TWI899079B

TWI899079B - 抗ror1/抗cd3雙特異性結合分子

Info

Publication number: TWI899079B
Application number: TW109117258A
Authority: TW
Inventors: 傑佛瑞Ｄ瓦金斯; 卡堤傑森; 美羅高; 布萊恩蘭努帝; 清莊武; Ｊ曼帝瓦金斯
Original assignee: 美商維洛斯生物公司
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2025-10-01

Abstract

本發明係關於結合於ROR1及CD3之雙特異性結合分子及使用其治療諸如癌症之疾病及病狀的方法。

Description

抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子

本發明係關於靶向ROR1及CD3之新穎雙特異性結合分子，以及包含此等抗體中之一或多者的醫藥組合物，及抗體及醫藥組合物用於治療癌症之用途。

受體酪胺酸驅動酶類孤兒受體1(ROR1)為介導來自其配體(分泌之醣蛋白Wnt5a)之信號的細胞表面蛋白。與其在胚胎發生期間影響幹細胞去向中之作用一致，觀測到ROR1對侵襲性惡性病之表現，該等侵襲性惡性病恢復至胚胎轉錄程式，但在正常成人組織上未觀測到，提供作為治療目標之有利選擇性概況。ROR1通常表現於患有急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性淋巴母細胞白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)及芮氏轉形(Richter's transformation)或理查特症候群(Richter's syndrome，RS)之患者的惡性細胞上。ROR1亦存在於多個實體腫瘤之細胞表面上，其中其似乎為癌症幹細胞之標誌物。因為其不表現為健康成人組織中之可觀含量，但在多種血液及實體腫瘤中顯示高表現量，所以ROR1為腫瘤特異性療法之有吸引力的目標。

分化簇3(CD3)為與T細胞受體複合物(TCR)結合表現於T細胞上之多聚體蛋白複合物，且為T細胞活化所需。功能性CD3由以下三個二聚體對中之一者中的四個不同鏈--ε、γ、δ及ζ中之兩者的二聚組合形成：γ/ε、δ/ε及ζ/ζ。已顯示針對CD3之抗體在T細胞上叢集CD3，引起T細胞活化。因此，已提出抗CD3抗體用於涉及T細胞活化之治療目的。舉例而言，已提出將能夠結合CD3及目標抗原之雙特異性抗體用於涉及將T細胞免疫反應靶向表現目標抗原之組織及細胞的治療性用途。CD19×CD3雙特異性T細胞接合子(BiTE)，博納吐單抗之當前批准已驗證此方法。

已針對雙特異性結合分子描述多種型式及組合物。多個變量影響此等分子之活體內效能，包括PK、靶向抗原之抗原決定基、抗原結合組分之相對親和力，及互補位之價數及空間組態。當前，不存在先驗設計優化雙特異性結合分子(諸如特異性結合於ROR1及CD3兩者之抗體)之所有此等參數的單分子的可靠方法。雙特異性構築體必須設計、製造及測試以系統地評估許多此等參數之影響及選擇用於治療性用途(諸如癌症治療)之最佳雙特異性結合分子。

鑒於上文，需要將ROR1抗原之腫瘤特異性與重新導向T細胞之有效活性組合的新穎且改良之癌症治療劑。

本發明係關於靶向ROR1及CD3之新穎雙特異性結合分子，以及包含此等抗體中之一或多者的醫藥組合物，及抗體及醫藥組合物用於治療癌症之用途。與當前可獲得之癌症治療(包括抗體治療)相比，預期本發明之雙特異性結合分子可提供優良臨床反應。

在一些實施例中，本發明提供一種雙特異性結合分子，其包含特異性結合於人類ROR1之細胞外域的第一抗原結合域及特異性結合於人類CD3之細胞外域的第二抗原結合域。

在某些實施例中，第一抗原結合域與包含SEQ ID NO：82 中所闡述之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：83中所闡述之輕鏈胺基酸序列的抗體競爭結合於人類ROR1上，或與該抗體結合人類ROR1之相同的抗原決定基。在特定實施例中，第一抗原結合域包含：a)分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65之胺基酸序列的重鏈(H)-CDR1-3及輕鏈(L)-CDR1-3；b)分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；c)包含與SEQ ID NO：72至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變域(VH)及包含與SEQ ID NO：73至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變域(VL)；d)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的VL；e)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的VL；f)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的輕鏈(LC)；g)包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；h)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；或i)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC。

在某些實施例中，第二抗原結合域與一抗體競爭結合於人類CD3，或與該抗體結合人類CD3之相同的抗原決定基，該抗體包含：a)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的重鏈可變域(VH)及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的輕鏈可變域(VL)；b)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的VL；或c)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的VL。在特定實施例中，第二抗原結合域包含：a)分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的重鏈(H)-CDR1-3及輕鏈(L)-CDR1-3；b)分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；c)分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；d)包含與SEQ ID NO：70至少90%一致之胺基酸序列的重鏈可變域(VH)及包含與SEQ ID NO：71至少90%一致之胺基酸序列的輕鏈可變域(VL)；e)包含與SEQ ID NO：66至少90%一致之胺基酸序列的VH及包含與SEQ ID NO：67至少90%一致之胺基酸序列的VL；f)包含與SEQ ID NO：68至少90%一致之胺基酸序列的VH及包含與SEQ ID NO：69至少90%一致之胺基酸序列的VL；g)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的VL；h)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的VL；i)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的VL；j)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的VL；k)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的VL；或l)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的VL。

在一些實施例中，本發明提供一種雙特異性結合分子，其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65之胺基酸序列的重鏈(H)-CDR1-3及輕鏈(L)-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；c)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3； d)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；e)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；或f)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3。

在一些實施例中，本發明提供一種雙特異性結合分子，其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；c)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列之VH及VL； d)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列之VH及VL；e)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列之VH及VL；或f)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列之VH及VL。

在一些實施例中，本發明提供一種雙特異性結合分子，其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81之胺基酸序列之VH及VL；b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81之胺基酸序列之VH及VL；c)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL的，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：78及79之胺基酸序列之VH及VL；d)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：76及77之胺基酸序列之VH及VL； e)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：78及79之胺基酸序列之VH及VL；或f)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：76及77之胺基酸序列之VH及VL。

在一些實施例中，本發明提供一種雙特異性結合分子，其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之重鏈(HC)及輕鏈(LC)，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；c)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列之VH及VL；d)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列之VH及VL；e)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列之VH及VL； f)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列之VH及VL；g)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；h)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；i)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列之VH及VL；j)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列之VH及VL；k)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列之VH及VL；或 l)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列之VH及VL。

在一些實施例中，本發明提供一種雙特異性結合分子，其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之重鏈(HC)及輕鏈(LC)，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81之胺基酸序列之VH及VL；b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81之胺基酸序列之VH及VL；c)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：78及79之胺基酸序列之VH及VL；d)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：76及77之胺基酸序列之VH及VL；e)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：78及79之胺基酸序列之VH及VL；f)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：76及77 之胺基酸序列之VH及VL；g)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81之胺基酸序列之VH及VL；h)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81之胺基酸序列之VH及VL；i)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：78及79之胺基酸序列之VH及VL；j)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：76及77之胺基酸序列之VH及VL；k)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：78及79之胺基酸序列之VH及VL；或l)第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106或109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83 之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：76及77之胺基酸序列之VH及VL。

在某些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含SEQ ID NO：14及19、SEQ ID NO：7及19、SEQ ID NO：7及18或SEQ ID NO：7及23之胺基酸序列。在某些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含：a)SEQ ID NO：1及16之胺基酸序列；b)SEQ ID NO：2及16之胺基酸序列；c)SEQ ID NO：3及16之胺基酸序列；d)SEQ ID NO：4及16之胺基酸序列；e)SEQ ID NO：5及16之胺基酸序列；f)SEQ ID NO：6及16之胺基酸序列；g)SEQ ID NO：7及17之胺基酸序列；h)SEQ ID NO：7及20之胺基酸序列；i)SEQ ID NO：7及21之胺基酸序列；j)SEQ ID NO：7及22之胺基酸序列；k)SEQ ID NO：8、9及16之胺基酸序列；l)SEQ ID NO：8、10及16之胺基酸序列；m)SEQ ID NO：8、11及16之胺基酸序列；n)SEQ ID NO：12、11及16之胺基酸序列；o)SEQ ID NO：12、13及16之胺基酸序列；或p)SEQ ID NO：8、15及16之胺基酸序列。

在一些實施例中，本文所描述之雙特異性結合分子可具有第一及第二抗原結合域之以下價數中之任一者： a)該第一抗原結合域具有2價數，且該第二抗原結合域具有2價數；b)該第一抗原結合域具有1價數，且該第二抗原結合域具有1價數；或c)該第一抗原結合域具有2價數，且該第二抗原結合域具有1價數。

在一些實施例中，本文所描述之雙特異性結合分子可包含人類IgG1恆定區；該恆定區可含有胺基酸取代L234A、L235A及/或G237A，其中殘基係根據EU系統編號。

在一些實施例中，本文所描述之雙特異性結合分子之第二抗原結合域為scFv。

在本文所描述之雙特異性結合分子的一些實施例中，第二抗原結合域之重鏈或輕鏈胺基酸序列經由肽連接子與第一抗原結合域之重鏈或輕鏈胺基酸序列融合。在某些實施例中，肽連接子具有GGGGSGGGGS之胺基酸序列(SEQ ID NO：93)。在特定實施例中，第二抗原結合域之重鏈或輕鏈胺基酸序列可與例如以下融合：a)該第一抗原結合域之該輕鏈的羧基端；或b)該第一抗原結合域之該輕鏈的胺基端。

在某些實施例中，本文所描述之雙特異性結合分子具有以下特性中之至少一者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)：a)如藉由ELISA所測定，用於固定ROR1之K_D為0.5nM或更小；b)如藉由ELISA所測定，用於可溶性b-ROR1之K_D為0.4nM或更小； c)與分別包含SEQ ID NO：82及83之重鏈及輕鏈胺基酸序列之抗體相比，在經ROR1轉染之MEC細胞及/或Jurkat細胞中展現經減少之內化作用；d)以1μg/mL或更小誘導在經PBMC暴露之經ROR1轉染之MEC細胞中之LDH釋放；e)以1μg/mL或更小誘導在經PBMC暴露之JeKo-1細胞中之LDH釋放；f)以1μg/mL或更小誘導在經PBMC暴露之Mino細胞中之LDH釋放；g)以1μg/mL或更小誘導在經PBMC暴露之MDA-MB-468細胞中之LDH釋放；h)如藉由流式細胞測量術所測定，以1μg/mL或更小上調與經ROR1轉染之MEC細胞一起共培養之T細胞表面上之CD69；i)如藉由流式細胞測量術所測定，以1μg/mL或更小上調與JeKo-1細胞一起共培養之該T細胞表面上之CD69；j)如藉由流式細胞測量術所測定，以1μg/mL或更小上調與Mino細胞一起共培養之該T細胞表面上之CD69；k)如藉由流式細胞測量術所測定，以1μg/mL或更小上調與MDA-MB-468細胞一起共培養之該T細胞表面上之CD69；及l)以1μg/mL或更小誘導來自與經Jeko-1或ROR1轉染之MEC細胞共培養之T細胞之IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-4及IL-2的釋放。

本發明亦提供一種免疫結合物，其包含與細胞毒性劑結合的本文所描述之雙特異性結合分子。

本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之雙特異性結合分子及醫藥學上可接受之賦形劑。

本發明亦提供一或多個經分離核酸分子，其包含編碼本文所描述之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之重鏈及輕鏈可變域(VH及VL)的核苷酸序列，且進一步包含編碼本文所描述之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之VH及VL的核苷酸序列。在一些實施例中，經分離核酸分子包含：a)SEQ ID NO：37及42之核苷酸序列；b)SEQ ID NO：30及42之核苷酸序列；c)SEQ ID NO：30及41之核苷酸序列；d)SEQ ID NO：30及46之核苷酸序列；e)SEQ ID NO：24及39之核苷酸序列；f)SEQ ID NO：25及39之核苷酸序列；g)SEQ ID NO：26及39之核苷酸序列；h)SEQ ID NO：27及39之核苷酸序列；i)SEQ ID NO：28及39之核苷酸序列；j)SEQ ID NO：29及39之核苷酸序列；k)SEQ ID NO：30及40之核苷酸序列；l)SEQ ID NO：30及43之核苷酸序列；m)SEQ ID NO：30及44之核苷酸序列；n)SEQ ID NO：30及45之核苷酸序列；o)SEQ ID NO：31、32及39之核苷酸序列；p)SEQ ID NO：31、33及39之核苷酸序列； q)SEQ ID NO：31、34及39之核苷酸序列；r)SEQ ID NO：35、34及39之核苷酸序列；s)SEQ ID NO：35、36及39之核苷酸序列；或t)SEQ ID NO：31、38及39之核苷酸序列。

本發明亦提供一種載體，其包含本文所描述之經分離核酸分子。

本發明亦提供一種宿主細胞，其包含編碼本文所描述之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之重鏈及輕鏈可變域(VH及VL)的核苷酸序列，且進一步包含編碼本文所描述之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之VH及VL的核苷酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，宿主細胞包含以下核苷酸序列：a)SEQ ID NO：37及42；b)SEQ ID NO：30及42；c)SEQ ID NO：30及41；d)SEQ ID NO：30及46；e)SEQ ID NO：24及39；f)SEQ ID NO：25及39；g)SEQ ID NO：26及39；h)SEQ ID NO：27及39；i)SEQ ID NO：28及39；j)SEQ ID NO：29及39；k)SEQ ID NO：30及40；l)SEQ ID NO：30及43； m)SEQ ID NO：30及44；n)SEQ ID NO：30及45；o)SEQ ID NO：31、32及39；p)SEQ ID NO：31、33及39；q)SEQ ID NO：31、34及39；r)SEQ ID NO：35、34及39；s)SEQ ID NO：35、36及39；或t)SEQ ID NO：31、38及39。

本發明亦提供一種用於產生本文所描述之雙特異性結合分子的方法，其包含提供如本文所描述之宿主細胞，在適合於表現雙特異性結合分子之條件下培養該宿主細胞，及分離所得雙特異性結合分子。

本發明亦提供一種治療患者之癌症的方法，其包含向該患者投與本文所描述之雙特異性結合分子。另外，本發明提供本文所描述之雙特異性結合分子用於製造供治療患者之癌症用之藥劑及本文所描述之雙特異性結合分子用於治療患者之癌症的用途。在一些實施例中，癌症為ROR1-陽性癌症。在一些實施例中，癌症為白血病、淋巴瘤或實體腫瘤。在一些實施例中，癌症為急性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、T細胞白血病、套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、T細胞非霍奇金淋巴瘤(T cell non-Hodgkin lymphoma)、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、華氏巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)、多發性骨髓瘤、邊緣區淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤或已經歷芮氏轉形之非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)。在一些實施例中，癌症為結腸癌、非小細胞肺癌、神經膠母細胞瘤、肝細胞癌、胰臟癌、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、頭頸癌、卵巢癌、乳癌或三陰性乳癌。在某些實施例中，患者可用一或多種額外治療劑治療，諸如布魯頓氏酪胺酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BTK)抑制劑、B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)抑制劑、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制劑及/或磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑。在特定實施例中，額外治療劑為依魯替尼(ibrutinib)、阿卡替尼(acalabrutinib)、維納妥拉(venetoclax)、依維莫司(everolimus)、賽泮替布(sapanisertib)或艾德昔布(idelalisib)。

本發明亦提供一種套組，其包含如本文所描述之雙特異性結合分子。另外，本發明提供一種包含如本文所描述之雙特異性結合分子的製品，其中該製品適用於治療患者之癌症。

圖1為說明本發明之雙特異性結合分子之例示性組態的示意圖。

圖2為說明如藉由ELISA(A圖)及藉由結合於活的經ROR1轉染之MEC細胞之流式細胞測量術分析(B圖)所測定，與親本Ab1 Fab(WT)及三個重鏈變異體(Ab2(T32A)、Ab3(T32E)及W110Y)之人類ROR1結合的一對圖。

圖3為說明如藉由ELISA使用延長之洗滌條件所測定，結合於親本Ab1 Fab(WT)及三個變異體(Ab2(T32A)、Ab6(T32A(HC)+A25P(LC))及Ab7(T32A(HC)+T69R(LC))之人類ROR1的圖。

圖4為展示如藉由結合於經ROR1轉染之MEC細胞(A圖)及對照MEC細胞(B圖)之流式細胞測量術分析所表明，針對ROR1之雙特異性構築體1-3、7-9及13-15之選擇性的一對圖。非特異性人類IgG作為對照包括在內(「對照」)。

圖5為展示ROR1表現量對雙特異性構築體1-3、7-9及13-15(A圖)、4-6及10-12(B圖)及3、9及15-20(C圖)之結合之影響的一組圖。藉由流式細胞測量術使用Jeko-1細胞評估結合，該等細胞表現比經ROR1轉染之MEC細胞(約56,000個複本/細胞)更低水準之ROR1(約13,000個複本/細胞)。

圖6為展示如藉由ELISA表徵之雙特異性構築體與固定人類ROR1之結合的一對圖。

圖7為展示如藉由ELISA表徵之雙特異性構築體與可溶性經生物素標記之人類ROR1之結合的圖。

圖8為展示對於用構築體1(A圖)、構築體7(B圖)及構築體13(C圖)培育之經ROR1轉染之MEC細胞，結合於ROR1之雙特異性結合分子之細胞表面水準(「表面biAb」)、不結合於雙特異性結合分子之游離ROR1之細胞表面水準(「未佔用抗原決定基」)及總細胞表面ROR1(「總ROR1」)的一組圖。

圖9為展示對於用構築體19(A圖)及構築體20(B圖)培育之經ROR1轉染之MEC細胞，結合於ROR1之雙特異性結合分子之細胞表面水準(「表面biAb」)、不結合於雙特異性結合分子之游離ROR1之細胞表面水準(「未佔用抗原決定基」)及總細胞表面ROR1(「總ROR1」)的一對圖。

圖10為展示在培育24小時之後在經ROR-1轉染之MEC細胞之表面上的雙特異性構築體1、7及13之定量的圖。

圖11為說明如藉由流式細胞測量術分析所表明，結合於雙特異性構築體1-6(A圖)、7-12(B圖)及13-15(C圖)之Jurkat細胞的一組圖。非特異性人類IgG作為對照包括在內(「對照」)。

圖12為說明如藉由流式細胞測量術分析所表明，結合於雙特異性構築體1、7及13(A圖)及雙特異性構築體3、9及15-10(B圖)之Jurkat細胞的一對圖。在一個實驗中包括非特異性人類IgG作為對照(A圖，「對照」)，而在第二實驗中包括不相關ROR1×CD3雙特異性構築體(美國專利公開案2017/0233472)作為對照(B圖，「對照1」)。

圖13為在不存在ROR1下結合於CD3之後，隨時間推移定量在Jurkat細胞表面上雙特異性構築體1-3、7-9及13-15之水準的圖。

圖14為定量自經ROR1轉染之MEC細胞的LDH釋放(A圖)及CD8⁺細胞上之CD69之細胞表面水準(B圖)的一對圖，其中經ROR1轉染之MEC細胞與(1)人類PBMC及(2)雙特異性構築體1、3、7、9、13及15及對照抗CD19/抗CD3雙特異性結合分子(「CD19×CD3」)一起培育。

圖15為定量自經ROR1轉染之MEC細胞的LDH釋放(A圖)及CD8⁺細胞上之CD69之細胞表面水準(B圖)的一對圖，其中經ROR1轉染之MEC細胞與人類PBMC及雙特異性構築體3、9及15-20一起培育。

圖16為比較與(1)PBMC及(2)雙特異性構築體1-3、7-9及13-15及抗CD19/抗CD3雙特異性結合分子對照一起培育的經ROR1轉染及未經轉染之MEC細胞之間的LDH釋放的圖。亦在不含靶細胞(「PBMC」)之樣品及不含雙特異性構築體(「無biAb」)之樣品中評定LDH釋放。

圖17為評定T細胞上CD69含量之一組圖，其中將ROR1^- /CD19⁺ MEC細胞(A圖)或ROR1⁺/CD19⁺ MEC細胞(B圖)與(1)T細胞及(2)雙特異性構築體7或對照抗CD19/抗CD3雙特異性結合分子(「CD19×CD3」)一起培育。

圖18為定量來自JeKoa-1細胞之LDH釋放(A圖)及CD8⁺細胞上之CD69之細胞表面含量(B圖)的一對圖，其中JeKo-1細胞與人類PBMC及雙特異性構築體2、3、8、9、14及15一起培育。

圖19為定量來自JeKo-1細胞之LDH釋放(A圖)及CD8⁺細胞上之CD69之細胞表面含量(B圖)的一對圖，其中JeKo-1細胞與人類PBMC及雙特異性構築體3、7、9及15-20一起培育。

圖20為定量來自Mino細胞之LDH釋放(A圖)及CD8⁺細胞上之CD69之細胞表面含量(B圖)的一對圖，其中Mino細胞與人類PBMC及雙特異性構築體7-9一起培育。

圖21為定量來自MDA-MB-468細胞之LDH釋放(A圖)及CD8⁺細胞上之CD69之細胞表面含量(B圖)的一對圖，其中MDA-MB-468細胞與人類PBMC及雙特異性構築體2、3、8、9、12及14一起培育。

圖22為定量來自MDA-MB-468細胞之LDH釋放(A圖)及CD8⁺細胞上之CD69之細胞表面含量(B圖)的一對圖，其中MDA-MB-468細胞與人類PBMC及雙特異性構築體9、18及20一起培育。

圖23為在用指定目標細胞及雙特異性構築體7、9、18及20(A圖)或9、18、20(B圖及C圖)活化T細胞之後，定量來自JeKo-1細胞(A圖)、經ROR1轉染之MEC細胞(B圖)及來自經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)之TNF-α之釋放的一組圖。用單一濃度(1μg/mL)之雙特異性構築體處理經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)。「對照1」為不相關的 ROR1×CD3雙特異性構築體。

圖24為在用指定目標細胞及雙特異性構築體7、9、18及20(A圖)或9、18、20(B圖及C圖)活化T細胞之後，定量來自JeKo-1細胞(A圖)、經ROR1轉染之MEC細胞(B圖)及來自經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)之IFN-γ之釋放的一組圖。用單一濃度(1μg/mL)之雙特異性構築體處理經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)。「對照1」為不相關的ROR1×CD3雙特異性構築體。

圖25為在用指定目標細胞及雙特異性構築體7、9、18及20(A圖)或9、18、20(B圖及C圖)活化T細胞之後，定量來自JeKo-1細胞(A圖)、經ROR1轉染之MEC細胞(B圖)及來自經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)之IL-2之釋放的一組圖。用單一濃度(1μg/mL)之雙特異性構築體處理經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)。「對照1」為不相關的ROR1×CD3雙特異性構築體。

圖26為在用指定目標細胞及雙特異性構築體7、9、18及20(A圖)或9、18、20(B圖及C圖)活化T細胞之後，定量來自JeKo-1細胞(A圖)、經ROR1轉染之MEC細胞(B圖)及來自經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)之IL-4之釋放的一組圖。用單一濃度(1μg/mL)之雙特異性構築體處理經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)。「對照1」為不相關的ROR1×CD3雙特異性構築體。

圖27為在用指定目標細胞及雙特異性構築體7、9、18及20(A圖)或9、18、20(B圖及C圖)活化T細胞之後，定量來自JeKo-1細胞(A圖)、經ROR1轉染之MEC細胞(B圖)及來自經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)之IL-6之釋放的一組圖。用單一濃度(1μg/mL)之雙特異性構築體處理經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)。「對照1」為不相關的ROR1×CD3雙特異性構築體。

圖28為在用指定目標細胞及雙特異性構築體7、9、18及20(A圖)或9、18、20(B圖及C圖)活化T細胞之後，定量來自JeKo-1細胞(A圖)、經ROR1轉染之MEC細胞(B圖)及來自經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)之IL-10之釋放的一組圖。用單一濃度(1μg/mL)之雙特異性構築體處理經假擬轉染之ROR1^-MEC細胞(C圖)。「對照1」為不相關的ROR1×CD3雙特異性構築體。

圖29為展示抗ROR1及抗CD3抗原結合域之指定序列之SEQ ID NO的圖表。

相關申請之交叉參考

本申請案主張2019年5月23日申請之美國臨時專利申請案62/852,039之優先權。申請案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

序列表

本申請案含有已以ASCII格式電子地提交且特此以全文引用之方式併入之序列表。2020年5月18日產生之序列表之電子複本命名為024651_WO004_SL.txt且為258,844位元組大小。

本發明提供結合於ROR1及CD3之新的雙特異性結合分子。在一些實施例中，雙特異性結合分子結合於ROR1及CD3使T細胞接近於ROR1-陽性腫瘤細胞，因此藉由調用T細胞毒性來治療癌症。除非另有說明，否則如本文中所使用，「ROR1」係指人類ROR1。人類ROR1多肽序列可在UniProt寄存編號Q01973-1(SEQ ID NO：89)下獲得。除非另有說明，否則如本文中所使用，「CD3」係指人類CD3。CD3由γ鏈、δ鏈及兩個ε鏈構成。人類CD3 γ多肽序列可在GenBank寄存編號NP_000064.1(SEQ ID NO：90)下獲得。人類CD3 δ多肽序列可在GenBank寄存編號NP_000723.1(SEQ ID NO：91)下獲得。人類CD3 ε多肽序列可在GenBank寄存編號NP_000724.1(SEQ ID NO：(SEQ ID NO：92)下獲得。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子之抗原結合域來源於抗ROR1抗體及抗CD3抗體。如本文所用，術語「抗體」(Ab)或「免疫球蛋白」(Ig)可指包含藉由二硫鍵互連之兩個重(H)鏈(約50-70kDa)及兩個輕(L)鏈(約25kDa)之四聚體。各重鏈由重鏈可變域(VH)及重鏈恆定區(CH)構成。各輕鏈由輕鏈可變域(VL)及輕鏈恆定區(CL)構成。VH及VL域可進一步再分成高變區，稱為「互補決定區」(CDR)，與更保守之區域穿插，稱為「構架區」(FR)。各VH及VL由三個CDR(本文中H-CDR指示來自重鏈之CDR；且本文中L-CDR指示來自輕鏈之CDR)及四個FR構成，按以下順序自胺基端至羧基端配置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

給定CDR或FR之精確胺基酸序列邊界可容易地使用若干熟知方案，包括由以下所描述之方案，中之任一者確定：Kabat等人，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)(「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人，JMB 273,927-948(1997)(「Chothia」編號方案)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)(「接觸」編號方案)；Lefranc等人，Dev Comp Immunol.27(1)：55-77(2003)(「IMGT」編號方案)；及Honegger及Plückthun,J Mol Biol,309(3)：657-70(2001)(「Aho」編號方案)。

給定CDR或FR之邊界可根據用於標識之方案而變化。舉例而言，Kabat方案係基於序列比對，而Chothia方案係基於結構資訊。Kabat及Chothia方案之編號均係基於最常見抗體區序列長度，具有由插入字母容納之插入，例如「30a」。兩種方案使得某些插入及缺失(「插入或缺失」)位於不同位置，產生不同編號。接觸方案係基於複合物晶體結構之分析且在多個方面與Chothia編號方案相似。除非另外指明，否則本文中所提及之抗體之CDR可根據Kabat、Chothia、IMGT、接觸及Aho方法中之任一者鑑別。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子所來源的抗ROR1抗體及/或抗CD3抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗ROR1抗體及/或抗CD3抗體為嵌合抗體、人類化抗體或完全人類抗體。

術語「親和力」係指抗原與抗體或其抗原結合片段或諸如雙特異性結合分子之相關分子之間的吸引力之量測。抗體對抗原之固有吸引性典型地表示為特定抗體-抗原相互作用之結合親和力平衡常數(K_D)。當K_D 1mM，較佳100nM時，抗體稱為特異性結合於抗原。K_D結合親和力常數可例如藉由表面電漿子共振(BIAcore^TM)或生物層干涉術，例如使用來自IBIS技術之IBIS MX96 SPR系統或來自ForteBio之Octet^TM系統量測。

術語「互補位」係指抗體之抗原結合位點(亦即，識別且結合於抗原抗原決定基之抗體之一部分)。

如本文所用，術語「抗原決定基」係指特異性結合於抗體或相關分子(諸如雙特異性結合分子)之抗原的一部分(決定子)。抗原決定基決定子一般由諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈之分子之化學活性表面基團組成，且通常具有特定三維結構特徵，以及荷質比特徵。抗原決定基可為「線性」或「構形」的。在線性抗原決定基中，蛋白質(例如抗原)與相互作用分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿著蛋白質之初始胺基酸序列呈線性存在。在構形抗原決定基中，相互作用點存在於整個主要胺基酸序列中之彼此分離之蛋白質上的胺基酸殘基中。在測定抗原上之所需抗原決定基後，有可能使用此項技術中熟知之技術產生彼抗原決定基之抗體。舉例而言，可例如藉由用具有線性抗原決定基之胺基酸殘基之肽使動物免疫來產生線性抗原決定基之抗體。可例如藉由用含有構形抗原決定基之相關胺基酸殘基之微域使動物免疫來產生構形抗原決定基之抗體。亦可例如藉由用所關注之目標分子(例如ROR1或CD3)或其相關部分使動物免疫來產生特定抗原決定基之抗體，隨後篩選以結合於抗原決定基。

吾人可藉由使用此項技術中已知之方法(包括但不限於競爭分析、抗原決定基分組及丙胺酸篩選)判定抗體是否與本發明之雙特異性結合分子結合ROR1或CD3之相同抗原決定基或與本發明之雙特異性結合分子競爭結合。在一個實施例中，吾人允許本發明之雙特異性結合分子在飽和條件下結合於ROR1或CD3，且隨後量測測試抗體結合於該抗原之能力。若測試抗體能夠與參考雙特異性結合分子同時結合於該抗原，則測試抗體結合於與參考雙特異性結合分子不同之抗原決定基。然而，若測試抗體不能夠同時結合於抗原，則測試抗體結合於與本發明之雙特異性結合分子所結合之抗原決定基相同的抗原決定基、重疊的抗原決定基或緊密接近的抗原決定基。此實驗可使用例如ELISA、RIA、BIACORE^TM、SPR、生物層干涉術或流式細胞測量術進行。為測試本發明之雙特異性結合分子是否與另一抗體交叉競爭結合於ROR1或CD3，吾人可使用上文在兩個方向上所描述之競爭方法，亦即確定已知抗體是否阻斷測試抗體且反之亦然。此類交叉競爭實驗可例如使用IBIS MX96 SPR儀器或Octet^TM系統進行。

如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指抗體之一或多個部分或片段，其保留特異性結合於抗原(例如人類ROR1或CD3，或其部分)之能力。已展示全長抗體之特定片段可以進行抗體之抗原結合功能。術語「抗原結合部分」內涵蓋的結合片段之實例包括(i)Fab片段：由V_L、V_H、C_L及C_H1域組成之單價片段；(ii)F(ab')₂片段：在鉸鏈區包含藉由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由V_H及C_H1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單一組之V_L及V_H域組成之Fv片段；(v)由V_H域組成之dAb片段；及(vi)能夠特異性結合於抗原之分離互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域V_L及V_H由獨立基因編碼，但其可使用重組方法，藉由使其能夠以單一蛋白質鏈形式製備之合成連接子接合，其中V_L與V_H域配對形成單價分子(稱為單鏈可變片段(scFv))。亦在本發明內之為包含V_H及/或V_L之抗原結合分子。在V_H之情況下，分子亦可包含CH1、鉸鏈、CH2或CH3區中之一或多者。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中V_H及V_L域表現於單一多肽鏈上，但使用太短以致不允許兩個域之間於同一鏈上配對的連接子，從而迫使域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。

除非另外指明，否則本發明中所提及之所有抗體胺基酸殘基編號為在Honegger編號方案下之彼等(Honegger及Plückthun,J Mol Biol,309(3)：657-70(2001))。

抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子

本發明係關於一種雙特異性結合分子，其包含特異性結合於人類ROR1之細胞外域的第一抗原結合域及特異性結合於人類CD3之細胞外域的第二抗原結合域。

在一些實施例中，第一抗原結合域結合於ROR1蛋白質之細胞外部分上的抗原決定基，諸如免疫球蛋白(Ig)樣、捲曲及三環域中之一或多者中的抗原決定基。在某些實施例中，第一抗原結合域結合於SEQ ID NO：94或95中所示之ROR1之胺基酸序列(不包括末端半胱胺酸，其為方便結合起見而添加)。

在一些實施例中，第一抗原結合域與PCT專利申請案PCT/US2013/32572中所描述之抗ROR1抗體競爭結合於人類ROR1上，及/或與該抗ROR1抗體結合人類ROR1之相同的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗原結合域與包含SEQ ID NO：82中所闡述之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：83中所闡述之輕鏈胺基酸序列的抗體(「Ab1」)競爭結合於人類ROR1，及/或與該抗體結合人類ROR1之相同的抗原決定基。

在一些實施例中，第一抗原結合域在SEQ ID NO：82之胺基酸序列中包含重鏈(H)-CDR1-3且在SEQ ID NO：83之胺基酸序列中包含輕鏈(L)-CDR1-3，其中CDR藉由Kabat、Chothia、IMGT或接觸方法或其任何組合測定。

在一些實施例中，第一抗原結合域包含H-CDR1-3及L-CDR1-3，其包含以下胺基酸序列：-分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65；-分別為SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65； -分別為SEQ ID NO：98、61、62、63、64及65；-分別為SEQ ID NO：60、61、62、99、64、65；-分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、102、65；-分別為SEQ ID NO：97、61、62、99、64、65；-分別為SEQ ID NO：97、61、62、63、102、65；-分別為SEQ ID NO：98、61、62、99、64、65；或-分別為SEQ ID NO：98、61、62、63、102、65。

在一些實施例中，第一抗原結合域包含重鏈可變域(VH)，其包含與SEQ ID NO：72至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列；及輕鏈可變域(VL)，其包含與SEQ ID NO：73至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，第一抗原結合域包含：-包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列的VL； -包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列的VL；或-包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列的VL。

在一些實施例中，第一抗原結合域包含重鏈(HC)，其包含與SEQ ID NO：82至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列；及輕鏈(LC)，其包含與SEQ ID NO：83至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，第一抗原結合域包含：-包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；或-包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC。

在某些實施例中，HC序列經修飾以減少或消除效應功能。舉例而言，HC序列之IgG1部分可包含「LALA」(L234A/L235A)或「LALAGA」(L234A/L235A/G237A)突變(其中所有殘基根據EU編號方案編號)。

在一些實施例中，第一抗原結合域包含：-包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；或-包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC。

在一些實施例中，第一抗原結合域包含：-包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；或-包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC。

在一些實施例中，第一抗原結合域包含：-包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC；-包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的LC；或-包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的LC。

在一些實施例中，第一抗原結合域包含如PCT/US2013/32572中所描述之抗ROR1抗體之六個CDR、重鏈及輕鏈可變域及/或重鏈及輕鏈胺基酸序列。

在一些實施例中，第二抗原結合域結合於如Tunnacliffe等人，International Immunology 1：546-550(1989)中所定義之CD3之第I族或第II族抗原決定基。

在一些實施例中，第二抗原結合域與抗CD3抗體OKT3或SP34競爭結合於人類CD3，及/或與該抗CD3抗體OKT3或SP34結合人類CD3之相同的抗原決定基。在一些實施例中，第二抗原結合域與一抗體競爭結合於人類CD3，及/或與該抗體結合人類CD3之相同的抗原決定基，該抗體包含：-包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的VL；或-包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的VL。

在一些實施例中，第二抗原結合域包含在以下之胺基酸序列中之H-CDR1-3及L-CDR1-3：-分別為SEQ ID NO：66及67；-分別為SEQ ID NO：68及69；或-分別為SEQ ID NO：70及71；其中CDR藉由Kabat、Chothia、IMGT或接觸方法或其任何組合測定。

在一些實施例中，第二抗原結合域包含H-CDR1-3及L-CDR1-3，其包含以下之胺基酸序列：-分別為SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52；-分別為SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52；或-分別為SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59。

在一些實施例中，第二抗原結合域包含：-包含與SEQ ID NO：66至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：67至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列的VL；-包含與SEQ ID NO：68至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：69至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列的VL；或-包含與SEQ ID NO：70至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：71至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之胺基酸序列的VL。

在一些實施例中，第二抗原結合域包含：-包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的VL； -包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的VL；-包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的VL；或-包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的VL。

在一些實施例中，第二抗原結合域包含如美國專利公開案2018/0112011中所描述之抗CD3抗體的六個CDR及/或重鏈及輕鏈可變域。

本發明亦涵蓋上述第一與第二抗原結合域之任何組合。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含：-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3； -第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：98、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：98、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H- CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：98、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、99、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、99、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、99、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、102及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、102及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、102及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、99、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、99、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、99、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、102及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、 102及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、102及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：98、61、62、99、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：98、61、62、99、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：98、61、62、99、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：98、61、62、63、102及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3； -第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：98、61、62、63、102及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；或-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：98、61、62、63、102及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：47、53、49、50、51及52之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含：-包含分別與SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：75及73之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：75及73之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH 及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：75及73之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：72及100之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：72及100之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：72及100之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域； -包含分別與SEQ ID NO：72及103之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：72及103之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：72及103之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：74及100之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：74及100之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：74及100之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：74及103之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：74及103之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：74及103之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：75及100之胺基酸序列至少90%(例如至少 92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：75及100之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：75及100之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：75及103之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：75及103之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：66及67之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域；-包含分別與SEQ ID NO：75及103之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第一抗原結合域，及包含分別與SEQ ID NO：68及69之胺基酸序列至少90%(例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%)一致之VH及VL的第二抗原結合域。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含：-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：75及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：75及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：75及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及100之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及100之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及100之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及103之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL； -第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及103之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及103之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及100之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及100之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及100之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及103之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及103之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及103之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69 或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：75及100之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：75及100之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：75及100之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：75及103之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：75及103之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：75及103之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含：-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL； -第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：85及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：85及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：85及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69 或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及104之胺基酸序列之HC及LC的第一抗原結合域，及包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL的第二抗原結合域；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：85及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：85及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：85及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL； -第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：85及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：85及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：85及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL。

在某些實施例中，HC序列經修飾以減少或消除效應功能。舉例而言，HC序列之IgG1部分可包含L235E、「LALA」(L234A/L235A)或「LALAGA」(L234A/L235A/G237A)突變(其中所有殘基根據EU編號方案編號)。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含：-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：14及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：7及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：7及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL； -第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：14及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：14及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：7及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：105及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：105及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：105及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：7及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：7及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67 或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：7及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：7及104之胺基酸序列之HC及LC的第一抗原結合域，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：7及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：7及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：14及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：14及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：14及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：14及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：14及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：14及104之胺基酸序列之HC及LC的第一抗原結合域，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：105及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：105及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：105及101之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：105及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：105及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL； -第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：105及104之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含：-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69 或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之 HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL； -第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；或-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含：-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之 HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL； -第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69 或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71或80及81之胺基酸序列之VH及VL；-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：66及67或76及77之胺基酸序列之VH及VL；或-第一抗原結合域，其包含有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之HC、包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之HC及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列之LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：68及69或78及79之胺基酸序列之VH及VL。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含：- SEQ ID NO：1及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：2及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：3及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：4及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：5及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：6及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：7及17之胺基酸序列；- SEQ ID NO：7及18之胺基酸序列； - SEQ ID NO：7及19之胺基酸序列；- SEQ ID NO：7及20之胺基酸序列；- SEQ ID NO：7及21之胺基酸序列；- SEQ ID NO：7及22之胺基酸序列；- SEQ ID NO：8、9及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：8、10及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：8、11及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：12、11及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：12、13及16之胺基酸序列；- SEQ ID NO：14及19之胺基酸序列；- SEQ ID NO：8、15及16之胺基酸序列；或- SEQ ID NO：7及23之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含如上文所描述之一或兩個第一抗原結合域。在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含如上文所描述之一或兩個第二抗原結合域。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子中之第一抗原結合域具有1或2價數。在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子中之第二抗原結合域具有1或2價數。涵蓋第一與第二抗原結合域之價數的任何組合；舉例而言，第一與第二抗原結合域之價數可分別為2及2；分別為1及1；分別為2及1；或分別為1及2。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子可包含人類IgG、IgM、IgE、IgA或IgD恆定區。在某些實施例中，人類恆定區具有屬於IgG同型，例如屬於IgG子類別IgG1、IgG2a或IgG2b、IgG3或 IgG4。在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子可包含人類κ恆定區。本文所描述之雙特異性結合分子之類別可與另一類別或子類別改變或交換。舉例而言，為最初IgM之恆定區可類別轉換為IgG。此外，類別轉換可用於將一種IgG子類別轉換成另一種，例如自IgG1轉換至IgG2。κ輕鏈恆定區可例如改變至λ輕鏈恆定區。

在某些實施例中，本發明之雙特異性結合分子可包含人類IgG恆定區。在特定實施例中，IgG恆定區可包括降低或消除效應功能之突變(參見例如Wang等人，Protein Cell 9(1)：63-73(2018))。舉例而言，本發明之雙特異性結合分子可包含具有突變L235E、「LALA」突變(L234A/L235A)或「LALAGA」突變(L234A/L235A/G237A)之人類IgG1恆定區，所有均根據Eu編號方案編號。

本發明之雙特異性結合分子之類別(同型)及子類別可藉由此項技術中已知之任何方法測定。一般而言，抗體之類別及子類別可使用對抗體之特定類別及子類別具有特異性之抗體來測定。此類抗體為可商購的。類別及子類別可藉由ELISA、西方墨點法以及其他技術測定。或者，可藉由測序抗體之重鏈及/或輕鏈之恆定區之全部或一部分，將其胺基酸序列與免疫球蛋白之各種類別及子類別之已知胺基酸序列進行比較，及判定抗體之類別及子類別來判定類別及子類別。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子為均二聚體。在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子為雜三聚體(輕鏈與重鏈雜二聚體組合)，其中重鏈雜二聚體為例如於Brinkmann及Kontermann,MABS 9：182-212(2017)中所描述之格式。舉例而言，可使用「杵臼」、HA-TF、ZW1、CH3帶電對、EW-RVT、LUZ-Y、鏈交換經工程改造之域主體(SEED主體)、Biclonic、DuoBody、BEAT、7.8.60,20.8.34、Triomab/Quadroma或CrossMAb策略來促進包含本發明之雙特異性結合分子之架構中之免疫球蛋白之Fc區的多肽的雜二聚(例如過均二聚)。在某些實施例中，可使用「杵臼」方法，其中域之「杵」變異體藉由用具有較大側鏈之另一胺基酸(例如精胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸)置換具有較小側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸)獲得。域之「臼」變異體係藉由用具有較小側鏈之另一胺基酸(例如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸)置換具有較大側鏈之胺基酸(例如精胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸)而獲得。在某些實施例中，杵及/或臼突變在CH3域中。

在一些實施例中，抗ROR1抗體之抗原結合片段及/或抗CD3抗體之抗原結合片段可用於製備本發明之雙特異性結合分子。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；重組IgG(rIgG)片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv或sFv)；以及單域抗體(例如，sdAb、sdFv、奈米抗體)。在某些實施例中，片段為包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區之單鏈抗體片段，諸如scFv。

在特定實施例中，第一抗原結合域、第二抗原結合域或兩者為包含連接至整個抗體之輕鏈可變域(VL)之抗體之重鏈可變域(VH)的單鏈抗體(scFv)，其中融合蛋白保持與該抗體相同之抗原特異性。VH及VL可經由肽連接子連接。在某些實施例中，第二抗原結合域為特異性結合於CD3之scFv。

為產生單鏈抗體(scFv)，編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接至編碼可撓性連接子之另一片段，例如編碼胺基酸序列(Gly4- Ser)4(SEQ ID NO：96)，使得VH及VL序列可表現為連續單鏈蛋白質，其中VL及VH域藉由可撓性連接子接合。若僅僅使用單一VH及VL，則單鏈抗體可為單價；若使用兩個VH及VL，則為二價；或若使用超過兩個VH及VL，則為多價。

在一些實施例中，第一抗原結合域之胺基酸序列例如經由肽連接子融合於第二抗原結合域之胺基酸序列以形成融合多肽。在某些實施例中，第二抗原結合域為scFv，且融合至第一抗原結合域之重鏈或輕鏈胺基酸序列。舉例而言，第二抗原結合域可融合至：-第一抗原結合域之重鏈之胺基端；-第一抗原結合域之輕鏈之胺基端；-第一抗原結合域之重鏈的羧基端；及/或-第一抗原結合域之輕鏈之羧基端。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子如圖1中之示意圖A-E中之任一者中所示經組態。

在某些實施例中，結合第一及第二抗原結合域之肽連接子的長度在5-30個、5-25個、5-15個、10-30個、10-20個或10-15個胺基酸之間。在某些實施例中，肽連接子包含允許肽連接子溶解性之胺基酸，諸如絲胺酸及蘇胺酸。在某些實施例中，可裝入連接子(參見例如美國專利9,856,327)。在某些實施例中，肽連接子包含允許肽連接子可撓性之胺基酸，諸如甘胺酸，或允許肽連接子剛性。在某些實施例中，結合第一及第二抗原結合域之肽連接子之序列為(Gly4-Ser)X，其中X可為1、2、3或4(SEQ ID NO：114)。在特定實施例中，肽連接子之序列為GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：93)。

在一些實施例中，如本文所描述之第二抗原結合域包含一或多個突變(例如用半胱胺酸置換胺基酸殘基)以使二硫鍵結合穩定，例如以防止或減少雙特異性結合分子之聚集。

在一些實施例中，如藉由ELISA所測定，本發明之雙特異性結合分子用於固定ROR1之K_D為100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM或更小(例如0.5nM或更小)。

在一些實施例中，如藉由ELISA所測定，本發明之雙特異性結合分子用於可溶性b-ROR1之K_D為100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM或更小(例如0.4nM或更小)。

在一些實施例中，如藉由ELISA所測定，本發明之雙特異性結合分子針對CD3之K_D為100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM或更小(例如5nM或更小)。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子以10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10 ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.9ng/mL、0.8ng/mL、0.7ng/mL、0.6ng/mL、0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL或0.01ng/mL或更小在經PBMC暴露之經ROR1轉染之MEC細胞中誘導LDH釋放。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子以10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.9ng/mL、0.8ng/mL、0.7ng/mL、0.6ng/mL、0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL或0.01ng/mL或更小在經PBMC暴露之JeKo-1細胞中誘導LDH釋放。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子以10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.9ng/mL、0.8ng/mL、0.7ng/mL、0.6ng/mL、0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL或0.05ng/mL、0.01ng/mL或更小在經PBMC暴露之Mino細胞中誘導LDH釋放。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子以10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.9ng/mL、0.8ng/mL、0.7ng/mL、0.6 ng/mL、0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL或0.01ng/mL或更小在經PBMC暴露之MDA-MB-468細胞中誘導LDH釋放。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子藉由PBMC活體外誘導經ROR1轉染之MEC細胞、JeKo-1細胞、Mino細胞、MDA-MB-468細胞或其任何組合之ROR1相關性殺死。

在一些實施例中，如藉由流式細胞測量術所測定，本發明之雙特異性結合分子以50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.9ng/mL、0.8ng/mL、0.7ng/mL、0.6ng/mL、0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL或0.01ng/mL或更小上調與經ROR1轉染之MEC細胞一起培養之T細胞表面上之CD69。

在一些實施例中，如藉由流式細胞測量術所測定，本發明之雙特異性結合分子以50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.9ng/mL、0.8ng/mL、0.7ng/mL、0.6ng/mL、0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL或0.01ng/mL或更小上調與Jeko-1細胞一起培養之T細胞表面上之CD69。

在一些實施例中，如藉由流式細胞測量術所測定，本發明之雙特異性結合分子以50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7 ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.9ng/mL、0.8ng/mL、0.7ng/mL、0.6ng/mL、0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL或0.01ng/mL或更小上調與Mino細胞一起培養之T細胞表面上之CD69。

在一些實施例中，如藉由流式細胞測量術所測定，本發明之雙特異性結合分子以50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.9ng/mL、0.8ng/mL、0.7ng/mL、0.6ng/mL、0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL或0.01ng/mL或更小上調與MDA-MB-468細胞一起培養之T細胞表面上之CD69。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子以10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.9ng/mL、0.8ng/mL、0.7ng/mL、0.6ng/mL、0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL或0.01ng/mL或更小誘導來自與經JeKo-1或ROR1轉染之MEC細胞一起共培養之T細胞之IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-4及IL-2的釋放。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子具有以下特性中之至少一者：a)如藉由ELISA所測定，用於固定ROR1之K_D為0.5nM或更小；b)如藉由ELISA所測定，可溶性b-ROR1之K_D為0.4nM或更小； c)與分別包含SEQ ID NO：82及83之重鏈及輕鏈胺基酸序列之抗體相比，在經ROR1轉染之MEC細胞及/或Jurkat細胞中展現經減少之內化作用；d)以1μg/mL或更小誘導在經PBMC暴露之經ROR1轉染之MEC細胞中之LDH釋放；e)以1μg/mL或更小誘導在經PBMC暴露之JeKo-1細胞中之LDH釋放；f)以1μg/mL或更小誘導在經PBMC暴露之Mino細胞中之LDH釋放；g)以1μg/mL或更小誘導在經PBMC暴露之MDA-MB-468細胞中之LDH釋放；h)如藉由流式細胞測量術所測定，以1μg/mL或更小上調與經ROR1轉染之MEC細胞一起共培養之T細胞表面上之CD69；i)如藉由流式細胞測量術所測定，以1μg/mL或更小上調與JeKo-1細胞一起共培養之該T細胞表面上之CD69；j)如藉由流式細胞測量術所測定，以1μg/mL或更小上調與Mino細胞一起共培養之該T細胞表面上之CD69；k)如藉由流式細胞測量術所測定，以1μg/mL或更小上調與MDA-MB-468細胞一起共培養之該T細胞表面上之CD69；及l)以1μg/mL或更小誘導來自與經JeKo-1或ROR1轉染之MEC細胞共培養之T細胞之IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-4及IL-2的釋放。

在某些實施例中，本發明之雙特異性結合分子具有該等特性中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個。在特定實施例中，本發明之雙特異性結合分子具有所有該等特性。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子誘導針對ROR1-陽性細胞之T細胞細胞毒性。

核酸分子及載體

本發明亦提供編碼本文所描述之雙特異性結合分子的核酸分子及序列。在一些實施例中，不同核酸分子編碼形成雙特異性結合分子之不同多肽。在其他實施例中，相同核酸分子編碼超過一個或所有形成雙特異性結合分子之多肽。

除非另外說明，否則對核苷酸序列之提及涵蓋其互補序列。因此，提及具有特定序列之核酸應理解為涵蓋具有其互補序列的其互補鏈。如本文中所提及之術語「聚核苷酸」意謂具有至少10個鹼基長度之核苷酸(核糖核苷酸或去氧核苷酸)之聚合形式或任一種類型之核苷酸的修飾形式。術語包括單鏈及雙鏈形式。

在以上實施例中之任一者中，核酸分子可經分離。本文中稱為「經分離之」或「經純化之」核酸分子為(1)已與基因組DNA之核酸或其來源之細胞RNA分離的核酸；及/或(2)在自然界中不存在。

在一些實施例中，本發明之核酸分子包含編碼以下之核苷酸序列：- 本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之H-CDR1-3及/或L-CDR1-3；- 本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之H-CDR1-3及/或L-CDR1-3；- 本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之VH及/或VL； - 本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之VH及/或VL；及/或- 本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之HC及/或LC。

在一些實施例中，本發明之核酸分子包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之H-CDR1-3及L-CDR1-3的核苷酸序列，且進一步包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之H-CDR1-3及L-CDR1-3的核苷酸序列。在一些實施例中，本發明之核酸分子包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之VH及VL的核苷酸序列，且進一步包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之VH及VL的核苷酸序列。在一些實施例中，本發明之核酸分子包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之HC及LC的核苷酸序列，且進一步包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之VH及VL的核苷酸序列。

在一些實施例中，本發明之核酸分子包含一或多個選自由SEQ ID NO：24-46組成之群的核苷酸序列。

在某些實施例中，本發明之核酸分子包含：- SEQ ID NO：24及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：25及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：26及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：27及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：28及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：29及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及40之核苷酸序列； - SEQ ID NO：30及41之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及42之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及43之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及44之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及45之核苷酸序列；- SEQ ID NO：31、32及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：31、33及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：31、34及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：35、34及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：35、36及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：37及42之核苷酸序列；- SEQ ID NO：31、38及39之核苷酸序列；或- SEQ ID NO：30及46之核苷酸序列。

在另一態樣中，本發明提供一種適用於表現一或多種形成如本文所描述之雙特異性結合分子之多肽的載體。如本文所用，術語「載體」意謂一種核酸分子，其能夠輸送已與其連接的另一核酸。在一些實施例中，載體為質體，亦即可接合額外DNA片段之DNA之環狀雙鏈片。在一些實施例中，載體為病毒載體，其中額外DNA片段可接合至病毒基因組。在一些實施例中，載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。在其他實施例中，載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中後整合至宿主細胞之基因組中，且從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導與其操作性連接之基因之表現。此類載體在本文中稱作「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。

在一些實施例中，本發明之核酸分子可包含編碼第一抗原結合域之胺基酸序列的核苷酸序列，其在框內接合至編碼第二抗原結合域之胺基酸序列的核苷酸序列。

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子係藉由將編碼雙特異性結合分子之多肽組分的DNA插入至表現載體中，使得DNA可操作地連接至必需表現控制序列，諸如轉錄及轉譯控制序列來表現。表現載體包括質體、反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、植物病毒(諸如花椰菜嵌紋病毒、菸草嵌紋病毒)、黏質體、YAC、EBV來源之游離基因體及其類似物。編碼序列可以接合至載體中，使得載體內的轉錄及轉譯控制序列提供其調控編碼序列之轉錄及轉譯的預定功能。可以選擇與所用表現宿主細胞相容的表現載體及表現控制序列。編碼本發明之雙特異性結合分子之不同多肽組分的核苷酸序列可插入至相同或個別載體中，且可以操作方式連接至相同或不同表現控制序列(例如，啟動子)。在一個實施例中，兩個或更多個編碼序列插入至相同表現載體中且可以操作方式連接至相同表現控制序列(例如常用啟動子)、隔開相同表現控制序列(例如啟動子)，或不同表現控制序列(例如啟動子)。編碼序列可藉由標準方法(例如抗體基因片段及載體上之互補限制位點之接合，或若無限制位點存在時之鈍端接合)插入至表現載體中。

宿主細胞及雙特異性結合分子產生之方法

本發明之另一態樣係關於用於製造本發明之雙特異性結合分子之方法。在一些實施例中，用於產生如本文所定義之雙特異性結合分子的方法包含提供能夠表現雙特異性結合分子之重組宿主細胞(例如如本文所描述之宿主細胞)，在適於表現雙特異性結合分子之條件下培養該宿主細胞，及分離所得雙特異性結合分子。

可作為宿主用於表現之哺乳動物細胞株為此項技術中所熟知且包括許多可獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)之永生化細胞株。此等尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、293自由式細胞(Invitrogen)、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、嬰兒倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞及大量其他細胞株。可使用之其他細胞株為昆蟲細胞株，諸如Sf9或Sf21細胞及酵母細胞株。可基於其表現量選擇細胞株。

在一些實施例中，本發明之宿主細胞包含編碼以下之核苷酸序列：- 本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之H-CDR1-3及/或L-CDR1-3；- 本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之H-CDR1-3及/或L-CDR1-3；- 本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之VH及/或VL；- 本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之VH及/或VL；及/或- 本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之HC及/或LC。

在一些實施例中，本發明之宿主細胞包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之H-CDR1-3及L-CDR1-3的核苷酸序列，且進一步包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之H- CDR1-3及L-CDR1-3的核苷酸序列。在一些實施例中，本發明之宿主細胞包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之VH及VL的核苷酸序列，且進一步包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之VH及VL的核苷酸序列。在一些實施例中，本發明之宿主細胞包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第一抗原結合域之HC及LC的核苷酸序列，且進一步包含編碼本發明之雙特異性結合分子之第二抗原結合域之VH及VL的核苷酸序列。

在一些實施例中，本發明之宿主細胞包含一或多個選自由SEQ ID NO：24-46組成之群的核苷酸序列。

在某些實施例中，本發明之宿主細胞包含：- SEQ ID NO：24及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：25及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：26及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：27及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：28及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：29及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及40之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及41之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及42之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及43之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及44之核苷酸序列；- SEQ ID NO：30及45之核苷酸序列；- SEQ ID NO：31、32及39之核苷酸序列； - SEQ ID NO：31、33及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：31、34及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：35、34及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：35、36及39之核苷酸序列；- SEQ ID NO：37及42之核苷酸序列；- SEQ ID NO：31、38及39之核苷酸序列；或- SEQ ID NO：30及46之核苷酸序列。

醫藥組合物

本發明之另一態樣為一種醫藥組合物，其包含本發明之雙特異性結合分子作為活性成分(或作為唯一活性成分)。醫藥組合物可包含如本文所描述之任何雙特異性結合分子。在一些實施例中，組合物意欲用於改善、預防及/或治療本文所描述之癌症(例如ROR1-陽性癌症)。

一般而言，本發明之雙特異性結合分子適合於以與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑結合之調配物形式投與，例如如下所描述。

術語「賦形劑」在本文中用於描述除本發明之化合物以外的任何成分。一或多種賦形劑之選擇將在很大程度上視諸如以下之因素而定：特定投與模式、賦形劑對溶解度及穩定性之影響及劑型之性質。如本文所用，「醫藥學上可接受之賦形劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及其類似物。醫藥學上可接受之賦形劑的一些實例為水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物，以及其組合。在多數情況下，組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。醫藥學上可接受之物質之其他實例為濕潤劑或少量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其增強雙特異性結合分子之存放期或有效性。

本發明之醫藥組合物及其製備方法對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。此類組合物及其製備方法可見於例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company,1995)。醫藥組合物較佳在GMP(優良製造規範)條件下製造。

本發明之醫藥組合物可以散裝、以單一單位劑量或以複數個單一單位劑量形式製備、封裝或出售。如本文中所使用，「單位劑量」為包含預定量之活性成分之醫藥組合物的個別量。活性成分之量通常等於將向個體投與之活性成分之劑量或此劑量之適宜部分，諸如此劑量之二分之一或三分之一。

此項技術中認可之用於投與肽、蛋白質或抗體之任何方法可適合地用於本發明之雙特異性結合分子。

本發明之醫藥組合物典型地適用於非經腸投與。如本文所使用，醫藥組合物之「非經腸投與」包括特徵為個體之組織之物理突破及經由突破組織投與醫藥組合物，因此通常使得直接投與至血流、肌肉或內部器官的任何投與途徑。非經腸投與因此包括但不限於藉由注射組合物、藉由經由手術切口施加組合物、藉由經由組織穿透性非手術傷口施加組合物及類似方式來投與醫藥組合物。特定言之，預期非經腸投與包括但不限於：皮下、腹膜內、肌內、胸骨內、靜脈內、動脈內、鞘內、心室內、尿道內、顱內、瘤內及滑膜內注射或輸注；及腎透析輸注技術。亦涵蓋局部灌注。特定實施例包括靜脈內及皮下途徑。

適合於非經腸投與(例如靜脈內投與)之醫藥組合物的調配物通常包含與醫藥學上可接受之載劑(諸如無菌水或無菌等張鹽水)組合之活性成分。此類調配物可以適於以快速注射投與或連續投與之形式製備、封裝或出售。可注射調配物可以單位劑型製備、封裝或出售，諸如在安瓿中或含有防腐劑之多劑量容器中。用於非經腸投與之調配物包括但不限於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液、乳液、糊劑及其類似物。此類調配物可進一步包含一或多種其他成分，包括但不限於懸浮劑、穩定劑或分散劑。在用於非經腸投與之調配物的一個實施例中，活性成分以乾燥(亦即粉末或顆粒狀)形式提供，用於在非經腸投與重組組合物之前用適合媒劑(例如無菌無熱原水)重組。非經腸調配物亦包括水溶液，其可含有賦形劑，諸如鹽、碳水化合物及緩衝劑(較佳緩衝至pH為3至9)，但在一些應用中，非經腸調配物更適當地調配為無菌非水性溶液或待與適合媒劑(諸如無菌、無熱原質水)結合使用的乾燥形式。例示性非經腸投與形式包括無菌水溶液，例如丙二醇或右旋糖水溶液中之溶液或懸浮液。必要時，此類劑型可經適當緩衝。適用之其他可非經腸投與之調配物包括包含微晶形式或脂質體製備物中之活性成分的彼等物。用於非經腸投與之調配物可調配成速釋型及/或調釋型。調釋型調配物包括延遲釋放型、持續釋放型、脈衝釋放型、受控釋放型、靶向釋放型及程控釋放型。

雙特異性結合分子之治療性用途

在一些實施例中，本發明之雙特異性結合分子用於治療患者之癌症，諸如ROR1-陽性癌症。患者可為哺乳動物，例如人類。已顯示ROR1在許多類型之腫瘤中表現，包括淋巴瘤及實體腫瘤。較高比例之人類癌症表現ROR1。舉例而言，Zhang等人展示其檢查之54%卵巢癌、57%結腸癌、77%肺癌、90%淋巴瘤、89%皮膚癌、83%胰臟癌、73%睾丸癌、43%膀胱癌、96%子宮癌、90%前列腺癌及83%腎上腺癌經抗ROR1抗體4A5中等至強度染色(Zhang等人，Am J Pathol.181(6)：1903-10(2012))。Daneshmanesh等人相似地發現ROR1在慢性淋巴球性白血病(CLL)及毛細胞白血病(HCL)中之幾乎普遍表現及在其他淋巴癌症，諸如套細胞淋巴瘤(MCL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)/邊緣區淋巴瘤(MZL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓淋巴瘤(AML)及骨髓瘤中之不同程度之表現(Daneshmanesh等人，Leuk Lymphoma 54(4)：843-50(2013))。多個組已證明ROR1在B細胞急性淋巴母細胞白血病(ALL)之子集中之表現(參見例如，Dave等人，PLoS One 7：e52655(2012))。ROR1亦在顯著比例之肝細胞癌(HCC)或非小細胞肺癌(NSCLC)之案例中表現(美國專利公開案2018/0369406)。另外，已顯示在侵襲性癌症中ROR1表現增加且與不良預後相關；因此，本發明之雙特異性結合分子尤其適合於治療侵襲性或晚期癌症。

「治療(treat/treating/treatment)」係指一種緩解或消除生物病症及/或其伴隨症狀中之至少一者的方法。如本文所用，「緩解」疾病、病症或病狀意指降低疾病、病症或病狀之症狀之嚴重程度及/或出現頻率。另外，本文中對「治療」之提及包括對治癒性、緩解性及預防性治療之提及。癌症之治療涵蓋抑制癌症生長(包括引起部分或完全癌症消退)、抑制癌症進展或轉移、預防癌症復發或殘留疾病及/或延長患者之存活期。

雙特異性結合分子可以治療有效量向患有本文所描述之癌症的患者投與。「治療有效量」係指將在一定程度上緩解經治療之病症之症狀中之一或多者的治療劑投與量。治療有效量之抗癌治療劑可例如使得腫瘤縮小、提高存活期、消除癌細胞、減少疾病進展、逆轉癌轉移或健康護理專業人士所需之其他臨床指標。

在一些實施例中，可藉由本文所描述之雙特異性結合分子治療的癌症為ROR1表現型(亦即，ROR1-陽性)癌症。癌症可藉由任何適合確定基因表現或蛋白表現之方法，例如藉由組織學、流式細胞測量術、RT-PCR或RNA-Seq鑑別為ROR1表現型。用於測定之癌細胞可經由腫瘤切片檢查或經由收集循環腫瘤細胞獲得。在某些實施例中，若使用基於之抗體分析，諸如流式細胞測量術或免疫組織化學，則ROR1表現型癌症為任何具有顯示出抗ROR1抗體反應性比同型對照抗體大的細胞的癌症。在某些實施例中，若使用基於RNA之分析，則ROR1表現型癌症為顯示出相比於陰性對照細胞或不表現ROR1之癌症而言，ROR1 RNA之含量升高的癌症。

在某些實施例中，本發明之雙特異性結合分子用於治療血液惡性病(例如白血病及/或淋巴瘤)。在某些實施例中，本發明之雙特異性結合分子用於治療實體腫瘤。待治療之癌症可選自例如淋巴瘤、小淋巴球性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、邊緣細胞母細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、已經歷芮氏轉形之非霍奇金淋巴瘤、T細胞非霍奇金淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、華氏巨球蛋白血症、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞白血病、肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、腎細胞癌、肝細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮鱗狀細胞癌、神經膠母細胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、腦癌、肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸癌、甲狀腺癌及頭頸癌。在某些實施例中，癌症選自套細胞淋巴瘤、乳癌、肺癌、骨肉瘤及尤文氏肉瘤。

在一些實施例中，待治療之癌症可為難以用其他治療劑治療之癌症(例如三陰性乳癌)。癌症可例如處於早期、中期、晚期或轉移期。

在一些實施例中，待用本發明之雙特異性結合分子治療之患者已接受先前癌症治療。在其他態樣中，患者尚未接受先前癌症治療。

本發明之雙特異性結合分子可在無額外治療劑治療(亦即作為單獨療法(單藥療法))之情況下投與。或者，用本發明之雙特異性結合分子治療可包括至少一種額外治療性治療(組合療法)。在一些實施例中，雙特異性結合分子可與另一療法/藥物共投與或調配以用於治療癌症。額外治療可包含例如化學治療劑、抗腫瘤劑或抗血管生成劑、不同抗癌抗體及/或放射療法。

在某些實施例中，本發明之雙特異性結合分子與額外治療劑或生物活性分子組合使用(例如以治療本文所描述之癌症)。生物活性分子之實例包括但不限於：肽、蛋白質、酶、小分子藥物、前藥、碳水化合物、顯像劑、脂質、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、細胞、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、抗炎劑、抗腫瘤劑、心血管藥劑、抗焦慮藥劑、激素、生長因子、甾族藥劑、微生物衍生毒素及類似者。在一些實施例中，額外治療劑為血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑、布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白之抑制劑(mTOR)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑、Janus激酶/信號轉導及轉錄活化因子(Jak/STAT)信號傳導抑制劑、B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)抑制劑、脾臟酪胺酸激酶(SYK) 抑制劑、微管抑制劑、上皮成長因子受體(EGFR)抑制劑、聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑、多形性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑、DNA修復抑制劑、DNA交叉連接子、核苷類似物或免疫調節劑。在一些實施例中，額外治療劑為抗體，諸如利妥昔單抗(抗CD20)或貝伐單抗(bevacizumab)(抗VEGF)；布魯東氏酪胺酸激酶抑制劑，諸如阿卡替尼(acalabrutinib)或依魯替尼；mTOR抑制劑，諸如賽泮替布、依維莫司(everolimus)或BEZ235；PI3K抑制劑，諸如艾德昔布或布帕昔布(buparlisib)；Jak/STAT信號傳導抑制劑，諸如盧利替尼(ruxolitinib)；Bcl-2抑制劑，諸如ABT-199/維納妥拉、Bcl-2i-1或Bcl-2i-2；SYK抑制劑，諸如福他替尼(fostamatinib)；微管抑制劑，諸如太平洋紫杉醇或長春新鹼；EGFR抑制劑，諸如埃羅替尼(erlotinib)；PARP抑制劑，諸如奧拉帕尼(olaparib)；ALK抑制劑，諸如克唑替尼(crizotinib)；DNA修復抑制劑，諸如卡鉑(carboplatin)；DNA交聯劑，諸如奧沙利鉑(oxaliplatin)/順鉑；核苷類似物，諸如吉西他濱(gemcitabine)；或免疫調節藥物(IMiD)，諸如來那度胺(lenalidomide)或泊利度胺(pomalidomide)。在某些實施例中，額外治療劑為依魯替尼、阿卡替尼、維納妥拉、Bcl-2i-1、Bcl-2i-2、依維莫司、賽泮替布、艾德昔布、帕瑞替尼(pacritinib)、布帕昔布、BEZ235、盧利替尼、福他替尼、利妥昔單抗、利妥昔單抗-CHOP、來那度胺、泊利度胺、太平洋紫杉醇、長春新鹼、埃羅替尼、克唑替尼、卡鉑、奧沙利鉑/順鉑、貝伐單抗或吉西他濱。

在某些實施例中，本發明之雙特異性結合分子與增強患者之免疫系統(例如治療如本文所描述之癌症)之免疫檢查點調節劑組合使用。舉例而言，結合物與免疫檢查點抑制劑，諸如抗體或抗體衍生物、反義寡核苷酸、短小干擾RNA、適體或肽、靶向程序化死亡型配位體1(PD-L1，亦稱為B7-H1、CD274)、程序化死亡1(PD-1)、CTLA-4、PD-L2(B7-DC、CD273)、LAG3、TIM3、2B4、A2aR、B7H1、B7H3、B7H4、BTLA、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD137、CD160、CD226、CD276、DR3、GAL9、GITR、HAVCR2、HVEM、IDO1、IDO2、ICOS(可誘導T細胞協同刺激因子)、KIR、LAIR1、LIGHT、MARCO(具有膠原結構之巨噬細胞受體)、PS(磷脂醯絲胺酸)、OX-40、SLAM、TIGHT、VISTA、VTCN1或其任何組合一起使用。

在某些實施例中，向患者投與本發明之雙特異性結合分子與T細胞之組合(例如向患者投與自體或同種異體之T細胞)。在特定實施例中，在患者為人類之情況下，T細胞亦為人類。在一些實施例中，在向患者投與之前，雙特異性結合分子與T細胞結合。

應理解，本發明之雙特異性結合分子可用於如本文所描述之治療方法中，可用於如本文所描述之治療中及/或可用於製造如本文所描述之治療用藥劑。本發明亦提供包含如本文所描述之本發明之雙特異性結合分子的套組及製品。

製品及套組

本發明亦提供製品，例如套組，其包含一或多個含有本發明之雙特異性結合分子之醫藥組合物、視情況存在之其他生物活性分子(例如另一治療劑)及使用說明書的容器(例如一次性或多次使用容器)。雙特異性結合分子及視情況存在之其他生物活性分子可單獨地封裝於適合之包裝，諸如由非反應性玻璃或塑膠製得之小瓶或安瓿中。在某些實施例中，小瓶或安瓿容納包含雙特異性結合分子及/或其他生物活性分子的凍乾粉末。在某些實施例中，小瓶或安瓿容納雙特異性結合分子或生物活性分子之濃縮原料(例如2倍、5倍、10倍或更多倍)。在某些實施例中，製品(諸如套組)包括用於投與雙特異性結合分子及/或生物活性分子(例如注射器及針頭)之醫療裝置；及/或適當稀釋劑(例如無菌水及標準生理鹽水)。本發明亦包括用於製造該等製品之方法。

除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語將具有一般技術者通常理解的含義。儘管可使用類似於或等效於本文中所描述之彼等的方法及材料來實踐或測試本發明，但下文描述例示性方法及材料。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。

一般而言，與本文所描述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、分析化學、合成有機化學、醫學及醫藥化學以及蛋白質及核酸化學及雜交結合使用的命名法及其技術為此項技術中眾所周知的且常用的命名法及技術。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書如此項技術中通常所實現或如本文所描述來進行。

此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本說明書及實施例通篇中，詞語「具有(have)」及「包含(comprise)」或諸如「具有(has/having)」、「包含(comprises/comprising)」之變化形式應理解為暗示包括陳述的整數或整數群，但不排除任何其他整數或整數群。

本文中提及的所有公開案及其他文獻均以全文引用之方式併入本文中。儘管本文中引用多個文件，但此引用不構成此等文件中之任一者形成此項技術中公共常識之部分的許可。

為了能更好地理解本發明，闡述以下實例。此等實例僅用於說明之目的且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。

實例

以下實例說明本發明之代表性實施例且不意圖以任何方式限制。

實例1：抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子之設計及表現

多個變量影響雙特異性結合分子之活體內效能，包括PK、抗原決定基、結合組分之相對親和力，及互補位之價數及空間組態。目前，不存在用於先驗設計優化所有此等參數之單分子的可靠方法。因此，設計、製備及測試多個抗ROR1/抗CD3雙特異性構築體以系統地評估許多此等參數之影響。

為鑑別提供最佳組態之結構，特定言之，ROR1及CD3結合組分之活性最強相對空間置放，如圖1中概述設計多種構築體。儘管已描述多種雙特異性型式(參見例如Brinkmann及Kontermann,MABS 9：182-212(2017))，但本發明成果集中於含有抗體Fc組分之型式以便實現有利的PK及使用公認基於蛋白A之抗體純化方法。

已證明雙特異性結合分子中所使用之ROR1結合組分對人類ROR1具有高度選擇性，且已證明其在人類臨床試驗中安全(參見例如Choi等人，Cell Stem Cell 22：951-959(2018))。此外，使用基於SP34及OKT3抗體之抗CD3 scFv序列，用對兩種不同CD3抗原決定基具有特異性之CD3結合組分測試雙特異性結合分子。CD3抗體已基於其抗原決定基之獨特特徵進行分類(Tunnacliffe等人，International Immunology 1：546-550(1989))。使用此系統，將SP34分類為第I組，而將OKT3分類為第II組。

對於某些構築體，使用野生型抗體Fc序列能夠評估對於ROR1及CD3兩者均為二價之雙特異性構築體(圖1，A、B及E)。對於其他構築體，Fc區中使用節-臼突變使得能夠實現具有不同價數之雙特異性結合分子對ROR1及CD3之表現。舉例而言，一個構築體對ROR1為二價且對CD3為單價(圖1，D)，而另一構築體對於ROR1及CD3兩者均為單價的(圖1，C)。

最後，與不同CD3互補位組合測試親和力及價數改變之ROR1互補位，以評估具有不同相對親和力/親合力之CD3與ROR1互補位之作用。

基於此等設計參數，表現、純化及表徵多個雙特異性構築體。

材料及方法

將編碼具有SEQ ID NO：110之前導序列之雙特異性構築體之密碼子優化DNA選殖至pcDNA3.4載體中，隨後藉由短暫轉染引入Expi293細胞中。使細胞在含有Expi293F表現培養基(賽默飛世爾目錄號A1435103)之40mL培養物中生長。隨後，在單一步驟中使用HiTrap MabSelect SuRe(GE Healthcare目錄號11-0034-93)自培養上清液純化抗體。將純化抗體儲存於PBS(pH 7.2)中，且藉由SDS-PAGE表徵純度。藉由SEC使用TSKgel G3000SWxl 7.8mm×380mm管柱進一步表徵由三個不同多肽鏈組成之構築體的純度。移動相為0.1M磷酸鹽緩衝液，0.1M Na₂SO₄，pH 6.7，且管柱以0.7mL/min之流動速率運作。

結果

抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子之序列概述於表1(蛋白質)及表2(DNA)中。

如藉由SDS-PAGE所測定，大部分構築體很好地表現(17/20表現>1mg；14/20表示>2mg)且在大多數情況下，在單個步驟中使用蛋白質A層析基本上純化(表3)。

在蛋白質A層析之後，不含有經二硫鍵穩定之抗CD3 scFv之構築體一般具有較高純度(>90%)(表3，比較構築體2及5)。

對由三個不同多肽鏈組成之構築體進行SEC分析。一般而言，在單一蛋白質A純化步驟之後，獲得之由兩個不同鏈組成之構築體(野生型Fc)的純度高於由三個不同鏈組成之構築體(雜聚Fc)的純度(表3，比較樣品1-3及7-9與樣品13-17之純度)。

總體而言，此等資料證實大部分構築體表現良好且在單一蛋白質A純化步驟之後純度>90%。

實例2：抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子與ROR1之結合

評價與人類ROR1結合之具有不同組態、ROR1親和力及ROR1價數的雙特異性結合分子，以確定此等參數對細胞毒性之影響。使用經ROR1轉染之MEC細胞、JeKo-1細胞及重組ROR1細胞外域(ECD)表徵雙特異性構築體1-20與人類ROR1之結合。

材料及方法 使用細胞及流式細胞測量術之ROR1結合分析

使用經ROR1轉染之MEC細胞及JeKo-1細胞兩者定量ROR1結合。對於各條件，使用2.5E5個細胞。將細胞置放於具有2% FBS之50μL PBS中。隨後，用相等體積之測試雙特異性結合分子之2倍儲備液稀釋細胞。將細胞及抗體在冰上共培育20分鐘。隨後用300μL FACS緩衝液洗滌細胞3次，且將其再懸浮於100μL抗人類Fc-PE結合抗體(Invitrogen目錄號12499882)中，且在弱光下在冰上培育20分鐘。隨後，用300μL FACS緩衝液洗滌細胞3次且在25℃下用2%多聚甲醛固定10分鐘。隨後用300μL FACS緩衝液洗滌細胞2次且在Miltenyi MACSQuant分析儀上分析。

使用重組型ROR1-ECD及ELISA之ROR1結合分析

雙特異性結合分子與重組ROR1之結合藉由ELISA使用兩種不同組態評估。在第一組態中，將ROR1蛋白質固定在96孔盤上且滴定雙特異性構築體(細節如下)。雙特異性結合分子之特徵亦在於使用第二組態之ROR1結合，其中雙特異性結合分子固定於96孔盤上且滴定可溶性生物素化ROR1(b-ROR1)(細節如下)。

固定ROR1 ELISA

在4℃下在PBS中用50μL/孔之2μg/mL人類TL1A(Acro Biosystems目錄號R01-H522Y)塗覆96孔Costar-3366盤隔夜。盤用含有0.05% Tween 20之PBS(PBS-T)沖洗一次且在25℃下用100μL/孔含5%脫脂乳之PBS(5% M-P)阻斷1小時。使用5% M-P連續稀釋抗體樣品2倍，且在25℃(50μL/孔)下培育1小時。將盤用PBS-T洗滌三次並在25℃下以50μL/孔添加含10,000倍稀釋之抗人類κ,HRP結合物(Southern Biotech目錄號2060-05)之5% M-P持續1小時。將盤用PBS-T洗滌三次，用50μL/孔1-Step Ultra TMB-ELISA(Thermo Scientific目錄號34028)顯影。藉由添加2N H₂SO₄終止反應且使用Spectramax盤讀取器測定A450。

可溶性ROR1 ELISA

為生物素化ROR1，將200μg人類ROR1(Acro Biosystems目錄號R01-H522Y)再懸浮於2mL水中至100μg/mL，且隨後以1：5莫耳比將其與EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Scientific目錄號21327)組合，且在25℃下培育2小時。藉由添加31μL之750mM精胺酸鹽酸鹽終止反應且將其儲存在4℃下。

為量測雙特異性構築體與可溶性ROR1之結合，在4℃下用50μL/孔之2μg/mL山羊抗人類κ(Southern Biotech目錄號2060-01)塗覆96孔Costar-3366盤。將盤用PBS-T沖洗一次，在25℃下用100μL/孔之5% M-P阻斷1小時，用PBS-T沖洗一次，且添加2μg/mL雙特異性結合分子且在25℃下培育1小時。用PBS-T洗滌培養盤三次。經生物素標記之ROR1在5% M-P中以3倍連續稀釋，且在25℃下培育1小時(50μL/孔)。用PBS-T洗滌培養盤三次。為偵測b-ROR1之結合，在25℃下添加含1：5000稀釋之50μL/孔中性鏈親和素-HRP(Pierce目錄號31030)的1% BSA-PBS 1小時。將盤用PBS-T洗滌三次，隨後用50μL/孔1-Step Ultra TMB-ELISA (Thermo Scientific目錄號34028)顯影。藉由添加2N H₂SO₄終止反應且使用Spectramax盤讀取器測定A450。

結果

使用基於ELISA之篩選及活細胞結合，藉由H-CDR2中之單獨胺基酸各自與親本抗體不同的三種抗ROR1 Fab變異體表徵為與人類ROR1結合。兩種變異體T32A及T32E顯示比親本Fab高的親和力(圖2，A圖，空心圓及正方形相對於實心圓)，而其他變異體W110Y顯示較低親和力(圖2，A圖，三角形)。使用活的經ROR1轉染之MEC細胞，此等變異體之相對親和力進一步表徵。與基於ELISA之篩選類似，變異體T32A及T32E顯示較高親和力(圖2，B圖，空心圓及正方形相對於實心圓)，而W110Y具有降低之結合(圖2，B圖，三角形)。當使用經對照空載體轉染之MEC細胞(未展示)時，未偵測到任何變異體之結合，表明變異體對ROR1之特異性。不論分析型式如何，變異體之相對結合強度非常類似。舉例而言，T32A變異體比親本抗體之親和力高4倍至4.7倍，而W110Y變異體的親和力比親本抗體低5.9倍至6.8倍。此等極密切相關之變異體彼此相差一至兩個胺基酸，顯示與ROR1之結合活性的27倍範圍，且能夠設計出具有對ROR1以及CD3之親和力範圍的抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子。

隨後，使用先前描述基於ELISA之篩選的經修改版本，各自含有與重鏈T32A突變組合之不同輕鏈CDR突變的兩個額外抗ROR1 Fab變異體表徵為結合於人類ROR1。特定言之，Fab結合於固定ROR1之後的第一洗滌步驟藉由將盤放入較大體積之PBS-T中持續延長的一小時解離步驟來改變。此使得具有緩慢解離速率之變異體能夠彼此區分。與T32A相比，使用經修飾之ELISA，兩種變異體，T32A(HC)+A25P(LC)及T32A(HC)+T69R(LC)顯示更強的結合(圖3)。如先前所描述，T32A變異體顯示相對於親本(WT)之結合的>5倍改良，而T32A(HC)+A25P(LC)及T32A(HC)+T69R(LC)顯示相對於親本Fab之結合的進一步改良(分別為>8倍及>13倍)。此等極密切相關之變異體彼此相差1-3個胺基酸，顯示與ROR1之結合活性的80倍至90倍範圍，且能夠設計出具有對ROR1以及CD3之親和力範圍的抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子。

使用以下三個分析測試雙特異性結合分子之ROR1結合：(1)結合於活細胞且藉由流式細胞測量術偵測，(2)如藉由ELISA所測定結合於固定ROR1上，及(3)如藉由ELISA所測定結合於可溶性經生物素標記之ROR1上。不管所採用之篩選格式如何，所有構築體均選擇性地結合ROR1(圖4-7)。

藉由量測與經ROR1轉染之MEC細胞及對照MEC細胞之結合來證明ROR1之選擇性。雙特異性結合分子與經ROR1轉染之細胞的結合具有濃度依賴性(圖4，A圖)，且在任何濃度下未觀測到與對照細胞之結合(圖4，B圖)。對於兩個細胞株，包括非特異性人類IgG作為對照(「對照」)。

觀測雙特異性構築體對經ROR1轉染之MEC細胞之結合強度的變化(圖4，A圖)。舉例而言，ROR1二價構築體比ROR1單價構築體結合得更緊密(圖4，A圖，比較構築體1-3及7-9與13-15)。此結合強度差異在較低濃度(<100ng/mL)下最明顯。

藉由流式細胞測量術使用JeKo-1細胞評估ROR1表現量對雙特異性構築體之結合的影響。Jeko-1細胞表現低於經ROR1-轉染之 MEC細胞(約56,000個複本/細胞)之ROR1含量(約13,000個複本/細胞)。所有構築體均結合JeKo-1細胞(圖5)。用JeKo-1細胞觀測使用經ROR1轉染之MEC細胞所觀測到之相對結合傾向。特定言之，單價ROR1構築體與二價構築體相比通常結合更弱(圖5，A圖，比較構築體14及15與其他構築體；圖5，C圖，比較構築體15-17與其他構築體)。

隨後，雙特異性結合分子與ROR1之結合藉由ELISA使用ROR1之重組表現胞外域表徵。將ROR1固定於微量滴定盤上，滴定雙特異性結合分子，且用抗人類κ-HRP試劑定量結合。與細胞結合資料一致，所有構築體以濃度依賴性方式結合ROR1(圖6)。此外，單價ROR1構築體13-15的結合不如除兩個二價構築體之外之全部緊密。二價雙特異性結合分子之結合活性類似於親本抗ROR1 IgG(對照物)，證實將scFv域附加至Ig分子不抑制ROR1結合。在此格式中測試之雙特異性構築體之相對親和力概述於表4中。

在細胞分析及ELISA中，用二價構築體相對於單價構築體觀測到的較強結合(其中抗原固定)與親合力效應一致。為了測定是否為此情況，藉由將雙特異性結合分子固定於塗覆有山羊抗人類κ抗體之微量滴定盤上且滴定生物素化ROR1來評估結合於可溶性單體ROR1。所有雙特異性結合分子在此格式中為活性的(圖7)，且在大多數情況下，單價與二價構築體之間不存在顯著差異。視所用分析格式而定，此等結果與親合力效應一致。觀測到具有兩種變異體的較弱結合，其中抗CD3 scFv相對於重鏈或輕鏈之胺基端(分別為構築體19及20)得以改善，表明CD3互補位之置放非常接近於ROR1互補位可在一定程度上抑制ROR1結合。

含有更高親和力ROR1結合域之雙特異性結合分子構築體 (構築體16-18)結合具有比利用野生型(更低親和力)ROR1結合域的相應構築體(構築體9、19、20)更高親和力的經生物素標記之ROR1。雙特異性構築體18(二價，更高親和力ROR1)比相應構築體9(二價，更低親和力ROR1)更緊密地結合。同樣，雙特異性構築體16及17(單價，更高親和力ROR1)比構築體15(單價，更低親和力ROR1)更緊密地結合。此等資料概述於表4中。另外，具有更高親和力ROR1結合域之雙特異性結合分子結合具有比親本IgG(對照)更高親和力的可溶性ROR1。

實例3：藉由抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子之ROR1內化

ROR1及識別ROR1之雙特異性結合分子之內化及回收可能影響活體內治療功效。舉例而言，預期ROR1在接合T細胞之前的結合、內化及降解可能削弱細胞毒性。針對結合及內化表徵具有五個不同組態之抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子。

各種雙特異性構築體進行表徵內化的同時，使用兩個不同ROR1抗體檢查ROR1之細胞表面表現。一種抗體(UC961)識別與雙特異性結合分子相同之ROR1抗原決定基，而另一種(4A5)識別非重疊ROR1抗原決定基。

另外，在37℃下培育24小時之後，評估雙特異性結合分子之細胞表面結合以確定延長之暴露是否影響各種結合分子之細胞表面含量。

ROR1雙特異性結合分子之內化及ROR1之再循環/再表現使用經ROR1-轉染之MEC細胞及流式細胞測量術表徵。

材料及方法 雙特異性結合分子之內化的量測

在0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘、180分鐘及240分鐘使用流式細胞測量術，使用定量非內化之細胞表面抗體的脈衝追蹤方法來量測雙特異性結合分子之內化。經ROR1轉染之MEC細胞用冷PBS洗滌且以1×10⁷個/毫升再懸浮於冷培育緩衝液(具有2% FBS-Fisher之RPMI/Gibco目錄號16140071)中。隨後，將3.5×10⁶個細胞等分至微量離心機試管中用於所測試之各雙特異性構築體。將相等體積(350μL)之雙特異性結合分子與細胞組合以使得最終濃度為30μg/mL。基於先前結合研究，預期30μg/mL將飽和以獲得二價ROR1構築體(構築體1-12)之更高親和力/親合力。將細胞及抗體在冰上培育20分鐘，用1mL冷FACS緩衝液(具有2% FBS之PBS)洗滌五次，且再懸浮於1.4mL培育緩衝液中。隨後，在37℃下培育樣品0、30、60、120、180及240分鐘，之後將200μL 各樣品轉移至冰中以停止內化。

將各構築體及時間點之樣品分成一半(各100μL)且短暫離心。將一半樣品再懸浮於100μL二級抗體(山羊抗人類IgGa-PE、Fc-γ特異性-eBiosciences目錄號12-4998)中，以檢測結合雙特異性構築體。另一半用100μL UC961-PE及4A5-AlexaFluor647之混合物染色。UC961結合與雙特異性構築體相同之抗原決定基，因此偵測不結合於雙特異性結合分子之游離ROR1。4A5結合不同抗原決定基上之ROR1，且因此不與雙特異性結合分子競爭結合。因此，4A5偵測總細胞表面ROR1(結合及游離)。在暗處在冰上兩個染色組保持在培育緩衝液中20分鐘。細胞用FACS緩衝液洗滌三次且在25℃下再懸浮於100μL固定緩衝液(含2%多聚甲醛之PBS)中10分鐘。隨後，用FACS緩衝液洗滌固定細胞一次且分析。

對於各染色劑，定量中值螢光強度(MFI)。使用若干對照條件。量測PE及A1647 MFI用於未染色對照細胞以用於背景螢光減除。不暴露於雙特異性構築體之細胞用二級抗體PE染色，說明二級抗體之非特異性染色(二級陰性對照)，且用UC961-PE染色以獲得最大UC961結合對照。如下進行表面雙特異性結合分子、未佔用細胞表面ROR1抗原決定基及總ROR1之定量：

結果

先前使用用於構築本文中所描述之雙特異性結合分子的抗 ROR1抗體的實驗展現：(1)抗體快速內化，及(2)ROR1在細胞表面上再出現而無結合抗體。此細胞表面表現為ROR1自內體隔室再循環之結果，或經由從頭合成或胞內儲存之遷移反映ROR1之快速上調(參見例如，美國專利公開案2018/0369406)。不同雙特異性構築體顯示可變內化及ROR1再循環/再表現模式(圖8及圖9)。

將抗CD3 scFv置放在重鏈之羧基端(組態A，構築體1)處引起快速內化(圖8，A圖，圓形)。在時間零時，可用的ROR1雙特異性抗原決定基飽和，因為未偵測到游離抗原決定基。在實驗時程期間，ROR1不再循環至細胞表面或以顯著含量再表現，因為總ROR1表面含量降低(圖8，A圖，正方形)，且未偵測到雙特異性結合分子所識別之游離ROR1抗原決定基(圖8，A圖，三角形)。此等資料與雙特異性結合分子-ROR1複合物之內化及遷移至溶酶體中一致。在雙特異性結合分子構築體2及3下觀測到極類似之內化及遷移(未圖示)。

在輕鏈之羧基端安置抗CD3 scFv(組態B，構築體7)顯著地抑制內化(圖8，B圖，比較相對於圖8，A圖中構築體3之內化程度)。在時間0時，構築體完全飽和其抗原決定基。總細胞表面ROR1含量呈現相對恆定(圖8，B圖，正方形)。另外，藉由雙特異性識別之游離ROR1抗原決定基以時間依賴性方式增加(圖8，B圖，三角形)，與雙特異性結合分子自細胞表面解離或ROR1之再循環/再表現一致。在雙特異性結合分子構築體8及9下觀測到極類似之內化及遷移(未圖示)。

單價抗ROR1(組態C，構築體13)亦不有效內化(圖8，C圖)。先前研究證明二價構築體之結合在30μg/mL下飽和(圖4，A圖及圖5)。然而，在此實驗中，單價抗ROR1雙特異性結合分子在30μg/mL下之結合似乎並未使細胞表面ROR1飽和。在時間0時，構築體13之結合程度在時間0時僅為構築體1及7之相應飽和MFI的約80%(圖8，C圖，在時間0處比較圓形與方形)。另外，在時間0時亦偵測到構築體13所識別之游離ROR1抗原決定基(圖8，C圖，三角形)。總而言之，單價雙特異性結合分子構築體13、總細胞表面ROR1及未佔用雙特異性抗原決定基之含量在實驗時間內皆保持相對恆定。總體而言，此等資料與雙特異性結合分子13之極小內化一致。用構築體15觀察到極類似之內化及遷移(未圖示)。

在一條重鏈之胺基端安置抗CD3 scFv(組態D，構築體19)引起部分內化(圖9，A圖，圓形)。在實驗時程期間將ROR1再循環至細胞表面或以顯著含量再表現，因為總ROR1表面含量提高(圖9，A圖，正方形)，且存在藉由雙特異性結合分子識別之ROR1抗原決定基之增加的時間依賴性偵測(圖9，A圖，三角形)。在一條重鏈之胺基端安置抗CD3 scFv部分引起內化及遷移，其非常類似於具有組態B之雙特異性結合分子(與輕鏈之羧基端融合的抗CD3 scFv)。

在輕鏈之胺基端安置抗CD3 scFv(組態E，構築體20)引起部分內化(圖9，B圖，圓形)。在實驗時程期間將ROR1再循環至細胞表面或以顯著含量再表現，因為總ROR1表面含量提高(圖9，B圖，正方形)，且存在藉由雙特異性結合分子識別之ROR1抗原決定基之增加的時間依賴性偵測(圖9，B圖，三角形)。在輕鏈之胺基端安置抗CD3 scFv部分引起內化及遷移，其非常類似於具有組態B之雙特異性結合分子(與輕鏈之羧基端融合的抗CD3 scFv)。

為測定ROR1遷移及表現對結合於細胞表面之雙特異性結合分子之含量的長期影響，將細胞與雙特異性結合分子一起培育24小時，洗滌，且量測細胞表面雙特異性結合分子。在24小時培育之後表面雙特異性結合分子之定量顯示，具有融合至重鏈之羧基端之抗CD3 scFv的雙特異性結合分子(圖10，構築體1，圓形)以低於具有融合至輕鏈之羧基端之抗CD3 scFv之雙特異性結合分子(圖10，構築體7，正方形)或具有融合至Fc之胺基端之抗CD3 scFv之雙特異性結合分子(圖10，構築體13，三角形)的含量存在。抗CD3 scFv與重鏈之羧基端融合，但不與其他雙特異性組態融合之構築體之減弱細胞表面含量表明表面ROR1之下調且與內化實驗中進行之觀測相符(圖8)。

實例4：抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子之CD3結合及內化

T細胞表面上之TCR-CD3複合物之數目反映新蛋白質之合成及分泌、內化、再循環及降解之組合。已展示用抗CD3抗體OKT3處理以藉由內化自表面選擇性移除CD3。

在抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子中使用三個抗CD3序列作為scFv構築體。序列中之兩者為OKT3之不同人類化版本(Ab8及Ab9)，而第三序列為不同抗CD3抗體，SP34之第三方人類化版本(Ab10)。如上文所指出，OKT3及SP34結合不同抗原決定基，且已基於其抗原決定基之不同特徵對抗CD3抗體進行分類(Tunnacliffe等人，International Immunology 1：546-550(1989))。使用此系統，將SP34分類為第I組，而將OKT3分類為第II組。預期基於SP34之序列而非基於OKT3之序列可與食蟹獼猴CD3交叉反應。

在五個不同組態中評估各種CD3互補位(圖1，A-E)且將單價抗CD3雙特異性構築體之結合(圖1，C及D)與某些二價抗CD3構築體進行比較(圖1，A、B及E)。亦在各種雙特異性組態中評估經二硫鍵穩定版本之所有三個scFv序列。

評估各種雙特異性構築體在不存在ROR1接合的情況下之內化。雙特異性結合分子之結合及內化使用Jurkat細胞及流式細胞測量術表徵。

材料及方法 CD3結合分析

為了定量CD3結合，針對各條件使用2.5E5 Jurkat細胞。藉由將細胞再懸浮至5E6/mL，藉由置放於具有2% FBS之50μL PBS中來製備2倍細胞儲備液。隨後，用相等體積之測試雙特異性結合分子之2倍儲備液稀釋細胞。將細胞及抗體在冰上共培育20分鐘。隨後用300μL FACS緩衝液洗滌細胞3次且以1：500稀釋度將其再懸浮於100μL山羊抗人類Fc-PE結合物抗體(Invitrogen目錄號12499882)中，且在弱光下在冰上培育20分鐘。隨後用300μL FACS緩衝液洗滌細胞3次且在25℃用2%多聚甲醛固定10分鐘。細胞用300μL FACS緩衝液洗滌2次且在Miltenyi MACSQuant分析儀上分析。

CD3內化分析

為了定量雙特異性結合分子之內化，將2.5E5 Jurkat細胞與1μg/mL雙特異性結合分子一起在冰上共培育20分鐘。細胞隨後用300μL冰冷FACS緩衝液洗滌3次且再懸浮於培養基中且在37℃下培育。在各種時間，移除細胞，用300μL冰冷FACS緩衝液洗滌且如上文所描述處理。

結果

評價五個不同雙特異性組態(圖1)。如藉由結合於Jurkat細胞所表明，在所測試之所有雙特異性組態中，保留與基於OKT3及SP34之序列兩者的CD3結合。構築體以不同程度結合(圖11及圖12)。

對於用OKT3及SP34序列(構築體1-15)測試之所有雙特異性組態，基於OKT3之序列以高於基於SP34之序列的親和力結合。舉例而言，構築體1及2比3更緊密地結合(圖11，A圖)，構築體7及8比9更緊密地結合(圖11，B圖)，且構築體13及14比15更緊密地結合(圖11，C圖)。非特異性人類IgG作為對照包括在內(「對照」)。

引入半胱胺酸殘基以產生抗CD3 scFv之經二硫鍵穩定之變異體不會不利地影響結合。經二硫鍵穩定之變異體之結合與相應的未經二硫鍵穩定之序列不可區分(圖11，A圖，分別比較構築體1-3與4-6；及圖11，B圖，分別比較構築體7-9與10-12)。

雙特異性結合分子之組態對抗CD3 scFv之結合具有深遠作用(圖12)。當將抗CD3 scFv部分置放在輕鏈(圖12，B圖，構築體20)或重鏈(圖12，B圖，構築體19)之胺基端上時，觀測到與Jurkat細胞之最強結合。反之，當將抗CD3 scFv置放於輕鏈(圖12，B圖，構築體9及18)之羧基端時，觀察到較弱結合。置放於一條重鏈之胺基端的單個抗CD3 scFv部分(單價CD3結合；圖12，B圖，構築體19)同樣結合或比在重鏈(二價CD3結合；圖12，B圖，構築體3)或輕鏈(二價CD3結合；圖12，B圖，構築體9及18)之羧基端置放兩個抗CD3 scFv部分更好地結合。在一個實驗中包括非特異性人類IgG作為對照(圖12，A圖，「對照」)，而在第二實驗中包括不相關ROR1×CD3雙特異性構築體(美國專利公開案2017/0233472；SEQ ID NO：111-113)作為對照(圖12，B圖，「對照1」)。

使用OKT3序列，在此等雙特異性組態之子集下觀測到類似趨勢。特定言之，單價抗CD3 scFv與Fc之胺基端的融合最強(圖12，A圖，構築體13)，隨後為其中scFv與重鏈之羧基端融合之構築體(圖12，A圖，構築體1)，隨後為其中scFv與輕鏈之羧基端融合之構築體(圖12，A圖，構築體7)。

值得注意的是，相較於CD3互補位價數，雙特異性結合分子之組態似乎為CD3結合強度之更重要決定因素。此出人意料之效果藉由以下觀測突出顯示：與重鏈(圖12，B圖，構築體19)或Fc(圖12，A圖，構築體13；及圖12，B圖，構築體15及16)之胺基端融合之單價抗CD3構築體同樣結合或比與重鏈及輕鏈(圖12，B圖，構築體3、9及18)之羧基端融合之二價抗CD3構築體更好地結合。

總體而言，此等資料證明存在調節CD3結合強度之三種不同方法。第一，當與在相同雙特異性型式中之彼此相比時，基於SP34及OKT3之序列顯示不同的結合強度。其次，基於SP34及OKT3之序列的結合強度受雙特異性結合分子之組態影響。最後，使用雜聚Fc構築體能夠實現單價或二價抗CD3雙特異性結合分子。

藉由抗CD3抗體之T細胞活化可引起CD3之增加之內化。一旦內化，CD3可進入再循環路徑且在細胞表面再表現或可分選至溶酶體且降解。在無腫瘤抗原(ROR1)接合存在下雙特異性結合分子誘導之CD3之內化及降解可抑制雙特異性結合分子之活體內細胞毒活性。因此，表徵雙特異性結合分子在ROR1不存在下結合於CD3之後內化(圖13)。

在雙特異性結合分子結合且在4℃下洗滌之後，在37℃下培育Jurkat細胞。隨後，在不同時間點定量細胞表面上雙特異性結合分子之量。因為雙特異性結合分子最初以不同強度結合(圖11及圖12)，內化報導為在時間0時觀測到之結合百分比。以此方式定量之表面雙特異性結合分子之含量反映內化與解離之組合。儘管如此，出於下文概述之原因，似乎影響表面含量之主要因素為雙特異性結合分子之內化而不為解離。

雖然損失程度改變，但所有所測試之雙特異性構築體的表面雙特異性結合分子之含量以時間依賴性方式降低。在前30分鐘內觀測到九個所測試構築體中之八個的快速內化(>50%)，隨後為在下一個3.5小時內之更慢但連續的內化。由與輕鏈之羧基端融合之基於SP34之序列組成的構築體9至少在實驗期間內內化，在4小時之後，在細胞表面上仍可偵測到約50%之雙特異性結合分子。另外，由與重鏈之羧基端融合之抗CD3 scFv部分組成之構築體1及3呈現中間內化，其中在4小時培育之後，約20%在細胞表面上仍可偵測。

如先前所論述，隨時間推移所觀測到的細胞表面雙特異性結合分子之降低的染色有可能反映了雙特異性結合分子與內化相對的表面解離。然而，展示信號隨時間之最小損失的雙特異性構築體中之兩者，構築體3及9在表徵之最弱結合構築體中(圖11，分別為A圖及B圖)，而構築體13之結合在時間0時顯示極強結合(圖11，C圖)，在4小時時染色減弱(8%初始信號)。總體而言，此等資料表明由基於SP34之抗CD3 scFv部分組成的某些組態可在比由基於OKT3之scFv部分組成的組態更小的程度上內化。

實例5：活體外抗原ROR1/抗CD3雙特異性結合分子之重新定向T細胞毒性

測試二十種抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子以評估多個參數對T細胞介導之細胞毒性分析中之抗體效能的影響。所檢驗之變量包括抗CD3抗原決定基及價數、抗ROR1親和力及價數，以及CD3及ROR1結合組分之各種組態。

針對具有不同ROR1表現量之一組血液及實體腫瘤癌細胞測試構築體之殺滅活性。除了表徵雙特異性結合分子之殺滅活性之外，使用CD69作為標記物評估T細胞之活化。亦表徵藉由活化T細胞之細胞介素釋放。

材料及方法 具有人類PBMC之細胞毒性分析

對於細胞毒性分析，在RPMI(無酚紅)，含有青黴素-鏈黴素之10% FBS中，使目標細胞再懸浮至4E5個細胞/毫升。隨後，將2E4個細胞/孔(50微升/孔)轉移至96孔盤中且在培育箱中在37℃下置放1小時。將圓底盤用於懸浮液細胞且平底盤用於黏著性細胞株。如下文所描述分離人類PBMC。使PBMC再懸浮至2E6個細胞/毫升，且隨後向含有目標細胞之孔中添加2E5個細胞/孔(100微升/孔)。除非另外指明，否則所用PBMC(效應細胞)與腫瘤細胞(目標)之比率為10：1(E：T比率)。混合目標細胞及PBMC且在培育箱中在37℃下置放1小時。將雙特異性結合分子在培養基中稀釋至適當濃度，且將50μL添加至目標細胞與PBMC之混合物中，且隨後在37℃下置放於培育箱中24小時。對於各實驗包括以下對照物：(1)僅培養基(培養基)，(2)對於溶解緩衝液調節之培養基(Adj)，(3)僅PBMC(PBMC)，(4)僅對於LDH之自發釋放為目標細胞(SR)，(5)僅用於最大釋放LDH之目標細胞(MR)，及(6)無雙特異性結合分子之目標細胞及PBMC(AICC)。

分離PBMC

用15mL Ficoll填充SepMate-50(StemCell Technologies)錐形管之下部腔室。在肝素血液收集管中自未鑑別之正常供體獲得血液，且在25℃下以1：1比率與無菌PBS混合。在SepMate-50管之頂部腔室上分層經稀釋之血液，且在25℃下用制動器以1200×g離心15分鐘。為獲得PBMC(頂部腔室內容物)，將SepMate-50管快速倒置至新鮮的50mL錐形管中。隨後用冷的含5% FBS之PBS藉由在500×g下離心3分鐘洗滌細胞三次。最後，將細胞再懸浮於10mL培養基(無酚紅之RPMI，含有青黴素-鏈黴素之10% FBS)中且移除等分試樣以用於細胞計數。細胞隨後用於進行細胞毒性分析。

LDH釋放之定量

在培育24小時之後，為了定量LDH釋放，將20μL之10倍裂解緩衝液添加至Adj及MR孔，且將各孔之內含物轉移至V型底96孔盤且在500×g下短暫離心5分鐘。隨後，將170μL上清液轉移至另一96孔盤以用於後續分析。在新鮮透明底部96孔盤中，將50μL上清液與50μL CytoTox 96非放射性細胞毒性分析(Promega目錄號G1780)組合，且在25℃下在暗處培育30分鐘。最後，添加50μL停止溶液，隨後在490nm下讀取吸光度。根據製造商說明書計算LDH釋放%。

T細胞活化之評估

使用CD69之上調來表徵T細胞之早期活化。使用流式細胞測量術進行CD69之定量。簡言之，粒化細胞藉由再懸浮於100μL 2% PFA/PBS中且在25℃下培育10分鐘來固定。細胞用300μL PBS洗滌兩次，再懸浮於150μL PBS中且在4℃下在暗處儲存直至使用。隨後，藉由離心收集細胞且再懸浮於100μL染色混合物中且在4℃下在暗處培育20分鐘。染色混合物由以下組成：以1：75稀釋之Pacific Blue抗人類CD8純系SK1(BioLegend目錄號344717)；以1：500稀釋之PE/Cy7抗人類CD69純系FN50(BioLegend目錄號310911)；及在PBS中以1：500稀釋之AlexaFluor647小鼠抗人類ROR1純系4A5。細胞隨後用300μL冷PBS洗滌三次且再懸浮於150μL含2% FBS之PBS中。在Mitenyi MACSQuant分析儀上分析樣品。

在重新定向T細胞分析中來自PBMC之細胞介素釋放的定量

為量測細胞介素釋放，使用MSD^®V-PLEX細胞介素圖1人類套組同時量測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及TNF-α。根據製造商說明書進行分析。簡言之，將V-叢細胞介素圖1盤用150μL/孔洗滌緩衝液(具有0.05% Tween-20之PBS)洗滌3次。隨後，每孔添加50μL經稀釋之樣品及校準劑。用黏著劑盤密封件密封盤且在震盪器上在4℃下以500rpm培育隔夜。第二天，用150μL/孔洗滌緩衝液洗滌盤3次且在室溫下在震盪器上與25μL偵測抗體溶液一起培育2小時。用洗滌緩衝液再洗滌盤3次。最後，在使用MSD儀器分析之前添加150μL讀取緩衝液T。

結果

儘管相對效能不同，但在大多數所測試之雙特異性構築體情況下觀測到經ROR1轉染之MEC細胞之抗原依賴性殺滅。代表性滴定曲線展示於圖14，A圖(具有組態A、B及C之構築體)及圖15，A圖(具有組態A、B、C、D及E之構築體)中。構築體2、8及14之滴定曲線(未圖示)分別類似於構築體1、7及13之滴定曲線。

如所預期，當使用不同PBMC供體時，雙特異性結合分子之絕對效能在一定程度上變化。儘管如此，不同構築體之相對效能並未顯著波動。舉例而言，雙特異性結合分子構築體9始終為活性最強中之一者，且具有顯示一個供體之EC₅₀為<0.1ng/mL(圖14，A圖)及第二供體為1.1ng/mL(圖15，A圖)的經ROR1轉染之MEC目標細胞。

構築體1-3、7-9及13-15皆展示在1μg/mL下之選擇性殺滅(對於構築體1-3及7-9為5nM，對於構築體13-15為8nM)(圖16，黑色條)。藉由在不含有目標細胞(圖16，「PBMC」)或抗體(圖16，「無biAb」)或當未經轉染之MEC細胞用作目標細胞時(圖16，灰色條)之樣品中缺乏LDH釋放來證明殺滅之抗原依賴性。相比之下，對照抗CD19/抗CD3雙特異性結合分子(Creative Biolabs目錄號BSAB-L002)誘導經ROR1轉染及未經轉染之MEC細胞兩者之細胞毒性(圖16，「CD19×CD3」)。在此實驗中未測試雙特異性構築體16-20。

藉由檢查CD69(T細胞活化之早期標記物)之上調來評估培養物中之T細胞之活化。與細胞毒性資料一致，在1μg/mL下觀測到所有構築體之活化，除了#17及#19(圖14，B圖；圖15，B圖)。對於更強效雙特異性結合分子而言，在更低濃度下觀測到活化(圖14，B圖，比較7與3；圖15，B圖，比較18與3)。

T細胞活化，如藉由CD69表現增加所評估，通常反映雙特異性結合分子之細胞毒活性。然而，存在CD69活化不與細胞毒性直接相關之實例(圖19，比較7與9；圖20，比較7與8及9)。

T細胞之活化為抗原依賴性的(圖17)。在對照CD19×CD3雙特異性結合分子存在下(圖17，A圖，左側)，但不在ROR1雙特異性結合分子存在下(圖17，A圖，右側)，與ROR1^-/CD19⁺ MEC細胞共培養之T細胞活化。然而，當T細胞與經ROR1轉染之MEC細胞(ROR1⁺/CD19⁺)一起共培養時，T細胞在ROR1雙特異性結合分子存在下活化(圖17，B圖，右側)。此等資料表明，在此研究中表徵之雙特異性構築體活化T細胞需要ROR1。

隨後，檢查藉由雙特異性結合分子對不同人類目標細胞之ROR1依賴性殺滅。儘管具有不同效力，但在組態A、B、C及E之所有雙特異性結合分子下觀察到JeKo-1細胞(套細胞淋巴瘤細胞株)之ROR1依賴性殺滅。代表性滴定曲線展示於圖18，A圖(構築體1-15)及圖19，A圖(構築體16-20)中。與經ROR1轉染之MEC細胞製備的觀測結果一致，T細胞之活化一般反映雙特異性結合分子之相對細胞毒性(圖18，B圖；圖19，B圖)。

亦測試第二套細胞淋巴瘤細胞株，Mino細胞作為目標細胞株。具有組態B之所有三個為經二硫鍵穩定之構築體顯示針對Mino細胞之有效活性(圖20，A圖)，其中基於SP34之CD3序列(構築體9)為最有效的。有趣的是，構築體9經活化T細胞(如CD69上調所測定)少於基於OKT3之構築體(圖20，B圖)。

同樣，在雙特異性組態A、B、C及E之不同效能下觀測到乳癌細胞株MDA-MB-468之ROR1依賴性殺滅。代表性滴定曲線展示於圖21，A圖(構築體1-15)及圖22，A圖(構築體16-20)中。與經ROR1轉染之MEC細胞及JeKo-1細胞所製備的觀測結果一致，T細胞之活化一般反映雙特異性結合分子之相對細胞毒性(圖21，B圖；圖22，B圖)。

表徵在T細胞活化之後在重新定向殺滅JeKo-1細胞、經ROR1-轉染之MEC細胞及經假擬轉染(ROR1^-)之MEC細胞中細胞介素釋放之誘導。展示構築體7、9、18、20及對照ROR1×CD3雙特異性結合分子之代表性劑量-反應曲線(美國專利公開案2017/0233472)。(圖23(TNF-α)，圖24(IFN-γ)，圖25(IL-2)，圖26(IL-4)，圖27(IL-6)，圖28(IL-10))。對於所測試之所有構築體，在JeKo-1細胞(A圖)及經ROR1轉染之MEC細胞(B圖)，但不經假擬轉染之(ROR1^-)MEC細胞(C圖)之情況下，觀測到劑量依賴型細胞介素產生(TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10)。與JeKo-1細胞相比，經ROR1轉染之MEC細胞表現更高ROR1含量(表5)，且與JeKo-1細胞相比，對所測試之雙特異性結合分子更敏感，表明目標表現量之重要性。細胞介素之分泌視ROR1之表現而定。用經假擬轉染(ROR1^-)之MEC細胞培育1μg/mL構築體(C圖)不誘導細胞激素中之任一者在顯著高於背景之含量下分泌(無雙特異性抗體對照)。相比之下，ROR1×CD3雙特異性結合分子(「對照1」)與經假擬轉染(ROR1^-)之MEC細胞一起培育引起一些發炎性細胞介素IFN-γ之分泌(圖24，C圖)。除IL-6之外，當使用JeKo-1細胞測試時，對照1誘導更高總含量之細胞介素分泌。相比之下，在用更高之ROR1表現之經轉染MEC細胞測試時，所有構築體(包括對照1)誘導類似含量之細胞介素分泌。

一些雙特異性結合分子相對於各種目標細胞之活性的概述展示於表5中。

總體而言，具有抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子(具有一系列特性及組態)之各種目標細胞株的重新定向之T細胞殺滅鑑別出某些趨勢。

基於使用人類PBMC作為效應細胞及各種目標細胞株之活體外細胞毒性分析，組態B、E及C傾向於比組態A及D更有效。基於組態之相對效能可反映CD3與ROR1結合組之相對空間定位。效能亦可反映各種組態對雙特異性結合分子之遷移所具有的影響。舉例而言，組態B及C之雙特異性結合分子不如組態A之雙特異性結合分子快速或以相同程度內化。

儘管基於OKT3之序列呈現對CD3之親和力比基於SP34之序列更高，但具有二價基於SP34之序列的雙特異性結合分子經常更有效。增強之活性可反映親和力，或另外或或者，由SP34識別之不同抗原決定基。有趣的是，當評定具有單價CD3結合之雙特異性結合分子時，趨勢不同。在一些情況下，基於OKT3之序列比基於SP34之序列更有效(圖14，比較構築體13及15)。

未觀測到目標細胞ROR1表現量與細胞毒性之間的直接相關性(表5)。儘管如此，抗ROR1抗體之更高親和力變異體比親本WT序列更有效。此在ROR1表現量更低之情形中可能具有增加之重要性。

此等實驗之結果顯示雖然CD3及ROR1結合組分可分別最佳化及表徵，但活性最強的雙特異性結合分子僅可經由使用不同雙特異性組態之結合組分之不同配對的經驗測試來鑑別。實驗證明構築體9及18(組態B)始終在最強效抗ROR1/抗CD3雙特異性結合分子中。此尤其值得注意，因為CD3結合實驗證明在無ROR1存在下，此等構築體在Jurkat細胞之最弱結合子中。此預期為適用特徵，因為T細胞上之CD3之活化及內化將為極小的，直至ROR1參與腫瘤微環境中。

Claims

一種雙特異性結合分子，其包含特異性結合於人類ROR1之細胞外域的第一抗原結合域及特異性結合於人類CD3之細胞外域的第二抗原結合域；其中該第一抗原結合域包含：a)分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65之胺基酸序列的重鏈(H)-CDR1-3及輕鏈(L)-CDR1-3；或b)分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；且其中該第二抗原結合域包含：分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的重鏈(H)-CDR1-3及輕鏈(L)-CDR1-3。
如請求項1之雙特異性結合分子，其中該第一抗原結合域包含：a)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的VL；b)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的VL；c)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的輕鏈(LC)；d)包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；e)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC；或f)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的LC。
如請求項1之雙特異性結合分子，其中該第二抗原結合域包含：a)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的VL；或b)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的VL。
如請求項1之雙特異性結合分子，其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：97、61、62、63、64及65之胺基酸序列的重鏈(H)-CDR1-3及輕鏈(L)-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；或b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58及59之胺基酸序列的H-CDR1-3及L-CDR1-3；或其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；或 b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；或其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：74及73之胺基酸序列之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81之胺基酸序列之VH及VL；或b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：72及73之胺基酸序列之VH及VL，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81之胺基酸序列之VH及VL；或其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之重鏈(HC)及輕鏈(LC)，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；或b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：70及71之胺基酸序列之VH及VL；或其包含：a)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：84及83之胺基酸序列之重鏈(HC)及輕鏈(LC)，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81之胺基酸序列之VH及VL；或b)第一抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：82及83之胺基酸序列之HC及LC，及第二抗原結合域，其包含分別包含SEQ ID NO：80及81 之胺基酸序列之VH及VL。
一種特異性結合於人類ROR1及人類CD3之雙特異性結合分子，其包含SEQ ID NO：14及19之胺基酸序列；或其包含SEQ ID NO：7及19之胺基酸序列；或其包含SEQ ID NO：7及23之胺基酸序列。
如請求項1之雙特異性結合分子，其中：a)該第一抗原結合域具有2價數，且該第二抗原結合域具有2價數；b)該第一抗原結合域具有1價數，且該第二抗原結合域具有1價數；或c)該第一抗原結合域具有2價數，且該第二抗原結合域具有1價數。
如請求項1之雙特異性結合分子，其包含人類IgG1恆定區。
如請求項7之雙特異性結合分子，其包含：含有胺基酸取代L234A、L235A及G237A之人類IgG1恆定區，其中殘基係根據EU系統編號。
如請求項1之雙特異性結合分子，其中該第二抗原結合域為scFv。
如請求項1之雙特異性結合分子，其中該第二抗原結合域之重鏈或輕鏈胺基酸序列經由肽連接子與該第一抗原結合域之重鏈或輕鏈胺基酸序列融合。
如請求項10之雙特異性結合分子，其中在該第二抗原結合域之該重鏈或輕鏈胺基酸序列與該第一抗原結合域之該重鏈或輕鏈胺基酸序列之間的該肽連接子具有GGGGSGGGGS之胺基酸序列(SEQ ID NO：93)。
如請求項11之雙特異性結合分子，其中該第二抗原結合域融合至：a)該第一抗原結合域之該輕鏈的羧基端；或b)該第一抗原結合域之該輕鏈的胺基端。
一種免疫結合物，其包含與細胞毒性劑結合之如請求項1至12中任一項之雙特異性結合分子。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之雙特異性結合分子及醫藥學上可接受之賦形劑。
一種經分離核酸分子，其包含編碼如請求項1至12中任一項之雙特異性結合分子之該第一抗原結合域之重鏈及輕鏈可變域(VH及VL)的核苷酸序列，且進一步包含編碼如請求項1至12中任一項之雙特異性結合分子之該第二抗原結合域之該等VH及VL的核苷酸序列。
如請求項15之經分離核酸分子，其包含：a)SEQ ID NO：37及42之核苷酸序列；b)SEQ ID NO：30及42之核苷酸序列；或 c)SEQ ID NO：30及46之核苷酸序列。
一種載體，其包含如請求項15或16之經分離核酸分子。
一種宿主細胞，其包含編碼如請求項1至12中任一項之雙特異性結合分子之該第一抗原結合域之重鏈及輕鏈可變域(VH及VL)的核苷酸序列，且進一步包含編碼如請求項1至12中任一項之雙特異性結合分子之該第二抗原結合域之該等VH及VL的核苷酸序列。
如請求項18之宿主細胞，其中該宿主細胞包含以下之核苷酸序列：a)SEQ ID NO：37及42；b)SEQ ID NO：30及42；或c)SEQ ID NO：30及46。
一種用於製造如請求項1至12中任一項之雙特異性結合分子的方法，其包含提供如請求項18或19之宿主細胞，在適於表現該雙特異性結合分子之條件下培養該宿主細胞，及分離所得雙特異性結合分子。
一種如請求項1至12中任一項之雙特異性結合分子之用途，其用於製造供治療患者之癌症用之藥劑。
如請求項21之用途，其中該癌症為ROR1陽性癌症。
如請求項21之用途，其中該癌症為白血病、淋巴瘤或實體腫瘤。
如請求項21之用途，其中該癌症為急性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞白血病、套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、T細胞非霍奇金氏淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、華氏巨球蛋白血症、多發性骨髓瘤、邊緣區淋巴瘤、小淋巴球性淋巴瘤或已經歷芮氏轉形之非霍奇金淋巴瘤。
如請求項21之用途，其中該癌症為結腸癌、非小細胞肺癌、神經膠母細胞瘤、肝細胞癌、胰臟癌、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、頭頸癌、卵巢癌、乳癌或三陰性乳癌。
如請求項21之用途，其中該患者用額外治療劑治療。
如請求項26之用途，其中該額外治療劑係選自由以下組成之群：布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑、B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)抑制劑、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)抑制劑及磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑。
如請求項26之用途，其中該額外治療劑係選自由以下組成之群：依魯替尼、阿卡替尼、維納妥拉、依維莫司、賽泮替布及艾德昔布。
一種套組，其包含如請求項1至12中任一項之雙特異性結合分子。
如請求項29之套組，其用於根據如請求項21至28中任一項的癌症治療中。