗組的的楊氏係數顯著提升並且趨近於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：表面接枝有聚-L-組胺酸的His-CeO 2-HNS3能有效地包覆眼睛藥物並將之遞送至角膜組織，進而達到改善角膜鹼灼傷所造成的角膜組織張力損傷的功效。 實施例 6. 本發明承載有眼睛藥物之氧化鈰中空奈米球體對於角膜鹼灼傷所造成的發炎性損傷的治療效用之評估 實驗材料： 1.  製備承載有地塞米松(dexamethasone)的His-CeO 2-HNS3：
大體上參照上面實施例5 “實驗材料”的第2項當中所述的方法來製備承載有地塞米松的His-CeO 2-HNS3，不同之處在於：以地塞米松來替代Ach與SB431542藥物組合。 實驗方法與結果： A. 角膜鹼灼傷的誘發與眼睛藥物的投藥
首先，參照上面實施例5的第A項當中所述的方法來對大鼠進行角膜鹼灼傷的誘發，繼而將之隨機地分成3組(每組n=10)，其中包括1個病理對照組以及2個實驗組(亦即實驗組1至2)。然後將依據上面“實驗材料”的第1項當中所得到之承載有地塞米松的His-CeO 2-HNS3(劑量為20 μL/隻)滴注至實驗組1的大鼠的眼表中，以及將依據上面實施例5 “實驗材料”的第1項當中所得到之承載有Ach與SB431542之藥物組合的His-CeO 2-HNS3 (劑量為20 μL/隻)滴注至實驗組2的大鼠的眼表中。至於病理對照組的大鼠則不作任何處理。
另外，以沒有進行角膜鹼灼傷以及眼內給藥之正常的SD大鼠作為正常對照組。 B. IL-1β 基因的 mRNA 位準的測定：
在眼內給藥之後的第4天，藉由CO 2來犧牲大鼠並使用手術刀片而從正常對照組以及實驗組1與2的大鼠的眼睛中取出大約50 mg的角膜組織，繼而使用一RNA微量萃取套組(Qiagen RNeasy Mini Kit)(Qiagen, Hilden, Germany)並依據製造商所提供的操作指引來進行各組角膜組織的總RNAs (total RNAs)的萃取。由此所得到的各組的總RNAs分別以cDNA反轉錄試劑(廠牌為Promega Reverse Transcriptase，貨號為WI 53711-5399)並且依據製造商所提供的操作指引來進行反轉錄反應(reverse transcription reaction)，以合成第一股cDNA (first-strand cDNA)。
接著，以所得到的第一股cDNA作為模板(template)，並參考Lai J.Y. et al. (2014), Carbohydr. Polym., 101:203-212。而使用針對IL-1β基因所設計的專一性引子對(specific primer pair)來進行定量即時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，以下簡稱定量即時PCR)。另外，甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的基因表現被使用作為內部對照組(internal control)。有關該等引子對的相關資訊(包括：標的基因、各個引子的核苷酸序列以及所擴增出的PCR產物大小)已被整合於下面表3中。 表3. 被用來進行定量即時PCR的引子
標的基因 核酸分子 核苷酸序列 (5’→3’) PCR產物大小(bp)
IL-1β (對應於GenBank登錄編號NM_008361) 前向引子IL-1β-F gcaactgttcctgaactcaact (序列辨識編號：1) 307
反向引子IL-1β-R atcttttggggtccgtcaact (序列辨識編號：2)
GAPDH (對應於GenBank登錄編號XM_001726954.1) 前向引子GAPDH-F tggtatcgtggaaggactcatgac (序列辨識編號：3) 189
反向引子GAPDH-R atgccagtgagcttcccgttcagc (序列辨識編號：4)
定量即時PCR是使用一ABI 7900HT即時PCR系統(廠牌為Applied Biosystems)並依據製造商的操作指引來執行，而有關定量即時PCR的操作條件與反應條件大體上是參考Ma C. et al. (2015), PLoS One., 10(5):e0125776當中所述的方法來進行並被顯示於下面的表4中。 表4. 定量即時PCR的反應條件
內容物 體積(µL)
第一股cDNA (0.1 µg/µL) 1
前向引子(10 µM) 0.8
反向引子(10 µM) 0.8
Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (2X)預混合試劑 (廠牌為Applied Biosystems，貨號為4309155) 5
去離子水 3.4
操作條件：40個循環如下：在95℃下進行變性反應(denaturation)歷時5分鐘，在95℃下進行黏合反應(annealing)歷時10秒，以及在60℃下進行延伸反應(extension)歷時30秒。
由此所得到的各個PCR產物是以SYBR Green (雙股DNA結合染料)的螢光(fluorescence)來進行偵測，藉此計算出IL-1β基因的循環閾值[cycle threshold ( C t) value]。各組IL-1β基因相對的mRNA表現位準(relative mRNA expression level)是使用比較性 C t方法(comparative C tmethod)，將各自所得到之IL-1β基因循環閾值以GAPDH基因所得到的循環閾值來進行標準化，繼而減去正常對照組所得到之經標準化的IL-1β基因循環閾值而獲得。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：
圖12顯示各組大鼠的角膜組織所測得的IL-1β基因的相對mRNA表現位準。由圖12可見，與正常對照組的大鼠的角膜組織相較之下，病理對照組的大鼠的角膜組織會大量地表現IL-1β，這表示角膜鹼灼傷誘發了角膜組織的發炎反應。而與病理對照組相較之下，實驗組1與2的IL-1β基因的相對mRNA表現位準皆呈現顯著下降的情形，並且是近似於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：表面接枝有聚-L-組胺酸的His-CeO 2-HNS3能有效地包覆眼睛藥物並將之遞送至角膜組織，進而達到改善角膜鹼灼傷所造成的發炎性損傷的功效。
綜合以上的實驗結果，申請人認為：聚-L-組胺酸的官能基化能夠賦予氧化鈰中空奈米球體優異的角膜滲透能力，而可將所包覆的藥物遞送至眼前段組織中，並使其快速地釋放，以達致治療眼前段疾病的效用。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1顯示各種氧化鈰中空奈米球體藉由傅立葉轉換紅外線光譜分析所得到的光譜圖； 圖2顯示各種氧化鈰中空奈米球體所測得的ζ電位(mV)，其中“*”表示當與CeO 2-HNS作比較， p＜0.05； 圖3顯示各種氧化鈰中空奈米球體以及氧化鈰奈米粒子藉由穿透式電子顯微鏡所觀察到的結果； 圖4顯示實施例2的各組RCECs細胞在以不同氧化鈰中空奈米球體予以處理後所測得的滲透係數(×10 -6cm/s)，其中“*”表示當與對照組作比較， p＜0.05； 圖5顯示各種氧化鈰中空奈米球體對於Ach的藥物承載量百分比(%)，其中“*”表示當與CeO 2-HNS作比較， p＜0.05； 圖6顯示各種氧化鈰中空奈米球體對於SB431542的藥物承載量百分比(%)，其中“*”表示當與CeO 2-HNS作比較， p＜0.05； 圖7顯示承載有不同眼睛藥物之各種氧化鈰中空奈米球體的藥物包覆率(%)； 圖8顯示實施例4的各組的大鼠的角膜組織在以不同氧化鈰中空奈米球體予以處理後所測得的Ce的相對含量； 圖9顯示實施例5的各組大鼠的眼表在被滴注以不同氧化鈰中空奈米球體之後的第4天，藉由裂隙燈生物顯微鏡所觀察到的角膜混濁度； 圖10顯示實施例5的各組大鼠的眼表在被滴注以不同氧化鈰中空奈米球體之後的第4天，藉由蘇木精與伊紅染色所觀察到的角膜組織； 圖11顯示實施例5的各組大鼠的眼表在被滴注以不同氧化鈰中空奈米球體之後的第4天所測得的楊氏係數(MPa)，其中“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05；以及 圖12顯示實施例6的各組大鼠的角膜組織所測得的IL-1β基因的相對mRNA表現位準，其中“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05。
A0101_OR_PSEQ_Readable.pdf

Claims (11)

  1. 一種奈米球體，其包含有： 一金屬氧化物中空奈米球體，其中該金屬氧化物是選自於由下列所構成的群組：CeO 2、Al 2O 3、CuO、TiO 2、Na 2O、ZnO、AuO、Fe 3O 4，以及它們的組合；以及 接枝於該金屬氧化物中空奈米球體的表面的聚-L-組胺酸。
  2. 如請求項1的奈米球體，其中該金屬氧化物是CeO 2。
  3. 如請求項1的奈米球體，其是藉由使用1：0.25 (w/w)至1：1 (w/w)的金屬氧化物中空奈米球體與聚-L-組胺酸進行接枝反應而被製得。
  4. 如請求項3的奈米球體，其中，在進行該接枝反應前，該金屬氧化物中空奈米球體的表面有被進行聚乙二醇修飾。
  5. 如請求項1的奈米球體，其中該金屬氧化物中空奈米球體具有一範圍落在20 nm至150 nm內的粒徑。
  6. 一種藥物遞送載體，其包含有一如請求項1的奈米球體以及一眼睛藥物。
  7. 如請求項6的藥物遞送載體，其中，該奈米球體與該眼睛藥物的用量比是介於1：0.5 (w/w)至1：10 (w/w)之間。
  8. 如請求項6的藥物遞送載體，其中該眼睛藥物是選自於由下列所構成的群組：氯化乙醯膽鹼、SB431542、妥布黴素、青黴素、四環素、地塞米松、皮質醇、乙酸皮質醇、安西奈德、培他米松、鹵米松、氯倍他松-17-丁酸酯、抗壞血酸、透明質酸，以及它們的組合。
  9. 一種如請求項6至8中任一項的藥物遞送載體供應用於製備一用來治療眼前段疾病之醫藥品的用途。
  10. 如請求項9的用途，其中該眼前段疾病是選自於由下列所構成的群組：眼灼傷、角膜炎、葡萄膜炎、結膜炎、乾眼症、眼內炎、瞼板腺阻塞，以及它們的組合。
  11. 如請求項9的用途，其中該醫藥品是呈一供眼內投藥的劑型。
TW111150893A 2022-12-30 2022-12-30 奈米球體及其應用 TWI821091B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW111150893A TWI821091B (zh) 2022-12-30 2022-12-30 奈米球體及其應用
US18/204,780 US20240216286A1 (en) 2022-12-30 2023-06-01 Nanosphere and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW111150893A TWI821091B (zh) 2022-12-30 2022-12-30 奈米球體及其應用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TWI821091B true TWI821091B (zh) 2023-11-01
TW202425954A TW202425954A (zh) 2024-07-01

Family

ID=89722223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111150893A TWI821091B (zh) 2022-12-30 2022-12-30 奈米球體及其應用

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20240216286A1 (zh)
TW (1) TWI821091B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119972097B (zh) * 2025-04-17 2025-07-04 内蒙古大学 一种CuO/CeO2催化剂及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI764564B (zh) * 2021-02-08 2022-05-11 長庚大學 奈米載體及其應用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080213377A1 (en) * 2006-12-08 2008-09-04 Bhatia Sangeeta N Delivery of Nanoparticles and/or Agents to Cells
WO2011106702A2 (en) * 2010-02-25 2011-09-01 The Johns Hopkins University Sustained delivery of therapeutic agents to an eye compartment

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI764564B (zh) * 2021-02-08 2022-05-11 長庚大學 奈米載體及其應用

Also Published As

Publication number Publication date
TW202425954A (zh) 2024-07-01
US20240216286A1 (en) 2024-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Co-delivery of latanoprost and timolol from micelles-laden contact lenses for the treatment of glaucoma
Luo et al. Dually functional hollow ceria nanoparticle platform for intraocular drug delivery: A push beyond the limits of static and dynamic ocular barriers toward glaucoma therapy
Klausner et al. Ultrapure chitosan oligomers as carriers for corneal gene transfer
JP2021119183A (ja) スニチニブ製剤及び眼の障害の治療におけるその使用に対する方法
Jain et al. Betaxolol hydrochloride loaded chitosan nanoparticles for ocular delivery and their anti-glaucoma efficacy
Zahir-Jouzdani et al. Chitosan and thiolated chitosan: Novel therapeutic approach for preventing corneal haze after chemical injuries
Lai et al. Chitosan-g-poly (N-isopropylacrylamide) copolymers as delivery carriers for intracameral pilocarpine administration
US12440443B2 (en) Nano-emulsion of CBFβ-RUNX1 inhibitor for ocular drug deliver
CN107157952B (zh) 一种丝素蛋白纳米粒和载药丝素蛋白纳米粒
US9655862B2 (en) Ocular nanoformulation and method of use in angiogenesis-mediated disorders
TWI821091B (zh) 奈米球體及其應用
Girgis Formulation and evaluation of Atorvastatin calcium-poly-ε-caprolactone nanoparticles loaded ocular inserts for sustained release and antiinflammatory efficacy
Han et al. Reduction-responsive polymeric micelles for trans-corneal targeted delivery of microRNA-21-5p and glaucoma-specific gene therapy
Wang et al. Recent advances and prospects of nanoparticle-based drug delivery for diabetic ocular complications
TWI764564B (zh) 奈米載體及其應用
Zhang et al. Injectable hydrogels embedded with chitosan nanoparticles coated with hyaluronic acid for sequential release of dual drugs
CN118902984B (zh) 序贯控释双药物负载可注射水凝胶及其制备方法和应用
Datta et al. Self-assembled sodium alginate polymannuronate nanoparticles for synergistic treatment of ophthalmic infection and inflammation: Preparation optimization and in vitro/vivo evaluation
WO2018031771A1 (en) CATIONIC CaMKII INHIBITING NANOPARTICLES FOR THE TREATMENT OF ALLERGIC ASTHMA
Zhang et al. Topical application of insulin encapsulated by chitosan-modified PLGA nanoparticles to alleviate alkali burn-induced corneal neovascularization
CN114983972B (zh) 水凝胶包被miRNA-200s纳米微粒缓释系统在制备视神经炎疾病类药物中的应用
Khairnar et al. Moxifloxacin loaded microspheres-composed gel for controlled release and enhanced penetration in ocular tissues: In vitro, ex vivo and in vivo proof of concept
Zou et al. Intraocular pressure changes: an important determinant of the biocompatibility of intravitreous implants
Noomwong et al. Development of acyclovir-loaded bovine serum albumin nanoparticles for ocular drug delivery
TWI877652B (zh) 眼用藥物遞送載體及其應用