TWI813934B - 一種雙特異性抗pd-l1/vegf抗體及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭露提供了雙特異性抗VEGF x PD-L1抗體或其抗原結合部分，產生該雙特異性抗體或其抗原結合部分的方法，以及該雙特異性抗體或其抗原結合部分在用於治療疾病例如癌症中的用途。

Description

一種雙特異性抗PD-L1/VEGF抗體及其用途

對相關申請的交叉引用

本申請要求2020年1月21日提交的中國專利申請202010070440.X的優先權，其全部內容通過提述併入本文。

序列表

本申請包含電子形式的序列表，其全部內容通過引用併入本文。

本揭露一般涉及雙特異性抗PD-L1 x VEGF抗體，用於製備該抗體的方法及其用途。

血管產生對於腫瘤生長和轉移進展至關重要。控制腫瘤相關的血管產生是一種有前景的癌症治療策略。血管內皮生長因數(VEGF)是血管產生的關鍵介導物，已在各種類型的人類癌症中得到驗證。腫瘤細胞釋放與附近內皮細胞結合的生長因數(例如VEGF)，從而啟動訊號傳導級聯反應，刺激內皮細胞分裂並形成新血管。VEGF通過其受體VEGFR進行的訊號傳導在許多實體瘤的血管產生和生長中起著至關重要的作用。靶向VEGF途徑的抗血管產生藥物，例如Avastin(貝伐單抗(Bevacizumab))，已在臨床上取得成功。

另一方面，靶向免疫檢查點分子例如程式性死亡配體1(PD-L1)或其受體程式性死亡1(PD-1)已顯示出有前景的臨床成功。PD-L1表達與各種類型的癌症的不良預後密切相關。抗PD-L1抗體可以靶向在腫瘤細胞和腫瘤浸潤性免疫細胞上表達的PD-L1，防止與T細胞表面上的PD-1和B7.1結合， 還可以啟動T細胞以及募集其他T細胞來攻擊腫瘤，然後使免疫系統能夠抵抗多種類型的癌症。

除了已確立的抗血管產生作用外，抗VEGF療法還可以進一步增強抗PD-1/PD-L1療法恢復抗癌免疫力的能力，其通過抑制VEGF相關的免疫抑制、促進T細胞的腫瘤浸潤以及引發和啟動針對腫瘤抗原的T細胞應答等來實現。因此，開發將抗血管產生治療和免疫檢查點抑制結合起來的VEGF和PD-L1雙特異性抗體可以在癌症治療中取得有前景的成果。

儘管靶向VEGF以及靶向PD-1/PD-L1療法具有明顯的益處，但是仍然存在大量未滿足的需求。15%-20%的患者對抗VEGF治療無應答，而且越來越多的證據表明，將抗VEGF藥劑長期用於癌症治療會增強腫瘤耐藥性。3%-9%的患者形成了治療的免疫原性。此外，總體生存時間的延長有限和安全性問題受限，包括骨骼形態的變化、腎小球病變伴隨腎臟炎症、以及腎上腺中空泡形成的減少伴隨炎症。阻斷PD-1/PD-L1途徑的免疫檢查點抑制劑(例如nivolumab、pembrolizumab和atezolizumab)代表了患有多種癌症的患者的標準治療選擇。但是，這些藥物在未選擇人群中的應答率為14-23%，在患有表達PD-L1的腫瘤的患者中的應答率為16-48%，這些藥物在部分而非所有患者中都能提供更好的治療效果。

因此，非常需要開發新的抗PD-L1/抗VEGF雙特異性抗體。在本揭露中，產生了能夠同時以高親和力結合人PD-L1和VEGF，阻斷PD-1/PD-L1和VEGF/VEGFR兩者的訊號傳導，並顯示出優越的抗腫瘤功效的雙特異性抗體。

廣義而言，本揭露涉及提供具有改善功效的抗體的化合物、方法、組合物和製品。本揭露提供的益處廣泛地適用於抗體治療和診斷領域，並且可以與能夠與各種靶標反應的抗體聯合使用。

在一方面，本揭露提供一種雙特異性抗體或其抗原結合部分，其包含與VEGF抗原結合模組聯合的PD-L1抗原結合模組，其中：該PD-L1抗原結合模組包含：包含SEQ ID NO：1的互補決定區(CDR)1、包含SEQ ID NO：2的CDR2、和包含SEQ ID NO：3的CDR3；和該VEGF抗原結合模組包含：包含SEQ ID NO：4的重鏈互補決定區(HCDR)1、包含SEQ ID NO：5的HCDR2、包含SEQ ID NO：6的HCDR3、包含SEQ ID NO：7的輕鏈互補決定區(LCDR)1、包含SEQ ID NO：8的LCDR2、以及包含SEQ ID NO：9的LCDR3。

在某些實施方案中，如本文揭露的PD-L1抗原結合模組包含可變域，其包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10至少85%、90%、或95%相同的胺基酸序列。

在某些實施方案中，如本文揭露的VEGF抗原結合模組包含：重鏈可變域，其包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列或與SEQ ID NO：11至少85%、90%、或95%相同的胺基酸序列；和輕鏈可變域，其包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列或與SEQ ID NO：12至少85%、90%、或95%相同的胺基酸序列。

在某些實施方案中，該PD-L1抗原結合模組融合於該VEGF抗原結合模組的N末端。在一些其它的實施方案中，該PD-L1抗原結合模組融合於該VEGF抗原結合模組的C末端。

在某些實施方案中，該PD-L1抗原結合模組來自單域抗體(sdAb)，例如VHH抗體。該VHH可以衍生自駱駝科動物，包括羊駝(alpaca)和美洲駝(llama)。較佳地，該VHH是人源化VHH。

在某些實施方案中，該PD-L1抗原結合模組可操作地連接於該VEGF抗原結合模組的輕鏈或重鏈的N末端，任選地經由接頭。該接頭可以包含2至4個拷貝的GGGGS(G4S)或由其組成，例如該接頭可以是(G4S)₂。所述包括1個GGGGS(G4S)的接頭定義為SEQ ID NO：15。

在某些實施方案中，如本文揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分包含重鏈和輕鏈，其中：該重鏈包含如VH-CH1-鉸鏈-Fc中可操作連接的域，其中VH-CH1來自該VEGF抗原結合模組；和該輕鏈包含如VHH-VL-CL中可操作連接的域，其中VHH來自該PD-L1抗原結合模組且VL-CL來自該VEGF抗原結合模組。

在某些實施方案中，該Fc區是人IgG Fc區，較佳為人IgG1 Fc區。

在某些實施方案中，本揭露提供了一種雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中重鏈包含SEQ ID NO：13，輕鏈包含SEQ ID NO：14。

在某些實施方案中，如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分是人源化抗體。

在一方面，本揭露提供了分離的核酸分子，其包含編碼如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分的核酸序列。

在一方面，本揭露提供了包含如本文中揭露的核酸分子的載體。在一方面，本揭露提供了包含如本文中揭露的核酸分子或載體的宿主細胞。

在一方面，本揭露提供了包含如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分以及藥學可接受的載體的藥物組合物。

在一方面，本揭露提供了一種產生如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分的方法，包括以下步驟：- 在宿主細胞中表達該抗體或其抗原結合部分；和- 從該宿主細胞分離抗體或其抗原結合部分。

在一方面，本揭露提供了一種調控受試者中免疫應答的方法，包括對該受試者施用如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分或藥物組合物。

在一方面，本揭露提供了一種抑制受試者中腫瘤細胞生長的方法，包括對該受試者施用有效量的如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分或藥物組合物。

在一方面，本揭露提供了一種預防或治療受試者中癌症的方法，包括對該受試者施用有效量的如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分或藥物組合物。該癌症可選自結腸癌、結直腸癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、腎癌、膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、淋巴瘤、黑素瘤、肝癌和頭頸癌。在某些實施方案中，該癌症為結腸癌或結直腸癌。

在一些實施方案中，該雙特異性抗體或其抗原結合部分可與化療劑、放療及/或用於癌症免疫治療的其他藥劑組合施用。

在一方面，本揭露提供了如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其用於：i)調控PD-L1/VEGF有關的免疫應答；ii)增強T細胞增殖和細胞因數產生；及/或iii)刺激免疫應答或功能，例如激發針對癌細胞的免疫應答。

在一方面，本揭露提供了如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分用於診斷、預防或治療癌症。

在一方面，本揭露提供了如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分在製備用於調控受試者中的免疫應答或抑制腫瘤細胞生長的藥物中的用途。

在一方面，本揭露提供了如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分在製備用於治療或預防癌症的藥物中的用途。

在一方面，本揭露提供了一種試劑盒，其包含如本文中揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分。該試劑盒可用於疾病或病況(例如癌症)的檢測、診斷、預後或治療。

以上內容是一概述，因此必要時包含細節的簡化、概括和省略；因此，本領域技術人員將認識到，該概述僅是舉例說明性的，並不意圖以任何方式進行限制。本文所述的方法、組合物及/或裝置及/或其他主題的其它方面、特徵和優勢將在本文所示的教導中變得明顯。提供概述以簡化地介紹一些選擇的概念，這些概念將在下面的詳細描述中進一步描述。本概述不旨在確定所要求保護的主題的關鍵特徵或基本特徵，也不旨在用作確定所要求保護的主題的範圍的輔助手段。此外，貫穿本申請引用的所有參考文獻、專利和揭露的專利申請的內容通過引用整體併入本文。

MFI:均值螢光強度

PBS:磷酸鹽緩衝鹽水

圖1顯示了W3256抗體的示意圖。

圖2顯示了W3256抗體的SDS-PAGE(第1泳道)。NuPAGE(Novex 4-12% Bis-Tris)凝膠中，NR：非還原性狀態，R：還原性狀態，M：PageRuler^TM未染色蛋白質梯度。

圖3顯示了W3256抗體的HPLC-SEC結果。

圖4顯示了W3256抗體的DSF概況。

圖5顯示了W3256抗體對人VEGF(與食蟹猴VEGF相同)的ELISA結合結果。WBP332-1.80.12×Ab.hIgG1是同種型對照。

圖6顯示了W3256抗體對人PD-L1的FACS結合結果。

圖7顯示了W3256抗體對VEGF和之後的PD-L1的雙重結合結果。

圖8顯示了W3256抗體對PD-L1和之後的VEGF的雙重結合結果。

圖9顯示了W3256抗體對食蟹猴PD-L1的FACS結合結果。

圖10顯示了W3256抗體對小鼠VEGF的ELISA結合結果。

圖11顯示了W3256抗體對小鼠PD-L1的FACS結合結果。

圖12至圖13顯示了W3256抗體對人PD-L1(圖12)和VEGF(圖13)的SPR傳感圖譜。

圖14至圖15顯示了W3256抗體在人VEGF結合上與人VEGFR1的競爭(圖14)，以及在人PD-L1結合上與人PD-1的競爭(圖15)。

圖16至圖17顯示了W3256抗體在人VEGF結合上與小鼠VEGFR1的競爭(圖16)，以及在小鼠PD-L1結合上與小鼠PD-1的競爭(圖17)。

圖18顯示了抗體對HUVEC細胞增殖的抑制。

圖19顯示了抗體報導基因測定(RGA)的效果。

圖20顯示了抗體在MLR中對hCD4+T細胞的IFN-γ分泌的效果。“Combo”表示WBP325-BMK3.uIgG1和W315-BMK8.uIgG1K(RKNA)的聯用。

圖21顯示了在總IgG結合測定中在單次靜脈內注射等摩爾劑量的抗體之後W3256抗體的小鼠PK分析。“mpk”是“mg/kg”的縮寫。

圖22顯示了在雙重抗原結合測定中在單次靜脈內注射等摩爾劑量的抗體之後W3256抗體的小鼠PK分析。

圖23顯示了在PBMC-RKO小鼠癌症模型中抗體的功效。

雖然本發明可以以許多不同的形式來實施，但在此揭露的是驗證本發明原理的其具體的舉例說明性實施方案。應該強調的是，本發明不限於所舉例說明的具體實施方案。此外，本文使用的任何章節標題僅用於組織目的，並不被解釋為限制所描述的主題。

除非在此另外定義，否則與本發明結合使用的科學和技術術語將具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數形式的術語應包括複數形式，複數形式的術語應包括單數形式。更具體地，如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式“一”，“一個”和“該”包括複數指示物。因此，例如，提及“一種蛋白質”包括多種蛋白質；提及“一細胞”包括細胞的混合物等。在本申請中，除非另有說明，否則使用“或”意指“及/或”。此外，術語“包含”以及其他形式(諸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，說明書和所附申請專利範圍中提供的範圍包括端點和中斷點之間的所有值。

通常，與本文描述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白質以及核酸化學和雜交有關的術語以及其技術是本領域眾所週知和常用的術語。除非另有說明，否則本發明的方法和技術通常根據本領域公知的常規方法進行，並如在本說明書全文中引用和討論的各種通用和更具體的參考文獻中所述進行。參見例如Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology，第6版，W.B.Saunders Company(2010)；Sambrook J.& Russell D.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley,John & Sons,Inc.(2002)；Harlow和Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1998)；和Coligan等人，Short Protocols in Protein Science，Wiley,John & Sons,Inc.(2003)。與本文描述的分析化學，合成有機化學和藥物和藥物化學有關的術語以及實驗室程式和技術是本領域中眾所週知和常用的術語。

定義

為了更好地理解本發明，相關術語的定義和解釋提供如下。

術語“抗體”或“Ab”在本文中以最廣泛含義使用，其涵蓋多種抗體結構，包括多選殖抗體、單特異性和多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。天然的完整抗體通常是指包含通過共價二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)多肽鏈的Y形四聚體蛋白。抗體的輕鏈可以分為κ和λ輕鏈。重鏈可分為μ、δ、γ、α和ε，它們分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區通過約12個或更多個胺基酸的“J”區與恆定區連接，並且重鏈還包含約3個或更多個胺基酸的“D”區。每條重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。VH和VL區可以進一步分為由相對保守的區域(稱為框架區(FR))間隔開的高變區(稱為互補決定區(CDR))。每個VH和VL由以下順序的3個CDR和4個FR組成：從N端到C端的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每個重鏈/輕鏈對的可變區(VH和VL)分別形成抗原結合位點。胺基酸在各種區域或結構域中的分佈遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia & Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：878-883中的定義。抗體可以具有不同的抗體同種型，例如IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。

術語抗體的“抗原結合部分”或“抗原結合片段”，可以在本申請的上下文中互換使用，是指包含全長抗體的片段的多肽，其保留了與全長抗體特異性結合的抗原特異性結合的能力，及/或其與全長抗體競爭結合相同的抗原。一般而言，參見Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.編，第二版，Raven Press，N.Y.(1989)，其出於所有目的通過引用併入本文。抗體的抗原結合片段可使用任何適合的標準技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及編碼抗體可變結構域和任選地恆定結構域的DNA的操作和表達的重組基因工程技術，衍生自例如全抗體分子。這樣的DNA為已知的及/或可容易地從例如商業來源、DNA文庫(包括，例如噬菌體-抗體文庫)取得，或是可合成的。DNA可用化學或通過使用分子生物技術來測序和操作，例如，以將一或複數可變及/或恆定結構域排列成適合的構型，或導入密碼子、產生半胱氨酸殘基、修飾、增加或刪除胺基酸等。

抗原結合片段的非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模擬抗體高變區的胺基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR)，例如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子，例如結構域特異性抗體、單結構域抗體、結構域刪除的抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫藥物(SMIP)及鯊可變IgNAR結構域，也涵蓋在文中所用的表達法“抗原結合片段”內。在某些實施方案中，抗體的抗原結合片段可以含有與至少一恆定結構域共價連接的至少一可變結構域。可變結構域和恆定結構域可以彼此直接連接或可以通過完整或部分鉸鏈或接頭區域連接。鉸鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60個或更多個)胺基酸組成，其導致單個多肽分子中相鄰的可變及/或恆定結構域之間的可撓性或半可撓性連接。

如本文中使用的，術語抗體的“可變域/可變結構域”指包含一或複數CDR的抗體可變區或其片段。儘管可變域可以包含完整的可變區(如HCVR或LCVR)，但也可以包含少於完整的可變區但仍然保留結合抗原或形成抗原結合位點的能力。

如本文中使用的，術語“抗原結合模組”是指由包含一或複數CDR的抗體的一部分形成的抗體片段，或與抗原結合但不包含完整天然抗體結構的任何其他抗體片段。與通常指可變結構域的術語“抗原結合位點”不同，抗原結合模組除了可變結構域之外還可以包含恆定結構域。抗原結合模組的例子包括但不限於，可變結構域、可變區、雙抗體、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫化鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫化鍵穩定的雙抗體(dsdiabody)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體(nanobody)、域抗體、和二價域抗體。抗原結合模組能與親本抗體結合相同的抗原。在某些實施方案中，抗原結合模組可以是Fab片段或VHH抗體。在一些實施方案中，抗原結合模組可包含來自特定人抗體的一或複數CDR嫁接到來自一或複數不同人抗體的框架區上。抗原結合模組的詳細形式的更多描述參見Spiess等人，Molecular Immunology，67(2)，第95-106頁(2015)，和Brinkman等人，mAbs,9(2)，第182-212頁(2017)，其通過提述完整併入本文。

抗體的“Fab”是指抗體的以下部分，其由單個輕鏈(可變區和恆定區均有)與單個重鏈的可變區和第一恆定區通過二硫鍵聯合組成。在某些實施方案中，輕鏈和重鏈的二恆定區均被TCR恆定區替換。

抗體的“Fc”是指抗體的以下部分，其包含第一重鏈的第二(CH2)和第三(CH3)恆定區經由二硫鍵聯合第二重鏈的第二和第三恆定區。在提及Fc區時，根據上下文，可以指Fc區的一條鏈或兩條鏈。抗體的Fc部分負責多種效應器功能例如ADCC和CDC，但並不在抗原結合中發揮功能。抗體經由其Fc域 啟動和調節效應器功能的能力是其體內保護性活性的關鍵部分。儘管以前認為抗體的中和活性僅僅是Fab-抗原相互作用的結果，但越來越多的證據表明其體內活性還高度依賴於IgG Fc域與其相關受體Fcγ受體(FcγR)之間的相互作用，這些受體在效應器淋巴細胞表面上表達。

術語“PD-L1”，也稱為程式性死亡配體1，是一種40kDa的1型跨膜蛋白，據推測在抑制免疫系統的適應性臂中起主要作用。PD-L1是程式性死亡1(PD-1)的主要配體，PD-1是一種共抑制性受體，可以在髓樣、淋巴樣、正常上皮細胞和癌症中組成性表達或誘導。如本文所用，術語“PD-L1”在指PD-L1蛋白的胺基酸序列時，包括全長PD-L1蛋白，或PD-L1的胞外域(PD-L1 ECD)或含有PD-L1 ECD的片段；還包括PD-L1 ECD的融合蛋白，例如與小鼠或人(mFc或hFc)的IgG Fc融合的片段。此外，如本領域技術人員所理解的，PD-L1蛋白也將包括那些天然或人工引入胺基酸序列的突變(包括但不限於置換、缺失及/或添加)而不影響生物學功能的蛋白。

如本文所用，術語“結合PD-L1的抗體”或“抗PD-L1抗體”包括特異性識別PD-L1的抗體及其抗原結合片段。本揭露的抗體和抗原結合片段可以結合可溶性PD-L1蛋白及/或細胞表面表達的PD-L1。可溶性PD-L1包括天然PD-L1蛋白以及缺少跨膜結構域或與細胞膜不相關聯的重組PD-L1蛋白變體。如本文所用，表述“抗PD-L1抗體”包括具有單一特異性的單價抗體，以及包含結合PD-L1的第一抗原結合位點和結合第二(靶)抗原的第二抗原結合位點的雙特異性抗體，其中抗PD-L1抗原結合位點包含如本文表A所述的重鏈可變區/輕鏈可變區或CDR序列的任意一種或多種。抗PD-L1雙特異性抗體的實例在本文其他地方描述。術語“抗原結合分子”包括抗體和抗體的抗原結合片段，包括例如雙特異性抗體。

術語“VEGF”(血管內皮生長因數，也稱為VEGF-A)是細胞產生的訊號蛋白，其刺激血管形成。VEGF是胱氨酸結(cystine-knot)生長因數的血小板衍生的生長因數家族的一子家族。它們是參與血管發生(胚胎循環系統從頭形成)和血管產生(來自現有血管的血管生長)的重要訊號傳導蛋白。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF(胎盤生長因數)、VEGF-E(Orf-VEGF)和Trimeresurus flavoviridis svVEGF。

如本文所用，“VEGF受體”或“VEGFR”是指血管內皮生長因數(VEGF)的受體。有三種子類型的VEGFR，編號為1、2和3。根據其可選的剪接，VEGF受體可以是結合膜的或者可溶的。在VEGF受體中，VEGFR-1結合VEGF-A、PlGF和VEGF-B。

如本文所用，“雙特異性”抗體是指具有源自兩種不同單選殖抗體的片段並能夠結合兩種不同表位元元的人工抗體。兩個表位可以存在於相同的抗原上，或者它們可以存在於兩種不同的抗原上。

術語“雙特異性抗原結合分子”是指包含至少第一抗原結合結構域(在本文中也稱為第一抗原結合位點)和第二抗原結合結構域(在本文中也稱為第二抗原結合位點)的蛋白質、多肽或分子複合物。在一些實施方案中，“雙特異性抗原結合分子”是“雙特異性抗體”。雙特異性抗體內的每個抗原結合結構域包含至少一CDR，其單獨地或與一或複數另外的CDR及/或FR組合地特異性結合特定抗原。在本發明的上下文中，第一抗原結合位點特異性結合第一抗原(例如PD-L1)，並且第二抗原結合位點特異性結合第二不同抗原(例如VEGF)。

術語“抗PD-L1/抗VEGF抗體”、“抗PD-L1/抗VEGF雙特異性抗體”、“針對PD-L1和VEGF的抗體”、“抗PD-L1×VEGF雙特異性抗體”、“PD-L1×VEGF抗體”在本文中可交換使用，其是指特異性結合PD-L1和VEGF的雙特異性抗體。

如本文所用，術語“單選殖抗體”或“mAb”是指單分子成分的抗體分子製劑。單選殖抗體顯示對特定表位元的單一結合特異性和親和力。

如本文所用，術語“嵌合抗體”是指其中可變區序列衍生自一物種而恆定區序列衍生自另一物種的抗體，例如其中可變區序列衍生自小鼠抗體而恆定區序列衍生自人抗體的抗體。

術語“人源化抗體”意指其中衍生自另一哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR序列已嫁接到人框架序列上的抗體。可以在人框架序列內進行其他框架區修飾。

術語“可操作地連接”是指二或複數感興趣的生物序列的並置(帶有或不帶有間隔區或接頭)以使得它們處於允許以預期方式起作用的關係。就多肽而言，是指以允許連接的產物具有預期的生物學功能的方式連接多肽序列。例如，抗體可變區可以可操作地連接於恆定區，以便提供具有抗原結合活性的穩定產物。該術語也可以關於多核苷酸使用。舉例來說，當編碼多肽的多核苷酸可操作地連接於調節序列(例如啟動子、增強子、沉默子序列等)時，其意指多核苷酸序列以允許調節多肽從該多核苷酸的表達的方式連接。

如本文所用，術語“Ka”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而本文所用的術語“Kd”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的解離速率。抗體的Kd值可以使用本領域良好建立的方法來確定。如本文所用，術語“KD”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的解離常數，其從Kd與Ka的比率(即，Kd/Ka)獲得並且表示為摩爾濃度(M)。確定抗體Kd的較佳方法是通過使用表面電漿共振，較佳使用生物感測器系統如Biacore®系統。

如本文所用的術語IgG抗體的“高親和力”是指標對靶抗原具有1×10^-7M或更低，更佳5×10^-8M或更低，甚至更佳1×10^-8M或更低，甚至更佳5×10^-9M或更低，和甚至更佳1×10^-9M或更低的K_D的抗體。

如本文所用，術語“EC₅₀”，也被稱為“半數有效濃度”，是指在特定的暴露時間後誘導在基線和最大值之間的50%的應答的藥物、抗體或毒劑的濃度。在本申請的上下文中，EC₅₀的單位為“nM”。

如本文所用，術語“IC₅₀”，也被稱為“半數抑制濃度”，是對一種物質在抑制特定生物學或生物化學功能中的效力的量度。在本申請的上下文中，IC₅₀的單位為“nM”。

如本文所用，“抑制結合”的能力是指抗體或其抗原結合片段抑制兩個分子(例如人PD-L1/VEGF和人PD-1/VEGFR)的結合至任何可檢測水平。在某些實施方案中，兩個分子的結合可以被抗體或其抗原結合片段以不超過50nM、不超過30nM、不超過10nM、不超過5nM、不超過1nM或甚至更低的IC₅₀抑制。

如本文所用，術語“表位”是指免疫球蛋白或抗體特異性結合的抗原部分。“表位”也被稱為“抗原決定簇”。表位或抗原決定簇通常由分子例如胺基酸、碳水化合物或糖側鏈的化學活性表面基團組成，並且通常具有特定的三維結構和特定的電荷特徵。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，編(1996)。

如本文所用，術語“分離的”是指通過人工方式從天然狀態獲得的狀態。如果某種“分離的”物質或組分天然存在，則可能是因為其天然發生變化，或者物質與天然分離，或者兩者兼而有之。例如，某種未分離的多核苷酸或多肽天然存在於某個活動物體內，從該天然狀態分離的相同的高純度多核苷酸或多肽被稱為分離的多核苷酸或多肽。術語“分離的”既不排除混合的人造或合成物質，也不排除不影響分離的物質的活性的其他不純物質。

如本文所用，術語“分離的抗體”旨在指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性結合PD-L1/VEGF蛋白的分離的抗體 基本上不含特異性結合除PD-L1/VEGF蛋白以外的抗原的抗體)。然而，特異性結合人PD-L1/VEGF蛋白的分離的抗體對其他抗原如來自其他物種的PD-L1/VEGF蛋白可能具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料及/或化學物質。

如本文所用，術語“載體”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。當載體允許插入其中的多核苷酸編碼的蛋白質的表達時，該載體稱為表達載體。該載體可以通過轉化、轉導或轉染入宿主細胞而使攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中表達。載體是本領域技術人員所熟知的，包括但不限於質粒，噬菌體，黏粒，人工染色體如酵母人工染色體(YAC)，細菌人工染色體(BAC)或P1衍生人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體和動物病毒。可用作載體的動物病毒包括但不限於逆轉錄病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴隨病毒，皰疹病毒(如單純皰疹病毒)，痘病毒，桿狀病毒，乳頭瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。載體可以包含用於控制表達的複數元件，包括但不限於啟動子序列，轉錄起始序列，增強子序列，選擇元件和報導基因。另外，載體可以包含複製起點。

如本文所用，術語“宿主細胞”是指可被工程化以產生感興趣的蛋白質、蛋白質片段或肽的細胞系統。宿主細胞包括但不限於培養細胞，例如來源於齧齒動物(大鼠、小鼠、豚鼠或倉鼠)的哺乳動物培養細胞，如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；或人體組織或雜交瘤細胞，酵母細胞和昆蟲細胞，以及包含在轉基因動物或培養組織內的細胞。該術語不僅涵蓋特定的受試細胞，還涵蓋這種細胞的後代。由於突變或環境影響可能在後代中發生某些修飾，這樣的後代可能與親本細胞不同，但仍包括在術語“宿主細胞”的範圍內。

如本文所用，術語“同一性”是指通過比對和比較序列確定的二或更多個多肽分子或二或更多個核酸分子的序列之間的關係。“百分比同一性”是指 比較分子中胺基酸或核苷酸之間相同殘基的百分比，並基於被比較的最小分子的大小計算。對於這些計算，比對中的間隙(如果有的話)較佳通過特定的數學模型或電腦程式(即“演算法”)來定址。可以用於計算比對的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology，(Lesk,A.M.編)，1988，New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects，(Smith,D.W.編)，1993，New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編)，1994，New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.，1987，Sequence Analysis in Molecular Biology，New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer，(Gribskov,M.和Devereux,J.編)，1991，New York：M.Stockton Press；和Carillo等人，1988，SIAMJ.Applied Math.48：1073中描述的那些。

如本文所用，術語“免疫原性”是指刺激生物體中特異性抗體或致敏淋巴細胞形成的能力。它不僅指抗原刺激特定免疫細胞活化、增殖和分化以最終產生免疫效應物質如抗體和致敏淋巴細胞的性質，還指抗體或致敏T淋巴細胞的特異性免疫應答可以在用抗原刺激生物體後在生物體的免疫系統中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能夠成功誘導宿主中免疫應答的產生取決於三個因素：抗原的性質，宿主的反應性和免疫手段。

如本文所用，術語“轉染”是指將核酸引入真核細胞特別是哺乳動物細胞的過程。用於轉染的方案和技術包括但不限於脂質轉染和化學和物理方法如電穿孔。許多轉染技術在本領域是公知的並且在本文中揭露。參見例如Graham等人，1973,Virology 52：456；Sambrook等人，2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，同上；Davis等人，1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等人，1981,Gene 13：197。在本發明的一具體實施方案中，將人PD-L1/VEGF基因轉染入293F細胞。

如本文所用，術語“SPR”或“表面電漿共振”是指並且包括允許通過檢測生物感測器基質內的蛋白質濃度的改變來分析即時生物特異性相互作用的光學現象，例如使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。關於詳細描述，參見實施例和Jönsson,U.，等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jönsson,U.，等人(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson,B.，等人(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson,B.，等人(1991)Anal.Biochem.198：268-277。

如本文所用，術語“螢光啟動細胞分選”或“FACS”是指專門類型的串流細胞術。它提供了根據每個細胞的特定光散射和螢光特徵，將生物細胞的異質混合物以每次一細胞分揀到二或更多個容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”.2017-11-09)。用於進行FACS的儀器是本領域技術人員已知的並且可以對於公眾是可商購獲得的。這種儀器的實例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACS Star Plus、FACScan和FACSort儀器、來自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的Epics C和來自Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。

術語“受試者”包括任何人或非人動物，較佳為人。

如本文所用，術語“癌症”是指引發醫學病症的任何腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移介導的實體瘤和非實體瘤如白血病。

本文在治療病況的情況中使用的術語“治療”、“處理”和“醫治”一般涉及人或動物的治療和療法，其中實現了一些期望的治療效果，例如，抑制病況進展，包括進展速度下降，進展速度停滯，病況消退，病況改善和病況治癒。還包括了作為預防措施(即預防)的治療。對於癌症，“治療”可能是指抑制或減緩腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移或其某種組合。對於腫瘤，“治療”包括去除全 部或部分腫瘤、抑制或減緩腫瘤生長和轉移、預防或延遲腫瘤的發展或其某種組合。

如本文所用，術語“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、組合物或劑量的量，其在按照所需的治療方案施用時有效用於產生與合理的益處/風險比相稱的某些所需的治療效果。例如，當與治療CD3/CD20相關疾病或病症聯合使用時，“有效量”是指抗體或其抗原結合部分有效治療該疾病或病症的量或濃度。

如本文所用，關於哺乳動物中的某種疾病病況的術語“預防”、“防止”或“阻止”是指預防或延遲疾病的發作或預防其臨床或亞臨床症狀的表現。

如本文所用，術語“藥學上可接受”是指載體、稀釋劑、成形劑及/或其鹽在化學及/或物理上與製劑中的其他成分相容，並且與接受者在生理學上相容。

如本文所用，術語“藥學上可接受的載體及/或成形劑”是指在藥理學及/或生理學上與受試者和活性劑相容的載體及/或成形劑，其在本領域中是公知的(參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，第19版，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1995)，並且包括但不限於pH調節劑、表面活性劑、佐劑和離子強度增強劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液；表面活性劑包括但不限於陽離子、陰離子或非離子表面活性劑，例如Tween-80；離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。

如本文所用，術語“佐劑”是指非特異性免疫增強劑，其在與抗原一起遞送至生物體或被提前遞送至有機體時可以增強生物體中的對抗原的免疫應答或改變免疫應答的類型。存在多種佐劑，包括但不限於鋁佐劑(例如氫氧化鋁)、弗氏佐劑(例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)、短小棒狀桿菌(coryne bacterium parvum)、脂多糖、細胞因數等。弗氏佐劑是目前動物實驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑更常用於臨床試驗。

雙特異性抗體及其抗原結合部分

在某些實施方案中，本文中提供的抗體及其抗原結合部分是雙特異性的。在一些實施方案中，本文中提供的抗體及其抗原結合部分具有對PD-L1的第一特異性，和對VEGF的第二特異性。

根據某些範例性實施方案，本揭露包括雙特異性抗體或其抗原結合部分，其包含與PD-L1特異性結合的第一抗原結合模組和與VEGF特異性結合的第二抗原結合模組。這類抗體在本文中可稱為，例如“抗VEGF/抗PD-L1”或“抗PD-L1/VEGF”或“抗PD-L1xVEGF”或“PD-L1xVEGF”雙特異性抗體，或其他類似的命名。

本揭露的雙特異性抗體能以高親和力結合人PD-L1和人VEGF。本揭露的抗體對PD-L1或VEGF的結合可使用本領域中確立的一種或多種技術(例如ELISA)來評估。本揭露的抗體的結合特異性也可以通過監測抗體對表達PD-L1蛋白或VEGF蛋白的細胞的結合(例如串流細胞術)來測定。例如，可以通過串流細胞術測定來測試抗體，其中使抗體與表達人PD-L1的細胞系反應，例如經過轉染以在其細胞表面上表達PD-L1的CHO細胞。另外或者備選地，可以在BIAcore結合測定法中測試抗體的結合，包括結合動力學(例如K_D值)。其他合適的結合測定法包括ELISA或FACS測定法，例如可使用重組PD-L1蛋白。

例如，本揭露的抗體以1×10^-7M或更低的K_D、5×10^-8M或更低的K_D、2×10^-8M或更低的K_D、1×10^-8M或更低的K_D、5×10^-9M或更低的K_D、4×10^-9M或更低的K_D、3×10^-9M或更低的K_D、2×10^-9M或更低的K_D、1×10^-9M或更 低的K_D、5×10^-10M或更低的K_D、1×10^-10M或更低的K_D結合人PD-L1蛋白或人VEGF蛋白，如通過表面等離子共振測量的。

如實施例部分驗證的，本揭露的雙特異性抗體能夠以較高的親和力結合人PD-L1和人VEGF(與食蟹猴VEGF相同)；結合食蟹猴和小鼠PD-L1；有效阻斷PD-1/PD-L1和VEGFR/VEGF兩種訊號傳導途徑，例如以nM級別的IC₅₀；阻斷VEGF誘導的HUVEC增殖；並在細胞因數分泌上產生較強的激動劑作用。

PD-L1抗原結合模組

如本文中定義的PD-L1抗原結合模組可以具有多種形式(例如VHH、scFv、Fab)，只要其能特異性結合抗原。一般地，包含在雙特異性抗體中的PD-L1結合模組衍生自單特異性抗PD-L1抗體，該抗體可以是本領域已知的抗體或者全新開發的抗體。在根據本申請的一些實施方案中，PD-L1抗原結合模組可以衍生自親本的單域抗體(sdAb)，例如VHH抗體，其通常指由單一抗體可變域組成的抗體。與完整抗體相似，單域抗體也能選擇性地結合特定的抗原。在一些其它的實施方案中，PD-L1抗原結合模組可以衍生自沒有輕鏈的重鏈抗體。

術語“單可變域”或“重鏈抗體的重鏈可變區”與術語“VHH”、“VHH抗體”、“VHH結構域”、“VHH抗體片段”、“V_HH”或“奈米抗體”等可交換使用。來源於駱駝科抗體的V_HH分子是已知的最小的完整抗原結合結構域(約15kDa，或比常規IgG小10倍)，因此非常適合遞送至緻密組織和進入大分子之間的有限空間。

本文揭露的親本VHH抗體可以由技術人員根據本領域已知的方法或任何未來的方法來製備。例如，可以使用本領域已知的方法獲得VHH，例如 通過免疫駱駝並從中獲得雜交瘤，或通過使用本領域已知的分子生物學技術選殖本發明的VHH的文庫，隨後通過使用噬菌體展示進行選擇。

例如，可以通過用所需抗原免疫羊駝或美洲駝，然後分離編碼重鏈抗體的mRNA來獲得VHH抗體。通過反轉錄和聚合酶鏈式反應，產生了包含數百萬個選殖的單域抗體的基因文庫。篩選技術例如諸如噬菌體展示和核糖體展示可用於幫助鑒定結合抗原的選殖。在噬菌體展示中，在噬菌體上合成(例如人)抗體的文庫，用目的抗原或其抗體結合部分篩選該文庫，並分離與抗原結合的噬菌體，從而可以獲得免疫反應片段。製備和篩選此類文庫的方法是本領域眾所週知的，並且用於產生噬菌體展示文庫的試劑盒是可商購獲得的(例如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目錄號27-9400-01；和Stratagene SurfZAP^TM噬菌體展示試劑盒，貨號240612)。還存在可用於產生和篩選抗體展示文庫的其他方法和試劑(參見，例如，Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991))。

VHH抗體的人源化可通過許多本領域中已確立的方法實現，例如，可將VHH框架區的胺基酸序列對人種系V基因資料庫blast，並根據Kabat CDR定義通過將高命中序列中的人CDR序列用VHH CDR序列替換來產生人源化VHH序列。此外，框架區中的某些殘基可以回復突變以維持親和力。

在一些實施方案中，該PD-L1抗原結合模組包含一或複數選自下組的CDR：(i)包含SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失、或取代的胺基酸序列的CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2或與SEQ ID NO：2相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失、或取代的胺基酸序列的CDR2；和 (iii)包含SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失、或取代的胺基酸序列的CDR3。

在一些實施方案中，該PD-L1抗原結合模組是VHH抗體，其包含：(i)包含SEQ ID NO：1或由其組成的CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2或由其組成的CDR2；和(iii)包含SEQ ID NO：3或由其組成的CDR3。

在一些實施方案中，該PD-L1抗原結合模組的VHH包含：(i)SEQ ID NO：10的胺基酸序列；(ii)與SEQ ID NO：10至少85%、90%或95%相同的胺基酸序列；或(iii)與SEQ ID NO：10相比具有一或複數(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個)胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。

VEGF抗原結合模組

類似地，本文中提供的VEGF抗原結合模組可以衍生自抗VEGF單特異性抗體。在根據本申請的一些實施方案中，VEGF抗原結合模組是一種抗VEGF完整抗體的Fab片段，即包含重鏈的VH和CH1區，和包含輕鏈的VL和CL區。

被用作親本抗體的抗VEGF完整抗體可以是本領域中已知的單抗(例如貝伐單抗)，或者是全新開發的。較佳地，該抗VEGF抗體是全人抗體或人源化抗體。

在一些實施方案中，該VEGF抗原結合模組的VH區包含選自下組的一或複數重鏈CDR(HCDR)：(i)由SEQ ID NO：4組成的HCDR1或胺基酸序列與SEQ ID NO：4相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失、或取代的HCDR1；(ii)由SEQ ID NO：5組成的HCDR2或胺基酸序列與SEQ ID NO：5相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失、或取代的HCDR2；和 (iii)由SEQ ID NO：6組成的HCDR3或胺基酸序列與SEQ ID NO：6相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失、或取代的HCDR3；及/或VL區包含選自下組的一或複數輕鏈CDR(LCDR)：(i)由SEQ ID NO：7組成的LCDR1或胺基酸序列與SEQ ID NO：7相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失、或取代的LCDR1；(ii)由SEQ ID NO：8組成的LCDR2或胺基酸序列與SEQ ID NO：8相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失、或取代的LCDR2；和(iii)由SEQ ID NO：9組成的LCDR3或胺基酸序列與SEQ ID NO：9相差不超過2個胺基酸的胺基酸添加、缺失、或取代的LCDR3。

在一些實施方案中，該VH包含：(i)包含SEQ ID NO：4或由其組成的HCDR1；(ii)包含SEQ ID NO：5或由其組成的HCDR2；和(iii)包含SEQ ID NO：6或由其組成的HCDR3；且該VL包含：(i)包含SEQ ID NO：7或由其組成的LCDR1；(ii)包含SEQ ID NO：8或由其組成的LCDR2；和(iii)包含SEQ ID NO：9或由其組成的LCDR3。

在一些實施方案中，該VEGF抗原結合模組的VH包含：(i)SEQ ID NO：11的胺基酸序列；(ii)與SEQ ID NO：11至少85%、90%或95%相同的胺基酸序列；或(iii)與SEQ ID NO：11相比具有一或複數(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個)胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該VEGF抗原結合模組的VL包含：(i)SEQ ID NO：12的胺基酸序列；(ii)與SEQ ID NO：12至少85%、90%或95%相同的胺基酸序列；或(iii)與SEQ ID NO：12相比具有一或複數(例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個)胺基酸的添加、缺失及/或取代的胺基酸序列。

除非另有說明，否則將胺基酸分配給每個CDR可以根據以下提供的編號方案之一：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest (第5版)，US Dept.of Health and Human Services，PHS，NIH，NIH Publication no.91-3242；Chothia等人，1987，PMID：3681981；Chothia等人，1989，PMID：2687698；MacCallum等人，1996，PMID：8876650；或Dubel編(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies，第3版，Wily-VCH VerVEGF GmbH and Co.。

抗體序列中的可變區和CDR可以根據本領域已經開發的一般規則(如上所述，例如Kabat編號系統)或通過將序列與已知可變區的資料庫比對來鑒定。在Kontermann和Dubel編，Antibody Engineering，Springer，New York，NY，2001和Dinarello等人，Current Protocols in Immunology，John Wiley and Sons Inc.，Hoboken,NJ，2000中描述了鑒定這些區域的方法。抗體序列的範例性資料庫描述於並可獲自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”網站(由Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London，London，England的A.C.Martin維護)和VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人，Nucl.Acids Res.，33(Database issue)：D671-D674(2005)中所述。較佳使用Abysis資料庫分析序列，其整合了來自Kabat、IMGT和蛋白質資料庫(PDB)的序列資料與來自PDB的結構資料，參見Dr.Andrew C.R.Martin所著的書中的Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In：Antibody Engineering Lab Manual(編：Duebel,S.和Kontermann,R.，Springer-VerVEGF，Heidelberg，ISBN-13：978-3540413547，也可在網站bioinforg.uk/abs上獲得)。Abysis資料庫網站還包括已經開發用於識別可以根據本文的教導使用的CDR的一般規則。除非另有說明，否則本文所述的所有CDR均根據Kabat的Abysis資料庫網站獲得。

二胺基酸序列之間的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的演算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))確定，該演算法已被併入ALIGN程式(版本2.0)，使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為 4。另外，兩個胺基酸序列之間的百分比同一性可以通過Needleman和Wunsch的演算法(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))確定，其已併入GCG套裝軟體(可從http：//www.gcg.com獲得)中的GAP程式中，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，空隙權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。

另外地或可選地，本發明的蛋白質序列可以進一步用作“查詢序列”來執行針對公共資料庫的搜索以例如識別相關序列。這種搜索可以使用Altschul等人(1990)J.MoI.Biol.215：403-10的XBLAST程式(版本2.0)來執行。可用XBLAST程式進行BLAST蛋白質搜索，得分=50，字長=3，以獲得與本發明的抗體分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的的空位比對，可使用空位BLAST，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述的。當使用BLAST和空位BLAST程式時，可以使用各個程式(例如，XBLAST和NBLAST)的默認參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。

在其他實施方案中，CDR胺基酸序列可以是與上述相應序列中所包含的具體的CDR胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在其他實施方案中，可變區的胺基酸序列可以與上述相應序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。

較佳地，分離的抗體或其抗原結合部分的CDR包含不多於2個胺基酸或不多於1個胺基酸的保守取代。本文使用的術語“保守取代”是指胺基酸取代，其不會不利地影響或改變包含胺基酸序列的蛋白質/多肽的基本性質。例如，保守取代可以通過本領域已知的標準技術(例如定點誘變和PCR介導的誘變)引入。保守胺基酸取代包括其中胺基酸殘基被具有相似側鏈的另一胺基酸殘基取代的取代，例如物理或功能相似的殘基(例如具有相似的大小、形狀、電荷、 化學性質包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)至相應的胺基酸殘基的取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)，具有酸性側鏈的胺基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側鏈的胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支側鏈的胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，相應的胺基酸殘基較佳被來自相同側鏈家族的另一胺基酸殘基取代。用於鑒定胺基酸保守取代的方法在本領域中是公知的(參見例如Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997)，其通過引用併入本文)。

雙特異性抗體的產生

為了建構抗PD-L1/VEGF雙特異性抗體，如上文描述的PD-L1抗原結合模組和VEGF抗原結合模組可以以多種形式融合在一起。在某些實施方案中，PD-L1抗原結合模組融合於VEGF抗原結合模組的N末端。當PD-L1抗原結合模組是VHH時，該PD-L1抗原結合模組的單鏈可以可操作地連接於VEGF抗原結合模組的重鏈或輕鏈，任選地經由接頭。較佳地，PD-L1抗原結合模組連接於VEGF抗原結合模組的輕鏈。該接頭可以是肽接頭，例如可以包含1-4個拷貝的GGGGS(G4S)。在一實施方案中，該接頭是(G4S)2。

本文中提供的雙特異性抗體及其抗原結合部分可使用本領域中已知的任何適宜的方法來製備。一種常規的辦法是將兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈在宿主細胞中共表達從而以重組方式產生雙特異性抗體(參見，例如Milstein和Cuello,Nature，305：537(1983))，然後通過親和層析純化。還可以將編碼針對兩 種特異性的抗體重鏈可變域的序列分別與免疫球蛋白恆定域序列融合，然後插入表達載體，將該表達載體與輕鏈序列的表達載體共轉染至適宜的宿主細胞，從而重組表達雙特異性抗體(參見，例如WO 94/04690；Suresh等人，Methods in Enzymology，121：210(1986))。

Fc區

在某些實施方案中，該雙特異性抗體包含可操作地連接於VEGF抗原結合模組的Fc區。本文中揭露的雙特異性抗體的Fc區可以是人IgG Fc區。該IgG Fc區可以具有任何同種型，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些實施方案中，該Fc區為IgG1同種型。

在本揭露的雙特異性抗體的背景下，與指定的Fc區嵌合形式相比，Fc區可以包含一或複數胺基酸改變(例如，插入，缺失或取代)。例如，本揭露包括在Fc區中包含一或複數修飾的雙特異性抗原結合分子，其導致在Fc與FcRn或FcγR之間具有修飾的結合相互作用的修飾的Fc區。

當述及免疫球蛋白重鏈恆定區中的殘基時，通常使用“EU編號系統”或“EU索引”(例如報導在Kabat等人，見上文中的EU索引)。“如Kabat中的EU編號”或“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗體的殘基編號。除非本文中另外說明，對抗體恆定域中殘基編號的提述都指的是通過EU編號系統的殘基編號。

在某些實施方案中，Fc區經由鉸鏈區可操作地連接於VEGF抗原結合模組。任選地，該鉸鏈區可以源自人IgG1、IgG2或IgG4。在某些實施方案中，該鉸鏈區源自人IgG1。

編碼本揭露抗體的核酸分子

在一些方面，本發明涉及分離的核酸分子，其包含編碼如本文所揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分的核酸序列。例如，該核酸序列可以編碼 雙特異性抗體的重鏈及/或輕鏈，或者該核酸序列可以編碼PD-L1抗原結合模組，或VEGF抗原結合模組的重鏈或輕鏈可變區。該核酸序列也可以編碼雙特異性抗體的Fc區。

在一些方面，本揭露涉及包含編碼如本文所揭露的核酸序列的載體。在一些實施方案中，表達載體進一步包含編碼雙特異性抗體例如嵌合的或人源化雙特異性抗體的恆定區的核苷酸序列。

在本發明的情況下載體可以是任何合適的載體，包括染色體、非-染色體和合成的核酸載體(包含一組合適的表達控制元件的核酸序列)。這樣的載體的實例包括SV40的衍生物、細菌質粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質粒、源自質粒和噬菌體DNA的組合的載體，和病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一實施方案中，CD20或CD3抗體-編碼核酸包含在裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表達元件(描述於例如Sykes和Johnston，Nat Biotech 17，355-59(1997))、緊密核酸載體(描述於例如US 6,077,835及/或WO 00/70087)、質粒載體例如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119、"midge"最小尺寸的核酸載體(描述於例如Schakowski等人，Mol Ther 3,793-800(2001))或作為沉澱的核酸載體建構體，例如CaP04-沉澱的建構體(描述於例如WO200046147，Benvenisty和Reshef，PNAS USA 83，9551-55(1986)，Wigler等人，Cell 14，725(1978)和Coraro和Pearson，SomaticCell Genetics 7，603(1981))。這樣的核酸載體和其用途是本領域眾所週知的(參見例如US 5,589,466和US 5,973,972)。

在一實施方案中，載體適合在細菌細胞中表達抗PD-L1/VEGF雙特異性抗體。這樣的載體的實例包括表達載體，例如BlueScript(Stratagene)、pIN載體(Van Heeke &Schuster，J Biol Chem 264，5503-5509(1989)、pET載體(Novagen,Madison WI)等)。表達載體還可或備選地是適合在酵母系統中表達的載體。可使用合適在酵母系統中表達的任何載體。合適的載體包括，例如包含組成型或誘導 型啟動子，例如α因數、醇氧化酶和PGH的載體(綜述於：F.Ausubel等人編，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley InterScience New York(1987)和Grant等人，Methods in Enzymol 153，516-544(1987))。

表達載體還可或備選地是適合在哺乳動物細胞中表達的載體，例如，包含穀氨醯胺合成酶作為可選擇標記的載體，例如描述於Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10：169-175中的載體。

核酸及/或載體還可包含編碼分泌/定位序列的核酸序列，該序列可將多肽，例如新生的多肽鏈靶向週質空間或細胞培養基。這樣的序列是本領域已知的，和包括分泌前導或訊號肽。

表達載體可包含任何合適的啟動子、增強子和其它表達促進元件或與其締合。這樣的元件的實例包括強表達啟動子(例如人CMV IE啟動子/增強子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR啟動子)、有效的多聚(A)終止序列、在大腸桿菌中質粒產物的複製起點、作為可選擇標記的抗生素抗性基因及/或方便的選殖位點(例如，聚合接頭)。核酸還可包含與組成型啟動子相對的誘導型啟動子，例如CMV IE。

在再一方面，本揭露涉及包含本文所述的載體的宿主細胞。因此，本發明還涉及產生本發明的雙特異性抗體的重組真核或原核宿主細胞，例如轉染瘤。

PD-L1-特異性抗體可在重組的真核或原核宿主細胞例如轉染瘤中表達，其產生本文定義的本發明的抗體，或本文定義的本發明的雙特異性抗體。VEGF-特異性抗體可同樣地在重組的真核或原核宿主細胞例如轉染瘤中表達，其產生本文定義的本發明的抗體或本文定義的本發明的雙特異性抗體。

宿主細胞的實例包括酵母、細菌、植物和哺乳動物細胞，例如CHO、CHO-S、HEK，HEK293、HEK-293F、Expi293F、PER.C6或NS0細胞或淋巴細 胞。例如，在一實施方案中，宿主細胞可包含穩定整合至細胞基因組的第一和第二核酸建構體。在另一實施方案中，本發明提供包含非整合核酸、例如質粒、黏粒、噬菌粒或線性表達元件的細胞，其包含上文所述的第一和第二核酸建構體。

在另一方面，本發明涉及轉基因非人動物或植物，其包含編碼一組或兩組人重鏈和人輕鏈的核酸，其中該動物或植物產生本發明的雙特異性抗體。

在再一方面，本揭露涉及雜交瘤，其產生用於本文定義的本揭露的雙特異性抗體的抗體。

在一方面，本發明涉及表達載體，其包含(i)核酸序列，其編碼PD-L1抗原結合模組；(ii)核酸序列，其編碼VEGF抗原結合模組的重鏈及/或輕鏈；(iii)核酸序列，其編碼Fc區；或(iv)核酸序列，其編碼雙特異性抗體的重鏈及/或輕鏈。

核酸序列，其編碼雙特異性抗體的重鏈及/或輕鏈。

在一方面，本揭露涉及產生根據本文揭露的任一實施方案的雙特異性抗體的方法，包括培養本文揭露的包含表達雙特異性抗體的一種或多種表達載體的宿主細胞，和從培養基純化該抗體。在一方面，本發明涉及包含上文定義的表達載體的宿主細胞。在一實施方案中，宿主細胞是重組真核、重組原核或重組微生物宿主細胞。

藥物組合物

在一些方面，本發明涉及藥物組合物，其包含至少一種如本文所揭露的雙特異性抗體或其抗原結合部分和藥學上可接受的載體。

組合物的組分

藥物組合物可以任選地含有一種或多種另外的藥物活性成分，例如另一種抗體或藥物。本發明的藥物組合物還可以與例如另一種免疫刺激劑、抗癌劑、抗病毒劑或疫苗組合施用，使得抗PD-L1/抗VEGF雙特異性抗體增強對疫苗的免疫反應。藥學上可接受的載體可以包括例如藥學上可接受的液體、凝膠或固體載體、水性介質、非水性介質、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮/分散劑、螯合劑、稀釋劑、佐劑、成形劑或無毒的輔助物質，本領域已知的各種組分的組合或更多。

合適的組分可以包括例如抗氧化劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝劑、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑如糖和環糊精。合適的抗氧化劑可包括例如甲硫氨酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨糖醇、丁基甲基苯甲醚、丁基化羥基甲苯及/或丙基砷酸鹽。如本發明所揭露的，在包含還原抗體或其抗原結合片段的一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸的含有本發明揭露的組合物的抗體或抗原結合片段的溶劑中，其可被氧化。氧化還原可防止或減少結合親和力的降低，從而增強抗體穩定性並延長保質期。因此，在一些實施方案中，本發明提供了包含一種或多種抗體或其抗原結合片段和一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸的組合物。本發明進一步提供了多種方法，其中將抗體或其抗原結合片段與一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸混合。從而，抗體或其抗原結合片段可以被防止氧化，以延長其保質期及/或增加活性。

為了進一步說明，藥學上可接受的載體可以包括例如含水載體、例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液、非水性載體如植物來源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油、抑細菌劑或抑真菌濃度的抗微生物劑、等滲劑如氯化鈉或葡萄糖、緩衝劑如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑、抗氧化劑如硫酸氫鈉、局部麻醉劑如鹽酸普 魯卡因、懸浮劑和分散劑如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮、乳化劑如聚山梨酯80(TWEEN-80)、隔絕劑或螯合劑如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。用作載體的抗微生物劑可以添加到包含酚或甲酚、汞製劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯紮氯銨和苄索氯銨的多劑量容器中的藥物組合物中。合適的成形劑可以包括例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。合適的無毒輔助物質可包括例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解度增強劑或諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精的試劑。

施用、製劑和劑量

本發明的藥物組合物可以通過各種途徑體內施用至有需要的受試者，該途徑包括但不限於口服、靜脈內、動脈內、皮下、腸胃外、鼻內、肌內、顱內、心內、心室內、氣管內、口胺、直腸、腹膜內、皮內、局部、經皮和鞘內，或者通過植入或吸入。本發明組合物可以配製成固體、半固體、液體或氣體形式的製劑；包括但不限於片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑和氣霧劑。根據預期的應用和治療方案可以選擇合適的製劑和施用途徑。

用於腸內施用的合適製劑包括硬或軟的明膠膠囊、丸劑、片劑，包括包衣片劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑或吸入劑及其控釋劑型。

適用於腸胃外施用(例如通過注射)的製劑包括活性成分溶解、懸浮於其中或以其他方式提供的(例如，在脂質體或其他微粒中)的水性或非水性、等滲、無熱原、無菌液體(例如溶液、混懸液)。這些液體可以另外含有其它藥學上可接受的成分，例如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑和使製劑與預期接受者的血液(或其他相關體液)等滲的溶質。成形劑的 實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。適用於此類製劑的等滲載體的實例包括氯化鈉注射液、林格溶液或乳酸林格氏注射液。類似地，特定劑量方案(包括劑量、時間和重複)將取決於具體個體和個體的病史以及諸如藥代動力學(例如半衰期、清除率等)的經驗考慮。

施用頻率可以在治療過程中確定和調整，並且基於減少增殖或致瘤細胞的數量，維持這種腫瘤細胞的減少，減少腫瘤細胞的增殖或延遲轉移的發展。在一些實施方案中，施用的劑量可以被調節或減少以控制潛在的副作用及/或毒性。或者，本發明治療組合物的持續連續釋放製劑可能是合適的。

本領域技術人員將會理解，合適的劑量可因患者而異。確定最佳劑量通常涉及治療益處水平與任何風險或有害副作用的平衡。所選擇的劑量水平將取決於多種因素，包括但不限於特定化合物的活性、施用、施用時間、化合物清除速率、治療持續時間、其他聯合使用的藥物、化合物及/或材料、病症的嚴重程度，以及物種，患者的性別、年齡、體重、病況、一般健康狀況和以前的病史。化合物的量和施用途徑最終由醫生、獸醫或臨床醫師決定，但通常選擇劑量以達到實現所需效果的作用部位處的局部濃度，而不會導致實質性的有害或不利副作用。

通常，本發明的抗體或其抗原結合部分可以以各種範圍施用。這些包括每劑量約5μg/kg體重至約100mg/kg體重；每劑量約50μg/kg體重至約5mg/kg體重；每劑量約100μg/kg體重至約10mg/kg體重。其他範圍包括每劑量約100μg/kg體重至約20mg/kg體重和每劑量約0.5mg/kg體重至約20mg/kg體重。在一些實施方案中，每劑量為至少約100μg/kg體重，至少約250μg/kg體重，至少約750μg/kg體重，至少約3mg/kg體重，至少約5mg/kg體重，至少約10mg/kg體重。

無論如何，本發明的抗體或其抗原結合部分較佳根據需要施用於有需要的受試者。本領域技術人員可以確定施用頻率，例如主治醫生基於所治療病況、所治療受試者的年齡、所治療病況的嚴重程度、所治療受試者的一般健康狀況等的考慮。

在某些較佳的實施方案中，涉及本發明的抗體或其抗原結合部分的治療過程將包含在數週或數月的時間內施用的多劑量的所選藥物產品。更具體地說，本發明的抗體或其抗原結合部分可以每天、每兩天、每四天、每週、每十天、每兩週、每三週、每月、每六週、每兩個月、每十週或每三個月施用。就此而言，可以理解的是，可以基於患者響應和臨床實踐來改變劑量或者調整間隔。

在給予一次或多次施用的個體中也可憑經驗確定所揭露的治療組合物的劑量和方案。例如，可給予個體增量劑量的如本文所述產生的治療組合物。在選定的實施方案中，劑量可分別根據經驗確定或觀察到的副作用或毒性逐漸增加或減少或減輕。為了評估所選擇的組合物的功效，可以如前所述跟蹤特定疾病、病症或病況況的標誌物。對於癌症，這些包括通過觸診或視覺觀察直接測量腫瘤大小，通過X射線或其他成像技術間接測量腫瘤大小；通過直接腫瘤活組織檢查和腫瘤樣本的顯微鏡檢查評估的改善；測量根據本文所述方法鑒定的間接腫瘤標誌物(例如用於前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的減輕；與腫瘤相關的言語、視力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通過接受的測試測量的生活品質的提高或生存期的延長。本領域技術人員將明白，劑量將根據個體、腫瘤病況的類型、腫瘤病況的階段、腫瘤病況是否已開始轉移至個體中的其他位置以及過去使用的治療和並行使用的治療而變化。

用於腸胃外施用(例如靜脈內注射)的相容製劑將包含濃度為約10μg/ml至約100mg/ml的本文揭露的抗體或其抗原結合部分。在某些選定的實 施方案中，抗體或其抗原結合部分的濃度將包括20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml或1mg/ml。在其他較佳的實施方案中，抗體或其抗原結合部分的濃度將包括2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mgml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。

本發明的應用

在一些方面，本發明提供了治療受試者病症的方法，其包括向需要治療的患者(例如人)施用治療有效量的如本文揭露的抗體或其抗原結合部分。例如，這種疾病是一種癌症。

可以使用本揭露提供的方法治療或預防涉及PD-L1及/或VEGF的多種癌症，無論是惡性的還是良性的，以及是否是原發性的或繼發性的。這些癌症可以是實體癌或血液惡性腫瘤。這些癌症的實例包括肺癌如支氣管癌(例如鱗狀細胞癌、小細胞癌、大細胞癌和腺癌)、肺泡細胞癌、支氣管腺瘤、軟骨性錯構瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心臟癌如黏液瘤、纖維瘤和橫紋肌瘤；骨癌例如骨軟骨瘤、軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨樣軟骨瘤、骨樣骨瘤、巨細胞瘤、軟骨肉瘤、多發性骨髓瘤、骨肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、尤因氏腫瘤(尤因氏肉瘤)和網織細胞肉瘤；腦癌例如神經膠質瘤(例如多形性成膠質細胞瘤)、間變性星形細胞瘤、星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、成神經管細胞瘤、脊索瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、松果體瘤、骨瘤、血管母細胞瘤、顱咽管瘤、脊索瘤、生殖細胞瘤、畸胎瘤、皮樣囊腫和血管瘤；消化系統中的癌症如結腸癌、平滑肌瘤、表皮樣癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、腸脂肪瘤、腸神經纖維瘤、腸纖維瘤、大腸息肉和結腸直腸癌；肝癌如肝細胞腺瘤、血管瘤、 肝細胞癌、纖維板層癌、膽管癌、肝母細胞瘤和血管肉瘤；腎癌如腎腺癌、腎細胞癌、高腎上腺瘤和腎盂的移行細胞癌；膀胱癌；血液系統癌症如急性淋巴細胞白血病(急性淋巴細胞性白血病)、急性骨髓性(髓細胞性、骨髓、成髓細胞性、骨髓單核細胞性)白血病、慢性淋巴細胞性白血病(例如Sezary綜合症和毛細胞性白血病)、慢性髓細胞性(髓性、骨髓性、粒細胞性)淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、蕈樣黴菌病和骨髓增殖性疾病(包括骨髓增生性疾病，如真性紅細胞增多症、骨髓纖維化、血小板增多症和慢性粒細胞白血病)；皮膚癌如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑素瘤、卡波西肉瘤和佩吉特氏病；頭頸部癌症；與眼相關的癌症，如成視網膜細胞瘤和眼內黑素癌；男性生殖系統癌症如良性前列腺增生、前列腺癌和睾丸癌(例如精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌和絨毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系統癌症如子宮癌(子宮內膜癌)、宮頸癌(宮頸腫瘤)、卵巢癌(卵巢腫瘤)、外陰癌、陰道癌、輸卵管癌和葡萄胎；甲狀腺癌(包括乳頭狀、濾泡狀、間變性或髓樣癌)；嗜鉻細胞瘤(腎上腺)；甲狀旁腺的非癌性生長；胰腺癌；和血液學癌症例如白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在具體的實施方案中，癌症是結腸癌。

在一些實施方案中，癌症的實例包括但不限於B細胞癌，包括B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴細胞(SL)NHL；中級/濾泡性NHL；中間級別擴散性NHL；免疫母細胞NHL；高級別淋巴母細胞NHL；高級別小型非切割細胞NHL；大塊疾病NHL；套細胞淋巴瘤；愛滋病相關淋巴瘤；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性粒細胞白血病；和移植後淋巴增生性疾病(PTLD)，以及與瘢痣病相關的異常血管增生、水腫(例如與腦腫瘤相關的)，B細胞增殖性病症和Meigs'綜合症，更具體的例子包括但不限於復發或難治性NHL、前線低級別NHL、III/IV級NHL、化療耐受性NHL、前體 Bly成淋巴細胞性白血病及/或淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病及/或幼淋巴細胞性白血病及/或小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞幼淋巴細胞淋巴瘤、免疫細胞瘤及/或淋巴漿細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、結外邊緣區-MALT淋巴瘤、淋巴結邊緣區淋巴瘤、毛細胞白血病、漿細胞瘤及/或漿細胞骨髓瘤、低級/濾泡性淋巴瘤、中級/濾泡性NHL、套細胞淋巴瘤、濾泡中心淋巴瘤(包括侵襲性前線NHL和侵襲性復發NHL)、自體幹細胞移植後復發或復發的NHL、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、高級別免疫母細胞NHL、高級成淋巴細胞性NHL、高級別小非裂解性細胞NHL、龐大疾病NHL、伯基特淋巴瘤、前體(外週)大顆粒淋巴細胞白血病、蕈樣肉芽腫及/或塞紮裡綜合症、皮膚(皮膚)淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。

在一些實施方案中，癌症的實例進一步包括但不限於B細胞增殖性病症，其進一步包括但不限於淋巴瘤(例如B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))和淋巴細胞白血病。這種淋巴瘤和淋巴細胞白血病包括例如a)濾泡性淋巴瘤；b)小的未分裂細胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤，散發性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)；c)邊緣區淋巴瘤(包括結外邊緣區B細胞淋巴瘤(黏膜相關淋巴組織淋巴瘤，MALT)、結節邊緣區B細胞淋巴瘤和脾邊緣區淋巴瘤)；d)套細胞淋巴瘤(MCL)；e)大細胞淋巴瘤(包括B細胞彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)細胞淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B細胞淋巴瘤)；f)毛細胞白血病；g)淋巴細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症；h)急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病CLL)/小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、B細胞幼淋巴細胞性白血病；i)漿細胞瘤、漿細胞性骨髓瘤、多發性骨髓瘤、漿細胞瘤及/或j)霍奇金氏病。

在一些其他實施方案中，病症是自身免疫性疾病。可以用抗體或其抗原結合部分治療的自身免疫性疾病的實例包括自身免疫性腦脊髓炎，紅斑狼瘡和類風濕性關節炎。抗體或其抗原結合部分也可用於治療或預防感染性疾病，炎症性疾病(例如變應性哮喘)和慢性移植物抗宿主病。

與化療組合使用

抗體或其抗原結合部分可以與抗癌劑、細胞毒性劑或化學治療劑組合使用。

術語“抗癌劑”或“抗增殖劑”意指可用於治療細胞增殖性病症例如癌症的任何藥劑，並且包括但不限於細胞毒性劑、細胞抑制劑、抗血管產生劑、放射療法和放射治療劑、靶向抗癌劑、BRM、治療性抗體、癌症疫苗、細胞因數、激素療法、放射療法和抗轉移劑和免疫治療劑。應該理解的是，在如上所述的選定實施方案中，此類抗癌劑可以包含綴合物並且可以在施用之前與揭露的位點特異性抗體結合。更具體而言，在一些實施方案中，將選擇的抗癌劑連接至工程化抗體的不配對半胱氨酸以提供如本文所述的工程化綴合物。因此，這樣的工程化綴合物被明確地考慮在本發明的範圍內。在其他實施方案中，所揭露的抗癌劑將與包含如上所述的不同治療劑的位點特異性綴合物組合施用。

如本文所用，術語“細胞毒性劑”是指對細胞有毒並降低或抑制細胞功能及/或引起細胞破壞的物質。在一些實施方案中，該物質是源自活生物體的天然存在的分子。細胞毒性劑的實例包括但不限於，細菌(例如，白喉毒素、假單胞菌內毒素和外毒素，葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxin)A)，真菌(例如α-八疊球菌素(sarcin)，侷限麯黴素(restrictocin))，植物(相思豆毒蛋白、蓖麻毒素、蒴蓮根毒素、槲寄生素、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素、白樹毒素、momoridin、天花粉蛋白、大麥毒素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、Phytolacca mericana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒素、石堿草(Saponaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、mitegellin、侷限麯黴素、酚黴素、新黴素和單端孢黴烯族化合物)或動物(例如細胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段及/或變體)的小分子毒素或酶促活性毒素。

為了本發明的目的，“化學治療劑”包括非特異性降低或抑制癌細胞的生長、增殖及/或存活的化學化合物(例如細胞毒性劑或細胞抑制劑)。這些化學藥劑通常針對細胞生長或分裂所需的細胞內過程，因此對於通常快速生長和分裂的癌細胞特別有效。例如，長春新堿使微管解聚，從而抑制細胞進入有絲分裂。通常，化學治療劑可以包括抑制或被設計用於抑制癌細胞或可能變成性或產生致瘤後代(例如TIC)的細胞的任何化學藥劑。這些藥劑通常是組合使用的，並且通常是最有效的，例如，在諸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以與本發明的位點特異性建構體組合使用的抗癌劑(作為位點特異性綴合物的組分或未綴合狀態)的實例包括但不限於烷化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶、乙烯亞胺和甲基三聚氰胺、多聚乙醯(acetogenins)、喜樹堿、苔蘚抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、朵拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉堿、沙克迪因(sarcodictyin)、海綿素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔類抗生素、dynemicin、雙膦酸鹽、埃斯波黴素、色素蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素類(aclacinomysins)、放線菌素、安麯黴素、偶氮絲氨酸、博萊黴素、放線菌素C、卡拉賓辛(carabicin)、洋紅黴素、嗜癌黴素、色黴素類(chromomycinis)、更生黴素、柔紅黴素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN^®多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅黴素、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、博地黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星；抗-代謝物、埃 羅替尼、威羅菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依魯替尼、恩雜魯胺、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗-腎上腺素、葉酸補充劑如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛內酯、醛磷醯胺糖苷、氨基乙醯丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、貝斯布希(bestrabucil)、比生群、依達曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋銨、愛波喜龍、依託格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達明、美坦生類化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩爾(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、PSK®多糖複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生；根黴素；西佐喃；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯類(尤其是T-2毒素、維拉庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A和蛇形菌素)；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；呱泊溴烷；凱西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷類；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR®吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；氨甲喋呤；鉑類似物；長春堿；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新堿，NAVELBINE®長春瑞濱；諾消靈；替尼泊苷；依達曲沙；柔紅黴素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸；類視色素；卡培他濱；考布他汀；甲醯四氫葉酸；奧沙利鉑；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制劑(其減少細胞增殖)，以及上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。這一定義中還包括的是用於調節或抑制對腫瘤的激素作用的抗激素劑，諸如抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑，抑制調節腎上腺中的雌激素產生的芳香酶的芳香酶抑制劑，和抗-雄激素；以及曲沙他濱(1，3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核酶諸如VEGF表達抑制劑和HER2表達抑制劑；疫苗，PROLEUKIN^® rIL-2；LURTOTECAN^®拓撲異構酶1抑制劑； ABARELIX^® rmRH；長春瑞濱和埃斯波黴素，以及上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。

與放射療法組合使用

本發明還提供了抗體或其抗原結合部分與放射療法(即，用於在腫瘤細胞內局部誘導DNA損傷的任何機制，例如γ-照射、X-射線、UV-照射、微波、電子發射等)的組合。還考慮了使用放射性同位素至腫瘤細胞的定向遞送的聯合療法，並且所揭露的抗體可以與靶向的抗癌劑或其他靶向手段結合使用。通常，放射療法在約1週至約2週的時間段內以脈衝方式施用。放射療法可以對患有頭頸癌的受試者施用約6至7週。任選地，放射療法可以作為單劑量或作為複數順序劑量施用。

藥物包裝和試劑盒

還提供了包含含有一或複數劑量的抗體或其抗原結合部分的一或複數容器的藥物包裝和試劑盒。在一些實施方案中，提供單位劑量，其中單位劑量含有預定量的組合物，該組合物包含例如抗體或其抗原結合部分，具有或不具有一種或多種其他試劑。對於其他實施方案，這種單位劑量以一次性使用的預充式注射用注射器供應。在其他實施方案中，單位劑量中包含的組合物可以包含鹽水、蔗糖或類似物；緩衝液，如磷酸鹽等；及/或配製在穩定和有效的pH範圍內。或者，在一些實施方案中，組合物可以作為凍幹粉末提供，其可以在加入合適的液體(例如無菌水或鹽溶液)後重建。在某些較佳的實施方案中，組合物包含一種或多種抑制蛋白質聚集的物質，包括但不限於蔗糖和精氨酸。一種或多種容器上或與容器相關聯的任何標籤指示封裝的組合物用於治療選擇的腫瘤疾病病況。

本發明還提供了用於產生抗體以及任選地一種或多種抗癌劑的單劑量或多劑量施用單元的試劑盒。該試劑盒包括容器以及在容器上或與容器相 關聯的標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多種材料形成，例如玻璃或塑膠，並且包含藥學有效量的所揭露的綴合或非綴合形式的抗體。在其他較佳實施例中，一種或多種容器包括無菌存取口(例如容器可以是靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶)。這樣的試劑盒通常在合適的容器中包含抗體的藥學上可接受的製劑，並且任選地在相同或不同的容器中包含一種或多種抗癌劑。試劑盒還可以含有其他藥學上可接受的製劑，用於診斷或組合治療。例如，除了本發明的抗體或其抗原結合部分之外，這樣的試劑盒可以含有任何一種或多種抗癌劑，例如化學治療劑或放射治療劑；抗血管產生劑；抗轉移劑；靶向抗癌劑；細胞毒性劑；及/或其他抗癌劑。

更具體地說，試劑盒可以具有含有所揭露的抗體或其抗原結合部分的單個容器，其含有或不含另外的組分，或者它們可以具有用於每種所需試劑的不同容器。在提供用於綴合的組合治療劑的情況下，可以按摩爾當量組合或一種組分多於另一種的方式預混合單一溶液。或者，試劑盒的抗體和任何任選的抗癌劑可以在施用於患者之前分開保存在不同的容器中。試劑盒還可以包含用於容納無菌藥學上可接受的緩衝液或其他稀釋劑例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器裝置。

當試劑盒的組分以一種或多種液體溶液提供時，液體溶液較佳為水溶液，特佳為無菌水溶液或鹽水溶液。然而，試劑盒的組分可以作為乾粉提供。當試劑或組分以乾粉形式提供時，可以通過添加合適的溶劑來重構粉末。可以設想溶劑也可以提供於另一容器中。

如上簡要所述，該試劑盒還可含有向患者施用抗體或其抗原結合部分和任何任選組分的工具，例如一種或多種針，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他類似裝置，通過其可以將製劑注射或引入動物體內或將其施用於身體的患病區域。本發明的試劑盒通常還包括用於容納小瓶或類似物的裝 置以及用於商業銷售的其他緊密封閉的部件，例如注射或吹塑塑膠容器，其中放置並且保持所需的小瓶和其他裝置。

序列表概述

本申請附帶有包含許多胺基酸序列的序列表。下表A提供了所包含的序列的概述。

如本文中揭露的一種範例性抗VEGF/抗PD-L1雙特異性抗體，稱為W3256-U15T2.G6-1.uIgG1(在整篇說明書中可縮寫為W3256)。

實施例

通過參考以下實施例將更容易地理解本文一般地描述的本發明，這些實施例是以舉例說明的方式提供的，並且不旨在限制本發明。這些實施例並旨在表示下面的實驗是全部或僅進行的實驗。

實施例1

材料、基準抗體和細胞系的準備

1.1 材料的準備

表1中提供了實施例中使用的可商購獲得的材料的資訊。

1.2 抗原製備

編碼人VEGF(Uniport編號：P15692)、小鼠VEGF(Uniport編號：Q00731)和人PD-L1的胞外結構域序列(Uniport編號：Q9NZQ7)、小鼠PD-L1(Uniport編號：Q9EP73)、人PD-1(Uniport編號：Q15116)和小鼠PD-1(Uniport編號：Q02242)的DNA序列由Sangon Biothech(中國上海)合成，然後亞選殖到經修飾的pcDNA3.3表達載體中，在C末端帶有不同標籤(例如6xhis、人Fc或小鼠Fc)。

用純化的表達載體轉染Expi293細胞(Thermo Fisher Scientific，A14527)。將細胞培養5天，並收集上清液使用Ni-NTA柱(GE Healthcare，175248)、蛋白A柱(GE Healthcare，175438)或蛋白G柱(GE Healthcare，170618)進行蛋白質純化。通過SDS-PAGE和SEC對獲得的人VEGF、人PD-L1、小鼠PD-L1、人PD-1和小鼠PD-1進行質控，然後在-80℃保存。

1.3 基準抗體(BMK Ab)的產生

在Sangon Biothech(中國上海)或Genewiz(中國蘇州)合成了編碼抗VEGF抗體貝伐單抗(命名為WBP325-BMK3或WBP325-BMK3.uIgG1，序列來自Drug Bank，Drug Bank編號：DB00112)的片段的DNA序列，然後與人IgG1的Fc區一起亞選殖到經修飾的pcDNA3.3表達載體。

通過用人PD-L1的胞外域和小鼠PD-L1的胞外域交替免疫羊駝來產生抗PD-L1 VHH抗體(W3156-AP3R2-1A3-z12)，並分離PBMC用於噬菌體文庫的建構。在淘選、篩選和測序後，鑒定出獨特的陽性VHH片段(專利申請號PCT/CN2020/117351中揭露的SEQ ID No：4)。

將Roche開發的抗PD-L1抗體Atezolizumab(命名為W315-BMK8.uIgG1K(RKNA)或縮寫為W315-BMK8)用作對照抗體。

為了產生WBP325-BMK3，將含有重組VH和VL基因的質粒共轉染到Expi293細胞中。將細胞培養5天，並收集上清液使用蛋白A柱(GE Healthcare，175438)或蛋白G柱(GE Healthcare，170618)進行蛋白質純化。通過SDS-PAGE和SEC分析獲得的抗體，然後在-80℃保存。

1.4 穩定的細胞系/細胞集區的建立

表達PD-L1的細胞系

使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific，11668019)或PlasFect(Bioline，46026)，將CHO-K1或293F細胞用含有編碼全長人PD-L1或小鼠PD-L1或食蟹猴PD-L1的基因的表達載體轉染。在含有適當選擇標誌物的培養基中培養細胞。通過有限稀釋獲得人PD-L1高表達穩定細胞系(WBP315.CHO-K1.hPro1.C11)，小鼠PD-L1高表達穩定細胞系(WBP315.293F.mPro1.C1)和食蟹猴PD-L1高表達穩定細胞系(WBP315.293F.cPro1.2A)。

將人PD-L1或小鼠PD-L1或食蟹猴PD-L1的基因分別插入表達載體pcDNA3.3。然後將質粒分別轉染至CHO-K1細胞或293細胞。簡言之，對於CHO-K1細胞，在轉染前一天，將5x10⁵個CHO-K1細胞接種到6孔組織培養板的一個孔中，並在5%CO2和37℃下孵育。用3ml新鮮的非選擇性培養基(F12-K，10%FBS)培養細胞。在1.5ml管中製備轉染試劑，包括4μg DNA與10μg Lipofectamine 2000混合，以使最終體積在Opti-MEM培養基中為200μl。將移液管中的溶液逐滴加入細胞中。轉染後6-8小時，用PBS洗滌細胞，並加入3ml新鮮的非選擇性培養基。轉染後24-48小時，用胰蛋白酶收穫表達細胞，並接種到T75燒瓶中的選擇性培養基(F12-K，10%FBS，10μg/ml殺稻瘟素)中。對於 293F細胞，將20μg DNA與50μl PlasFect混合以在Opti-MEM培養基中使最終體積為200μl。將該混合物加到20ml(1×10⁶/ml)懸浮的293F細胞中，並在125ml燒瓶中的Freestyle293培養基中培養。轉染後48小時，加入殺稻瘟素作為選擇標誌物。選擇兩三遍後，用抗PD-L1抗體檢測細胞。通過有限稀釋分離穩定的單細胞選殖，並使用抗PD-L1抗體通過FACS進行篩選。

表達靶標的細胞系

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購自ScienceCell(貨號：8000)，並在含有鹼性培養基、5%FBS、1%內皮細胞生長因數(ECGS，ScienceCell，1052)的內皮細胞培養基(ECM，ScienceCell，貨號：1001)中培養。在37℃和5%CO2的培養箱中培養細胞。為了長期保存，將細胞在補充有5%(v/v)DMSO的完全生長培養基中冷凍並保存在液氮氣相中。

實施例2

抗PD-L1/VEGF雙特異性抗體的產生

2.1 表達載體的建構

將通過可撓性G4S接頭連接的編碼VHH抗體W3156-AP3R2-1A3-z12的DNA序列置於WBP325-BMK3(貝伐單抗)的輕鏈的N末端。使用與WBP325-BMK3(貝伐單抗)的序列相同的序列建構重鏈。將重組DNA序列分別選殖到經修飾的pcDNA3.3表達載體中。所建構的抗體命名為W3256-U15T2.G6-1.uIgG1(在整個揭露中可縮寫為“W3256”)。

如上所述，W3256-U15T2.G6-1.uIgG1的重鏈包含WBP325-BMK3的可變重鏈區(貝伐單抗)和人IgG1的恆定重鏈區(CH1-CH3)。W3256-U15T2.G6-1.uIgG1的輕鏈由WBP325-BMK3(貝伐單抗)的可變輕鏈區和人IgG1的恆定輕鏈區(CL)以及在N末端的VHH抗體W3156-AP3R2-1A3-z12構成，如圖1所示。W3256抗體的具體序列在下表2-4中列出。

2.2 轉染、表達和純化

根據製造商的說明，使用Expi293表達系統試劑盒(ThermoFisher-A14635)將重鏈和輕鏈表達質粒共轉染入Expi293細胞。轉染後5天，收集上清液，並使用Protein A柱(GE Healthcare-17543802)進行蛋白純化。抗體濃度通過NanoDrop測量。通過SDS-PAGE和HPLC-SEC評估蛋白質的純度。表達和純化後獲得雙特異性抗體，包括W3256-U15T2.G6-1.uIgG1。

2.3 產生用於體內研究(包括內毒素控制和測試)的雙特異性抗體

根據製造商的說明，使用Expi293表達系統試劑盒(ThermoFisher-A14635)將W3256-U15T2.G6-1.uIgG1表達質粒轉染到Expi293細胞中。轉染後五天，收集上清液，並在內毒素控制的條件下使用Protein A柱(GE Healthcare-17543802)進行蛋白純化。使用內毒素檢測試劑盒(GenScript-L00350)確認了低內毒素水平(低於10EU/mg)。

通過NanoDrop測量抗體濃度，W3256-U15T2.G6-1.uIgG1的產率為44.8mg/l。通過SDS-PAGE(圖2)和HPLC-SEC(圖3)評估蛋白質的純度。 根據HPLC-SEC，蛋白A一步純化後，W3256-U15T2.G6-1.uIgG1的純度為93.43%。

實施例3

雙特異性抗體的體外表徵

3.1 差示掃描螢光法(DSF)

使用7500快速即時PCR系統(Applied Biosystems)進行DSF測定。簡言之，將19μl雙特異性抗體溶液與1μl 62.5X SYPRO Orange溶液(ThermoFisher-S6650)混合，然後添加到96孔板中。將板以2℃/min的速率從26℃加熱至95℃，並收集所得的螢光資料。通過其操作軟體自動分析資料，並通過獲取所得螢光資料相對於溫度的負導數的最大值來計算Th。T_on可以大致確定為負導數圖開始從轉變前基線降低的溫度。

如圖4所示，W3256抗體的T_h1值為65.7℃。

3.2 人/食蟹猴VEGF結合(ELISA)

通過結合ELISA測定法測試抗體與人VEGF抗原(WBP325-hProl，Sino Biological，11066-HNAB)的結合。由於食蟹猴VEGF的胺基酸序列與人VEGF相同，因此該結合結果代表人VEGF的結合和食蟹猴VEGF的結合。簡言之，將96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher，442404)在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液(20mM Na₂CO3、180mM NaHCO₃，pH9.2)中用0.25μg/ml人VEGF於4℃包被過夜。用溶解於PBS中的2%(w/v)牛血清白蛋白(Pierce)進行1小時封閉步驟後，將W3256-U15T2.G6-1.UIgG1在PBS中的系列稀釋液在室溫在平板上孵育2小時。孵育後，將板用每孔300μL的含0.5%(v/v)Tween 20的PBS洗滌3次。加入100ng/ml山羊抗人IgG Fc-HRP(Bethyl，# A80-304P)並在室溫在板上孵育1小時。洗滌6次後，添加四甲基聯苯胺(TMB)底物(Sigma- 860336-5G)進行檢測。大約8分鐘後，通過每孔添加100μl的2M HCl終止反應。用多孔板讀數器(SpectraMax® M5^e)在450nm處測量孔的吸光度。

W3256在人VEGF上顯示出與WBP325-BMK3.uIgG1可比的結合能力，EC₅₀為約0.095nM(圖5)。

3.3 人PD-L1結合(FACS)

將工程化的人PD-L1表達細胞(WBP315.CHO-K1.hPro1.C11)以1×10⁵細胞/孔接種在U型底96孔板中。將W3256-U15T2.G6-1.UIgG1的系列稀釋液添加至細胞。將板在4℃孵育1小時。洗滌後，將FITC標記的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，109-095-008)添加到每個孔中，並將板在4℃孵育1小時。通過串流細胞儀測試抗體與細胞的結合，並通過FlowJo分析均值螢光強度(MFI)。

W3256在人PD-L1上還顯示了與W3156-AP3R2-1A3-z12-hIgG1可比的結合能力，EC₅₀為約0.128nM(圖6)。

3.4 人VEGF/人PD-L1雙重結合(ELISA)

為了測試雙特異性抗體是否可以結合VEGF和PD-L1兩者，開發了如下ELISA測定法。將96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher)在4℃用1μg/ml抗原-1(VEGF，WBP325-hPro1，Sino Biological)或1μg/ml抗原-2(PD-L1.ECD.mFc，W3153-hPro1.ECD.mFc)在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液中包被過夜。封閉1小時後，將W3256-U15T2.G6-1.UIgG1在酪蛋白緩衝液中的系列稀釋液在板上於室溫孵育1小時。孵育後，將板用每孔300μL的含0.5%(v/v)Tween 20的PBS洗滌3次。將0.5μg/ml抗原-2.Biotin(PD-L1-ECD，WBP315-hPro1.ECD.mFc)或0.5μg/ml抗原-1.Biotin(VEGF，WBP325-hPro1.his)加入板中並孵育1小時。洗滌板3次後，加入HRP標記的檢測二抗並在板上室溫孵育1小時。洗滌板6次後，加入四甲基聯苯胺(TMB)底物(Sigma-860336-5G) 進行檢測。大約10分鐘後，通過添加每孔100μL的2M HCl終止反應。用多孔板讀數器(SpectraMax® M5^e)在450nm處測量孔的吸光度。

結果表明，W3256與VEGF的結合不會影響隨後的PD-L1結合(圖7)，反之亦然(圖8)。

3.5 跨物種結合(FACS/ELISA)

食蟹猴PD-L1結合(FACS)

將工程化的食蟹猴PD-L1表達細胞(WBP315.293F.cPro1.2A)以1×10⁵細胞/孔的密度接種在U型底96孔板中。將W3256-U15T2.G6-1.UIgG1的系列稀釋液添加至細胞。將板在4℃孵育1小時。洗滌後，將FITC標記的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，109-095-008)添加到每個孔中，並將板在4℃孵育1小時。通過串流細胞術測試抗體與細胞的結合，並通過FlowJo分析均值螢光強度(MFI)。

小鼠VEGF結合(ELISA)

抗體與小鼠VEGF抗原(WBP325-mPro1，Sino Biological，50159-MNAB)的結合通過與上文描述的人VEGF結合相同的ELISA測定法進行，只不過包被蛋白為100μL 0.25μg/mL的小鼠VEGF。

小鼠PD-L1結合(FACS)

將工程化的小鼠PD-L1表達細胞(WBP315.293F.mPro1.C1)以1×10⁵細胞/孔的密度接種到U型底96孔板中。將不同抗體的系列稀釋液添加到細胞中。將板在4℃孵育1小時。洗滌後，將FITC標記的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，109-095-008)添加到每個孔中，並將板在4℃孵育1小時。通過串流細胞術測試W3256-U15T2.G6-1.UIgG1在細胞上的結合，並通過FlowJo分析均值螢光強度(MFI)。

食蟹猴VEGF的胺基酸序列與人VEGF相同，因此，W3256也具有與食蟹猴VEGF的結合活性。還評估了W3256與食蟹猴PD-L1、小鼠VEGF和小鼠PD-L1的跨物種結合活性。圖9、圖10和圖11顯示了它們與VEGF或PD-L1的結合活性。W3256在食蟹猴PD-L1上顯示與親本抗體可比的結合能力，EC₅₀為約2.618nM(圖9)。W3256不能與小鼠VEGF結合(圖10)。W3256在小鼠PD-L1上還顯示出與親本抗體可比的結合能力，EC₅₀為約1.687nM(圖11)。

3.6 與VEGF和PD-L1的結合親和力(SPR)

使用SPR技術來測量抗體對VEGF或PD-L1的ECD的結合速率常數(ka)和解離速率常數(kd)。因此確定了親和常數(KD)。

Biacore T200，S系列感測器晶片CM5，胺偶聯試劑盒和10x HBS-EP購自GE Healthcare。將抗體捕獲到固定在CM5-生物感測器晶片(GE Healthcare Inc.)上的抗人Fc IgG(Jackson，109-005-098)表面上。用HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare Inc.)作為運行緩衝液和稀釋緩衝液在25℃實施測定。注入連續稀釋的PD-L1抗原或VEGF抗原(W315-hPro1.ECD.his或W325-hPro1.his)和運行緩衝液用於結合階段和隨後的解離階段檢測。通過注射pH 1.5的10mM甘氨酸達到晶片表面的再生。

W3256的親和常數(KD)是根據SPR技術測量的。同時還測量了結合速率常數(ka)和解離速率常數(kd)。每個相互作用的最終資料都從參考通道和緩衝通道資料中扣除。分析實驗資料，如圖12和圖13所示。抗體的動力學親和力結果列於表5。

3.7 配體競爭測定(ELISA)

人VEGFR1競爭測定

通過競爭性ELISA測定了對VEGF與人VEGF受體1(W325-hpro1R1.ECD.hFc，Sino Biological，10136-H02H)結合的抑制作用。將96孔ELISA板(Nunc MaxiSorp，ThermoFisher，442404)在4℃用2μg/mL W325-hpro1R1.ECD.His在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液(20mM Na₂CO₃，180mM NaHCO₃，PH9.2)中包被過夜。所有孔用每孔300μL的PBS/0.5‰ Tween-20(v/v)洗滌3次，測定中隨後的所有洗滌步驟均相同。然後將孔用200μL/孔的50%酪蛋白(Thermo SCIENTIFIC，37528)封閉1小時，然後在洗滌步驟後，將系列稀釋的抗體和0.02μg/ml生物素標記的人VEGF(W325-hPro1.Biotin，ACRO Biosystems，VE5-H8210)混合物加入孔中，並在25℃孵育2小時。將板洗滌3次，然後加入在PBS/50%酪蛋白中1：10000稀釋的過氧化物酶連接的鏈黴親和素(Jackson，016-030-084)。將板在25℃孵育1小時，然後像之前一樣洗滌6次。將100μL/孔的四甲基聯苯胺(TMB)底物(Sigma，860336)添加到所有孔中8分鐘，然後用100μL 2M HCl終止反應。人VEGF-生物素與W325-hpro1R1.ECD.hFc結合的程度通過用多孔平板讀數器(SpectraMax® M5^e)測量 OD₄₅₀來確定。使用GraphPad Prism 5軟體通過四參數非線性回歸分析獲得結合的IC₅₀值。

W3256顯示出與親本抗體可比的與hVEGFR1的競爭結合能力，其結合VEGF的IC₅₀為約3.86nM(圖14)。

小鼠VEGFR1競爭測定

通過競爭性ELISA評估抗體阻斷VEGF結合小鼠VEGF受體1(W325-mpro1R1.ECD.hFc.his(R&D，471-F1)的作用。小鼠VEGFR1競爭ELISA方法類似於人VEGFR1競爭ELISA，只不過在96孔ELISA板上預包被的蛋白是2μg/ml的W325-mpro1R1.ECD.hFc.his，封閉緩衝液是PBS/2%BSA，而W325-hPro1.Biotin的濃度是0.44μg/ml。

W3256顯示出與親本抗體可比的與mVEGFR1的競爭能力(圖16)，其結合VEGF的IC₅₀為約31nM。

人PD-1競爭測定

通過基於FACS的競爭測定法測量W3256與人PD-1的競爭。將表達人PD-L1的CHO-K1細胞(WBP315.CHO-K1.hPro1.C11)以1×10⁵細胞/孔的密度接種到96孔U型底板中。將測試抗體的系列稀釋液與5μg/ml帶小鼠Fc標籤的人PD-1預混合，然後添加到細胞中，並在4℃孵育1小時。洗滌後，加入PE標記的抗小鼠IgG，並在4℃與細胞孵育45分鐘。將細胞洗滌兩次，並通過串流細胞儀測量細胞的MFI，並通過FlowJo進行分析。

W3256顯示出與親本抗體可比的競爭能力，其阻斷hPD-1與PD-L1結合的IC₅₀為約0.048nM(圖15)。

小鼠PD-1競爭測定

將表達小鼠PD-L1的CHO-K1細胞(WBP315.293F.mPro1.C1)以1×10⁵細胞/孔接種到96孔U型底板中。將測試抗體的系列稀釋液與5μg/ml帶 小鼠Fc標籤的鼠PD-1預混合，然後添加到細胞中，並在4℃孵育1小時。洗滌後，加入PE標記的抗小鼠IgG，並在4℃與細胞孵育1小時。將細胞洗滌兩次，並通過串流細胞儀測量細胞的MFI，並通過FlowJo進行分析。

W3256顯示出與親本抗體可比的競爭能力，其阻斷小鼠PD-1與PD-L1結合的IC₅₀為約1.687nM(圖17)。

3.8 HUVEC細胞增殖測定

評估了W3256在VEGF誘導的HUVEC增殖中的生物學活性。HUVEC細胞常規在ECM+5%FBS+1%ECGS中培養。用胰蛋白酶收集近匯合的細胞，用ECM+1%FBS+0.05%ECGS稀釋至1×10⁵細胞/mL。將細胞以5000個細胞/孔的密度接種在96孔透明底部黑色平板(Greiner，655090)中。加入系列稀釋的抗體以及50ng/mL的人VEGF(WBP325-hPro1，Sino Biological，11066-HNAB)。將板放回培養箱中4天，然後使用CellTiter Glo(Promega，G7573)評估細胞活力。將不添加配體的孔用作配體刺激的細胞生長的對照。通過在減去背景(無配體)發光後，比較有或沒有添加抗體(僅配體)的發光值，計算出測試抗體在抑制配體刺激的細胞生長上的效果。使用GraphPad Prism 5軟體，使用四參數非線性回歸分析來獲得增殖抑制IC₅₀值。

W3256以濃度依賴性方式有效阻斷VEGF誘導的HUVEC增殖，IC₅₀為約12nM，最大抑制率為101%(圖18)。

3.9 報告基因測定

通過胰蛋白酶收穫常規培養的CHOK1-OKT3-PD-L1細胞，並以20000個細胞/孔的密度接種在96孔透明底部黑色平板(Greiner，655090)中。添加了系列稀釋的抗體，以及整合了報告訊號NFAT-RE-Luc2p和表達全長PD-1的Jurkat細胞。將平板放回培養箱中4小時，然後添加50μl One-glo螢光素酶測定緩衝液/底物混合物。在多孔板讀數器M5e中測量發光。

W3256在報告基因測定中顯示了功能(圖19)，表明該抗體誘導PD-1訊號傳導途徑。

3.10 混合淋巴細胞反應(MLR)測定

使用MLR來測試PD-L1抗體對細胞因數、人IFN-γ分泌和活化的人CD4⁺ T細胞增殖的激動作用。

使用Ficoll-Paque PLUS梯度離心從健康供體中新鮮分離出人外週血單核細胞(PBMC)。在補充有100U重組人IL-2(SL PHARM)的完全RPMI-1640(含10%FBS和1%PS)中培養分離的PBMC。使用人單核細胞富集試劑盒根據製造商的說明分離單核細胞。在補充有800U/ml重組人GM-CSF和50μg/ml IL-4的完全RPMI-1640培養基中，將細胞濃度調整為2×10⁶細胞/ml。將細胞培養5至7天以分化為樹突細胞(DC)。每2-3天通過用補充有細胞因數的新鮮培養基替換一半培養基來補充細胞因數。在MLR前18至24小時，將1μg/ml LPS加入培養物中以誘導DC的成熟。根據製造商的方案使用人CD4⁺ T細胞富集試劑盒分離人類CD4⁺ T細胞。

使用完全RPMI-1640培養基在96孔圓底平板(Nunc，163320)中建立MLR。將CD4⁺ T細胞、各種濃度的抗體和成熟的DC添加到平板中。將平板在37℃、5%CO₂孵育。在第5天測定IFN-γ的產生。

使用匹配的抗體對通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)測量人IFN-γ。將重組人IFN-γ(PeproTech，300-02)用作標準品。將平板預先包被對人IFN-γ具有特異性的捕獲抗體(Pierce，M700A)。封閉後，將標準品或樣品吸移到每個孔中，並在環境溫度孵育2小時。除去未結合的物質後，將對IFN-γ具有特異性的綴合有生物素的檢測抗體(Pierce，M701B)加入孔中並分別孵育1小時。然後將綴合有鏈黴親和素的辣根過氧化物酶(HRP)(Invitrogen，SNN1004)添 加至孔中，在環境溫度孵育30分鐘。通過加入TMB底物顯色，然後用2M HCl終止。使用Microplate分光光度計在450和540nm讀取吸光度。

圖20顯示了在混合淋巴細胞反應測定中抗體對hCD4⁺ T細胞IFN-γ分泌的影響。結果表明，W3256在MLR中能以濃度依賴性方式誘導IFN-γ的分泌。

實施例4

體內抗腫瘤效果研究

4.1 小鼠體內的藥代動力學研究

從上海SLAC或BK Laboratory Co.,LTD.購買了雄性C57BL/6小鼠(6-8週，18-22g)，並在特定的無病原體條件下且可以自由獲取食物和水的WuXi Biologics(中國上海)的動物設施中進行飼養。

在單次靜脈內注射等摩爾濃度的W3256抗體後0、0.5、6、24、48、72、120、168小時收集雄性C57BL/6小鼠(n=5)的血樣。使用人IgG ELISA定量法和雙抗原結合ELISA法測量血清抗體濃度。

根據總的IgG結合結果，通過靜脈內注射路徑以11.5mg/kg的劑量注射時，W3256的半衰期為129小時(圖21)，在雙抗原結合PK測定中，通過靜脈內注射路徑以11.5mg/kg的劑量注射時，W3256的半衰期為104個小時(圖22)。

4.2 PBMC-RKO小鼠模型的功效

在補充有10%胎牛血清、100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的培養基中，在37℃和5%CO₂條件下以單層培養形式體外維持RKO腫瘤細胞。通過胰蛋白酶-EDTA處理每週兩次常規地將腫瘤細胞傳代培養。收穫在指數生長期生長的細胞並計數以進行腫瘤接種。

雌性NCG小鼠(6-10週齡)購自上海SLAC或Laboratory Co.,LTD.，並在特定的無病原體條件下且可以自由獲取食物和水的WuXi Biologics(中國上海)的動物設施中進行飼養。

每只小鼠皮下接種含50%基質凝膠的0.2ml PBS中的RKO腫瘤細胞(2 x 10⁶)以形成腫瘤，並在第0天腹膜內注射4 x 10⁶個PBMC(Hemacare)。治療從第7天開始。

主要終點是看是否能夠延緩腫瘤生長或治癒小鼠。使用卡尺每週兩次測量腫瘤大小，並使用以下公式以mm³表示體積：V=0.5 a x b²，其中a和b分別代表腫瘤的長直徑和短直徑。

提供每個時間點各組腫瘤體積的統計資料匯總，包括均值和均值的標準誤(SEM)。各組之間腫瘤體積差異的統計分析和藥物相互作用的分析是在最終劑量後(開始給藥後第28天)的最佳治療時間點獲得的資料上進行的。進行雙向ANOVA分析以比較各組之間的腫瘤體積，然後進行事後多重比較Dunnett的t檢驗(均與IgG組比較)。使用SPSS 17.0或Prism 5分析所有資料。p<0.05被認為具有統計學意義。

W3256顯示了在NCG小鼠的PBMC-RKO結直腸癌模型中的抗腫瘤效果，顯著優於W315-BMK8且與W325-BMK3可比(圖23)。

本領域技術人員可以認識和理解本專利描述，在不脫離其本質或基本特徵的情況下，本發明可以以其他具體形式來實施。由於本發明的前述描述僅揭露了其範例性實施方案，其他變化應該被理解為在本發明的範圍內。因此，本發明不限於在此詳細描述的特定實施方案。相反，應當參考所附申請專利範圍來指示本發明的範圍和內容。

<110> 甫康(上海)健康科技有限責任公司

<120> 一種雙特異性抗PD-L1/VEGF抗體及其用途

<130> IEC196155-TW WBP3256

<150> CN202010070440.X

<151> 2020-01-21

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 6

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 7

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 8

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 9

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH

<400> 10

<210> 11

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH VEGF

<400> 11

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL VEGF

<400> 12

<210> 13

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC

<400> 13

<210> 14

<211> 335

<212> PRT

<213> LC

<400> 14

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接頭

<400> 15

MFI:均值螢光強度

PBS:磷酸鹽緩衝鹽水

Claims (23)

1. 一種雙特異性抗體或其抗原結合部分，其包含與VEGF抗原結合模組聯合的PD-L1抗原結合模組，其中：該PD-L1抗原結合模組包含：包含SEQ ID NO：1的互補決定區1(CDR1)、包含SEQ ID NO：2的CDR2、和包含SEQ ID NO：3的CDR3；和該VEGF抗原結合模組包含：包含SEQ ID NO：4的重鏈互補決定區1(HCDR1)、包含SEQ ID NO：5的HCDR2、包含SEQ ID NO：6的HCDR3、包含SEQ ID NO：7的輕鏈互補決定區1(LCDR1)、包含SEQ ID NO：8的LCDR2、以及包含SEQ ID NO：9的LCDR3，該PD-L1抗原結合模組可操作地連接於該VEGF抗原結合模組的輕鏈的N末端。
2. 如請求項1所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該抗PD-L1抗原結合模組包含一可變域，該可變域包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10至少85%、90%、或95%相同的胺基酸序列。
3. 如請求項1所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該VEGF抗原結合模組包含：一重鏈可變域，其包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列或與SEQ ID NO：11至少85%、90%、或95%相同的胺基酸序列；和一輕鏈可變域，其包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列或與SEQ ID NO：12至少85%、90%、或95%相同的胺基酸序列。
4. 如請求項1-3中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該PD-L1抗原結合模組來自單域抗體(sdAb)。
5. 如請求項4所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該PD-L1抗原結合模組來自VHH抗體。
6. 如請求項5所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該VHH抗體衍生自駱駝科動物，包括羊駝(alpaca)和美洲駝(llama)。
7. 如請求項4所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該PD-L1抗原結合模組經由接頭可操作地連接於該VEGF抗原結合模組的輕鏈的N末端。
8. 如請求項7所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該接頭包含1至4個拷貝的序列SEQ ID NO：15或由其組成。
9. 如請求項1-3中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其包含一重鏈和一輕鏈，其中：該重鏈包含如VH-CH1-鉸鏈-Fc中可操作連接的域，其中VH-CH1來自該VEGF抗原結合模組；和該輕鏈包含如VHH-VL-CL中可操作連接的域，其中VHH來自該PD-L1抗原結合模組且VL-CL來自該VEGF抗原結合模組。
10. 如請求項9所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該Fc區是人IgG Fc區。
11. 如請求項9所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該Fc區為人IgG1 Fc區。
12. 如請求項9所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中重鏈包含SEQ ID NO：13，且輕鏈包含SEQ ID NO：14。
13. 如請求項1-3中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分，其中該雙特異性抗體是人源化抗體。
14. 一種分離的核酸分子，其包含編碼如請求項1-13中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分的核酸序列。
15. 一種載體，其如請求項14所述的核酸分子。
16. 一種宿主細胞，其包含如請求項14所述的核酸分子或如請求項15所述的載體。
17. 一種藥物組合物，其包含如請求項1-13中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分以及藥學可接受的載體。
18. 一種產生如請求項1-13中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分的方法，包括以下步驟：- 在請求項16所述的宿主細胞中表達如請求項1-13中任一項所述的抗體或其抗原結合部分；和- 從該宿主細胞分離該抗體或其抗原結合部分。
19. 一種如請求項1-13中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分在製備診斷、治療或預防癌症的藥物中的用途。
20. 如請求項19所述的用途，其中該癌症選自結腸癌、結直腸癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、腎癌、膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、淋巴瘤、黑素瘤、肝癌以及頭頸癌。
21. 如請求項20所述的用途，其中該癌症為結腸癌或結直腸癌。
22. 如請求項19-21中任一項所述的用途，其中該藥物還包括化療劑、放療及/或用於癌症免疫治療的其他藥劑。
23. 一種試劑盒，其包含如請求項1-13中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合部分。