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TWI818276B - Fab-HCAb結構的結合蛋白 - Google Patents

Fab-HCAb結構的結合蛋白 Download PDF

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Abstract

本發明揭示了一種結合蛋白，其包括蛋白功能區A和蛋白功能區B，兩者標靶不同的抗原或抗原的不同表位；所述蛋白功能區A為Fab；所述蛋白功能區B為VH，所述結合蛋白還包括Fc同源二聚合體。所述結合蛋白具有較小的分子量、較少的多肽鏈、更簡單的結構；其具有通用性的結構，可適用於多種不同的標的組合；相較於其他結構的雙特異性結合蛋白能夠更強的活化效應細胞的能力。

Description

Fab-HCAb結構的結合蛋白
本申請要求申請日為2020/06/30的中國專利申請202010618158.0的優先權、申請日為2020/06/30的中國專利申請202010630471.6的優先權、以及申請日為2020/12/08的中國專利申請202011423832.6的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及Fab-HCAb結構的結合蛋白及其製備和應用。
抗體是免疫系統在抗原刺激下，由B細胞產生的、可與相應抗原發生特異性結合的免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)。大多數物種的抗體的基本結構為呈現“Y”型的四聚合體形式，包含兩個完全相同的重鏈(H鏈)和兩個完全相同的輕鏈(L鏈)，也稱為“H2L2”。重鏈包括靠近N端的重鏈可變區(VH)和靠近C端的重鏈恆定區(CH)；輕鏈包括靠近N端的輕鏈可變區(VL)和靠近C端的輕鏈恆定區(CL)。IgG抗體的重鏈恆定區有3個結構域，分別為CH1、CH2和CH3；CH1和CH2之間還有一段樞紐區(hinge)。抗體的可變區是其辨識和結合抗原的主要部位；抗體的可變區結構域VH和VL以及恆定區結構域CH1和CL共同組成了抗原結合片段(antigen-binding fragment, Fab)。CH2和CH3組成了可結晶片段(fragment crystallizable, Fc)，是發揮抗體的效應功能以及影響抗體的血清半衰期的主要部位。
在駱駝科及鯊魚科動物血清中還天然存在一種缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chain antibody, HCAb)。來源於駱駝科的重鏈抗體與常規抗體相比，除了缺少輕鏈外，其重鏈可變區與樞紐區之間沒有CH1區，只含有一個重鏈可變區(VHH)和兩個重鏈恆定結構域(CH2和CH3)；其基本結構為重鏈二聚合體。駱駝科動物的重鏈抗體的VHH片段與常規抗體的VH特徵不同，其單獨選殖並表現出來的VHH結構具有與原重鏈抗體相當的結構穩定性以及與抗原的結合活性，分子量只有約13 KDa，因此也被稱作奈米抗體(Nanobody)或單域抗體(single-domain antibody)。重鏈抗體或者其衍生的奈米抗體在分子影像、診斷試劑等方面有獨特優勢，但是其非人源屬性及其潛在的免疫原性風險限制了它的治療性用途，需要經過進一步的抗體工程改造(例如抗體人源化)才能使其滿足用於臨床治療的要求。
由於人的抗體天然結構為“H2L2”，VH和VL的締合保證了抗體的穩定性和可溶性；如果沒有VL的存在，VH上的原本由VL保護住的疏水性基團將暴露於水性溶劑，使得VH易於發生聚集，進而導致抗體可溶性變差；因此無法從天然來源中獲得有功能的人源的重鏈抗體。Frank Grosveld等人提出了一種利用基因轉殖動物獲得全人源重鏈抗體的方法 (專利申請WO2007/096779)。Frank Grosveld等人建構了一種基因轉殖小鼠，其小鼠內源的抗體重鏈基因座和輕鏈基因座都被剔除或者去活化，使其無法產生小鼠的抗體；然後將人源的抗體重鏈基因片段(V、D、J片段)轉入該小鼠，利用該小鼠自身的重排和突變機制產生具有人源抗體基因序列的抗體，而且由於沒有輕鏈，產生的抗體就是人源的重鏈抗體。該基因轉殖小鼠體內可以利用在VDJ重排後引入基因突變和自然選擇的過程，選擇有利於VH溶解性的VDJ組合和突變，有效地改善VH的溶解性，因此該基因轉殖小鼠體內可以產生天然不存在的人源的重鏈二聚合體結構。從該基因轉殖小鼠獲得的全人源重鏈抗體及其衍生的全人源單域抗體都有廣闊的應用前景。
雙特異性抗體(bispecific antibodies)和多特異性抗體(multispecific antibodies)是一類在天然的單株抗體基礎上透過蛋白質工程技術製備出的具有兩種或者多種不同特異性抗原結合位址的人工抗體。天然的單株抗體是單特異性的，即只能辨識和結合一種抗原；雙特異性抗體可以結合兩種不同的抗原或者同一個抗原上的不同表位；而多特異性抗體則可能辨識更多的抗原。這使得雙特異性抗體可以實現一些單特異性抗體無法實現的作用機制和功能效果，這極大地擴展了雙特異性抗體的治療性應用場景。近年來隨著腫瘤免疫的興起，雙特異性抗體吸引了越來越多的注意力、技術和資金支援，成為治療性抗體市場中增長最快的一個領域。
雙特異性抗體的結構設計是非常重要的。天然存在的二價IgG抗體由兩個相同的重鏈和兩個相同的輕鏈組成，含有兩個相同的抗原結合位址。雙特異性抗體需要利用蛋白質工程技術等手段透過結構設計引入兩個不同的抗原結合位址，由此產生的分子的多肽鏈來源於兩個不同的重鏈和兩個不同的輕鏈。因此，雙特異性抗體開發的一個最主要的挑戰就是鏈的錯配問題，即怎樣從超過10種的不同的重鏈和輕鏈的組合中獲得具有正確的鏈組合的功能性的雙特異性抗體。為了解決這一問題，科學家已經研發出多種開發策略和技術平臺，透過引入不同設計特徵或功能特性來提高所需目標產物的均質性和產量。採用對稱結構是一種解決鏈的錯配問題的策略。大多數對稱結構採用“2+2”結構設計，也稱“四價雙特異性”對稱結構(tetravalent bispecific symmetric structures)。由於其抗原結合域可能有不同的結構、朝向和位置，這些對稱結構的分子在分子大小和藥學性能上有較大差異。對稱結構仍然有輕鏈錯配的問題；AbbVie的DVD-Ig技術平臺，EpimAb的FIT-Ig技術平臺，WuXi Biologics的WuXiBody技術平臺等都利用不同的策略來解決輕鏈錯配的問題；Aptevo和MedImmune等公司則透過引入scFv結構來解決輕鏈錯配的問題。但是，各種技術手段都有其侷限性，例如，FIT-Ig等技術產生的雙抗分子的分子量在250 KDa左右，較大的分子尺寸可能會影響其細胞內吞和組織穿透等能力；而scFv結構的引入可能會帶來穩定性和溶解性的影響；而且許多技術平臺產生的雙抗分子有至少三條不同的多肽鏈，增加了分子的複雜度。
因此，仍然亟需開發新型的雙特異性抗體分子結構，使其具有較簡單和穩定的分子結構和優秀的藥學性能，以滿足快速開發和降低生產成本的需求。
重鏈抗體及其衍生的單域抗體在建構雙特異甚至多特異抗體方面有其獨特的優勢。重鏈抗體的抗原結合結構域只有常規抗體的Fab的四分之一大小；而且沒有輕鏈，避免了輕鏈錯配的問題。所以，利用重鏈抗體及其衍生的單域抗體，可以建構分子量較小的、多肽鏈較少的、結構更簡單的雙特異甚至多特異抗體。而且，全人源重鏈抗體相較於駱駝科動物的重鏈抗體，在免疫原性和成藥性方面更有優勢。
為克服現有技術中缺乏結構簡單和穩定、且具備優異的藥學性能的雙特異性結合蛋白的缺陷，本發明提供了一種具有“Fab-HCAb結構”的雙特異性結合蛋白及其製備方法和應用。所述“Fab-HCAb結構”具有較小的分子量、較少的多肽鏈、結構簡單等特點，還具有與IgG抗體相似的Fc效應子功能、優秀的分子穩定性和藥學性能等。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之一為：提供一種含有至少兩個蛋白功能區的結合蛋白，其中，所述結合蛋白包括蛋白功能區A和蛋白功能區B；所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B標靶不同的抗原或相同抗原的不同表位，其中所述蛋白功能區A為Fab結構，所述蛋白功能區B為VH結構；所述結合蛋白還包括Fc同源二聚合體(含有至少一個Fc)； 其中所述蛋白功能區A的數量為二個，所述蛋白功能區B的數量為二個；所述結合蛋白為對稱結構，所述對稱結構為左右對稱的結構； 所述結合蛋白從N末端至C末端依次為蛋白功能區A、蛋白功能區B和Fc，其中所述蛋白功能區A與所述蛋白功能區B透過第一連接胜肽(L1)連接，所述蛋白功能區B與所述Fc透過第二連接胜肽(L2)連接。
本發明所述的結合蛋白中，二個的所述蛋白功能區B與所述Fc形成對稱的單鏈抗體的二聚合體形式，並在所述單鏈抗體的二聚合體的N末端上連接了所述蛋白功能區A，此時所述蛋白功能區A可以以其CH1 (例如參見圖1，結構(2))或CL (例如參見圖1，結構(1))與所述蛋白功能區B的N末端連接。
本發明中，所述的結合蛋白可為四價結合蛋白，所述結合蛋白例如具有如圖1中結構(1)或(2)所示的結構；所述結合蛋白具有兩條不同的多肽鏈。
較佳地，所述結合蛋白具有四條多肽鏈，分別為兩條相同的短鏈(或稱“多肽鏈1”)和兩條相同的長鏈(或稱“多肽鏈2”)，其中，(1)所述短鏈(或稱“多肽鏈1”)從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述長鏈(或稱“多肽鏈2”)從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3；或(2)所述短鏈(或稱“多肽鏈1”)從N末端至C末端依次包括VL_A-CL，所述長鏈(或稱“多肽鏈2”)從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1-L1-VH_B- L2-CH2-CH3。在結構(1)中所述蛋白功能區A以其CL的C末端與所述蛋白功能區B的N末端連接，蛋白功能區A的VL_A和蛋白功能區B的VH_B融合在同一條多肽鏈上，相對於結構(2)來說更加能夠避免VL_A和VH_B的締合產生的錯配副產物。
本文中VL、VH、CL、CH的含義均為本領域常規，分別代表輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈恆定區和重鏈恆定區，其中CH包括CH1、CH2和CH3，分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域；所述的CL是輕鏈恆定區結構域；_A與_B分別代表該功能區為蛋白功能區A或蛋白功能區B或其組成(即，VH_A代表蛋白功能區A的重鏈可變區，VH_B代表蛋白功能區B的重鏈可變區，VL_A代表蛋白功能區A的輕鏈可變區)；“-”代表聯結不同結構區的多肽鍵或用來分隔不同結構區；C末端即肽鏈的羧基末端(也可寫成“C’”)，N末端即肽鏈的胺基末端(也可寫成“N’”)。上述不同蛋白功能區融合在同一條多肽鏈上，可以避免錯配副產物。在一些實施方案中，L1和L2可以是相同的序列。在另一些實施方案中，L1和L2可以是不同的序列。當所述L1和/或L2為“-”時，連接胜肽的長度為0。較佳地，所述L1 (第一連接胜肽)和L2 (第二連接胜肽)獨立地可為例如“-”、GS或如SEQ ID NOs: 161- 182的胺基酸序列所示。在一些實施方案中，所述L1的長度可優選為0、或如SEQ ID NOs: 163、164或167的胺基酸序列所示。在一些實施方案中，所述L2可優選如SEQ ID NOs: 169、178或179的胺基酸序列所示。在一些實施方案中，所述L1和L2分別如SEQ ID NO: 167和SEQ ID NO: 179的胺基酸序列所示。在一些實施方案中，所述L1的長度為0，所述L2如SEQ ID NO: 178的胺基酸序列所示。在一些實施方案中，所述L1的長度為0，所述L2如SEQ ID NO: 179的胺基酸序列所示。在一些實施方案中，所述L1和L2分別如SEQ ID NO: 163和SEQ ID NO: 178的胺基酸序列所示。在一些實施方案中，所述L1和L2分別如SEQ ID NO: 164和SEQ ID NO: 178的胺基酸序列所示。在一些實施方案中，所述L1和L2分別如SEQ ID NO: 167和SEQ ID NO: 178的胺基酸序列所示。在一些實施方案中，所述L1和L2分別如SEQ ID NO: 163和SEQ ID NO: 169的胺基酸序列所示。
在一些具體的實施例中，所述蛋白功能區A又稱作針對第一抗原的抗體A或第一抗原結合結構域；所述蛋白功能區B又稱作針對第二抗原的抗體B或第二抗原結合結構域。
在一些具體的實施方式中，所述的“Fab-HCAb結構”的雙特異性結合蛋白含有至少一個來源於人源重鏈抗體的重鏈可變區結構域VH，並且能夠結合兩個或更多個抗原，或同一抗原的兩個或更多個表位，或同一表位的兩個或更多個拷貝。
在一些具體的實施方式中，所述的“Fab-HCAb結構”的雙特異性結合蛋白含有的重鏈恆定區可以是優選為人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的重鏈恆定區或其突變；所述突變優選自C220S、N297A、L234A、L235A、G237A和P329G中的一種或多種突變，所述突變位址使用EU編號規則。例如所述重鏈恆定區可以包括L234A、L235A、G237A、N297A或P329G中的一個、兩個或三個突變，例如包含L234A和L235A的突變組合(LALA)或包含L234A、L235A和P329G的突變組合(AAG)或L234A、L235A和G237A的突變組合(AAA)等等。
在一些具體的實施例中，所述抗原選自PD-L1、HER2、B7H4、CTLA4、OX40、4-1BB和BCMA中的一種或多種。所述結合蛋白含有至少兩個蛋白功能區即蛋白功能區A和蛋白功能區B；所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B是獨立地來源於PD-L1抗體或其抗原結合片段、HER2抗體或其抗原結合片段、B7H4抗體或其抗原結合片段、CTLA4抗體或其抗原結合片段、OX40抗體或其抗原結合片段、4-1BB抗體或其抗原結合片段、和BCMA抗體或其抗原結合片段中的一個或多個。較佳地，所述蛋白功能區A為來源於PD-L1抗體或其抗原結合片段、HER2抗體或其抗原結合片段、B7H4抗體或其抗原結合片段或BCMA抗體或其抗原結合片段的Fab，和/或，所述蛋白功能區B為來源於CTLA4抗體或其抗原結合片段、4-1BB抗體或其抗原結合片段、OX40抗體或其抗原結合片段或BCMA抗體或其抗原結合片段的VH。更佳地，所述結合蛋白中：所述蛋白功能區A為來源於HER2抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於CTLA4抗體或其抗原結合片段的VH；或，所述蛋白功能區A為來源於PD-L1抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於4-1BB抗體或其抗原結合片段的VH；或，所述蛋白功能區A為來源於B7H4抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於4-1BB抗體或其抗原結合片段的VH；或，所述蛋白功能區A為來源於B7H4抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於OX40抗體或其抗原結合片段的VH；或，所述蛋白功能區A為來源於BCMA抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於BCMA抗體或其抗原結合片段的VH。
在一些具體的實施例中，所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 75、85和97所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 13、32和54所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述的B7H4抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 78、83和100所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 15、37和59所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述的4-1BB抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 73、83和95所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 11、30和52所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述的4-1BB抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 14、35和57所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia 定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述的OX40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 13、36和58所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 17、39和61所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 77、87和99所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 13、34和56所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述的CTLA4抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 10、29和51所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述的HER2抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 74、84和96所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 12、31和53所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包括如SEQ ID NO: 118所示的胺基酸序列，所述VH包括如SEQ ID NO: 108所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述的B7H4抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包括如SEQ ID NO: 121所示的胺基酸序列，所述VH包括如SEQ ID NO: 113所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述的4-1BB抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包括如SEQ ID NO: 116所示的胺基酸序列，所述VH包括如SEQ ID NO: 106所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述的4-1BB抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO: 111所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述的OX40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO: 112所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO: 115所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包括如SEQ ID NO: 120所示的胺基酸序列，所述VH包括如SEQ ID NO: 110所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述的CTLA4抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO: 105所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述的HER2抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含如SEQ ID NO: 117所示的胺基酸序列，所述VH包含如SEQ ID NO: 107所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO: 136所示的輕鏈和序列如SEQ ID NO: 126所示的重鏈。
在一些具體的實施例中，所述的B7H4 抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO: 139所示的輕鏈和序列如SEQ ID NO: 131所示的重鏈。
在一些具體的實施例中，所述的4-1BB抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO: 134所示的輕鏈和序列如SEQ ID NO: 124所示的重鏈。
在一些具體的實施例中，所述的4-1BB抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO: 129所示的重鏈。
在一些具體的實施例中，所述的OX40 抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO: 130所示的重鏈。
在一些具體的實施例中，所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO: 133所示的重鏈。
在一些具體的實施例中，所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO: 138所示的輕鏈和序列如SEQ ID NO: 128所示的重鏈。
在一些具體的實施例中，所述的CTLA4抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO: 123所示的重鏈。
在一些具體的實施例中，所述的HER2抗體或其抗原結合片段包含序列如SEQ ID NO: 135所示的輕鏈和序列如SEQ ID NO: 125所示的重鏈。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 75、85和97所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 13、32和54所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 14、35和57所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 78、83和100所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 15、37和59所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 14、35和57所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 78、83和100所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 15、37和59所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 13、36和58所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 77、87和99所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 13、34和56所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所示胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 17、39和61。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 74、84和96所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 12、31和53所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 10、29和51所示。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 118所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO: 108所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 111所示的重鏈可變區。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 121所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO: 113所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 111所示的重鏈可變區。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 121所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO: 113所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 112所示的重鏈可變區。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 120所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO: 110所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 115所示的重鏈可變區。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：蛋白功能區A和蛋白功能區B。其中，所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 117所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO: 107所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 105所示的重鏈可變區。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 147所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 153所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 136所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 183所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 147所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 184所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 155所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 158所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 155所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 156所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 159所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 160所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 141所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 142所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 141所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 143所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 141所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 144所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 141所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 145所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，所述結合蛋白包含兩個多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈。其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO: 141所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO: 149所示的胺基酸序列。
本申請中，所述的CDR均可包含在所限序列的基礎上進行突變的情形。所述突變為在所述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的胺基酸序列的基礎上分別具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換。本申請中，在類似“具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換”中“胺基酸突變”是指相較於原胺基酸序列而言，變體的序列存在胺基酸的突變，包括在原胺基酸序列的基礎上發生胺基酸的插入、缺失或替換。示例性的解釋是對CDR的突變可以包含3個、2個或1個胺基酸的突變，這些CDR之間可以任選地選擇相同或不同數目的胺基酸殘基進行突變，例如可以是對CDR1進行1個胺基酸的突變，對CDR2和CDR3不進行胺基酸突變。
本申請中，所述的VH、VL或所述的多肽鏈均可包含在所限定的序列的基礎上進行突變的情形。所述突變為所限定的胺基酸序列上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加，且所述突變的胺基酸序列與所限定的胺基酸序列具有至少85%序列相同性，並保持或改善了所述抗體或其抗原結合片段、結合蛋白的結合活性；所述至少85%序列相同性優選為至少90%序列相同性；更優選為至少95%序列相同性；最優選為至少99%序列相同性。
為了解決上述技術問題，本發明第二方面提供了一種分離的核酸，其編碼如本發明第一方面所述的結合蛋白。
為了解決上述技術問題，本發明第三方面提供了一種重組表現載體，其包含如本發明第二方面所述的分離的核酸。較佳地，所述表現載體包含真核細胞表現載體和/或原核細胞表現載體。
為了解決上述技術問題，本發明第四方面提供了一種轉形株，其包含如本發明第二方面所述的分離的核酸或如本發明第三方面所述的重組表現載體。較佳地，所述轉形株的宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞優選E. coli 細胞如TG1、BL21，所述真核細胞優選HEK293細胞或CHO細胞。
為了解決上述技術問題，本發明第五方面提供了一種結合蛋白的製備方法，其包含培養如本發明第四方面所述的轉形株，從培養物中獲得結合蛋白。
為了解決上述技術問題，本發明第六方面提供了一種藥物組成物，所述藥物組成物包含如本發明第一方面所述的結合蛋白，以及藥學上可接受的載劑。較佳地，所述藥物組成物還包括其他抗腫瘤抗體作為活性成分。
為了解決上述技術問題，本發明第七方面提供了一種套組，其包括如本發明第一方面所述的結合蛋白和/或如本發明第六方面所述的藥物組成物。
較佳地，所述套組還包括(i)施用結合蛋白或藥物組成物的裝置；和/或(ii)使用說明。
為了解決上述技術問題，本發明第八方面提供了一種套裝藥盒，所述套裝藥盒包括藥盒一和藥盒二，所述藥盒一包括如本發明第一方面所述的結合蛋白和/或如本發明第六方面所述的藥物組成物，所述藥盒二包括其它抗體或藥物組成物。
為了解決上述技術問題，本發明第九方面提供了一種給藥裝置，所述給藥裝置包括如本發明第一方面所述的結合蛋白和/或如本發明第六方面所述的藥物組成物。
較佳地，所述給藥裝置還包括容納或將所述合蛋白和/或所述藥物組成物施用於受試者的組件，例如注射器、輸液裝置或植入式給藥裝置。
為了解決上述技術問題，本發明第十方面提供了一種如本發明第一方面所述的結合蛋白、如本發明第六方面所述的藥物組成物、如本發明第七方面所述的套組、如本發明第八方面所述的套裝藥盒、和/或如本發明第九方面所述的給藥裝置在製備診斷、預防和/或治療癌症或其他疾病的藥物中的應用。
較佳地，所述的癌症選自乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤、結直腸癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤中的一種或多種。
為了解決上述技術問題，本發明第十一方面提供了一種體外或體內檢測特異性抗原的方法，其包括使用如本發明第一方面所述的結合蛋白和/或如本發明第六方面所述的藥物組成物進行檢測。
為了解決上述技術問題，本發明第十二方面提供了如本發明第一方面所述的結合蛋白、如本發明第六方面所述的藥物組成物、如本發明第七方面所述的套組、如本發明第八方面所述的套裝藥盒、和/或如本發明第九方面所述的給藥裝置在診斷、預防和/或治療癌症或其他疾病中的應用。
較佳地，所述的癌症選自乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤、結直腸癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤中的一種或多種。
為了解決上述技術問題，本發明第十三方面提供了一種診斷、預防和/或治療癌症或其他疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如本發明第一方面所述的結合蛋白、如本發明第六方面所述的藥物組成物、如本發明第七方面所述的套組、如本發明第八方面所述的套裝藥盒、和/或如本發明第九方面所述的給藥裝置的步驟； 較佳地，所述的癌症選自乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤、結直腸癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤中的一種或多種。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於： 本發明提供了利用重鏈抗體(HCAb)和常規抗體的抗原結合區Fab所建構的具有Fab-HCAb結構的雙特異性結合蛋白。本發明中Fab-HCAb結構的雙特異性結合蛋白分子具有簡單的和通用性的結構，可適用於多種不同的標的組合；其具有較小的分子量、較少的多肽鏈、結構簡單等特點，還具有與IgG抗體相似的Fc效應子功能、優秀的分子穩定性和藥學性能等。而且，相較於現有的具有其他結構的雙特異性結合蛋白更有優勢。
在某一較佳地實施例中，Fab-HCAb結構的分子相較於FIT-Ig結構、VH-IgG結構或IgG-VH結構的分子有如下一個或多個優勢： (1) Fab-HCAb結構的分子量相對較小，只有兩種不同的多肽鏈，結構更簡單，幾乎沒有多肽鏈的錯配； (2) Fab-HCAb結構有更優的標的結合能力； (3) Fab-HCAb結構的第一結合結構域(Fab)和第二結合結構域(VH)之間的距離更有利於標靶細胞(例如，腫瘤細胞)和效應細胞(例如，T細胞)之間相互作用形成免疫突觸以進一步促進效應細胞的活化； (4) Fab-HCAb結構有更強的效應細胞活化能力； (5) Fab-HCAb結構的分子中可以無需額外的連接胜肽，減少因連接胜肽被剪切的風險。 (6) Fab-HCAb結構更加緊湊，其兩個第二結合結構域(VH)之間的距離較近，在某些情形下更利於標的的成簇和聚合反應； (7) Fab-HCAb結構可能會優先結合Fab結構域辨識的標的，之後才會引起VH結構域的結合，不同標的結合的順序以及結合力的差異可以適用於一些特殊的應用場景的需求，例如TAA × 4-1BB的Fab-HCAb可以優先結合腫瘤標的。
具體實施方式
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭示的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
在本申請中，術語“結合蛋白”或者“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及任選地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。可典型地包含抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈可變區(VH)或上述兩者。VH和VL區可進一步被區分為稱為互補決定區(CDR)的高度變異區，它們散佈在稱為框架區(FR)的更保守的區域中。每個VH和VL可由三個CDR和四個FR區構成，它們從胺基端至羧基端可按以下順序排列：FR-1、CDR1、FR-2、CDR2、FR-3、CDR3和FR-4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。VH的三個CDR分別表示為HCDR1、HCDR2和HCDR3，也可表示為VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；VL的三個CDR分別表示為LCDR1、LCDR2和LCDR3，也可表示為VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab，Fab’，F(ab)2 ，Fv片段，F(ab’)2 ，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，所述CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的。但是，本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Biol 273:927-48,1997)。在本發明的技術方案中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則來確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍，詳見下表。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。表 -I 本申請抗體 CDR 定義方法
  Kabat Chothia Combined
LCDR1 L24--L34 L24--L34 L24-L34
LCDR2 L50--L56 L50--L56 L50-L56
LCDR3 L89--L97 L89--L97 L89-L97
HCDR1 H31--H35 H26--H32 H26-H35
HCDR2 H50--H65 H52--H56 H50-H65
HCDR3 H95--H102 H95--H102 H95-H102
其中，Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列；Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列。例如，L24-L34可以指從抗體輕鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第24位至第34位的胺基酸序列；H26-H32可以指從抗體重鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第26位至第32位的胺基酸序列。本領域技術人員應當知曉的是，在用Chothia編碼CDR時，有些位置會有插入位址的情況(可參見http://bioinf.org.uk/abs/)。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即集群中的個別抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突變。單株抗體通常針對單個抗原位址具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定位的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定位。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以透過融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要透過任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以透過重組DNA方法製備。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因全部或部分轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表現的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。全人源抗體可以大大減少異源抗體對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、基因轉殖小鼠技術等。
在本申請中，術語“特異性結合”通常是指抗體透過其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。根據該定義，當抗體相比於其將結合隨機的，不相關的表位而言更容易透過其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。“表位”是指抗原上與抗原結合蛋白(如抗體)結合的特定的原子基團(例如，醣側鏈、磷醯基、磺醯基)或胺基酸。
在本申請中，術語“Fab”通常指常規抗體(例如IgG)中與抗原結合的部分，包括抗體的重鏈可變區VH、輕鏈可變區VL和重鏈恆定區結構域CH1以及輕鏈恆定區CL。在常規抗體中，VH的C端與CH1的N端聯結形成重鏈Fd片段，VL的C端與CL的N端聯結形成輕鏈，CH1的C端又進一步與重鏈的樞紐區和其他恆定區結構域聯結形成重鏈。在一些實施例中，“Fab”也指Fab的變體結構。例如，在某些實施例中，VH的C端與CL的N端聯結形成一個多肽鏈，VL的C端與CH1的N端聯結形成另一個多肽鏈，形成Fab(cross VH/VL)的結構；在某些實施例中，Fab的CH1不與樞紐區聯結，而是CL的C端與重鏈的樞紐區聯結，形成Fab(cross Fd/LC)的結構。
在本申請中，術語“VH”通常指抗體的重鏈可變區VH結構域，即可以是人或者其他動物的常規抗體(H2L2結構)的重鏈可變區VH，也可以是駱駝科等動物的重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VHH，還可以是利用Harbour HCAb基因轉殖小鼠產生的全人源重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VH。
在本申請中，術語“抗原結合片段”通常指任何可以與抗原特異結合的蛋白功能區域，既可以是“Fab”，也可以是“VH”，還可以是其他抗原結合形式(例如脂質運載蛋白(lipocalins)、神經細胞粘附分子(NCAM)、纖維結合蛋白(fibronectin)、錨蛋白重複片段蛋白(DARPins)等衍生蛋白結構)。
在本申請中，術語“Fab-HCAb結構”即為表1和圖1中的如結構(1)和結構(2)所示的結構。該結構包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。或者，該結構還可以包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。其中，VH_A和VL_A分別為常規抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區，CL是輕鏈恆定區結構域，CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域，L1和L2是連接胜肽。在某些實施例中，L1的長度可以為0。在某些實施例中，L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接胜肽序列，或是表2中所列序列。在某些實施例中，“Fab-HCAb結構”特指結構(1)的形式。
在本申請中，術語“腫瘤抗原”(tumor antigen)即可以是腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen, TSA)還可以是腫瘤相關抗原(tumor associated antigen, TAA)。腫瘤特異性抗原是指腫瘤細胞所特有的、不存在於正常細胞或組織上的抗原。腫瘤相關抗原並非腫瘤細胞所特有，也存在於正常細胞或組織，但是腫瘤細胞增殖時高度表現。
在本申請中，術語“標靶細胞”是指需要被清除掉的細胞，主要是腫瘤細胞，也可以是免疫抑制性細胞等。
在本申請中，術語“效應細胞”一般指在免疫反應中參與清除異物抗原和行使效應功能的免疫細胞。如漿細胞、細胞毒性T細胞、NK細胞等等。
在本申請中，術語“PD-L1”通常是指程序性細胞死亡配體1蛋白、其功能變體和/或其功能片段。PD-L1也稱為分化簇274 (CD274)或B7同源物1 (B7-H1)，並且是由(人類中) CD274基因編碼的蛋白。PD-L1序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可在NCBI登錄號NP_054862或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到；示例性的全長食蟹猴PD-L1蛋白序列可在NCBI登錄號XP_005581836或Uniprot登錄號G7PSE7下找到。PD-L1主要表現在抗原呈現細胞以及多種腫瘤細胞。PD-L1與PD-1相互作用會向下調控T細胞的活性，減弱細胞激素的分泌，起到免疫抑制作用。在許多人類腫瘤組織中均可檢測到PD-L1蛋白的表現，腫瘤部位的微環境可誘導腫瘤細胞上的PD-L1的表現，表現的PD-L1有利於腫瘤的發生和生長，誘導抗腫瘤T細胞的凋亡，並進一步保護腫瘤細胞逃避免疫攻擊。
在本申請中，術語“HER2”通常是指受體酪胺酸激酶erbB-2 (也稱為ERBB2)、其功能變體和/或其功能片段。HER2序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人HER2序列可以在Uniprot登錄號P04626中找到；示例性的全長的食蟹猴HER2序列可以在NCBI登錄號XP_005584091中找到。
在本申請中，術語“B7H4”通常是指含V-Set域T細胞活化抑制因子1 (也稱為VTCN1, B7h.5, B7S1, B7x)、其功能變體和/或其功能片段。B7H4序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人B7H4序列可以在Uniprot登錄號Q7Z7D3中找到；示例性的全長的食蟹猴B7H4序列可以在NCBI登錄號XP_005542249中找到；示例性的全長的小鼠B7H4序列可以在Uniprot登錄號Q7TSP5中找到。B7-H4是一種隸屬於B7/CD28超家族的跨膜蛋白。B7-H4 蛋白表現於一些免疫細胞如單核細胞和樹突狀細胞，有可能參與T細胞的負調控免疫反應。此外，B7H4還在乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、非小細胞肺癌、腎癌等的腫瘤細胞表面上高度表現，而在大多數正常組織中沒有表現或者表現極低。B7-H4作為這些腫瘤的一個新興標的，近年來受到關注。抗B7-H4的抗體可以透過多種機制作用於腫瘤細胞，但是其研發方向主要集中在單株抗體上，目前尚無雙特異性抗體療法。
在本申請中，術語“4-1BB”通常是指腫瘤壞死因子受體超家族成員9 (也稱為CD137，TNFRSF9，4-1BBL受體)、其功能變體和/或其功能片段。4-1BB序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人4-1BB序列可以在Uniprot登錄號Q07011中找到；示例性的全長的食蟹猴4-1BB序列可以在NCBI登錄號XP_005544945中找到。4-1BB是一種隸屬於TNF受體超家族的跨膜蛋白。4-1BB是在多種免疫細胞上表現的共刺激分子，為免疫活性的多功能調節劑。其誘導表現於活化的T細胞、NK細胞等免疫細胞。4-1BB透過其配體4-1BBL媒介的三聚化來活化T細胞，促進細胞增殖和細胞激素釋放。抗4-1BB的促效型抗體具有抑制腫瘤的功能，最早進入臨床試驗的4-1BB抗體是輝瑞的Utomilumab和百時美施貴寶(BMS)公司的Urelumab (BMS-663513)。Urelumab最初的臨床結果發表於2008年，儘管在部分患者上觀察到令人鼓舞的療效，但數據顯示Urelumab導致肝臟毒性，且與標的和劑量有關。Utomilumab安全性更好，劑量可提高至10 mg/kg，但治療效果依然欠佳。4-1BB標靶性藥物開發的核心問題是如何較為合適地透過4-1BB活化免疫細胞，在藥效和安全性之間達到平衡。
在本申請中，術語“OX40”通常是指腫瘤壞死因子受體超家族成員4 (也稱為CD134，TNFRSF4，OX40L受體)、其功能變體和/或其功能片段。OX40序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人OX40序列可以在Uniprot登錄號P43489中找到；示例性的全長的食蟹猴OX40序列可以在NCBI登錄號XP_005545179中找到。OX40是TNF受體超家族成員之一，參與增強T細胞受體觸發的T細胞反應，是共刺激受體分子。它是一種50 kD的跨膜蛋白。OX40暫態表現在TCR刺激後的人CD4+ 和CD8+ T細胞上。但在腫瘤部位，OX40在CD4+ T細胞上的表現比在CD8+ T細胞更高。因此，CD4+ 和CD8+ T細胞是OX40定向免疫治療癌症的藥物的潛在標的。OX40抗體一些臨床前研究表明抗OX40的單抗透過促進MDSC的積累和生成Th2細胞激素而產生有害的免疫抑制副作用。
在本申請中，術語“BCMA”通常是指腫瘤壞死因子受體超家族成員17 (也稱為B-細胞成熟抗原，TNFRSF17，CD269)、其功能變體和/或其功能片段。BCMA序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人BCMA序列可以在Uniprot登錄號Q02223中找到；示例性的全長的食蟹猴BCMA序列可以在NCBI登錄號XP_005591343中找到。BCMA是一種屬於TNF受體超家族的跨膜蛋白，其參與B細胞成熟、生長和存活。BCMA主要有兩種配體：高親和力配體APRIL以及低親和力配體BAFF。BCMA在多發性骨髓瘤(MM)患者的惡性漿細胞中表現，支持多發性骨髓瘤細胞的生長和存活。多發性骨髓瘤是繼非霍奇金淋巴瘤的血液系統第二大惡性腫瘤，約占血液系統惡性腫瘤的13%。作為多發性骨髓瘤的一個新興標的，BCMA抗體可以透過多種機制作用於MM細胞。
在本申請中，術語“CTLA4”通常是指細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4 (也稱為CD152)、其功能變體和/或其功能片段。CTLA4序列是本領域已知的。例如，示例性的全長的人CTLA4序列可以在Uniprot登錄號P16410中找到；示例性的全長的食蟹猴CTLA4序列可以在Uniprot登錄號G7PL88中找到。CTLA4是T 細胞上表現的負調控因子，它與抗原呈現細胞上的CD80或CD86結合後，在阻斷CD28的共剌激信號同時，還會向下調控T細胞的活性，起到免疫抑制作用。透過阻斷CTLA4與其配體的相互作用可以恢復T細胞的活性，增強抗腫瘤的能力。Ipilimumab單抗(商品名Yervoy®)是第一個獲批上市的抗CTLA4單抗藥物。Ipilimumab在晚期黑色素瘤的治療上體現出較好的治療效果，但是Ipilimumab也帶來了較高的免疫相關副反應，這嚴重地影響了它的臨床應用。Ipilimumab所表現出來的毒副作用大部分是CTLA4標的相關的，在目前的PD-1/PD-L1抑制劑和CTLA4抑制劑的聯合用藥方案中，CTLA4抑制劑無論Ipilimumab或是Tremelimumab都通常選用較低劑量。為了降低CTLA4抑制劑的毒副作用，其中一種值得嘗試的方法是將CTLA4抑制劑定向輸送到腫瘤組織內部，使相關的T細胞媒介的反應僅侷限於腫瘤微環境內，而減少細胞激素釋放症候群的風險。例如，利用辨識腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen)的抗體將CTLA4抑制劑重定向到特定的腫瘤微環境中，使其在腫瘤微環境中解除T細胞的免疫抑制信號，恢復T細胞的功能。實施例
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於建構載體和質體的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質體的方法或將質體引入宿主細胞的方法．這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例 1 基於重鏈抗體的雙特異性結合蛋白
本實施例中的表1和圖1列出了本發明申請所涉及的利用重鏈抗體(HCAb)及其衍生的單域抗體(sdAb)所建構的雙特異性結合蛋白的結構。每一種結構會在下文進一步描述。在本發明申請中，所述Fab-HCAb結構即為表1和圖1中的如結構(1)和結構(2)所示的結構，且優選結構為結構(1)。
在有些結構中，結構域和結構域之間用連接胜肽進行聯結。在有些結構中，重鏈的Fc區域引入了胺基酸突變以改變其與Fc受體的結合進而改變相關的效應功能或者其他性能。表2列出了本申請的結構設計中可能用到的連接胜肽序列。表 1 本申請所列舉的多特異性結合蛋白分子結構
結構編號 結構模式名稱 結構類型 結合價數 對稱性 不同的多肽鏈數目
1 Fab(CL)-VH-Fc Fab-HCAb 四價 對稱 2
2 Fab(CH1)-VH-Fc Fab-HCAb 四價 對稱 2
3 IgG_HC-VH IgG-VH 四價 對稱 2
4 VH-IgG_HC VH-IgG 四價 對稱 2
5 FIT-Ig FIT-Ig 四價 對稱 3
表 2 連接 胜肽序列
連接 胜肽 名字 長度 序列 SEQ ID NO
GS_2 2 GS  
GS_4 4 GSGS 161
GS_5 5 GGGGS 162
GS_7 7 GGGGSGS 163
GS_15 15 GGGGSGGGGSGGGGS 164
GS_20 20 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 165
GS_25 25 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 166
H1_15 15 EPKSSDKTHTPPPPP 167
LH1 10 DKTHTCPPCP 168
G5-LH 15 GGGGGDKTHTCPPCP 169
H1_15-RT 17 EPKSSDKTHTPPPPPRT 170
L-GS_15-RT 18 LGGGGSGGGGSGGGGSRT 171
L-H1_15-RT 18 LEPKSSDKTHTPPPPPRT 172
KL-H1_15-RT 19 KLEPKSSDKTHTPPPPPRT 173
KL-H1_15-AS 19 KLEPKSSDKTHTPPPPPAS 174
RT-GS_5-KL 9 RTGGGGSKL 175
RT-GS_15-KL 19 RTGGGGSGGGGSGGGGSKL 176
RT-GS_25-KL 29 RTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKL 177
人IgG1樞紐 15 EPKSCDKTHTCPPCP 178
人IgG1樞紐 (C220S) 15 EPKSSDKTHTCPPCP 179
人IgG2樞紐 12 ERKCCVECPPCP 180
人IgG4樞紐 12 ESKYGPPCPSCP 181
人IgG4樞紐 (S228P) 12 ESKYGPPCPPCP 182
實施例 1.1 含有重鏈抗體 VH 結構域的雙特異性結合蛋白結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A (例如，IgG抗體)和結合第二抗原的重鏈抗體B。
如圖1中結構(1)-(4)所示，Fab端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列，L或L1或L2是連接胜肽。實施例 1.1.1 結構 (1):Fab(CL)-VH-Fc
結構(1)的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。在結構(1)中，抗體A的VL_A和重鏈抗體B的VH_B融合在同一條多肽鏈上，這樣可以避免VL_A和VH_B的締合產生的錯配副產物。
多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接胜肽序列，或是表2中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐(C220S)或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CL與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CL經由連接胜肽L1聯結到VH_B；L1可以是表2中所列序列。實施例 1.1.2 結構 (2) : Fab(CH1)-VH-Fc
結構(2)的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。
多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接胜肽序列，或是表2中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐(C220S)或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH1與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH1經由連接胜肽L1聯結到VH_B；L1可以是表2中所列序列。實施例 1.1.3 結構 (3):IgG_HC-VH
結構(3)的結合蛋白包含兩條不同的多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接胜肽L聯結到VH_B；L可以是表2中所列序列。實施例 1.1.4 結構 (4):VH-IgG_HC
結構(4)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B與VH_A直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L聯結到VH_A；L可以是表2中所列序列。實施例 1.2 其他雙特異性結合蛋白結構 實施例 1.2.1 結構 (5):FIT-Ig
FIT-Ig結構的設計可以參考專利WO2015/103072A1，見圖1的結構(5)所示。FIT-Ig結構的雙抗分子可以建構自：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的常規抗體B。
結構(5)的結合蛋白包含三條多肽鏈：多肽鏈1，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L-VH_B-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈2，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈3，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_B-CL。其中，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH_B和VL_B分別為抗體B的重鏈可變區和輕鏈可變區，CL是輕鏈恆定區結構域，CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域，h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列，L是連接胜肽。一般情況下，多肽鏈2和多肽鏈3的締合會產生錯配副產物VH_A-CH1/VL_B-CL。
在一個實施方案中，多肽鏈1的CL與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈1的CL經由連接胜肽L聯結到VH_B；L可以是表2中所列序列。實施例 2 抗體的序列分析、表現純化、和理化性質特徵分析 實施例 2.1 抗體的表現和純化
本實施例介紹了利用哺乳動物宿主細胞(例如，人胚腎細胞HEK293或中國倉鼠卵巢細胞CHO及其衍生細胞)、暫態轉染表現和親和捕捉分離等技術來製備抗體的一般方法。本方法適用於含有Fc的目標抗體；目標抗體可以由一條或多條蛋白質多肽鏈組成；可以來源於一個或多個表現質體。
將抗體多肽鏈的胺基酸序列透過密碼子最適化方法轉換成核苷酸序列；合成編碼的核苷酸序列並選殖到與宿主細胞相容的表現載體上。將編碼抗體多肽鏈的質體按照特定比例同時轉染哺乳動物宿主細胞，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到具有正確摺疊和多肽鏈組裝的重組抗體。具體地，將FreeStyle™ 293-F細胞 (Thermo, #R79007) 在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo, #A1383504)中擴大培養。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6 - 8 x105 細胞/ml，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養24小時，細胞濃度在1.2 x106 細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將編碼抗體多肽鏈的質體按照一定比例混合共計30 µg質體(質體與細胞的比例為1 µg : 1 ml)溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo, #31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM 溶入1 mg/ml PEI (Polysciences, #23966-2) 120 µl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10 分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養5天。5天後觀測細胞存活率。收集培養物，以3300g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS pH7.4緩衝液平衡含有MabSelect™ (GE Healthcare, #71-5020-91)的重力管柱(Bio-Rad, #7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱；用5-10倍管柱體積的PBS緩衝液沖洗管柱，再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗提目標蛋白，隨後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore, #UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液或者含有其他成分的緩衝液，得到純化的重組抗體溶液。最後用NanoDrop (Thermo, NanoDrop™ One)測定濃度，分裝、存儲備用。實施例 2.2 利用 SEC-HPLC 分析蛋白純度和聚合體
本實施例使用分析型分子粒徑篩析層析法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚合體形式。將分析型層析管柱TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, #08541, 5 µm, 7.8 mm × 30 cm) 連接到高壓液相層析儀HPLC (Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10 µg)用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS緩衝液將樣品以1.0 ml/分鐘的流速流過層析管柱，最長時間為25分鐘。HPLC將生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。實施例 3 建構具有 Fab-HCAb 結構和其他結構的雙特異性結合蛋白
本實施例總結了本發明申請的各個實施例中所使用的IgG單抗和HCAb單抗以及衍生的雙特異性結合蛋白。
IgG單抗和HCAb單抗的資訊列於表3，其序列編號見表6，胺基酸序列見表11。
按照實施例1.1.1和圖1(1)所述結構或實施例1.1.2和圖1(2)所述結構設計具有Fab-HCAb結構的雙特異性結合蛋白，其分子設計總結於表4，其序列編號見表7，胺基酸序列見表12；並按照實施例2所述方法製備蛋白樣品並進行分析，總結於表9。
其他結構的雙特異性結合蛋白的分子資訊總結於表5，對應的結構編號即為實施例 1 和圖1中的結構(3)、(4)或(5)；其序列編號見表7，胺基酸序列見表12；並按照實施例2所述方法製備蛋白樣品並進行分析，總結於表10。
表8還列出了雙特異性結合蛋白的蛋白功能區A (第一抗原結合結構域)和蛋白功能區B (第二抗原結合結構域)的對應的CDR序列的序列編號。
在有些結合蛋白的結構中，重鏈的Fc區域引入了胺基酸突變以改變其與Fc受體的結合進而改變相關的效應功能或者其他性能。例如，在表4和表5中，表中的突變位址代號是：AAG：(L234A, L235A, P329G); LALA：(L234A, L235A)。表 3 本申請所使用的對照分子和親代單抗
蛋白編號 說明
PR000628 抗4-1BB 單抗 Urelumab 類似物 (hIgG4)
PR003475 抗OX40 單抗 Pogalizumab 類似物 (hIgG1)
PR000210 抗HER2 單抗 Trastuzumab 類似物 (hIgG1)
PR000265 抗PD-L1 H2L2單抗 91G3H5H3(D54E) , hIgG1(N297A)
PR002408 抗B7H4 H2L2單抗 80C8-2E9(H:G55A; L:N92Q), hIgG1
PR000197 抗4-1BB H2L2單抗 79B10G8D4, hIgG4
PR001760 抗4-1BB 重鏈抗體 1016P0011G10
PR002067 抗OX40 重鏈抗體 R1026P079E12
PR004433 抗BCMA重鏈抗體 PR001046_R2_4G10
PR000892 抗BCMA H2L2單抗 1005_21C11E1, hIgG1
PR000184 抗CTLA4 重鏈抗體 CL5v3
表 4 本申請中具有 Fab-HCAb 結構的雙特異性結合蛋白
結構編號 蛋白編號 抗原 -1 Fab 抗體 A 抗原 -2 HCAb 抗體 B 第一連接 胜肽 (Fab 和 VH_B 之間 ) 第二連接 胜肽 (VH_B 和 CH2 之間 ) Fc 類型 ( 突變 )
1 PR004270 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001760 H1_15 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (LALA)
2 PR007163 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001760 無 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (LALA)
1 PR007164 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001760 無 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (LALA)
1 PR004279 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 H1_15 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (LALA)
1 PR004277 B7H4 PR002408 OX40 PR002067 H1_15 人IgG1樞紐 (C220S) 人 IgG1 (LALA)
1 PR005744 BCMA PR000892 BCMA PR004433 無 人IgG1樞紐 人 IgG1
1 PR000305 HER2 PR000210 CTLA4 PR000184 無 人IgG1樞紐 人IgG1
1 PR000653 HER2 PR000210 CTLA4 PR000184 GS_7 人IgG1樞紐 人IgG1
1 PR000654 HER2 PR000210 CTLA4 PR000184 GS_15 人IgG1樞紐 人IgG1
1 PR000655 HER2 PR000210 CTLA4 PR000184 H1_15 人IgG1樞紐 人IgG1
1 PR000706 HER2 PR000210 CTLA4 PR000184 GS_7 G5-LH 人IgG1
表 5 本申請中其他結構的雙特異性結合蛋白
結構編號 蛋白編號 抗原 -1 Fab 抗體 A 抗原 -2 HCAb 抗體 B 結構說明 連接 胜肽 Fc 類型 ( 突變 )
3 PR003335 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 4-1BB VH在B7H4 IgG重鏈C端 H1_15-RT 人 IgG1 (LALA)
3 PR003550 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001760 4-1BB VH在PD-L1 IgG 重鏈C端 H1_15-RT 人 IgG1 (AAG)
3 PR004276 B7H4 PR002408 OX40 PR002067 OX40 VH在B7H4 IgG 重鏈C端 H1_15-RT 人 IgG1 (LALA)
4 PR004268 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001760 4-1BB VH在PD-L1 IgG 重鏈N端 GS_15 人 IgG1 (LALA)
4 PR004278 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 4-1BB VH在B7H4 IgG 重鏈N端 GS_15 人 IgG1 (LALA)
5 PR000701 PD-L1 PR000265 4-1BB PR000197 FIT-Ig; 4-1BB Fab靠近 Fc 無 人 IgG4
表 6 本申請中對照分子和親代單抗的可變區和 CDR 的序列編號表
蛋白編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000628 137 127 119 109 76 86 98 11 33 55
PR003475 140 132 122 114 79 88 101 16 38 60
PR000210 135 125 117 107 74 84 96 12 31 53
PR000265 136 126 118 108 75 85 97 13 32 54
PR002408 139 131 121 113 78 83 100 15 37 59
PR000197 134 124 116 106 73 83 95 11 30 52
PR001760   129   111       14 35 57
PR002067   130   112       13 36 58
PR004433   133   115       17 39 61
PR000892 138 128 120 110 77 87 99 13 34 56
PR000184   123   105       10 29 51
表 7 本申請中雙特異性結合蛋白的序列編號表
結構編號 蛋白編號 多肽鏈 1 多肽鏈 2 多肽鏈 3
1 PR004270 147 153  
2 PR007163 136 183  
1 PR007164 147 184  
1 PR004279 155 158  
1 PR004277 155 156  
1 PR005744 159 160  
1 PR000305 141 142  
1 PR000653 141 143  
1 PR000654 141 144  
1 PR000655 141 145  
1 PR000706 141 149  
3 PR003335 139 150  
3 PR003550 136 151  
3 PR004276 139 154  
4 PR004268 136 152  
4 PR004278 139 157  
5 PR000701 148 147 146
表 8 本申請中雙特異性結合蛋白的抗原結合結構域的 CDR 序列編號表
結構編號 蛋白編號 蛋白功能區 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
1 PR004270, PR007164 A 75 85 97 13 32 54
B       14 35 57
1 PR004279 A 78 83 100 15 37 59
B       14 35 57
1 PR004277 A 78 83 100 15 37 59
B       13 36 58
1 PR005744 A 77 87 99 13 34 56
B       17 39 61
1 PR000305, PR000653, PR000654, PR000655, PR000706 A 74 84 96 12 31 53
B       10 29 51
2 PR007163 A 75 85 97 13 32 54
B       14 35 57
3 PR003335 A 78 83 100 15 37 59
B       14 35 57
3 PR003550 A 75 85 97 13 32 54
B       14 35 57
3 PR004276 A 78 83 100 15 37 59
B       13 36 58
4 PR004268 A 75 85 97 13 32 54
B       14 35 57
4 PR004278 A 78 83 100 15 37 59
B       14 35 57
5 PR000701 A 75 85 97 13 32 54
B 73 83 95 11 30 52
表 9 本申請中 Fab-HCAb 結構的雙特異性結合蛋白的表現
結構編號 蛋白編號 表現系統和體積 質體轉染比例 ( 短鏈：長鏈 ) 第一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
1 PR004270 HEK293-6E (40ml) 3 : 2 77.5 92.33
2 PR007163 HEK293 (100ml) 3 : 1 13 97.84
1 PR007164 HEK293 (100ml) 3 : 1 47 93.37
1 PR004279 HEK293-F (30ml) 3 : 2 11.4 79.18
1 PR004279 CHO (100ml) 3 : 2 3.6 95.46
1 PR004277 CHO (100ml) 3 : 2 48 93.03
1 PR005744 HEK293-F (100ml) 3 : 2 51.9 99.34
1 PR000305 HEK293-F (30ml) 3 : 2 70.0 87.17
1 PR000653 HEK293-F (30ml) 3 : 2 69.9 100.00
1 PR000654 HEK293-F (30ml) 3 : 2 62.9 100.00
1 PR000655 HEK293-F (30ml) 3 : 2 102.1 97.82
1 PR000706 HEK293-F (30ml) 3 : 2 40.9 100.00
表 10 本申請中其他結構的雙特異性結合蛋白的表現
結構編號 蛋白編號 表現系統和體積 第一步純化後產量 (mg/L) HPLC-SEC 純度 (%)
3 PR003335 ExpiCHO (200ml) 68.9 99.29
3 PR003550 HEK293-F (30ml) 42.2 95.41
3 PR004276 HEK293-6E (40ml) 17.7 95.46
4 PR004268 HEK293-6E (40ml) 31.5 97.94
4 PR004278 HEK293-6E (40ml) 11.5 98.08
5 PR000701 HEK293-F (30ml) 198.0 79.88
表 11 本申請中對照分子和親代單抗的胺基酸序列
蛋白編號 SEQ ID NO 片段 胺基酸序列
PR000628 137 輕鏈 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
119 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIK
76 LCDR1 RASQSVSSYLA
86 LCDR2 DASNRAT
98 LCDR3 QQRSNWPPALT
127 重鏈 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
109 VH QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSS
11 HCDR1 GGSFSGY
33 HCDR2 NHGGY
55 HCDR3 DYGPGNYDWYFDL
PR003475 140 輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
122 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIK
79 LCDR1 RASQDISNYLN
88 LCDR2 YTSRLRS
101 LCDR3 QQGHTLPPT
132 重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
114 VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQGTLVTVSS
16 HCDR1 GYTFTDS
38 HCDR2 YPDNGD
60 HCDR3 APRWYFSV
PR000210 135 輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
117 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
74 LCDR1 RASQDVNTAVA
84 LCDR2 SASFLYS
96 LCDR3 QQHYTTPPT
125 重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
107 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
12 HCDR1 GFNIKDT
31 HCDR2 YPTNGY
53 HCDR3 WGGDGFYAMDY
PR000265 136 輕鏈 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASQSIYIWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYGSSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
118 VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASQSIYIWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYGSSRTFGQGTKVEIK
75 LCDR1 RASQSIYIWLA
85 LCDR2 KASSLET
97 LCDR3 QQYYGSSRT
126 重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRAVAGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
108 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRAVAGAFDIWGQGTMVTVSS
13 HCDR1 GFTFSSY
32 HCDR2 KQEGSE
54 HCDR3 DRAVAGAFDI
PR002408 139 輕鏈 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSNLGWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYQSWPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
121 VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSNLGWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYQSWPPLTFGGGTKVEIK
78 LCDR1 RASQSISSNLG
83 LCDR2 GASTRAT
100 LCDR3 QQYQSWPPLT
131 重鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDASNEYYADSVKGRFIISRDNSKDTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGGGLRWYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
113 VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDASNEYYADSVKGRFIISRDNSKDTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGGGLRWYFAYWGQGTLVTVSS
15 HCDR1 GFTFRSF
37 HCDR2 SYDASN
59 HCDR3 GGGLRWYFAY
PR000197 134 輕鏈 EFVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSILAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYNWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
116 VL EFVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSILAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYNWPLTFGGGTKVEIK
73 LCDR1 RASQSISSILA
83 LCDR2 GASTRAT
95 LCDR3 QQYYNWPLT
124 重鏈 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTDSNPSLKGRVTFSVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARLTGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
106 VH QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTDSNPSLKGRVTFSVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARLTGPFDYWGQGTLVTVSS
11 HCDR1 GGSFSGY
30 HCDR2 NHSGS
52 HCDR3 LTGPFDY
PR001760 129 重鏈 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
111 VH EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSS
14 HCDR1 GFTFSNY
35 HCDR2 SGSGVS
57 HCDR3 EGSSETDDHYYNVDV
PR002067 130 重鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGRGGSTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVDGTTGTTDVDYWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
112 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGRGGSTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVDGTTGTTDVDYWGQGTLVTVSS
13 HCDR1 GFTFSSY
36 HCDR2 SGRGGS
58 HCDR3 GTTGTTDVDY
PR004433 133 重鏈 EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSDSYMTWVRQAPGKGLEWVSVIFSGGRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARRNYDDTRGTDVFDIWGQGTMVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
115 VH EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSDSYMTWVRQAPGKGLEWVSVIFSGGRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARRNYDDTRGTDVFDIWGQGTMVTVSS
17 HCDR1 GFTVSDS
39 HCDR2 FSGGR
61 HCDR3 RNYDDTRGTDVFDI
PR000892 138 輕鏈 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQTDDFATYYCQQYNSYLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
120 VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQTDDFATYYCQQYNSYLFTFGQGTKLEIK
77 LCDR1 RASQSISSWLA
87 LCDR2 KASSLES
99 LCDR3 QQYNSYLFT
128 重鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAATGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAAIWNDGSNNYYADSVKGRFTISRDDSKNTLNLQMNSLRAEDTAMYYCARDRLPMASLRYFDWLGVMDAWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
110 VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAATGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAAIWNDGSNNYYADSVKGRFTISRDDSKNTLNLQMNSLRAEDTAMYYCARDRLPMASLRYFDWLGVMDAWGQGTSVTVSS
13 HCDR1 GFTFSSY
34 HCDR2 WNDGSN
56 HCDR3 DRLPMASLRYFDWLGVMDA
PR000184 123 重鏈 EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSKNYMSWVRQAPGKGLEWVSVVYSGGSKTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAVPHSPSSFDIWGQGTMVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
105 VH EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSKNYMSWVRQAPGKGLEWVSVVYSGGSKTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAVPHSPSSFDIWGQGTMVTVSS
10 HCDR1 GFTVSKN
29 HCDR2 YSGGS
51 HCDR3 AVPHSPSSFDI
表 12 本申請中雙特異性結合蛋白的胺基酸序列
蛋白編號 SEQ ID NO 片段 胺基酸序列
PR004270 147 短鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRAVAGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
153 長鏈 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASQSIYIWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYGSSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSSDKTHTPPPPPEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007163 136 短鏈 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASQSIYIWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYGSSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
183 長鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRAVAGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007164 147 短鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRAVAGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
184 長鏈 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASQSIYIWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYGSSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR004279 155 短鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDASNEYYADSVKGRFIISRDNSKDTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGGGLRWYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
158 長鏈 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSNLGWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYQSWPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSSDKTHTPPPPPEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR004277 155 短鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDASNEYYADSVKGRFIISRDNSKDTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGGGLRWYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
156 長鏈 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSNLGWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYQSWPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSSDKTHTPPPPPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGRGGSTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVDGTTGTTDVDYWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR005744 159 短鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAATGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAAIWNDGSNNYYADSVKGRFTISRDDSKNTLNLQMNSLRAEDTAMYYCARDRLPMASLRYFDWLGVMDAWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
160 長鏈 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQTDDFATYYCQQYNSYLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSDSYMTWVRQAPGKGLEWVSVIFSGGRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARRNYDDTRGTDVFDIWGQGTMVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR000305 141 短鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
142 長鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSKNYMSWVRQAPGKGLEWVSVVYSGGSKTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAVPHSPSSFDIWGQGTMVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR000653 141 短鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
143 長鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGSEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSKNYMSWVRQAPGKGLEWVSVVYSGGSKTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAVPHSPSSFDIWGQGTMVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR000654 141 短鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
144 長鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSKNYMSWVRQAPGKGLEWVSVVYSGGSKTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAVPHSPSSFDIWGQGTMVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR000655 141 短鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
145 長鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSSDKTHTPPPPPEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSKNYMSWVRQAPGKGLEWVSVVYSGGSKTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAVPHSPSSFDIWGQGTMVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR000706 141 短鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
149 長鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGSEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFTVSKNYMSWVRQAPGKGLEWVSVVYSGGSKTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAVPHSPSSFDIWGQGTMVTVSSGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR003335 139 短鏈 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSNLGWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYQSWPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
150 長鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDASNEYYADSVKGRFIISRDNSKDTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGGGLRWYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGEPKSSDKTHTPPPPPRTEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSS
PR003550 136 短鏈 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASQSIYIWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYGSSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
151 長鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRAVAGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGEPKSSDKTHTPPPPPRTEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSS
PR004276 139 短鏈 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSNLGWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYQSWPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
154 長鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDASNEYYADSVKGRFIISRDNSKDTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGGGLRWYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGEPKSSDKTHTPPPPPRTEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGRGGSTFYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVDGTTGTTDVDYWGQGTLVTVSS
PR004268 136 短鏈 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASQSIYIWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYGSSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
152 長鏈 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRAVAGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR004278 139 短鏈 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSNLGWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYQSWPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
157 長鏈 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQAPEKGLEWVSSISGSGVSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTRLTAEDTAVYFCAKEGSSETDDHYYNVDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDASNEYYADSVKGRFIISRDNSKDTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGGGLRWYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR000701 148 多肽鏈 1 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASQSIYIWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYGSSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTDSNPSLKGRVTFSVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARLTGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
147 多肽鏈 2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRAVAGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
146 多肽鏈 3 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISSILAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYNWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
實施例 4  PD-L1 × 4-1BB 雙特異性結合蛋白
在本實施例中，我們建構了標靶PD-L1和4-1BB的具有Fab-HCAb、IgG-VH、VH-IgG或FIT-Ig結構的雙特異性結合蛋白PD-L1 × 4-1BB，透過一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，PD-L1 × 4-1BB 可以透過阻斷PD-1/PD-L1信號途徑來活化T細胞。第二，高度表現於腫瘤細胞表面的PD-L1分子可以利用PD-L1 × 4-1BB促進T細胞表面的4-1BB分子的交聯和三聚化並活化下游信號傳導途徑，進而促進T細胞的活化和增殖。第三，PD-L1 × 4-1BB媒介的T細胞活化僅限於在腫瘤微環境內，這樣可以避免類似Urelumab的單抗在正常組織中過度活化T細胞所帶來的毒副作用。實施例 4.1 獲得抗 PD-L1 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 IgG 或 HCAb 抗體 實施例 4.1.1 獲得抗 PD-L1 的全人源 IgG 抗體
Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。
用可溶的重組人PD-L1蛋白(NovoProtein, #CM06)對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中PD-L1特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞株融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，鑑定出若干個特異辨識PD-L1的單株抗體分子。對這些單株抗體進行進一步的鑑定，根據其對人PD-L1的結合能力、食蟹猴PD-L1的結合能力、抑制PD-L1與PD-1結合能力等參數，優選出數個候選抗體分子。然後對候選抗體分子進行序列分析和最適化，得到數個變體序列。將抗體的VL和VH序列與相應的人的κ輕鏈恆定區和IgG1重鏈恆定區序列進行融合表現，得到重組全人源抗體分子。
抗PD-L1的重組全人源IgG抗體PR000265的序列見表6。實施例 4.1.2 獲得抗 4-1BB 的全人源 IgG 抗體
Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。
用可溶的重組人4-1BB-Fc融合蛋白(南京金斯瑞生物科技)對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中4-1BB特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞株融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，鑑定出若干個特異辨識4-1BB的單株抗體分子。對這些單株抗體進行進一步的鑑定，根據其對人4-1BB的結合能力、食蟹猴4-1BB的結合能力、T細胞活化能力等參數，優選出數個候選抗體分子。然後對候選抗體分子進行序列分析和最適化，得到數個變體序列。將抗體的VL和VH序列與相應的人的κ輕鏈恆定區和IgG1重鏈恆定區序列進行融合表現，得到重組全人源抗體分子。
抗4-1BB的重組全人源IgG抗體PR000197的序列見表6。實施例 4.1.3 獲得抗 4-1BB 的全人源 HCAb 抗體
Harbour HCAb小鼠(Harbour Antibodies BV，WO2010/109165A2)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，能夠產生僅有重鏈的抗體，該抗體的分子量只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體重鏈可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。
用可溶的重組人4-1BB-Fc融合蛋白(睿智化學提供) 或者過度表現了人4-1BB的NIH-3T3細胞(睿智化學提供) 對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中4-1BB特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用小鼠漿細胞分選套組(Miltenyi, #130-092-530)分選CD138陽性的漿細胞。用常規的分子生物學手段從漿細胞中擴增人VH基因，並將擴增的人VH基因片段建構到編碼人IgG1抗體重鏈Fc序列的哺乳動物細胞表現質體pCAG載體中。質體轉染哺乳動物宿主細胞 (如人胚腎細胞HEK293)進行表現，得到全人源HCAb抗體上清。用FACS測試HCAb抗體上清與高度表現人4-1BB的CHO-K1細胞CHO-K1/hu4-1BB的結合，鑑定出陽性HCAb抗體。對這些HCAb抗體進行進一步的鑑定，根據其對人4-1BB的結合能力、食蟹猴4-1BB的結合能力、T細胞活化能力等參數，優選出數個候選HCAb抗體分子。
抗4-1BB的重組全人源HCAb抗體PR001760的序列見表6。實施例 4.2 建構 PD-L1 × 4-1BB 雙特異性結合蛋白
一方面，本實施例利用抗PD-L1的IgG抗體PR000265的Fab，和抗4-1BB的HCAb抗體PR001760的VH，來建構具有如實施例1.1.1所述Fab-HCAb結構(圖1結構(1) : Fab(CL)-VH-Fc)的抗PD-L1 × 4-1BB的雙特異性結合蛋白PR004270 和PR007164 ；和建構具有如實施例1.1.2所述Fab-HCAb結構(圖1結構(2) : Fab(CH1)-VH-Fc)的抗PD-L1 × 4-1BB的雙特異性結合蛋白PR007163 。PR004270、PR007163和PR007164的分子設計見表4，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表9。如表9中所示，PR007164 (結構(1))、PR004270的純化後產量顯著高於PR007163 (結構(2))。
另一方面，本實施例還利用抗PD-L1的IgG抗體PR000265的Fab，和抗4-1BB的HCAb抗體PR001760的VH，來建構具有如實施例1.1.3所述IgG-VH結構的抗PD-L1 × 4-1BB的雙特異性結合蛋白PR003550 。PR003550的分子設計見表5，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例 2所述方法進行製備和分析，總結於表10。
另一方面，本實施例還利用抗PD-L1的IgG抗體PR000265的Fab，和抗4-1BB的HCAb抗體PR001760的VH，來建構具有如實施例1.1.4所述VH-IgG結構的抗PD-L1 × 4-1BB的雙特異性結合蛋白PR004268 。PR004268的分子設計見表5，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表10。
另一方面，本實施例還利用抗PD-L1的IgG抗體PR000265的Fab，和抗4-1BB的IgG抗體PR000197的Fab，來建構具有如實施例1.2.1所述FIT-Ig結構的抗PD-L1 × 4-1BB的雙特異性結合蛋白PR000701 。PR000701的分子設計見表5，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表10。實施例 4.3 結合 4-1BB
本實施例利用流式細胞術FACS測試結合蛋白與高度表現人4-1BB的CHO-K1細胞株CHO-K1/hu4-1BB (南京金斯瑞, M00538)細胞的結合能力。具體地，消化酶處理細胞並用完全培養基重新懸浮；將細胞密度調整為2x106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔(2x105 細胞/孔)接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的結合蛋白以100 µL/孔加入96孔盤並混合均勻，結合蛋白可以從最高終濃度為200 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共12個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL/孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的PBS緩衝液)漂洗細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100 µL/孔螢光二抗(Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液漂洗細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體 FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到結合蛋白對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的單抗Urelumab (蛋白編號PR000628)或抗4-1BB的HCAb抗體PR001760。
圖2中所示，PD-L1 × 4-1BB雙特異性結合蛋白(PR004270，PR004268，PR003550)結合4-1BB的能力相當，且在MFI最大值上優於陽性對照Urelumab，並在EC50值上優於FIT-Ig結構的分子PR000701。PD-L1 × 4-1BB雙特異性結合蛋白(PR007163，PR007164)結合4-1BB的能力與其親代單抗PR001760的相當。實施例 4.4 結合 PD-L1
本實施例利用流式細胞術FACS測試結合蛋白與高度表現人PD-L1的CHO-K1細胞株 CHO-K1/hPD-L1 (南京金斯瑞, M00543)的結合能力。具體地，消化酶處理細胞並用完全培養基重新懸浮；將細胞密度調整為1x106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後將梯度稀釋的結合蛋白以100 µL /孔加入96孔盤並混合均勻，結合蛋白可以從最高終濃度為200 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共12個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL/孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的 PBS緩衝液)漂洗細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100 µL/孔螢光二抗(Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液漂洗細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到結合蛋白對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的單抗PR000265，亦為PD-L1 × 4-1BB的PD-L1端的親代單抗。
圖3中所示，Fab-HCAb結構的分子(PR004270)和VH-IgG結構的分子(PR004268)結合PD-L1的能力與親代單抗PR000265相似，其結合PD-L1的EC50值雖略弱於親代單抗，但是結合的MFI最大值比親代單抗更高。IgG-VH結構的分子(PR003550)結合PD-L1的能力與親代單抗PR000265相似，且EC50值和MFI最大值略優於FIT-Ig結構的分子(PR000701)。Fab-HCAb結構的分子(PR007163，PR007164)結合PD-L1的能力與親代單抗PR000265相當。實施例 4.5 混合淋巴細胞反應 (MLR)
本實施例是利用混合淋巴細胞反應(MLR) 來研究PD-L1 × 4-1BB雙特異結合蛋白對T細胞的活化作用。
第一步，利用CD14磁珠(Meltenyi, #130-050-201) 從第一供體PBMC細胞(妙通生物)中分離單核細胞(monocytes)；具體操作參照相關套組說明書。然後加入50 ng/mL重組人源IL-4 (PeproTech, #200-02-A) 和100 ng/mL重組人源GM-CSF (PeproTech, #300-03-A)，於37℃誘導7天後，獲得未成熟的樹突狀細胞(iDC細胞)。繼續加入1 μg/ml的脂多醣Lipopolysaccharide (LPS, Sigma, #L6529)，誘導24小時後，獲得成熟的樹突狀細胞(mDC細胞)。第二步，利用T細胞分離套組(Meltenyi, #130-096-535)從第二供體PBMC細胞(妙通生物)中分離得到T淋巴細胞。第三步，將獲得的T細胞和mDC細胞按5 : 1比例接種至96孔盤(1×105 /孔的T細胞和2×104 /孔的mDC細胞)。隨後以50 µL/孔加入不同濃度的結合蛋白，其終濃度可以是 (10 nM, 1 nM)；3個重複孔加載樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)或者空白孔作為對照。於37℃，5% CO2 培養箱培育5天。第四步，分別收集第4天和第5天的上清液，用IL-2 ELISA套組(Thermo, #88-7025-88)檢測第4天的上清中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA套組(Thermo, #88-7316-77)檢測第5天的上清中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關套組操作說明。應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析。
圖4中所示，在MLR實驗中，抗4-1BB單抗(PR001760)對T細胞的活化作用有限，產生細胞激素(IFN-γ，IL-2)的能力很弱；但是，抗PD-L1單抗(PR000265)有較明顯的活化作用。另一方面，PD-L1 × 4-1BB雙特異結合蛋白可以進一步提高T細胞的功能，優於抗PD-L1單抗。而且相較於FIT-Ig結構的分子(PR000701)，IgG-VH結構的分子(PR003550)和Fab-HCAb結構的分子(PR004270)能夠刺激T細胞產生更多的細胞激素。實施例 4.6 標靶細胞媒介的 T 細胞的特異性活化
本實施例是為了研究PD-L1 × 4-1BB雙特異結合蛋白在標靶細胞的存在時透過結合4-1BB來活化T細胞的活性。標靶細胞可以是高度表現人PD-L1的細胞CHO-K1/hPD-L1(南京金斯瑞, M00543)；效應細胞可以是分離的人PBMC或者T細胞。
具體的，首先以100 µL/孔將0.3 µg/mL抗CD3抗體OKT3 (Thermo, #16-0037-81)塗覆於96孔盤(Corning, #3599)。接著，將人T細胞(從人PBMC中用T細胞分選套組(Miltenyi, #130-096-535)分離得到)的密度調整為2x106 細胞/mL，將標靶細胞的密度調整為3x105 細胞/mL，隨後把兩種細胞懸浮液各以50 µL/孔接種於96孔盤，最終效應細胞-標的細胞比為20 : 3。然後，以100 µL/孔加入不同濃度的結合蛋白，其終濃度可以是(10 nM, 1 nM)；2個重複孔加載樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)和hIgG4 iso (CrownBio, #C0045)作為對照。將96孔盤置於37℃，5% CO2 培養箱中培育3天。分別收集培養48小時後和72小時後的上清液，用IL-2 ELISA套組(Thermo, #88-7025-88)檢測48小時後的上清中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA套組(Thermo, #88-7316-77)檢測72小時後的上清中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關套組操作說明。應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析。
圖8中所示，在標靶細胞CHO-K1/hPD-L1和T細胞混合的系統中，不依賴於交聯的抗4-1BB單抗Urelumab可以活化T細胞釋放IFN-γ；Fab-HCAb結構的分子(PR004270)具有最強的T細胞活化能力，其IFN-γ位準高於Urelumab和其他結構的雙特異分子(如， PR003550，PR000701)。總體說來，T細胞活化能力排序：PR004270 ＞ PR003550 ＞ Urelumab = PR000701 ＞ PR004268。實施例 4.7 結構類比
在實施例4.5和實施例4.6中，Fab-HCAb結構的分子(PR004270)相較於FIT-Ig結構的分子(PR000701)，顯示出更強的T細胞活化能力。為了進一步研究Fab-HCAb結構和FIT-Ig結構之間的差異，本實施例利用已知的人IgG1全長抗體晶體結構(PDB登錄號1HZH)透過同源建模技術預測出Fab-HCAb(結構(1))的三維結構模型(圖17 (A))和FIT-Ig(結構(5))的三維結構模型，並在此基礎上測量不同抗原結合位址之間的相對距離(圖17 (B)和(C))；在這兩個結構模型中，蛋白功能區A和蛋白功能區B之間都採用7個胺基酸長度的連接胜肽GS_7 (SEQ ID NO: 163)進行聯結。
如圖17中所示，Fab-HCAb結構更加緊湊。在Fab-HCAb結構處於最為伸展狀態的模型中，兩個VH端(B1和B2)之間距離約為10 nm，兩個Fab端(A1和A2)之間距離約為30 nm；相應地，在FIT-Ig結構中，B1和B2之間距離約為18 nm，A1和A2之間距離約為37 nm。在標靶4-1BB的雙特異性結合蛋白中，Fab-HCAb的這種更加緊湊的結構特性也許更有利於4-1BB的三聚化並在細胞表面成簇，進而活化下游信號。實施例 5  B7H4 × 4-1BB 雙特異性結合蛋白
在本實施例中，我們建構了標靶B7H4和4-1BB的具有Fab-HCAb、IgG-VH或VH-IgG結構的雙特異性結合蛋白B7H4 × 4-1BB，透過一個或者多個作用機制來提高抗腫瘤效果和安全性。第一，B7H4 × 4-1BB可以透過解除B7H4的負調控信號來活化T細胞。第二，B7H4 × 4-1BB富集於B7H4高度表現的腫瘤組織，在腫瘤微環境中，免疫細胞和腫瘤細胞透過B7H4 × 4-1BB結合在一起，促進免疫突觸的形成；同時，高度表現於腫瘤細胞表面的B7H4分子可以透過B7H4 × 4-1BB促進T細胞表面的4-1BB分子的交聯，並活化下游信號傳導途徑，提供共刺激信號，進而促進T細胞的活化和增殖，提高抗腫瘤活性。第三，B7H4 × 4-1BB只能在腫瘤微環境中利用標靶細胞來媒介T細胞的活化，以避免類似Urelumab的單抗在正常組織中過度活化T細胞所帶來的毒副作用。實施例 5.1 獲得抗 B7H4 的 IgG 抗體和抗 4-1BB 的 HCAb 抗體 實施例 5.1.1 獲得抗 B7H4 的全人源 IgG 抗體
Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。
用可溶的重組人B7H4-mFc融合蛋白(Sino Biological Inc., #10738-H05H)對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。當檢測小鼠血清中B7H4特異的抗體效價達到一定的位準後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞株融合得到融合瘤細胞；對融合瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，鑑定出若干個特異辨識B7H4的單株抗體分子。對這些單株抗體進行進一步的鑑定，根據其對人B7H4的結合能力、食蟹猴B7H4的結合能力、標靶細胞受體內化能力等參數，優選出數個候選抗體分子。然後對候選抗體分子進行序列分析和最適化，得到數個變體序列。將抗體的VL和VH序列與相應的人的κ輕鏈恆定區和IgG1重鏈恆定區序列進行融合表現，得到重組全人源抗體分子。
抗B7H4的重組全人源IgG抗體PR002408的序列見表6。實施例 5.1.2 獲得抗 4-1BB 的全人源 HCAb 抗體
本實施例使用的抗4-1BB的全人源HCAb抗體PR001760 (表6)來源於Harbour HCAb小鼠，其發現過程如實施例4.1.3所述。實施例 5.2 建構 B7H4 × 4-1BB 雙特異性結合蛋白
一方面，本實施例利用抗B7H4的IgG抗體PR002408的Fab，和抗4-1BB的HCAb抗體PR001760的VH，來建構具有如實施例1.1.1所述Fab-HCAb結構的抗B7H4 × 4-1BB的雙特異性結合蛋白PR004279 。PR004279的分子設計見表4，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表9。
另一方面，本實施例還利用抗B7H4的IgG抗體PR002408的Fab，和抗4-1BB的HCAb抗體PR001760的VH，來建構具有如實施例1.1.3所述IgG-VH結構的抗B7H4 × 4-1BB的雙特異性結合蛋白PR003335 。PR003335的分子設計見表5，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表10。
另一方面，本實施例還利用抗B7H4的IgG抗體PR002408的Fab，和抗4-1BB的HCAb抗體PR001760的VH，來建構具有如實施例1.1.4所述VH-IgG結構的抗B7H4 × 4-1BB的雙特異性結合蛋白PR004278 。PR004278的分子設計見表5，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表10。實施例 5.3 結合 4-1BB
本實施例利用實施例4.3所述方法測試結合蛋白與高度表現人4-1BB的CHO-K1細胞株CHO-K1/hu4-1BB(南京金斯瑞, M00538) 細胞的結合能力。
圖5中所示，B7H4 × 4-1BB雙特異性結合蛋白(PR004279，PR004278，PR003335)都可以結合4-1BB；而且Fab-HCAb結構的分子(PR004279)和VH-IgG結構的分子(PR004278)結合4-1BB的能力優於IgG-VH結構的分子(PR003335)。實施例 5.4 結合 B7H4
本實施例利用流式細胞術FACS測試結合蛋白與高度表現人B7H4的腫瘤細胞株SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)的結合能力。具體地，消化酶處理SK-BR-3細胞並用完全培養基重新懸浮，將細胞密度調整為2x106 細胞/mL；接著以50 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)。隨後以50 µL /孔加入5倍濃度梯度稀釋的結合蛋白共8個濃度，混合均勻；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。隨後以100 µL/孔加入預冷的PBS緩衝液漂洗細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。之後，以100 µL/孔加入螢光二抗(Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson ImmunoResearch, #109-605-098, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃避光培育1小時。隨後以100 µL/孔加入預冷的PBS緩衝液漂洗細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的PBS緩衝液)重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到結合蛋白對標靶細胞的結合曲線及EC50 值等參數。
圖6中所示，B7H4 × 4-1BB雙特異性結合蛋白(PR004279，PR004278，PR003335)都可以結合B7H4；而且Fab-HCAb結構的分子(PR004279)結合B7H4的能力略優於其他結構的分子。實施例 5.5 標靶細胞媒介的 T 細胞的特異性活化
本實施例是為了研究B7H4 × 4-1BB雙特異結合蛋白在標靶細胞的存在時透過結合4-1BB來活化T細胞的活性。標靶細胞可以是高度表現人B7H4的細胞SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)；效應細胞可以是分離的人PBMC或者T細胞。
具體的，首先將抗CD3抗體OKT3 (Thermo, #16-0037-81)塗覆培養盤於96孔盤(Corning, #3799)。接著，將人T細胞的密度調整為3 x106 細胞/mL，將標靶細胞的密度調整為3 x105 細胞/mL，隨後把兩種細胞懸浮液各以50 µL/孔接種於96孔盤，最終效應細胞-標的細胞比為10 : 1。然後，以50 µL/孔加入5倍濃度梯度稀釋的結合蛋白共5個濃度，最大終濃度為6 nM，兩個重複孔加載樣品；30 nM的hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為對照。將96孔盤置於37℃，5% CO2 培養箱中培育。分別收集培養48小時後和72小時後的上清液，用IL-2 ELISA套組(Thermo, #88-7025-88)檢測48小時後的上清中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA套組 (Thermo, #88-7316-77)檢測72小時後的上清中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關套組操作說明。應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析。
本實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的單抗Urelumab。
圖7顯示了結合蛋白活化T細胞釋放IL-2。Fab-HCAb結構的分子(PR004279)和IgG-VH結構的分子(PR003335)有比Urelumab更強的活化T細胞的能力，且PR004279比PR003335略強。儘管VH-IgG結構的分子(PR004278)有很強的結合4-1BB的能力，但是它幾乎不能活化T細胞。這說明，當4-1BB結合域VH位於IgG重鏈的N端時，其標靶細胞結合結構域Fab和4-1BB結合域VH之間的距離不適合形成標靶細胞和T細胞之間的相互作用。總體說來，T細胞活化能力排序：PR004279 ＞ PR003335 ＞ Urelumab ＞ PR004278。實施例 6  B7H4 × OX40 雙特異性結合蛋白
在本實施例中，我們建構了標靶B7H4和OX40的具有Fab-HCAb或IgG-VH結構的雙特異性結合蛋白B7H4 × OX40，利用與B7H4 × 4-1BB類似的作用機制，透過腫瘤相關抗原B7H4將OX40抗體重定向到腫瘤細胞，特異性活化腫瘤微環境的免疫反應。實施例 6.1 獲得抗 B7H4 的 IgG 抗體和抗 OX40 的 HCAb 抗體 實施例 6.1.1 獲得抗 B7H4 的全人源 IgG 抗體
本實施例使用的抗B7H4的重組全人源IgG抗體PR002408 (表6)來源於Harbour H2L2小鼠，其發現過程如實施例5.1.1所述。實施例 6.1.2 獲得抗 OX40 的全人源 HCAb 抗體
本實施例使用的抗OX40的全人源HCAb抗體PR002067 (表6)來源於Harbour HCAb小鼠，其發現過程與實施例4.1.3所述的抗4-1BB的HCAb的發現過程類似，即利用重組人OX40-Fc融合蛋白(睿智化學提供)或者高度表現人OX40的細胞株HEK293/OX40 (睿智化學提供) 對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫，並經過多輪篩選驗證得到。實施例 6.2 建構 B7H4 × OX40 雙特異性結合蛋白
一方面，本實施例利用抗B7H4的IgG抗體PR002408的Fab，和抗OX40的HCAb抗體PR002067的VH，來建構具有如實施例1.1.1所述Fab-HCAb結構的抗B7H4 × OX40的雙特異性結合蛋白PR004277 。PR004277的分子設計見表4，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表9。
另一方面，本實施例還利用抗B7H4的IgG抗體PR002408的Fab，和抗OX40的HCAb抗體PR002067的VH，來建構具有如實施例1.1.3所述IgG-VH結構的抗B7H4 × OX40的雙特異性結合蛋白PR004276 。PR004276的分子設計見表5，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表10。實施例 6.3 結合 OX40
本實施例利用流式細胞術FACS測試結合蛋白與高度表現人OX40的CHO-K1細胞株CHO-K1/huOX40 (南京金斯瑞, M00561)細胞的結合能力。具體地，消化酶處理細胞並用F12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度分別調整為1×106 細胞/ml。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，隨後加入100 µl/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測結合蛋白。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µl/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100 µl/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson ImmunoResearch, #109-545-06, 1:1000稀釋)，4℃，避光培育30分鐘。用100 µl/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200 µl /孔預冷PBS重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到結合蛋白對標靶細胞的結合曲線及EC50 值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗OX40的單抗Pogalizumab (蛋白編號PR003475)。
圖9中所示，B7H4 × OX40雙特異性結合蛋白(PR004277，PR004276)都可以結合OX40，結合能力相當。實施例 6.4 結合 B7H4
本實施例利用實施例5.4所述方法測試結合蛋白與高度表現人B7H4的腫瘤細胞株SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)的結合能力。陽性對照分子為抗B7H4的單抗PR002408，亦為B7H4 × OX40的B7H4端的親代單抗。
圖10中所示，B7H4 × OX40雙特異性結合蛋白(PR004277，PR004276)都可以結合B7H4，且與親代抗體PR002408的結合能力一致。實施例 6.5 標靶細胞媒介的 T 細胞的特異性活化
本實施例是為了研究B7H4 × OX40雙特異結合蛋白在標靶細胞的存在時透過結合OX40來活化T細胞的活性。標靶細胞可以是高度表現人B7H4的細胞CHO-K1/hB7H4 (和鉑醫藥自製)；效應細胞可以是分離的人PBMC或者T細胞。
具體的，首先以100 µL/孔將0.3 µg/mL抗CD3抗體OKT3 (Thermo, #16-0037-81)塗覆於96孔盤(Corning, #3599)。接著，將人T細胞(從人PBMC中用T細胞分選套組 (Miltenyi, #130-096-535)分離得到)的密度調整為2 x106 細胞/mL，將標靶細胞的密度調整為3 x105 細胞/mL，隨後把兩種細胞懸浮液各以50 µL/孔接種於96孔盤。然後，以100 µL/孔加入不同濃度的結合蛋白，兩個重複孔加載樣品，結合蛋白終濃度為(20 nM，2 nM，0 nM)；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 和不加抗體的空白孔(無Ab)作為對照。將96孔盤置於37℃，5% CO2 培養箱中培育3天。分別收集培養48小時後和72小時後的上清液，用IL-2 ELISA套組(Thermo, #88-7025-88)檢測48小時後的上清中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA套組(Thermo, #88-7316-77)檢測72小時後的上清中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關套組操作說明。應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析。
本實施例中，對照分子為相應的親代單抗PR002408和PR002067。
圖11中所示，在高度表現B7H4的CHOK1/hB7H4細胞存在時，抗OX40的HCAb單抗PR002067和抗B7H4的IgG單抗PR002408都不能活化T細胞；B7H4 × OX40雙特異性結合蛋白(PR004277，PR004276)都可以活化T細胞並促進細胞激素IL-2的產生，這說明B7H4 × OX40對T細胞的活化是依賴於標靶細胞的。而且，Fab-HCAb結構的分子(PR004277)的T細胞活化能力略強於IgG-VH結構的分子(PR004276)。實施例 7  BCMA × BCMA 雙特異性結合蛋白
在本實施例中，我們建構了標靶BCMA的具有Fab-HCAb結構的多價雙表位雙特異性結合蛋白，其可以更好地利用內化作用實現對標靶細胞的毒殺。實施例 7.1 獲得抗 BCMA 的抗體 實施例 7.1.1 獲得抗 BCMA 的全人源 IgG 抗體
本實施例使用的抗BCMA的重組全人源IgG抗體PR000892 (序列見表6)來源於Harbour H2L2小鼠，其發現過程和序列揭示於發明專利CN111234020B。實施例 7.1.2 獲得抗 BCMA 的全人源 HCAb 抗體
用可溶的重組人BCMA-ECD-Fc融合蛋白(ACRO Biosystems, #BC7-H82F0)對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。用類似實施例4.1.3所述方法進行篩選並獲得抗BCMA 的全人源HCAb抗體。然後，進一步對HCAb抗體PR001046的VH的CDR區進行兩輪定點突變，以獲得結合BCMA的親和力提高的突變體，如PR001046_R2_4G10 (即PR004433)。
本實施例使用的抗BCMA的重組全人源HCAb抗體PR004433的序列見表6。實施例 7.2 建構 BCMA× BCMA 雙特異性結合蛋白
本實施例利用抗BCMA的IgG抗體PR000892的Fab，和抗BCMA的HCAb抗體PR004433的VH，來建構具有如實施例1.1.1所述Fab-HCAb結構的抗BCMA × BCMA的雙特異性結合蛋白PR005744 。PR005744的分子設計見表4，相應的序列編號見表7；該分子按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表9。
隨後，測試抗原結合蛋白PR005744的結合BCMA的能力和其在BCMA高度表現細胞NCI-H929 (ATCC, CRL-9068)上內化的能力。實施例 7.3 利用 BLI 方法測定 BCMA 結合蛋白與 BCMA 的親和力
本實施例透過生物膜干涉(BLI)技術，使用Octet分子相互作用分析儀(ForteBio，型號Octet Red96e)，來進行BCMA結合蛋白與BCMA的結合動力學分析。
將重組人BCMA-ECD-Fc融合蛋白(ACRO Biosystems, #BC7-H82F0)先利用生物素化套組(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，ThermoFisher，A39257)按照說明書要求進行生物素化。本實驗使用感測器為SA生物感測器(ForteBio，#18-5019)；工作緩衝液為1×動力學緩衝液(從10×動力學緩衝液(ForteBio，#18-1105)稀釋)，用於親和力測試以及抗原和結合蛋白的稀釋；平衡緩衝液為1×PBS緩衝液(從10×PBS緩衝液(BBI Life Sciences， #E607016-0500)稀釋)。
先將兩列SA感測器(每列放置8個感測器；第一列稱為參照SA感測器，第二列稱為測試SA感測器)在平衡緩衝液中平衡10分鐘。然後，測試SA感測器捕捉生物素化的BCMA，設置捕捉高度為0.2 nm，而參照SA感測器浸入緩衝液中30秒。兩列感測器再與梯度稀釋的待測BCMA結合蛋白進行結合；待測BCMA結合蛋白濃度為10 – 2.5 nM的兩倍梯度稀釋以及0 nM。感測器與待測蛋白結合180秒，然後解離800秒。
使用Octet Data Analysis軟體(Fortebio，版本11.0)進行數據分析時，選擇雙扣除模式(double reference)扣除參照訊號，選擇“1:1 Global fitting”方法進行數據擬合，計算出抗原與抗原結合蛋白結合的動力學參數，得到kon (1/Ms)值、kdis (1/s)值和KD (M)值。
結果如表13和圖13所示，四價的PR005744比二價的PR004433有更高的結合BCMA的親和力(KD 值)；而且PR005744比PR004433有更高的最大反應訊號(Response)。表 13 結合蛋白與 BCMA 的結合動力學參數
蛋白編號 結合蛋白濃度 (nM) KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Full R^2 反應訊號 最大值
PR004433 10 - 2.5 7.92E-11 9.04E+05 7.16E-05 0.9975 0.2172
PR005744 10 - 2.5 2.79E-11 1.75E+06 4.87E-05 0.9989 0.5377
實施例 7.4 用 FACS 方法測定結合蛋白的內化作用
前述實施例已經驗證了四價結合蛋白(PR005744)與二價結合蛋白(PR004433)相比有相似甚至更高的結合BCMA的結合能力。本實施例進一步利用FACS方法來研究標靶BCMA的抗原結合蛋白內化媒介對表現人BCMA的細胞的毒殺。具體地，將NCI-H929 (ATCC, CRL-9068)細胞以2×105 個/孔接種至96-孔盤 (Beyotime, # FT018)；隨後加入用FACS緩衝液稀釋的200 nM待測抗原結合蛋白；然後置於4℃培育1小時；接著，取樣品於37℃分別培育不同時間(如30分鐘、1小時、2小時和4小時)；然後，離心並重新懸浮細胞，加入螢光二抗(Jackson ImmunoResearch, #109-545-098)後再於4℃培育30分鐘。最後，使用流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。以37℃培育0分鐘(T0)時的螢光訊號MFI為基線，不同培育時間的樣品的MFI與T0的基線進行扣減並計算相對減少量，以此反應抗原結合蛋白的內化作用的效率。應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析。
如圖12所示，PR005744在NCI-H929細胞的內化作用顯著優於PR004433；其在30分鐘內可以使超過60%的BCMA被內化。實施例 8  HER2 × CTLA4 雙特異性結合蛋白
在本實施例中，我們建構了多個標靶HER2和CTLA4的具有Fab-HCAb結構的雙特異性結合蛋白HER2 × CTLA4。HER2 × CTLA4可以富集於HER2高度表現的腫瘤組織，在腫瘤微環境中特異性地解除CTLA4抑制信號來活化T細胞，減少CTLA4單抗在周邊系統非特異活化帶來的毒副作用。本實施例建構了多個含有不同連接胜肽的Fab-HCAb結構的分子，以研究連接胜肽對Fab-HCAb分子結構的影響。實施例 8.1 獲得抗 HER2 的 IgG 抗體和抗 CTLA4 的 HCAb 抗體 實施例 8.1.1 獲得抗 HER2 的 IgG 抗體
本實施例使用抗HER2的IgG抗體trastuzumab (蛋白編號PR000210)，其相應的胺基酸序列來源於IMGT資料庫，序列見表6。實施例 8.1.2 獲得抗 CTLA4 的全人源 HCAb 抗體
用可溶的重組人CTLA4蛋白(ACRO Biosystems, #CT4-H5229)對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。用類似實施例4.1.3所述方法進行篩選並獲得抗CTLA4的全人源HCAb抗體。
本實施例使用的抗CTLA4的重組全人源HCAb抗體PR000184的序列見表6。實施例 8.2 建構 HER2 × CTLA4 雙特異性結合蛋白
本實施例利用抗HER2的IgG抗體PR000210 (trastuzumab 類似物)的Fab，和抗CTLA4的HCAb抗體PR000184的VH，來建構具有如實施例1.1.1所述Fab-HCAb結構的抗HER2 × CTLA4的雙特異性結合蛋白PR000305 、PR000653 、PR000654 、PR000655 和PR000706 。其分子設計見表4，相應的序列編號見表7；並按照實施例2所述方法進行製備和分析，總結於表9。這些雙特異性結合蛋白分子具有相似的結構，其抗原結合結構域Fab和VH都相同，其細微的差異在於不同的第一連接胜肽(Fab和VH之間)和第二連接胜肽(VH和CH2之間)的序列。
本實施例利用這些分子來研究不同連接胜肽對Fab-HCAb分子結構的影響。實施例 8.3 結合 HER2
本實施例利用流式細胞術FACS測試結合蛋白與高度表現人HER2的腫瘤細胞株SK-BR-3 (ATCC, HTB-30) 的結合能力。具體地，消化酶處理SK-BR-3細胞，並用完全培養基重新懸浮，將細胞密度調整為1x106 細胞/mL；接著以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後以100 µL/孔加入以最高終濃度為100 nM的5倍濃度梯度稀釋的結合蛋白，共8個濃度，混合均勻；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，4℃下離心5分鐘，棄上清；隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的PBS緩衝液)漂洗細胞兩次，然後於500 g，4℃下離心5分鐘，棄上清。之後，以100 µL/孔加入螢光二抗 (Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液漂洗細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗HER2的單抗PR000210 (trastuzumab 類似物)，亦為HER2 × CTLA4的HER2端的親代單抗。
圖14中所示，Fab-HCAb結構的雙特異性結合蛋白(PR000305、PR000653、PR000654、PR000655和PR000706)結合HER2的能力與親代單抗PR000210相當，體現在幾乎一致的EC50值和MFI最大值。這說明，Fab-HCAb結構的Fab端可以很好地保留其對應的標的結合能力。實施例 8.4 結合 CTLA4
本實施例利用流式細胞術FACS測試結合蛋白與高度表現人CTLA4的CHO-K1細胞株CHO-K1/hCTLA4 (睿智化學) 等細胞的結合能力。具體地，消化酶處理CHO-K1/hCTLA4細胞，並用F12K培養基重新懸浮；將細胞密度調整為2x106 細胞/mL。接著將CHO-K1/hCTLA4細胞以100 µL/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清。隨後以100 µL/孔加入以最高終濃度為300 nM的5倍濃度梯度稀釋的結合蛋白，共8個濃度，混合均勻；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001) 作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL /孔預冷FACS緩衝液(含有0.5% BSA的PBS緩衝液)漂洗細胞兩次，4℃下500g離心5分鐘，棄上清。接著，再加入100 µL/孔螢光二抗(Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液漂洗細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗CTLA4的HCAb單抗PR000184，亦為HER2 × CTLA4的CTLA4端的親代單抗。
圖15中所示，Fab-HCAb結構的雙特異性結合蛋白(PR000305、PR000653、PR000654、PR000655和PR000706)都可以結合CTLA4。這些分子具有相似的結構，CTLA4端的VH序列也相同，其細微的差異在於不同的第一連接胜肽和連接Fc的樞紐區；因而這些分子有非常相似的結合CTLA4的能力。這說明了不同的連接胜肽的長度或者序列對Fab-HCAb結構中的結合結構域VH的影響很小。
另一方面，這些分子結合CTLA4的EC50值與親代單抗PR000184的相似或者略弱僅1.5 ~ 3 倍，但是在FACS上的最大結合訊號(MFI最大值)比親代單抗PR000184低。這可能暗示了，在Fab-HCAb結構的某些應用場景中，Fab結構域可能對HCAb的VH結構域有一種“遮蔽”效應，使得Fab-HCAb分子可能會優先結合Fab結構域辨識的標的，之後才會引起VH結構域的結合。這種先後順序的結合以及不同標的結合力的差異可以適用於一些特殊的應用場景的需求。例如，抗HER2的單抗trastuzumab在治療乳腺癌的推薦初始劑量是4 mg/kg，在治療胃癌的推薦初始劑量是8 mg/kg；而抗CTLA4的單抗ipilimumab在治療黑色素瘤的推薦劑量3 mg/kg，在組合療法中劑量更低。Fab-HCAb結構的HER2 × CTLA4的HER2端的活性幾乎與其親代單抗相當，但是其CTLA4端的活性相對減弱，因而可以用來實現臨床上對CTLA4抑制劑的中低劑量的需求。此外，HER2 × CTLA4可以優先結合HER2，使其富集於HER2高度表現的腫瘤組織，進而減少CTLA4抗體在周邊系統非特異活化T細胞帶來的毒副作用。實施例 9  Fab-HCAb 結構的分子的藥代動力學研究
本實施例研究了具有Fab-HCAb結構的雙特異性結合蛋白分子PR004270 (序列見表7)在小鼠體內的藥代動力學性能。
給藥和採血：對於每一個測試抗體分子，選取體重18~22克的雌性BALB/c或者C57BL/6小鼠6隻，按5 mg/kg的劑量透過靜脈注射給與測試抗體分子。一組3隻於給藥前以及給藥後15分鐘、24小時(1天)、第4天、和第10天採集全血，另一組3隻於只於給藥前以及給藥後5小時、第2天、第7天、和第14天採集全血。將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後離心並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。
分析方法：採用兩種ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA方法一，即Fc端檢測方法，透過塗覆於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕捉小鼠血清中的含有人Fc的抗體，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。ELISA方法二，即功能結構域檢測方法，透過塗覆於96孔盤的PD-L1蛋白來捕捉小鼠血清中的特異辨識抗原的抗體，然後加入HRP標記的的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。最後，使用Phoenix WinNonlin軟體8.2版，選用非房室模型(NCA)分析藥代動力學參數。
圖16和表14中所示，Fab-HCAb結構的分子PR004270有與常規IgG抗體相似的血清半衰期t1/2 值，PD-L1端檢測方法顯示其t1/2 值超過10天。表 14 小鼠體內的藥代動力學參數
雙抗分子 PR004270
動物(數量) BALB/c 小鼠 (n=6)
抗體劑量 5 mg/kg, I.V.
PK 參數 Fc端檢測 PD-L1端檢測
T1/2 (小時) 465.6 256.5
Vd (mL/kg) 75.7 83.9
AUC (µg*小時/mL) 17,536 13,126
Cl (mL/小時/kg) 0.11 0.23
C0 (µg/mL) 119.7 81.7
本實施例說明了Fab-HCAb結構的分子具有優秀的藥代動力學性能。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
圖1為分子結構示意圖。 圖2顯示了PD-L1 × 4-1BB分子結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB的活性。 圖3顯示了PD-L1 × 4-1BB分子結合人PD-L1細胞CHO-K1/hPD-L1的活性。 圖4顯示了PD-L1 × 4-1BB分子在混合淋巴細胞反應(MLR)實驗中活化T細胞：(A) IL-2釋放位準；(B) IFN-γ釋放位準。 圖5顯示了B7H4 × 4-1BB分子結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB的活性。 圖6顯示了B7H4 × 4-1BB分子結合腫瘤細胞SK-BR-3的活性。 圖7顯示了B7H4 × 4-1BB分子透過SK-BR-3細胞媒介T細胞特異性活化。 圖8顯示了PD-L1 × 4-1BB分子透過CHO-K1/hPD-L1細胞媒介T細胞特異性活化。 圖9顯示了B7H4 × OX40分子結合人OX40細胞CHO-K1/hu OX40的活性。 圖10顯示了B7H4 × OX40分子結合腫瘤細胞SK-BR-3的活性。 圖11顯示了B7H4 × OX40分子透過人B7H4細胞CHO-K1/hB7H4媒介T細胞特異性活化。 圖12顯示了BCMA結合蛋白在NCI-H929細胞上的內化。 圖13顯示了用BLI方法測定BCMA結合蛋白與BCMA的親和力：(A) 重鏈抗體PR004433；(B) Fab-HCAb結構的雙特異性結合蛋白PR005744。 圖14顯示了HER2 × CTLA4分子結合腫瘤細胞SK-BR-3的活性。 圖15顯示了HER2 × CTLA4分子結合人CTLA4細胞CHO-K1/hCTLA4的活性。 圖16顯示了Fab-HCAb結構的分子PR004270在小鼠體內的藥代動力學。 圖17顯示了預測出的Fab-HCAb結構：(A) Fab-HCAb的三維結構模型，A1和A2是Fab端的抗原結合位址，B1和B2是VH端的抗原結合位址；(B) Fab-HCAb結構處於最為伸展狀態時，不同抗原結合位址之間的相對距離；(C) FIT-Ig結構處於最為伸展狀態時，不同抗原結合位址之間的相對距離。
<110> 大陸商和鉑醫藥(上海)有限責任公司(HARBOUR BIOMED(SHANGHAI)CO.,LTD)
<120> Fab-HCAb結構的結合蛋白
<140> TW110123881
<141> 2021-06-29
<150> CN202010618158.0
<151> 2020-06-30
<150> CN202010630471.6
<151> 2020-06-30
<150> CN202011423832.6
<151> 2020-12-08
<160> 184
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000184 HFWR1 Chothia
<400> 1
Figure 110123881-A0305-02-0103-1
Figure 110123881-A0305-02-0104-2
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 HFWR1 Chothia,PR000628 HFWR1 Chothia
<400> 2
Figure 110123881-A0305-02-0104-3
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
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<400> 3
Figure 110123881-A0305-02-0104-4
Figure 110123881-A0305-02-0105-5
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 HFWR1 Chothia
<400> 4
Figure 110123881-A0305-02-0105-6
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR001760 HFWR1 Chothia
<400> 5
Figure 110123881-A0305-02-0105-7
Figure 110123881-A0305-02-0106-8
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002067 HFWR1 Chothia
<400> 6
Figure 110123881-A0305-02-0106-9
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 HFWR1 Chothia
<400> 7
Figure 110123881-A0305-02-0106-10
Figure 110123881-A0305-02-0107-11
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 HFWR1 Chothia
<400> 8
Figure 110123881-A0305-02-0107-12
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004433 HFWR1 Chothia
<400> 9
Figure 110123881-A0305-02-0107-13
Figure 110123881-A0305-02-0108-14
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000184 HCDR1 Chothia
<400> 10
Figure 110123881-A0305-02-0108-15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 HCDR1 Chothia,PR000628 HCDR1 Chothia
<400> 11
Figure 110123881-A0305-02-0108-16
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 HCDR1 Chothia
<400> 12
Figure 110123881-A0305-02-0109-17
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 HCDR1 Chothia,PR000892 HCDR1 Chothia,PR002067 HCDR1 Chothia
<400> 13
Figure 110123881-A0305-02-0109-18
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR001760 HCDR1 Chothia
<400> 14
Figure 110123881-A0305-02-0110-19
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 HCDR1 Chothia
<400> 15
Figure 110123881-A0305-02-0110-20
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 HCDR1 Chothia
<400> 16
Figure 110123881-A0305-02-0110-21
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004433 HCDR1 Chothia
<400> 17
Figure 110123881-A0305-02-0111-22
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000184 HFWR2 Chothia
<400> 18
Figure 110123881-A0305-02-0111-23
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 HFWR2 Chothia
<400> 19
Figure 110123881-A0305-02-0112-24
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 HFWR2 Chothia
<400> 20
Figure 110123881-A0305-02-0112-25
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 HFWR2 Chothia
<400> 21
Figure 110123881-A0305-02-0113-26
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 HFWR2 Chothia
<400> 22
Figure 110123881-A0305-02-0113-27
<210> 23
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 HFWR2 Chothia
<400> 23
Figure 110123881-A0305-02-0114-28
<210> 24
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR001760 HFWR2 Chothia
<400> 24
Figure 110123881-A0305-02-0114-29
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002067 HFWR2 Chothia
<400> 25
Figure 110123881-A0305-02-0115-30
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 HFWR2 Chothia
<400> 26
Figure 110123881-A0305-02-0115-31
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 HFWR2 Chothia
<400> 27
Figure 110123881-A0305-02-0116-32
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004433 HFWR2 Chothia
<400> 28
Figure 110123881-A0305-02-0116-33
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000184 HCDR2 Chothia
<400> 29
Figure 110123881-A0305-02-0117-34
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 HCDR2 Chothia
<400> 30
Figure 110123881-A0305-02-0117-35
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 HCDR2 Chothia
<400> 31
Figure 110123881-A0305-02-0118-36
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 HCDR2 Chothia
<400> 32
Figure 110123881-A0305-02-0118-37
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 HCDR2 Chothia
<400> 33
Figure 110123881-A0305-02-0118-38
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 HCDR2 Chothia
<400> 34
Figure 110123881-A0305-02-0119-39
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR001760 HCDR2 Chothia
<400> 35
Figure 110123881-A0305-02-0119-40
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002067 HCDR2 Chothia
<400> 36
Figure 110123881-A0305-02-0120-41
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 HCDR2 Chothia
<400> 37
Figure 110123881-A0305-02-0120-42
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 HCDR2 Chothia
<400> 38
Figure 110123881-A0305-02-0121-43
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004433 HCDR2 Chothia
<400> 39
Figure 110123881-A0305-02-0121-44
<210> 40
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000184 HFWR3 Chothia
<400> 40
Figure 110123881-A0305-02-0121-45
Figure 110123881-A0305-02-0122-46
<210> 41
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 HFWR3 Chothia
<400> 41
Figure 110123881-A0305-02-0122-47
<210> 42
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 HFWR3 Chothia
<400> 42
Figure 110123881-A0305-02-0123-48
<210> 43
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 HFWR3 Chothia
<400> 43
Figure 110123881-A0305-02-0123-49
<210> 44
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 HFWR3 Chothia
<400> 44
Figure 110123881-A0305-02-0124-50
<210> 45
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 HFWR3 Chothia
<400> 45
Figure 110123881-A0305-02-0124-51
<210> 46
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR001760 HFWR3 Chothia
<400> 46
Figure 110123881-A0305-02-0125-52
<210> 47
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002067 HFWR3 Chothia
<400> 47
Figure 110123881-A0305-02-0125-53
Figure 110123881-A0305-02-0126-54
<210> 48
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 HFWR3 Chothia
<400> 48
Figure 110123881-A0305-02-0126-55
<210> 49
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 HFWR3 Chothia
<400> 49
Figure 110123881-A0305-02-0127-56
<210> 50
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004433 HFWR3 Chothia
<400> 50
Figure 110123881-A0305-02-0127-57
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000184 HCDR3 Chothia
<400> 51
Figure 110123881-A0305-02-0128-58
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 HCDR3 Chothia
<400> 52
Figure 110123881-A0305-02-0128-59
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 HCDR3 Chothia
<400> 53
Figure 110123881-A0305-02-0129-60
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 HCDR3 Chothia
<400> 54
Figure 110123881-A0305-02-0129-61
<210> 55
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 HCDR3 Chothia
<400> 55
Figure 110123881-A0305-02-0129-62
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 HCDR3 Chothia
<400> 56
Figure 110123881-A0305-02-0130-63
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR001760 HCDR3 Chothia
<400> 57
Figure 110123881-A0305-02-0130-64
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002067 HCDR3 Chothia
<400> 58
Figure 110123881-A0305-02-0131-65
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 HCDR3 Chothia
<400> 59
Figure 110123881-A0305-02-0131-66
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 HCDR3 Chothia
<400> 60
Figure 110123881-A0305-02-0132-67
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004433 HCDR3 Chothia
<400> 61
Figure 110123881-A0305-02-0132-68
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000184 HFWR4 Chothia,PR000265 HFWR4 Chothia,PR004433 HFWR4 Chothia
<400> 62
Figure 110123881-A0305-02-0132-69
Figure 110123881-A0305-02-0133-70
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 HFWR4 Chothia,PR000210 HFWR4 Chothia,PR002067 HFWR4 Chothia,PR002408 HFWR4 Chothia,PR003475 HFWR4 Chothia
<400> 63
Figure 110123881-A0305-02-0133-71
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 HFWR4 Chothia
<400> 64
Figure 110123881-A0305-02-0133-72
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 HFWR4 Chothia
<400> 65
Figure 110123881-A0305-02-0134-73
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR001760 HFWR4 Chothia
<400> 66
Figure 110123881-A0305-02-0134-74
<210> 67
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 LFWR1 Chothia
<400> 67
Figure 110123881-A0305-02-0135-75
<210> 68
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 LFWR1 Chothia,PR003475 LFWR1 Chothia
<400> 68
Figure 110123881-A0305-02-0135-76
<210> 69
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 LFWR1 Chothia
<400> 69
Figure 110123881-A0305-02-0136-77
<210> 70
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 LFWR1 Chothia
<400> 70
Figure 110123881-A0305-02-0136-78
<210> 71
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 LFWR1 Chothia
<400> 71
Figure 110123881-A0305-02-0137-79
<210> 72
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 LFWR1 Chothia
<400> 72
Figure 110123881-A0305-02-0137-80
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 LCDR1 Chothia
<400> 73
Figure 110123881-A0305-02-0138-81
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 LCDR1 Chothia
<400> 74
Figure 110123881-A0305-02-0138-82
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 LCDR1 Chothia
<400> 75
Figure 110123881-A0305-02-0138-83
Figure 110123881-A0305-02-0139-84
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 LCDR1 Chothia
<400> 76
Figure 110123881-A0305-02-0139-85
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 LCDR1 Chothia
<400> 77
Figure 110123881-A0305-02-0139-86
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 LCDR1 Chothia
<400> 78
Figure 110123881-A0305-02-0140-87
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 LCDR1 Chothia
<400> 79
Figure 110123881-A0305-02-0140-88
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 LFWR2 Chothia,PR000628 LFWR2 Chothia,PR002408
LFWR2 Chothia
<400> 80
Figure 110123881-A0305-02-0141-89
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 LFWR2 Chothia,PR000892 LFWR2 Chothia,PR003475 LFWR2 Chothia
<400> 81
Figure 110123881-A0305-02-0141-90
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 LFWR2 Chothia
<400> 82
Figure 110123881-A0305-02-0141-92
Figure 110123881-A0305-02-0142-93
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 LCDR2 Chothia,PR002408 LCDR2 Chothia
<400> 83
Figure 110123881-A0305-02-0142-94
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 LCDR2 Chothia
<400> 84
Figure 110123881-A0305-02-0142-95
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 LCDR2 Chothia
<400> 85
Figure 110123881-A0305-02-0143-96
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 LCDR2 Chothia
<400> 86
Figure 110123881-A0305-02-0143-97
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 LCDR2 Chothia
<400> 87
Figure 110123881-A0305-02-0144-98
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 LCDR2 Chothia
<400> 88
Figure 110123881-A0305-02-0144-99
<210> 89
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 LFWR3 Chothia,PR002408 LFWR3 Chothia
<400> 89
Figure 110123881-A0305-02-0144-100
Figure 110123881-A0305-02-0145-101
<210> 90
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 LFWR3 Chothia
<400> 90
Figure 110123881-A0305-02-0145-102
<210> 91
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 LFWR3 Chothia
<400> 91
Figure 110123881-A0305-02-0145-103
Figure 110123881-A0305-02-0146-104
<210> 92
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 LFWR3 Chothia
<400> 92
Figure 110123881-A0305-02-0146-105
<210> 93
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 LFWR3 Chothia
<400> 93
Figure 110123881-A0305-02-0146-106
Figure 110123881-A0305-02-0147-107
<210> 94
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 LFWR3 Chothia
<400> 94
Figure 110123881-A0305-02-0147-108
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 LCDR3 Chothia
<400> 95
Figure 110123881-A0305-02-0147-109
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 LCDR3 Chothia
<400> 96
Figure 110123881-A0305-02-0148-110
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 LCDR3 Chothia
<400> 97
Figure 110123881-A0305-02-0148-111
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 LCDR3 Chothia
<400> 98
Figure 110123881-A0305-02-0149-112
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 LCDR3 Chothia
<400> 99
Figure 110123881-A0305-02-0149-113
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 LCDR3 Chothia
<400> 100
Figure 110123881-A0305-02-0149-114
Figure 110123881-A0305-02-0150-115
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 LCDR3 Chothia
<400> 101
Figure 110123881-A0305-02-0150-116
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 LFWR4 Chothia,PR000628 LFWR4 Chothia,PR002408 LFWR4 Chothia
<400> 102
Figure 110123881-A0305-02-0150-117
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 LFWR4 Chothia,PR000265 LFWR4 Chothia,PR003475 LFWR4 Chothia
<400> 103
Figure 110123881-A0305-02-0151-118
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 LFWR4 Chothia
<400> 104
Figure 110123881-A0305-02-0151-119
<210> 105
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000184 VH
<400> 105
Figure 110123881-A0305-02-0152-120
<210> 106
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 VH
<400> 106
Figure 110123881-A0305-02-0153-121
<210> 107
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 VH
<400> 107
Figure 110123881-A0305-02-0154-122
<210> 108
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 VH
<400> 108
Figure 110123881-A0305-02-0155-123
<210> 109
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 VH
<400> 109
Figure 110123881-A0305-02-0156-124
<210> 110
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 VH
<400> 110
Figure 110123881-A0305-02-0157-125
<210> 111
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR001760 VH
<400> 111
Figure 110123881-A0305-02-0158-126
<210> 112
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002067 VH
<400> 112
Figure 110123881-A0305-02-0159-127
<210> 113
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 VH
<400> 113
Figure 110123881-A0305-02-0160-128
<210> 114
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 VH
<400> 114
Figure 110123881-A0305-02-0161-129
<210> 115
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004433 VH
<400> 115
Figure 110123881-A0305-02-0162-130
<210> 116
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 VL
<400> 116
Figure 110123881-A0305-02-0163-131
<210> 117
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 VL
<400> 117
Figure 110123881-A0305-02-0164-132
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 VL
<400> 118
Figure 110123881-A0305-02-0164-133
Figure 110123881-A0305-02-0165-134
<210> 119
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 VL
<400> 119
Figure 110123881-A0305-02-0165-135
Figure 110123881-A0305-02-0166-136
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 VL
<400> 120
Figure 110123881-A0305-02-0166-137
Figure 110123881-A0305-02-0167-138
<210> 121
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 VL
<400> 121
Figure 110123881-A0305-02-0167-139
Figure 110123881-A0305-02-0168-140
<210> 122
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 VL
<400> 122
Figure 110123881-A0305-02-0168-141
Figure 110123881-A0305-02-0169-142
<210> 123
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000184 HC
<400> 123
Figure 110123881-A0305-02-0169-143
Figure 110123881-A0305-02-0170-144
Figure 110123881-A0305-02-0171-145
<210> 124
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 HC
<400> 124
Figure 110123881-A0305-02-0171-146
Figure 110123881-A0305-02-0172-147
Figure 110123881-A0305-02-0173-148
Figure 110123881-A0305-02-0174-149
<210> 125
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 HC
<400> 125
Figure 110123881-A0305-02-0174-150
Figure 110123881-A0305-02-0175-151
Figure 110123881-A0305-02-0176-152
<210> 126
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 HC
<400> 126
Figure 110123881-A0305-02-0177-153
Figure 110123881-A0305-02-0178-154
Figure 110123881-A0305-02-0179-155
<210> 127
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 HC
<400> 127
Figure 110123881-A0305-02-0179-156
Figure 110123881-A0305-02-0180-157
Figure 110123881-A0305-02-0181-158
Figure 110123881-A0305-02-0182-159
<210> 128
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 HC
<400> 128
Figure 110123881-A0305-02-0182-160
Figure 110123881-A0305-02-0183-161
Figure 110123881-A0305-02-0184-162
<210> 129
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR001760 HC
<400> 129
Figure 110123881-A0305-02-0185-163
Figure 110123881-A0305-02-0186-164
Figure 110123881-A0305-02-0187-165
<210> 130
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002067 HC
<400> 130
Figure 110123881-A0305-02-0187-166
Figure 110123881-A0305-02-0188-167
Figure 110123881-A0305-02-0189-168
<210> 131
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 HC
<400> 131
Figure 110123881-A0305-02-0189-169
Figure 110123881-A0305-02-0190-170
Figure 110123881-A0305-02-0191-171
Figure 110123881-A0305-02-0192-172
<210> 132
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 HC
<400> 132
Figure 110123881-A0305-02-0192-173
Figure 110123881-A0305-02-0193-174
Figure 110123881-A0305-02-0194-175
<210> 133
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004433 HC
<400> 133
Figure 110123881-A0305-02-0195-176
Figure 110123881-A0305-02-0196-177
<210> 134
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000197 LC
<400> 134
Figure 110123881-A0305-02-0197-178
Figure 110123881-A0305-02-0198-179
<210> 135
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000210 LC
<400> 135
Figure 110123881-A0305-02-0198-180
Figure 110123881-A0305-02-0199-181
Figure 110123881-A0305-02-0200-182
<210> 136
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000265 LC,PR003550鏈，PR004268鏈，PR007163鏈
<400> 136
Figure 110123881-A0305-02-0200-183
Figure 110123881-A0305-02-0201-184
<210> 137
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000628 LC
<400> 137
Figure 110123881-A0305-02-0201-185
Figure 110123881-A0305-02-0202-186
Figure 110123881-A0305-02-0203-187
<210> 138
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000892 LC
<400> 138
Figure 110123881-A0305-02-0203-188
Figure 110123881-A0305-02-0204-189
<210> 139
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR002408 LC,PR003335鏈，PR004276鏈，PR004278鏈
<400> 139
Figure 110123881-A0305-02-0204-190
Figure 110123881-A0305-02-0205-191
Figure 110123881-A0305-02-0206-192
<210> 140
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003475 LC
<400> 140
Figure 110123881-A0305-02-0206-193
Figure 110123881-A0305-02-0207-194
<210> 141
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000305鏈，PR000653鏈，PR000654鏈，PR000655鏈，PR000706鏈
<400> 141
Figure 110123881-A0305-02-0208-195
Figure 110123881-A0305-02-0209-196
<210> 142
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000305鏈
<400> 142
Figure 110123881-A0305-02-0209-197
Figure 110123881-A0305-02-0210-198
Figure 110123881-A0305-02-0211-199
Figure 110123881-A0305-02-0212-200
<210> 143
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000653鏈
<400> 143
Figure 110123881-A0305-02-0212-201
Figure 110123881-A0305-02-0213-202
Figure 110123881-A0305-02-0214-203
Figure 110123881-A0305-02-0215-204
<210> 144
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000654鏈
<400> 144
Figure 110123881-A0305-02-0216-205
Figure 110123881-A0305-02-0217-206
Figure 110123881-A0305-02-0218-207
Figure 110123881-A0305-02-0219-208
<210> 145
<211> 580
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000655鏈
<400> 145
Figure 110123881-A0305-02-0219-209
Figure 110123881-A0305-02-0220-210
Figure 110123881-A0305-02-0221-211
Figure 110123881-A0305-02-0222-212
<210> 146
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000701鏈
<400> 146
Figure 110123881-A0305-02-0223-213
Figure 110123881-A0305-02-0224-214
<210> 147
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000701鏈，PR004270鏈，PR007164鏈
<400> 147
Figure 110123881-A0305-02-0224-215
Figure 110123881-A0305-02-0225-216
<210> 148
<211> 656
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000701鏈
<400> 148
Figure 110123881-A0305-02-0226-217
Figure 110123881-A0305-02-0227-218
Figure 110123881-A0305-02-0228-219
Figure 110123881-A0305-02-0229-220
<210> 149
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR000706鏈
<400> 149
Figure 110123881-A0305-02-0229-221
Figure 110123881-A0305-02-0230-222
Figure 110123881-A0305-02-0231-223
Figure 110123881-A0305-02-0232-224
<210> 150
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003335鏈
<400> 150
Figure 110123881-A0305-02-0233-225
Figure 110123881-A0305-02-0234-226
Figure 110123881-A0305-02-0235-227
Figure 110123881-A0305-02-0236-228
<210> 151
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR003550鏈
<400> 151
Figure 110123881-A0305-02-0236-229
Figure 110123881-A0305-02-0237-230
Figure 110123881-A0305-02-0238-231
Figure 110123881-A0305-02-0239-232
<210> 152
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004268鏈
<400> 152
Figure 110123881-A0305-02-0239-233
Figure 110123881-A0305-02-0240-234
Figure 110123881-A0305-02-0241-235
Figure 110123881-A0305-02-0242-236
<210> 153
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004270鏈
<400> 153
Figure 110123881-A0305-02-0243-237
Figure 110123881-A0305-02-0244-238
Figure 110123881-A0305-02-0245-239
Figure 110123881-A0305-02-0246-240
<210> 154
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004276鏈
<400> 154
Figure 110123881-A0305-02-0246-241
Figure 110123881-A0305-02-0247-242
Figure 110123881-A0305-02-0248-243
Figure 110123881-A0305-02-0249-244
<210> 155
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004277鏈，PR004279鏈
<400> 155
Figure 110123881-A0305-02-0250-245
Figure 110123881-A0305-02-0251-246
<210> 156
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004277鏈
<400> 156
Figure 110123881-A0305-02-0251-247
Figure 110123881-A0305-02-0252-248
Figure 110123881-A0305-02-0253-249
Figure 110123881-A0305-02-0254-250
<210> 157
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004278鏈
<400> 157
Figure 110123881-A0305-02-0255-251
Figure 110123881-A0305-02-0256-252
Figure 110123881-A0305-02-0257-253
Figure 110123881-A0305-02-0258-254
<210> 158
<211> 586
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR004279鏈
<400> 158
Figure 110123881-A0305-02-0258-255
Figure 110123881-A0305-02-0259-256
Figure 110123881-A0305-02-0260-257
Figure 110123881-A0305-02-0261-258
<210> 159
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR005744鏈
<400> 159
Figure 110123881-A0305-02-0261-259
Figure 110123881-A0305-02-0262-260
Figure 110123881-A0305-02-0263-261
<210> 160
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR005744鏈
<400> 160
Figure 110123881-A0305-02-0263-262
Figure 110123881-A0305-02-0264-263
Figure 110123881-A0305-02-0265-264
Figure 110123881-A0305-02-0266-265
<210> 161
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> GS_4
<400> 161
Figure 110123881-A0305-02-0266-266
<210> 162
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> GS_5
<400> 162
Figure 110123881-A0305-02-0267-267
<210> 163
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> GS_7
<400> 163
Figure 110123881-A0305-02-0267-268
<210> 164
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> GS_15
<400> 164
Figure 110123881-A0305-02-0268-269
<210> 165
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> GS_20
<400> 165
Figure 110123881-A0305-02-0268-270
<210> 166
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> GS_25
<400> 166
Figure 110123881-A0305-02-0269-271
<210> 167
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> H1_15
<400> 167
Figure 110123881-A0305-02-0269-272
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> LH1
<400> 168
Figure 110123881-A0305-02-0269-273
<210> 169
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> G5-LH
<400> 169
Figure 110123881-A0305-02-0270-274
<210> 170
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> H1_15-RT
<400> 170
Figure 110123881-A0305-02-0270-275
<210> 171
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> L-GS_15-RT
<400> 171
Figure 110123881-A0305-02-0271-276
<210> 172
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> L-H1_15-RT
<400> 172
Figure 110123881-A0305-02-0271-277
<210> 173
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> KL-H1_15-RT
<400> 173
Figure 110123881-A0305-02-0272-278
<210> 174
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> KL-H1_15-AS
<400> 174
Figure 110123881-A0305-02-0272-279
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> RT-GS_5-KL
<400> 175
Figure 110123881-A0305-02-0273-280
<210> 176
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> RT-GS_15-KL
<400> 176
Figure 110123881-A0305-02-0273-281
<210> 177
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> RT-GS_25-KL
<400> 177
Figure 110123881-A0305-02-0274-282
<210> 178
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> 人類IgG1樞紐
<400> 178
Figure 110123881-A0305-02-0274-283
<210> 179
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> 人類IgG1樞紐(C220S)
<400> 179
Figure 110123881-A0305-02-0275-284
<210> 180
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> 人類IgG2樞紐
<400> 180
Figure 110123881-A0305-02-0275-285
<210> 181
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> 人類IgG4樞紐
<400> 181
Figure 110123881-A0305-02-0275-286
<210> 182
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> 人類IgG4樞紐(S228P)
<400> 182
Figure 110123881-A0305-02-0276-287
<210> 183
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR007163鏈
<400> 183
Figure 110123881-A0305-02-0276-288
Figure 110123881-A0305-02-0277-289
Figure 110123881-A0305-02-0278-290
Figure 110123881-A0305-02-0279-291
<210> 184
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工的序列
<220>
<223> PR007164鏈
<400> 184
Figure 110123881-A0305-02-0280-292
Figure 110123881-A0305-02-0281-293
Figure 110123881-A0305-02-0282-294
Figure 110123881-A0305-02-0283-295

Claims (24)

  1. 一種含有至少兩個蛋白功能區的結合蛋白，其中，所述結合蛋白包括蛋白功能區A和蛋白功能區B；所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B標靶不同的抗原或相同抗原的不同表位；其中所述蛋白功能區A為Fab結構；所述蛋白功能區B為VH結構，所述結合蛋白還包括Fc同源二聚合體；所述蛋白功能區A的數量為二個，所述蛋白功能區B的數量為二個；所述結合蛋白為左右對稱的結構；所述結合蛋白從N末端至C末端依次為蛋白功能區A、蛋白功能區B和Fc同源二聚合體，其中所述蛋白功能區A與所述蛋白功能區B透過第一連接胜肽(L1)連接，所述蛋白功能區B與所述Fc透過第二連接胜肽(L2)連接；其中，所述結合蛋白具有四條多肽鏈，分別為兩條相同的短鏈和兩條相同的長鏈，其中，所述短鏈從N末端至C末端依次包括VH_A-CH1，所述長鏈從N末端至C末端依次包括VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3；其中，所述的VL_A和VH_A分別為所述蛋白功能區A的VL和VH，所述的VH_B為所述蛋白功能區B的VH；所述的CL是輕鏈恆定區結構域；所述的CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域；所述的L1或L2為連接胜肽。
  2. 如請求項1所述的結合蛋白，其中，所述L1和L2獨立地為如“-”、GS或如SEQ ID NOs：161-182的胺基酸序列所示。
  3. 如請求項1所述的結合蛋白，其中，所述抗原選自PD-L1、HER2、B7H4、CTLA4、OX40、4-1BB和BCMA中的一種或多種。
  4. 如請求項3所述的結合蛋白，其中，所述蛋白功能區A為來源於PD-L1抗體或其抗原結合片段、HER2抗體或其抗原結合片段、B7H4抗體或其抗原結合片段或BCMA抗體或其抗原結合片段的Fab，和/或，所述蛋白功能區B為來源於CTLA4抗體或其抗原結合片段、4-1BB抗體或其抗原結合片段、OX40抗體或其抗原結合片段或BCMA抗體或其抗原結合片段的VH。
  5. 如請求項4所述的結合蛋白，其中，所述蛋白功能區A為來源於HER2抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於CTLA4抗體或其抗原結合片段的VH；或，所述蛋白功能區A為來源於PD-L1抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於4-1BB抗體或其抗原結合片段的VH；或，所述蛋白功能區A為來源於B7H4抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於4-1BB抗體或其抗原結合片段的VH；或，所述蛋白功能區A為來源於B7H4抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於OX40抗體或其抗原結合片段的VH；或，所述蛋白功 能區A為來源於BCMA抗體或其抗原結合片段的Fab，且所述蛋白功能區B為來源於BCMA抗體或其抗原結合片段的VH。
  6. 如請求項4所述的結合蛋白，其中，所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：75、85和97所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：13、32和54所示；所述的B7H4抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：78、83和100所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：15、37和59所示；所述的4-1BB抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：14、35和57所示；所述的OX40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：13、36和58所示；所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3， 胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：17、39和61所示；或者，所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：77、87和99所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：13、34和56所示；所述的CTLA4抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：10、29和51所示；和/或，所述的HER2抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：74、84和96所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：12、31和53所示。
  7. 如請求項6所述的結合蛋白，其中，所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列，所述VH包括如SEQ ID NO：108所示的胺基酸序列；所述的B7H4抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包括如SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列，所述VH包括如SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列；所述的4-1BB抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列；所述的OX40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列；所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；或者，所述的BCMA抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包括如SEQ ID NO：120所示的胺基酸序列，所述VH包括如SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列；所述的CTLA4抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO：105所示的胺基酸序列；和/或所述的HER2抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含如SEQ ID NO：117所示的胺基酸序列，所述VH包含如SEQ ID NO：107所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項4所述的結合蛋白，其中，所述結合蛋白含有蛋白功能區A和蛋白功能區B： 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：75、85和97所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：13、32和54所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：14、35和57所示；或，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：78、83和100所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：15、37和59所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：14、35和57所示；或，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：78、83和100所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：15、37和59所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：13、36和58所示；或， 所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：77、87和99所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：13、34和56所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所示胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：17、39和61；或，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：74、84和96所示；所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：12、31和53所示；並且，所述蛋白功能區B包含重鏈可變區(VH)，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，胺基酸序列分別如SEQ ID NOs：10、29和51所示。
  9. 如請求項8所述的結合蛋白，其中，所述結合蛋白含有蛋白功能區A和蛋白功能區B：所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO：118所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO：108所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO：111所示的重鏈可變區；或，所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO：121所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO： 113所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO：111所示的重鏈可變區；或，所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO：121所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO：113所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO：112所示的重鏈可變區；或，所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO：120所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO：110所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO：115所示的重鏈可變區；或，所述蛋白功能區A包含胺基酸序列如SEQ ID NO：117所示的輕鏈可變區和胺基酸序列如SEQ ID NO：107所示的重鏈可變區；所述蛋白功能區B包含胺基酸序列如SEQ ID NO：105所示的重鏈可變區。
  10. 如請求項9所述的結合蛋白，其中，所述結合蛋白包含兩種不同的多肽鏈：第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：147所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：153所示的胺基酸序列；或，所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：147所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：184所示的胺基酸序列；或， 所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：155所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：158所示的胺基酸序列；或，所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：155所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：156所示的胺基酸序列；或，所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：159所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：160所示的胺基酸序列；或，所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：141所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：142所示的胺基酸序列；或，所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：141所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：143所示的胺基酸序列；或，所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：141所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：144所示的胺基酸序列；或，所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：141所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：145所示的胺基酸序列；或，所述第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：141所示的胺基酸序列，和所述第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：149所示的胺基酸序列。
  11. 如請求項1所述的結合蛋白，其中，所述的結合蛋白中，所述Fab結構中的輕鏈恆定區(CL)為人輕鏈恆定區；和/或，所述的結合蛋白中，所包含的重鏈恆定區(CH)為人重鏈恆定區或其突變。
  12. 如請求項11所述的結合蛋白，其中，所述突變選自C220S、N297A、L234A、L235A、G237A和P329G中的一種或多種突變，所述突變位址使用EU編號規則。
  13. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-12任一項所述的結合蛋白。
  14. 一種重組表現載體，其包含如請求項13所述的分離的核酸。
  15. 一種轉形株，其包含如請求項13所述的分離的核酸或如請求項14所述的重組表現載體。
  16. 一種結合蛋白的製備方法，其包含培養如請求項15中所述的轉形株，從培養物中獲得結合蛋白。
  17. 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物包含如請求項1-12任一項所述的結合蛋白，以及藥學上可接受的載劑。
  18. 如請求項17所述的藥物組成物，其中，所述藥物組成物還包括其他抗腫瘤抗體作為活性成分。
  19. 一種套組，其包括如請求項1-12任一項所述的結合蛋白和/或如請求項17或18所述的藥物組成物；所述套組還包括(i)施用結合蛋白或藥物組成物的裝置；和/或(ii)使用說明。
  20. 一種套裝藥盒，其特徵在於，所述套裝藥盒包括藥盒一和藥盒二，所述藥盒一包括如請求項1-12任一項所述的結合蛋白和/或如請求項17或18所述的藥物組成物，所述藥盒二包括其它抗體或藥物組成物。
  21. 一種給藥裝置，其特徵在於，所述給藥裝置包括如請求項1-12任一項所述的結合蛋白和/或如請求項17或18所述的藥物組成物；所述給藥裝置還包括容納或將所述合蛋白和/或所述藥物組成物施用於受試者的組件。
  22. 一種如請求項1-12中任一項所述的結合蛋白、如請求項17或18所述的藥物組成物、如請求項19所述的套組、如請求項20所述的套裝藥盒和/或如請求項21所述的給藥裝置在製備診斷、預防和/或治療癌症或其他疾病的藥物中的應用。
  23. 如請求項22所述的應用，其中，所述的癌症選自乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤、結直腸癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤中的一種或多種。
  24. 一種體外檢測特異性抗原的方法，其包括使用如請求項1-12中任一項所述的結合蛋白進行檢測。
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