TWI802377B

TWI802377B - 用於吸附層析術的靜相媒質及其製造方法

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Publication number: TWI802377B
Application number: TW111114908A
Authority: TW
Inventors: 杜宗翰; 林嘉偉; 王斯瑜; 陳暉; 許銘賢; 楊適弘
Original assignee: 台灣創新材料股份有限公司
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2023-05-11
Also published as: CN116899539B; JP2023159869A; US20230338924A1; EP4265327A2; TW202342154A; US12403453B2; EP4265327A3; JP7498933B2; CN116899539A

Abstract

本發明關於一種用於吸附層析術的靜相媒質，其呈現適合被填充於層析管柱的多孔粒子的形式。這些多孔粒子由交聯高分子材料製成，而且形成有許多相互連接的巨孔以構成一多孔網絡，而移動相流體可以對流方式流過該多孔網絡。這些多孔粒子實質上不具有擴散孔，因而通過該多孔網絡的物質傳輸只由對流作用所支配。這些多孔粒子被製作成具有粗糙外表面的不規則顆粒構形，使得層析過程中多孔粒子之間的對流流動不會受到阻礙。

Description

用於吸附層析術的靜相媒質及其製造方法

本發明關於一種用於吸附層析術的靜相媒質，尤其是關於一種被製作成高分子多孔粒子形式的靜相媒質，其適合被填充於層析管柱，而以高通量、高效率和低背壓來分離大分子。

吸附層析術是液相層析的一種類型，其藉由使一混合物中之某成份從移動相選擇性地吸附至固態靜相而分離出該成份。多孔樹脂珠已經被廣泛地用來作為吸附層析術中的靜相。典型的樹脂珠形成有直徑為數奈米至數十奈米的曲折微孔網絡，容許存在於移動相中的低分子量溶質擴散進出微孔。如圖1所示，這些微孔通常位於靠近樹脂珠的外表面處，而且彼此不相連。大多數的吸附表面位於樹脂珠內部，只能夠透過擴散作用抵達。雖然習用樹脂珠已被證實在分離小分子上非常有用，但它們在分離大分子上的表現不佳，因為大分子無法進入小尺寸的微孔。換句話說，大分子只能結合於樹脂珠的表面成為薄薄的一層，造成結合容量低下。對於容易受到酵素降解或其他破壞性狀況影響的生物分子而言，分離速率低下尤其有害。以樹脂作為基礎的層析術還具有其他缺點，由於珠粒內的擴散作用乃是吸附過程中的速率決定步驟，所以解析度會隨著流速的上升而降低，而樹脂珠之間的對流流動不足則導致跨越整個層析管柱的高壓降。所有的這些缺點都造成了分離效率的降低和令人無法滿意的大分子生產率。一般而言，運用傳統樹脂珠作為靜相媒質的層析過程需要數日才能完成，因而非常耗時且成本也高。

業界已經付出了許多努力來處理這些缺點。美國專利第5,228,989號提出了所謂的灌注型層析樹脂，其含有直徑為0.6-0.8微米的巨孔供物質對流傳輸，以及許多擴散微孔以提供吸附容量。但是，在吸附過程中涉及擴散傳輸進出灌注型樹脂珠，仍然會降低整體生產速率。此外，灌注型樹脂珠通常被製作成球狀顆粒的形式，而且具有狹窄的尺寸分佈。當這些珠粒一起被密實地填充於管柱內而應用於例如高效液相層析時，位於樹脂珠之間的對流通道將會非常狹小，而這又轉而導致了高背壓。

不同於被製作成細微顆粒形式的樹脂珠，呈塊狀的多孔整體柱被揭露於例如美國專利第7,026,364號、第11,118,024號和第11,236,184號，供用作為吸附層析術的靜相媒質。憑藉著形成於這些多孔整體柱內部的對流巨孔所帶來的快速物質傳輸能力，這些多孔整體柱適合使用作為分離大分子的基質。這些多孔整體柱可以由習用方法製成，例如高內相乳液模版法（high internal phase emulsion templating）和膠晶體模版法（colloidal crystal templating）。前面的技術涉及製備出一油包水乳液，再使含有單體的外相聚合化並且移除內相，而後面的技術包括使單體滲入一膠晶體模版的間隙空間，使單體聚合化成高分子基質後再移除模版。然而，製造出一個沒有缺陷的高分子整體柱是一項困難的任務，因為它容易因聚合反應期間的熱膨脹不均勻而破裂。帶有多個缺陷的整體柱可能導致解析度喪失以及標的物質回收率下降。

因此，相關業界仍需要一種靜相媒質，其不但被製作成適合被填充於層析管柱而具有低背壓的高分子多孔粒子的形式，更主要由對流巨孔所構成，而且實質上不具有擴散微孔，以使得大分子更容易接近粒子內部，並且容許物質對流傳輸通過粒子。

為了克服前述缺點，本發明提供了一種用於吸附層析術的靜相媒質，其呈現一群適合被填充於層析管柱的多孔粒子的形式。各個多孔粒子由交聯高分子材料製成，而且形成有許多相互連接的巨孔以構成一多孔網絡，而移動相流體可以對流方式流過該多孔網絡。因為本案多孔粒子實質上不具有擴散孔，所以被移動相流體所乘載的溶質或分析物只藉由對流作用來傳輸通過該多孔網絡。該多孔網絡具有一足夠大的直徑，以容許移動相流體的對流流動，並且具有一個極大的比表面積作為吸附表面，使大分子容易接近並且附著。更重要的是，本案多孔粒子被製作成具有不規則的顆粒構形，且具有粗糙的外表面，使得層析過程中於多孔粒子之間的對流流動不會受到阻礙或降低速度，因而不同於在呈現均一球體構形的傳統樹脂珠所發生的不利情形。

因此，本案第一態樣提供一種用於吸附層析術的靜相媒質，其特別適合用於分離大分子。該靜相媒質包含：多個由交聯高分子材料製成的多孔粒子，其具有位於25微米至500微米的範圍內的費雷特直徑（Feret diameter），並且具有70%至90%的孔隙率（porosity），各個粒子形成有許多球狀巨孔，直徑位於3微米至10微米的範圍內，其中所述球狀巨孔經由連接孔而相互連接，從而構成一多孔網絡，該多孔網絡的平均直徑位於 0.2微米至6微米的範圍內；以及其中所述多孔粒子呈現不規則顆粒構形，其具有介於1.0至3.5的費雷特長寬比分佈（Feret aspect ratio distribution）和位於1.2至2.2的範圍內的標準差。

本案第二態樣提供一種用於製造前述靜相媒質的方法，其包含下列步驟： A. 製備一由交聯高分子材料製成且具有70%至90%的孔隙率的多孔整體柱，其中該多孔整體柱形成有許多球狀巨孔，直徑位於3微米至10微米的範圍內，且所述球狀巨孔經由連接孔而相互連接，從而構成一多孔網絡，該多孔網絡的平均直徑位於 0.2微米至6微米的範圍內； B. 使該多孔整體柱接受機械式研磨，以使得該多孔整體柱被研磨成具有低於1,000微米的粒子尺寸分佈的第一群多孔粒子；以及 C. 依粒子尺寸分選該第一群多孔粒子，以獲得費雷特直徑位於25微米至500微米的範圍內的第二群多孔粒子，其中所述第二群多孔粒子呈現不規則顆粒構形，具有介於1.0至3.5的費雷特長寬比分佈（Feret aspect ratio distribution）和位於1.2至2.2的範圍內的標準差。

在一較佳具體例中，依據壓汞法（mercury intrusion porosimetry）測量，所述多孔粒子實質上不具有直徑低於100奈米的微孔。

在一較佳具體例中，該多孔網絡具有位於0.5微米至3.0微米的範圍內的平均直徑。在一更佳具體例中，該多孔網絡具有位於1.2微米至2.4微米的範圍內的平均直徑。

在一較佳具體例中，該靜相媒質經過表面改質而具有離子交換官能基。在一更佳具體例中，該離子交換官能基選自於由四級銨、二乙基胺乙基、磺醯基和羧甲基所組成的群組。

在較佳的具體例中，該交聯高分子材料選自於由聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚吡咯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯和聚矽氧所組成的群組。在更佳的具體例中，該交聯高分子材料選自於聚甲基丙烯酸酯。

在一較佳具體例中，個別多孔粒子的球狀巨孔中有至少70%是以最密堆積的形式排列。

另外，相較於由傳統方法所製成的靜相媒質，透過前述方法製成的靜相媒質具有下列結構特徵：在多孔整體柱製備過程中所形成的內部多孔網絡，以及透過機械式研磨步驟所給予的不規則顆粒構形和粗糙外表面。因此，本案第三態樣提供一種由前述方法所製成的靜相媒質。

本案第四態樣提供一種層析管柱，其包含一填充有前述靜相媒質的中空長形管體。

除非另外說明，否則本申請說明書和申請專利範圍中所使用的下列用語具有下文給予的定義。請注意，本申請說明書和申請專利範圍中所使用的單數形用語“一”意欲涵蓋在一個以及一個以上的所載事項，例如至少一個、至少二個或至少三個，而非意味著僅僅具有單一個所載事項。此外，申請專利範圍中使用的“包含”、“具有”等開放式連接詞是表示請求項中所記載的元件或成分的組合中，不排除請求項未載明的其他組件或成分。亦應注意到用語“或”在意義上一般也包括“及/或”，除非內容另有清楚表明。本申請說明書和申請專利範圍中所使用的用語“約”或“實質上”，是用以修飾任何可些微變化的誤差，但這種些微變化並不會改變其本質。

圖2和3顯示依據本發明所進行的吸附層析方法，其中使用固態靜相2和液態移動相3，並且藉由各種大分子4與靜相2的吸附性交互作用來分離大分子4。所述吸附層析術可以是相關技術領域所知悉的類型，其包括但不限於離子交換層析術、疏水性交互作用層析術、親和層析術和逆相層析術。本案所使用的術語“靜相”可以指稱一種固著化的固相載體，在層析過程中容許移動相3流過其中，以使得大分子4能夠被靜相2所滯留。於此，靜相2包含被填充於層析管柱內的一群多孔粒子。本案所使用的術語“靜相媒質”希望涵蓋處於被填充狀態或非填充狀態下的多孔粒子。如圖2所示，移動相3由管柱頂部饋入，使其向下流動至管柱底部。如圖3所示，比較容易被靜相2吸引的大分子4會在管柱中滯留較長時間，而比較不容易被靜相2吸附的大分子4則較快離開管柱。結果是，可以藉此分別收集具有不同吸附特性的大分子4。本案吸附層析術可以結合-洗提模式進行（bind-and-elute mode），其中標的大分子被留滯於靜相媒質上，隨後再以適當洗提液洗提出來，抑或是以流經模式進行（flow-through mode），其中不需要的分子和雜質被靜相媒質所吸附，而容許標的大分子流出。

圖4B-4F和5顯示依據本發明的多孔粒子。明顯可見這些多孔粒子各形成有許多相互堆疊的球狀巨孔，如圖5中實線圓圈所標示。這些巨孔經由連接孔而相互連接且呈流體連通，連接孔如圖5中虛線圓圈所標示。在電子顯微鏡下測量，這些多孔粒子所具有的費雷特直徑位於25微米至500微米的範圍內，較佳為位於25微米至300微米的範圍內，例如位於25微米至100微米的範圍內，而球狀巨孔所具有的直徑位於3微米至10微米的範圍內。本案所使用的術語“費雷特直徑”意指某一粒子的外部輪廓上最遠兩點之間的最長距離。在個別的多孔粒子中，這些相互連接的巨孔以及與其相連的連接孔構成了一個連續的多孔網絡，經由毛細管流動測孔法（capillary flow porometry）測量，該多孔網絡所具有的平均直徑位於0.2微米至6.0微米的範圍內，較佳為位於0.5微米至3.0微米的範圍內，例如位於1.2微米至2.4微米的範圍內。如後文所述，多孔粒子的粒子尺寸，以及巨孔和多孔網絡的直徑，都可以透過控制多孔粒子製造方法的參數和條件來進行調整。

依據前述電子顯微鏡和毛細管流動測孔法的測量，各個多孔粒子中所形成的多孔網絡夠大，而足以容許移動相流體對流流過所述多孔網絡。這些多孔粒子也實質上不具有擴散孔，於此處意指透過壓汞法測量，有超過90%，較佳為超過95%，更佳為超過98%，例如超過99%的完整多孔粒子，以及其中所形成的多孔網絡，實質上不具有直徑低於100奈米的微孔。帶來的有利結果是，通過多孔網絡的物質傳輸完全透過對流作用來進行，如後文中記載於實例5及顯示於圖9中的結果。如同進一步顯示於圖4B-4F中的SEM影像和圖6中的示意圖，所述多孔網絡向周圍環境開放而且提供極大的比表面積，使大分子易於接近而被滯留。憑藉著這些結構特徵，本案揭露的靜相媒質容許移動相以高速流過其中，同時對於大分子提供了高吸附容量。

本案揭露的粒子具有高孔隙率，且巨孔均勻地分佈於粒子中，從而確保分離過程中的物質傳輸高且背壓低。多孔粒子的孔隙率（porosity）被定義為孔洞體積相對於粒子總體積的百分比，其可以透過下式計算出來： 1-[(多孔粒子的重量/連續相的密度)/多孔粒子的外觀體積] 也可以透過掃描式電子顯微鏡拍攝多孔粒子的截面影像，再經由ImageJ軟體（美國國家科學院，美國馬里蘭州Bethesda市）計算出孔隙率。在一具體例中，這些粒子所具有的孔隙率位於約70%至約90%的範圍內，較佳為74%至90%。

如進一步於圖4B-4F所示，本案多孔粒子被製作成具有粗糙外表面的不規則顆粒構形。本案所使用的術語“不規則”意指多孔粒子偏離球形至某一程度。依據本發明，不規則的程度是以費雷特長寬比（Feret aspect ratio）來表示，其被計算成某一特定多孔粒子的長軸長度除以其短軸長度所得到的商數。由於完美球體的費雷特長寬比為1，所以計算出來的數值通常會大於1。粒子的不規則性是以粒子影像分析來進行計算，顯示本案多孔粒子具有介於1.0至3.5的費雷特長寬比分佈和位於1.2至2.2的範圍內的標準差。如後文所述，多孔粒子的不規則構形可以透過將多孔整體柱機械式研磨成為粒子來達成，並且由此帶來幾個好處。第一，相較於塊狀整體柱和圓球狀粒子，相同類型但呈現不規則構形的多孔粒子具有更大的表面積，因而具有更高的吸附容量。第二，直觀上可以推斷本案不規則粒子具有粗糙的外表面，因而被填充於層析管柱內時容易相互固鎖，得到具有高機械強度的填充床，其能夠承受分離過程中所發生的背壓。第三，相較於填充狀態下的圓球狀粒子，填充床中的不規則粒子之間具有更寬廣的對流流動通道。因此，在分離過程中，本案不規則粒子間的對流流動不會受到阻礙或降低速度。在一些具體例中，粒子間的通道所具有的平均直徑位於2微米至110微米的範圍內。

本案多孔粒子由交聯高分子材料製成。適用於本發明的高分子材料為相關技術領域所熟悉，其包括但不限於聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚吡咯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯和聚矽氧。在一較佳具體例中，所述多孔粒子由聚甲基丙烯酸酯製成。

憑藉著快速的動力學表現、高孔隙率、高機械性質和低背壓，本案靜相媒質可供用於分離具有巨大分子尺寸的大分子，包括流體動力學半徑超過10奈米且較佳為超過50奈米的大分子，它們包括但不限於蛋白質、核酸、類病毒（viroids）、病毒、病毒載體、病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）、胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）和微脂體。

本發明進一步思及一種填充有本案靜相媒質的層析管柱。該層析管柱包含一中空長形管體，用以容納填充床。適用於該中空長形管體的材料和構形皆為層析技術領域所熟悉。在一具體例中，該管體是由選自於不鏽鋼、鈦、石英、玻璃和例如聚丙烯等硬質塑膠所組成的群組中的材料製成，並且被製作成圓柱形、矩形或多邊形管體的形式。

在一些具體例中，靜相媒質經過化學改質而帶有用於吸附大分子的官能基或配體。舉例來說，在靜相媒質被使用作為離子交換劑的具體例中，多孔粒子，包括其中所形成的多孔網絡，經過表面改質而具有離子交換官能基，例如以四級銨作為強陰離子交換劑、以二乙基胺乙基（DEAE）作為弱陰離子交換劑、以磺醯基作為強陽離子交換劑，以及以羧甲基作為弱陽離子交換劑。

圖7顯示依據本發明的靜相媒質的製造方法流程圖，該方法包含步驟A：製備一多孔高分子整體柱；步驟B：將整體柱研磨成為第一群多孔粒子；以及步驟C：依粒子尺寸分選該第一群多孔粒子，以獲得費雷特直徑為25微米至500微米的第二群多孔粒子。

步驟A涉及製備一多孔高分子整體柱，其具有相同於前述多孔粒子的孔洞特性。換句話說，該多孔整體柱由交聯高分子材料製成，具有位於70%至90%的範圍內的孔隙率，並且形成有許多直徑位於3微米至10微米的範圍內的球狀巨孔。這些球狀巨孔經由連接孔而相互連接，構成了一個多孔網絡，而該多孔網絡所具有的平均直徑位於0.2微米至6.0微米的範圍內，較佳為位於0.5微米至3.0微米的範圍內，例如位於1.2微米至2.4微米的範圍內。

術語“整體柱”意指一種固態的多孔三維結構，其在本質上不呈顆粒狀。適用於製備多孔高分子整體柱的方法為相關技術領域所知悉。

在一較佳具體例中，步驟A是採用高內相乳液模版法來進行。高內相乳液模版法的一般性工序準則涉及製備出一種高內相乳液（HIPE），其中乳化微滴所構成的內相（或稱分散相）被分散於外相中（或稱連續相），而內相的體積分率超過74.05%，隨後使含有單體的外相聚合化，再移除內相模版。

實用的作法可見於例如讓渡給本案申請人的美國專利第11,236,184號，其包含將連續相組成物與不相混溶的分散相組成物，以高轉速的均質機進行劇烈攪拌，使分散相均勻分散於連續相中，從而獲得一個油包水乳液。可以選擇性地使所述油包水乳液接受外力沈降，以提高乳液中分散相相對於連續相的體積分率，而得到一高內相乳液。在本案中，連續相通常是發生聚合反應的相，其可以包含至少一種單體和交聯劑，且選擇性包含起始劑和乳化安定劑，而分散相則可以包含溶劑和電解質。

所述至少一種單體意欲涵蓋任何可透過聚合反應而形成高分子的單體（monomers）和寡聚體（oligomers）。在一較佳具體例中，所述至少一種單體包含至少一種適於進行自由基聚合反應的烯屬不飽和單體（ethylenically unsaturated monomer）或炔屬不飽和單體（acetylenically unsaturated monomer），亦即具有碳-碳雙鍵或參鍵的有機單體，其包括但不限於丙烯酸及其酯類，例如丙烯酸羥乙酯；甲基丙烯酸及其酯類，例如甲基丙烯酸甘油酯（GMA）、甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）；丙烯醯胺類；甲基丙烯醯胺類；苯乙烯及其衍生物，例如氯甲基苯乙烯、二乙烯基苯（DVB）、苯乙烯磺酸鹽；矽烷類，例如二氯二甲基矽烷；吡咯類；乙烯基吡啶，以及彼等之組合。

本案所使用的術語“交聯劑”意指在前述至少一種單體經過聚合反應所形成的高分子主鏈之間形成化學性橋接的試劑。在一較佳具體例中，“交聯劑”是一種交聯單體，其可以與前述至少一種單體共溶於連續相中，通常具有多個官能基，以便在前述至少一種單體經聚合而成的高分子主鏈之間形成共價鍵結。適用的交聯劑為本發明所屬技術領域所熟知，而且可以視所述至少一種單體的類型來選用，其包括但不限於油溶性交聯劑，例如二甲基丙烯酸乙二醇酯（ EGDMA ）、二甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PEGDMA）、二丙烯酸乙二醇酯（EGDA）、二丙烯酸三乙二醇酯（TriEGDA）、二乙烯基苯（DVB）；以及水溶性交聯劑，例如N,N-二烯丙基丙烯醯胺、N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺（MBAA）。如本發明所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，交聯劑的用量與所製成的多孔整體柱的機械強度成正相關，亦即交聯程度愈高，多孔整體柱的機械強度就愈高。較佳為交聯劑在連續相中佔有約5至50重量%的含量，例如佔有約5至25重量%的含量。

本案所使用的術語“乳化安定劑”意指一種界面活性劑，其適用於安定高内相乳液，避免分散相中的微滴單元彼此合併。乳化安定劑可以在調製乳液前添加於連續相組成物或分散相組成物中。適用於本發明的乳化安定劑可以是非離子界面活性劑，或是陰離子或陽離子界面活性劑。在高内相乳液為油包水乳液的具體例中，乳化安定劑較佳為具有3至14的親水親油平衡值（hydrophilic-lipophilic balance；HLB），更佳為具有4至6的HLB值。在較佳的具體例中，本發明使用非離子界面活性劑做為乳化安定劑，適用的類型包括但不限於聚氧乙烯化烷酚類、聚氧乙烯化直鏈烷醇類、聚氧乙烯化聚丙二醇類、聚氧乙烯化硫醇類、長鏈羧酸酯類、鏈烷醇胺縮合物、四級炔屬二醇類、聚氧乙烯聚矽氧烷類、N-烷基吡咯烷酮類、含氟碳化物液體，以及烷基聚糖苷。乳化安定劑的特定實例包括但不限於失水山梨醇單月桂酸酯（商品名Span ^®20）、失水山梨醇三硬脂酸酯（商品名Span ^®65）、失水山梨醇單油酸酯（商品名Span ^®80）、單油酸甘油酯、聚乙二醇200雙油酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物（例如Pluronic ^®F-68、Pluronic ^®F-127、Pluronic ^®L-121、Pluronic ^®P-123）、蓖麻油、單蓖麻油酸甘油酯、二硬脂基二甲基氯化銨，以及二油基二甲基氯化銨。

“起始劑”意指能夠引發前述至少一種單體及/或交聯劑發生聚合反應及/或交聯反應的試劑。較佳為本發明所使用的起始劑為熱起始劑，亦即受熱後能夠引發前述聚合反應及/或交聯反應的起始劑。起始劑可以在調製高内相乳液前添加於連續相組成物或是分散相組成物中。依據本發明，適合添加於連續相組成物的起始劑包括但不限於偶氮二異丁腈（ AIBN ）、偶氮二異庚腈（ABVN）、偶氮二異戊腈、2,2-二[4,4-二(叔丁基過氧基)環己基]丙烷（BPO），和過氧化月桂醯基（LPO），而適合添加於分散相組成物的起始劑包括但不限於過硫酸鹽，例如過硫酸銨和過硫酸鉀。本案高内相乳液也可以另包含藉由紫外光或可見光活化的光起始劑，來引發前述聚合反應及/或交聯反應，甚至可以適當的光起始劑來取代前述熱起始劑。

分散相主要包含溶劑。所述溶劑可以是任何與該連續相不相混溶的液體。在連續相具有高疏水性的具體例中，所述溶劑包括但不限於水、氟碳化物液體（fluorocarbon liquids）和其他與連續相不相混溶的有機溶劑。較佳為所述溶劑是水。在此例中，分散相可以另包含一電解質，其在溶劑中可以實質解離出自由離子，包括可溶解於該溶劑的鹽、酸和鹼。較佳為該電解質包含鹼金屬的硫酸鹽，例如硫酸鉀，以及鹼金屬和鹼土金屬的氯鹽，例如氯化鈉、氯化鈣和氯化鎂。

高内相乳液可以添加聚合反應促進劑。“促進劑”意指能夠加速所述至少一種單體及/或交聯劑發生聚合反應及/或交聯反應的試劑。促進劑的典型實例包括但不限於N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）、 N,N,N’,N”,N”-五甲基二亞乙基三胺（PMDTA）、三（2-二甲基胺基)乙胺、 1,1,4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺、1,4,8,11-四甲基-1,4,8,11-四氮雜環十四烷，其促使例如過硫酸銨等起始劑分解成為自由基，從而加速前述聚合反應及/或交聯反應。促進劑的添加量較佳為起始劑之添加量的10-100莫耳%。

使製備出來的HIPE受熱及曝露於適當波長的光線，讓所述至少一種單體和交聯劑完成聚合反應和交聯反應，藉此使HIPE固化成為整體柱。隨後，透過例如以異丙醇、甲醇、乙醇、四氫呋喃、丙酮或甲乙酮進行索式萃取（Soxhlet extraction），將分散相和未反應試劑由整體柱去除。所述整體柱可以直接進行乾燥，較佳為在真空下進行乾燥，以促使分散相中的微滴破泡而生成連接孔。當多孔整體柱是由HIPE製得時，整體柱中巨孔的尺寸和均一度可以在HIPE製備過程中透過改變攪拌速率及/或攪拌溫度來調整，而連接孔的尺寸，以及整體柱中所形成的多孔網絡的最小直徑，則可以透過改變分散相對於連續相的體積比來進行調整。

在另一較佳具體例中，步驟A是採用膠晶體模版法來進行，其包括使均一尺寸的高分子奈米球進行自組裝，以產生一個具有三維有序微結構的模版，接著使含有單體的組成物滲入該模版的間隙空間，再使單體聚合化成為整體柱，最後透過索式萃取法或超臨界流體萃取法（supercritical fluid extraction）將模版從整體柱去除。此處所稱含有單體的組成物可以具有與前述連續相組成物相同的組成份。膠晶體模版法的可行作法可見於例如美國專利第6414043號和第11,118,024號。

透過膠晶體模版法製備出來的多孔整體柱的優勢特徵在於，其具有高度規律的多孔結構，其中均一尺寸的巨孔以最密堆積的形式排列，而各個巨孔皆經由12個連接孔與相鄰巨孔相互連接。較佳為多孔整體柱中有至少70%的巨孔，更佳為有至少80%的巨孔，且最佳為有至少90%的巨孔，例如有至少95%的巨孔，是以最密堆積的形式排列。最密堆積的例子包括三維六方最密堆積（hexagonal closest packing；hcp）、三維面心立方堆積（face centered cubic packing；fcc）或它們的組合。如美國專利第11,118,024號所揭露，整體柱中巨孔的尺寸可以透過改變用於生成模版的奈米球的尺寸來調整，而連接孔的尺寸，以及整體柱中所形成的多孔網絡的最小直徑，則可以透過使有序排列的奈米球發生受控制的形變而增進彼此間的接觸面積來加以放大。

步驟A所得到的多孔整體柱在形狀上與發生聚合反應的反應容器一致。通常來說，多孔整體柱呈現體積小於或等於200立方公分的高分子塊體的形式。在步驟B中，使多孔整體柱接受機械式研磨，以使得其被碎化且研磨成為第一群多孔粒子，而第一群多孔粒子具有低於1,000微米的尺寸分佈，這代表這些粒子中有至少50%，較佳為有至少70%，更佳為有至少80%，例如有至少90%具有低於1,000微米的費雷特直徑。本案所使用的術語“機械式研磨”可以意指運用磨擦、碰撞、衝擊、剪切或其他機械作用來減少固體的尺寸。所述機械式研磨通常是在一具傳統研磨裝置中透過高能研磨進行，例如在一具圓盤式磨機、球磨機、旋轉刀式粉碎機、雙輥研磨機、造粒機、渦輪式研磨機及彼等的組合中進行。在機械式研磨過程中，第一群多孔粒子被賦予了不規則的構形和粗糙的外表面。

在步驟C中，步驟B所得到的第一群多孔粒子依據尺寸進行分離，從而分離出費雷特直徑位於25微米至500微米的範圍內的第二群多孔粒子，此意指被分離出來的粒子中有至少70%，較佳為有至少80%，較佳為有至少90%，例如有至少95%，具有25-500微米的費雷特直徑。在一較佳具體例中，第一群多孔粒子經過一系列的泰勒式篩網進行篩分，再收集位於所希望的尺寸範圍內的粒子，例如位於＜ 25微米、25-75微米、75-150微米和150-500微米的範圍內的粒子。在一較佳具體例中，所述篩分是一具振動式篩分機中進行，其中垂直疊設有至少三層篩網，且位於上層的篩網具有比下層篩網更大的孔目。可以將第一群多孔粒子從上方饋入振動式篩分機中，經過篩分後可以從其中一篩網獲取具有所欲尺寸分佈的第二群多孔粒子。在一些場合下，個別篩網中可以添加由例如氧化鋯和玻璃等硬質材料製成的磨球，將多孔粒子碎化成更小的尺寸，以增進產率。在電子顯微鏡下透過粒子影像分析進行測量，所述第二群多孔粒子在統計學上具有介於1.0至3.5的費雷特長寬比分佈，和位於1.2至2.2的範圍內的標準差。

下列實例僅供用於例示本發明，而非限制本發明的範圍。

實例1：多孔整體柱的製備

將甲基丙烯酸甘油酯（GMA；Sigma-Aldrich Corporation，美國）、二乙烯基苯（DVB；Sigma-Aldrich Corporation，美國）和過氧化月桂醯基（LPO；Sigma-Aldrich Corporation，美國）以50:25:2 (w/w/w)的比例加以混合，以製成一連續相組成物，再以連續相組成物的總重量為基準添加6重量%的Pluronic ^®L-121。製備水性非連續相組成物，其含有CaCl ₂和四甲基乙二胺（TMEDA；Sigma-Aldrich Corporation，美國）溶於二次蒸餾水中，比例為約11:2:1100 (w/w/w)，再將所述水性非連續相組成物加入連續相組成物，比例為3:1 (v/v)，並且運用一具高速均質機（型號T25；IKA，德國）劇烈攪拌5分鐘而製得一油包水乳液。將所述乳液置入一具烤箱中（型號DENG YNG DO60）。於4小時內，將溫度由室溫逐漸上升至80°C，並且保持於80°C歷時24小時，以進行聚合反應，藉此使乳液固化成為整體柱。使用異丙醇進行索氏萃取來洗滌整體柱，以去除水和未反應試劑。接著，在真空下乾燥所述多孔整體柱，獲得乾燥的多孔整體柱。透過毛細管流動測孔法（PMI Porous Materials Inc., CFP-1100AE）來測量整體柱中多孔網絡的最小直徑。

實例2：由整體杜製備多孔粒子

在一具不鏽鋼研磨機中（輝綠科技有限公司，型號NBM-200，台灣），將實例1所製得的多孔整體柱加以研磨，以獲取粒子尺寸分佈低於1,000微米的第一群多孔粒子。接著，在一具配備有層疊式多孔篩板的振動式篩分機中（福里茨有限責任公司，型號Analysette 3 Pro，班霍夫大街，德國）篩選多孔粒子，並且分離出直徑範圍25-100微米的粒子，作為第二群多孔粒子。依據圖4A所顯示的具體例，所述第二群多孔粒子具有呈現常態分佈的粒子尺寸分佈，中位數直徑（D50）為56微米。透過掃描式電子顯微鏡（Thermo Fisher Scientific Inc., Phenom Pro）拍攝多孔粒子的影像，其中的一些影像顯示於圖4B-4F。隨機選出45個粒子的SEM影像，用於計算粒子的不規則性，而所述第二群多孔粒子顯示出具有1.75 ± 0.59的費雷特長寬比。

實例3：多孔粒子的孔洞鑑定

依據ASTM D-4284標準(2003)透過壓汞法來測量實例2所得多孔粒子的孔徑分佈曲線。如圖8所示，多孔粒子內所形成的多孔網絡具有1.26微米的平均直徑。可以從圖8進一步得知，有超過90%的多孔網絡位於500-2,000奈米的範圍內，只有極少數具有低於500奈米的直徑。這些結果指出，本案多孔粒子實質上不具有直徑低於100奈米的擴散孔，而且粒子內所形成的多孔網絡夠大而足以容許物質對流傳輸經過所述粒子。

實例4：多孔粒子的表面改質

將實例2所製得的多孔粒子加入四亞乙基五胺的1%水溶液中，並且在70 ^oC下加熱至少5小時。將多孔粒子濾出，再加入氯化縮水甘油基三甲基銨的1%水溶液中，並且在70 ^oC下加熱至少5小時。以水洗滌多孔粒子，得到一種強陰離子交換劑，後文稱為DuloCore ^TMQA。

將1 mL強陰離子交換劑DuloCore ^TMQA填充於一個內徑7.4毫米的聚丙烯層析管柱中。

實例5: 動態結合容量（Dynamic Binding Capacity）

測試實例4所製作的層析管柱對於牛血清白蛋白（BSA）的動態結合容量，並且將結果與使用兩種商用陰離子交換管柱所得到的結果作比較，其中Capto ^TMQ（購自於GE Healthcare Life Science，美國）包括右旋糖酐基質，且具有90微米的粒子尺寸和50奈米的擴散微孔，而CIMmultus ^TMQA （購自於BIA Separations）是一種以聚甲基丙烯酸甲酯為主的整體柱，具有2微米的孔徑。本實例中所使用的移動相為50mM Tris-HCl, pH 8.5，並且將1 mg/mL BSA添加於移動相以作為分析物。透過一具Ä KTATM Pure層析系統（Cytiva Sweden AB，烏普薩拉，瑞典）來檢測動態結合容量。結果顯示於圖9。

如圖9所示，就Capto ^TMQ管柱而言，其動態結合容量隨著移動相的流速增加而明顯下降，這顯示流速的增加，不利於被填充於該管柱內的右旋糖酐粒子從移動相中吸附大分子。這看起來是歸因於下列事實，亦即該習用管柱中物質於粒子內部的傳輸僅僅透過擴散作用來達成，而擴散作用的效率會隨著流速的增加而降低。就CIMmultus ^TMQA而言，其動態結合容量隨著流速的增加而稍微上升，但管柱製造廠商不建議在流速超過每小時600公分下操作。就實例4的層析管柱而言，其中所填充的多孔粒子在從移動相中吸附BSA分子上展現出穩定的能力，即使在例如每小時2400公分的超高流速下也能穩定表現。換句話說，本案多孔粒子對於BSA分子的吸附能力，與移動相的流速無關，這顯示BSA分子是以對流方式被傳輸於多孔粒子內部。這個結果也顯示，在本案填充層析管柱中，BSA於粒子內部的傳輸只被對流作用所支配，這指出本發明的多孔粒子，以及其中所形成的多孔網絡，實質上不具有擴散孔，亦即實質上不具有直徑小於100奈米的微孔。

實例6：病毒的純化

在本例中，實例4所製得的離子交換層析管柱，與Capto ^TMQ和CIMmultus ^TMQA等習用管柱產品一起，依據Tseng Y.F. et al., Vaccine36 (2018), p.3146-3152此篇論文所提出的方法，就其收穫人類感染性禽流感病毒（H7N9）的能力接受測試。病毒樣品是以圖10A-10B所標示的流速載入各個管柱。收集流經管柱的分離部分，用於測量病毒回收率，而宿主細胞DNAs則被管柱所吸附。

如圖10A所示，CIMmultus ^TMQA管柱的病毒回收效率隨著流速增加而急遽降低。另一方面，DuloCore ^TMQA管柱的回收率在整個受測流速範圍皆維持在高於75%。進一步於圖10B顯示，DuloCore ^TMQA管柱展現出近乎恆定的DNA去除率，且即使當流速增加至高達每小時2400公分，該DNA去除率仍然維持於高位，相對來說，Capto ^TMQ和CIMmultus ^TMQA管柱皆不被建議使用在流速超過每小時600公分的場合下。

儘管本發明已參照以上較佳具體例說明，應認知到較佳具體例僅為例示目的給予而非意圖限制本發明之範圍，可進行對熟習相關技藝者而言極為明顯的各種更動與改變，而不會逸離本發明精神與範圍。

2:靜相 3:移動相 4:大分子

本發明的上述與其他目的、特徵與功效在參照下列較佳具體例的說明連同隨附圖式將變得顯明，其中：

圖1是一個習用樹脂珠的示意圖；

圖2是依據本發明進行的吸附層析術的示意圖；

圖3是一示意圖，顯示具有不同吸附特性的大分子離開管柱的時間不同；

圖4A顯示篩分後所得兩群粒子的尺寸分佈；以及圖4B-4F是依據本發明一具體例的多孔粒子的幾個掃描式電顯影像；

圖5是一個掃描式電顯影像，顯示依據本發明一具體例的一個多孔粒子的內部；

圖6是一示意圖，顯示通過依據本發明一具體例的多孔粒子的物質傳輸；

圖7顯示依據本發明一具體例的多孔粒子的製造方法流程圖；

圖8是透過壓汞法測得的多孔粒子的孔徑分佈曲線圖；

圖9是一直方圖，其比較了依據本發明一具體例的層析管柱和兩種習用離子交換管柱的動態結合容量；以及

圖10A是一直方圖，其比較了依據本發明一具體例的層析管柱和兩種習用離子交換管柱的血球凝集素（HA）回收率；以及圖10B是一直方圖，其比較了依據本發明一具體例的層析管柱和兩種習用離子交換管柱的DNA去除能力。

無

Claims

一種用於吸附層析術的靜相媒質，其包含：多個由交聯高分子材料製成的多孔粒子，其具有位於25微米至500微米的範圍內的費雷特直徑(Feret diameter)，並且具有70%至90%的孔隙率，所述粒子各形成有許多球狀巨孔，直徑位於3微米至10微米的範圍內，其中所述球狀巨孔經由連接孔而相互連接，從而構成一多孔網絡，該多孔網絡的平均直徑位於0.2微米至6微米的範圍內；以及其中所述多孔粒子是經由使一多孔整體柱接受機械式研磨來製造出形狀不規則且尺寸不一之複數顆粒構形，其具有介於1.0至3.5的費雷特長寬比分佈(Feret aspect ratio distribution)和位於1.2至2.2的範圍內的標準差。
如請求項1所述的靜相媒質，其中依據壓汞法測量，所述多孔粒子實質上不具有直徑低於100奈米的微孔。
如請求項2所述的靜相媒質，其中該多孔網絡具有位於0.5微米至3.0微米的範圍內的平均直徑。
如請求項3所述的靜相媒質，其中該多孔網絡具有位於1.2微米至2.4微米的範圍內的平均直徑。
如請求項2所述的靜相媒質，其中該靜相媒質經過表面改質而具有離子交換官能基。
如請求項5所述的靜相媒質，其中該離子交換官能基選自於由四級銨、二乙基胺乙基、磺醯基和羧甲基所組成的群組。
如請求項6所述的靜相媒質，其中該交聯高分子材料選自於由聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚吡咯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯和聚矽氧所組成的群組。
如請求項7所述的靜相媒質，其中該交聯高分子材料選自於聚甲基丙烯酸酯。
如請求項2所述的靜相媒質，其中所述多孔粒子的球狀巨孔中有至少70%是以最密堆積的形式排列。
一種層析管柱，其包含一填充有如請求項1所述的靜相媒質的中空長形管體。
一種用於製造如請求項1所述的靜相媒質的方法，其包含下列步驟：A.製備一由交聯高分子材料製成且具有70%至90%的孔隙率的多孔整體柱，其中該多孔整體柱形成有許多球狀巨孔，直徑位於3微米至10微米的範圍內，且所述球狀巨孔經由連接孔而相互連接，從而構成一多孔網絡，該多孔網絡的平均直徑位於0.2微米至6微米的範圍內；B.使該多孔整體柱接受機械式研磨，以使得該多孔整體柱被研磨成具有低於1,000微米的粒子尺寸分佈的第一群多孔粒子；以及C.依粒子尺寸分選該第一群多孔粒子，以獲得費雷特直徑位於25微米至500微米的範圍內的第二群多孔粒子，其中所述第二群多孔粒子呈現不規則顆粒構形，具有介於1.0至3.5的費雷特長寬比分佈和位於1.2至2.2的範圍內的標準差。
如請求項11所述的方法，其中該步驟C的依粒子尺寸分選包含使該第一群多孔粒子經過一系列的泰勒式篩網來進行篩分。