TWI810644B

TWI810644B - 治療性草藥組合物

Info

Publication number: TWI810644B
Application number: TW110132930A
Authority: TW
Inventors: ＡＴ雅各; 賈亞拉曼巴拉西; 湯瑪士Ａ雅各
Original assignee: 印度商Ｆｆｆ生物工程公司
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2023-08-01
Also published as: TW202310824A

Abstract

本發明係關於一種治療性草藥組合物，其包含植物性化合物(即類薑黃素(curcuminoids)及類胡蘿蔔素(諸如葉黃素))之新穎組合。更特別地，該治療性草藥組合物包含類薑黃素及葉黃素以及賦形劑，其中該等類薑黃素係以24至49%之範圍存在，葉黃素係以1%至14.5%之範圍存在及該等賦形劑係在50至64%之範圍內。該治療性草藥組合物有效調節血脂概況、調節發炎效應且具有抗發炎效應。另外，該治療性草藥組合物有效控制由於諸如發炎、氧化壓力等因素引起之疾病，及諸如糖尿病性視網膜病變及年齡相關性黃斑變性之疾病。本發明亦提供一種用於製造此組合物之新穎方法及此組合物於食物、飲料(包括酒精飲料)中及作為營養品、膳食補充劑及藥物之用途。

Description

治療性草藥組合物

本發明係關於一種治療性草藥組合物，其包含植物性化合物(即類薑黃素及類胡蘿蔔素(諸如葉黃素))之新穎組合。更特別地，本發明係關於一種包含類薑黃素及葉黃素之治療性草藥組合物。本發明之治療性草藥組合物有利於人類之整體健康。該治療性草藥組合物有效調節血脂概況及調節發炎效應。本發明亦提供一種用於製造此組合物之方法及此組合物於食物、飲料(酒精飲料)中及作為營養品、膳食補充劑及藥物之用途。

發炎係免疫系統保護生物體免受感染及傷害之反應並藉由去除受損組織組分發揮作用，使得身體開始癒合。僅持續幾天之發炎反應稱為急性發炎，而持續時間較長之反應稱為慢性發炎。感染物/病原體(諸如病毒及細菌)係一些最常見之發炎刺激物。其他可刺激發炎之因素包括物理藥劑、化學物質、不適當之免疫反應及組織死亡。在許多器官系統(包括心臟、胰、肝、腎、肺、腦、腸道及生殖系統)中觀測到急性及慢性發炎介導之組織損傷。發炎係許多慢性疾病(包括癌症、動脈粥樣硬化、胰島素抗性、2型糖尿病及心血管疾病)之常見發病機制。

儘管發炎反應過程取決於初始刺激之精確性質及其於體內之位置，但其等均共用一個共同機制，該機制可總結如下：1)細胞表面模式受體識別有害刺激物；2)活化發炎途徑；3)釋放發炎標記；及4)募集發炎細胞。發炎途徑影響許多慢性疾病之發病機制，且涉及常見發炎介質及調節途徑。自循環系統、發炎細胞及受損組織釋放各種化學介質以調節發炎反應。釋放之化學介質包括(1)血管活性胺，諸如組織胺及血清素，(2)肽(例如，緩激肽)，及(3)類花生酸(例如，血栓素、白三烯及前列腺素)。前列腺素E2(PGE2)(一種調節分子之類花生酸家族之成員)於發炎部位大量產生，並參與導致發炎典型徵象之所有過程：發紅；腫脹及疼痛。發紅及水腫由流入發炎組織內之血流增加導致。

各種研究已表明，發炎細胞介素關於各種發炎疾病發揮重要作用。細胞介素(諸如介白素-1β(IL-1β)、介白素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α))通過與TLR、IL-1受體(IL-1R)、IL-6受體(IL-6R)及TNF受體(TNFR)相互作用介導發炎。受體活化觸發重要之細胞內訊息傳遞路徑，包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κ-B(NF-κB)及Janus激酶(JAK)-信號轉導與轉錄活化蛋白(STAT)途徑。該腫瘤壞死因子-α(TNF-α)係由多種細胞類型(包括巨噬球、嗜中性球及淋巴球)產生之細胞介素。

一氧化氮(NO)係在發炎之發病機制中發揮關鍵作用之訊息傳遞分子。一氧化氮在正常生理條件下產生抗發炎效應。另一方面，一氧化氮由於異常狀況中之過度產生而誘導發炎。一氧化氮已與急性及慢性發炎疾患相關，包括各種類型之關節炎、胃腸道疾病、中樞神經系統之發炎病症及某些形式之哮喘，且視為促發炎標記。NO之活體內產生由一氧化氮合成酶(NOS)酵素家族(包括誘導型一氧化氮合成酶(I-NOS))介導，NOS由許多不同之免疫刺激物(包括脂多醣(LPS)、干擾素γ及介白素-1 (IL-1))活化。因此，認為NO抑制劑適用於治療及/或控制發炎疾患。天然產物提供大量NO抑制劑。水果及蔬菜之疾病預防能力已歸因於此等膳食來源中存在之抗氧化劑/多酚。

肝發炎保護此器官免受感染及損傷，但過度發炎可導致肝細胞大量損失、缺血再灌注損傷、代謝改變並最終導致永久性肝損傷。發炎可破壞肝實質細胞，增加慢性肝病(諸如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)或病毒性肝炎)之風險。肝係生命器官，在各種內源性及外源性有害物質之代謝及解毒中發揮重要作用。肝中發生藥物之結構改變，導致生物活性或無活性代謝物且此等中之一些有毒。因此，肝係來自各種化學物質及藥物之損傷之脆弱目標。肝病之主要原因係毒性化學物質、過量飲酒、感染及自體免疫性疾病。

此外，已報導氧化代謝過程中產生的各種發炎刺激物(諸如過量活性氧物質(ROS)/反應性氮物質(RNS))及一些天然或人工化學物質啟動導致促發炎細胞介素之合成及分泌之發炎過程。氧化壓力係與多種疾病(諸如心血管疾病、癌症、糖尿病、高血壓、衰老及動脈粥樣硬化)之發病機制有關。氧化壓力係指ROS及氧化劑之產生與抗氧化劑之對抗活性之間的失衡。已認為氧化壓力係肝損傷之啟動及進展之主要因素。已知各種風險因素(諸如酒精及藥物)誘導氧化壓力，其進一步可導致慢性疾病(諸如脂肪肝疾病)。脂肪肝疾病包含酒精性肝病(ALD)及非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。越來越多的證據表明，由活性氧物質(ROS)之產生引起之氧化壓力在ALD及NAFLD之進展中起關鍵作用。ROS之過量產生在細胞功能中產生有害影響，最終導致脂肪肝疾病。在粒線體中，ROS產生增加可引起mtDNA耗竭、攻擊生物分子(即，蛋白質、碳水化合物及脂質)並損害粒線體膜。值得注意地，粒線體具有大量濃度的含有多不飽和脂肪酸(PUFA)之磷脂。該等PUFA更容易受到氧化損傷，因為其等化學結構中存在雙鍵，其導致脂質過氧化。PUFA過氧化增強ApoB之內質網後分泌前蛋白水解，藉此減少極低密度脂蛋白(VLDL)分泌；此可進一步促進肝中甘油三酯(TG)蓄積。此外，通過PUFA過氧化形成之醛損害細胞穩態，因為此等分子影響核苷酸及蛋白質合成，減少肝麩胱甘肽含量並增加促發炎細胞介素TNF-α之產生。此等影響導致肝細胞死亡及壞死、發炎及肝纖維化。

肝損傷通過數個相互關聯之途徑發生。酒精代謝主要發生在肝中。乙醇代謝之主要途徑係脫氫酶系統。酒精脫氫酶及乙醛脫氫酶使菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)還原為NADH(NAD之還原形式)。NAD/NADH比率之改變通過抑制糖質新生及脂肪酸氧化促進脂肪肝。慢性酒精曝露亦活化肝巨噬球，其然後產生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。TNF-α誘導粒線體增加活性氧物質(ROS)之產生。此氧化壓力促進肝細胞壞死及細胞凋亡。

因此，氧化壓力產物亦可用作發炎反應之標記。

糖尿病性視網膜病變(DR)係糖尿病併發症，其影響眼睛，導致視力殘疾及失明。常伴有脂質滲出。血脂異常導致硬性滲出物及臨床顯著黃斑水腫(CSME)之發展。此等進一步干擾視力。升高之脂質濃度係與內皮功能障礙相關聯，該內皮功能障礙似乎在糖尿病性視網膜病變之發病機制中發揮重要作用，特別與血液-視網膜屏障之破壞相關。最近，糖尿病控制及併發症試驗(DCCT)樣本中血脂概況之分析在DR之發展與1型糖尿病中之血脂異常之間建立緊密關聯，且數項使用降脂藥物之臨床試驗表明血脂異常與2型糖尿病中之DR進展之間存在關聯(Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes Follow-On,2016,Frank,2014,Matthews,2011,Wright and Dodson,2011)。

在靈長類動物視網膜黃斑中及周圍發現葉黃素類胡蘿蔔素葉黃素及玉米黃質，其中將其等稱為黃斑色素(MP)。膳食葉黃素及玉米黃質在腸道中與脂肪一起吸收，且最終傳輸至肝。將肝內之葉黃素及玉米黃質併入脂蛋白分子內，該等分子作為類胡蘿蔔素-脂蛋白複合物之部分在整個血流中運輸。MP及血清脂蛋白兩者均已與神經退化性疾病(諸如年齡相關性黃斑變性(AMD))之風險相關。AMD係慢性、進行性、退化性眼病，其影響負責最高視力之中央視網膜。其已成為發達國家及發展中國家老年人法定失明之主要原因。高密度脂蛋白(HDL)(與AMD風險降低相關)及低密度脂蛋白(LDL)(與風險增加相關)兩者上均攜載葉黃素及玉米黃質。因此，據報導血清葉黃素、視網膜葉黃素及脂蛋白濃度有顯著相關性，及脂蛋白濃度之變化可影響視網膜葉黃素之濃度。亦已顯示與外視網膜中低等級發炎及缺氧相關之氧化壓力在AMD之發病機制中係重要的。此與低黃斑色素光學密度(MPOD)可為AMD之風險因素的觀點一致，因為黃斑類胡蘿蔔素顯示作為抗氧化劑之有效性質。

因此，藉由使用抗發炎劑抑制及/或調節上文描述之發炎介質中之一或多者限制發炎過程對控制此過程並限制由其引起之疾病而言係重要的。然而，廣泛使用之合成抗發炎劑/藥物似乎長期使用將產生副作用。因此，仍需來自天然產物之更新穎且更好的抗發炎劑。

此外，如上文描述，維持身體之脂質概況對預防肝損傷(肝係生命器官)同樣重要，並藉此有助於控制由於諸如發炎、氧化壓力等因素引起之疾病，及諸如糖尿病性視網膜病變及年齡相關性黃斑變性之疾病。

植物性化合物係植物中存在的用於食物及藥品之生物活性化合物。植物性化合物(諸如類薑黃素及類胡蘿蔔素(諸如葉黃素及玉米黃質))因其促進健康之性質而聞名。

薑黃(Turmeric(Curcuma longa))係流行之印度香料，其係屬於薑科(ginger family(Zingiberaceae))的多年生根莖草本植物，其原產於南亞熱帶地區。薑黃主要因其在印度菜餚中作為咖喱及其他民族美食中之常見成分而聞名。薑黃在阿育吠陀醫學中亦使用數個世紀，阿育吠陀醫學將草藥之藥用性質與食物相結合。在阿育吠陀醫學系統中，已向薑黃分配許多治療性活性以用於範圍廣泛之疾病及病症中，包括彼等皮膚、肺、腸胃系統、酸痛、疼痛、傷口、扭傷及肝病。類薑黃素係薑黃根莖中之多酚化合物且係薑黃呈黃色之原因。類薑黃素佔乾薑黃根粉末之2至4%。薑黃素係薑黃之主要類薑黃素，及另外兩種類薑黃素係脫甲氧基薑黃素及雙脫甲氧基薑黃素。薑黃素之生物效應範圍從抗氧化、抗發炎至抑制血管生成且亦顯示具有特定抗腫瘤活性。已發現薑黃具有抗氧化性質，以及其具有減少促發炎細胞介素形成之能力。

薑黃素可以薑黃、薑黃之濃縮物、類薑黃素粉、基本上純(95%)類薑黃素或薑黃素的形式單獨投與。極大限制薑黃素之有效性及實用性之問題在於其低生體可用率，此歸因於水不溶性、生理pH下之不穩定性、光降解、細胞吸收緩慢及快速代謝成無活性代謝物。薑黃素之水溶性估計為11ng/mL(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/curcumin)。

動物中之藥物動力學研究已證實40至85%經口劑量之薑黃素通過胃腸道時無變化，及大多數吸收之類黃酮在腸黏膜及肝中代謝。人類及嚙齒類動物中之許多藥物動力學研究已顯示薑黃素具有非常低之生體可用率，從而限制其益處。此低生體可用率很可能由於其在腸道及肝中之低吸收及快速代謝及快速消除。由於薑黃素的低吸收率，因此薑黃素通常與其他植物化合物調配用於增加吸收並增強抗發炎效應。

I期臨床試驗已顯示，薑黃素即使在高劑量(12g/天)下在人體中亦為安全的，但顯示差生體可用率。限制薑黃素之生體可用率之潛在因素包括差吸收、快速代謝及快速全身消除。由於烹飪或溶解於油中，食物中攝取之薑黃素之生體可用率可增加。為改善生體可用率，已開始採取許多方法。此等方法涉及首先使用干擾葡萄糖醛酸化之佐劑(諸如胡椒鹼)；其次，使用脂質體薑黃素；第三，薑黃素奈米顆粒；第四，使用薑黃素磷脂複合物；且第五，使用薑黃素之結構類似物(例如，EF-24)。據報導後者吸收快速，及血漿半衰期達成峰值。儘管生體可用率較低，但類薑黃素針對各種人類疾病(包括癌症、心血管疾病、糖尿病、關節炎、神經疾病及克羅恩病(Crohn’s disease))之治療性效用已記錄在案。奈米顆粒、脂質體、膠束及磷脂複合物係其他具有前景之新穎調配物，其等似乎提供更長之循環、更好的滲透性及對代謝過程之抗性。因此當前需要增強薑黃素之生體可用率，以自薑黃素用於治療人類疾病之治療性性質獲得更大益處。

葉黃素屬於一大類植物色素，通常可見其異構體玉米黃質及痕量之其他胡蘿蔔素(諸如β-胡蘿蔔素)及隱黃質，統稱為類胡蘿蔔素。其在人類組織中之存在完全由於攝入植物來源；其非由動物組織合成。葉黃素存在於範圍廣泛之水果及蔬菜中且賦予其所在植物(諸如玉米)黃色。葉黃素在綠葉蔬菜(諸如菠菜、羽衣甘藍及芥藍)中之濃度特別高。由於動物食用植物產物，因此葉黃素亦存在於一些動物產物(諸如蛋黃)中。葉黃素及玉米黃質一起存在於許多食物來源中。深綠葉蔬菜係葉黃素及玉米黃質之主要來源，但其等亦以較少量存在於其他顏色之水果及蔬菜(諸如綠菜花、橙辣椒、玉米、豌豆、柿子及及紅橘)中。葉黃素通常與玉米黃質一起自萬壽菊油樹脂分離。在人類血液及組織中發現之20至30種類胡蘿蔔素中，僅葉黃素及玉米黃質存在於晶狀體及視網膜中。葉黃素及玉米黃質集中在視網膜之黃斑或中央區域，且稱為黃斑色素。

各種研究表明，葉黃素可降低老年人發展兩種最常見眼病(即，白內障及黃斑變性)之風險。由於強烈之光曝露及視網膜中之高氧化代謝率，因此眼中之氧化壓力高。葉黃素之抗氧化性質可降低氧化損傷促進此等疾病之程度或可藉由限制氧滲透膜之程度最小化由於氧化壓力導致之損傷。此外，已在個體(individual)之間發現最高血清或膳食葉黃素濃度與較低冠心病或中風發病率之間存在關聯。在兩項流行病學研究中，如由頸動脈內膜厚度量測，具有葉黃素加玉米黃質之最高血清濃度之個體患冠心病之風險顯著降低。葉黃素及玉米黃質在血漿中主要由高密度脂蛋白(HDL)運輸。

因此，如上文討論，薑黃素及葉黃素經證明為抗氧化劑且有助於由於氧化壓力引起之疾病。因此，自薑黃素及類胡蘿蔔素(諸如葉黃素及玉米黃質)製備包含類薑黃素之組合物將係有利的，該組合物將在調節脂質概況中具有潛在有利效應，藉由抑制及/或調節一或多種關鍵發炎介質之產生而具有抗發炎效應。

因此，本發明之目的係提供一種有效調節血脂概況且具有抗發炎效應之治療性組合物。另外，該治療性草藥組合物有效控制由於諸如發炎(包括由於病原感染引起之發炎)、氧化壓力等因素引起之疾病，及諸如糖尿病性視網膜病變及年齡相關性黃斑變性之疾病。

本發明之目的亦係提供一種治療性草藥組合物，其包含類薑黃素及類胡蘿蔔素(諸如葉黃素及玉米黃質)，該組合物在非常低之劑量下顯示其成分之協同效應且同時具有高生體可用率。

本發明係關於一種治療性草藥組合物，其包含植物性化合物(即類薑黃素及類胡蘿蔔素(諸如葉黃素))之新穎組合。更特別地，該治療性草藥組合物包含類薑黃素及葉黃素。該治療性草藥組合物有效促進健康，更特別地，有效調節血脂概況且具有抗發炎效應。該抗發炎效應係藉由抑制及/或調節一或多種關鍵發炎介質之產生而產生。另外，該治療性草藥組合物有效保護肝免受任何氧化損傷，包括由過氧化多不飽和脂肪酸引起之損傷，藉此有助於控制由於諸如發炎、氧化壓力等因素引起之疾病，及諸如糖尿病性視網膜病變及年齡相關性黃斑變性之疾病。本發明亦提供一種用於製造此組合物之新穎方法及此組合物於食物、飲料(酒精飲料)中及作為營養品、膳食補充劑及藥物之用途。

根據本發明之一實施例，提供一種包含植物性化合物類薑黃素及葉黃素之治療性草藥組合物。

根據本發明之一實施例，類薑黃素可以類薑黃素粉或類薑黃素濃縮物之形式使用及葉黃素可以葉黃素晶體或葉黃素濃縮物之形式使用。此外，如本文使用之術語「葉黃素」包括葉黃素及玉米黃質之混合物，因為玉米黃質通常連同葉黃素一起存在/分離。

根據本發明之一實施例，該治療性草藥組合物包含在24至49%之範圍內之類薑黃素粉/濃縮物，在1至14.5%之範圍內之葉黃素晶體/濃縮物及在50至64%之範圍內之賦形劑。此外，該類薑黃素粉/濃縮物可具有80至95%之類薑黃素含量及葉黃素晶體/濃縮物可具有70至80%之葉黃素含量及4.5至9%之玉米黃質含量。

根據本發明之一實施例，類薑黃素及葉黃素係以其等純化形式存在於治療性草藥組合物中。

根據本發明之一實施例，類薑黃素粉/濃縮物可自植物薑黃獲得/萃取及純化及葉黃素晶體/濃縮物可自萬壽菊植物金盞花(Tagetes erecta)或任何其他合適之植物來源獲得/萃取及純化。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物有效下調發炎途徑。該組合物亦減少活性氧物質(ROS)之形成並平衡NADH/NAD(菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)與NADH(NAD之還原形式))比率。此外，本發明之治療性草藥組合物亦有效控制脂肪肝形成。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物有效調節血脂概況且具有抗發炎效應。體內異常脂質概況及發炎之一些致病因素可為不健康飲食模式、攝入大量酒精、攝入含有大量過氧化多不飽和脂肪酸(PUFA)含量之食物或由於服用某些藥物。體內發炎亦可由病原感染引起，該病原感染由感染物/病原體諸如病毒(包括病毒諸如冠狀病毒病(COVID-19)及其他引起感染之病毒)及細菌引起。該抗發炎效應係藉由抑制及/或調節一或多種關鍵發炎介質之產生而產生。此外，本發明之治療性草藥組合物亦有效保護肝免受由不健康飲食模式引起之非酒精性脂肪肝疾病。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物有效抑制受感染細胞中氧化應激損傷。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物有助於保護肝免受肝過氧化。通過發明人在活體外及活體內進行之效用研究已建立相同結論。

根據本發明之又其他實施例，該治療性草藥組合物有效調節血脂概況。此外，該治療性草藥組合物有效維持健康之膽固醇濃度及健康之低密度脂蛋白與高密度脂蛋白(LDL/HDL)比率。該組合物亦有效降低升高之血清甘油三酯。由於該治療性草藥組合物有效調節血脂概況，因此其亦有效控制諸如糖尿病性視網膜病變及年齡相關性黃斑變性之疾病，因為該治療性草藥組合物導致黃斑色素光學密度(MPOD)快速增加。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物有效增加受感染細胞中非酵素抗氧化劑麩胱甘肽還原酶(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)之濃度。

根據本發明之另一實施例，如活體外研究顯示，該治療性草藥組合物有效減少受感染細胞中硫巴比妥酸反應性物質(TBARS)丙二醛(MDA)之產生，其中發現該治療性草藥組合物有效抵抗肝過氧化。

在本發明之一實施例中，如活體外研究，本發明之治療性草藥組合物有效防止受感染細胞中細胞核凋亡及細胞核碎裂。

在本發明之一實施例中，本發明之治療性草藥組合物有效降低促發炎細胞介素(TNF-α、IL-6及IL-1)濃度，此有利於減少可由不健康飲食模式、攝入大量酒精、攝入含有大量過氧化多不飽和脂肪酸(PUFA)含量之食物或由於服用某些藥物、由於病原感染，及由於酒精性及非酒精性脂肪肝疾病引起之肝發炎反應。

在本發明之一實施例中，本發明之治療性草藥組合物顯示降脂活性，因此其亦有效抵抗可由於飲酒、藥物及不健康飲食模式引起之肝毒性。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物可作為補充劑定期或在攝入高脂肪食物、藥物及/或酒精之前、期間或之後服用/攝取。

根據本發明之另一實施例，提供一種用於製造包含植物性化合物類薑黃素及葉黃素之治療性草藥組合物之方法，其中該方法包括：a)使用類薑黃素含量在80至95%之範圍內之類薑黃素粉/濃縮物及葉黃素含量在70至80%之範圍內及玉米黃質含量4.5至9%之葉黃素晶體/濃縮物並以預定量混合該類薑黃素粉/濃縮物及葉黃素晶體/濃縮物以形成摻合物；未處理乾燥摻合物之粒度可落於D₅₀-20μm至50μm及D₉₀-100μm至200μm之範圍內；b)將賦形劑諸如合適之乳化劑及麥芽糊精添加至該摻合物；c)將純化水添加至該摻合物以製造懸浮液；d)使該懸浮液通過液體膠體磨機以形成均勻懸浮液；e)使該懸浮液經受進一步處理諸如通過均質機或高剪切顆粒濕磨機以產生微粉化乳液；f)以25rpm之速度將該微粉化乳液進一步攪動8至12小時以使質量溫度升至25℃至40℃，較佳25℃至30℃之溫度；g)使該微粉化乳液經受進一步處理諸如濃縮及/或乾燥以獲得該治療性草藥組合物。

該方法進一步包括使經乾燥之治療性草藥組合物通過合適之顆粒篩以獲得均勻成品。此經處理治療性草藥組合物之粒度可落於D₅₀-0.36μm至5μm之範圍內及D₉₀在0.60μm至10μm之範圍內。此粒度減小有利於該治療性草藥組合物具有高生體可用率。

根據本發明之一實施例，類薑黃素粉/濃縮物及葉黃素晶體/濃縮物之預定量可為使得該類薑黃素粉/濃縮物在24至49%之範圍內，葉黃素晶體/濃縮物在1至14.5%之範圍內及賦形劑在50至64%之範圍內。

根據本發明之又其他實施例，最終經處理治療性草藥組合物包含在22.5%至46.5%之範圍內之類薑黃素、在0.90%至11.25%之範圍內之葉黃素及在0.06%至1.12%之範圍內之玉米黃質。顯而易見，最終組合物中玉米黃質之量構成該最終組合物中葉黃素總含量之大約6至9%。

根據本發明之一實施例，使用之賦形劑係麥芽糊精及乳化劑。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物可添加至食物及/或飲料產品或調配成膳食補充劑。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物可用作膳食/營養補充劑或用作各種食物及飲料產品中之治療性/健康成分。其中該治療性草藥組合物可用作健康成分之食物及飲料之一些實例包括(但不限於)茶、輸液、果汁、飲料、牛奶及牛奶製品、穀類產品、酒精飲料及加工食物等。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物亦可調配成選自由以下組成之群之合適劑型：粉末、糊劑、錠劑、糖漿及/或膠囊等。

根據本發明之另一實施例，植物性化合物類薑黃素及葉黃素在該治療性草藥組合物中顯示協同活性。此外，當相較於較高劑量之未調配葉黃素及未調配類薑黃素之生體可用率時，該治療性草藥組合物中存在之類薑黃素及葉黃素係高度生體可用。此外，該等類薑黃素及葉黃素係以遠低於建議每日需求量之量存在。

在完整說明書中更清楚描述本發明之上文及其他特徵及態樣。

本發明可根據下圖描述，其中：圖1(a)闡述不同濃度之未處理類薑黃素(U1)在人類肝癌(HepG2)細胞中之細胞毒性效應。

圖1(b)闡述不同濃度之未處理葉黃素(U2)在人類肝癌(HepG2)細胞中之細胞毒性效應。

圖1(c)闡述不同濃度之未處理治療性草藥組合物(U3)在人類肝癌(HepG2)細胞中之細胞毒性效應。

圖1(d)闡述不同濃度之經處理類薑黃素(P1)在人類肝癌(HepG2)細胞中之細胞毒性效應。

圖1(e)闡述不同濃度之經處理葉黃素(P2)在HepG2細胞中之細胞毒性效應。

圖1(f)闡述不同濃度之經處理治療性草藥組合物(P3)在HepG2細胞中之細胞毒性效應。

圖2(a)闡述不同濃度之未處理類薑黃素(U1)在乙醇誘導之HepG2細胞中之細胞毒性效應。

圖2(b)闡述不同濃度之未處理葉黃素(U2)在乙醇誘導之HepG2細胞中之細胞毒性效應。

圖2(c)闡述不同濃度之未處理治療性草藥組合物(U3)在乙醇誘導之HepG2細胞中之細胞毒性效應。

圖2(d)闡述不同濃度之經處理類薑黃素(P1)在乙醇誘導之HepG2細胞中之細胞毒性效應。

圖2(e)闡述不同濃度之經處理葉黃素(P2)在乙醇誘導之HepG2細胞中之細胞毒性效應。

圖2(f)闡述不同濃度之經處理治療性草藥組合物(P3)在乙醇誘導之HepG2細胞中之細胞毒性效應。

圖3(a)闡述未處理及經處理治療性草藥組合物對乙醇誘導之人類肝癌(HepG2)細胞中硫巴比妥酸反應性物質(TBARS)活性之治療效應。

圖3(b)闡述未處理及經處理治療性草藥組合物對乙醇誘導之人類肝癌(HepG2)細胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性之治療效應。

圖3(c)闡述未處理及經處理治療性草藥組合物對乙醇誘導之HepG2細胞中麩胱甘肽還原酶(GSH)濃度之治療效應。

圖4(a)係顯示經處理治療性草藥組合物在經對乙醯胺基酚(APAP)處理之HepG2細胞中之細胞毒性效應的條形圖。

圖4(b)係顯示水飛薊素在經APAP處理之HepG2細胞中之細胞毒性效應的條形圖。

圖5(a)闡述經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對經APAP處理之HepG2細胞中TBARS活性之治療效應之比較。

圖5(b)闡述經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對經APAP處理之HepG2細胞中SOD活性之治療效應之比較。

圖5(c)闡述經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對經APAP處理之HepG2細胞中GSH濃度之治療效應之比較。

圖6闡述未處理及經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對HepG2細胞中乙醇誘導之細胞內活性氧物質(ROS)產生之影響之比較。

圖7闡述未處理及經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對HepG2細胞中乙醇介導之粒線體膜電位(MMP)降低之影響之比較。

圖8闡述未處理及經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對HepG2細胞中乙醇誘導之細胞核凋亡之影響之比較。

圖9闡述未處理及經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對HepG2細胞中乙醇誘導之細胞核碎裂之影響之比較。

圖10闡述經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對HepG2細胞中APAP誘導之細胞內ROS產生之影響之比較。

圖11闡述經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對HepG2細胞中APAP介導之MMP減少之影響之比較。

圖12闡述經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對HepG2細胞中APAP誘導之細胞核凋亡之影響之比較。

圖13闡述經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對HepG2細胞中APAP誘導之細胞核碎裂之影響之比較。

圖14闡述在研究之第28天，經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對大鼠肝中乙醇誘導之組織病理學變化之效應。

圖15顯示類薑黃素之平均血漿濃度-時間曲線。

圖16顯示葉黃素之平均血漿濃度-時間曲線。

下文討論本發明之一些代表性實施例。本發明在其更廣泛之態樣中不限於特定細節及代表性方法。說明性實例結合本文提供之實施例及方法一起描述於此章節中。根據本說明書閱讀之隨附申請專利範圍中特別指出並清楚主張根據其各種態樣之本發明。

應注意，如本說明書及隨附申請專利範圍中使用，除非內文另有明確規定，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個參考物。因此，例如，包含「一種化合物」之組合物之提及包括兩種或更多種化合物之混合物。亦應注意，除非內文另有明確規定，否則術語「或」一般以其包括「及/或」之意義採用。

除非另有規定，否則以「%」表示之各種量意謂總溶液或組合物之重量百分比。

如本文使用之術語「葉黃素」包括葉黃素及玉米黃質之混合物，因為玉米黃質通常連同葉黃素一起存在/分離。

所有引用之參考文獻均係以全文引用之方式併入本文中。任何參考文獻之引用並非關於對其作為本發明先前技術之可用性之任何確定之承認。

除非另有明確定義，否則本文使用之技術及科學術語具有熟習本發明所屬領域之技術者通常瞭解之含義。本文對熟習此項技術者已知的各種方法論及材料作出參考。

熟習此項技術者已知的任何合適之材料及/或方法可用以進行本發明。然而，本文描述較佳材料及方法。除非另有提及，否則以下說明書及實例中作出參考之材料、試劑及類似物可自商業來源獲得。

本發明在其產品及方法態樣中係經如下詳細描述。

本發明係關於一種治療性組合物，其包含植物性化合物(即類薑黃素及類胡蘿蔔素(諸如葉黃素))之新穎組合。更特別地，該治療性草藥組合物包含類薑黃素及葉黃素。該治療性草藥組合物有效調節血脂概況及調節發炎效應。發炎效應或抗發炎效應之此調節係藉由抑制及/或調節一或多種關鍵發炎介質之產生而產生。另外，該治療性草藥組合物有效保護肝免受任何氧化損傷，包括由過氧化多不飽和脂肪酸引起之損傷，藉此有助於控制由於諸如發炎、氧化壓力等因素引起之疾病，及諸如糖尿病性視網膜病變及年齡相關性黃斑變性之疾病。本發明亦提供一種用於製造此組合物之新穎方法及此組合物於食物、飲料(包括酒精飲料)及營養品中及/或作為膳食補充劑之用途。

根據本發明之一實施例，該治療性草藥組合物包含類薑黃素及葉黃素。

根據本發明之一實施例，類薑黃素可以類薑黃素粉或類薑黃素濃縮物之形式使用及葉黃素可以葉黃素晶體或葉黃素濃縮物之形式使用。

根據本發明之一實施例，該治療性草藥組合物包含在24至49%之範圍內之類薑黃素粉/濃縮物、在1至14.5%之範圍內之葉黃素晶體/濃縮物及在50至64%之範圍內之賦形劑。此外，該等類薑黃素可具有80至95%之類薑黃素含量及葉黃素晶體/濃縮物可具有70至80%之葉黃素含量及4.5至9%之玉米黃質含量。

根據本發明之一實施例，類薑黃素及葉黃素係以其等經純化形式存在於該治療性草藥組合物中。

根據本發明之一實施例，類薑黃素粉/濃縮物可自植物薑黃獲得/萃取及純化及葉黃素晶體/濃縮物可自萬壽菊植物金盞花或任何其他合適之植物來源獲得/萃取及純化。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物有效下調發炎途徑及亦有效調節血脂概況。體內異常脂質概況及發炎之一些致病因素可能為不健康飲食模式、攝入大量酒精、服用某些藥物或服用飲食中含有大量過氧化多不飽和脂肪酸(PUFA)之食物。體內發炎亦可由病原感染引起，該病原感染由感染物/病原體諸如病毒(包括病毒諸如冠狀病毒病(COVID-19)及其他引起感染之病毒)及細菌引起。該抗發炎效應係藉由抑制及/或調節一或多種關鍵發炎介質之產生而產生。此外，本發明之治療性草藥組合物亦有效保護肝免受由不健康飲食模式引起之非酒精性脂肪肝疾病。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物對細胞中氧化應激損傷具有抑制作用。發明人已研究，該治療性草藥組合物有效抵抗肝細胞中之氧化應激損傷及肝過氧化，藉此指示該治療性草藥組合物抑制受感染細胞中氧化應激損傷，該損傷可由各種因素諸如酒精攝入、藥物攝入或不健康飲食模式(包括在飲食中攝入大量過氧化多不飽和脂肪酸PUFA等)引起。

根據本發明之另一實施例，如活體外研究中顯示，該治療性草藥組合物有效減少受感染細胞中硫巴比妥酸反應性物質(TBARS)丙二醛(MDA)之產生，其中發現該治療性草藥組合物有效抵抗肝過氧化。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物有效增加受感染細胞中非酵素抗氧化劑麩胱甘肽還原酶(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)之濃度。該等非酵素抗氧化劑之減少可由各種因素諸如酒精攝入、藥物攝入或不健康飲食模式(包括在飲食中攝入大量過氧化多不飽和脂肪酸PUFA等)引起。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物顯示抗發炎活性，因為該治療性草藥組合物有效減弱ROS之形成、平衡NADH/NAD比率及下調發炎途徑。本發明之治療性草藥組合物亦有效控制脂肪肝形成。

根據本發明之又其他實施例，本發明之治療性草藥組合物有效防止受感染細胞中活性氧物質(ROS)產生，藉此後續減弱受感染細胞中發炎之進一步退化途徑。ROS產生增加可由各種因素諸如酒精攝入、藥物攝入或不健康飲食模式(包括在飲食中攝入大量過氧化多不飽和脂肪酸PUFA等)引起。該治療性草藥組合物亦有效防止受感染細胞中細胞粒線體膜去極化。

在本發明之一實施例中，如由活體外研究建立，本發明之治療性草藥組合物藉由防止受感染細胞中細胞核凋亡及細胞核碎裂而有效抵抗由諸如酒精、藥物及不健康飲食模式之因素引起之肝毒性。

在本發明之又其他實施例中，如由臨床前研究建立，本發明之治療性草藥組合物有效抑制血清酵素，即丙胺酸胺基轉移酶(ALT)、天冬胺酸胺基轉移酶(AST)、酒精脫氫酶(ADH)及γ-麩胺醯轉移酶(GGT)之濃度增加。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物有助於保護肝免受肝過氧化。通過發明人進行之活體外及活體內效用研究已建立相同結論。

根據本發明之又其他實施例，該治療性草藥組合物有效正常化並維持脂質概況，藉此調節脂質概況。此外，該治療性草藥組合物有效維持健康之膽固醇濃度及健康之低密度脂蛋白與高密度脂蛋白(LDL/HDL)比率。該組合物亦有效降低升高之血清甘油三酯。此外，由於該治療性草藥組合物有效降低升高之血清甘油三酯並正常化脂質概況，藉此其亦有效控制諸如糖尿病性視網膜病變及年齡相關性黃斑變性疾病，因為該治療性草藥組合物導致黃斑色素光學密度(MPOD)快速增加。

根據本發明之又其他實施例，由於該治療性草藥組合物顯示降脂活性，因此其亦有效抵抗可由於飲酒、藥物及不健康飲食模式引起之肝毒性。

根據本發明之另一實施例，類薑黃素及葉黃素獲自天然來源，已知其等無副作用。

根據本發明之另一實施例，植物性化合物類薑黃素及葉黃素在治療性草藥組合物中顯示協同活性。此外，當相較於較高劑量之未調配葉黃素及未調配類薑黃素之生體可用率時，存在於該治療性草藥組合物中之類薑黃素及葉黃素係高度生體可用。此外，該等類薑黃素及葉黃素係以遠低於建議每日需求量之量存在。

本發明亦提供一種用於製造包含類薑黃素及葉黃素之治療性草藥組合物之方法，其中該方法包括下列步驟：a)使用類薑黃素含量在80至95%之範圍內之類薑黃素粉/濃縮物及葉黃素含量在70至80%之範圍內及玉米黃質含量4.5至9%之葉黃素晶體/濃縮物並以預定量混合該類薑黃素粉/濃縮物及葉黃素晶體/濃縮物以形成摻合物；未處理乾燥摻合物之粒度可落於D₅₀-20μm至50μm及D₉₀-100μm至200μm之範圍內；b)將賦形劑諸如合適之乳化劑及麥芽糊精添加至該摻合物；c)將純化水添加至該摻合物以製造懸浮液；d)使該懸浮液通過液體膠體磨機以形成均勻懸浮液；e)使該懸浮液經受進一步處理諸如通過均質機或高剪切顆粒濕磨機以產生微粉化乳液；f)以25rpm之速度將該微粉化乳液進一步攪動8至12小時以使質量溫度升至25℃至40℃，較佳25℃至30℃之溫度；g)使該微粉化乳液經受進一步處理諸如濃縮及/或乾燥以獲得該治療性草藥組合物。

此外，類薑黃素粉/濃縮物及葉黃素晶體/濃縮物之預定量可為使得該類薑黃素粉/濃縮物在24至49%之範圍內，葉黃素晶體/濃縮物在1至14.5%之範圍內及賦形劑在50至64%之範圍內。

使用之賦形劑係麥芽糊精及乳化劑。此外，可使用之乳化劑之一些實例係(但不限於)改質澱粉、哥地膠、阿拉伯膠(Gum Arabic)、亞拉伯膠(Gum Acacia)、甲基纖維素及蔗糖脂肪酸酯等。

根據本發明之另一實施例，可將該治療性草藥組合物添加至食物及/或飲料產品、調配成膳食補充劑、營養品及/或藥物。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物可用作營養品、藥物、膳食/營養補充劑或用作各種食物及飲料產品中之治療性/健康成分。其中該治療性草藥組合物可用作健康成分之食物及飲料之一些實例包括(但不限於)茶、輸液、果汁、飲料、牛奶及牛奶製品、穀類產品、酒精飲料及加工食物等。

根據本發明之另一實施例，該治療性草藥組合物亦可調配成選自由以下組成之群之合適劑型：粉末、糊劑、錠劑、糖漿、輸液及或膠囊等。

在本發明之一實施例中，亦可將該治療性草藥組合物添加至任何酒精飲料以抵消人們飲用酒精時的不良影響。

下列實例旨在進一步闡述本發明之某些較佳實施例且本質上非限制性的。熟習此項技術者將知曉或可確定，僅使用例行性實驗即可獲得本文描述之特定物質及程序之許多等效物。

實例1

在此實例中，描述本發明之代表性治療性草藥組合物，其包含按重量計之不同量之類薑黃素、葉黃素及賦形劑。表1顯示具有不同量之類薑黃素、葉黃素及賦形劑之治療性草藥組合物中所使用之組分及其量。此外，該等類薑黃素可以類薑黃素粉或類薑黃素濃縮物之形式使用且葉黃素可獲自葉黃素晶體或葉黃素濃縮物。

實例2

藉由如下文描述之方法製造如實例1中詳細闡述之治療性草藥組合物：以給定量將具有類薑黃素含量80至95%之類薑黃素粉/濃縮物及具有葉黃素含量70至80%及玉米黃質含量4.5至9%之葉黃素晶體與賦形劑(諸如改質澱粉乳化劑及麥芽糊精)混合在一起以製備摻合物(100g)。因此獲得之乾燥摻合物之粒度係D₅₀-20μm及D₉₀-100μm。然後用 333.4ml RO純化水重構此摻合物以製造懸浮液並進一步攪動直至該懸浮液中不存在團塊。然後在液體膠體磨機或液體濕磨機中預乳化該懸浮液以形成均勻乳液。使因此獲得之預乳液通過高壓均質機/高剪切顆粒濕磨機以產生亞微米尺寸乳液液滴。然後以達25rpm之速度將該微粉化乳液進一步攪動8至12小時以使質量溫度升至25℃至40℃，較佳25℃至30℃。此微粉化乳液以不超過110℃之腔室溫度進一步噴霧乾燥。然後收集噴霧乾燥粗粉並經受使用微粉碎機乾磨或空氣輔助高剪切乾磨。收集磨碎顆粒並使其等通過合適之顆粒篩且摻合以獲得最終產物。該最終粉末之粒度係在D₅₀-0.360μm至5μm及D₉₀-0.60μm至10μm之範圍內。

藉由上文方法製造之實例1之100gm治療性草藥組合物含有如下活性成分：類薑黃素含量22.5%至46.5%；葉黃素含量0.90%至11.25%及玉米黃質含量0.06%至1.12%。顯而易見，最終組合物中玉米黃質之量構成該最終組合物中葉黃素總含量之大約6至9%。

實例3

藉由如下文描述之方法製造如實例1中詳細闡述之治療性草藥組合物：將28.13g具有類薑黃素含量80%之類薑黃素粉及14.10g具有葉黃素含量80%及玉米黃質含量5.72%之葉黃素晶體與52.22g改質澱粉乳化劑及10g麥芽糊精混合在一起以製備摻合物(100g)。因此獲得之乾燥摻合物之粒度係D₅₀-40μm及D₉₀-155μm。然後用333.4ml RO純化水重構此乾燥摻合物以製造懸浮液並進一步攪動直至該懸浮液中不存在團塊。然後在液體膠體磨機或液體濕磨機中預乳化該懸浮液以形成均勻乳液。使因此獲得之預乳液通過高壓均質機/高剪切顆粒濕磨機以產生亞微米尺寸乳液液滴。以達25rpm之速度將該微粉化乳液進一步攪動8至12小時以使質量溫度升至25℃至40℃，較佳25℃至30℃。此微粉化乳液以不超過110℃之腔室溫度進一步噴霧乾燥。然後收集該噴霧乾燥粗粉並經受使用微粉碎機乾磨或空氣輔助高剪切乾磨。收集磨碎顆粒並使其等通過合適之顆粒篩且摻合以獲得最終產物。該最終粉末之粒度係D₅₀-2.76μm及D₉₀-5.44μm。

實例3中製造之100gm治療性草藥組合物含有22.5%類薑黃素、11.25%葉黃素及0.81%玉米黃質。

實例4

藉由如下文描述之方法製造如實例1中詳細闡述之治療性草藥組合物：將31.57g具有類薑黃素含量95%之類薑黃素濃縮物及3.85g具有葉黃素含量78%及玉米黃質含量5.10%之葉黃素濃縮物與54.58g改質澱粉乳化劑及10g麥芽糊精混合在一起以製備摻合物(100g)。因此獲得之乾燥摻合物之粒度係D₅₀-50μm及D₉₀-200μm。然後用333.4ml RO純化水重構此乾燥摻合物以製造懸浮液並進一步攪動直至該懸浮液中不存在團塊。然後在液體膠體磨機或液體濕磨機中預乳化該懸浮液以形成均勻乳液。使因此獲得之預乳液通過高壓均質機/高剪切顆粒濕磨機以產生亞微米尺寸乳液液滴。以達25rpm之速度將該微粉化乳液進一步攪動8至12小時以使質量溫度升至25℃至40℃，較佳25℃至30℃。此微粉化乳液以不超過110℃之腔室溫度進一步噴霧乾燥。然後收集該噴霧乾燥粗粉並經受使用微粉碎機乾磨或空氣輔助高剪切乾磨。收集磨碎顆粒並使其等通過合適之顆粒篩且摻合以獲得最終產物。該最終粉末之粒度係D₅₀-0.6μm及D₉₀-6.8μm。

實例4中製造之100gm治療性草藥組合物含有30%類薑黃素、3%葉黃素及0.20%玉米黃質。

實例5

藉由如下文描述之方法製造如實例1中詳細闡述之治療性草藥組合物：將48.95g具有類薑黃素含量95%之類薑黃素粉及2.65g具有葉黃素含量70%及玉米黃質含量7.0%之葉黃素晶體與38.40g改質澱粉乳化劑及10g麥芽糊精混合在一起以製備摻合物(100g)。因此獲得之乾燥摻合物之粒度係D₅₀-50μm及D₉₀-200μm。然後用333.4ml RO純化水重構此乾燥摻合物以製造懸浮液並進一步攪動直至該懸浮液中不存在團塊。然後在液體膠體磨機或液體濕磨機中預乳化該懸浮液以形成均勻乳液。使因此獲得之預乳液通過高壓均質機/高剪切顆粒濕磨機以產生亞微米尺寸乳液液滴。以達25rpm之速度將該微粉化乳液進一步攪動8至12小時以使質量溫度升至25℃至40℃，較佳25℃至30℃。此微粉化乳液以不超過110℃之腔室溫度進一步噴霧乾燥。然後收集該噴霧乾燥粗粉並經受使用微粉碎機乾磨或空氣輔助高剪切乾磨。收集磨碎顆粒並使其等通過合適之顆粒篩且摻合以獲得最終產物。該最終粉末之粒度係D₅₀-0.36μm及D₉₀-2.2μm。

實例5中製造之100gm治療性草藥組合物含有46.5%類薑黃素、1.86%葉黃素及0.18%玉米黃質。

實例6

藉由如下文描述之方法製造如實例1中詳細闡述之治療性草藥組合物：將48.95g具有類薑黃素含量95%之類薑黃素濃縮物及1.20g具有葉黃素含量75%及玉米黃質含量5.65%之葉黃素濃縮物與54.58g改質澱粉乳化劑及10g麥芽糊精混合在一起以製備摻合物(100g)。因此獲得之乾燥摻合物之粒度係D₅₀-50μm及D₉₀-200μm。然後用333.4ml RO純化水重構此乾燥摻合物以製造懸浮液並進一步攪動直至該懸浮液中不存在團塊。然後在液體膠體磨機或液體濕磨機中預乳化該懸浮液以形成均勻乳液。使因此獲得之預乳液通過高壓均質機/高剪切顆粒濕磨機以產生亞微米尺寸乳液液滴。以達25rpm之速度將該微粉化乳液進一步攪動8至12小時以使質量溫度升至25℃至40℃，較佳25℃至30℃。此微粉化乳液以不超過110℃之腔室溫度進一步噴霧乾燥。然後收集該噴霧乾燥粗粉並經受使用微粉碎機乾磨或空氣輔助高剪切乾磨。收集磨碎顆粒並使其等通過合適之顆粒篩且摻合以獲得最終產物。該最終粉末之粒度係D₅₀-4.8μm及D₉₀-9.9μm。

實例6中製造之100gm治療性草藥組合物含有46.50%類薑黃素、0.90%葉黃素及0.068%玉米黃質。

實例7

評估治療性草藥組合物對肝細胞上乙醇誘導之及藥物誘導之氧化壓力之治療效應之活體外研究。

目的：

研究之主要目的係研究本發明之治療性草藥組合物相比於水飛薊素對人類肝癌(HepG2)細胞系中乙醇及對乙醯胺基酚(APAP)誘導之氧化應激損傷之影響。由於水飛薊素廣泛用以治療肝病，因此其用以比較本發明之新穎治療性草藥組合物之效用。此外，由於乙醇係一般抗發炎劑且肝係不考慮該抗發炎劑之發炎常見靶部位，因此研究該草藥組合物對肝細胞之影響且該抗發炎劑以乙醇的形式使用。

細胞系及培養基：

在人類肝癌(HepG2)細胞中進行此工作。該等HepG2細胞獲自National Centre for Cell Science,Pune,India。在37℃下在5% CO₂氣氛中將細胞維持在具有10% FBS、1%麩醯胺酸及100U青黴素-鏈黴素之DMEM培養基中。將儲備液維持在T-75cm²組織培養瓶中。

實驗

細胞毒性研究

藉由MTT分析評估未處理類薑黃素(U1)、未處理葉黃素(U2)、未處理治療性草藥組合物(U3)及經處理類薑黃素(P1)、經處理葉黃素(P2)及經處理治療性草藥組合物(P3)、水飛薊素之無毒濃度及其針對乙醇及對乙醯胺基酚(APAP)誘導之細胞毒性之預防效應。

樣品之製備：

1.藉由使用經純化之類薑黃素粉並以預定量將其與乾燥成分(即乳化劑及麥芽糊精)混合製備未處理類薑黃素(U1)樣品。

2.藉由使用經純化之葉黃素濃縮物並以預定量將其與乾燥成分(即乳化劑及麥芽糊精)混合製備未處理葉黃素(U2)樣品。

3.藉由混合預定量的類薑黃素粉、具有6至9%玉米黃質之葉黃素並與預定量的賦形劑(諸如乳化劑及麥芽糊精)進一步乾燥摻合製備未處理治療性草藥組合物(U3)樣品。

3.藉由使用經純化之類薑黃素並將其與賦形劑(即乳化劑及麥芽糊精)混合製備經處理類薑黃素(P1)樣品。然後使此乾燥摻合物經受與如針對上文實例2至4之任一者中之治療性草藥組合物描述之處理類似之處理。

4.藉由使用經純化之葉黃素並將其與賦形劑(即乳化劑及麥芽糊精)混合製備經處理葉黃素(P2)樣品。然後使此乾燥摻合物經受與與如針對上文實例2至4之任一者中之治療性草藥組合物描述之處理類似之處理。

5.如上文實例2至6之任一者中描述製備經處理治療性草藥組合物樣品(P3)。

收集HepG2細胞並以密度(1x10⁵個細胞/孔)接種於96孔盤中。以確定24小時U1、U2、U3、P1、P2、P3(1.95、3.90、7.81、15.62、31.25、62.50、125、250、500及1000μg/ml)之毒性並進行MTT分析。為評估U1、U2、U3、P1、P2、P3針對乙醇及乙醇與APAP之治療性效用，用不同濃度之U1、U2、U3、P1、P2、P3(3.90、7.81、15.62、31.25、62.50及125μg/ml)及水飛薊素(3.12至200μg)將細胞預處理1h，然後曝露於乙醇(100mM)及對乙醯胺基酚(APAP)(20mM)。然後，添加100μl MTT溶液(5mg/ml於PBS中)並將該培養再延長4h。然後，添加100μl DMSO並使用多模平板閱讀器在570nm下量測吸光度。

脂質過氧化及抗氧化劑酵素活性分析

基於硫巴比妥酸反應性物質(TBARS)產生測定丙二醛(MDA)(脂質過氧化之指標)之濃度，根據套組方法(Himedia及Sigma)量測超氧化物歧化酶(SOD)活性及麩胱甘肽還原酶(GSH)。藉由標準分光光度法量測樣品。

用乙醇(100mM)U1、U2、U3、P1、P2及P3及水飛薊素將細胞培養24h。量測療性草藥組合物中之總GSH含量、SOD活性及脂質過氧化。

用APAP(20mM)及P3、水飛薊素將細胞培養24h。量測保肝組合物中之總GSH含量、SOD活性及脂質過氧化。

細胞內活性氧物質(ROS)之量測

使用可滲入細胞之細胞內基質中之非螢光探針2,7-二乙醯二氯螢光素(DCFH-DH)量測ROS，其中由ROS將該探針氧化為螢光二氯螢光素(DCF)。簡而言之，在正常磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)中，將分離細胞之等分試樣(8×10⁶個細胞/ml)定容至2ml之最終體積。取出1ml細胞等分試樣，對該等分試樣添加1μl DCFH-DA(1mg/mL)並在37℃下在黑暗條件下培養30min。在具有數位相機(Nikon 4500 coolpix,Japan)之螢光顯微鏡(Nikon,Eclipse TS100,Japan)上拍攝影像。

用62.50μg U1、U2、U3、P1、P2、P3及50μg水飛薊素將HepG2細胞處理1小時，然後用乙醇100mM處理24小時。使用螢光探針DCF-DA量測細胞內ROS蓄積。

粒線體膜電位(MMP)之測定

減小之MMP係早期細胞凋亡之徵象。在此研究中，由螢光染料羅丹明123(Rh 123)偵測MMP之差異。在6孔盤(1×10⁶)中培養HepG2細胞並在指示治療結束時收集該等細胞。在用測試化合物及乙醇或APAP培養24小時後，用Rh 123(5mmol/ml)將細胞培養15分鐘。然後用PBS沖洗細胞；在螢光顯微鏡下使用藍色濾光鏡(450至490nm)觀測螢光。

HepG2細胞之雙螢光及DAPI染色

HepG2細胞在35mm細胞培養皿中生長，用各候選化合物P3(62.50μg)、水飛薊素(50μg)及乙醇100mM或APAP(20mM)處理24h，並用杜爾貝科磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)清洗。使用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)螢光染色偵測與乙醇或APAP誘導之肝毒性相關之形態變化。以1：1混合溴化乙錠(100mg/mL)及吖啶橙(100mg/mL)並將DAPI 100mg mL添加至細胞，接著進行螢光顯微術以評估形態特性。

結果：

A.未處理及經處理成分及治療性草藥組合物在HepG2細胞中之細胞毒性效應

圖1(a、b、c)顯示不同濃度之未處理成分及治療性草藥組合物在HepG2細胞中之細胞毒性效應。圖1(d、e及f)顯示不同濃度之經處理成分及經處理治療性草藥組合物在HepG2細胞中之細胞毒性效應。

圖2(a、b、c)顯示不同濃度之未處理成分及治療性草藥組合物在乙醇誘導之HepG2細胞中之細胞毒性效應。而圖2(d、e、f)顯示不同濃度之經處理成分及治療性草藥組合物在乙醇誘導之HepG2細胞中之細胞毒性效應。

MTT分析顯示，在HepG2細胞中，細胞存活率在低濃度1.95至62.50μg/ml下未改變。另外，相較於乙醇，3.9至62.50μg/ml U1、U2、U3、P1、P2、P3導致細胞存活率顯著增加。當曝露於62.50μg/ml時，觀測到細胞之最大存活率(圖2(a、b、c、d、e及f))。

因此，選擇62.50μg/ml濃度之U1、U2、U3、P1、P2、P3作為所有其他研究之最佳保護濃度。

B.未處理及經處理成分及治療性草藥組合物對乙醇誘導之HepG2細胞中抗氧化劑酵素活性之治療效應

進行硫巴比妥酸反應性物質(TBARS)分析以研究U1、U2、U3、P1、P2、P3及水飛薊素改變HepG2細胞中乙醇誘導之脂質過氧化之能力(圖3a)。結果顯示乙醇刺激組相較於對照細胞之更高TBARS形成。但該TBARS形成分別由經處理細胞減少。

U1、U2、U3、P1、P2、P3及水飛薊素對乙醇誘導之SOD活性及GSH濃度之影響顯示於圖3(b)及3(c)中。相較於對照細胞，乙醇刺激顯著降低HepG2細胞中非酵素抗氧化劑GSH濃度及SOD活性。有趣地，相較於乙醇刺激組，經U1、U2、U3、P1、P2、P3及水飛薊素處理之細胞中SOD及GSH增加。

此外，經處理治療性草藥組合物(P3)之效應堪比水飛薊素及對照組之效應。此外，由P3顯示之效應優於由未處理組合物及個別組分類薑黃素(U1、P1)及葉黃素(U2、P2)顯示之效應。

因此，可自此等結果推斷，本發明之治療性草藥組合物之經處理形式(P3)顯示個別組分，即類薑黃素及葉黃素(具有6至9%玉米黃質)之協同活性。

C.經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素在經對乙醯胺基酚(APAP)處理之HepG2細胞中之細胞毒性效應

圖4(a)及4(b)顯示經處理治療性草藥組合物(P3)相比於水飛薊素在經APAP處理之HepG2細胞中之細胞毒性效應之比較。

在此研究中，APAP曝露在HepG2細胞中引起顯著之細胞毒性。然而，經處理治療性草藥組合物(P3)(62.50μg)預處理在HepG2細胞中顯著防止APAP誘導之細胞毒性；結果堪比水飛薊素(50μg)之結果。

D.經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對對乙醯胺基酚(APAP)誘導之HepG2細胞上之抗氧化劑酵素活性之治療效應

可自圖5(a)推斷，當相較於對照治療時，APAP誘導之HepG2細胞中TBARS之濃度增加。此外，在APAP誘導前使用62.50μg經處理治療性草藥組合物(P3)之處理顯著阻止APAP介導之TBARS濃度。此等結果堪比由水飛薊素(50μg)顯示之效應。

抗氧化劑充當針對自由基之主要防禦。由於產生過量ROS，因此APAP誘導之HepG2細胞顯著降低細胞抗氧化狀態。相反，如圖5(b)及(c)中可見，在誘導APAP之前，使用62.50μg經處理治療性草藥組合物(P3)及50μg給定之水飛薊素濃縮物之處理顯著阻止HepG2細胞中APAP誘導之抗氧化狀態(SOD及GSH濃度)損失。

E.未處理及經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對乙醇誘導之細胞內ROS產生之影響

可自圖6推斷，相較於未處理對照組，由乙醇單獨刺激之HepG2細胞中ROS濃度增加。相反，U1、U2、U3、P1、P2、P3(62.50μg/ml)及水飛薊素(50μg/ml)顯著阻止HepG2細胞中乙醇誘導之ROS產生。藉由用62.50μg/mL經處理治療性草藥組合物(P3)處理的ROS產生的減少堪比50μg/mL水飛薊素處理之結果。

F.未處理及經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對乙醇介導之MMP減少之效應

圖7描述相較於對照，曝露於乙醇100mM 24小時之細胞中粒線體膜電位顯著降低。相較於對照，藉由破壞外膜誘導之粒線體膜電位之去極化導致該粒線體中染料之損失及細胞內螢光之降低。相反，用62.50μg/mL的U1、U2、U3、P1、P2及P3及50μg/mL水飛薊素預處理24小時減弱乙醇誘導之粒線體膜去極化，其由螢光強度之增加顯示。

結果指示，經處理治療性草藥組合物(P3)可顯著增加細胞內螢光，藉此指示對防止細胞粒線體膜電位之去極化具有積極效應，且此等結果堪比已知保肝劑水飛薊素之效應。

G.未處理及經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對乙醇誘導之細胞核凋亡之影響

圖8顯示在用AO/EtBr染色之後，對照及乙醇誘導之HepG2細胞中之螢光顯微術形態變化。該圖正繪示顯微照相，其正顯示經處理治療性草藥組合物(P3)62.50μg及水飛薊素50μg對HepG2細胞中乙醇100mM誘導之細胞凋亡形態變化之影響。可見經處理治療性草藥組合物(P3)抑制如HepG2細胞中藉由AO/EtBr染色進行染色之細胞凋亡，其堪比由水飛薊素顯示之效應。

H.未處理及經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對乙醇誘導之細胞核碎裂之效應

如圖9中顯示，經100mM乙醇處理的HepG2細胞引起細胞核濃縮及碎裂。可見在乙醇曝露之前經處理治療性草藥組合物(P3)及水飛薊素處理兩者由於其等強自由基清除性質而均減少細胞核濃縮及碎裂。

I.經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對APAP誘導之細胞內ROS產生之影響

經APAP 20mM處理的HepG2細胞引起DCF螢光增加。用經處理治療性草藥組合物(P3)62.50μg/ml預處理細胞降低DCF螢光，且其指示相較於APAP單獨處理組，P3顯著降低APAP誘導之自由基釋放(圖10)。

J.經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對對乙醯胺基酚(APAP)介導之MMP減少之效應

如圖11中顯示，在用Rh-123處理後，藉由測定綠色螢光比率量測粒線體膜電位(△Ψm)。將經APAP處理之細胞極化並顯示顯著△Ψm及相較於對照減少之綠色螢光。相較於經APAP單獨處理之細胞，用經處理治療性草藥組合物(P3)預處理細胞增加綠色螢光，此指示粒線體膜之去極化狀態。此外，經處理治療性草藥組合物(P3)及水飛薊素分別顯示相似效應。

K.經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對APAP誘導之細胞核凋亡之效應

圖12顯示顯微照相，其顯示經處理治療性草藥組合物(P3)62.50μg及水飛薊素50μg對HepG2細胞中APAP 20mM誘導之細胞凋亡形態變化之效應。可自圖12推斷，經處理治療性草藥組合物(P3)抑制HepG2細胞中如藉由AO/EtBr染色進行染色之細胞凋亡，且該等結果堪比由水飛薊素顯示之效應。

L.經處理治療性草藥組合物相比於水飛薊素對APAP誘導之細胞核碎裂之效應

如圖13中可見，在細胞中觀測到經20mM APAP處理的HepG2細胞引起細胞核濃縮及碎裂及形態變化。相較於經APAP單獨處理之細胞，在APAP曝露之前，用經處理治療性草藥組合物(P3)及水飛薊素預處理抑制細胞核濃縮及碎裂。

實例8：活體內研究

治療性草藥組合物抵抗韋斯大鼠中酒精誘導之肝損傷之效應

研究目的：

1.監測治療性草藥組合物(P3)對實驗大鼠之初始及最終體重中酒精誘導之肝損傷變化之效應。

2.藉由評估脂質概況濃度甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，評估不同劑量的治療性草藥組合物(P3)對酒精誘導之肝毒性之效應。

3.確定肝標記酵素之活性：天冬胺酸胺基轉移酶(AST)、丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及γ-麩胺醯轉移酶(GGT)。

4.藉由評估脂質過氧化標記丙二醛(MDA)及4-羥基壬烯醛(4-HNE)，評估不同劑量的治療性草藥組合物(P3)對酒精誘導之肝毒性之效應。

5.在大鼠中在酒精誘導之肝毒性期間評估發炎(腫瘤壞死因子α(TNF-α)及介白素6(IL-6)及介白素1(IL-1))標記。

材料及方法：

動物-

雄性韋斯大鼠，稱重130至150g，購買自Biogen Laboratory Animal Facility,India。動物在標準生態箱條件下在25±2℃下以12h光：暗循環適應環境。動物隨意餵食標準大鼠飼料及水。實驗前禁食18至24h。實驗室動物之護理及使用根據印度CPCSEA理事會指令(MCAS/IAEC/2019/6/9/2/2019)關於動物實驗之良好實驗室規範進行。

實驗設計及治療時間表：

將實驗雄性韋斯大鼠分成六組，各組含有六隻動物，分析28天總實驗時期及乙醇、水飛薊素及經處理治療性草藥組合物P3之投與劑量如下：

對照及乙醇組經由灌胃針歷時28天分別接受0.9%鹽水。為檢查治療性性質，在乙醇投與前30min，以200mg/Kg體重的劑量對大鼠投與水飛薊素及治療性草藥組合物(P3)，歷時28天。

動物飼料之組成：

蛋白質-17.7%、脂肪-4.2%、碳水化合物-50.5%、纖維-3.4%、礦物質-6.7%及維生素-1.7%。

在研究之第28天，使用氯仿麻醉所有動物，通過靜脈從對照及實驗大鼠收集血液樣本。以3000rpm將血液樣本離心30min，將血清樣本保存在-20℃之冷凍器中直至分析。亦立即取出經處死動物之肝，在冰冷生理鹽水中適當沖洗，吸乾並稱重，以記錄器官重量。然後將肝組織之一部分立即浸入適當之固定劑內以供進一步之組織病理學研究。保存肝之剩餘部分以供生化分析。

肝重量與體重之量測

記錄治療時期結束時所有動物之體重，連同其等處死當天之肝重量，以測定各組中動物之肝重量與最終體重。

組織勻漿之製備

使用組織均質機，在含有1mM EDTA之冰冷磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(pH 7.4)中製備10% w/v肝組織勻漿。然後在4℃下以10,000rpm將該勻漿離心30分鐘。因此獲得之上清液進一步用於組織氧化壓力標記之後續生化分析。

生化分析

藉由Lowry等人(1951)之方法評估蛋白質含量。藉由使用市售診斷套組(Micro clinical lab,Tamil Nadu)進行天冬胺酸胺基轉移酶(AST)、丙胺酸胺基轉移酶(ALT)、γ-麩胺醯轉移酶(GGT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙二醛(MDA)及4-羥基壬烯醛(4-HNE)分析。

肝ADH活性

藉由Bonnichsen及Brink(1955)之方法測定酒精脫氫酶(ADH)活性。簡而言之，在1ml最終體積中的50mM甘胺酸(pH 9.6)、0.8mM NAD、3mM乙醇及50μl胞質部分中量測ADH活性。在340nm下量測酵素活性並使用6.22×106M-1 cm-1之莫耳消光係數將該活性計算為nmol NADH形成/min/mg蛋白質。

細胞介素評估

亦使用市售ELISA套組進行促發炎細胞介素，即腫瘤壞死因子α(TNF-α)及介白素6(IL-6)及介白素1(IL-1)之評估，並以皮克每毫升 (pg/mL)(Biovision,Milpitas,CA,USA)表示。

組織病理學研究

將來自對照及經處理動物之大鼠肝組織之一部分直接固定於10%福爾馬林緩衝液中並在用鹽水定期清洗及脫水後包埋於石蠟中。在所有過程後，然後自組織塊使用切片機製備3至5μm厚之切片。然後該等組織切片用蘇木精及曙紅(H&E)染色。在顯微鏡下觀測該等組織切片並使用附接至其之數位相機捕獲對應影像。

統計學分析

各實驗重複至少三次。數據表示為平均值±S.E。在確定處理組之間之方差同質性後，使用方差分析(ANOVA)之單因素事後檢驗(圖基HSD檢驗)分析該等處理組之間不同參數之平均值的顯著性。使用SPSS軟體20.0版進行統計學測試。p<0.05之值視為統計學顯著。

結果：

A.經處理治療性草藥組合物對一般觀測體重之效應

表2顯示對照及實驗大鼠中水及食物之攝入量。在整個研究期間，對照組與實驗大鼠之間食物及水消耗量無差異。

表3及3a顯示乙醇及本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)分別對大鼠之對照組及實驗組中體重、體重增加及生長速率及肝重量之影響。相比於未處理對照(組1)大鼠，乙醇誘導之大鼠中體重降低，而肝重量顯著增加(P<0.05)，而當相較於組2大鼠時，在用經處理治療性草藥組合物(P3)處理之大鼠(組4至7)中其似乎接近正常。當相較於組1大鼠時，在組2大鼠中，體重、體重增加及生長速率顯著降低(p<0.05)。用具有不同量的類薑黃素及葉黃素(此外具有6至9%玉米黃質)之本發明之治療性草藥組合物(P3)處理亦顯示針對藉由乙醇處理大鼠誘導之體重損失之保護，且堪比由水飛薊素顯示之效應。

*值係以各組之平均SD給定。

*值係以各組之平均SD給定。

*值係以各組之平均SD給定。

B.本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)對肝功能標記酵素變化之效應

表4指示對照及實驗大鼠中肝標記酵素活性之變化。乙醇之投與分別顯著增加(p<0.05)AST、ALT及GGT濃度。最終，相較於經乙醇處理之大鼠，具有4mg至52mg量之類薑黃素及1.05mg至2mg量之葉黃素之本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)以200mg/Kg之劑量共處理(組4至7)顯著(p<0.05)降低AST、ALT及GGT之升高濃度。此外，由具有4mg至52mg量之類薑黃素及1.05mg至2mg量之葉黃素之本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)顯示之結果(組4至7)堪比水飛薊素之結果。

表4：治療性草藥組合物(P3)對各組(n=6)中對照及實驗大鼠之乙醇誘導之肝功能標記酵素變化之效應。

*值係以各組之平均SD給定。

乙醇消耗增強肝細胞中NADH/NADP之比率，此引起粒線體中脂肪酸之β-氧化之破壞，從而導致脂肪變性。酒精亦增加脂質自小腸運輸至肝，此導致脂肪酸自脂肪組織之移動增強，脂肪酸由肝吸收(1)。此引起肝細胞之細胞膜受損，從而導致血流中轉胺酶(丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及AST(天冬胺酸胺基轉移酶))濃度減弱。γ-麩胺醯轉移酶(GGT)在維持細胞內氧化壓力穩態中發揮關鍵作用，其保護細胞免受氧化損傷。γ-麩胺醯轉移酶存在於細胞膜中且當細胞膜受損時在循環中釋放。

本發明發現顯示，相較於對照組，乙醇投與觸發血清AST、ALT及GGT酵素活性顯著增加。此等增加由於酒精中毒引起之肝發炎。投與具有不同量之其組分，即類薑黃素及葉黃素(此外具有6至9%玉米黃質)之本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)有效緩解由酒精攝入引起之血清酵素濃度增加，且導致後續恢復至正常，其堪比對照組動物。

C.本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)對乙醇誘導之脂質概況變化之效應。

表5顯示藉由評估對照及實驗大鼠中脂質概況，即TG、TCH、LDL-C濃度及HDL-C濃度，比較具有不同量之其組分，即類薑黃素及葉黃素(此外具有6至9%玉米黃質)之經處理治療性草藥組合物(P3)對乙醇誘導之肝毒性之效應。

可自表5推斷，用乙醇處理亦破壞身體之脂質概況穩態，導致TG、TCH及LDL-C濃度分別增加，連同HDL-C濃度同時降低(p<0.05)。用本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)共處理將TG、TCH及LDL-C、HDL-C濃度之上文變化顯著逆轉至接近正常值(p<0.05)。在乙醇代謝期間，產生大量還原型菸鹼醯胺-腺嘌呤二核苷酸(NADH)，因此，抑制克氏循環(Krebs cycle)及脂肪酸氧化，此有利於肝脂肪變性及血清高脂血症(2)。

另外，乙醇基團亦顯示TCH、TG、LDL濃度增加連同HDL濃度同時降低。然而，用經處理治療性草藥組合物(P3)處理減弱脂質概況濃度之上文變化。因此，本發明之治療性草藥組合物(P3)有效維持該脂質概況。此外，該組合物有效維持健康之膽固醇濃度及健康之LDL/HDL比率並降低升高之血清甘油三酯濃度。

用經處理治療性草藥組合物(P3)處理之動物之低膽固醇血症活性可歸因於通過升高之血清HDL濃度增加膽固醇之肝廓清率，或歸因於膽固醇生物合成酵素HMG-CoA還原酶(3)之下調。

*值係以各組之平均SD給定。

D.本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)對乙醇誘導之肝ADH、MDA及4-HNE變化之效應

表6顯示具有不同量之其組分，即類薑黃素及葉黃素(此外具有6至9%玉米黃質)之本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)對乙醇誘導之肝ADH、MDA及4-HNE濃度變化之效應之比較。相較於對照組，乙醇處理組(組2)顯示ADH、MDA及4-HNE濃度顯著增加。乙醇對照組中ADH、MDA及4-HNE濃度增加指示存在肝細胞之脂質概況，其係由於乙醇之毒性效應。

相較於經乙醇處理之大鼠，用具有4mg至52mg量之類薑黃素及1.05mg至2mg量之葉黃素之本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)以200mg/Kg之劑量共處理(組4至7)顯著(p<0.05)降低升高之ADH、MDA及4-HNE濃度。

*值係以各組之平均SD給定。

E.本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)對乙醇誘導之細胞介素濃度變化之效應

表7指示本發明之經處理治療性組合物(P3)對乙醇誘導之細胞介素濃度變化之效應。可見相較於對照組1，投與乙醇導致血清TNF-α、IL-6及IL-1濃度顯著增加(p<0.001)。表7顯示在經乙醇處理之組2中，血清TNF-α、IL-6及IL-1濃度分別增加。如在組4至7之結果中可見，用經處理治療性草藥組合物(P3)共處理引起血清TNF-α、IL-6及IL-1濃度之顯著降低。

表7：本發明之治療性草藥組合物(P3)對乙醇誘導之細胞介素濃度變化之效應

*值係以各組之平均SD給定。

F.肝組織之組織病理學分析

圖14中顯示之組織學特徵指示對照大鼠中正常肝小葉結構及肝之細胞結構。健康對照肝中無病理學變化。在乙醇誘導之大鼠(即，組2)中，在連續攝入2.4gm/kg bw乙醇4週後，藉由組織學分析評估肝損傷程度。例如，小葉中心肝細胞中觀測到肝竇擴張、擠壓及索萎縮，可能表明肝細胞再生；中央靜脈周圍觀測到單核細胞及壞死細胞之輕微浸潤。在小葉中心區域中觀測到空泡變化及可能之脂肪變性。簡而言之，小葉中心區域中肝細胞腫脹、水樣變性及空泡化變得明顯，此反映由酒精性肝損傷引起之早期生化及病理學變化。

乙醇處理組2大鼠在中央靜脈周圍顯示發炎反應伴有空泡變性及壞死。在組3、4及5中，肝組織在中央靜脈周圍顯示較少之空泡變性及較少之發炎反應。組6及7肝組織顯示幾乎正常之結構。因此，本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)顯著改善乙醇誘導之組織病理學變化，尤其在具有4mg至52mg量之類薑黃素及1.05mg至2mg量之葉黃素之本發明之組合物(P3)中(組4至7)，其相較於經乙醇處理之組，顯著減輕肝中脂肪變性且顯示明顯之改善。

研究之結論

總之，活體內研究證實本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)有效正常化並維持脂質概況。此外，該組合物有效維持健康之膽固醇濃度及健康之LDL/HDL比率並有效降低升高之血清甘油三酯濃度。此外，本發明之治療性草藥組合物有效正常化並維持血清酵素(即AST、ALT、ADH及GGT)濃度。評估脂質過氧化標記MDA及4-HNE之研究亦顯示，該治療性草藥組合物(P3)有效降低可由各種因素(諸如不健康飲食模式、PUFA之高消耗量及飲酒)引起之脂質過氧化。此外，發現本發明之治療性草藥組合物(P3)有效降低血清促發炎細胞介素(TNF-α、IL-6及IL-1)濃度，其等係發炎反應之標記。據信在體內患有各種發炎之病患中及亦在患有非酒精性及酒精性脂肪肝疾病之病患中，此等血清促發炎細胞介素(TNF-α、IL-6及IL-1)顯著升高。此外，該治療性草藥組合物藉由保護就其抗氧化狀態而言之肝狀態、降低脂質概況、肝酵素標記濃度及抗發炎活性及抵抗慢性酒精曝露，而有利改善乙醇誘導之肝毒性。

自結果亦推斷，本發明之治療性草藥組合物具有降脂及抗發炎活性。體內異常脂質概況及發炎之致病因素中之一些可為不健康飲食模式、攝入大量酒精、攝入含有大量過氧化多不飽和脂肪酸(PUFA)含量之食物或由於服用某些藥物。體內發炎亦可由於病原感染引起，該病原感染由感染物/病原體諸如病毒(包括病毒諸如冠狀病毒病(COVID-19)及其他引起感染之病毒)及細菌引起。

肝組織之組織病理學分析指示本發明之經處理治療性草藥組合物(P3)顯著改善由乙醇誘導之變化，尤其在具有4mg至52mg量之類薑黃素及1.05mg至2mg量之葉黃素之本發明之組合物(P3)中。

實例9：臨床研究

治療性草藥組合物健康人類成年男性受試者(subject)在禁食條件下之隨機、開放標籤單中心、一個時期、單劑量、三臂生體可用率研究

研究目的：

主要(藥物動力學)目的：

確定本發明治療性草藥組合物中之類薑黃素及葉黃素之生體可用率相比於未調配類薑黃素及未調配葉黃素之生體可用率。

次要(安全性)目的：

次要目的為監測單劑量之本發明治療性草藥組合物在禁食條件下之9個健康人類成年男性受試者中之安全性及耐受性。

納入標準

(a)受試者必須為健康人類男性受試者。

(b)年齡必須介於18至65歲(包括)之間，體重至少50kg。

(c)準備提供書面知情同意書並應願意在整個研究過程期間可用且應遵循方案中提及之指南之受試者。

(d)在研究前篩選期間，無證據表明患有潛在疾病之受試者。如由病史及身體檢查、ECG、胸部X光片(PA視圖)及在研究開始前14天內進行之實驗室測試確定該等受試者必須係健康的。

(e)篩選實驗室值係於正常限值內或醫師/主要研究者認為無臨床顯著性之受試者。

排除標準：

1.對薑黃或其萃取物或類薑黃素或葉黃素或任何食物或其他藥物過敏之受試者。

2.患有靜息性低血壓(BP<90/60)或高血壓(BP>140/90)且脈搏率低於50/min及超過100/min之受試者。

3.患有或既往病史或存在顯著心血管、肺、肝、腎、血液、胃腸、內分泌、免疫、皮膚、神經、肌肉骨骼或精神疾病或於入住前最後4週內曾住院或接受手術之受試者。

4.具有MI、中風、外周動脈疾病、GI出血、肝損傷、哮喘、腎損傷、癲癇及顱內出血病史之受試者。

5.於研究前之最後14天內已服用非處方或處方藥(包括任何酵素修飾藥物)之受試者。

6.有酗酒、藥物濫用或吸煙史之受試者。

7.對肝素高敏之受試者。

8.在過去三個月內參與任何其他臨床研究之受試者。

9.具有臨床上顯著異常實驗室值/異常ECG/異常胸部X光片(PA視圖) 之受試者。

10.有獻血困難之受試者。

11.有吞嚥困難史之受試者。

12.具有不適用於反復靜脈穿刺之靜脈之受試者。

結果評量

類薑黃素及葉黃素於各別調配物中之生體可用率

研究程序

A.設計-隨機、試點、雙盲、單中心、一個時期、單劑量、三臂生體可用率研究

研究處理分配

組I：3個受試者，包含120mg類薑黃素及20mg葉黃素之治療性草藥組合物

組II：3個受試者，包含30mg類薑黃素及5mg葉黃素之治療性草藥組合物

組III：3個受試者，包含500mg類薑黃素及40mg未調配葉黃素之參考未調配類薑黃素

B.受試者之數量-9個健康男性志願者

C.隨機化(分配至處理順序)-藉由適當之統計學軟體(SAS 9.13版或更高版本)進行隨機化以在所有臂中達成相等數量之受試者。操作團隊無法獲得隨機化時間表以保持其等對處理分配不知情。

D.整體研究計劃

在獲得倫理委員會批准後，要求受試者訪問站點。在獲得健康受試者之書面知情同意書後，詢問受試者有關其等病史且研究人員進行身體檢查。自各受試者採取血液樣本用於分析血液學及生化分析。進行X射線及ECG。在滿足所有IC/EC標準後，將受試者納入該研究中。

受試者在給藥前12小時進入設施。向該等受試者提供不含薑黃之晚餐。進行身體檢查及生命體徵。

在給藥當天，進行身體檢查及生命體徵並記錄。收集5ml給藥前樣本並離心以供藥物動力學分析。對所有受試者進行給藥。根據隨機化時間表，將囊袋中1gm研究產品(IP)與240ml水混合，並要求該等受試者飲用具有IP之水。給藥後，採血時間點為：0.50、1、2、3、4、6及24小時，用於藥物動力學分析。於此等時間點記錄生命體徵：給藥後00.15、02.00、04.00、06.00、09.00及12.00小時。於此等時間點進行身體檢查：給藥後1、2、6、12小時。在給藥後(即，分別午餐、零食及晚餐)04.00、08.00及13.00小時，向該等受試者提供不含薑黃之食物。記錄不良事件(若存在)。

在檢查時(給藥後24小時)進行身體檢查及生命體徵。給藥後24小時收集血液樣本用於藥物動力學分析。記錄不良事件(若存在)。收集血液樣本用於安全性分析。在完成所有給藥後程序後，該等受試者自該設施出院。

E.藥物動力學分析

使用符合目的之LC-MS方法分析血漿樣本，定量樣本中總類薑黃素(薑黃素、脫甲氧基薑黃素及雙脫甲氧基薑黃素)以及葉黃素(此外具有6至9%玉米黃質)。使用標準分析工具計算藥物動力學參數。比較來自治療性草藥組合物之組分之相對生體可用率並報導關於未調配類薑黃素及未調配葉黃素來自相同分析之AUC_(0-24h)。

F.統計學分析

進行統計學分析並使用InStat軟體(GraphPad Prism,USA)計算AUC。採用雙尾ANOVA分析組間及組內之總血漿類薑黃素含量，而小於0.05之「p」值計算為該研究之統計學顯著性。

G.結果及討論

篩選所有9個無病史之受試者。納入該研究內之組I之受試者之平均年齡為28.4，組B為25.9及組C為23.0且平均值為25.76。組I中志願者之平均高度為162.00，組II為167.00，組III為163.00且平均值為164.0。在基線訪問時，組I之平均重量為65.0，組II為75.80及組III為63.0且平均值為69.6及平均BMI為25.60kg/m²。

安全性：在研究期間，在給藥前及在給藥後，於所有時間點量測生命體徵(諸如溫度、收縮壓及舒張壓、脈搏率及呼吸率)並記錄。此清楚證實，所有受試者均無臨床意義之價值且因此所有研究產品(本發明之治療性草藥組合物)對投與而言均完全安全。未觀測到不良事件。

因此，可得出結論，1g囊袋調配物中之本發明治療性草藥組合物對人類口服而言完全安全。

生體可用率：

A.類薑黃素

如表8中可見，在所有組中，發現口服產品後達成峰值血漿類薑黃素濃度(Tmax)之中值時間為2小時。

在組I中，發現曝露(C_max及AUC_last)分別為20.70及61.93，而在組II中，發現曝露(C_max及AUC_last)分別為2.51及45.48，而在組III中，發現曝露(C_max及AUC_last)分別為8.98及58.83。類薑黃素之平均血漿濃度-時間曲線呈現於圖15中。

因此，可推斷當相較於較高劑量之未調配類薑黃素之生體可用率時，在攝取時，經處理治療性草藥組合物中存在之類薑黃素為高度生體可用。

B.葉黃素

如表9中可見，在所有組中，發現口服產品後達成峰值血漿葉黃素濃度(Tmax)之中值時間為6小時。

在組I中，發現曝露(C_max及AUC_last)分別為55.88及424.87，而在組II中，發現曝露(C_max及AUC_last)分別為35.18及287.70，而在組III中，發現曝露(C_max及AUC_last)分別為52.27及365.07。葉黃素之平均血漿濃度-時間曲線呈現於圖16中。

因此，可推斷當相較於較高劑量之未調配葉黃素之生體可用率時，在攝取時，經處理治療性草藥組合物中存在之葉黃素為高度生體可用。

儘管已闡述並描述本發明之治療性草藥組合物之特定實施例，但熟習此項技術者將顯而易見，可作出各種其他變化及修飾而不背離本發明之精神及範圍。因此，意欲在隨附申請專利範圍中涵蓋於本發明之範疇內之此等變化及修飾。

參考文獻：

(1) Shukla I、Azmi L、Gupta SS、Upreti DK、Rao CV. (2018) Melioration of anti-hepatotoxic effect by Lichen rangiferinus against alcohol induced liver damage in rats. J Ayurveda Integr Med. 2018 Jan 29. pii: S0975-9476(17) 30047-5。

(2) Rukkumani, R.、Balasubashini, M.S.、Vishwanathan, P.及Menon, V.P. (2002) Comparative effects of curcumin and photo-irradiated curcumin on alcohol and polyunsaturated fatty acid induced hyperlipidemia. Pharmocol. Res. 46, 257-264。

(3) Patil, R.H.、Prakash, K.及Maheshwari, V.L. (2011) Hypolipidemic effect of Terminalia arjuna (L.) in experimentally induced hypercholesteremic rats. Acta Biol. Szeged. 55(2), 289-293。

Claims

一種治療性草藥組合物，其包含以24至49%之範圍存在之類薑黃素(curcuminoids)粉及以1至14.5%之範圍存在之葉黃素晶體及以50至64%之範圍存在之賦形劑，其中該類薑黃素粉具有80至95%之類薑黃素含量，且葉黃素晶體具有70至80%之葉黃素含量及4.5至9%之玉米黃質含量。
一種治療性草藥組合物，其包含以24至49%之範圍存在之類薑黃素(curcuminoids)濃縮物及以1至14.5%之範圍存在之葉黃素濃縮物及以50至64%之範圍存在之賦形劑，其中該類薑黃素濃縮物具有80至95%之類薑黃素含量，且葉黃素濃縮物具有70至80%之葉黃素含量及4.5至9%之玉米黃質含量。
如請求項1或2之治療性草藥組合物，其中該組合物有效調節血脂概況及調節發炎效應，其等可能係由各種因素引起。
如請求項3之治療性草藥組合物，其中該因素包括但不限於不健康飲食模式、攝入大量酒精、攝入含有大量過氧化多不飽和脂肪酸(peroxidized Polyunsaturated fatty acid；PUFA)含量之食物或由於服用某些藥物及由於因病原體引起之病原感染，其中該病原體包括病毒及細菌。
如請求項3之治療性草藥組合物，其中該病原體包括冠狀病毒COVID-19。
如請求項3之治療性草藥組合物，其中該組合物在以下病症之至少一者中有效，即：(a)抑制受感染細胞中氧化應激損傷；(b)增加受該等感染細胞中非酵素抗氧化劑麩胱甘肽還原酶(Glutathione reductase；GSH)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase；SOD)之含量；(c)預防該等受感染細胞中活性氧物質(reactive oxygen species；ROS)產生；(d)防止該等受感染細胞中細胞核凋亡、細胞核碎裂及防止細胞粒線體膜去極化。
如請求項3之治療性草藥組合物，其中該組合物有效減少該等受感染細胞中硫巴比妥酸反應性物質(Thiobarbituric acid reactive species；TBARS)丙二醛(Malondialdehyde；MDA)之產生。
如請求項1或2之治療性草藥組合物，其中該組合物有效正常化並維持脂質概況、維持健康之膽固醇含量及健康之LDL/HDL比率並降低高血清甘油三酯含量，藉此有效控制疾病。
如請求項8之治療性草藥組合物，其中該疾病包括但不限於糖尿病性視網膜病變及年齡相關性黃斑變性。
如請求項1或2之治療性草藥組合物，其中該組合物有效降低促發炎細胞介素(TNF-α、IL-6及IL-1)含量，此有利於減少可因不健康飲食模式、攝入大量酒精、攝入含有大量過氧化多不飽和脂肪酸(PUFA)含量之食物或由於服用某些藥物、由於酒精性及非酒精性脂肪肝疾病及由於病原感染引起之肝發炎反應。
如請求項1或2之治療性草藥組合物，其中該治療性草藥組合物中存在之類薑黃素及葉黃素顯示協同活性及當相較於較高劑量之未調配葉黃素及未調配類薑黃素之生體可用率時，顯示具有高度生體可用。
如請求項1或2之治療性草藥組合物，其中該組合物可作為補充劑定期或在攝入高脂肪食物、藥物及/或酒精之前、期間或之後服用/攝取。
如請求項1或2之治療性草藥組合物，其中該類薑黃素粉/濃縮物可自植物薑黃(Curcuma longa)獲得/萃取及純化及該等葉黃素晶體/濃縮物可自萬壽菊植物萬壽菊(Tagetes erecta)或任何其他合適之植物來源獲得/萃取及純化。
如請求項1或2之治療性草藥組合物，其中該組合物調配成及用作營養品、藥物、膳食/營養補充劑或用作各種食物及飲料產品茶中之治療性/健康成分、輸液、果汁、飲料、牛奶及牛奶製品、穀類產品、酒精飲料及加工食物等。
一種用於製造如請求項1至14中任一項之治療性草藥組合物之方法，其中該方法包括：a)使用類薑黃素含量在80至95%之範圍內之類薑黃素粉/濃縮物及葉黃素含量在70至80%之範圍內及玉米黃質含量4.5至9%之葉黃素晶體/濃縮物並以預定量混合該類薑黃素粉/濃縮物及葉黃素晶體/濃縮物以形成摻合物；未處理乾燥摻合物之粒度可落於D₅₀-20μm至50μm及D₉₀-100μm至200μm之範圍內；b)將賦形劑添加至該摻合物；c)將純化水添加至該摻合物以製造懸浮液；d)使該懸浮液通過液體膠體磨機以形成均勻懸浮液；e)使該懸浮液經受進一步處理，其中該處理包括通過均質機或高剪切顆粒濕磨機以產生微粉化乳液；f)以25rpm之速度將該微粉化乳液進一步攪動8至12小時以使質量溫度升至25℃至40℃；g)使該微粉化乳液經受進一步處理。
如請求項15之方法，其中該賦形劑可包括合適之乳化劑及麥芽糊精，且其中該微粉化乳液所經受之進一步處理包括濃縮及/或乾燥以獲得該治療性草藥組合物。
如請求項15或16之方法，其中該類薑黃素粉係以24至49%之範圍存在，及葉黃素晶體係在1%至14.5%之範圍內及該等賦形劑係在50至64%之範圍內。
如請求項15或16之方法，其中該類薑黃素濃縮物係以24至49%之範圍存在，及葉黃素濃縮物係在1%至14.5%之範圍內及該等賦形劑係在50至64%之範圍內。
如請求項15或16之方法，其中使該治療性草藥組合物進一步通過合適之顆粒篩以獲得均勻成品且其中該經處理治療性草藥組合物之粒度係在D₅₀-0.36μm至5μm之範圍內及D₉₀在0.60μm至10μm之範圍內。
如請求項15或16之方法，其中該類薑黃素粉/濃縮物可自植物薑黃獲得/萃取及純化及該等葉黃素晶體/濃縮物可自萬壽菊植物萬壽菊或任何其他合適之植物來源獲得/萃取及純化。