TWI817200B - 一種檢測標的dna序列基因型是否變異之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種檢測標的DNA序列基因型是否變異之方法，包含：(a)提供待偵測是否具變異基因型之標的DNA序列；(b)提供第一探針；(c)提供第二探針；(d)去除未能同時進行雜交及連接反應的第一探針及第二探針；以及(e)偵測成功雜交及連接反應之探針的數位磁珠其變異位點資訊與探針之標記，最終獲得該標的DNA序列基因型變異與否的資訊。
Description
本發明係提供一種用以檢測標的DNA序列基因型是否變異之方法，以獲得該標的DNA序列基因型變異與否的資訊。
單核甘酸多型性(single nucleotide polymorphism, SNP)為DNA序列中單一鹼基對的變異，即DNA序列中A、T、C或G的改變造成序列中一定位點出現兩個或多個核甘酸結合可能性的情形。目前已知的SNP中，以T(thymin)、C(gytosine)發生單一鹼基對突變的比例最為高，約占已知SNP變異情形的三分之二。而SNP亦為人體中最常見的一種遺傳變異型態，每個人DNA上所發生的SNP情形皆不相同，使得SNP成為一種新興的基因標記技術。
因此透過SNP與基因資料庫結合的分析方式，可達到SNP與人類癌症關係的研究；此外，整合SNP基因檢測的結果與受檢者之生活狀態、營養狀況及生活型態等因素，再藉由大數據資料分析，亦可將SNP用於各項人類疾病風險與性狀特徵的結果預測中，故如何有效地進行SNP之檢測成為未來趨勢。
目前已知用於SNP檢測技術的原理主要是雜交反應(hybridization)與聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)，然現行基於雜交反應亦或是聚合酶連鎖反應的SNP檢測效率皆極低，皆僅可進行單一SNP的檢測；多點SNP的檢測技術上有諸多限制；且多仰賴肽核酸(Peptide nucleic acid, PNA)、鎖核酸(Locked nucleic acid, LNA)的使用，大幅增加檢測成本。因此如何提高SNP的檢測效率以及降低其檢測成本成為一大挑戰。
有鑑於此，為解決上述問題，本發明之主要目的係提供一種檢測標的DNA序列基因型是否變異之方法，包含：(a)提供標的DNA序列，具有一待偵測是否變異之基因型；(b)提供複數個第一探針，其中第一探針具有一與標的DNA互補之第一核苷酸序列片段，且第一核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，而第一核苷酸序列片段之第1端為欲偵測之變異位點，且第一核苷酸序列片段之第2端接有一數位磁珠，每一數位磁珠對應每一第一核苷酸序列片段之第1端之欲偵測之變異位點資訊；(c)提供複數個第二探針，其中第二探針具有一與標的DNA互補之第二核苷酸序列片段，第二核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，第二核苷酸序列片段之第1端帶有一標記，且第二核苷酸序列片段之第2端帶有磷酸根或第一核苷酸序列片段之第1端帶有磷酸根，第一核苷酸序列片段與第二核苷酸序列片段互補於標的DNA之位置相連，而可同時進行雜交及連接反應；(d)去除未能同時進行雜交及連接反應之第一探針及第二探針；及(e)偵測成功雜交及連接反應之第一探針之數位磁珠之變異位點資訊與第二探針之標記，獲得標的DNA序列之基因型變異與否之資訊。
根據本發明之一個或多個實施例，第一核苷酸序列片段之第1端為3’端，第2端為5’端，且第二核苷酸序列片段之第1端為3’端，第2端為5’端並帶有磷酸根。
根據本發明之一個或多個實施例，第一核苷酸序列片段之第1端為5’端，第2端為3’端，且第二核苷酸序列片段之第1端為5’端並帶有磷酸根，第2端為3’端。
根據本發明之一個或多個實施例，第一核甘酸序列片段及/或第二核甘酸序列片段之長度介於20~100bp。
根據本發明之一個或多個實施例，第一核甘酸序列片段及/或第二核甘酸序列片段之長度介於50~100bp。
根據本發明之一個或多個實施例，標記可經生物素化(biotinylated) 作用達到螢光發光之生物標記。
根據本發明之一個或多個實施例，步驟(a)~(c)可同時進行。
根據本發明之一個或多個實施例，第一探針與第二探針之添加比例為1:1。
根據本發明之一個或多個實施例，DNA序列基因型變異包含點(point)突變、插入(insertion)突變、缺失(deletion)突變、重複(duplication)突變或移碼(frameshift)突變。
根據本發明之一個或多個實施例，該檢測標的DNA序列基因型是否變異之方法可用於進行單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism, SNP)之基因分型分析。
本發明之另一主要目的係提供一種檢測標的DNA序列基因型是否變異之套組，包含：(1)複數個第一探針，其中第一探針具有一與標的DNA互補之第一核苷酸序列片段，第一核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，第一核苷酸序列片段之第1端為欲偵測之變異位點，且第一核苷酸序列片段之第2端接有一數位磁珠，每一數位磁珠對應每一第一核苷酸序列片段之第1端之欲偵測之變異位點資訊；(2)複數個第二探針，其中第二探針具有一與標的DNA互補之第二核苷酸序列片段，第二核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，第二核苷酸序列片段之第1端帶有一標記，且第二核苷酸序列片段之第2端帶有磷酸根或第一核苷酸序列片段之第1端帶有磷酸根，第一核苷酸序列片段與第二核苷酸序列片段互補於標的DNA之位置相連，而可同時進行雜交及連接反應；及(3) 反應試劑。
由上述可知，本發明相較於習知的SNP檢測方式具有以下優點：
1. 可同時進行多點SNP檢測，大幅提高SNP的檢測效率。
2. 不須使用肽核酸(Peptide nucleic acid, PNA)以及鎖核酸(Locked nucleic acid, LNA)，大幅降低檢測成本。
3. 可使用多種類型之數位磁珠或是自行設計磁珠，達到降低檢測成本或是客製化之效。
4. 本發明之方法不限於SNP檢測，亦可應用於其他DNA序列之基因型變異之測定，如點突變、插入突變、缺失突變、重排突變或移碼突變，應用範圍廣泛。
為使本發明技術內涵更加詳盡與完備，以下針對本發明的實施態樣與具體實施例進行說明，但以下說明並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式，倘本領域中具通常知識者透過以下敘述可輕易明瞭此發明之必要技術內容，且在不違反其中的精神及範圍下多樣地改變及修飾此發明來適應不同用途及狀況，如此，其他的實施態樣亦屬於本發明的申請專利範圍。
本文中所使用之詞彙中，除非上下文另有載明，則「一」及「該」亦可解釋為複數。
本文中所使用之詞彙中，除非上下文另有載明，則「包含」、「包括」、「具有」或「含有」係包含性或開放性，並不排除其他未闡述之元素或方法步驟。
本文中所使用之詞彙中，除非上下文另有載明，則「大約」或「約」係指具有接近或可允許的誤差範圍，用於避免本發明所揭示之準確或絕對的數值受未知的第三方非法或非正當使用。因此，除非另有相反的說明，本文中所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。
本發明之主要目的係提供一種檢測標的DNA序列基因型是否變異之方法，包含：(a)提供標的DNA序列，具有一待偵測是否變異之基因型；(b)提供複數個第一探針，其中第一探針具有一與標的DNA互補之第一核苷酸序列片段，且第一核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，而第一核苷酸序列片段之第1端為欲偵測之變異位點，且第一核苷酸序列片段之第2端接有一數位磁珠，每一數位磁珠對應每一第一核苷酸序列片段之第1端之欲偵測之變異位點資訊；(c)提供複數個第二探針，其中第二探針具有一與標的DNA互補之第二核苷酸序列片段，第二核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，第二核苷酸序列片段之第1端帶有一標記，且第二核苷酸序列片段之第2端帶有磷酸根或第一核苷酸序列片段之第1端帶有磷酸根，第一核苷酸序列片段與第二核苷酸序列片段互補於標的DNA之位置相連，而可同時進行雜交及連接反應；(d)去除未能同時進行雜交及連接反應之第一探針及第二探針；及(e)偵測成功雜交及連接反應之第一探針之數位磁珠之變異位點資訊與第二探針之標記，獲得標的DNA序列之基因型變異與否之資訊。
本發明之另一主要目的係提供一種檢測標的DNA序列基因型是否變異之套組，包含：(1)複數個第一探針，其中第一探針具有一與標的DNA互補之第一核苷酸序列片段，第一核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，第一核苷酸序列片段之第1端為欲偵測之變異位點，且第一核苷酸序列片段之第2端接有一數位磁珠，每一數位磁珠對應每一第一核苷酸序列片段之第1端之欲偵測之變異位點資訊；(2)複數個第二探針，其中第二探針具有一與標的DNA互補之第二核苷酸序列片段，第二核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，第二核苷酸序列片段之第1端帶有一標記，且第二核苷酸序列片段之第2端帶有磷酸根或第一核苷酸序列片段之第1端帶有磷酸根，第一核苷酸序列片段與第二核苷酸序列片段互補於標的DNA之位置相連，而可同時進行雜交及連接反應；及(3) 反應試劑。
本文中所使用之術語「DNA序列基因型」，係指包含構成生物體內DNA序列的所有基因型態。其中該生物體包含但不限於哺乳類以及非哺乳類，前述哺乳動物包括但不限於：人類、非人靈長類動物、綿羊、狗、鼠類囓齒動物(如：小鼠、大鼠等)、天竺鼠、貓、兔、牛、馬；前述非哺乳動物包括但不限於：雞、兩棲類動物及爬行類動物。
本文中所使用之術語「變異」，係指生物體細胞內的基因於細胞分裂時發生基因複製錯誤，或基因於複製時受化學物質、基因毒性、輻射、病毒等影響所產生的基因變異情形。其中，該變異情形可為單個鹼基改變的點(point)突變，包含同義突變(synonymous mutation)、沉默突變(silent mutation)、錯義突變(missense mutation)、移碼突變(frameshift mutation)、無義突變(nonsense mutation)；或多個鹼基改變的大突變，包含缺失(deletion)、重排和插入(insertion)，其中重排突變包含重複(duplication)、倒位(inversion)以及易位(translocation)。
本文中所使用之術語「單一核苷酸多型性」，係指因DNA序列中單一鹼基對的變異造成序列中一定位點出現兩個或多個核甘酸結合可能性的情形，且該兩個或多個核甘酸結合可能性的情形係指分布於一特定種群中1%以上的個體中。
本文中所使用之術語「基因分型分析」，係指透過個體中單一核苷酸多型性之差異達到依個體基因型態分類之分析方式。
本文中所使用之術語「探針」，係指可與標的DNA序列專一性互補之核苷酸序列片段，且該核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，其中，該第1端可為欲偵測之變異位點(亦即，其最末位置設計為互補於該變異位點)，該第2端可接有一數位磁珠，且該數位磁珠可對應核苷酸序列片段之第1端欲偵測之變異位點資訊；或者該第1端可帶有一可經生物素化作用產生螢光之標記，該第2端可帶有磷酸根，可經酵素作用與其他探針進行連接反應。其中該第1端可為3’端或5’端；該第2端可為3’端或5’端。
本文中所使用之術語「磁珠」，係指帶有磁性之磁性載體，可透過磁性分離技術進行分離，且具備感應磁力並隨之移動的特性，其中，該磁性載體泛指顆粒、磁粒或薄膜型式等感磁性固相載體。依據本發明之一實施例，以顆粒或磁粒狀之磁性載體為較佳的實施態樣，故以下將泛稱磁性載體為「磁珠」，但並非用以限制本發明之磁性分離系統係採用磁珠作為磁性載體。
本文中所使用之術語「數位磁珠」，係指於晶圓上蝕刻出特定記號以作為條碼辨識使用之晶圓磁珠，較佳係使用半導體微米等級者，且該晶圓磁珠上帶有對應每一核苷酸序列片段之第1端欲偵測之變異位點資訊，且可經由可見光掃描該資訊，確認其所代表的變異位點。依據本發明之一實施例，該數位磁珠可為穩銀科技股份有限公司所生產之DMB(Digital Molecular Barcode)、瑞慈生物科技股份有限公司所生產之BMB(Barcoded Magnetic Bead)或博錸生技股份有限公司所生產之пCode。
本文中所使用之術語「標記」，係指可經生物素化作用之高敏感性及高特異性之生物標記(biomarker) 。依據本發明之一實施例，該標記可為生物素(biotin)。
本文中所使用之術語「雜交」，係指將第一探針所帶有之第一核苷酸序列片段與第二探針所帶有之第二核苷酸序列片段互補於標的DNA位置之過程。
本文中所使用之術語「連接」，係指將第一探針所帶有之第一核苷酸序列片段之第1端(即3’端)與第二探針所帶有之第二核苷酸序列片段之第2端(即帶有磷酸根之5’端)接合(ligation)的過程；或是將第一探針所帶有之第一核苷酸序列片段之第1端(即帶有磷酸根之5’端)與第二探針所帶有之第二核苷酸序列片段之第2端(即3’端)的過程接合(ligation)的過程。
本文中所使用之術語「生物素化(biotinylated)」，係指將生物素共價連接到蛋白質、核酸或其它分子上的過程。依據本發明之一實施例，該生物素化可為生物素與鏈親和素(streptavidin, SA) 的結合過程，其中，該鏈親和素之一端帶有螢光。
本文中所使用之術語「反應試劑」，係指包含有可使第一探針所帶有之第一核苷酸序列片段與第二探針所帶有之第二核苷酸序列片段互補於標的DNA位置的雜交試劑；以及使第一探針所帶有之第一核苷酸序列片段之一端與第二探針所帶有之第二核苷酸序列片段之一端進行連接反應的試劑。
本文中所使用之術語「酵素」，係指可將第一探針所帶有之第一核苷酸序列片段之一端與第二探針所帶有之第二核苷酸序列片段之一端進行接合反應的酵素。依據本發明之一實施例，該酵素可為DNA接合酶(ligase) ，其可藉由形成磷酸雙脂鍵將DNA在3'端的尾端與5'端的前端連在一起，其中該DNA接合酶包含但不限於哺乳類細胞之第I、II、III、IV型之DNA接合酶或T4噬菌體所攜帶的DNA連接酶(T4 DNA ligase)。
在本發明實施例中，第一探針之第一核甘酸序列片段及/或第二探針之第二核甘酸序列片段長度可為10~100bp，例如20~100bp、30~100bp、40~100bp、50~100bp、60~100bp、70~100bp、80~100bp、90~100bp。於一較佳實施例中，該第一探針之第一核甘酸序列片段及/或第二探針之第二核甘酸序列片段長度為20~100bp，更佳為50~100bp。
在本發明實施例中，反應試劑之作用時間可為10到60分鐘，例如10到30分鐘、40到60分鐘。於一較佳實施例中，該作用時間為20分鐘。
在本發明實施例中，第一探針與第二探針的比例可約為1~3:3~1，例如1:1、2:1、3:1、1:2、1:3。於一較佳實施例中，第一探針與第二探針的比例約為1:1。
在本發明實施例中，模板與探針的體積比可約為1~3:3~1，例如1:1、2:1、3:1、1:2、1:3。於一較佳實施例中，該模板與探針的體積比約為2:1。
因此，本發明透過將第一探針與第二探針同時與標的DNA雜交，兩探針與該標的DNA雜交後由於其中之一探針帶有磷酸根，且反應試劑中含有能使核苷酸序列片段進行接合反應的酵素，因此成功雜交的第一探針與第二探針可進行連結反應，而不會被後續的清洗步驟去除；該成功雜交且連結的第一探針帶有數位磁珠，且第二探針帶有標記且該標記可進一步放大並產生螢光，故以可見光掃描第一探針的數位磁珠，以及以螢光判斷第二探針確認發光，並可視實驗結果訂出螢光閾值，超過該閾值代表該數位磁珠帶有的變異位點有檢出。
本發明以下敘述為此技術領域中具通常知識者可輕易明瞭此發明之必要技術內容，倘在不違反其中的精神及範圍下多樣的改變及修飾此發明來適應不同的用途及狀況，如此，其他的實施態樣亦屬於本發明的申請專利範圍。
實施例
1
：檢測單一
SNP
位點
(single SNP detection)
本實施例以下針對家豬第6號染色體(NCBI Reference Sequence: NC_010448.4)上之第94601670號核苷酸位置的SNP位點其基因型(genotype)進行檢測，該位點之野生型(wild-type)位點為A，突變型(mutation)位點為G，其SNP在該交替基因座(allele)上組合有AA、AG與GG三種型態。
事前準備
根據下表1進行探針之設計。
表1 探針編號與檢測之SNP位點型態
| 探針編號 | 序列 | 數位磁珠編號 |
| 空白探針 | 核苷酸序列(未耦合(coupling)核苷酸(oligo)之數位磁珠) | 0 |
| 第一探針 (P1A) | GCTCAGGGTCAAGGTGGAAAGGCCA (SEQ ID NO. 1) | 3551 |
| 第一探針 (P1B) | GCTCAGGGTCAAGGTGGAAAGGCCG (SEQ ID NO. 2) | 4092 |
| 第二探針 (P1S) | GGTAGACACATGGAA (SEQ ID NO. 3) | N/A |
其中，第一探針為依據SNP位點多態性類型進行設計，因此若為兩種多態性可將第一探針設計為A與B；三種多態性可設計為A、B與C；四種多態性可設計為A、B、C與D。此處實施例1以兩種多態性為例來進行第一探針之設計，故將第一探針設計為P1A、P1B。然第一探針之設計並不限於此。
其中，第二探針為可與第一探針(P1)連接之序列，故將第二探針設計為P1S。
其中，空白探針係作為校正螢光基礎值使用。
根據下表2進行反應試劑的製備。
表2 反應試劑配方
| 組分 | 含量(μl) |
| 無菌去離子水 | 12 |
| 10X擴增酶反應緩衝液 | 2 |
| 第一探針 P1 (P1A+ P1B) | 1 |
| 第二探針 P1S | 1 |
| 空白探針 | 1 |
| 酵素 | 1 |
| 模板 (PCR產物) | 2 |
| 總計 | 20 |
實驗步驟
1. 將家豬第6號染色體以PCR進行放大，並控制放大的PCR產物片段大小在100-600 bp之間，以作為檢測之模板使用。
2. 於PCR產物中加入反應試劑，使模板與反應試劑同時進行雜交與連結反應20分鐘，使該試劑中的第一探針(P1A及P1B)、第二探針(P1S)與模板進行雜交；以及使第一探針(P1 A及P1B)與第二探針(P2S)透過酵素進行連接，產生數位磁珠-核酸-螢光標記產物，以作為螢光分析使用。
3. 以緩衝溶液去除未能與模板進行雜交之第一探針(P1 A及P1B)以及未能與第一探針P1進行連結之第二探針(P1S)。
4. 以具備螢光分析系統之螢光顯微鏡進行螢光標記之偵測。
5. 資料分析，讀取第一探針(P1)其數位磁珠所帶之變異位點資訊。
6. 結果判定，判定檢測標的DNA序列其基因型是否變異。
實驗結果
根據螢光顯微鏡之螢光分析偵測結果，讀取第一探針(P1 A及P1B)其數位磁珠變異位點資訊，進行檢測標的DNA序列基因型的判讀，實驗結果如下表3與圖1所示。
表3 家豬第6號染色體之第94601670號核苷酸單一SNP位點基因型檢測結果
*:以空白探針校正後螢光強度為0表無偵測到該特定編號之數位磁珠資訊。
| 樣本編號 | 數位磁珠編號 | 磁珠數目 | 螢光強度(校正)* | 探針基因型 | 樣本基因型 |
| 1 | 3551 | 423 | 1247 | A | A/G |
| 4092 | 383 | 1440 | G | ||
| 2 | 3551 | 349 | 0 | - | GG |
| 4092 | 438 | 1617 | G | ||
| 3 | 3551 | 430 | 1570 | A | AA |
| 4092 | 462 | 0 | - | ||
| 4 | 3551 | 342 | 1732 | A | AA |
| 4092 | 342 | 0 | - | ||
| 5 | 3551 | 352 | 1821 | A | AA |
| 4092 | 453 | 0 | - | ||
| 6 | 3551 | 360 | 2277 | A | A/G |
| 4092 | 466 | 1938 | G | ||
| 7 | 3551 | 405 | 0 | - | GG |
| 4092 | 448 | 1706 | G | ||
| 8 | 3551 | 396 | 2225 | A | AA |
| 4092 | 410 | 0 | - |
圖1之單一SNP螢光分析偵測照片結果中，以數位磁珠編號0之螢光訊號強度3679，與其它數位磁珠編號0之訊號強度平均後，作為螢光背景校正值後，可發現數位磁珠編號3551其平均螢光訊號強度為4923，較磁珠編號4092之平均螢光訊號強度3662強，可知磁珠編號3551其第一探針與第二探針的雜交與連接反應成功；所有樣本經分析後，可確認樣本1至樣本6其DNA序列基因型。
實施例
2
：檢測多個
SNPs
位點
(Multiplex SNPs detection)
本實施例以下針對家豬其三個SNP位點之基因型(genotype)進行偵測，其中，SNP位點一位於家豬6號染色體(NCBI Reference Sequence: NC_010448.4)上第94601670個核苷酸位置，該位點野生型(wild-type)位點為A，突變型(mutation)位點為G，其SNP在該交替基因座(allele)上組合有AA、AG與GG三種型態；SNP位點二位於家豬15號染色體(NCBI Reference Sequence: NC_010457.5)上第50030058個核苷酸位置，該位點野生型(wild-type)位點為A，突變型(mutation)位點為C，其SNP在該交替基因座(allele)上組合有AA、AC與CC三種型態；SNP位點三位於家豬X染色體(NCBI Reference Sequence: NC_010461.5)上第117766407個核苷酸位置，該位點野生型(wild-type)位點為A，突變型(mutation)位點為G，其SNP在該交替基因座(allele)上組合有AA、AG與GG三種型態。
本實施例同實施例1同樣係以兩種多態性為例來進行第一探針之設計，然與實施例1不同之處在於，本實施例同時偵測3個SNP位點。
事前準備
根據下表4進行探針之設計。
表4 探針編號與檢測之SNP位點型態
| 偵測位點 | 探針編號 | 序列 | 數位磁珠編號 |
| 無 | 空白探針 | 核苷酸序列(未耦合(coupling)核苷酸(oligo)之數位磁珠) | 0 |
| 位點一 | 第一探針 (P1A) | GCTCAGGGTCAAGGTGGAAAGGCCA (SEQ ID NO. 4) | 4090 |
| 第一探針 (P1B) | GCTCAGGGTCAAGGTGGAAAGGCCG (SEQ ID NO. 5) | 4085 | |
| 第二探針 (P1S) | GGTAGACACATGGAA (SEQ ID NO. 6) | N/A | |
| 位點二 | 第一探針 (P2A) | GGACTTGGAAATAGAGAGAATTGGA (SEQ ID NO. 7) | 4075 |
| 第一探針 (P2B) | GGACTTGGAAATAGAGAGAATTGGC (SEQ ID NO. 8) | 4055 | |
| 第二探針 (P2S) | AGATGTCATTTTTAT (SEQ ID NO. 9) | N/A | |
| 位點三 | 第一探針 (P3A) | TTTCAAGCTATAATTTCTGAGTATA (SEQ ID NO. 10) | 4015 |
| 第一探針 (P3B) | TTTCAAGCTATAATTTCTGAGTATG (SEQ ID NO. 11) | 3935 | |
| 第二探針 (P3S) | CTTGGCACTCTCTGC (SEQ ID NO. 12) | N/A |
此處實施例2以三個SNP位點的偵測為例來進行第一探針之設計，故將第一探針P1設計為P1A、P1B用於偵測SNP位點一；第一探針P2設計為P2A、P2B用於偵測SNP位點二；第一探針P3設計為P3A、P3B用於偵測SNP位點三。然第一探針之設計並不限於此。
此外，設計偵測三個SNP位點之第二探針，第二探針設計為P1S為可與第一探針P1連接之序列，故；第二探針P2S為可與第一探針P2連接之序列\；第二探針P3S為可與第一探針P3連接之序列。
其中，空白探針係作為校正螢光基礎值使用。
根據下表5進行反應試劑的製備。
表5 反應試劑配方
| 組分 | 含量 (μl) |
| 無菌去離子水 | 9 |
| 10X擴增酶反應緩衝液 | 2 |
| 第一探針 P1 (P1A+ P1B) | 1 |
| 第二探針 P1S | 1 |
| 第一探針 P2 (P2A+ P2B) | 1 |
| 第二探針 P2S | 1 |
| 第一探針 P3 (P3A+ P3B) | 1 |
| 第二探針 P3S | 1 |
| 酵素 | 1 |
| 模板(多重PCR產物) | 2 |
| 總計 | 20 |
實驗步驟
1. 將家豬第6號染色體(NCBI Reference Sequence: NC_010448.4)以多重PCR進行放大，並控制放大的PCR產物片段大小在100-600 bp之間，以作為檢測模板使用。
2. 於PCR產物中加入反應試劑，使模板與反應試劑同時進行雜交與連結反應20分鐘，使該試劑中的第一探針(P1、P2、P3)、第二探針(P1S、P2S、P3S)與多個模板進行雜交；以及使第一探針(P1、P2、P3)與第二探針(P1S、P2S、P3S)透過酵素進行連接，產生數位磁珠-核酸-螢光標記產物，以作為螢光分析使用。
3. 以緩衝溶液去除未能與模板進行雜交之第一探針(P1、P2、P3)以及未能與第一探針(P1、P2、P3)進行連結之第二探針(P1S、P2S、P3S)。
4. 以具備螢光分析系統之螢光顯微鏡進行螢光標記之偵測。
5. 資料分析，讀取第一探針(P1、P2、P3)其數位磁珠所帶之變異位點資訊。
6. 結果判定，判定檢測標的DNA序列其基因型是否變異。
實驗結果
根據螢光顯微鏡之螢光分析偵測解果，讀取第一探針(P1、P2、P3)其數位磁珠變異位點資訊，進行檢測標的DNA序列基因型的判讀，實驗結果如下表6與圖2所示。
表6 家豬第6號染色體之第94601670號核苷酸多SNPs位點基因型檢測結果
*:以空白探針校正後螢光強度為0表無偵測到該特定編號之數位磁珠資訊。
| 樣本編號 | 數位磁珠編號 | 磁珠數目 | 螢光強度(校正)* | 探針基因型 | 樣本基因型 |
| 1 | 4090 | 303 | 1783 | A | A/G |
| 4085 | 352 | 1789 | G | ||
| 4075 | 355 | 1278 | A | AA | |
| 4055 | 342 | 0 | - | ||
| 4015 | 345 | 0 | - | GG | |
| 3935 | 491 | 1864 | G | ||
| 2 | 4090 | 437 | 0 | - | GG |
| 4085 | 383 | 1987 | G | ||
| 4075 | 455 | 1163 | A | AA | |
| 4055 | 334 | 0 | - | ||
| 4015 | 420 | 1648 | A | AG | |
| 3935 | 439 | 1761 | G | ||
| 3 | 4090 | 324 | 1781 | A | AG |
| 4085 | 462 | 1725 | G | ||
| 4075 | 468 | 1314 | A | AG | |
| 4055 | 389 | 1631 | G | ||
| 4015 | 388 | 1897 | A | AA | |
| 3935 | 329 | 0 | - | ||
| 4 | 4090 | 306 | 1879 | A | AG |
| 4085 | 380 | 1720 | G | ||
| 4075 | 489 | 1348 | A | AA | |
| 4055 | 475 | 0 | - | ||
| 4015 | 475 | 0 | - | GG | |
| 3935 | 315 | 1419 | G | ||
| 5 | 4090 | 405 | 1650 | A | AG |
| 4085 | 451 | 1820 | G | ||
| 4075 | 460 | 1789 | A | AC | |
| 4055 | 499 | 1605 | G | ||
| 4015 | 448 | 1685 | A | AG | |
| 3935 | 425 | 1330 | G |
圖2之為本實施例樣品5之多個SNPs位點之螢光分析偵測照片中，以空白探針(數位磁珠編號0，僅於圖2中呈現)之螢光訊號強度3627，與其它數位磁珠編號0之訊號強度平均後，作為螢光背景校正值後，可發現數位磁珠編號4075、4055、3935 、4015之螢光訊號強度較強，因此可知該等編號磁珠之第一探針與第二探針之雜交及連接反應成功；另數位磁珠編號4090因其平均螢光訊號強度為5292，較接近背景值，可知其探針之雜交及連接反應與模板間的反應較差，故可做為判斷基因型之參考，由此可確認樣本1至5DNA序列基因型。
綜上所述，相較於習知的SNP檢測方式，本發明可同時進行多點SNP檢測，大幅提高SNP的檢測效率；且不須使用肽核酸(Peptide nucleic acid, PNA)以及鎖核酸(Locked nucleic acid, LNA)，大幅降低檢測成本；另亦可使用多種類型之數位磁珠或是自行設計磁珠，達到降低檢測成本或是客製化之效；此外，本發明之方法不限於SNP檢測，亦可應用於其他DNA序列之基因型變異之測定，如點突變、插入突變、缺失突變、重排突變或移碼突變，應用範圍廣泛。
以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者僅為本發明之一較佳實施態樣與實施例而已，並非用以此限定本發明之範圍，即任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內當可進行之均等變化與修飾，皆仍屬本發明所涵蓋的保護範圍。
無
圖1係單一SNP位點之螢光分析偵測照片。
圖 2 係多個SNPs位點之螢光分析偵測照片。
無。
序列表
<![CDATA[<110> 中國文化大學]]>
<![CDATA[<120> 一種檢測標的DNA序列基因型是否變異之方法]]>
<![CDATA[<160> 12 ]]>
<![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]>
<![CDATA[<210> 1]]>
<![CDATA[<211> 25]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 探針]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<221> 未知_特徵]]>
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<![CDATA[<400> 1]]>
gctcagggtc aaggtggaaa ggcca 25
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ggtagacaca tggaa 15
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Claims (11)
- 一種檢測標的DNA序列基因型是否變異之方法，包含：(a)提供該標的DNA序列，該標的DNA序列具有一待偵測是否變異之基因型；(b)提供複數個第一探針，其中該第一探針具有一與該標的DNA互補之第一核苷酸序列片段，該第一核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，該第一核苷酸序列片段之該第1端為欲偵測之變異位點，且該第一核苷酸序列片段之第2端接有一數位磁珠，每一數位磁珠對應每一該第一核苷酸序列片段之第1端之欲偵測之變異位點資訊；(c)提供複數個第二探針，其中該第二探針具有一與該標的DNA互補之第二核苷酸序列片段，該第二核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，該第二核苷酸序列片段之該第1端帶有一標記，且該第二核苷酸序列片段之該第2端帶有磷酸根或該第一核苷酸序列片段之第1端帶有磷酸根，該第一核苷酸序列片段與該第二核苷酸序列片段互補於標的DNA之位置相連，而可同時進行雜交及連接反應；(d)去除未能同時進行雜交及連接反應之第一探針及第二探針；及(e)偵測成功雜交及連接反應之第一探針之數位磁珠之變異位點資訊與第二探針之標記，獲得該標的DNA序列之基因型變異與否之資訊。
- 如請求項1之方法，其中該第一核苷酸序列片段之該第1端為3’端，該第一核苷酸序列片段之該第2端為5’端，且其中該第二核苷酸序列片段之該第1端為3’端，該第二核苷酸序列片段之該第2端為5’端並帶有磷酸根。
- 如請求項1之方法，其中該第一核苷酸序列片段之該第1端為5’端，該第一核苷酸序列片段之該第2端為3’端，且其中該第二核苷酸序列片段之該第1端為5’端並帶有磷酸根，該第二核苷酸序列片段之該第2端為3’端。
- 如請求項1至3任一項之方法，其中該第一核苷酸序列片段及/或該第二核苷酸序列片段之長度介於20~100bp。
- 如請求項4之方法，其中該，其中該第一核苷酸序列片段及/或該第二核苷酸序列片段之長度介於50~100bp。
- 如請求項5之方法，其中該標記為可經生物素化(biotinylated)作用達到螢光發光之生物標記。
- 如請求項1至3任一項之方法，其中該步驟(a)~(c)係可同時進行。
- 如請求項1至3任一項之方法，其中該第一探針與該第二探針之添加比例為1：1。
- 如請請求項1至3任一項之方法，其中該DNA序列基因型變異包含、點(point)突變、插入(insertion)突變、缺失(deletion)突變、重排突變或移碼(frameshift)突變。
- 如請求項1至3任一項之方法，其可用於進行單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)之基因分型分析。
- 一種檢測標的DNA序列基因型是否變異之套組，其包含：(1)至少一第一探針，其中該第一探針具有一與該標的DNA互補之第一核苷酸序列片段，該第一核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，該第一核苷酸序列片段之該第1端為欲偵測之變異位點，且該第一核苷酸序列片段之第2端接有一數位磁珠，每一數位磁珠對應每一該第一核苷酸序列片段之第1端之欲偵測之變異位點資訊；(2)一第二探針，其中該第二探針具有一與該標的DNA互補之第二核苷酸序列片段，該第二核苷酸序列片段具有第1端跟第2端，該第二核苷酸序列片段之該第1端帶有一標記，且該第二核苷酸序列片段之該第2端帶有磷酸根或該第一核 苷酸序列片段之第1端帶有磷酸根，該第一核苷酸序列片段與該第二核苷酸序列片段互補於標的DNA之位置相連，而可同時進行雜交及連接反應；及(3)反應試劑，其包含一酵素，用以於適當條件下催化該連接反應。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW110135314A TWI817200B (zh) | 2021-09-23 | 2021-09-23 | 一種檢測標的dna序列基因型是否變異之方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW110135314A TWI817200B (zh) | 2021-09-23 | 2021-09-23 | 一種檢測標的dna序列基因型是否變異之方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202313983A TW202313983A (zh) | 2023-04-01 |
| TWI817200B true TWI817200B (zh) | 2023-10-01 |
Family
ID=86943325
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| TW110135314A TWI817200B (zh) | 2021-09-23 | 2021-09-23 | 一種檢測標的dna序列基因型是否變異之方法 |
Country Status (1)
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|---|---|
| TW (1) | TWI817200B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102449169B (zh) * | 2009-04-01 | 2016-03-16 | 德克斯特里蒂诊断公司 | 化学连接依赖性的探针扩增(clpa) |
| US9709559B2 (en) * | 2000-06-21 | 2017-07-18 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays |
-
2021
- 2021-09-23 TW TW110135314A patent/TWI817200B/zh active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9709559B2 (en) * | 2000-06-21 | 2017-07-18 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays |
| CN102449169B (zh) * | 2009-04-01 | 2016-03-16 | 德克斯特里蒂诊断公司 | 化学连接依赖性的探针扩增(clpa) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202313983A (zh) | 2023-04-01 |
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