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TWI893039B - 透過循環腫瘤dna分析之分子疾病評估之方法及系統 - Google Patents

透過循環腫瘤dna分析之分子疾病評估之方法及系統

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Publication number
TWI893039B
TWI893039B TW109145799A TW109145799A TWI893039B TW I893039 B TWI893039 B TW I893039B TW 109145799 A TW109145799 A TW 109145799A TW 109145799 A TW109145799 A TW 109145799A TW I893039 B TWI893039 B TW I893039B
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tumor
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cancer
methylation
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TW109145799A
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English (en)
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TW202138566A (zh
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亞歷克斯 羅伯遜
尼爾 彼得曼
妮可 蘭伯特
哈路克 泰兹坎
羅西 史里瓦斯
彼得 喬治
傑森 克羅斯
Original Assignee
美商勒森特生物股份有限公司
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Publication date
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Abstract

本揭示內容提供評估個體之腫瘤狀態(例如進展、消退、復發等)的方法。在一態樣中，評估個體之腫瘤狀態(例如進展、消退、復發等)的方法可包含：基於在不同時間點個體之cfDNA分子的第一及第二WGS資料，測定(i) 第一及第二複數個CNA及(ii) 第一及第二複數個片段長度；處理該等第一及第二複數個CNA以測定CNA概況變化；比較該等第一及第二複數個片段長度以測定片段長度概況變化；至少部分地基於該CNA概況變化及該片段長度概況變化，測定在第一或第二時間點該個體之第一或第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一或第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。

Description

透過循環腫瘤DNA分析之分子疾病評估之方法及系統
腫瘤進展通常可指其中患有癌症之個體(例如，患者)患有在嚴重程度(例如，腫瘤負荷、腫瘤大小、癌症階段)上進展之腫瘤之情形。舉例而言，患者中之腫瘤進展可為患者之腫瘤對癌症之治療方案不反應之指示。另一方面，患者中之腫瘤無進展可為患者之腫瘤對癌症之治療方案作出反應之指示。另外，患者之腫瘤進展或腫瘤無進展狀態可指示個體對於癌症治療之預後。
提供藉由分析個體之體液樣品(例如血液樣品)評估個體(例如患有癌症之患者)之腫瘤狀態(例如進展、消退、復發等)的方法及系統。可藉由分析來自個體之樣品之腫瘤DNA(例如來自無細胞DNA)評估及/或監測腫瘤進展或腫瘤無進展。個體之腫瘤進展或腫瘤無進展狀態可指示患有癌症之個體之診斷、預後或治療選擇。
在一態樣中，本揭示內容提供評估患有癌症之個體之腫瘤進展的方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一 全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑(therapeutic)之前；處理第一WGS資料以測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；處理第二WGS資料以測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；處理第一複數個CNA以及第二複數個CNA以測定CNA概況變化；處理第一複數個片段長度以及第二複數個片段長度以測定片段長度概況變化；至少部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤進展。
在一態樣中，本揭示內容提供評估患有癌症之個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)的方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一WGS資料測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資 料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於第二WGS資料測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；比較第一複數個CNA與第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於第一複數個片段長度及第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；至少部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一態樣中，本揭示內容提供治療個體之癌症之方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一WGS資料測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於第二WGS資料測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；比較第一複數個CNA與第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於第一複數個片段長度及第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；至少 部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)；及基於所檢測之腫瘤狀態，投與治療有效劑量之治療(例如手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑)以治療該個體之該癌症。在一些實施例中，所檢測之腫瘤狀態包含腫瘤進展，且該方法包含向患者投與第二治療，其中在該投與之前，該患者已經針對癌症之第一治療來治療(且第一及第二治療不同)。
在一些實施例中，第一或第二體液樣品選自由以下組成之群：血液、血清、血漿、玻璃體、痰、尿液、眼淚、汗液、唾液、精液、黏膜分泌物、黏液、脊髓液、腦脊髓液(CSF)、胸水、腹膜液、羊水及淋巴液。在一些實施例中，獲得第一WGS資料包含對第一複數個cfDNA分子進行定序以產生第一複數個定序讀數，或其中獲得第二WGS資料包含對第二複數個cfDNA分子進行定序以產生第二複數個定序讀數。在一些實施例中，定序係藉由Nanopore定序、鏈終止(Sanger)定序、藉由合成之定序(例如Illumina或Solexa定序)、單分子即時定序、大規模平行簽名定序、Polony定序、454焦磷酸定序、組合探針錨定合成、藉由接合之定序(SOLiD定序)或GenapSys定序。在一些實施例中，定序包含全基因體亞硫酸氫鹽定序(WGBS)、全基因體酶促甲基-seq、全外顯子體定序、全表觀基因體定序、甲基化陣列、簡化代表性亞硫酸氫鹽定序(RRBS-Seq)、TET輔助之吡啶硼烷定序(TAPS)、Tet輔助之亞硫酸氫鹽定序(TAB- Seq)、APOBEC耦合之表觀遺傳定序(ACE-seq)、氧化亞硫酸氫鹽定序(oxBS-Seq)、下拉或甲基化DNA免疫沈澱定序或胞嘧啶5-羥甲基化定序(例如透過Bluestar)。
在一些實施例中，定序係以不超過約40X之深度實施。在一些實施例中，定序係以不超過約30X之深度實施。在一些實施例中，定序係以不超過約25X之深度實施。在一些實施例中，定序係以不超過約20X之深度實施。在一些實施例中，定序係以不超過約12X之深度實施。在一些實施例中，定序係以不超過約10X之深度實施。在一些實施例中，定序係以不超過約8X之深度實施。在一些實施例中，定序係以不超過約6X之深度實施。在一些實施例中，定序係以不超過約5X、不超過約4X、不超過約3X、不超過約2X或不超過約1X之深度實施。
在一些實施例中，該方法進一步包含將該第一或第二複數個定序讀數與參考基因體比對，藉此產生複數個比對之定序讀數。在一些實施例中，該方法進一步包含富集複數個基因體區之第一或第二複數個cfDNA分子。在一些實施例中，富集包含擴增第一或第二複數個cfDNA分子。在一些實施例中，擴增包含選擇性擴增。在一些實施例中，擴增包含通用擴增。在一些實施例中，富集包含選擇性分離第一或第二複數個cfDNA分子之至少一部分。在一些實施例中，選擇性分離第一或第二複數個cfDNA分子之至少該部分包含使用複數個探針，該複數個探針中之每一者具有與複數個基因體區之一個基因體區之至少一部分互補的序列。在一些實施例中，至少該部分包含腫瘤標記基因座。在一些實施例中，至少該部分包含複數個腫瘤標記基因座。在一些實施例中，複數個腫瘤標記基因座包含一或多個具有拷貝數改變之基因座(例如CNA基因座，例如MET、 EGFR及BRCA2，以及染色體1及8中之整臂CNA)。該等CNA基因座可使用資料庫(例如癌症基因體圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)及癌症體細胞突變目錄(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer，COSMIC))來發現。
在一些實施例中，測定第一複數個CNA包含在第一複數個定序讀數之複數個基因體區中之每一者處測定CNA之定量量度，且其中測定第二複數個CNA包含在第二複數個定序讀數之複數個基因體區中之每一者處測定CNA之定量量度。在一些實施例中，該方法進一步包含針對GC含量及/或可映射性偏差校正第一複數個CNA或第二複數個CNA。在一些實施例中，校正包含使用統計建模分析。在一些實施例中，校正包含使用LOESS回歸或貝氏(Bayesian)模型。在一些實施例中，複數個基因體區包含具有預定大小之參考基因體之非重疊基因體區。在一些實施例中，預定大小係約50千鹼基(kb)、約100kb、約200kb、約500kb、約1百萬鹼基(Mb)、約2Mb、約5Mb或約10Mb。
在一些實施例中，複數個基因體區包含至少約1,000個不同基因體區。在一些實施例中，複數個基因體區包含至少約2,000個不同基因體區。在一些實施例中，複數個基因體區包含至少約3,000個不同基因體區、至少約4,000個不同基因體區、至少約5,000個不同基因體區、至少約6,000個不同基因體區、至少約7,000個不同基因體區、至少約8,000個不同基因體區、至少約9,000個不同基因體區、至少約10,000個不同基因體區、至少約15,000個不同基因體區、至少約20,000個不同基因體區、至少約25,000個不同基因體區、至少約30,000個不同基因體區、至少約35,000個不同基因體區、至少約40,000個不同基因體區、至少約45,000個 不同基因體區、至少約50,000個不同基因體區、至少約100,000個不同基因體區、至少約150,000個不同基因體區、至少約200,000個不同基因體區、至少約250,000個不同基因體區、至少約300,000個不同基因體區、至少約400,000個不同基因體區或至少約500,000個不同基因體區。
在一些實施例中，測定CNA概況變化包含用複數個參考CNA值處理第一複數個CNA及第二複數個CNA，其中複數個參考CNA值係自額外cfDNA分子獲得，該等額外cfDNA分子係自額外個體之額外體液樣品獲得或衍生。在一些實施例中，額外個體包含一或多個無癌症之個體(例如未受癌症影響之個體或無癌症診斷之個體)。在一些實施例中，額外個體包含一或多個無腫瘤進展之個體。在一些實施例中，複數個參考CNA值係使用個體之額外體液樣品獲得，該等額外體液樣品係在第一時間點之後之一或多個後續時間點獲得。
在一些實施例中，該方法進一步包含過濾出滿足預定準則之第一複數個CNA及第二複數個CNA之亞組。在一些實施例中，當既定CNA值與相應參考CNA值之間之差包含不超過約1個標準偏差之差時，過濾出第一複數個CNA或第二複數個CNA值之既定CNA值。在一些實施例中，該方法進一步包含當既定CNA值與相應參考CNA值之間之差包含不超過約2個標準偏差之差時過濾出第一複數個CNA或第二複數個CNA值之既定CNA值。在一些實施例中，該方法進一步包含當既定CNA值與相應參考CNA值之間之差包含不超過約3個標準偏差之差時，過濾出第一複數個CNA或第二複數個CNA值之既定CNA值。在一些實施例中，該方法進一步包含基於既定CNA值與相應局部平均片段長度或局部平均甲基化之間之斯皮爾曼等級相關(Spearman’s rank correlation)，過濾出第一複數個 CNA或第二複數個CNA值之既定CNA值。在一些實施例中，該方法進一步包含當斯皮爾曼等級相關係數(Spearman’s rank correlation coefficient,Spearman’s rho)小於-0.1(例如，指示局部平均片段長度與局部腫瘤拷貝數之間不存在顯著負相關)時，過濾出第一複數個CNA或第二複數個CNA值之既定CNA值。此亦可利用皮爾森相關(Pearson’s correlation)或一些其他類型之相關統計學來進行以確定CNA與片段長度或甲基化之間是否存在負相關。
在一些實施例中，該方法進一步包含基於文庫或基因體位置正規化第一複數個片段長度或第二複數個片段長度。在一些實施例中，該方法進一步包含，當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數大於1、大於1.1、大於1.2、大於1.3、大於1.4、大於1.5、大於1.6、大於1.7、大於1.8、大於1.9、大於2、大於3、大於4或大於5時，腫瘤狀態(例如，腫瘤進展、無進展、消退或復發)包含個體之腫瘤進展。在一些實施例中，該方法進一步包含當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數小於0.01、小於0.05、小於0.1、小於0.2、小於0.3、小於0.4或小於0.5時，檢測個體之主要分子反應(MMR)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之靈敏度檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之靈敏度檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少 約99%之靈敏度檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之特異性檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之特異性檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之特異性檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93% 或至少約94%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約0.50、至少約0.55、至少約0.60、至少約0.65、至少約0.70、至少約0.75、至少約0.80、至少約0.85、至少約0.90、至少約0.91、至少約0.92、至少約0.93或至少約0.94之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約0.95、至少約0.96、至少約0.97或至少約0.98之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約0.99之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含當未檢測到腫瘤進展時，確定個體腫瘤無進展。在一些實施例中，該方法進一步包含基於個體確定之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)，投與治療有效劑量之治療以治療該個體之該癌症。在一些實施例中，治療包含用手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑之治療。在一些實施例中，所檢測之腫瘤狀態指示腫瘤進展、無進展、消退或復發。在一些實施例中， 第一及第二WGS資料係藉由定序裝置或電腦處理器(例如包含基於本揭示內容之方法執行指令之一或多個程式)獲得。
在另一態樣中，本揭示內容提供用於評估患有癌症之個體之腫瘤進展的電腦系統，其包含：資料庫，其經構形以儲存(i)第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前，及(ii)第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；及一或多個可操作地耦合至資料庫之電腦處理器，其中該一或多個電腦處理器個別地或共同地經程式化以：處理第一WGS資料以測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；處理第二WGS資料以測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；處理第一複數個CNA以及第二複數個CNA以測定CNA概況變化；處理第一複數個片段長度以及第二複數個片段長度以測定片段長度概況變化；至少部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化，測定該個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤進展。
在另一態樣中，本揭示內容提供用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)的電腦系統，其包含： 資料庫，其經構形以儲存(i)第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前，及(ii)第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；及一或多個可操作地耦合至資料庫之電腦處理器，其中該一或多個電腦處理器個別地或共同地經程式化以：基於第一WGS資料測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；基於第二WGS資料測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；比較第一複數個CNA與第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於第一複數個片段長度及第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；至少部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
在另一態樣中，本揭示內容提供包含機器可執行指令之非暫時性電腦可讀媒體，該等機器可執行指令在由一或多個電腦處理器執行時實施用於評估患有癌症之個體之腫瘤進展的方法，該方法包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之 前；處理第一WGS資料以測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；處理第二WGS資料以測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；處理第一複數個CNA以及第二複數個CNA以測定CNA概況變化；處理第一複數個片段長度以及第二複數個片段長度以測定片段長度概況變化；至少部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤進展。
在另一態樣中，本揭示內容提供包含機器可執行指令之非暫時性電腦可讀媒體，該等機器可執行指令在由一或多個電腦處理器執行時實施用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)的方法，該方法包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一WGS資料測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間 點係在向該個體投與該治療劑之後；基於第二WGS資料測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；比較第一複數個CNA與第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於第一複數個片段長度及第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；至少部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
在另一態樣中，本揭示內容提供評估患有癌症之個體之腫瘤進展的方法，其包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；處理第一MS資料以測定基因體區中一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與治療劑之後；處理第二MS資料以測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；處理跨越一或多個CpG島之第一平均甲基化分數概況及跨越一或多個CpG島之第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫 瘤分數檢測該個體之腫瘤進展。在一些實施例中，可獲取並分析第二時間點之後之額外時間點，以檢測在稍後時間發生之腫瘤進展。
在另一態樣中，本揭示內容提供用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)的方法，其包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與治療劑之後；基於第二MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較跨越一或多個CpG島之第一平均甲基化分數概況與跨越一或多個CpG島之第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。在一些實施例中，可獲取並分析第二時間點之後之額外時間點，以檢測在稍後時間發生之腫瘤進展。
在另一態樣中，本揭示內容提供治療個體之癌症之方法，其包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間 點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與治療劑之後；基於第二MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較跨越一或多個CpG島之第一平均甲基化分數概況與跨越一或多個CpG島之第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態；及基於所檢測之腫瘤狀態，投與治療有效劑量之治療(例如手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑)以治療該個體之該癌症。在一些實施例中，所檢測之腫瘤狀態包含腫瘤進展，且該方法包含向患者投與第二治療，其中在該投與之前，該患者已經針對癌症之第一治療來治療(且第一及第二治療不同)。
在一些實施例中，第一或第二體液樣品選自由以下組成之群：血液、血清、血漿、玻璃體、痰、尿液、眼淚、汗液、唾液、精液、黏膜分泌物、黏液、脊髓液、腦脊髓液(CSF)、胸水、腹膜液、羊水及淋巴液。在一些實施例中，獲得第一MS資料包含實施第一複數個cfDNA分 子之甲基化定序以生成第一複數個定序讀數，或其中獲得第二WGS資料包含實施第二複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第二複數個定序讀數。在一些實施例中，甲基化定序包含全基因體亞硫酸氫鹽定序。在一些實施例中，甲基化定序包含全基因體酶促甲基-seq。在一些實施例中，甲基化定序包含氧化亞硫酸氫鹽定序、TET輔助之吡啶硼烷定序(TAPS)、TET輔助之亞硫酸氫鹽定序(TABS)、氧化亞硫酸氫鹽定序(oxBS-Seq)、APOBEC耦合之表觀遺傳定序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沈澱(MeDIP)定序、羥甲基化DNA免疫沈澱(hMeDIP)定序、甲基化陣列分析、簡化代表性亞硫酸氫鹽定序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羥甲基化定序。
在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約40X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約30X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約25X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約20X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約12X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約10X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約8X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約6X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約5X、不超過約4X、不超過約3X、不超過約2X或不超過約1X之深度實施。
在一些實施例中，該方法進一步包含將該第一或第二複數個定序讀數與參考基因體比對(例如同時與參考基因體之C-至-T轉化形式比對)，藉此產生複數個比對之定序讀數。在一些實施例中，該方法進一步包含富集基因體區之第一或第二複數個cfDNA分子。在一些實施例中，富集包含擴增第一或第二複數個cfDNA分子。在一些實施例中，擴增包含 選擇性擴增。在一些實施例中，擴增包含通用擴增。在一些實施例中，富集包含選擇性分離第一或第二複數個cfDNA分子之至少一部分。在一些實施例中，選擇性分離第一或第二複數個cfDNA分子之至少該部分包含使用複數個探針，該複數個探針中之每一者具有與基因體區之至少一部分互補的序列。在一些實施例中，至少該部分包含腫瘤標記基因座。在一些實施例中，至少該部分包含複數個腫瘤標記基因座。在一些實施例中，複數個腫瘤標記基因座包含一或多個選自癌症基因體圖譜(TCGA)或癌症體細胞突變目錄(COSMIC)之基因座。
在一些實施例中，基因體區包含以下中之一或多者：CpG島、CpG島岸、患者特異性部分甲基化結構域、常見部分甲基化結構域、啟動子、基因體、均勻間隔之全基因體組格及轉座元件。在一些實施例中，基因體區包含基因體之複數個非重疊區。在一些實施例中，基因體之複數個非重疊區具有預定大小。在一些實施例中，預定大小係約50千鹼基(kb)、約100kb、約200kb、約500kb、約1百萬鹼基(Mb)、約2Mb、約5Mb或約10Mb。在一些實施例中，基因體區包含一或多個MAGE(黑色素瘤相關之抗原)基因，例如人類MAGE基因。在一些實施例中，基因體區包含一或多個對應於一或多個MAGE(黑色素瘤相關之抗原)基因(例如人類MAGE基因)之啟動子。
在一些實施例中，基因體之複數個非重疊區包含至少約1,000個不同區。在一些實施例中，基因體之複數個非重疊區包含至少約2,000個不同區。在一些實施例中，基因體之複數個非重疊區包含至少約3,000個不同區、至少約4,000個不同區、至少約5,000個不同區、至少約6,000個不同區、至少約7,000個不同區、至少約8,000個不同區、至少約 9,000個不同區、至少約10,000個不同區、至少約15,000個不同區、至少約20,000個不同區、至少約25,000個不同區、至少約30,000個不同區、至少約35,000個不同區、至少約40,000個不同區、至少約45,000個不同區、至少約50,000個不同區、至少約100,000個不同區、至少約150,000個不同區、至少約200,000個不同區、至少約250,000個不同區、至少約300,000個不同區、至少約400,000個不同區或至少約500,000個不同區。
在一些實施例中，測定第一或第二腫瘤分數包含用一或多個參考甲基化分數概況處理甲基化分數概況，其中一或多個參考甲基化分數概況係自額外cfDNA分子獲得，該等額外cfDNA分子係自額外個體之額外體液樣品獲得或衍生。在一些實施例中，額外個體包含一或多個患有癌症之個體。在一些實施例中，額外個體包含一或多個無癌症之個體。在一些實施例中，額外個體包含一或多個具有腫瘤進展之個體。在一些實施例中，額外個體包含一或多個無腫瘤進展之個體。在一些實施例中，一或多個參考甲基化分數概況係使用個體之額外體液樣品獲得，該等額外體液樣品係在第一時間點之後之一或多個後續時間點獲得。
在一些實施例中，該方法進一步包含，當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數大於1、大於1.1、大於1.2、大於1.3、大於1.4、大於1.5、大於1.6、大於1.7、大於1.8、大於1.9、大於2、大於3、大於4或大於5時，檢測腫瘤狀態(例如，腫瘤進展、無進展、消退或復發)包含個體之腫瘤進展。在一些實施例中，該方法進一步包含當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數小於0.01、小於0.05、小於0.1、小於0.2、小於0.3、小於0.4或小於0.5時，檢測個體之主要分子反應(MMR)。在一些實施例中，該方法進一步包含當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數在統計上顯著大於1、大於1.1、大 於1.2、大於1.3、大於1.4、大於1.5、大於1.6、大於1.7、大於1.8、大於1.9、大於2、大於3、大於4或大於5時，檢測個體之腫瘤進展。在一些實施例中，該方法進一步包含當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數在統計上顯著小於0.01、小於0.05、小於0.1、小於0.2、小於0.3、小於0.4或小於0.5時，檢測個體之主要分子反應(MMR)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之靈敏度檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之靈敏度檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之靈敏度檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之特異性檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之特異性檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之特異性檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約0.50、至少約0.55、至少約0.60、至少約0.65、至少約0.70、至少約0.75、至少約0.80、至少約0.85、至少約0.90、至少約0.91、至少約0.92、至少約0.93或至少約0.94之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約 0.95、至少約0.96、至少約0.97或至少約0.98之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約0.99之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含當未檢測到腫瘤進展時，確定個體腫瘤無進展。在一些實施例中，該方法進一步包含基於個體確定之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)，投與治療有效劑量之第二治療劑以治療該個體之該癌症。在一些實施例中，第二治療劑包含手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑。在一些實施例中，第一及第二複數個cfDNA分子係來自個體之免疫細胞。在一些實施例中，所檢測之腫瘤狀態指示腫瘤進展、無進展、消退或復發。在一些實施例中，第一及第二MS資料係藉由定序裝置或電腦處理器(例如包含基於本揭示內容之方法執行指令之一或多個程式)獲得。
在根據本文所述實施例中之任一者之一些實施例中，個體患有腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、腎癌、肝膽道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、甲狀腺癌或尿路癌。
在另一態樣中，本揭示內容提供用於評估患有癌症之個體之腫瘤進展的電腦系統，其包含：資料庫，其經構形以儲存(i)跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣 品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前，及(ii)跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與治療劑之後；及一或多個可操作地耦合至資料庫之電腦處理器，其中該一或多個電腦處理器個別地或共同地經程式化以：處理第一MS資料以測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；處理第二MS資料以測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；處理跨越一或多個CpG島之第一平均甲基化分數概況及跨越一或多個CpG島之第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤進展。
在另一態樣中，本揭示內容提供用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)的電腦系統，其包含：資料庫，其經構形以儲存(i)跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前，及(ii)跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與治療劑之後；及一或多個可操作地耦合至資 料庫之電腦處理器，其中該一或多個電腦處理器個別地或共同地經程式化以：基於第一MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；基於第二MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較跨越一或多個CpG島之第一平均甲基化分數概況與跨越一或多個CpG島之第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測個體之腫瘤狀態。
在另一態樣中，本揭示內容提供包含機器可執行指令之非暫時性電腦可讀媒體，該等機器可執行指令在由一或多個電腦處理器執行時實施用於評估患有癌症之個體之腫瘤進展的方法，該方法包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；處理第一MS資料以測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與治療劑之後；處理第二MS資料以測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；處理跨越一或多個CpG島之第一平均甲基化分數概況及跨越一或多個CpG島之第二平均甲基化分數概況 以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤進展。
在另一態樣中，本揭示內容提供包含機器可執行指令之非暫時性電腦可讀媒體，該等機器可執行指令在由一或多個電腦處理器執行時實施用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)的方法，該方法包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與治療劑之後；基於第二MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較跨越一或多個CpG島之第一平均甲基化分數概況與跨越一或多個CpG島之第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
在一些實施例中，所檢測之腫瘤進展至少部分地基於各別甲基化分數概況之一或多個統計建模分析。在一些實施例中，一或多個統 計建模分析包含線性回歸、簡單回歸、二元回歸、貝氏線性回歸、貝氏建模、多項式回歸、高斯(Gaussian)過程回歸、高斯建模、二元回歸、邏輯式回歸或非線性回歸。在一些實施例中，一或多個統計建模分析比較所檢測之腫瘤進展與源自具有已知腫瘤分數之樣品之MS資料、源自純腫瘤樣品之MS資料或源自健康樣品之MS資料。
在另一態樣中，本揭示內容提供用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)的方法，其包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一MS資料測定基因體之一或多個基因座(例如基因體區中之一或多個CpG島或非CpG甲基化基因座)中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與治療劑之後；基於第二MS資料測定基因體之一或多個基因座(例如基因體區中之一或多個CpG島或非CpG甲基化基因座)中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較跨越一或多個基因座之第一甲基化概況與跨越一或多個基因座之第二甲基化概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。在一些實施例中，可獲取並分析第二時間點之後之額外時間點，以檢測在稍後時間發生之腫瘤進展。
在另一態樣中，本揭示內容提供治療個體之癌症之方法，其包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一MS資料測定基因體之一或多個基因座(例如基因體區中之一或多個CpG島或非CpG甲基化基因座)中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與治療劑之後；基於第二MS資料測定基因體之一或多個基因座(例如基因體區中之一或多個CpG島或非CpG甲基化基因座)中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較跨越一或多個基因座之第一甲基化概況與跨越一或多個基因座之第二甲基化概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態；及基於所檢測之腫瘤狀態，投與治療有效劑量之治療(例如手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑)以治療該個體之該癌症。在一些實施例中，所檢測之腫瘤狀態包含腫瘤進展，且該方法包含向患者投與第二治療，其中在該投與之前，該患者已經針對癌症之第一治療來治療(且第一及第二治療不同)。
在另一態樣中，本揭示內容提供用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)的方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一WGS資料測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於第一MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於第二WGS資料測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於第二MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較第一複數個CNA與第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於第一複數個片段長度及第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；比較跨越一或多個CpG島之第一平均甲基化分數概況與跨越一或多個CpG島之第二平均甲基化分數 概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於CNA概況變化、片段長度概況變化及各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
在另一態樣中，本揭示內容提供治療個體之癌症之方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一WGS資料測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於第一MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於第二WGS資料測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於第二MS資料測定基因體區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較第一複數個 CNA與第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於第一複數個片段長度及第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；比較跨越一或多個CpG島之第一平均甲基化分數概況與跨越一或多個CpG島之第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於CNA概況變化、片段長度概況變化及各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態；及基於所檢測之腫瘤狀態，投與治療有效劑量之治療(例如手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑)以治療該個體之該癌症。在一些實施例中，所檢測之腫瘤狀態包含腫瘤進展，且該方法包含向患者投與第二治療，其中在該投與之前，該患者已經針對癌症之第一治療來治療(且第一及第二治療不同)。
在另一態樣中，本揭示內容提供用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)的方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一WGS資料測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於第一MS資料測定基因體之一或多個基因座 中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於第二WGS資料測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於第二MS資料測定基因體之一或多個基因座中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較第一複數個CNA與第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於第一複數個片段長度及第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；比較跨越一或多個基因座之第一甲基化概況與跨越一或多個基因座之第二甲基化概況；至少部分地基於CNA概況變化、片段長度概況變化及各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
在另一態樣中，本揭示內容提供治療個體之癌症之方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；基於第一WGS資料測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA) 分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於第一MS資料測定基因體之一或多個基因座中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於第二WGS資料測定(iii)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；獲得跨越基因體區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於第二MS資料測定基因體之一或多個基因座中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較第一複數個CNA與第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於第一複數個片段長度及第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；比較跨越一或多個基因座之第一甲基化概況與跨越一或多個基因座之第二甲基化概況；至少部分地基於CNA概況變化、片段長度概況變化及各別甲基化分數概況，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態；及基於所檢測之腫瘤狀態，投與治療有效劑量之治療(例如手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑)以治療該個體之該癌症。在一些實施例中，所檢測之腫瘤狀態包含腫瘤進展，且該方法包含向患者投與第二治療，其中在該投與之前，該 患者已經針對癌症之第一治療來治療(且第一及第二治療不同)。
在一些實施例中，第一及第二甲基化概況包含5-羥甲基胞嘧啶狀態、5-甲基胞嘧啶狀態、基於富集之甲基化評估、中值甲基化程度、模式甲基化程度、最大甲基化程度或最小甲基化程度。在一些實施例中，第一或第二體液樣品選自由以下組成之群：血液、血清、血漿、玻璃體、痰、尿液、眼淚、汗液、唾液、精液、黏膜分泌物、黏液、脊髓液、腦脊髓液(CSF)、胸水、腹膜液、羊水及淋巴液。在一些實施例中，獲得第一MS資料包含實施第一複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第一複數個定序讀數，或其中獲得第二WGS資料包含實施第二複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第二複數個定序讀數。在一些實施例中，甲基化定序包含全基因體亞硫酸氫鹽定序。在一些實施例中，甲基化定序包含全基因體酶促甲基-seq。在一些實施例中，甲基化定序包含氧化亞硫酸氫鹽定序、TET輔助之吡啶硼烷定序(TAPS)、TET輔助之亞硫酸氫鹽定序(TABS)、氧化亞硫酸氫鹽定序(oxBS-Seq)、APOBEC耦合之表觀遺傳定序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沈澱(MeDIP)定序、羥甲基化DNA免疫沈澱(hMeDIP)定序、甲基化陣列分析、簡化代表性亞硫酸氫鹽定序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羥甲基化定序。
在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約40X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約30X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約25X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約20X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約12X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約10X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約8X之深度 實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約6X之深度實施。在一些實施例中，甲基化定序係以不超過約5X、不超過約4X、不超過約3X、不超過約2X或不超過約1X之深度實施。
在一些實施例中，該方法進一步包含將該第一或第二複數個定序讀數與參考基因體比對(例如同時與參考基因體之C-至-T轉化形式比對)，藉此產生複數個比對之定序讀數。在一些實施例中，該方法進一步包含富集基因體區之第一或第二複數個cfDNA分子。在一些實施例中，富集包含擴增第一或第二複數個cfDNA分子。在一些實施例中，擴增包含選擇性擴增。在一些實施例中，擴增包含通用擴增。在一些實施例中，富集包含選擇性分離第一或第二複數個cfDNA分子之至少一部分。在一些實施例中，選擇性分離第一或第二複數個cfDNA分子之至少該部分包含使用複數個探針，該複數個探針中之每一者具有與基因體區之至少一部分互補的序列。在一些實施例中，至少該部分包含腫瘤標記基因座。在一些實施例中，至少該部分包含複數個腫瘤標記基因座。在一些實施例中，複數個腫瘤標記基因座包含一或多個選自癌症基因體圖譜(TCGA)或癌症體細胞突變目錄(COSMIC)之基因座。
在一些實施例中，基因體之基因座或區包含以下中之一或多者：CpG島、CpG島岸、患者特異性部分甲基化結構域、常見部分甲基化結構域、啟動子、基因體、均勻間隔之全基因體組格及轉座元件。在一些實施例中，基因體區包含基因體之複數個非重疊區。在一些實施例中，基因體之複數個非重疊區具有預定大小。在一些實施例中，預定大小係約50千鹼基(kb)、約100kb、約200kb、約500kb、約1百萬鹼基(Mb)、約2Mb、約5Mb或約10Mb。
在一些實施例中，基因體之複數個非重疊區包含至少約1,000個不同區。在一些實施例中，基因體之複數個非重疊區包含至少約2,000個不同區。在一些實施例中，基因體之複數個非重疊區包含至少約3,000個不同區、至少約4,000個不同區、至少約5,000個不同區、至少約6,000個不同區、至少約7,000個不同區、至少約8,000個不同區、至少約9,000個不同區、至少約10,000個不同區、至少約15,000個不同區、至少約20,000個不同區、至少約25,000個不同區、至少約30,000個不同區、至少約35,000個不同區、至少約40,000個不同區、至少約45,000個不同區、至少約50,000個不同區、至少約100,000個不同區、至少約150,000個不同區、至少約200,000個不同區、至少約250,000個不同區、至少約300,000個不同區、至少約400,000個不同區或至少約500,000個不同區。
在一些實施例中，測定第一或第二腫瘤分數包含用一或多個參考甲基化分數概況處理甲基化分數概況，其中一或多個參考甲基化分數概況係自額外cfDNA分子獲得，該等額外cfDNA分子係自額外個體之額外體液樣品獲得或衍生。在一些實施例中，額外個體包含一或多個患有癌症之個體。在一些實施例中，額外個體包含一或多個無癌症之個體。在一些實施例中，額外個體包含一或多個具有腫瘤進展之個體。在一些實施例中，額外個體包含一或多個無腫瘤進展之個體。在一些實施例中，一或多個參考甲基化分數概況係使用個體之額外體液樣品獲得，該等額外體液樣品係在第一時間點之後之一或多個後續時間點獲得。
在一些實施例中，該方法進一步包含，當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數大於1、大於1.1、大於1.2、大於1.3、大於1.4、大於1.5、大於1.6、大於1.7、大於1.8、大於1.9、大於2、大於3、大於4或大於5 時，檢測腫瘤狀態(例如，腫瘤進展、無進展、消退或復發)包含個體之腫瘤進展。在一些實施例中，該方法進一步包含當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數小於0.01、小於0.05、小於0.1、小於0.2、小於0.3、小於0.4或小於0.5時，檢測個體之主要分子反應(MMR)。在一些實施例中，該方法進一步包含，當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數在統計上顯著大於1、大於1.1、大於1.2、大於1.3、大於1.4、大於1.5、大於1.6、大於1.7、大於1.8、大於1.9、大於2、大於3、大於4或大於5時，檢測腫瘤狀態(例如，腫瘤進展、無進展、消退或復發)包含個體之腫瘤進展。在一些實施例中，該方法進一步包含當第一腫瘤分數或第二腫瘤分數在統計上顯著小於0.01、小於0.05、小於0.1、小於0.2、小於0.3、小於0.4或小於0.5時，檢測個體之主要分子反應(MMR)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之靈敏度檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之靈敏度檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之靈敏度檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93% 或至少約94%之特異性檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之特異性檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之特異性檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%或至少約94%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約95%、至少約96%、至少約97%或至少約98%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約99%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤狀態 (例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約0.50、至少約0.55、至少約0.60、至少約0.65、至少約0.70、至少約0.75、至少約0.80、至少約0.85、至少約0.90、至少約0.91、至少約0.92、至少約0.93或至少約0.94之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約0.95、至少約0.96、至少約0.97或至少約0.98之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。在一些實施例中，該方法進一步包含以至少約0.99之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)。
在一些實施例中，該方法進一步包含當未檢測到腫瘤進展時，確定個體腫瘤無進展。在一些實施例中，該方法進一步包含基於個體確定之腫瘤狀態(例如腫瘤進展、無進展、消退或復發)，投與治療有效劑量之第二治療劑以治療該個體之該癌症。在一些實施例中，第二治療劑包含手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑。在一些實施例中，第一及第二複數個cfDNA分子係來自個體之免疫細胞。在一些實施例中，所檢測之腫瘤狀態指示腫瘤進展、無進展、消退或復發。在一些實施例中，第一及第二MS資料係藉由定序裝置或電腦處理器(例如包含基於本揭示內容之方法執行指令之一或多個程式)獲得。
在根據本文所述實施例中之任一者之一些實施例中，個體患有腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管 癌、胃癌、腎癌、肝膽道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、甲狀腺癌或尿路癌。
本揭示內容之另一態樣提供包含機器可執行代碼之非暫時電腦可讀媒體，該機器可執行代碼在由一或多個電腦處理器執行時，實施上文或本文別處之方法中之任一者。
本揭示內容之另一態樣提供包含一或多個電腦處理器及耦合至該等電腦處理器之電腦記憶體之系統。電腦記憶體包含機器可執行代碼，該機器可執行代碼在由一或多個電腦處理器執行時實施上文或本文別處之方法中之任一者。
自以下詳細說明，熟習此項技術者將易於明瞭本揭示內容之額外態樣及優點，其中僅顯示及闡述本揭示內容之闡釋性實施例。將瞭解，本揭示內容能夠具有其他及不同的實施例且其若干細節能夠在各個顯而易見方面進行修改，而所有此等皆不背離本揭示內容。因此，應將各圖示及說明視為實質上具有闡釋性而非限定性。
本說明書中所提及之所有出版物、專利及專利申請案皆以引用方式併入本文中，其併入程度如同明確地及個別地指出將每一個別出版物、專利或專利申請案以引用方式併入一般。就以引用方式併入之出版物、專利及專利申請案與本說明書中涵蓋之揭示內容相矛盾而言，本說明書意欲取代及/或優先於任何此類矛盾材料。
201:電腦系統
205:中央處理單元
210:記憶體或記憶體位置
215:電子儲存單元
220:通信介面
225:周邊裝置
230:電腦網路/網路
235:電子顯示器
240:使用者介面
本發明之新穎特徵詳細闡明於隨附申請專利範圍中。藉由參考闡述其中利用本發明原理之闡釋性實施例之下文詳細說明及附圖(本文中亦為「圖(Figure及FIG)」)將會更好地瞭解本發明之特徵及優點。
圖1圖解說明根據一些實施例之使用偏差變化(CID)評分評估個體中之腫瘤進展的實例性方法。
圖2圖解說明經程式化或以其他方式經構形以實施本文提供之方法之電腦系統。
圖3A-3B顯示根據一些實施例之臨床設置之概覽。圖3A顯示比較放射照相反應評估及cfDNA評估分子反應之潛在用途之圖。圖3B顯示研究中之患者之成像及血液收集之定時。
圖4A-4E顯示根據一些實施例之用於確定分子進展之ctDNA之連續評估。圖4A顯示針對患者LS030178檢測之CNA之全基因體圖。在治療開始前13天收集T0基線抽血，且在治療開始後21天收集T1。圖4B顯示與CNA相比，正規化片段長度展示相反之模式。圖4C顯示在每一基因體位置之正規化片段長度與推測之拷貝數之間總體上存在強負相關(Spearman’s rho=-0.57,P<1E-10)。圖4D顯示患者LS030178在隨訪時間點T1及T2具有TFR之增加，其在指示進行性疾病之成像之前係可檢測的。圖4E顯示對療法有反應之患者LS030093在T1及T2顯示TFR之顯著降低，與顯示部分反應之稍後成像一致。
圖5A-5C顯示根據一些實施例，在第一或第二療法週期之後之ctDNA評估預測進展。圖5A顯示第一次FUI時之成像結果(藉由RECIST 1.1評估之SLD)與分子進展之ctDNA評估的比較，該分子進展係由任一治療後樣品之TFR之確信增加指示(靈敏度=54%，特異性=100%，PPV=100%，NPV=85%)。腳注病例顯示明顯之臨床進展。圖5B顯示與PD或非PD之放射照相或臨床評估相比，在T1(左)及T2(右)時進展者及未進展者之TFR，此顯示在每一時間點之預測性能。圖5C顯示 對於分子進展之患者，分子進展之檢測較由標準護理成像檢測進展日期早之中值時間為40天(在-21至103天之範圍內)。
圖6A-6I顯示根據一些實施例，療程早期之分子反應評估與有利之PFS有關。圖6A顯示完整同類群組(n=92)具有211天之中值PFS。圖6B顯示在T1或T2自cfDNA檢測到分子進展之患者(n=14，中值PFS=62天)與無分子進展之患者(n=78，中值PFS=263天；HR=12.6[95% CI：5.8至27.3]；對數秩P<1E-10)相比具有顯著更差之PFS。圖6C-6D顯示基於接受有或無化學療法之免疫療法之患者(n=34；對數秩P=2E-12)(圖6C)、接受有或無靶向療法之化學療法之患者(n=42；對數秩P=7E-6)(圖6D)之治療模式的亞組分析。圖6E-6F顯示基於肺癌患者(n=40；對數秩P=8E-8)(圖6E)及乳癌患者(n=25；對數秩P=3E-4)(圖6F)之癌症類型之亞組分析。圖6G顯示在基於分子進展解釋預測後，具有MMR之患者具有顯著更長之PFS(Cox P=0.011)。圖6H-6I顯示具有穩定疾病或部分反應之患者之亞組分析，該部分反應藉由放射照相術在第一次FUI時測定(n=65)，藉由反應狀態(對數秩P=0.4)(圖6H)或MMR(對數秩P=0.02)(圖6I)分層。
圖7A-7B顯示根據一些實施例，甲基化可向CNA提供正交信號以用於反應監測。該等圖顯示基線(黑線)及T1或T2(橙線)時患者LS030083(圖7A)及LS030078(圖7B)在全基因體1百萬鹼基倉中之平均甲基化程度之分佈。
圖8顯示根據一些實施例之健康個體之縱向WGS資料。該圖包括全基因體圖，其顯示在初始抽血(上圖)及34天後(下圖)未檢測到參與者LB-S00129之CNA，如圖4A中所示。
圖9顯示根據一些實施例，定序方案間之腫瘤分數比之比較。該圖顯示來自13個參與者之20個處理後樣品之結果，該等樣品經WGS及WGBS兩者處理。在第一次FUI時具有PD之患者之兩個樣品具有不一致之分子進展分類，TFR之量測結果接近調用邊界(call boundary)。
圖10顯示根據一些實施例之樣品定時及靈敏度。該圖顯示在第一次FUI時患有PD之26名參與者之42個樣品的分子進展及血液樣品定時(雙樣品Kolmogorov-Smirnov測試，P=0.15)。
圖11顯示根據一些實施例之其他癌症之分子反應評估及PFS。該圖顯示非肺非乳癌(n=27；對數秩P=5E-6)，如圖6E-6F中所繪製。
圖12A-12B顯示根據一些實施例，在第一次FUI時非PD患者之MMR及PFS。該等圖顯示具有放射照相部分反應(n=30)(圖12A)或穩定疾病(n=35)(圖12B)之所有患者之結果。
圖13A-13B顯示根據一些實施例之患者同類群組中該三個患者類別(MP、MMR及既非MP亦非MMR)中之每一者的Kaplan-Meier無進展存活(PFS)及總體存活(OS)圖之實例。該等圖顯示存活曲線彼此高度分離。此外，分子進展之預測以高特異性預測放射照相進展。
圖14A-14C顯示根據一些實施例，在三個MAGE基因(MAGEA1、MAGEA3及MAGEA4)觀察到之甲基化之強平均降低之實例。
圖15A及15B顯示，定量療程中患者之多個樣品中特定拷貝數異常(CNA)之強度變化較不易於出現某些錯誤模式，該等錯誤模式係由基於CNA分開定量不同樣品中之腫瘤分數引起。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2019年12月24日提出申請之美國臨時專利申請案第62/953,368號及於2020年3月23日提出申請之第62/993,564號的優先權益，該等申請案中之每一者均以全文引用方式併入本文中。
ASCII文字檔案上之序列表之提交
以下ASCII文字檔案上提交之內容其整體內容以引用的方式併入本文中：電腦可讀形式(CRF)之序列表(檔案名稱：197102004840SEQLIST.TXT，記錄日期：2020年12月18日，大小：34KB)。
如本文所用，術語「核酸」或「多核苷酸」通常係指包含一或多個核酸亞基或核苷酸之分子。核酸可包括一或多個選自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)或其變體之核苷酸。核苷酸通常包括核苷及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個磷酸(PO3)基團。核苷酸可個別地或組合地包括核鹼基、五碳糖(核糖或去氧核糖)及一或多個磷酸基團。
核糖核苷酸係其中糖係核糖之核苷酸。去氧核糖核苷酸係其中糖係去氧核糖之核苷酸。核苷酸可為單磷酸核苷或多磷酸核苷。核苷酸可為多磷酸去氧核糖核苷，例如三磷酸去氧核糖核苷(dNTP)，其可選自三磷酸去氧腺苷(dATP)、三磷酸去氧胞嘧啶(dCTP)、三磷酸去氧鳥苷(dGTP)、三磷酸尿苷(dUTP)及三磷酸去氧胸苷(dTTP)dNTP，其包括可檢測標籤，例如發光標籤或標記(例如螢光團)。核苷酸可包括可併入生長 核酸鏈中之任何亞基。此亞基可為A、C、G、T或U，或特定於一或多個互補A、C、G、T或U或互補於嘌呤(亦即，A或G，或其變體)或嘧啶(亦即，C、T或U，或其變體)之任何其他亞基。在一些實例中，核酸係去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其衍生物或變體。核酸可為單鏈或雙鏈。核酸分子可為線性的、彎曲的或環狀的或其任一組合。
如本文所用，術語「核酸分子」、「核酸序列」、「核酸片段」、「寡核苷酸」及「多核苷酸」通常指可具有各種長度之多核苷酸，例如去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(RNA)或其類似物。核酸分子可具有至少約5個鹼基、10個鹼基、20個鹼基、30個鹼基、40個鹼基、50個鹼基、60個鹼基、70個鹼基、80個鹼基、90個、100個鹼基、110個鹼基、120個鹼基、130個鹼基、140個鹼基、150個鹼基、160個鹼基、170個鹼基、180個鹼基、190個鹼基、200個鹼基、300個鹼基、400個鹼基、500個鹼基、1千鹼基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb或50kb之長度，或其可具有上文所提及之值中之任兩者之間之任一數目的鹼基。寡核苷酸通常由四種核苷酸鹼基之特定序列構成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；以及胸腺嘧啶(T)(當多核苷酸係RNA時，尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶(T))。因此，術語「核酸分子」、「核酸序列」、「核酸片段」、「寡核苷酸」及「多核苷酸」至少部分意欲為多核苷酸分子之字母表示。或者，該等術語可應用於多核苷酸分子本身。此字母表示可輸入至具有中央處理單元之電腦中之資料庫中及/或用於生物資訊學應用，例如功能基因體學及同源性搜索。寡核苷酸可包括一或多個非標準核苷酸、核苷酸類似物及/或修飾之核苷酸。
如本文所用，術語「樣品」通常係指生物樣品。生物樣品 之實例包括核酸分子、胺基酸、多肽、蛋白質、碳水化合物、脂肪或病毒。在實例中，生物樣品係包括一或多個核酸分子之核酸樣品。核酸分子可為無細胞或無細胞核酸分子，例如無細胞DNA(cfDNA)或無細胞RNA(cfRNA)。核酸分子可源自多種來源，包括人類、哺乳動物、非人類哺乳動物、猿、猴、黑猩猩、爬行動物、兩棲動物或禽類來源。此外，樣品可自各種含有無細胞序列之動物流體中提取，該等動物流體包括但不限於體液樣品，例如血液、血清、血漿、玻璃體、痰、尿、眼淚、汗液、唾液、精液、黏膜分泌物、黏液、脊髓液、腦脊髓液(CSF)、胸水、腹膜液、羊水、淋巴液及諸如此類。無細胞多核苷酸(例如cfDNA)可為胎兒來源的(經由取自懷孕個體之液體)，或可源自個體本身之組織。
如本文所用，術語「個體」通常係指具有正經歷處理或分析之生物樣品之個體。個體可為動物或植物。個體可為哺乳動物，例如人類、狗、貓、馬、豬或齧齒類動物。個體可為患者，例如，患有或懷疑患有疾病，例如一或多種癌症(例如腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、肝膽道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、皮膚癌、尿路癌)、一或多種傳染病、一或多種遺傳病症或一或多種腫瘤、或其任一組合。對於患有或懷疑患有一或多種腫瘤之個體，腫瘤可為一或多種類型。
如本文所用，術語「全血」通常係指未分離成亞組分(例如，藉由離心)之血液樣品。血液樣品之全血可含有cfDNA及/或種系DNA。全血DNA(其可含有cfDNA及/或種系DNA)可自血液樣品提取。全血DNA定序讀數(其可含有cfDNA定序讀數及/或種系DNA定序讀數)可自全血DNA提取。
評估個體之無細胞DNA序列資料中之腫瘤進展
當取自個體之樣品之顯著部分(例如，>80%)來自或源自腫瘤細胞時，腫瘤進展之評估可為相對直接的。然而，在源自血液樣品之個體之血漿之無細胞DNA(cfDNA)製劑中，自cfDNA檢測腫瘤DNA及由此評估腫瘤進展可為不靈敏且有噪音之過程。由於來自非腫瘤DNA(例如，來自非腫瘤來源之種系細胞之種系DNA)之壓倒性信號，檢測腫瘤DNA及自該等不靈敏及/或有噪音之信號評估腫瘤進展可為具有挑戰性的。本揭示內容提供用於自獲自或源自個體(例如，患有癌症之患者)之樣品之cfDNA分子之無細胞DNA(cfDNA)序列資料(例如，cfDNA定序讀數)評估腫瘤進展的方法及系統。一旦自個體之樣品之分析接收cfDNA序列資料，可使用一或多種生物資訊學方法來評估個體之腫瘤進展或腫瘤未進展。在一些實施例中，自cfDNA檢測免疫細胞DNA，其可視情況用於評估腫瘤進展。
在一態樣中，本揭示內容提供評估患有癌症之個體之腫瘤進展的方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前；處理第一WGS資料以測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；處理第二WGS資料以測定(iii)第二複數個cfDNA 分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；處理第一複數個CNA以及第二複數個CNA以測定CNA概況變化；處理第一複數個片段長度以及第二複數個片段長度以測定片段長度概況變化；至少部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤進展。
圖1圖解說明根據一些實施例之評估個體中之腫瘤進展之實例性方法。在操作102中，獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料。第一複數個cfDNA分子可在第一時間點自個體之第一體液樣品獲得或衍生。第一時間點可在向個體投與經設計以治療癌症之治療劑之前。在操作104中，第一WGS資料經處理以測定(i)第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度。在操作106中，獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料。第二複數個cfDNA分子可在第二時間點自個體之第二體液樣品獲得或衍生。第二時間點可在向個體投與經設計以治療癌症之治療劑之後。在操作108中，第二WGS資料經處理以測定(i)第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度。在操作110中，處理第一複數個CNA以及第二複數個CNA(例如二者進行比較)以測定CNA概況變化。在操作112中，處理第一複數個片段長度以及第二複數個片段長度(例如二者進行比較)以測定片段長度概況變化。在操作114中，至少部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化測定個體在第一 時間點之第一腫瘤分數及/或個體在第二時間點之第二腫瘤分數。在操作116中，至少部分地基於第一腫瘤分數及或第二腫瘤分數檢測個體之腫瘤進展。
在一些實施例中，該等方法包含鑑別一或多個文庫(例如，其中可例如藉由使用CNA模式、或基於文庫來自對照樣品之事實，測定腫瘤分數)。對於每一文庫，可使用本文所述之甲基化定序自基因體之一或多個區(例如一個、一些或所有CpG島、啟動子等)計算甲基化狀態(例如平均甲基化分數)。可使用統計建模(例如，線性回歸或本揭示內容之另一技術)以例如使用留一參與者交叉驗證(leave-one-participant-out cross validation)針對甲基化模式對已知腫瘤分數進行正則化。不希望受理論之束縛，認為該等方法允許基於甲基化模式預測樣品之腫瘤分數，例如，甚至當CNA不可檢測時。在一些實施例中，該等方法進一步包含跨越兩個或更多個時間點比較上述分析。
舉例而言，可使用熟習此項技術者已知之任何適宜定序方法自cfDNA產生定序讀數。定序方法可為第一代定序方法(例如Maxam-Gilbert或Sanger定序)、或高通量定序(例如下一代定序或NGS)方法。高通量定序方法可同時(或實質上同時)對至少10,000、100,000、1百萬、10百萬、100百萬、十億或更多之多核苷酸分子進行定序。定序方法可包括(但不限於)：焦磷酸定序、合成定序、單分子定序、奈米孔定序、半導體定序、接合定序、雜交定序、數位基因表現(Helicos®)、大量平行定序(例如，Helicos®)、選殖單分子陣列(Solexa®/Illumina®)、使用PacBio®、SOLiD®、Ion Torrent®或Nanopore®平臺之定序。在一些實施例中，定序係藉由Nanopore定序、鏈終止(Sanger)定序、藉由合成之定 序(例如Illumina或Solexa定序)、單分子即時定序、大規模平行簽名定序、Polony定序、454焦磷酸定序、組合探針錨定合成、藉由接合之定序(SOLiD定序)或GenapSys定序。在一些實施例中，定序包括基於雜交捕獲之定序(基於雜交捕獲之NGS)，例如使用基於銜接子接合之文庫。參見(例如)G.M.等人(2013)Nat.Biotech.31：1023-1031。
在一些實施例中，定序方法包含亞硫酸氫鹽定序。亞硫酸氫鹽定序通常包含在定序前用亞硫酸氫鹽處理DNA，其將未甲基化之胞嘧啶轉化為尿嘧啶而不轉化5-甲基胞嘧啶，藉此允許檢測DNA甲基化狀態(儘管需要額外方法來區分5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶，如下所述)。亞硫酸氫鹽處理後可使用多種標準定序方法，包括對甲基化之檢測具有特異性或非特異性之方法。定序方法可包括(但不限於)焦磷酸定序、直接定序(例如，使用PCR)、高解析度解鏈分析、甲基化敏感單鏈構形分析、甲基化敏感單核苷酸引子延伸、鹼基特異性切割/MALDI-TOF、藉由微陣列之序列分析及甲基化特異性PCR。
在一些實施例中，定序方法包含氧化亞硫酸氫鹽定序。氧化亞硫酸氫鹽定序可用於藉由將5-羥甲基胞嘧啶化學氧化成5-甲醯基胞嘧啶來區分5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶，該5-甲醯基胞嘧啶可經由亞硫酸氫鹽處理轉化成尿嘧啶。
在一些實施例中，定序方法包含基於TET之甲基化定序，例如TET輔助之吡啶硼烷定序(TAPS)或TET輔助之亞硫酸氫鹽定序(TABS或TAB-Seq)。TAB-Seq允許藉由使用10-11易位(TET)雙加氧酶來拆分5-羥甲基胞嘧啶。在實例性方法中，β-葡萄糖基轉移酶(βGT)用於將5-羥甲基胞嘧啶轉化為β-葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶(其阻斷藉由TET之進一步修 飾及藉由亞硫酸氫鹽之氧化)，且TET酶用於將5-羥甲基胞嘧啶氧化成5-羧基胞嘧啶，其對經由亞硫酸氫鹽之尿嘧啶轉化敏感。參見(例如)Yu,M.等人(2012)Cell 149：1368-1380。對於TAPS，TET酶用於將5-甲基胞嘧啶及5-羥甲基胞嘧啶氧化為5-羧基胞嘧啶，然後吡啶硼烷還原將5-羧基胞嘧啶轉化為二氫尿嘧啶(DHU)，其可經由PCR讀作胸腺嘧啶。參見(例如)Liu,Y.等人(2019)Nat.Biotechnol.37：424-429。
在一些實施例中，定序方法包含氧化亞硫酸氫鹽定序(oxBS-Seq)。在該方法中，過釕酸鉀可用於將5-羥甲基胞嘧啶轉化為5-甲醯基胞嘧啶而不影響5-甲基胞嘧啶。然後，亞硫酸氫鹽處理可將5-甲醯基胞嘧啶轉化為尿嘧啶。
在一些實施例中，定序方法包含APOBEC耦合之表觀遺傳定序(ACE-seq)。在該方法中，載脂蛋白B mRNA編輯酶亞基3A(APOBEC3A)用於使胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶去胺基並將其作為胸腺嘧啶定序，而β-葡萄糖基轉移酶(βGT)用於將5-羥甲基胞嘧啶轉化為β-葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶(其阻斷藉由APOBEC脫胺基)。
在一些實施例中，定序方法包含甲基化DNA免疫沈澱定序，例如甲基化DNA免疫沈澱(MeDIP)或羥甲基化DNA免疫沈澱(hMeDIP)定序。在該等技術中，藉由免疫沈澱、之後純化及定序，使用對5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶具有特異性之抗體自總DNA分離甲基化DNA。
在一些實施例中，定序方法包含甲基化陣列。在該方法中，微陣列技術可用於查詢多個基因體基因座之甲基化狀態。舉例而言，DNA可用亞硫酸氫鹽處理，且寡核苷酸探針可經設計以檢測相同基因座 之未甲基形式化(藉由檢測尿嘧啶)或甲基化形式(藉由檢測胞嘧啶)。檢測哪個探針與序列雜交，鑑別該序列是否甲基化。
在一些實施例中，定序方法包含簡化代表性亞硫酸氫鹽定序(RRBS-Seq)。在該方法中，用甲基化不敏感之限制性內切酶(例如MspI)消化DNA，且在黏性末端修復及A-曳尾後將序列銜接子添加至片段上。然後可用二硫化物處理DNA，藉由PCR擴增，並定序。參見(例如)Meissner,A.等人(2005)Nucleic Acids Res.33：5868-5877。
在一些實施例中，定序方法包含胞嘧啶5-羥甲基化定序，例如hMe-Seal。在該方法中，β-葡萄糖基轉移酶(βGT)用於將含有疊氮基之葡萄糖部分轉移至5-羥甲基胞嘧啶上，其可用生物素化學修飾以允許DNA片段之檢測、親和富集及定序。參見(例如)Song,C.X.等人(2011)Nat.Biotechnol.29：68-72。
在一些實施例中，定序包含全基因體定序(WGS)。定序可以足以評估個體中之腫瘤進展或腫瘤無進展之深度以期望性能(例如準確度、靈敏度、特異性、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)或接收者操作者特徵(ROC)之曲線下面積(AUC))實施。在一些實施例中，定序以「低通」方式、例如以不超過約12X、不超過約11X、不超過約10X、不超過約9X、不超過約8X、不超過約7X、不超過約6X、不超過約5X、不超過約4X、不超過約3.5X、不超過約3X、不超過約2.5X、不超過約2X、不超過約1.5X或不超過約1X之深度實施。
在一些實施例中，評估個體中之腫瘤進展或腫瘤無進展可包含比對cfDNA定序讀數與參考基因體。參考基因體可包含基因體(例如，人類基因體)之至少一部分。參考基因體可包含完整基因體(例如，完 整人類基因體)。參考基因體可包含應用某些鹼基轉化之完整基因體(例如，非甲基化胞嘧啶轉換成胸腺嘧啶之完整人類基因體)，如可用於甲基化資料比對。參考基因體可包含資料庫，該資料庫包含對應於基因體之編碼及/或非編碼基因體區之複數個基因體區。資料庫可包含複數個基因體區，其對應於基因體之癌症相關(或腫瘤相關)編碼及/或非編碼基因體區，例如癌症驅動突變(例如，單核苷酸變體(SNV)、拷貝數改變(CNA)、插入或缺失(插入缺失(indel))及其他重排、融合基因及基因體區(例如單核苷酸及/或二核苷酸))。可使用Burrows-Wheeler算法(BWA)、Sambamba算法、samtools算法或任何其他適宜比對算法實施比對。
在一些實施例中，評估個體中之腫瘤進展或腫瘤無進展可包含生成複數個基因體區中之每一者之cfDNA定序讀數的定量量度。可生成cfDNA定序讀數之定量量度，例如與給定基因體區比對之DNA定序讀數之計數。對具有與給定基因體區比對之定序讀數之一部分或全部之CfDNA定序讀數可計入該基因體區之定量量度。
在一些實施例中，基因體區可包含腫瘤標記。特異性及非特異性基因體區之模式可指示腫瘤進展或腫瘤無進展狀態。基因體區之該等模式隨時間之變化可指示腫瘤進展或腫瘤無進展狀態之變化。
在一些實施例中，可藉由在複數個基因體區中之每一者處實施複數個cfDNA分子之結合量測來分析cfDNA。在一些實施例中，實施結合量測包含使用對複數個cfDNA分子中複數個基因體區之至少一部分具有選擇性的探針分析複數個cfDNA分子。在一些實施例中，探針係具有與複數個基因體區之核酸序列具有序列互補性的核酸分子。在一些實施例中，核酸分子係引子或富集序列。在一些實施例中，分析包含使用陣列雜 交或聚合酶鏈式反應(PCR)或核酸定序。
在一些實施例中，該方法進一步包含富集複數個基因體區之至少一部分之複數個cfDNA分子。在一些實施例中，富集包含擴增複數個cfDNA分子。舉例而言，可藉由選擇性擴增(例如，藉由使用包含與複數個基因體區之核酸序列具有序列互補性之核酸分子的一組引子或探針)來擴增複數個cfDNA分子。或者或組合地，可藉由通用擴增(例如，藉由使用通用引子)來擴增複數個cfDNA分子。在一些實施例中，富集包含選擇性分離複數個cfDNA分子之至少一部分(例如，富集較短cfDNA分子之複數個cfDNA分子之一部分)。
在一些實施例中，本揭示內容之方法包含獲得(例如)片段長度、核苷酸數目等之一或多個定量量度。在一些實施例中，定量量度係統計量度。適宜統計量度為業內已知。舉例而言，在一些實施例中，偏差之統計量度包含相對於一組參考樣品或一組參考值(例如，一組基線值)之z評分。
在一些實施例中，評估個體中之腫瘤進展或腫瘤無進展之方法包含處理複數個計數以獲得複數個cfDNA分子之片段長度之定量量度(例如，統計量度)。在一些實施例中，複數個cfDNA分子之片段長度之定量量度包含複數個cfDNA分子中每一者之核苷酸數目。參考樣品可自一或多個具有腫瘤進展之個體及/或自無腫瘤進展之個體(例如，具有腫瘤無進展之個體或未受影響之患者)獲得。參考樣品可自一或多個患有癌症類型之個體或自無癌症類型(例如腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、腎癌、肝膽道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、甲狀腺癌、尿 路癌)之個體獲得。參考樣品可自一或多個患有晚期癌症或無晚期癌症(例如，早期癌症或無癌症)之個體獲得。
在一些實施例中，可正規化或校正cfDNA定序讀數。舉例而言，cfDNA定序讀數可經去重複、正規化及/或校正以解釋定序及文庫製備中之已知偏差及/或定序及文庫製備中之已知偏差。在一些實施例中，可例如基於該等定量量度(例如，跨越不同時間點)之變化是否與未受影響之個體中觀察到之彼等變化(例如，cfDNA分子之背景概況)顯著不同，過濾出定量量度(例如，統計量度)之亞組。舉例而言，當定量量度之z評分之絕對值小於(或不大於)預定數值時，可過濾掉定量量度。預定數值可為約0.1、約0.2、約0.5、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5或超過約5。
在一些實施例中，複數個基因體區包含單核苷酸及/或二核苷酸。複數個基因體區可包含至少約10個不同基因體區、至少約50個不同基因體區、至少約100個不同基因體區、至少約500個不同基因體區、至少約1千個不同基因體區、至少約5千個不同基因體區、至少約10千個不同基因體區、至少約50千個不同基因體區、至少約100千個不同基因體區、至少約500千個不同基因體區、至少約1百萬個不同基因體區、至少約2百萬個不同基因體區、至少約3百萬個不同基因體區、至少約4百萬個不同基因體區、至少約5百萬個不同基因體區、至少約10百萬個不同基因體區、至少約15百萬個不同基因體區、至少約20百萬個不同基因體區、至少約25百萬個不同基因體區、至少約30百萬個不同基因體區或超過30百萬個不同基因體區。
在一些實施例中，基因體區包含一或多個MAGE(黑素瘤 相關之抗原)基因，例如人類MAGE基因。在一些實施例中，基因體區包含一或多個對應於一或多個MAGE(黑色素瘤相關之抗原)基因(例如人類MAGE基因)之啟動子。MAGE基因(例如人類MAGE基因)為業內已知；參見(例如)Chomez,P.等人(2001)Cancer Res.61：5544-5551，以及Weon,J.L.及Potts,P.R.(2015)Curr.Opin.Cell Biol.37：1-8。實例性MAGE基因(例如人類MAGE基因)包括(但不限於)MAGE-A基因(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A2B、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11及MAGE-A12)、MAGE-B基因(例如MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-B6B、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGE-B17及MAGE-B18)、MAGE-C基因(例如MAGE-C1、MAGE-C2及MAGE-C3)及II型MAGE基因(例如MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D3、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-G1、MAGE-H1、MAGE-L2、NDN及NDNL2)。
在一些實施例中，以至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之靈敏度檢測個體之腫瘤進展。
在一些實施例中，以至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之特異性檢測個體之腫瘤進展。
在一些實施例中，以至少約10%、至少約20%、至少約 30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤進展。
在一些實施例中，以至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤進展。
在一些實施例中，以至少約0.5、至少約0.6、至少約0.7、至少約0.75、至少約0.8、至少約0.85、至少約0.9、至少約0.95、至少約0.96、至少約0.97、至少約0.98或至少約0.99之接收者操作者特徵(ROC)之曲線下面積檢測個體之腫瘤進展。
在一些實施例中，評估個體中之腫瘤進展之方法進一步包含當未檢測到腫瘤進展時，確定腫瘤無進展。
在一些實施例中，以至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之靈敏度檢測個體之腫瘤無進展。
在一些實施例中，以至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之特異性檢測個體之腫瘤無進展。
在一些實施例中，以至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約 80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之陽性預測值(PPV)檢測個體之腫瘤無進展。
在一些實施例中，以至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之陰性預測值(NPV)檢測個體之腫瘤無進展。
在一些實施例中，以至少約0.5、至少約0.6、至少約0.7、至少約0.75、至少約0.8、至少約0.85、至少約0.9、至少約0.95、至少約0.96、至少約0.97、至少約0.98或至少約0.99之接收者操作者特徵(ROC)之曲線下面積(AUC)檢測個體之腫瘤無進展。
在一些實施例中，個體經診斷患有癌症。舉例而言，癌症可為一或多種類型，包括(但不限於)：腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、腎癌、肝膽道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、甲狀腺癌或尿路癌。
在一些實施例中，該方法進一步包含基於所測定之個體之腫瘤進展，投與治療有效量之治療以治療個體之腫瘤。在一些實施例中，治療包含用手術、化學療法、治療劑、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑之治療。
可評估個體之腫瘤進展或腫瘤無進展以確定個體中癌症之診斷、癌症之預後、癌症之復發或腫瘤之進展或消退之指示。此外，可基 於腫瘤進展或腫瘤無進展評估或監測(例如，兩個或更多個時間點之間之腫瘤進展或腫瘤無進展狀態之差異)來分配一或多個臨床結果。該等臨床結果可包括診斷個體患有包含一或多種類型之腫瘤之癌症、診斷個體患有包含一或多種類型及階段之腫瘤之癌症、預後個體患有癌症(例如，指示個體之臨床療程(例如，手術、化學療法、治療劑、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑或其他治療)、指示另一臨床作用過程(例如，無治療、繼續監測，諸如在規定之時間間隔基礎上，停止當前治療、切換至另一治療)、或指示個體之預期存活時間。
在一些實施例中，評估個體之腫瘤進展之方法進一步包含第一複數個CNA以及第二複數個CNA處理以測定CNA概況變化。在一些實施例中，評估個體之腫瘤進展之方法進一步包含處理第一複數個片段長度以及第二複數個片段長度以測定片段長度概況變化。在一些實施例中，評估個體之腫瘤進展之方法進一步包含至少部分地基於CNA概況變化及片段長度概況變化，測定個體在第一時間點之第一腫瘤分數或個體在第二時間點之第二腫瘤分數。在一些實施例中，評估個體之腫瘤進展之方法進一步包含至少部分地基於第一腫瘤分數或第二腫瘤分數檢測個體之腫瘤進展。舉例而言，可基於第一腫瘤部分或第二腫瘤部分是否滿足預定準則(例如，至少為預定臨限值、大於預定臨限值、至多為預定臨限值或小於預定臨限值)來確定腫瘤進展。可藉由對自一或多個參考個體(例如，已知具有特定腫瘤類型之患者、已知具有特定階段之特定腫瘤類型之患者或未展示任何癌症之健康個體)獲得或衍生之一或多個參考樣品實施腫瘤進展 或腫瘤無進展評估，並基於自參考個體獲得或衍生之參考樣品之腫瘤進展或腫瘤無進展來鑑別適宜預定臨限值，來產生預定臨限值。
可基於評估個體之腫瘤進展或腫瘤無進展狀態之期望靈敏度、特異性、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)或準確度來調整預定臨限值。舉例而言，若期望評估個體之腫瘤進展或腫瘤無進展狀態之高靈敏度，則可將預定臨限值調整為更低。或者，若需要評估個體之腫瘤進展或腫瘤無進展狀態之高特異性，則可將預定臨限值調整為更高。可調整預定臨限值，以便在評估自一或多個參考個體獲得或衍生之包含一或多種類型之腫瘤之癌症中，實現偽陽性(FP)及偽陰性(FN)之間之期望平衡。
在一些實施例中，評估腫瘤進展或腫瘤無進展之方法進一步包含在第二較晚時間點重複評估。可選擇第二時間點以相對於第一時間點進行腫瘤進展或腫瘤無進展評估之適宜比較。第二時間點之實例可對應於手術切除後之時間、治療投與期間或治療投與後治療個體之癌症以監測治療效能之時間、或治療後個體之癌症不可檢測以監測個體之殘存疾病或癌症復發後之時間。
在一些實施例中，本揭示內容之方法包括確定兩個或更多個不同時間點之狀態(例如，腫瘤進展或腫瘤無進展狀態)之差異。各時間點之間之狀態差異(例如，比較較早點之狀態與較晚或當前點之狀態)可用於例如指示腫瘤之進展、消退、復發或穩定狀態。在一些實施例中，可繪製狀態隨時間之差異之圖，例如以便表示腫瘤之進展、消退、復發或穩定狀態。舉例而言，在一些實施例中，評估腫瘤進展或腫瘤無進展之方法進一步包含測定第一腫瘤進展/腫瘤無進展狀態與第二腫瘤進展/腫瘤無進展狀態之間之差異。在一些實施例中，差異指示個體之腫瘤之進展或消退。 或者或組合地，該方法可進一步包含藉由電腦處理器生成第一腫瘤進展/腫瘤無進展狀態及第二腫瘤進展/腫瘤無進展狀態隨著第一時間點及第二時間點變化之圖。在一些實施例中，該圖指示個體之腫瘤之進展或消退。舉例而言，電腦處理器可生成Y軸上之兩個或更多個腫瘤進展/腫瘤無進展狀態相對於X軸上之與對應於兩個或更多個腫瘤進展或腫瘤無進展狀態之資料之收集時間對應之時間的圖。
腫瘤狀態隨時間之差異，例如如上所述測定或繪製之第一腫瘤進展/無進展狀態與第二腫瘤進展/無進展狀態之間之差異，可指示個體中腫瘤之進展、消退、復發或穩定狀態。舉例而言，若晚期腫瘤進展/無進展狀態(例如，第二狀態)大於早期腫瘤進展/無進展狀態(例如，第一狀態)，則該差異可指示(例如)腫瘤進展、個體中腫瘤之治療無效、腫瘤對進行中之治療之抗性、腫瘤轉移至個體中之其他部位、或個體中之殘存疾病或癌症復發。若晚期腫瘤進展/無進展狀態(例如，第二狀態)小於早期腫瘤進展/無進展狀態(例如，第一狀態)，則該差異可指示(例如)腫瘤消退、個體中腫瘤之手術切除之效能、個體中腫瘤之治療之效能、或個體中無殘存疾病或癌症復發。
在評估及/或監測腫瘤進展或腫瘤無進展狀態之後，可基於腫瘤進展或腫瘤無進展狀態評估或監測(例如，兩個或更多個時間點之間之腫瘤進展或腫瘤無進展狀態之差異)來分配一或多個臨床結果。該等臨床結果可包括診斷個體患有包含一或多種類型之腫瘤之癌症、診斷個體患有包含一或多種類型及階段之腫瘤之癌症、預後個體患有癌症(例如，指示個體之臨床療程(例如，手術、化學療法、治療劑、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制 劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體、檢查點抑制劑或其他治療)、或鑑別個體內之腫瘤cDNA之來源、指示另一臨床作用過程(例如，無治療、繼續監測，諸如在規定之時間間隔基礎上，停止當前治療、切換至另一治療)、或指示個體之預期存活時間。
治療
本揭示內容之某些態樣係關於(例如)用一或多種治療劑之治療。舉例而言，在一些實施例中，治療可包括用手術、化學療法、治療劑、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑之治療。本文提供治療之實例性及非限制性說明。
舉例而言，治療可用細胞毒性劑或細胞生長抑制劑。實例性細胞毒性劑包括抗微管劑、拓樸異構酶抑制劑、紫杉烷、抗代謝物、有絲分裂抑制劑、烷基化劑、嵌入劑、能夠干擾信號轉導路徑之試劑及促進細胞凋亡及輻射之試劑。在其他實施例中，該等方法可與免疫調節劑(例如IL-1、2、4、6或12、或干擾素α或γ)或免疫細胞生長因子(例如GM-CSF)組合使用。
在一些實施例中，治療可為免疫治療或免疫調節療法，例如基於化合物、抗體或細胞之免疫療法。免疫療法之實例包括(但不限於)檢查點抑制劑、癌症疫苗、基於細胞之療法、基於T細胞受體(TCR)之療法、輔助免疫療法、細胞介素免疫療法或溶瘤病毒療法。在一些實施例中，癌症免疫療法包含小分子、核酸、多肽、碳水化合物、毒素、基於細胞之或結合劑治療劑。癌症免疫療法之實例在下文中更詳細地闡述，但不 意欲具有限制性。
在一些實施例中，癌症免疫療法包括以下中之一或多者：檢查點抑制劑、癌症疫苗、基於細胞之療法、基於T細胞受體(TCR)之療法、輔助免疫療法、細胞介素免疫療法及溶瘤病毒療法。在一些實施例中，癌症免疫療法包含小分子、核酸、多肽、碳水化合物、毒素、基於細胞之或結合劑治療劑。癌症免疫療法之實例在下文中更詳細地闡述，但不意欲具有限制性。在一些實施例中，癌症免疫療法活化免疫系統之一或多個態樣以攻擊表現本揭示內容之新抗原之細胞(例如，腫瘤細胞)。根據醫學判斷，考慮本揭示內容之癌症免疫療法用作單一療法，或在包含任何組合或數量之兩種或更多種之組合方法中使用。發現任何癌症免疫療法(視情況作為單一療法或與本文所述之另一癌症免疫療法或其他治療劑組合)可用於本文所述之任何方法中。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含癌症疫苗。已測試多種癌症疫苗，其採用不同方法來促進針對腫瘤之免疫反應(例如，參見Emens L A,Expert Opin Emerg Drugs 13(2)：295-308(2008)及US20190367613)。已設計增強B細胞、T細胞或專職抗原呈遞細胞針對腫瘤之反應之方法。癌症疫苗之實例性類型包括(但不限於)基於DNA之疫苗、基於RNA之疫苗、病毒轉導疫苗、基於肽之疫苗、樹突細胞疫苗、溶瘤病毒、全腫瘤細胞疫苗、腫瘤抗原疫苗等。在一些實施例中，癌症疫苗可為預防性的或治療性的。在一些實施例中，癌症疫苗經調配為基於肽之疫苗、基於核酸之疫苗、基於抗體之疫苗或基於細胞之疫苗。舉例而言，疫苗組合物可包括陽離子脂質調配物中之裸cDNA；脂肽(例如，Vitiello,A.等人，J.Clin.Invest.95：341,1995)、裸cDNA或肽，其例如囊 封於聚(DL-乳酸交酯-共-乙交酯)(「PLG」)微球體中(例如，參見Eldridge等人，Molec.Immunol.28：287-294,1991：Alonso等人，Vaccine 12：299-306,1994；Jones等人，Vaccine 13：675-681,1995)；包含於免疫刺激複合物(ISCOMS)中之肽組合物(例如Takahashi等人，Nature 344：873-875,1990；Hu等人，Clin.Exp.Immunol.113：235-243,1998)；或多抗原肽系統(MAP)(例如，參見Tam,J.P.,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.85：5409-5413,1988；Tam,J.P.,J.Immunol.Methods 196：17-32,1996)。在一些實施例中，癌症疫苗經調配為基於肽之疫苗、或其中核酸編碼多肽之基於核酸之疫苗。在一些實施例中，癌症疫苗經調配為基於抗體之疫苗。在一些實施例中，癌症疫苗經調配為基於細胞之疫苗。在一些實施例中，癌症疫苗係肽癌症疫苗，其在一些實施例中係個性化肽疫苗。在一些實施例中，癌症疫苗係多價長肽、多肽、肽混合物、雜合肽或肽脈衝樹突狀細胞疫苗(例如，參見Yamada等人，Cancer Sci,104：14-21)，2013)。在一些實施例中，該等癌症疫苗增強抗腫瘤反應。
在一些實施例中，癌症疫苗選自西普魯塞-T(sipuleucel-T)(Provenge®,Dendreon/Valeant Pharmaceuticals)，其已經批准用於治療無症狀或最低症狀之轉移性去勢抵抗性(激素難治性)前列腺癌；及塔裡莫拉維克病毒(talimogene laherparepvec)(Imlygic®,BioVex/Amgen，先前稱為T-VEC)，一種經批准用於治療黑色素瘤中不可切除之皮膚、皮下及結節病灶之經遺傳修飾之溶瘤病毒療法。在一些實施例中，癌症疫苗選自溶瘤病毒療法，例如派替德瓦(pexastimogene devacirepvec)(PexaVec/JX-594,SillaJen/以前稱為Jennerex Biotherapeutics)，一種用於肝細胞癌(NCT02562755)及黑色素瘤(NCT00429312)之經工程化以表 現GM-CSF之胸苷激酶-(TK-)缺乏牛痘病毒；佩拉瑞爾普(pelareorep)(Reolysin®,Oncolytis Biotech)，一種呼吸道腸道孤兒病毒(裡奧病毒(reovirus))之變體，其在各種癌症中不在未被RAS活化之細胞中複製，該等癌症包括結腸直腸癌(NCT01622543)、前列腺癌(NCT01619813)、頭頸部鱗狀細胞癌(NCT01166542)、胰臟腺癌(NCT00998322)、及非小細胞肺癌(NSCLC)(NCT 00861627)；艾納登圖西病毒(enadenotucirev)(NG-348,PsiOxus，以前稱為ColoAdl)，一種經工程化以在以下疾病中表現全長CD80及T細胞受體CD3蛋白特異性抗體片段之腺病毒：卵巢癌(NCT02028117)；轉移性或晚期上皮腫瘤，例如結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌及唾液腺癌(NCT02636036)；ONCOS-102(Targovax/以前稱為Oncos)，一種經工程化以在以下疾病中表現GM-CSF之腺病毒：黑色素瘤(NCT03003676)；及腹膜疾病、結腸直腸癌或卵巢癌(NCT02963831)；GL-ONC1(GLV-1h68/GLV-1h153,Genelux GmbH)，經工程化以分別表現β-半乳糖苷酶(β-gal)/β-糖醛酸糖苷酶或β-gal/人類碘化鈉同向運輸蛋白(hNIS)之牛痘病毒，其係在腹膜癌(NCT01443260)；輸卵管癌、卵巢癌(NCT 02759588)中進行研究；或CG0070(Cold Genesys)，一種經工程化以在膀胱癌(NCT02365818)中表現GM-CSF之腺病毒；抗gp100；STINGVAX；GVAX；DCVaxL；及DNX-2401。在一些實施例中，癌症疫苗選自JX-929(SillaJen/先前稱為Jennerex Biotherapeutics)，一種經工程化以表現胞嘧啶去胺酶之TK-及牛痘生長因子缺陷牛痘病毒，該胞嘧啶去胺酶能夠將前藥5-氟胞嘧啶轉化成細胞毒性藥物5-氟尿嘧啶；TGO1及TG02(Targovax/先前稱為Oncos)，靶向難以治療之RAS突變之基於肽之免疫治療劑；及TILT-123(TILT Biotherapeutics)，一種命名為以下之工程化腺病毒：Ad5/3-E2F-δ24-hTNFα-IRES-hIL20；及VSV-GP(ViraTherapeutics)，一種經工程化以表現淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)之醣蛋白(GP)的水疱性口炎病毒(VSV)，其可進一步經工程化以表現經設計以引起抗原特異性CD8+ T細胞反應的抗原。在一些實施例中，癌症疫苗包括基於載體之腫瘤抗原疫苗。基於載體之腫瘤抗原疫苗可用作提供穩定之抗原供應以刺激抗腫瘤免疫反應之方式。在一些實施例中，將編碼腫瘤抗原之載體注射至患者中(可能與促炎劑或其他引誘劑(例如GM-CSF)一起)，在活體內由細胞攝取以產生特異性抗原，然後其將激發期望免疫反應。在一些實施例中，載體可用於一次遞送多於一種腫瘤抗原，以增加免疫反應。此外，重組病毒、細菌或酵母載體應觸發其自身免疫反應，此亦可增強總體免疫反應。
在一些實施例中，癌症疫苗包含基於DNA之疫苗。在一些實施例中，基於DNA之疫苗可用於刺激抗腫瘤反應。直接注射之編碼抗原蛋白之DNA引起保護性免疫反應之能力已在許多實驗系統中得到證實。藉由直接注射編碼抗原蛋白之DNA以引發保護性免疫反應之疫苗接種通常產生細胞介導之反應及體液反應二者。此外，已報導在小鼠中對編碼各種抗原之DNA之可再現之免疫反應基本上持續動物之一生(例如，參見Yankauckas等人(1993)DNA Cell Biol.,12：771-776)。在一些實施例中，將包括編碼與基因表現所需之調節元件可操作地連接之蛋白質之序列的質體(或其他載體)DNA投與給個體(例如人類患者、非人類哺乳動物等)。在一些實施例中，個體之細胞攝取投與之DNA並表現編碼序列。在一些實施例中，如此產生之抗原成為免疫反應所針對之靶標。
在一些實施例中，癌症疫苗包含基於RNA之疫苗。在一些 實施例中，基於RNA之疫苗可用於刺激抗腫瘤反應。在一些實施例中，基於RNA之疫苗包含自我複製RNA分子。在一些實施例中，自我複製RNA分子可為α病毒源RNA複製子。自我複製RNA(或「SAM」)分子為業內熟知，且可藉由使用源自例如α病毒之複製元件並用編碼目標蛋白之核苷酸序列取代結構病毒蛋白來產生。自我複製RNA分子通常係可在遞送至細胞後直接轉譯之+鏈分子，且此轉譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，其然後自遞送之RNA產生反義及有義轉錄本。因此，所遞送之RNA使得產生多個子代RNA。該等子代RNA以及共線亞基因體轉錄本可自身轉譯以提供編碼多肽(即包含HPV抗原)之原位表現，或可轉錄以提供與遞送之RNA同義之其他轉錄本，其經轉譯以提供抗原之原位表現。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含基於細胞之療法。在一些實施例中，癌症免疫療法包含基於T細胞之療法。在一些實施例中，癌症免疫療法包含過繼性療法，例如基於過繼性T細胞之療法。在一些實施例中，T細胞對於接受者係自體的或同種異體的。在一些實施例中，T細胞係CD8+ T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD4+ T細胞。過繼免疫治療係指用於治療癌症或傳染病之治療方法，其中將免疫細胞投與宿主，目標係細胞直接或間接介導對腫瘤細胞之特異性免疫(即，發動針對腫瘤細胞之免疫反應)。在一些實施例中，免疫反應導致腫瘤及/或轉移性細胞生長及/或增殖之抑制，且在相關實施例中導致贅瘤細胞死亡及/或再吸收。免疫細胞可源自不同生物體/宿主(外源免疫細胞)或可為自個體生物體獲得之細胞(自體免疫細胞)。在一些實施例中，免疫細胞(例如，自體或同種異體T細胞(例如，調節性T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或γ-δ T細胞)、NK細胞、不變之NK細胞或NKT細胞)可經遺傳工程化以表現抗 原受體，例如工程化TCR及/或嵌合抗原受體(CAR)。舉例而言，宿主細胞(例如，自體或同種異體T細胞)經修飾以表現對癌症抗原具有抗原特異性之T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，NK細胞經工程化以表現TCR。NK細胞可進一步經工程化以表現CAR。可將多種CAR及/或TCR(例如針對不同抗原之CAR及/或TCR)添加至單一細胞類型(例如T細胞或NK細胞)中。在一些實施例中，細胞包含經由遺傳工程化引入之編碼一或多種抗原受體之一或多種核酸/表現構築體/載體，以及此類核酸之遺傳工程化產物。在一些實施例中，核酸係異源的，即通常不存在於細胞或自細胞獲得之樣品中，例如自另一生物體或細胞獲得之樣品，其例如通常不在工程化細胞及/或該細胞所源自之生物體中發現。在一些實施例中，核酸並非天然存在的，例如在自然界中未發現之核酸(例如嵌合)。在一些實施例中，免疫細胞之群體可自需要療法或患有與免疫細胞活性降低相關之疾病之個體獲得。因此，細胞對於需要療法之個體係自體的。在一些實施例中，免疫細胞之群體可自供體(例如組織相容性匹配之供體)獲得。在一些實施例中，免疫細胞群體可自外周血、臍帶血、骨髓、脾或免疫細胞駐存於該個體或供體中之任何其他器官/組織收穫。在一些實施例中，免疫細胞可自個體及/或供體之池中分離，例如自彙集之臍帶血中分離。在一些實施例中，當免疫細胞之群體自與個體不同之供體獲得時，供體可為同種異體的，條件係獲得之細胞係個體相容的，此乃因其可引入個體中。在一些實施例中，同種異體供體細胞可為或可不為人類白血球抗原(HLA)相容的。在一些實施例中，為了使個體相容，可處理同種異體細胞以降低免疫原性。
在一些實施例中，基於細胞之療法包含基於T細胞之療 法。在過去二十年中已闡述用於功能性抗腫瘤效應細胞之衍生、活化及擴增之若干基本方法。該等細胞包括：自體細胞，例如腫瘤浸潤淋巴球(TIL)；使用自體DC、淋巴球、人工抗原呈遞細胞(APC)或用T細胞配體及活化抗體塗覆之珠粒離體活化之T細胞，或藉助捕獲靶細胞膜分離之細胞；天然表現抗宿主腫瘤T細胞受體(TCR)之同種異體細胞；及非腫瘤特異性自體或同種異體細胞，其經遺傳重程式化或「重定向」以表現展示稱為「T-體」之抗體樣腫瘤識別能力的腫瘤反應性TCR或嵌合TCR分子。在一些實施例中，T細胞源自血液、骨髓、淋巴、臍帶或淋巴器官。在一些態樣中，細胞係人類細胞。在一些實施例中，細胞係原代細胞，例如直接自個體分離及/或自個體分離並冷凍之彼等細胞。在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型之一或多個亞組，例如完整T細胞群體、CD4+細胞、CD8+細胞及其亞群體，例如由功能、活化狀態、成熟度、分化潛能、擴增、再循環、定位及/或持久性能力、抗原特異性、抗原受體類型、特定器官或區室中之存在、標記或細胞介素分泌概況及/或分化程度所定義之彼等。在一些實施例中，細胞可為同種異體及/或自體的。在一些實施例中，例如對於現成技術，細胞係多潛能及/或多效能的，例如幹細胞，例如誘導之多潛能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，方法包括自個體分離細胞，如本文所述對其製備、處理、培養及/或工程化，以及在冷凍保存之前或之後將其重新引入同一患者。在一些實施例中，T細胞之亞型及亞群體(例如，CD4+及/或CD8+ T細胞)係未經處置之T(TN)細胞、效應T細胞(TEFF)；記憶T細胞及其亞型，例如幹細胞記憶T(TSCM)、中樞記憶T(TCM)、效應記憶T(TEM)或終末分化之效應記憶T細胞；腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、不成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細 胞、黏膜相關之不變T(MAIT)細胞、天然存在及適應性調節T(Treg)細胞、輔助T細胞，例如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助T細胞、α/β T細胞及δ/γ T細胞。在一些實施例中，T細胞群體中之一或多者富集或耗盡對特定標記(例如表面標記)呈陽性或對特定標記呈陰性之細胞。在一些實施例中，該等標記係在T細胞(例如，非記憶細胞)之某些群體上不存在或以相對低程度表現，但在其他T細胞(例如，記憶細胞)之某些群體上存在或以相對較高程度表現之彼等。在一些實施例中，藉由負向選擇在非T細胞(例如B細胞、單核球或其他白血球，例如CD 14)上表現之標記，自PBMC樣品中分離T細胞，在一些實施例中，使用CD4+或CD8+選擇步驟分離CD4+輔助細胞及CD8+細胞毒性T細胞。藉由對在一或多種未經處置之、記憶及/或效應T細胞亞群體上表現或表現至相對較高程度之標記進行正向或負向選擇，可將該等CD4+及CD8+群體進一步分類為亞群體。在一些實施例中，例如藉由基於與各別亞群體相關之表面抗原進行正向或負向選擇，進一步富集或耗盡未經處置之、中樞記憶、效應記憶及/或中樞記憶幹細胞之CD8+ T細胞。在一些實施例中，T細胞係自體T細胞。在該方法中，自患者獲得腫瘤樣品並獲得單細胞懸浮液。單細胞懸液可以任何適宜方式獲得，例如機械地獲得(使用例如gentleMACSTM Dissociator,Miltenyi Biotec,Auburn,Calif.使腫瘤解聚)或酶促地獲得(例如膠原酶或DNA酶)。在介白素-2(IL-2)中培養腫瘤酶促消化物之單細胞懸浮液。培養細胞直至鋪滿(例如，約2×106個淋巴球)，例如，約5至約21天，例如約10至約14天。
在一些實施例中，可彙集培養之T細胞並快速擴增。快速擴增使抗原特異性T細胞數量在約10至約14天之時段內增加(例如)至少約 50倍(例如50、60、70、80、90或100倍或更)。在一些實施例中，可藉由業內已知之許多方法中之任一者來完成擴增。舉例而言，在存在飼養淋巴球及介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)下(其中特別考慮IL-2)，使用非特異性T細胞受體刺激可快速擴增T細胞。非特異性T細胞受體刺激可包括約30ng/ml OKT3，一種小鼠單株抗CD3抗體(可自Ortho-McNeil®,Raritan,N.J.獲得)。在一些實施例中，T細胞可藉由在T細胞生長因子(例如300IU/ml IL-2或IL-15，其中考慮IL-2)存在下用癌症之一或多種抗原(包括其抗原部分，例如表位或細胞)活體外刺激外周血單核細胞(PBMC)而快速擴增，該等抗原可視情況自載體(例如人類白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽)表現。藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈遞細胞上之相同之癌抗原再刺激，快速擴增vv/ro誘導之T細胞。在一些實施例中，可用例如輻照之自體淋巴球或用輻照之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激T細胞。在一些實施例中，自體T細胞可經修飾以表現促進自體T細胞生長及活化之T細胞生長因子。在一些實施例中，適宜T細胞生長因子包括(例如)介白素(IL)-2、IL-7、IL-15及IL-12。適宜修飾方法為業內已知。參見(例如)Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第3版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,NY,1994。在一些實施例中，經修飾之自體T細胞以高程度表現T細胞生長因子。T細胞生長因子編碼序列(例如IL-12之編碼序列)在業內容易獲得，啟動子亦係如此，其與T細胞生長因子編碼序列之可操作連接促進高程度表現。在一些實施例中，自體T細胞可經工程化以表現針對靶TAA之定義之 T細胞受體(TCR)，其係野生型TCR或突變/工程化TCR，其對抗原肽/MHC分子複合物具有更高親和力。在一些實施例中，自體T細胞可經工程化以表現CAR，例如，如下文所述。
在一些實施例中，基於T細胞之療法包含基於嵌合抗原受體(CAR)-T之療法。該方法涉及工程化CAR，該CAR特異性結合目標抗原且包含一或多個細胞內信號傳導結構域用於T細胞活化。然後，CAR在工程化T細胞之表面上表現(CAR-T)並投與給患者，導致針對表現抗原之癌細胞之T細胞特異性免疫反應。在一些實施例中，CAR特異性結合本揭示內容之新抗原。
在一些實施例中，基於T細胞之療法包含表現重組T細胞受體(TCR)之T細胞。該方法包括鑑別特異性結合目標抗原之TCR，然後將其用於置換工程化T細胞表面上投與給患者之內源或天然TCR，導致針對表現抗原之癌細胞之T細胞特異性免疫反應。在一些實施例中，重組TCR特異性結合本揭示內容之新抗原。
在一些實施例中，基於T細胞之療法包含腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。舉例而言，TIL可從本揭示內容之腫瘤或癌症中分離，然後在活體外分離並擴增。該等TIL中之一些或全部可特異性地識別本揭示內容之新抗原。在一些實施例中，分離後在活體外將TIL暴露於本揭示內容之一或多種新抗原。然後將TIL投與給患者(視情況與一或多種細胞介素或其他免疫刺激物質組合)。
在一些實施例中，基於細胞之療法包含基於天然殺手(NK)細胞之療法。天然殺手(NK)細胞係淋巴球之亞群體，其針對多種腫瘤細胞、病毒感染之細胞及骨髓及胸腺中之一些正常細胞具有自發細胞毒性。 NK細胞係針對轉變及病毒感染之細胞之早期先天免疫反應的關鍵效應物。NK細胞佔人類外周血中淋巴球之約10%。當在介白素2(IL-2)存在下培養淋巴球時，產生強的細胞毒性反應。NK細胞係稱為大顆粒淋巴球之效應細胞，此乃因其尺寸較大且在其細胞質中存在特徵性嗜苯胺顆粒。NK細胞在骨髓、淋巴結、脾、扁桃體及胸腺中分化及成熟。NK細胞可藉由特異性表面標記(例如人類中之CD 16、CD56及CD8)來檢測。NK細胞不表現T細胞抗原受體、泛T標記CD3或表面免疫球蛋白B細胞受體。在一些實施例中，NK細胞藉由業內熟知之方法源自人類外周血單核細胞(PBMC)、未刺激之白血球分離產物(PBSC)、人類胚胎幹細胞(hESC)、多潛能幹細胞(iPSC)、骨髓或臍帶血。在一些實施例中，臍帶血用於衍生NK細胞。在一些實施例中，藉由先前闡述之NK細胞之離體擴增方法(Spanholtz等人，2011；Shah等人，2013)分離及擴增NK細胞。在一些實施例中，藉由聚蔗糖密度梯度離心分離CB單核細胞，並在生物反應器中與IL-2及人工抗原呈遞細胞(aAPC)一起培養。7天後，細胞培養物耗盡任何表現CD3之細胞，並再培養額外7天。使細胞再次耗盡CD3並表徵以測定CD56+/CD3細胞或NK細胞之百分比。在一些實施例中，臍帶血用於藉由分離CD34+細胞並藉由在含有SCF、IL-7、IL-15及IL-2之培養基中培養而分化成CD56+/CD3細胞來衍生NK細胞。
在一些實施例中，基於細胞之療法包含基於樹突細胞之療法，例如，樹突細胞疫苗。在一些實施例中，DC疫苗包含能夠誘導特異性T細胞免疫之抗原呈遞細胞，其自患者或自供體收穫。在一些實施例中，然後可在活體外將DC疫苗暴露於肽抗原，針對該肽抗原，將在患者中產生T細胞。在一些實施例中，然後將負載抗原之樹突細胞注射回患 者。在一些實施例中，若期望，可重複免疫多次。用於收穫、擴增及投與樹突細胞之方法為業內已知；參見(例如)WO2019178081。樹突細胞疫苗(例如西普魯塞-T，亦稱為APC8015及PROVENGE®)係涉及投與樹突細胞之疫苗，該等樹突細胞用作APC以向患者之免疫系統呈遞一或多種癌症特異性抗原，例如本揭示內容之新抗原。在一些實施例中，疫苗包含已暴露於本揭示內容之一或多種新抗原之樹突細胞。在一些實施例中，疫苗包含例如經由I類MHC呈遞本揭示內容之一或多種新抗原之樹突細胞。在一些實施例中，樹突細胞對於接受者係自體的或同種異體的。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含基於TCR之療法。在一些實施例中，癌症免疫療法包含投與特異性結合本揭示內容之新抗原之一或多種TCR或基於TCR之生物製劑。舉例而言，基於TCR之治療劑可包含特異性結合本揭示內容之新抗原(例如，如經由MHC I類呈遞於細胞表面上)之TCR或其細胞外部分，以及結合免疫細胞(例如，T細胞)之部分，例如特異性結合T細胞表面蛋白或受體之抗體或抗體片段(例如，抗CD3抗體或抗體片段)。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含輔助免疫療法。輔助免疫療法包含使用一或多種活化先天免疫系統之組分之試劑，例如靶向TLR7路徑之HILTONOL®(咪喹莫特(imiquimod))。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含細胞介素免疫療法。細胞介素免疫療法包含使用一或多種活化免疫系統之組分之細胞介素。實例包括(但不限於)阿地介白素(aldesleukin)(PROLEUKIN®；介白素-2)、干擾素α-2a(ROFERON®-A)、干擾素α-2b(INTRON®-A)及聚乙二醇干擾素α-2b(PEGINTRON®)。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含溶瘤病毒療法。溶瘤病毒療法使用遺傳修飾之病毒以在癌細胞中複製並殺死癌細胞，導致刺激免疫反應之抗原(例如，本揭示內容之新抗原)之釋放。在一些實施例中，表現腫瘤抗原之複製勝任溶瘤病毒包含任何天然存在之(例如來自「野外來源」)或修飾之複製勝任溶瘤病毒。在一些實施例中，除了表現腫瘤抗原之外，亦可修飾溶瘤病毒以增加病毒對癌細胞之選擇性。在一些實施例中，複製勝任溶瘤病毒包括(但不限於)作為肌尾病毒科(myoviridae)、長尾病毒科(siphoviridae)、短尾病毒科(podpviridae)、複層病毒科(teciviridae)、被脂病毒科(corticoviridae)、原生病毒科(plasmaviridae)、脂毛病毒科(lipothrixviridae)、福塞爾噬菌體科(fuselloviridae)、痘病毒科(poxyiridae)、虹彩病毒科(iridoviridae)、藻DNA病毒科(phycodnaviridae)、桿狀病毒科(baculoviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、腺病毒科(adnoviridae)、乳多空病毒科(papovaviridae)、多DNA病毒科(polydnaviridae)、絲桿病毒科(inoviridae)、微病毒科(microviridae)、雙粒病毒科(geminiviridae)、圓環病毒科(circoviridae)、微小病毒科(parvoviridae)、肝病毒科(hcpadnaviridae)、反轉錄病毒科(retroviridae)、囊狀病毒科(cyctoviridae)、呼腸孤病毒科(reoviridae)、雙核糖核酸病毒科(birnaviridae)、副黏液病毒科(paramyxoviridae)、彈狀病毒科(rhabdoviridae)、絲狀病毒科(filoviridae)、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科(bunyaviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、光滑噬菌體科(Leviviridae)、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)、隨伴病毒科(sequiviridae)、豇豆鑲嵌病毒科 (comoviridae)、馬鈴薯Y病毒科(potyviridae)、杯狀病毒科(caliciviridae)、星狀病毒科(astroviridae)、野田病毒科(nodaviridae)、四病毒科(tetraviridae)、西紅柿叢矮病毒科(tombusviridae)、冠狀病毒科(coronaviridae)、黃病毒科(glaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)及桿狀RNA病毒科(barnaviridae)之成員之溶瘤病毒。在一些實施例中，複製勝任溶瘤病毒包括腺病毒、反轉錄病毒、裡奧病毒、棒狀病毒、新城雞瘟病毒(NDV)、多瘤病毒、牛痘病毒(VacV)、單純疱疹病毒、微小RNA病毒、柯薩奇病毒(coxsackie virus)及小病毒。在一些實施例中，表現腫瘤抗原之複製型溶瘤牛痘病毒可經工程化以缺乏一或多個功能基因，以便增加病毒之癌症選擇性。在一些實施例中，溶瘤牛痘病毒經工程化以缺乏胸苷激酶(TK)活性。在一些實施例中，溶瘤牛痘病毒可經工程化以缺乏牛痘病毒生長因子(VGF)。在一些實施例中，溶瘤牛痘病毒可經工程化以缺乏VFG及TK活性二者。在一些實施例中，溶瘤牛痘病毒可經工程化以缺乏一或多個參與逃避宿主干擾素(IFN)反應之基因，例如E3L、K3L、B18R或B8R。在一些實施例中，複製型溶瘤牛痘病毒係Western Reserve、Copenhagen、Lister或Wyeth株，且缺乏功能性TK基因。在一些實施例中，溶瘤牛痘病毒係缺乏功能性B18R及/或B8R基因之Western Reserve、Copenhagen、Lister或Wyeth株。在一些實施例中，表現組合之腫瘤抗原之複製型溶瘤牛痘病毒可局部或全身投與給個體，例如經由腫瘤內、腹膜內、靜脈內、動脈內、肌內、真皮內、顱內、皮下或鼻內投與。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含檢查點抑制劑。如業內已知，檢查點抑制劑靶向至少一種免疫檢查點蛋白以改變免疫反應之調 節，例如下調或抑制免疫反應。免疫檢查點蛋白包括(例如)CTLA4、PD-L1、PD-1、PD-L2、VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CEACAM、LAIR1、CD80、CD86、CD276、VTCN1、MHC I類、MHC II類、GALS、腺苷、TGFR、CSF1R、MICA/B、精胺酸酶、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受體、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、LAG-3、BTLA、IDO、OX40及A2aR。在一些實施例中，參與調節免疫檢查點之分子包括(但不限於)：PD-1(CD279)、PD-L1(B7-H1、CD274)、PD-L2(B7-CD、CD273)、CTLA-4(CD152)、HVEM、BTLA(CD272)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、LAG-3(CD223)、TIM-3(HAVCR2)、CEACAM、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、GAL9、VISTA(PD-1H)、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、A2AR、GITR(CD357)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD276(B7-H3)、VTCNI(B7-H4)、MHC I類、MHC II類、GALS、腺苷、TGFR、B7-H1、OX40(CD134)、CD94(KLRD1)、CD137(4-1BB)、CD137L(4-1BBL)、CD40、IDO、CSF1R、CD40L、CD47、CD70(CD27L)、CD226、HHLA2、ICOS(CD278)、ICOSL(CD275)、LIGHT(TNFSF14、CD258)、NKG2a、NKG2d、OX40L(CD134L)、PVR(NECL5、CD155)、SIRPa、MICA/B及/或精胺酸酶。在一些實施例中，檢查點抑制劑降低負調節免疫細胞功能之檢查點蛋白之活性，例如，以便增強T細胞活化及/或抗癌免疫反應；在其他實施例中，檢查點抑制劑增加正調節免疫細胞功能之檢查點蛋白之活性，例如，以便增強T細胞活化及/或抗癌免疫反應。在一些實施例中， 檢查點抑制劑係抗體。在一些實施例中，檢查點抑制劑係抗體。檢查點抑制劑之實例包括(但不限於)PD-L1軸結合拮抗劑(例如抗PD-L1抗體，例如阿替珠單抗(atezolizumab)(MPDL3280A))、針對共抑制分子之拮抗劑(例如CTLA4拮抗劑(例如抗CTLA4抗體)、TIM-3拮抗劑(例如抗TIM-3抗體)或LAG-3拮抗劑(例如抗LAG-3抗體))、或其任一組合。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包含藥物，例如小分子、配體或受體之重組形式，或係抗體，例如人類抗體(例如，國際專利公開案W02015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer,12(4)：252-64,2012；二者皆以引用方式併入本文中)。在一些實施例中，可使用免疫檢查點蛋白或其類似物之已知抑制劑，具體而言可使用嵌合、人類化或人類形式之抗體。
在一些實施例中，檢查點抑制劑係PD-L1軸結合拮抗劑，例如PD-1結合拮抗劑、PD-L1結合拮抗劑或PD-L2結合拮抗劑。PD-1(程式化死亡1)在業內亦稱為「程式化細胞死亡1」、「PDCD1」、「CD279」及「SLEB2」。實例性人類PD-1示於UniProtKB/Swiss-Prot登錄號Q15116中。PD-L1(程式化死亡配體1)在業內亦稱為「程式化細胞死亡1配體1」、「PDCD1 LG1」、「CD274」、「B7-H」及「PDL1」。實例性人類PD-L1示於UniProtKB/Swiss-Prot登錄號Q9NZQ7.1中。PD-L2(程式化死亡配體2)在業內亦稱為「程式化細胞死亡1配體2」、「PDCD1 LG2」、「CD273」、「B7-DC」、「Btdc」及「PDL2」。實例性人類PD-L2示於UniProtKB/Swiss-Prot登錄號Q9BQ51中。在一些實施例中，PD-1、PD-L1及PD-L2係人類PD-1、PD-L1及PD-L2。
在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抑制PD-1與其配體結合配偶體結合之分子。在具體態樣中，PD-1配體結合配偶體係PD-L1及 /或PD-L2。在另一情形下，PD-L1結合拮抗劑係抑制PD-L1與其結合配體結合之分子。在具體態樣中，PD-L1結合配偶體係PD-1及/或B7-1。在另一情形下，PD-L2結合拮抗劑係抑制PD-L2與其配體結合配偶體結合之分子。在具體態樣中，PD-L2結合配體配偶體係PD-1。拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係小分子、核酸、多肽(例如抗體)、碳水化合物、脂質、金屬或毒素。
在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係抗PD-1抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)，例如如下文所述。在一些情況下，抗PD-1抗體選自由以下組成之群：MDX-1 106(尼沃魯單抗(nivolumab))、MK-3475(派姆單抗(pembrolizumab))、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、MGA-012、JNJ-63723283、BI 754091及BGB-108。MDX-1 106(亦稱為MDX-1 106-04、ONO-4538、BMS-936558或尼沃魯單抗)係WO2006/121 168中所述之抗PD-1抗體。MK-3475(亦稱為派姆單抗或蘭布魯珠單抗)係WO 2009/1 14335中所述之抗PD-1抗體。在一些情況下，PD-1結合拮抗劑係免疫黏附素(例如，包含與恆定區(例如，免疫球蛋白序列之Fc區)融合之PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分的免疫黏附素)。在一些情況下，PD-1結合拮抗劑係AMP-224。AMP-224(亦稱為B7-DCIg)係WO 2010/027827及WO 2011/066342中所述之PD-L2-Fc融合可溶性受體。
在一些實施例中，抗PD-1抗體係尼沃魯單抗(CAS登記號：946414-94-4)。尼沃魯單抗(Bristol-Myers Squibb/Ono)(亦稱為MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558及OPDIVO®)係 WO2006/121168中所述之抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含重鏈及輕鏈序列，其中：(a)重鏈序列與以下重鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：1)，及(b)輕鏈序列與以下輕鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：2)。
在一些實施例中，抗PD-1抗體包含來自SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之六個HVR序列(例如，三個重鏈HVR來自SEQ ID NO：1及三個輕鏈HVR來自SEQ ID NO：2)。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含來自SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域及來自SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域。
在一些實施例中，抗PD-1抗體係派姆單抗(CAS登記號：1374853-91-4)。派姆單抗(Merck)(亦稱為MK-3475、Merck 3475、蘭布魯珠單抗(lambrolizumab)、KEYTRUDA®及SCH-900475)係WO2009/114335中所述之抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含重鏈及輕鏈序列，其中：(a)重鏈序列與以下重鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：3)，及(b)輕鏈序列與以下輕鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：4)。
在一些實施例中，抗PD-1抗體包含來自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4之六個HVR序列(例如，三個重鏈HVR來自SEQ ID NO：3及三個輕鏈HVR來自SEQ ID NO：4)。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含來自SEQ ID NO：3之重鏈可變結構域及來自SEQ ID NO：4之輕鏈可變結構域。
抗PD-1抗體之其他實例包括(但不限於)MEDI-0680 (AMP-514；AstraZeneca)、PDR001(CAS登記號1859072-53-9；Novartis)、REGN2810(LIBTAYO®或西米單抗(cemiplimab)-rwlc；Regeneron)、BGB-108(BeiGene)、BGB-A317(BeiGene)、BI 754091、JS-001(Shanghai Junshi)、STI-A1110(Sorrento)、INCSHR-1210(Incyte)、PF-06801591(Pfizer)、TSR-042(亦稱為ANB011；Tesaro/AnaptysBio)、AM0001(ARMO Biosciences)、ENUM 244C8(Enumeral Biomedical Holdings)、ENUM 388D4(Enumeral Biomedical Holdings)。在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑包含替雷利珠單抗(tislelizumab)(BGB-A317)、BGB-108、STI-A1110、AM0001、BI 754091、信迪利單抗(sintilimab)(IBI308)、塞曲利單抗(cetrelimab)(JNJ-63723283)、特瑞普利單抗(toripalimab)(JS-001)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab)(SHR-1210、INCSHR-1210、HR-301210)、MEDI-0680(AMP-514)、MGA-012(INCMGA 0012)、尼沃魯單抗(BMS-936558、MDX1106、ONO-4538)、斯巴達利珠單抗(spartalizumab)(PDR00l)、派姆單抗(MK-3475、SCH 900475)、PF-06801591、西米單抗(REGN-2810、REGEN2810)、多斯塔利馬單抗(dostarlimab)(TSR-042、ANB011)、FITC-YT-16(PD-1結合肽)、APL-501或CBT-501或傑諾單抗(genolimzumab)(GB-226)、AB-122、AK105、AMG 404、BCD-100、F520、HLX10、HX008、JTX-4014、LZM009、Sym021、PSB205、AMP-224(靶向PD-1之融合蛋白)、CX-188(PD-1 probody)、AGEN-2034、GLS-010、布迪加力單抗(budigalimab)(ABBV-181)、AK-103、BAT-1306、CS-1003、AM-0001、TILT-123、BH-2922、BH-2941、BH-2950、ENUM-244C8、ENUM-388D4、HAB-21、H EISCOI 11-003、 IKT-202、MCLA-134、MT-17000、PEGMP-7、PRS-332、RXI-762、STI-1110、VXM-10、XmAb-23104、AK-112、HLX-20、SSI-361、AT-16201、SNA-01、AB122、PD1-PIK、PF-06936308、RG-7769、CAB PD-1 Abs、AK-123、MEDI-3387、MEDI-5771、4H1128Z-E27、REMD-288、SG-001、BY-24.3、CB-201、IBI-319、ONCR-177、Max-1、CS-4100、JBI-426、CCC-0701、CCX-4503或其衍生物。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係肽或小分子化合物。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑係AUNP-12(PierreFabre/Aurigene)。在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑包含Guzik等人，Molecules(2019)5月30日；24(11)中所述之小分子PD-1軸結合拮抗劑。用於本文提供之方法中之其他PD-1抑制劑為業內已知，例如闡述於美國專利第8,735,553號、第8,354,509號及第8,008,449號中。
在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抑制PD-1之小分子。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抑制PD-L1之小分子。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係抑制PD-L1及VISTA或PD-L1及TIM3之小分子。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係CA-170(亦稱為AUPM-170)。在本文之任何情況下，分離之抗PD-L1抗體可結合至人類PD-L1，例如如UniProtKB/Swiss-Prot登錄號Q9NZQ7.1中所示之人類PD-L1或其變體。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑係小分子、核酸、多肽(例如抗體)、碳水化合物、脂質、金屬或毒素。
在一些情況下，PD-L1結合拮抗劑係抗PD-L1抗體，例如，如下文所述。在一些情況下，抗PD-L1抗體能夠抑制PD-L1與PD-1之間及/或PD-L1與B7-1之間之結合。在一些情況下，抗PD-L1抗體係單株 抗體。在一些情況下，抗PD-L1抗體係選自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段組成之群之抗體片段。在一些情況下，抗PD-L1抗體係人類化抗體。在一些情況下，抗PD-L1抗體係人類抗體。在一些情況下，抗PD-L1抗體選自由以下組成之群：YW243.55.S70、MPDL3280A(阿替珠單抗(atezolizumab))、MDX-1 105、及MEDI4736(德瓦魯單抗(durvalumab))及MSB0010718C(阿維魯單抗(avelumab))。抗體YW243.55.S70係WO 2010/077634中所述之抗PD-L1。MDX-1 105(亦稱為BMS-936559)係WO2007/005874中所述之抗PD-L1抗體。MEDI4736(德瓦魯單抗)係WO201 1/066389及US2013/034559中所述之抗PD-L1單株抗體。可用於本揭示內容之方法之抗PD-L1抗體及其製備方法之實例闡述於PCT專利申請案WO 2010/077634、WO 2007/005874、WO 2011/066389、美國專利第8,217,149號及US2013/034559中。在一些實施例中，PD-L1軸結合拮抗劑包含阿替珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗(imfinzi)、BGB-A333、SHR-1316(HTI-1088)、CK-301、BMS-936559、恩沃利單抗(envafolimab)(KN035、ASC22)、CS1001、MDX-1105(BMS-936559)、LY3300054、STI-A1014、FAZ053、CX-072、INCB086550、GNS-1480、CA-170、CK-301、M-7824、HTI-1088(HTI-131、SHR-1316)、MSB-2311、AK-106、AVA-004、BBI-801、CA-327、CBA-0710、CBT-502、FPT-155、IKT-201、IKT-703、10-103、JS-003、KD-033、KY-1003、MCLA-145、MT-5050、SNA-02、BCD-135、APL-502(CBT-402或TQB2450)、IMC-001、KD-045、INBRX-105、KN-046、IMC-2102、IMC-2101、KD-005、IMM-2502、89Zr-CX-072、89Zr-DFO-6E11、KY-1055、MEDI-1109、MT-5594、 SL-279252、DSP-106、Gensci-047、REMD-290、N-809、PRS-344、FS-222、GEN-1046、BH-29xx、FS-118或其衍生物。
在一些實施例中，抗PDL1抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中：(a)重鏈可變區包含分別GFTFSDSWIH(SEQ ID NO：5)、AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)及RHWPGGFDY(SEQ ID NO：7)之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3序列，且(b)輕鏈可變區包含分別RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)、SASFLYS(SEQ ID NO：9)及QQYLYHPAT(SEQ ID NO：10)之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3序列。
在一些實施例中，抗PDL1抗體係MPDL3280A，亦稱為阿替珠單抗及TECENTRIQ®(CAS登記號：1422185-06-5)。在一些實施例中，抗PDL1抗體包含重鏈及輕鏈序列，其中：(a)重鏈序列與以下重鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：11)，且(b)輕鏈序列與以下輕鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：12)。
在一些實施例中，抗PDL1抗體包含重鏈及輕鏈序列，其中：(a)重鏈序列與以下重鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：13)，且(b)輕鏈序列與以下輕鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：14)。
在一些情況下，提供包含重鏈及輕鏈序列之分離之抗PD-L1抗體，其中輕鏈序列與SEQ ID NO：14之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些情況下，提供包含重鏈及輕鏈序列之分離之抗PD-L1抗體，其中重鏈序列與SEQ ID NO：13之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些情況下，提供包含重鏈及輕鏈序列之分離之抗PD-L1抗體，其中輕鏈序列與SEQ ID NO：14之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性且重鏈序列與SEQ ID NO：13之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。
在又一具體態樣中，抗體進一步包含人類或鼠類恆定區。在又一態樣中，人類恆定區選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG2、IgG3及IgG4。在又一具體態樣中，人類恆定區係IgG1。在又一態樣中，鼠類恆定區選自由以下組成之群：IgG1、IgG2A、IgG2B及IgG3。在又 一態樣中，鼠類恆定區係IgG2A。在又一具體態樣中，抗體具有降低或最小效應功能。在又一具體態樣中，最小效應功能係由「無效應Fc突變」或無醣基化產生。在又一情況下，無效應Fc突變係恆定區中之N297A或D265A/N297A取代。
在一些情況下，分離之抗PD-L1抗體係無醣基化的。抗體之醣基化通常係N-連接的或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸外之任一胺基酸)係用於碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接之識別序列。因此，多肽中存在此等三肽序列中之任一者均可產生潛在醣基化位點。O-連接之醣基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸(最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸)之連接。自抗體去除醣基化位點係藉由改變胺基酸序列使得去除上述三肽序列中之一者(對於N-連接醣基化位點)來便捷地完成。可藉由將醣基化位點內之天冬醯胺、絲胺酸或蘇胺酸殘基取代為另一胺基酸殘基(例如，甘胺酸、丙胺酸或保守取代)來進行改變。
在一些實施例中，抗PDL1抗體係阿維魯單抗(CAS登記號：1537032-82-8)。阿維魯單抗(亦稱為MSB0010718C)係人類單株IgG1抗PDL1抗體(Merck KGaA,Pfizer)。在一些實施例中，抗PDL1抗體包含重鏈及輕鏈序列，其中：(a)重鏈序列與以下重鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：15)，且(b)輕鏈序列與以下輕鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：16)。
在一些實施例中，抗PDL1抗體包含來自SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16之六個HVR序列(例如，三個重鏈HVR來自SEQ ID NO：15及三個輕鏈HVR來自SEQ ID NO：16)。在一些實施例中，抗PDL1抗體包含來自SEQ ID NO：15之重鏈可變結構域及來自SEQ ID NO：16之輕鏈可變結構域。
在一些實施例中，抗PDL1抗體係德瓦魯單抗(CAS登記 號：1428935-60-7)。德瓦魯單抗(亦稱為MEDI4736)係WO2011/066389及US2013/034559中所述之Fc最佳化人類單株IgG1 κ抗PDL1抗體(MedImmune,AstraZeneca)。在一些實施例中，抗PDL1抗體包含重鏈及輕鏈序列，其中：(a)重鏈序列與以下重鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：17)，且(b)輕鏈序列與以下輕鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：18)。
在一些實施例中，抗PDL1抗體包含來自SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18之六個HVR序列(例如，三個重鏈HVR來自SEQ ID NO：17及三個輕鏈HVR來自SEQ ID NO：18)。在一些實施例中，抗PDL1抗體包含來自SEQ ID NO：17之重鏈可變結構域及來自SEQ ID NO：18之輕鏈可變結構域。
抗PD-L1抗體之其他實例包括(但不限於)MDX-1105(BMS-936559；Bristol Myers Squibb)、LY3300054(Eli Lilly)、STI-A1014(Sorrento)、KN035(Suzhou Alphamab)、FAZ053(Novartis)或CX-072(CytomX Therapeutics)。
在一些實施例中，PD-L1軸結合拮抗劑包含小分子PD-L1軸結合拮抗劑GS-4224。在一些實施例中，PD-L1軸結合拮抗劑包含PCT/US2019/017721中所述之小分子PD-L1軸結合拮抗劑。
在一些實施例中，檢查點抑制劑係CT-011，亦稱為hBAT、hBAT-1或匹利珠單抗(pidilizumab)，於WO 2009/101611中所述之一種抗體。
在一些實施例中，檢查點抑制劑係CTLA4之拮抗劑。在一些實施例中，檢查點抑制劑係CTLA4之小分子拮抗劑。在一些實施例中，檢查點抑制劑係抗CTLA4抗體。CTLA4係免疫檢查點分子之CD28-B7免疫球蛋白超家族之一部分，其用於負調節T細胞活化，特別係CD28依賴性T細胞反應。CTLA4與CD28競爭結合至共同配體(例如CD80(B7-1)及CD86(B7-2))，並以比CD28更高之親和力結合至該等配體。據信阻 斷CTLA4活性(例如，使用抗CTLA4抗體)會增強CD28介導之共刺激(導致T細胞活化/引發增加)、影響T細胞發育及/或耗盡Treg(例如腫瘤內Treg)。在一些實施例中，CTLA4拮抗劑係小分子、核酸、多肽(例如抗體)、碳水化合物、脂質、金屬或毒素。
在一些實施例中，抗CTLA4抗體係伊匹單抗(ipilimumab)(YERVOY ®；CAS登記號：477202-00-9)。伊匹單抗(亦稱為BMS-734016、MDX-010及MDX-101)係WO2001/14424中所述之完全人類單株IgG1 κ抗CTLA4抗體(Bristol-Myers Squibb)。在一些實施例中，抗CTLA4抗體包含重鏈及輕鏈序列，其中：(a)重鏈序列與以下重鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：19)，且(b)輕鏈序列與以下輕鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性： (SEQ ID NO：20)。
在一些實施例中，抗CTLA4抗體包含來自SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20之六個HVR序列(例如，三個重鏈HVR來自SEQ ID NO：19及三個輕鏈HVR來自SEQ ID NO：20)。在一些實施例中，抗CTLA4抗體包含來自SEQ ID NO：19之重鏈可變結構域及來自SEQ ID NO：20之輕鏈可變結構域。
抗CTLA4抗體之其他實例包括(但不限於)APL-509、AGEN1884及CS1002。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包含伊匹單抗(IBI310、BMS-734016、MDX010、MDX-CTLA4、MEDI4736)、曲美目單抗(tremelimumab)(CP-675、CP-675,206)、APL-509、AGEN1884、及CS1002、AGEN1181、阿巴西普(Abatacept)(Orencia、BMS-188667、RG2077)、BCD-145、ONC-392、ADU-1604、REGN4659、ADG116、KN044、KN046或其衍生物。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包含LAG-3抑制劑(例如，抗體、抗體偶聯物或其抗原結合片段)。在一些實施例中，LAG-3抑制劑包含小分子、核酸、多肽(例如抗體)、碳水化合物、脂質、金屬或毒素。在一些實施例中，LAG-3抑制劑包含小分子。在一些實施例中，LAG-3抑制劑包含LAG-3結合劑。在一些實施例中，LAG-3抑制劑包含抗體、抗體偶聯物或其抗原結合片段。在一些實施例中，LAG-3抑制劑包含艾夫替拉吉莫德(eftilagimod)α(IMP321、IMP-321、EDDP-202、EOC-202)、瑞拉單抗(relatlimab)(BMS-986016)、GSK2831781(IMP-731)、LAG525(IMP701)、TSR-033、EVIP321(可溶性LAG-3蛋白)、BI 754111、IMP761、REGN3767、MK-4280、MGD-013、XmAb22841、INCAGN-2385、ENUM-006、AVA-017、AM-0003、iOnctura抗LAG-3抗體、Arcus Biosciences LAG-3抗體、Sym022、其衍生物或與前述中之任一者競爭之抗體。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係單價的及/或單特異性的。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係多價的及/或多特異性的。
在一些實施例中，免疫療法包含免疫調節性分子或細胞介素。需要免疫調節概況以在個體中觸發有效免疫反應及平衡免疫。在一些實施例中，免疫調節分子包括在本文詳述之任何治療中。適宜免疫調節性細胞介素之實例包括(但不限於)干擾素(例如IFNα、IFNβ及IFNγ)、介白素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12及IL-20)、腫瘤壞死因子(例如TNFα及TNFβ)、促紅血球生成素(EPO)、FLT-3配體、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1α、MIP-1β、Rantes、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、以及其功能片段。在一些實施例中，在本發明之上下文中可使用結合至趨化介素受體(即CXC、CC、C或CX3C趨化介素受體)之任何免疫調節性趨化介素。趨化介素之實例包括(但不限於)MIP-3α(Lax)、MIP-3β、Hcc-1、MPIF-1、MPIF-2、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、伊紅趨素(Eotaxin)、Tarc、Elc、I309、IL-8、GCP-2 Groα.、Gro-β.、Nap-2、Ena-78、Ip-10、MIG、I-Tac、SDF-1、及BCA-1(Blc)、以及其功能片段。
本文所述方法(例如癌症免疫療法)中利用之組合物可藉由任何適宜方法、包括(例如)靜脈內、肌內、皮下、真皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鞘內、鼻內、陰道內、直腸內、局部、腫瘤內、腹膜、結膜下、囊內、黏膜、心包內、臍內、眼內、眶內、口服、局部、經皮、玻璃體內(例如藉由玻璃體內注射)、藉由滴眼劑、藉由吸入、藉由注射、藉由植入、藉由 輸注、藉由連續輸注、藉由局部灌注直接浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、於乳膏劑中或於脂質組合物中投與。本文所述方法中利用之組合物亦可全身或局部投與。投與方法可根據各種因素(例如，投與之化合物或組合物及治療之病況、疾病或病症之嚴重程度)而變化。在一些情況下，檢查點抑制劑係藉由靜脈內、肌內、皮下、局部、口服、經皮、腹膜內、眶內、藉由植入、藉由吸入、鞘內、心室內或鼻內投與。投藥可藉由任何適宜途徑，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，此部分取決於投與係短暫的或長期的。本文考慮各種投藥時間表，包括但不限於在不同時間點之單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
本文所述之癌症免疫療法(例如抗體、結合多肽及/或小分子)(任何額外治療劑)可以符合良好醫療實踐之方式調配、投用及投與。在此背景下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床狀況、病症之原因、藥劑之遞送部位、投與方法、投與時間安排以及醫學從業者已知之其他因素。治療劑不必但視情況與一或多種目前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配及/或同時投與。該等其他藥劑之有效量取決於調配物中存在之檢查點抑制劑之量、病症或治療之類型以及上文論述之其他因素。該等藥劑通常以相同劑量使用，並以本文所述之投與途徑使用、或以本文所述劑量之約1至99%使用，或以任何劑量使用，並藉由經驗/臨床確定為適當之任何途徑使用。
此療法之進程係容易地藉由習用技術及分析來監測。舉例而言，作為一般建議，投與給人類之免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM-3抗體或抗LAG-3抗體)之治療有效量將在約0.01至約50mg/kg患者體重之範圍內，無論係藉由一次或多次 投與。在一些情況下，所用抗體係(例如)約0.01mg/kg至約45mg/kg、約0.01mg/kg至約40mg/kg、約0.01mg/kg至約35mg/kg、約0.01mg/kg至約30mg/kg、約0.01mg/kg至約25mg/kg、約0.01mg/kg至約20mg/kg、約0.01mg/kg至約1 5mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約0.01mg/kg至約5mg/kg或約0.01mg/kg至約1mg/kg、每天、每週、每兩週、每三週或每月投與。在一些情況下，抗體以15mg/kg投與。然而，其他劑量方案可為有用的。在一種情況下，在21天週期(每三週，q3w)之第1天，以約100mg、約200mg、約300mg、約400mg、約500mg、約600mg、約700mg、約800mg、約900mg、約1000mg、約1100mg、約1200mg、約1300mg、約1400mg、約1500mg、約1600mg、約1700mg或約1800mg之劑量向人類投與本文所述之抗PD-L1抗體。在一些情況下，每三週(q3w)以1200mg靜脈內投與抗PD-L1抗體MPDL3280A。該劑量可作為單劑量或作為多劑量(例如，2或3個劑量)投與，例如輸注。與單一治療相比，可減少組合治療中投與之抗體之劑量。此療法之進程係容易地藉由習用技術來監測。
在一些實施例中，該等方法進一步涉及向患者投與有效量之額外治療劑。在一些實施例中，額外抗癌症療法包括手術、放射療法、化學療法、抗血管生成療法、抗DNA修復療法及抗發炎療法中之一或多者。在一些情況下，額外治療劑選自由以下組成之群：抗瘤劑、化學治療劑、生長抑制劑、抗血管生成劑、放射療法、細胞毒性劑及其組合。在一些情況下，癌症免疫療法可與化學療法或化學治療劑聯合投與。在一些實施例中，化學療法或化學治療劑係基於鉑之藥劑(包括但不限於順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及沙鉑 (staraplatin))。在一些情況下，癌症免疫療法可與放射治療劑聯合投與。在一些情況下，癌症免疫療法可與靶向療法或靶向治療劑聯合投與。在一些情況下，癌症免疫療法可與另一免疫療法或免疫治療劑(例如單株抗體)聯合投與。在一些情況下，額外治療劑係針對共刺激分子之激動劑。在一些情況下，額外治療劑係針對共抑制分子之拮抗劑。在一些情況下，癌症免疫療法作為單一療法投與。
化學治療劑之實例包括烷基化劑，例如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)及尿多巴(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫化磷醯胺及三羥甲基蜜胺；番荔枝內酯(acetogenin)(尤其係布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利斯他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻素(cryptophycin)(尤其係念珠藻素1及念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥，例如氮芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷醯胺、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲基二氯乙基胺(mechlorethamine)、甲基二氯乙基胺氧化物鹽酸鹽、美法倉 (melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)及尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽類，例如氯膦酸(clodronate)；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素髮色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉基-多柔比星、氰嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、泛艾黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(例如絲裂黴素C)、黴酚酸、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，例如胺甲蝶呤 (methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)及三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-阿紮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)及睪內酯(testolactone)；抗腎上腺素，例如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；硝胺丙吖啶(nitraerine)；噴托他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西左非蘭(sizofiran)；鍺螺胺 (spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2」-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene)(尤其係T-2毒素、疣疱菌素A(verracurin A)、桿孢菌素(roridin A)及蛇形菌素(anguidine)；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西他賽(docetaxel)吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑配位錯合物，例如順鉑、奧沙利鉑及卡鉑；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙；道諾黴素；胺喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如，CPT-l l)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑、丙卡巴肼、普卡黴素(plicomycin)、吉西他濱、諾維本(navelbine)、法尼基-蛋白轉移酶抑制劑、反鉑，及上述中任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
可與本揭示內容組合之化學治療藥物之一些(非限制性)實例係卡鉑(佳鉑帝(Paraplatin))、順鉑(鉑帝爾(Platinol)、鉑帝爾-AQ)、環磷醯胺(癌得星(Cytoxan)、癌得散(Neosar))、多西他賽(剋癌易(Taxotere))、多柔比星(阿德力黴素(Adriamycin))、厄洛替尼(erlotinib)(得舒緩(Tarceva))、依託泊苷(滅必治(VePesid))、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西 他濱(健擇(Gemzar))、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(基利克(Gleevec))、伊立替康(抗癌妥(Camptosar))、胺甲喋呤(弗萊科斯(Folex)、麥科特(Mexate)、安米特林(Amethopterin))、太平洋紫杉醇(紫杉醇(Taxol)、亞伯杉烷(Abraxane))、索拉非尼(sorafinib)(蕾莎瓦(Nexavar))、舒尼替尼(sunitinib)(舒癌特(Sutent))、托泊替康(癌康定(Hycamtin))、長春新鹼(安可平(Oncovin)、維卡薩PFS(Vincasar PFS))及長春鹼(威爾班(Velban))。用於互補癌症療法之另一大組潛在靶標包括激酶抑制劑，此乃因癌細胞之生長及存活與激酶活性之失調密切相關。為了恢復正常激酶活性並因此減少腫瘤生長，使用廣泛範圍之抑制劑。靶向激酶之組包含受體酪胺酸激酶、例如BCR-ABL、B-Raf、EGFR、HER-2/ErbB2、IGF-IR、PDGFR-a、PDGFR-β、cKit、Flt-4、Flt3、FGFR1、FGFR3、FGFR4、CSF1R、c-Met、RON、c-Ret、ALK；細胞質酪胺酸激酶、例如c-SRC、c-YES、Abl、JAK-2；絲胺酸/蘇胺酸激酶、例如ATM、Aurora A及B、CDKs、mTOR、PKCi、PLKs、b-Raf、S6K、STK1 1/LKB1；及脂質激酶、例如PI3K、SKI。小分子激酶抑制劑係(例如)PHA-739358、尼羅替尼(Nilotinib)、達沙替尼(Dasatinib)及PD166326、NSC 74341 1、拉帕替尼(Lapatinib)(GW-572016)、卡奈替尼(Canertinib)(CI-1033)、司馬沙尼(Semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(Vatalanib)(PTK787/ZK222584)、舒癌特(Sutent)(SU1 1248)、索拉菲尼(Sorafenib)(BAY 43-9006)及來氟米特(Leflunomide)(SU101)。關於更多資訊，參見(例如)Zhang等人2009：Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors.Nature Reviews Cancer 9,28-39。小分子靶向療法藥物通常係癌細胞內突變、過表現或其他關鍵蛋白質上之酶結構域之抑制劑。 突出且非限制性實例係酪胺酸激酶抑制劑伊馬替尼(基利克/基利維(Glivec))及吉非替尼(gefitinib)(艾瑞莎(Iressa))。
在一些實施例中，額外抗癌症療法包含抗血管生成療法。血管生成抑制劑阻止腫瘤存活所需之血管之廣泛生長(血管生成)。舉例而言，可藉由靶向不同分子來阻斷由腫瘤細胞促進之血管生成以滿足其增加之營養及氧需求。可與本發明組合之血管生成介導分子或血管生成抑制劑的非限制性實例係可溶性VEGF(VEGF同種型VEGF121及VEGF165、受體VEGFR1、VEGFR2及輔受體神經纖毛蛋白(Neuropilin)-1及神經纖毛蛋白-2)1及NRP-1、血管生成素2、TSP-1及TSP-2、血管抑素及相關分子、內皮抑素、血管抑制素、鈣網蛋白、血小板因子-4、TIMP及CDAI、Meth-1及Meth-2、IFNα、-β及-γ、CXCL10、IL-4、-12及-18、凝血酶原(三環結構域-2)、抗凝血酶III片段、泌乳素、VEGI、SPARC、骨橋蛋白、馬思品(maspin)、血管能抑素、增殖蛋白相關蛋白、網狀內皮系統刺激素(restin)及藥物、例如貝伐珠單抗(bevacizumab)、伊曲康唑(itraconazole)、羧胺三唑、TNP-470、CM101、IFN-a、血小板因子-4、舒拉明(suramin)、SU5416、凝血酶敏感蛋白、VEGFR拮抗劑、血管生成抑制類固醇+肝素、軟骨源血管生成抑制因子、基質金屬蛋白酶抑制劑、2-甲氧基雌二醇、替康蘭(tecogalan)、四硫鉬酸鹽、沙利竇邁(thalidomide)、凝血酶敏感蛋白、泌乳素ν β3抑制劑、利諾胺(linomide)及他喹莫德(tasquinimod)。在一些實施例中，已知治療性候選者包括天然血管生成抑制劑、包括但不限於血管抑素、內皮抑素及血小板因子-4。在另一實施例中、治療性候選者包括(但不限於)內皮細胞生長之特異性抑制劑、例如TNP-470、沙利竇邁及介白素-12。其他抗血管生成劑包括中和 血管生成分子之彼等、例如包括但不限於纖維母細胞生長因子之抗體或血管內皮生長因子之抗體或血小板源生長因子之抗體或抗體或EGF、VEGF或PDGF之受體之其他類型之抑制劑。在一些實施例中，抗血管生成劑包括(但不限於)舒拉明及其類似物、及替康蘭.在其他實施例中，抗血管生成劑包括(但不限於)中和血管生成因子之受體之藥劑或干擾血管基底膜及細胞外基質之藥劑，包括但不限於金屬蛋白酶抑制劑及血管生成抑制類固醇。抗血管生成化合物之另一組包括(但不限於)抗黏著分子、例如整聯蛋白α v β 3之抗體。其他抗血管生成化合物或組合物包括(但不限於)激酶抑制劑、沙利竇邁、伊曲康唑、羧胺三唑、CM101、IFN-α、IL-12、SU5416、凝血酶敏感蛋白、軟骨源血管生成抑制因子、2-甲氧基雌二醇、四硫鉬酸鹽、凝血酶敏感蛋白、泌乳素及利諾胺。在一個特定實施例中，抗血管生成化合物係VEGF之抗體，例如Avastin®/貝伐珠單抗(Genentech)。
在一些實施例中，額外抗癌症療法包含抗DNA修復療法。在一些實施例中，DNA損傷修復及反應抑制劑選自PARP抑制劑、RAD51抑制劑、或選自CHCK1、ATM或ATR之DNA損傷反應激酶之抑制劑。在一些實施例中，額外抗癌症療法包含放射敏化劑。實例性放射敏化劑包括低氧放射敏化劑，例如迷索硝唑(misonidazole)、甲硝唑(metronidazole)及反式藏花酸鈉(trans-sodium crocetinate)，一種有助於增加氧向低氧腫瘤組織中擴散之化合物。放射敏化劑亦可為DNA損傷反應抑制劑，其干擾鹼基切除修復(BER)、核苷酸切除修復(NER)、失配修復(MMR)、包含同源重組(HR)及非同源末端接合(NHEJ)之重組修復以及直接修復機制。SSB修復機制包括BER、NER或MMR路徑，而DSB修復機制由HR及 NHEJ路徑組成。放射引起DNA斷裂，若不修復，則係致死的。單鏈斷裂係藉由BER、NER及MMR機制之組合使用完整之DNA鏈作為模板來修復。SSB修復之主要路徑係利用稱為聚-(ADP-核糖)聚合酶(PARP)之相關酶家族之BER。因此，放射敏化劑可包括DNA損傷反應抑制劑，例如聚(ADP)核糖聚合酶(PARP)抑制劑。在一些實施例中，額外抗癌症療法係DNA修復及反應路徑抑制劑、PARP抑制劑(例如他拉唑帕尼(Talazoparib)、盧卡帕尼(Rucaparib)、奧拉帕尼)、RAD51抑制劑(RI-1)、或DNA損傷反應激酶之抑制劑、例如CHCK1(AZD7762)、ATM(KU-55933、KU-60019、NU7026、VE-821)及ATR(NU7026)。
在一些實施例中，額外抗癌症療法包含抗發炎劑。在一些實施例中，抗發炎劑係阻斷、抑制或減少發炎或自發炎信號傳導路徑信號傳導的藥劑。在一些實施例中，抗發炎劑抑制或降低以下中之任一者中之一或多者之活性：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、干擾素(IFN)(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、IFN-γ誘導因子(IGIF)、轉變生長因子-β(TGF-β)、轉變生長因子-α(TGF-α)、腫瘤壞死因子TNF-α、TNF-β、TNF-RI、TNF-RII、CD23、CD30、CD40L、EGF、G-CSF、GDNF、PDGF-BB、RANTES/CCL5、IKK、NF-κB、TLR2、TLR3、TLR4、TL5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR8、TLR9及/或其任何同源受體。在一些實施例中，抗發炎劑係IL-1或IL-1受體拮抗劑，例如阿那白滯素(anakinra)(KINERET®)、利納西普(rilonacept)或卡那單抗(canakinumab)。在一些實施例中，抗發炎劑係IL-6或IL-6受體拮抗劑、例如抗IL-6抗體或抗IL-6受體抗體、例如托珠單抗(tocilizumab)(ACTEMRA®)、奧樂珠單抗 (olokizumab)、克拉紮珠單抗(clazakizumab)、薩利單抗(sarilumab)、西魯單抗(sirukumab)、司妥昔單抗(siltuximab)或ALX-0061。在一些實施例中、抗發炎劑係TNF-α拮抗劑、例如抗TNFα抗體、例如英利昔單抗(infliximab)(REMICADE®)、戈利木單抗(golimumab)(SIMPONI®)、阿達木單抗(adalimumab)(HUMIRA®)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)(CIMZIA®)或依那西普(etanercept)。
在一些實施例中，抗發炎劑係皮質類固醇。實例性皮質類固醇包括(但不限於)可體松(cortisone)(氫化可體松、氫化可體松磷酸鈉、氫化可體松琥珀酸鈉、ALA-CORT®、HYDROCORT ACETATE®、磷酸氫化可體松LANACORT®、SOLU-CORTEF®)、德卡德隆(decadron)(地塞米松(dexamethasone)、乙酸地塞米松、地塞米松磷酸鈉、DEXASONE®、DIODEX®、HEXADROL®、MAXIDEX®)、甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)(6-甲基普賴蘇濃、乙酸甲基普賴蘇濃、甲基普賴蘇濃琥珀酸鈉、DURALONE®、MEDRALONE®、MEDROL®、M-PREDNISOL®、SOLU-MEDROL®)、普賴蘇濃(prednisolone)(DELTA-CORTEF®、ORAPRED®、PEDIAPRED®、PREZONE®)、及普賴松(prednisone)(DELTASONE®、LIQUID PRED®、METICORTEN®、ORASONE®))、及雙膦酸鹽(例如帕米膦酸(pamidronate)(AREDIA®)及唑來膦酸(zoledronic acid)(ZOMETAC®)。
上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在相同或單獨調配物中)及分開投與，在該情形下，癌症免疫療法之投與可在投與另外一或多種治療劑之前、同時及/或之後發生。在一種情況下，癌症免疫療法之投與及另外之治療劑之投與彼此在約一個月內、或 在約一週、兩週或三週內、或在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內發生。
不希望受理論之束縛，認為藉由促進共刺激分子或藉由抑制共抑制分子來增強T細胞刺激可促進腫瘤細胞死亡，藉此治療癌症或延遲癌症進展。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與針對共刺激分子之激動劑聯合投與。在一些情況下，共刺激分子可包括CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127。在一些情況下，針對共刺激分子之激動劑係結合至CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127之激動劑抗體。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與針對共抑制分子之拮抗劑聯合投與。在一些情況下，共抑制分子可包括CTLA-4(亦稱為CD1 52)、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精胺酸酶。在一些情況下，針對共抑制分子之拮抗劑係結合至CTLA-4、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精胺酸酶之拮抗劑抗體。
在一些情況下，PD-L1軸結合拮抗劑可與針對CTLA-4(亦稱為CD152)之拮抗劑(例如阻斷抗體)聯合投與。在一些情況下，PD-L1軸結合拮抗劑可與伊匹單抗(亦稱為MDX-010、MDX-101或YERVOY®)聯合投與。在一些情況下，PD-L1軸結合拮抗劑可與曲美目單抗(亦稱為替西木單抗(ticilimumab)或CP-675,206)聯合投與。在一些情況下，PD-L1軸結合拮抗劑可與針對B7-H3(亦稱為CD276)之拮抗劑(例如阻斷抗體)聯合投與。在一些情況下，PD-L1軸結合拮抗劑可與MGA271聯合投與。在 一些情況下，PD-L1軸結合拮抗劑可與針對TGF-β之拮抗劑(例如美替木單抗(metelimumab)(亦稱為CAT-192)、夫蘇木單抗(fresolimumab)(亦稱為GC1008)或LY2157299)聯合投與。
在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與包含過繼轉移表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞(例如細胞毒性T細胞或CTL)之治療聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與包含過繼轉移包含顯性陰性TGFβ受體(例如顯性陰性TGF β II型受體)之T細胞之治療聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與包含HERCREEM方案之治療聯合投與(參見例如ClinicalTrials.gov Identifier NCT00889954)。
在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與針對CD137(亦稱為TNFRSF9、4-1 BB或ILA)之激動劑(例如活化抗體)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與烏瑞魯單抗(urelumab)(亦稱為BMS-663513)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與針對CD40之激動劑(例如活化抗體)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與CP-870893聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與針對OX40(亦稱為CD134)之激動劑(例如活化抗體)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與抗OX40抗體(例如AgonOX)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制 劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與針對CD27之激動劑(例如活化抗體)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與CDX-1127聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與針對吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)之拮抗劑聯合投與。在一些情況下，其中IDO拮抗劑係1-甲基-D-色胺酸(亦稱為1-D-MT)。
在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與抗體-藥物偶聯物聯合投與。在一些情況下，抗體-藥物偶聯物包含莫登素(mertansine)或單甲基奧裡斯他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與抗NaPi2b抗體-MMAE偶聯物(亦稱為DNIB0600A或RG7599)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與曲妥珠單抗艾坦辛(emtansine)(亦稱為T-DM1、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛或KADCYLA®，Genentech)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與DMUC5754A聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與靶向內皮素B受體(EDNBR)之抗體-藥物偶聯物(例如針對與MMAE偶聯之EDNBR之抗體)聯合投與。
在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與抗血管生成劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與針對VEGF之抗體(例如VEGF-A)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制 劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與貝伐珠單抗(亦稱為AVASTIN®,Genentech)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與針對血管生成素2(亦稱為Ang2)之抗體聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與MEDI3617聯合投與。
在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與抗瘤劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與靶向CSF-1R(亦稱為M-CSFR或CD115)之藥劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與抗CSF-1R(亦稱為IMC-CS4)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與干擾素(例如干擾素α或干擾素γ)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與Roferon-A(亦稱為重組干擾素α-2a)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與GM-CSF(亦稱為重組人類顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、rhuGM-CSF、沙格司亭(sargramostim)或LEUKINE®)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與IL-2(亦稱為阿地白介素或PROLEUKIN®)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與IL-12聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與靶向CD20之抗體聯合投與。在一些情況下，靶向CD20之抗體係奧妥珠單抗(obinutuzumab)(亦稱為GA101或 GAZYVA®)或利妥昔單抗(rituximab)。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與靶向GITR之抗體聯合投與。在一些情況下，靶向GITR之抗體係TRX518。
在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與癌症疫苗聯合投與。在一些情況下，癌症疫苗係肽癌症疫苗，其在一些情況下係個體化肽疫苗。在一些情況下，肽癌症疫苗係多價長肽、多肽、肽混合物、雜合肽或肽脈衝之樹突狀細胞疫苗(參見，例如，Yamada等人，Cancer Sci.104：14-21,2013)。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與佐劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與包含TLR激動劑(例如聚-ICLC(亦稱為HILTONOL®)、LPS、MPL或CpG ODN)之治療聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與腫瘤壞死因子(TNF)α聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與IL-1聯合投與，在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與HMGB1聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與IL-10拮抗劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與IL-4拮抗劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與IL-13拮抗劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與HVEM拮抗劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD- L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與ICOS激動劑聯合投與，例如藉由投與ICOS-L或針對ICOS之激動性抗體。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與靶向CX3CL1之治療聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與靶向CXCL9之治療聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與靶向CXCL10之治療聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與靶向CCL5之治療聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與LFA-1或ICAM1激動劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與選擇素激動劑聯合投與。
在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與靶向療法聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與B-Raf之抑制劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與威羅菲尼(vemurafenib)(亦稱為ZELBORAF®)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與達拉菲尼(dabrafenib)(亦稱為TAFINLAR®)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與厄洛替尼(erlotinib)(亦稱為TARCEVA®)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與MEK(例如MEK1(亦稱為MAP2K1) 或MEK2(亦稱為MAP2K2))之抑制劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與考比替尼(cobimetinib)(亦稱為GDC-0973或XL-518)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與曲美替尼(trametinib)(亦稱為MEKINIST®)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與K-Ras之抑制劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與c-Met之抑制劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與昂妥珠單抗(onartuaumab)(亦稱為MetMAb)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與Alk之抑制劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與AF802(亦稱為CH5424802或阿雷替尼(alectinib))聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)之抑制劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與BKM120聯合投與。
在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與艾代拉裡斯(idelalisib)(亦稱為GS-1101或CAL-101)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與哌立福辛(perifosine)(亦稱為KRX-0401)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與Akt之抑制劑聯合投與。在一些情況下，免 疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與MK2206聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與GSK690693聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與GDC-0941聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與mTOR之抑制劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與西羅莫司(sirolimus)(亦稱為雷帕黴素(rapamycin))聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與替西羅莫司(temsirolimus)(亦稱為CCI-779或TORISEL®)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與依維莫司(everolimus)(亦稱為RAD001)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與地磷莫司(ridaforolimus)(亦稱為AP-23573、MK-8669或地伏莫司(deforolimus))聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與OSI-027聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與AZD8055聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與INK128聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與雙重PI3K/mTOR抑制劑聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與XL765聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮 抗劑)可與GDC-0980聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與BEZ235(亦稱為NVP-BEZ235)聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與BGT226聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與GSK2126458聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與PF-04691502聯合投與。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑(例如PD-L1軸結合拮抗劑及/或CTLA4拮抗劑)可與PF-05212384(亦稱為PKI-587)聯合投與。
儘管PD-L1軸結合拮抗劑及CTLA4拮抗劑在上文被稱為實例性癌症免疫療法，但此並不意欲具有限制性；本揭示內容之任何癌症免疫療法可與本文所述之任何其他治療或業內已知之其他治療(根據醫學判斷)聯合投與。
電腦系統
本揭示內容提供經程式化以實施本揭示內容之方法之電腦系統。圖2顯示電腦系統201，其經程式化或以其他方式經構形以(例如)處理WGS資料以測定cfDNA分子之拷貝數異常(CNA)及片段長度、處理CNA以測定CNA概況變化、處理片段長度以測定片段長度概況變化、處理MS資料以測定基因體之一區中之一或多個CpG島中之每一者的平均甲基化分數、處理跨越CpG島之平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況、測定個體在一時間點之腫瘤分數、及檢測個體之腫瘤進展。電腦系統201可調節本揭示內容之分析、計算及生成之各個態樣，例如處理WGS資料以測定cfDNA分子之拷貝數異常(CNA)及片段長度、處理CNA以測定 CNA概況變化、處理片段長度以測定片段長度概況變化、處理MS資料以測定基因體之一區中之一或多個CpG島中之每一者的平均甲基化分數、處理跨越CpG島之平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況、測定個體在一時間點之腫瘤分數、及檢測個體之腫瘤進展。電腦系統201可為用戶之電子裝置或相對於電子裝置位於遠程之電腦系統。電子裝置可為移動電子裝置。
電腦系統201包括中央處理單元(CPU，在本文中亦為「處理器」及「電腦處理器」)205，其可為單核或多核處理器、或複數個用於平行處理之處理器。電腦系統201亦包括記憶體或記憶體位置210(例如，隨機存取記憶體、唯讀記憶體、快閃記憶體)、電子儲存單元215(例如，硬碟機)、用於與一或多個其他系統通信之通信介面220(例如，網路配接器)，以及周邊裝置225，例如快取記憶體、其他記憶體、資料儲存及/或電子顯示配接器。記憶體210、儲存單元215、介面220及周邊裝置225透過通信匯流排(實線)與CPU 205通信，以形成母板。儲存單元215可為用於儲存資料之資料儲存單元(或資料儲存庫)。電腦系統201藉助通信介面220可操作地耦合至電腦網路(「網路」)230。網路230可為網際網路、或與網際網路通信之網際網路及/或外部網路。在一些情形下，網路230係電信及/或資料網路。在一些實施例中，網路230可包括局域網(「LAN」)，包括但不限於乙太網(Ethernet network)、令牌環網(Token-Ring network)及/或諸如此類；廣域網；無線廣域網(「WWAN」)；虛擬網路，例如虛擬專用網路(「VPN」)；網際網路；內部網路；外部網路；無線網路，包括但不限於在IEEE 802.11協議組、業內已知之BluetoothTM協議及/或任何其他無線協議中之任一者下運行之網路；及/或該等及/或其 他網路之任何組合。網路230可包括一或多個電腦伺服器，此可使得能夠進行分布式計算，例如雲計算。舉例而言，一或多個電腦伺服器可使得能夠藉由網路230(「雲」)進行雲計算以實施本揭示內容之分析、計算及生成之各個態樣，例如處理WGS資料以測定cfDNA分子之拷貝數異常(CNA)及片段長度、處理CNA以測定CNA概況變化、處理片段長度以測定片段長度概況變化、處理MS資料以測定基因體之一區中之一或多個CpG島中每一者之平均甲基化分數、處理跨越CpG島之平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況、測定個體在一時間點之腫瘤分數、及檢測個體之腫瘤進展。該雲計算可由雲計算平臺(例如，Amazon® Web Services(AWS)、Microsoft® Azure、Google® Cloud Platform及IBM® cloud)提供。在一些情形下，網路230藉助電腦系統201可實施對等式網路，此可使得裝置能夠耦合至電腦系統201以充當客戶端或伺服器。
CPU 205可執行存儲在記憶體210上之機器可讀指令序列，其可以程式或軟體來實現。指令由CPU 205執行，其隨後可程式化或以其他方式構形CPU 205以實施本揭示內容之方法。藉由CPU 205實施之操作之實例可包括擷取、解碼、執行及回寫。
CPU 205可為電路(諸如積體電路)之一部分。電路中可包括系統201之一或多個其他組件。在一些情況下，電路係專用積體電路(ASIC)、微處理器、核或記憶體晶片。應理解，CPU可為任何類型之電子電路。
儲存單元215可儲存檔案，例如驅動器、庫及保存程式。儲存單元215可儲存使用者資料，例如，使用者偏好及使用者程式。在一些情形下，電腦系統201可包含在電腦系統201外部(諸如，位於經由內部 網路或網際網路與電腦系統201通信之遠程伺服器上)之一或多個額外資料儲存單元。
電腦系統201可藉由網路230與一或多個遠程電腦系統通信。舉例而言，電腦系統201可與使用者(例如，醫生、護士、看管人、患者或個體)之遠程電腦系統通信。遠程電腦系統之實例包括個人電腦(例如，可攜式PC)、平板(slate,tablet)PC(例如，Apple® iPad、Samsung® Galaxy Tab)、電話、智慧型手機(例如，Apple® iPhone、啟用Android®之裝置、Blackberry®)或個人數位助理。使用者可經由網路230存取電腦系統201。
如本文所闡述之方法可藉助儲存於電腦系統201之電子儲存位置上(例如，於記憶體210或電子儲存單元215上)之機器(例如，電腦處理器)可執行代碼來實施。機器可執行或機器可讀代碼可以軟體形式提供。在使用期間，可由處理器205執行代碼。在一些情形下，可自儲存單元215檢索代碼並將其儲存於記憶體210上以供處理器205就緒存取。在一些情況下，可排除電子儲存單元215，且機器可執行指令儲存於記憶體210上。
代碼可經預編譯且經構形以與具有經調適以執行代碼之處理器之機器一起使用，或可在運行時間期間經編譯。代碼可以程式化語言提供，該程式語言可經選擇以使得代碼能夠以預編譯或編譯後原樣之方式執行。
本文提供之系統及方法之態樣(例如電腦系統201)可以程式化來體現。該技術之各個態樣可被認為係「產品」或「製品」，其通常呈機器(或處理器)可執行代碼及/或相關資料之形式，其被承載在一種機器可 讀媒體上或被包含在一種機器可讀媒體中。機器可執行代碼可儲存於電子儲存單元(例如記憶體(例如，唯讀記憶體、隨機存取記憶體、快閃記憶體)或硬碟)上。「儲存」型媒體可包括電腦、處理器或諸如此類之任何或所有有形記憶體或其相關聯之模組，例如各種半導體記憶體、磁帶驅動器、磁碟驅動器及諸如此類，其可在任何時間為軟體程式化提供非暫時性儲存。軟體之全部或部分有時可經由網際網路或各種其他電信網路來通信。該等通信(例如)可使得能夠將軟體自一個電腦或處理器加載至另一電腦或處理器中，例如，自管理伺服器或主機加載至應用伺服器之電腦平臺中。因此，可承載軟體元件之另一類型之媒體包括光、電及電磁波，例如經由有線及光陸線網路以及經由各種空中鏈路在本地裝置之間之物理介面中使用。攜帶該等波之物理元件(例如有線或無線鏈路、光鏈路或諸如此類)亦可被認為係承載軟體之媒體。如本文所用，除非限於非暫時性、有形「儲存」媒體，否則諸如電腦或機器的術語「可讀媒體」係指參與向處理器提供指令以供執行之任何媒體。
因此，諸如電腦可執行代碼等機器可讀媒體可採取許多形式，包括但不限於有形儲存媒體、載波媒體或物理傳輸媒體。非揮發性儲存媒體包括(例如)光碟或磁碟，例如任何電腦中之任何儲存裝置或諸如此類，例如可用於實施附圖中所示之資料庫等。揮發性儲存媒體包括動態記憶體，例如該電腦平臺之主記憶體。有形傳輸媒體包括同軸電纜；銅導線及光纖，包括在電腦系統內構成匯流排之導線。載波傳輸媒體可採取電信號或電磁信號或者聲波或光波(例如在射頻(RF)及紅外(IR)資料通信期間產生之彼等)的形式。因此，電腦可讀媒體之常見形式包括(例如)：軟碟、軟性磁碟、硬碟、磁帶、任一其他磁性媒體、CD-ROM、DVD或 DVD-ROM、任一其他光學媒體、穿孔卡、紙帶、具有孔型樣之任一其他實體儲存媒體、RAM、ROM、PROM及EPROM、FLASH-EPROM、任一其他記憶體晶片或記憶體匣、輸送資料或指令之載波、輸送此一載波之電纜或鏈路、或電腦可自其讀取程式代碼及/或資料之任一其他媒體。該等形式之電腦可讀媒體中之多者可參與將一或多個指令之一或多個序列載送至處理器以供執行。
電腦系統201可包括電子顯示器235或與其通信，該電子顯示器包含使用者介面(UI)240，用於提供例如cfDNA分子之測定之CNA及片段長度、測定之CNA概況變化、測定之片段長度概況變化、測定之腫瘤分數、個體之檢測之腫瘤進展或無進展、檢測之腫瘤狀態(例如進展或無進展)、腫瘤進展/腫瘤無進展狀態隨時間之變化(例如以數字提供或繪圖)、測定之甲基化狀態或其變化及諸如此類。UI之實例包括(但不限於)圖形使用者介面(GUI)。GUI可包括(但不限於)基於網之使用者介面或基於應用之使用者介面，以供在移動裝置上執行。
可藉助一或多種算法實施本揭示內容之方法及系統。算法可在由中央處理單元205執行時藉助軟件來實施。該算法可(例如)處理WGS資料以測定cfDNA分子之拷貝數異常(CNA)及片段長度、處理CNA以測定CNA概況變化、處理片段長度以藉由定量在療程中來自患者之多個樣品中特定CNA信號強度之變化來測定片段長度概況變化(其顯示較不易於出現某些錯誤模式，該等錯誤模式係由基於CNA分開定量單獨樣品中之腫瘤分數引起，參見圖15A及15B)、處理MS資料以測定基因體之一區中之一或多個CpG島中每一者之平均甲基化分數、處理跨越CpG島之平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況、基於對正交資料之訓練測定個 體在一時間之腫瘤分數、並檢測個體之腫瘤進展。
儘管此闡述為統計建模技術，但亦可藉由修改各種眾所周知之機器學習技術來實施上述過程。
所列舉實施例
以下所列舉實施例代表本發明之一些態樣。
1.一種評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前；基於該第一WGS資料測定(i)該第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)該第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二WGS資料測定(iii)該第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)該第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；比較該第一複數個CNA與該第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於該第一複數個片段長度及該第二複數個片段長度測定片段長度概況變化； 至少部分地基於該CNA概況變化及該片段長度概況變化，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
2.如實施例1之方法，其中該第一或第二體液樣品選自由以下組成之群：血液、血清、血漿、玻璃體、痰、尿液、眼淚、汗液、唾液、精液、黏膜分泌物、黏液、脊髓液、腦脊髓液(CSF)、胸水、腹膜液、羊水及淋巴液。
3.如實施例1之方法，其中獲得該第一WGS資料包含對該第一複數個cfDNA分子進行定序以產生第一複數個定序讀數，或其中獲得該第二WGS資料包含對該第二複數個cfDNA分子進行定序以產生第二複數個定序讀數。
4.如實施例3之方法，其中該定序係以不超過約25X之深度實施。
5.如實施例3之方法，其中該定序係以不超過約10X之深度實施。
6.如實施例3之方法，其中該定序係以不超過約8X之深度實施。
7.如實施例3之方法，其中該定序係以不超過約6X之深度實施。
8.如實施例3之方法，其進一步包含將該第一或第二複數個定序讀數與參考基因體比對，藉此產生複數個比對之定序讀數。
9.如實施例1之方法，其進一步包含富集複數個基因體區之該第一或第二複數個cfDNA分子。
10.如實施例9之方法，其中該富集包含擴增該第一或第二複數個cfDNA分子。
11.如實施例10之方法，其中該擴增包含選擇性擴增。
12.如實施例10之方法，其中該擴增包含通用擴增。
13.如實施例9之方法，其中該富集包含選擇性分離該第一或第二複數個cfDNA分子之至少一部分。
14.如實施例13之方法，其中選擇性分離該第一或第二複數個cfDNA分子之該至少該部分包含使用複數個探針，該複數個探針中之每一者具有與該複數個基因體區之基因體區之至少一部分互補的序列。
15.如實施例13之方法，其中該至少該部分包含腫瘤標記基因座。
16.如實施例15之方法，其中該至少該部分包含複數個腫瘤標記基因座。
17.如實施例16之方法，其中該複數個腫瘤標記基因座包含一或多個選自癌症基因體圖譜(TCGA)或癌症體細胞突變目錄(COSMIC)之基因座。
18.如實施例3之方法，其中測定第一複數個CNA包含在該第一複數個定序讀數之複數個基因體區中之每一者處測定CNA之定量量度，且其中測定該第二複數個CNA包含在該第二複數個定序讀數之該複數個基因體區中之每一者處測定CNA之定量量度。
19.如實施例18之方法，其進一步包含針對GC含量及/或可映射性偏差校正該第一複數個CNA或該第二複數個CNA。
20.如實施例19之方法，其中該校正包含使用統計建模分析。
21.如實施例20之方法，其中該統計建模分析包含LOESS回歸或貝氏模型。
22.如實施例18之方法，其中該複數個基因體區包含具有預定大小 之參考基因體之非重疊基因體區。
23.如實施例22之方法，其中該預定大小係約50千鹼基(kb)、約100kb、約200kb、約500kb、約1百萬鹼基(Mb)、約2Mb、約5Mb或約10Mb。
24.如實施例18之方法，其中該複數個基因體區包含至少約1,000個不同基因體區。
25.如實施例24之方法，其中該複數個基因體區包含至少約2,000個不同基因體區。
26.如實施例1之方法，其中測定該CNA概況變化包含比較該第一複數個CNA及該第二複數個CNA與複數個參考CNA值，其中該複數個參考CNA值係自額外cfDNA分子獲得，該等額外cfDNA分子係自額外個體之額外體液樣品獲得或衍生。
27.如實施例26之方法，其中該等額外個體包含一或多個無癌症之個體。
28.如實施例26之方法，其中該等額外個體包含一或多個無腫瘤進展之個體。
29.如實施例26之方法，其中該複數個參考CNA值係使用該個體之額外體液樣品獲得，該等額外體液樣品係在該第一時間點之後之一或多個後續時間點獲得。
30.如實施例1之方法，其進一步包含過濾出滿足預定準則之該第一複數個CNA及該第二複數個CNA之亞組。
31.如實施例30之方法，其進一步包含當既定CNA值與相應參考CNA值之間之差包含不超過約1個標準偏差之差時，過濾出該第一複數個 CNA或該第二複數個CNA值之既定CNA值。
32.如實施例31之方法，其進一步包含當既定CNA值與相應參考CNA值之間之差包含不超過約2個標準偏差之差時，過濾出該第一複數個CNA或該第二複數個CNA值之既定CNA值。
33.如實施例31之方法，其進一步包含當既定CNA值與相應參考CNA值之間之差包含不超過約3個標準偏差之差時，過濾出該第一複數個CNA或該第二複數個CNA值之既定CNA值。
34.如實施例30之方法，其進一步包含基於既定CNA值與相應局部平均片段長度之間之斯皮爾曼等級相關，過濾出該第一複數個CNA或該第二複數個CNA值之既定CNA值。
35.如實施例34之方法，其進一步包含當該斯皮爾曼等級相關係數(Spearman’s rho)小於-0.1時，過濾出該第一複數個CNA或該第二複數個CNA值之既定CNA值。
36.如實施例1之方法，其進一步包含基於文庫或基因體位置正規化該第一複數個片段長度或該第二複數個片段長度。
37.如實施例1之方法，其進一步包含當該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數大於1、大於1.1、大於1.2、大於1.3、大於1.4、大於1.5、大於1.6、大於1.7、大於1.8、大於1.9、大於2、大於3、大於4或大於5時，檢測該腫瘤狀態包含該個體之腫瘤進展。
38.如實施例1之方法，其進一步包含當該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數小於0.01、小於0.05、小於0.1、小於0.2、小於0.3、小於0.4或小於0.5時，檢測該個體之主要分子反應(MMR)。
39.如實施例1至38中任一項之方法，其進一步包含以至少約50% 之靈敏度檢測該個體之該腫瘤狀態。
40.如實施例39之方法，其進一步包含以至少約70%之靈敏度檢測該個體之該腫瘤狀態。
41.如實施例40之方法，其進一步包含以至少約90%之靈敏度檢測該個體之該腫瘤狀態。
42.如實施例1至41中任一項之方法，其進一步包含以至少約50%之特異性檢測該個體之該腫瘤狀態。
43.如實施例42之方法，其進一步包含以至少約70%之特異性檢測該個體之該腫瘤狀態。
44.如實施例43之方法，其進一步包含以至少約90%之特異性檢測該個體之該腫瘤狀態。
45.如實施例44之方法，其進一步包含以至少約98%之特異性檢測該個體之該腫瘤狀態。
46.如實施例1至45中任一項之方法，其進一步包含以至少約50%之陽性預測值(PPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
47.如實施例46之方法，其進一步包含以至少約70%之陽性預測值(PPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
48.如實施例47之方法，其進一步包含以至少約90%之陽性預測值(PPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
49.如實施例1至48中任一項之方法，其進一步包含以至少約50%之陰性預測值(NPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
50.如實施例49之方法，其進一步包含以至少約70%之陰性預測值(NPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
51.如實施例50之方法，其進一步包含以至少約90%之陰性預測值(NPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
52.如實施例1至51中任一項之方法，其進一步包含以至少約0.60之曲線下面積(AUC)檢測該個體之該腫瘤狀態。
53.如實施例52之方法，其進一步包含以至少約0.75之曲線下面積(AUC)檢測該個體之該腫瘤狀態。
54.如實施例53之方法，其進一步包含以至少約0.90之曲線下面積(AUC)檢測該個體之該腫瘤狀態。
55.如實施例1至54中任一項之方法，其進一步包含當未檢測到腫瘤進展時，確定該個體腫瘤無進展。
56.如實施例1至55中任一項之方法，其進一步包含基於該個體之該確定之腫瘤狀態，投與治療有效劑量之治療以治療該個體之該癌症。
57.如實施例56之方法，其中該治療包含手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑。
58.如實施例1至57中任一項之方法，其中該檢測之腫瘤狀態指示腫瘤進展、無進展、消退或復發。
59.如實施例1至58中任一項之方法，其中該等第一及第二WGS資料係藉由焦磷酸定序、合成定序、單分子定序、奈米孔定序、半導體定序、接合定序、雜交定序、大量平行定序、鏈終止定序、單分子即時定序、Polony定序、組合探針錨定合成或基於雜交捕獲之定序獲得。
60.如實施例1至59中任一項之方法，其中該等第一及第二WGS資 料係藉由定序裝置或電腦處理器獲得。
61.一種用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的電腦系統，其包含：資料庫，其經構形以儲存(i)第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前，及(ii)第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；及一或多個可操作地耦合至該資料庫之電腦處理器，其中該一或多個電腦處理器個別地或共同地經程式化以：基於該第一WGS資料測定(i)該第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)該第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；基於該第二WGS資料測定(iii)該第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)該第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；比較該第一複數個CNA與該第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於該第一複數個片段長度及該第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；至少部分地基於該CNA概況變化及該片段長度概況變化，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分 數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數，檢測該個體之腫瘤狀態。
62.一種非暫時性電腦可讀媒體，其包含機器可執行指令，該等機器可執行指令在由一或多個電腦處理器執行時實施評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，該方法包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前；基於該第一WGS資料測定(i)該第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)該第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二WGS資料測定(iii)該第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)該第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；比較該第一複數個CNA與該第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於該第一複數個片段長度及該第二複數個片段長度測定片段長度概況變化； 至少部分地基於該CNA概況變化及該片段長度概況變化，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
63.一種評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，其包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前；基於該第一MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較跨越該一或多個CpG島之該第一平均甲基化分數概況與跨越該一或多個CpG島之該第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤 狀態。
64.如實施例63之方法，其中該第一或第二體液樣品選自由以下組成之群：血液、血清、血漿、玻璃體、痰、尿液、眼淚、汗液、唾液、精液、黏膜分泌物、黏液、脊髓液、腦脊髓液(CSF)、胸水、腹膜液、羊水及淋巴液。
65.如實施例63之方法，其中獲得該第一MS資料包含實施該第一複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第一複數個定序讀數，或其中獲得該第二WGS資料包含實施該第二複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第二複數個定序讀數。
66.如實施例65之方法，其中該甲基化定序包含全基因體亞硫酸氫鹽定序。
67.如實施例65之方法，其中該甲基化定序包含全基因體酶促甲基-seq。
68.如實施例65之方法，其中該甲基化定序包含氧化亞硫酸氫鹽定序、TET輔助之吡啶硼烷定序(TAPS)、Tet輔助之亞硫酸氫鹽定序(TABS)、氧化亞硫酸氫鹽定序(oxBS-Seq)、APOBEC耦合之表觀遺傳定序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沈澱(MeDIP)定序、羥甲基化DNA免疫沈澱(hMeDIP)定序、甲基化陣列分析、簡化代表性亞硫酸氫鹽定序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羥甲基化定序。
69.如實施例65之方法，其中該甲基化定序係以不超過約25X之深度實施。
70.如實施例65之方法，其中該甲基化定序係以不超過約10X之深度實施。
71.如實施例65之方法，其中該甲基化定序係以不超過約8X之深度實施。
72.如實施例65之方法，其中該甲基化定序係以不超過約6X之深度實施。
73.如實施例65之方法，其進一步包含將該第一或第二複數個定序讀數與參考基因體比對，藉此產生複數個比對之定序讀數。
74.如實施例65之方法，其進一步包含富集該基因體區之該第一或第二複數個cfDNA分子。
75.如實施例74之方法，其中該富集包含擴增該第一或第二複數個cfDNA分子。
76.如實施例75之方法，其中該擴增包含選擇性擴增。
77.如實施例75之方法，其中該擴增包含通用擴增。
78.如實施例74之方法，其中該富集包含選擇性分離該第一或第二複數個cfDNA分子之至少一部分。
79.如實施例78之方法，其中選擇性分離該第一或第二複數個cfDNA分子之至少該部分包含使用複數個探針，該複數個探針中之每一者具有與該基因體之該區之至少一部分互補的序列。
80.如實施例78之方法，其中該至少該部分包含腫瘤標記基因座。
81.如實施例80之方法，其中該至少該部分包含複數個腫瘤標記基因座。
82.如實施例81之方法，其中該複數個腫瘤標記基因座包含一或多個選自癌症基因體圖譜(TCGA)或癌症體細胞突變目錄(COSMIC)之基因座。
83.如實施例63之方法，其中該基因體之該區包含以下中之一或多者：CpG島、CpG島岸、患者特異性部分甲基化結構域、常見部分甲基化結構域、啟動子、基因體、均勻間隔之全基因體組格及轉座元件。
84.如實施例63之方法，其中該基因體之該區包含該基因體之複數個非重疊區。
85.如實施例84之方法，其中該基因體之該複數個非重疊區具有預定大小。
86.如實施例85之方法，其中該預定大小係約50千鹼基(kb)、約100kb、約200kb、約500kb、約1百萬鹼基(Mb)、約2Mb、約5Mb或約10Mb。
87.如實施例84之方法，其中該基因體之該複數個非重疊區包含至少約1,000個不同區。
88.如實施例87之方法，其中該基因體之該複數個非重疊區包含至少約2,000個不同區。
89.如實施例63之方法，其中測定該第一或第二腫瘤分數包含比較該甲基化分數概況與一或多個參考甲基化分數概況，其中該一或多個參考甲基化分數概況係自額外cfDNA分子獲得，該等額外cfDNA分子係自額外個體之額外體液樣品獲得或衍生。
90.如實施例89之方法，其中該等額外個體包含一或多個患有癌症之個體。
91.如實施例89之方法，其中該等額外個體包含一或多個無癌症之個體。
92.如實施例89之方法，其中該等額外個體包含一或多個具有腫瘤 進展之個體。
93.如實施例89之方法，其中該等額外個體包含一或多個無腫瘤進展之個體。
94.如實施例89之方法，其中該一或多個參考甲基化分數概況係使用該個體之額外體液樣品獲得，該等額外體液樣品係在該第一時間點之後之一或多個後續時間點獲得。
95.如實施例63之方法，其進一步包含當該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數大於1、大於1.1、大於1.2、大於1.3、大於1.4、大於1.5、大於1.6、大於1.7、大於1.8、大於1.9、大於2、大於3、大於4或大於5時，檢測該腫瘤狀態包含該個體之腫瘤進展。
96.如實施例63之方法，其進一步包含當該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數小於0.01、小於0.05、小於0.1、小於0.2、小於0.3、小於0.4或小於0.5時，檢測該個體之主要分子反應(MMR)。
97.如實施例63至96中任一項之方法，其進一步包含以至少約50%之靈敏度檢測該個體之該腫瘤狀態。
98.如實施例97之方法，其進一步包含以至少約70%之靈敏度檢測該個體之該腫瘤狀態。
99.如實施例98之方法，其進一步包含以至少約90%之靈敏度檢測該個體之該腫瘤狀態。
100.如實施例63至99中任一項之方法，其進一步包含以至少約50%之特異性檢測該個體之該腫瘤狀態。
101.如實施例100之方法，其進一步包含以至少約70%之特異性檢測該個體之該腫瘤狀態。
102.如實施例101之方法，其進一步包含以至少約90%之特異性檢測該個體之該腫瘤狀態。
103.如實施例102之方法，其進一步包含以至少約98%之特異性檢測該個體之該腫瘤狀態。
104.如實施例63至103中任一項之方法，其進一步包含以至少約50%之陽性預測值(PPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
105.如實施例104之方法，其進一步包含以至少約70%之陽性預測值(PPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
106.如實施例105之方法，其進一步包含以至少約90%之陽性預測值(PPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
107.如實施例63至106中任一項之方法，其進一步包含以至少約50%之陰性預測值(NPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
108.如實施例107之方法，其進一步包含以至少約70%之陰性預測值(NPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
109.如實施例108之方法，其進一步包含以至少約90%之陰性預測值(NPV)檢測該個體之該腫瘤狀態。
110.如實施例63至109中任一項之方法，其進一步包含以至少約0.60之曲線下面積(AUC)檢測該個體之該狀態進展。
111.如實施例110之方法，其進一步包含以至少約0.75之曲線下面積(AUC)檢測該個體之該腫瘤狀態。
112.如實施例111之方法，其進一步包含以至少約0.90之曲線下面積(AUC)檢測該個體之該腫瘤狀態。
113.如實施例63至112中任一項之方法，其進一步包含當未檢測到 腫瘤進展時，確定該個體腫瘤無進展。
114.如實施例63至113中任一項之方法，其進一步包含基於該個體之該確定之腫瘤狀態，投與治療有效劑量之第二治療劑以治療該個體之該癌症。
115.如實施例114之方法，其中該第二治療劑包含手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑。
116.如實施例63至115中任一項之方法，其中該等第一及第二複數個cfDNA分子係來自該個體之免疫細胞。
117.如實施例63至116中任一項之方法，其中該檢測之腫瘤狀態指示腫瘤進展、無進展、消退或復發。
118.如實施例63至117中任一項之方法，其中該等第一及第二MS資料係藉由定序裝置或電腦處理器獲得。
119.如實施例1至60及63至118中任一項之方法，其中該個體患有腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、腎癌、肝膽道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、甲狀腺癌或尿路癌。
120.一種用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的電腦系統，其包含：資料庫，其經構形以儲存(i)跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該 第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前，及(ii)跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；及一或多個可操作地耦合至該資料庫之電腦處理器，其中該一或多個電腦處理器個別地或共同地經程式化以：基於該第一MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；基於該第二MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較跨越該一或多個CpG島之該第一平均甲基化分數概況與跨越該一或多個CpG島之該第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數，檢測該個體之腫瘤狀態。
121.一種非暫時性電腦可讀媒體，其包含機器可執行指令，該等機器可執行指令在由一或多個電腦處理器執行時實施評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，該方法包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前； 基於該第一MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較跨越該一或多個CpG島之該第一平均甲基化分數概況與跨越該一或多個CpG島之該第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於各別甲基化分數概況，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
122.如實施例120之電腦系統或如實施例121之非暫時性電腦可讀媒體，其中該檢測之腫瘤進展至少部分地基於該等各別甲基化分數概況之一或多個統計建模分析。
123.如實施例122之系統或媒體，其中該一或多個統計建模分析包含線性回歸、簡單回歸、二元回歸、貝氏線性回歸、貝氏建模、多項式回歸、高斯過程回歸、高斯建模、二元回歸、邏輯式回歸或非線性回歸。
124.如實施例122或實施例123之系統或媒體，其中該一或多個統計建模分析比較該檢測之腫瘤進展與源自具有已知腫瘤分數之樣品的MS資料、源自純腫瘤樣品之MS資料或源自健康樣品之MS資料。
125.一種評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，其包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前；基於該第一MS資料測定該基因體之一或多個基因座中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；獲得跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二MS資料測定該基因體之一或多個基因座中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較跨越該一或多個基因座之該第一甲基化概況與跨越該一或多個基因座之該第二甲基化概況；至少部分地基於該等各別甲基化概況測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
126.如實施例125之方法，其中該等第一及第二甲基化概況包含5-羥甲基胞嘧啶狀態、5-甲基胞嘧啶狀態、基於富集之甲基化評估、中值甲基化程度、模式甲基化程度、最大甲基化程度或最小甲基化程度。
127.如實施例125或實施例126之方法，其中該第一或第二體液樣品 選自由以下組成之群：血液、血清、血漿、玻璃體、痰、尿液、眼淚、汗液、唾液、精液、黏膜分泌物、黏液、脊髓液、腦脊髓液(CSF)、胸水、腹膜液、羊水及淋巴液。
128.如實施例125之方法，其中獲得該第一MS資料包含實施該第一複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第一複數個定序讀數，或其中獲得該第二WGS資料包含實施該第二複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第二複數個定序讀數。
129.如實施例128之方法，其中該甲基化定序包含全基因體亞硫酸氫鹽定序。
130.如實施例128之方法，其中該甲基化定序包含全基因體酶促甲基-seq。
131.如實施例128之方法，其中該甲基化定序包含氧化亞硫酸氫鹽定序、TET輔助之吡啶硼烷定序(TAPS)、Tet輔助之亞硫酸氫鹽定序(TABS)、氧化亞硫酸氫鹽定序(oxBS-Seq)、APOBEC耦合之表觀遺傳定序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沈澱(MeDIP)定序、羥甲基化DNA免疫沈澱(hMeDIP)定序、甲基化陣列分析、簡化代表性亞硫酸氫鹽定序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羥甲基化定序。
132.如實施例128之方法，其進一步包含將該第一或第二複數個定序讀數與參考基因體比對，藉此產生複數個比對之定序讀數。
133.如實施例128之方法，其進一步包含富集該基因體區之該第一或第二複數個cfDNA分子。
134.如實施例128之方法，其中該基因體之該區包含以下中之一或多者：CpG島、CpG島岸、患者特異性部分甲基化結構域、常見部分甲基 化結構域、啟動子、基因體、均勻間隔之全基因體組格及轉座元件。
135.如實施例128之方法，其中該基因體之該區包含該基因體之複數個非重疊區。
136.如實施例128之方法，其中測定該第一或第二腫瘤分數包含比較該甲基化分數概況與一或多個參考甲基化分數概況，其中該一或多個參考甲基化分數概況係自額外cfDNA分子獲得，該等額外cfDNA分子係自額外個體之額外體液樣品獲得或衍生。
137.如實施例128之方法，其進一步包含當該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數大於1、大於1.1、大於1.2、大於1.3、大於1.4、大於1.5、大於1.6、大於1.7、大於1.8、大於1.9、大於2、大於3、大於4或大於5時，檢測該腫瘤狀態包含該個體之腫瘤進展。
138.如實施例128之方法，其進一步包含當該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數小於0.01、小於0.05、小於0.1、小於0.2、小於0.3、小於0.4或小於0.5時，檢測該個體之主要分子反應(MMR)。
139.如實施例128至138中任一項之方法，其進一步包含當未檢測到腫瘤進展時，確定該個體腫瘤無進展。
140.如實施例128至139中任一項之方法，其進一步包含基於該個體之該確定之腫瘤狀態，投與治療有效劑量之第二治療劑以治療該個體之該癌症。
141.如實施例128至140中任一項之方法，其中該等第一及第二複數個cfDNA分子係來自該個體之免疫細胞。
142.如實施例128至141中任一項之方法，其中該檢測之腫瘤狀態指示腫瘤進展、無進展、消退或復發。
143.如實施例128至142中任一項之方法，其中該等第一及第二MS資料係藉由定序裝置或電腦處理器獲得。
144.如實施例128至143中任一項之方法，其中該個體患有腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、腎癌、肝膽道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、甲狀腺癌或尿路癌。
145.一種用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的電腦系統，其包含：資料庫，其經構形以儲存(i)跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前，及(ii)跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；及一或多個可操作地耦合至該資料庫之電腦處理器，其中該一或多個電腦處理器個別地或共同地經程式化以：基於該第一MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者的甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；基於該第二MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者的甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較跨越該一或多個CpG島之該第一甲基化概況與跨越該一或多個CpG島之該第二甲基化概況； 至少部分地基於該等各別甲基化概況，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
146.一種非暫時性電腦可讀媒體，其包含機器可執行指令，該等機器可執行指令在由一或多個電腦處理器執行時實施評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，該方法包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前；基於該第一MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者的甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；獲得跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者的甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較跨越該一或多個CpG島之該第一平均甲基化分數概況與跨越該一或多個CpG島之該第二平均甲基化分數概況；至少部分地基於該等各別甲基化概況測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及 至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
147.一種評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前；基於該第一WGS資料測定(i)該第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)該第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之體液樣品獲得或衍生；基於該第一MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第一平均甲基化分數概況；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二WGS資料測定(iii)該第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)該第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；獲得跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之 第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於該第二MS資料測定該基因體之該區中之一或多個CpG島中之每一者之平均甲基化分數，藉此獲得第二平均甲基化分數概況；比較該第一複數個CNA與該第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於該第一複數個片段長度及該第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；比較跨越該一或多個CpG島之該第一平均甲基化分數概況與跨越該一或多個CpG島之該第二平均甲基化分數概況以測定甲基化分數概況；至少部分地基於該CNA概況變化、該片段長度概況變化及該等各別甲基化分數概況，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
148.一種評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，其包含：獲得第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一全基因體定序(WGS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前；基於該第一WGS資料測定(i)該第一複數個cfDNA分子中之第一複數個拷貝數異常(CNA)及(ii)該第一複數個cfDNA分子之第一複數個片段長度；獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第 一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之體液樣品獲得或衍生；基於該第一MS資料測定該基因體之一或多個基因座中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；獲得第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二全基因體定序(WGS)資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二WGS資料測定(iii)該第二複數個cfDNA分子中之第二複數個拷貝數異常(CNA)及(iv)該第二複數個cfDNA分子之第二複數個片段長度；獲得跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自個體之體液樣品獲得或衍生；基於該第二MS資料測定該基因體之一或多個基因座中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較該第一複數個CNA與該第二複數個CNA以測定CNA概況變化；基於該第一複數個片段長度及該第二複數個片段長度測定片段長度概況變化；比較跨越該一或多個基因座之該第一甲基化概況與跨越該一或多個基因座之該第二甲基化概況；至少部分地基於該CNA概況變化、該片段長度概況變化及該等各別甲基化分數概況，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在 該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
149.如實施例148之方法，其中該等第一及第二甲基化概況包含5-羥甲基胞嘧啶狀態、5-甲基胞嘧啶狀態、基於富集之甲基化評估、中值甲基化程度、模式甲基化程度、最大甲基化程度或最小甲基化程度。
150.如實施例147至149中任一項之方法，其中該第一WGS資料及該第一MS資料係自相同樣品獲得。
151.如實施例147至149中任一項之方法，其中該第一WGS資料及該第一MS資料係自不同樣品獲得。
152.如實施例147至151中任一項之方法，其中該第二WGS資料及該第二MS資料係自相同樣品獲得。
153.如實施例147至151中任一項之方法，其中該第二WGS資料及該第二MS資料係自不同樣品獲得。
154.如實施例147至153中任一項之方法，其中該第一或第二體液樣品選自由以下組成之群：血液、血清、血漿、玻璃體、痰、尿液、眼淚、汗液、唾液、精液、黏膜分泌物、黏液、脊髓液、腦脊髓液(CSF)、胸水、腹膜液、羊水及淋巴液。
155.如實施例147至154中任一項之方法，其中獲得該第一WGS資料包含對該第一複數個cfDNA分子進行定序以產生第一複數個定序讀數，或其中獲得該第二WGS資料包含對該第二複數個cfDNA分子進行定序以產生第二複數個定序讀數。
156.如實施例147至155中任一項之方法，其進一步包含富集複數個 基因體區之該第一或第二複數個cfDNA分子。
157.如實施例155或實施例156之方法，其中測定該第一複數個CNA包含在該第一複數個定序讀數之複數個基因體區中之每一者處測定CNA之定量量度，且其中測定該第二複數個CNA包含在該第二複數個定序讀數之該等複數個基因體區中之每一者處測定CNA之定量量度。
158.如實施例147至157中任一項之方法，其中測定該CNA概況變化包含比較該第一複數個CNA及該第二複數個CNA與複數個參考CNA值，其中該複數個參考CNA值係自額外cfDNA分子獲得，該等額外cfDNA分子係自額外個體之額外體液樣品獲得或衍生。
159.如實施例147至158中任一項之方法，其中該等第一及第二WGS資料係藉由焦磷酸定序、合成定序、單分子定序、奈米孔定序、半導體定序、接合定序、雜交定序、大量平行定序、鏈終止定序、單分子即時定序、Polony定序、組合探針錨定合成或基於雜交捕獲之定序獲得。
160.如實施例147至159中任一項之方法，其中獲得該第一MS資料包含實施該第一複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第一複數個定序讀數，或其中獲得該第二WGS資料包含實施該第二複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第二複數個定序讀數。
161.如實施例147至160中任一項之方法，其進一步包含富集該基因體區之該第一或第二複數個cfDNA分子。
162.如實施例147至161中任一項之方法，其中該基因體之該區包含以下中之一或多者：CpG島、CpG島岸、患者特異性部分甲基化結構域、常見部分甲基化結構域、啟動子、基因體、均勻間隔之全基因體組格及轉座元件。
163.如實施例147至162中任一項之方法，其中測定該第一或第二腫瘤分數包含比較該甲基化分數概況與一或多個參考甲基化分數概況，其中該一或多個參考甲基化分數概況係自額外cfDNA分子獲得，該等額外cfDNA分子係自額外個體之額外體液樣品獲得或衍生。
164.如實施例147至163中任一項之方法，其進一步包含基於該個體之該確定之腫瘤狀態，投與治療有效劑量之治療以治療該個體之該癌症。
165.如實施例164之方法，其中該治療包含手術、化學療法、放射療法、靶向療法、免疫療法、細胞療法、抗激素劑、抗代謝物化學治療劑、激酶抑制劑、甲基轉移酶抑制劑、肽、基因療法、疫苗、基於鉑之化學治療劑、抗體或檢查點抑制劑。
166.如實施例147至165中任一項之方法，其中該等第一及第二複數個cfDNA分子係來自該個體之免疫細胞。
167.如實施例147至166中任一項之方法，其中該檢測之腫瘤狀態指示腫瘤進展、無進展、消退或復發。
168.如實施例147至167中任一項之方法，其中該等第一及第二MS資料係藉由定序裝置或電腦處理器獲得。
169.如實施例147至168中任一項之方法，其中該個體患有腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、腎癌、肝膽道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、甲狀腺癌或尿路癌。
170.如實施例63至119、125至144及147至169中任一項之方法，其中該基因體之該(等)區包含一或多個MAGE(黑色素瘤相關之抗原)基因，例如人類MAGE基因。
171.如實施例63至119、125至144及147至169中任一項之方法，其中該基因體之該(等)區包含一或多個對應於一或多個MAGE(黑色素瘤相關之抗原)基因(例如人類MAGE基因)之啟動子。
實例 實例1：藉由晚期實體腫瘤中之全基因體循環腫瘤DNA早期檢測分子疾病進展
患有晚期實體腫瘤之患者之治療反應評估可為複雜的，且其他評估方法可需要更大之精密度用於早期疾病評估。當前之指南可依賴於成像，此可施加限制，例如在可確定治療有效性之前需要長時間之持續時間。使用本揭示內容之方法及系統，使用全基因體(WG)循環腫瘤DNA(ctDNA)之連續變化在治療過程早期檢測疾病進展。
入選一組97名患有晚期癌症之患者，且在開始新治療之前及之後自每一患者收集血液樣品。製備無漿細胞之DNA文庫用於WG或WG亞硫酸氫鹽定序。定量ctDNA之分數之縱向變化以二元方式(例如，「進展」或「不進展」)鑑別分子進展或反應。研究終點與第一次隨訪成像(FUI)及無進展存活(PFS)之分層一致。
結果展現，與無早期分子進展之其他患者(n=78；中值=263天，危險比(HR)=12.6[95%信賴區間(CI)為5.8至27.3]，對數秩P<1E-10，5排除在分析之外)相比，具有早期分子進展之患者具有較短之無進展存活(PFS)(n=14；中值=62天)。所有分子進展之病例皆藉由FUI確認，且分子進展在FUI之前40天之中值。在患者中以54%之靈敏度及100%之特異性鑑別臨床進展，至治療中之中值時間為24天。
基於ctDNA資料鑑別之分子進展在隨訪成像前大約6週成 功地檢測到以高特異性治療之病例之癌症患者中之疾病進展。該方法可使早期過程變化成為潛在有效之療法，藉此避免與無效治療之週期相關之副作用及成本。
本揭示內容之方法及系統可具有顯著之轉譯相關性。用於早期評估晚期實體腫瘤中之治療反應之工具可需要細化。使用本揭示內容之方法及系統，實施WG ctDNA之基線及早期連續評估以在護理標準臨床及放射照相評估之前預測治療反應。結果展現，基於血液之預測方法在成像前大約6週可靠地鑑別分子進展，在多種不同腫瘤類型及治療類型中具有非常高之特異性及陽性預測值。與未進展者患者相比，具有分子進展之患者具有顯著較短之無進展存活(PFS)。此外，腫瘤分數比之大量減少與顯著耐久益處相關。總之，該等結果展現，血液中之癌症相關變化先於臨床或成像變化，且可在治療過程中較早地告知臨床管理之變化，以改良長期患者結果並限制成本。
用於評價癌症患者中晚期實體腫瘤之治療反應之當前護理標準可基於患者之體檢、患者報告之症狀及患者之定期放射照相腫瘤評估。然而，該等方法可存在限制，此乃因疾病之細微變化通常係無症狀的，且存在與頻繁成像相關之相當大之成本、不確定性及患者焦慮。在臨床試驗中，將反應準則標準化(例如RECIST、irRECIST)以藉由將治療開始前之基線掃描及定期隨訪成像(FUI)與預先指定之反應準則進行比較來指導評估。該等準則可受以下限制：量測隨時間之可靠性、疾病之量測部位(例如，骨或胸膜滲出液)之困難及區分偽進展(例如，進展之偽陽性病例)與真實進展(例如，真陽性病例)之挑戰。因此，考慮到新治療形式之出現及關於如何最好地管理臨床治療、最小化對患者之毒性及控制成本之 持續存在問題，用於監測對治療之反應之經改良方法可為有利的。此處，評價使用WG ctDNA之動態變化之基於血液之方法用於早期評估治療反應。
液體生檢分析可分析循環無細胞DNA(cfDNA)、循環腫瘤細胞(CTC)、核糖核酸(RNA)、蛋白質、外來體、微生物體或代謝物。ctDNA可能源自經歷細胞凋亡、壞死或潛在活性機制之癌細胞，該等活性機制涉及核酸分泌以促進轉移及在遠處位點之基因表現。ctDNA之量可與腫瘤負荷及/或疾病之更晚期階段相關，且亦可受腫瘤類型、來源、轉移位置及治療之影響。ctDNA與非腫瘤cfDNA之間可存在若干分區特徵。具體地，與cfDNA相比，ctDNA可含有以下中之一或多者：腫瘤特異性體細胞點突變、結構變異、較短之片段長度、位移之片段起始及末端位置、以及表觀遺傳模式之變化。拷貝數異常(CNA)(其可包括基因體之部分之缺失、複製或更高拷貝擴增)可為吾人在患有晚期疾病之患者中在基因體之不同位點觀察到之常見形式之結構變異。此外，CNA可顯示為可藉由低通下一代定序(NGS)在來自患者之cfDNA中檢測到，其中在患有晚期疾病之患者中以較高比率檢測到CNA。然而，晚期癌症患者中CNA隨時間之變化可仍未得到充分研究。
最近，對評價ctDNA在晚期實體腫瘤中之潛在臨床效用有重大興趣。舉例而言，可展現ctDNA基因體改變之預後值及突變等位基因頻率作為腫瘤負荷之替代物。在輔助設置中，手術後之殘餘ctDNA(例如，指示最小殘存疾病)可與多種不同腫瘤類型中之疾病復發相關。在晚期疾病中，經充分驗證之臨床用途可為用已知藥物靶標鑑別驅動突變。另外，可在血液中鑑別抗性突變，從而指導臨床管理。可在腫瘤類型(例如 黑色素瘤、非小細胞肺癌、乳癌及前列腺癌)中評價ctDNA用於腫瘤反應評估之潛在作用；然而，常規評估之臨床效用可能尚未建立。
此處，在前瞻性入選之晚期泛癌同類群組中，與疾病之常規臨床及放射照相評估相比，在治療過程之早期，實施全基因體cfDNA分析作為疾病進展之分子標記或指示物。與分析特定基因相反，該方法利用基因體中之CNA及片段化模式，此係一種在多種不同腫瘤類型中具有廣泛潛在臨床應用之技術。此外，對於患者之亞組，實施亞硫酸氫鹽轉化作為分析之一部分，此提供對全基因體甲基化變化之見解。假設血液中癌症相關信號之早期變化可預測第一次FUI時之反應狀態，且信號之動態變化之幅度將提供多種實體腫瘤類型及治療中之長期預後資訊。
個體及患者之研究樣品如下獲得。研究樣品此處代表當前增長之縱向觀察研究之亞組。自2017年5月至2018年12月，參與者(年齡超過18歲)前瞻性入選美國之五個腫瘤學中心(TMPN-Cancer Care,Redondo Beach,CA；Scripps-California Cancer Associates,San Diego,CA；Sharp Memorial Hospital,San Diego,CA；Summit Cancer Centers,Post Falls,ID；Robert H.Lurie Comprehensive Cancer Center of Northwestern University,Chicago,IL)且跟蹤至2019年6月(如表1中所示)。合格性準則包括以下：呈遞時診斷非血液及手術不可切除之晚期腫瘤(III期或更高期)；開始醫師選擇之新的全身治療方案；以及藉由成像顯示存在可量測或可評價之疾病。為了包括在該同類群組中，參與者需要自至少兩個時間點獲取靜脈血液樣品：基線(在時間=T0，在治療開始之前)及在週期2(在時間=T1)及/或週期3(在時間=T2，如圖3A中所示)之前之另一時間點。該研究係根據赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)執行並 由Northwestern University、Sharp Memorial Hospital及Western Institutional Review Boards批准。在參與研究之前自每一患者獲得知情同意書。
圖3A-3B顯示根據一些實施例之臨床設置之概覽。圖3A顯示比較放射照相反應評估及cfDNA評估分子反應之潛在用途之圖。圖3B顯示研究中之患者之成像及血液收集之定時。
反應狀態之評價如下實施。在基線時對參與者進行放射學評估，並在第一次隨訪時再次進行評估，如藉由標準護理常規臨床評估所確定。研究之主要終點係放射照相進展(例如，如藉由實體腫瘤中之反應評價準則(RECIST)1.1版所確定)或臨床反應評價之證據。藉由成像可量測之疾病由對分子反應之評估不知情的治療醫師機構及獨立之放射師解釋。當由於不可評價或丟失成像研究而不能確定RECIST結果時，使用臨床反應評價。臨床反應定義為在治療改變之前醫師之結果評估，且分類為臨床進行性疾病(PD)、反應性疾病(非PD)、穩定疾病(非PD)或過早而無法評估。
PFS定義為自治療開始至PD之首次記錄或由於任何原因之死亡之時間，以先發生者為準。最後已知存活且無進展之患者在最後接觸之日期進行檢查。若患者不再係研究之一部分且其狀態係未知的(不可評估之病例)，則其被認為係失去隨訪。
樣品製備如下實施。在每一時間點，在Streck無細胞DNA血液收集管(BCT)中收集10mL全血。經由以1600×g離心15分鐘、之後在自收集時起之7天內以2500×g離心10分鐘來分離血漿。使用Qiagen QIAmp MinElute ccfDNA套組自血漿提取cfDNA，並儲存在-80℃下直至 文庫製備。對於每一患者，使用用於全基因體定序(WGS)之KAPA HyperPrep文庫製備套組(n=54個患者)或Nugen Ovation超低甲基-seq全基因體亞硫酸氫鹽定序套組(WGBS)(n=43個患者)製備文庫。輸入文庫製備物中之cfDNA平均係20奈克(ng)。在Illumina HiSeq X平臺上將文庫定序至20X之平均深度(6X至29X之範圍)。
生物資訊學方法如下實施。量測腫瘤分數比(TFR)以使用CNA評估ctDNA之變化及cfDNA片段長度之局部變化，兩者均自定序資料評估。用基於BWA、sambamba及samtools之定製生物資訊學管線將讀數與人類基因體(GRCh37)比對。然後將讀數去重複，並使用deepTools軟體包校正GC偏離量。使用基於ichorCNA及定製算法之管線來檢測CNA。藉由對文庫中片段長度分佈之中值及多個未受影響之文庫中之基因體位置進行整個化來計算正規化之片段長度。使用取自44名當前或先前未診斷任何惡性病之個體之健康正常樣品，為每一定序方案建立CNA及片段長度之背景信號(如表S1中所示)。為了最大化CNA之靈敏度同時防止偽陽性檢測，使用局部平均片段長度與拷貝數之間之斯皮爾曼等級相關作為CNA調用集之不合格者。
經由直接比較患者之時間點之間之TF之CNA源估計值來評估ctDNA隨時間之變化可能並非始終可靠，此乃因在哪個讀取深度值對應於哪個結構事件中可能存在模糊性。舉例而言，在其中存在不明確中性程度之高度突變腫瘤中，兩個區可稱為中性區及重複區、或異型接合缺失及中性區。為了規避此挑戰，將在多個時間點檢測之CNA與線性模型縱向比較以量化TFR。為了確定確信調用，將量測之變化與模擬之背景模型進行比較，且要求超過3之Z-評分臨限值。來自44名健康參與者(表S1)之樣品之縱向比較顯示TFR沒有顯著變化。舉例而言，圖8顯示根據一些實施例之健康個體之縱向WGS資料。該圖包括全基因體圖，其顯示在初始抽血(上圖)及34天後(下圖)未檢測到參與者LB-S00129之CNA，如圖4A中所示。在任一時間點顯示腫瘤分數確信增加(例如，如藉由TFR大於1所指示)之病例被歸類為分子進展。主要分子反應(MMR)定義為TFR<0.1。
統計分析如下實施。出於計算靈敏度、特異性、陽性預測值及陰性預測值之目的，將真陽性定義為其中分析顯示分子進展之情形，其亦在第一次FUI時在臨床上或藉由RECIST 1.1被評價為PD；真陰性係其中分析及臨床評價二者在第一次隨訪時皆未調用PD之情形。偽陽性及偽陰性定義為其中分子反應評估分別與具有臨床或放射照相進展或無臨床或放射照相進展之第一次FUI不一致之情形。用威爾森(Wilson)評分間隔方法計算關於該等靈敏度、特異性、陽性預測值及陰性預測值度量之信賴 區間。
使用Kaplan-Meier方法產生存活曲線，並使用對數秩測試評估分子進展者及非進展者之間之PFS差異。Cox比例危險模型用於評估不同變化幅度對PFS之效應。利用R存活包2.41-3版實施存活之統計分析，且使用python scipy包1.1.0版確定其他統計分析。
患者特徵如下獲得。總共97名患有晚期癌症之患者(其符合研究之納入準則並具有適當長期隨訪資料)獲得樣品並定序用於分析。五名參與者之基線血液樣品定序失敗，因此將其排除在外。餘92名具有NGS及臨床結果資料之患者包括在該分析中。中值年齡為70歲，且55%為女性(如表1中所示)。約一半之參與者接受一線療法(52%)，且25%接受二線療法。大多數患者患有肺癌(44%)或乳癌(27%)，且其餘代表胃腸癌(15%)、泌尿生殖系統癌(6.5%)、黑色素瘤(6.5%)及肉瘤(1%)。在研究期間，所有參與者中之46%接受化學療法(具有或無抗體治療)，且37%接受具有或無化學療法之免疫療法(n=34，表1，表S2)。第一次FUI發生較治療開始晚之中值時間為71天(圖3B，26至208天之範圍)。三名參與者進行不可評估之成像研究，且在第12週評估為臨床非PD；且兩名參與者在治療改變之前未進行成像研究且由治療醫師在第-9週及第-19週評估為臨床PD。完整同類群組之中值隨訪時間為140天(35至645天之範圍)。
在治療開始前收集所有患者之基線血液樣品(圖3B，中值=治療開始後0天，最小值=治療開始前19天)。對於每一患者收集一個或兩個治療後樣品，其中在治療開始後中值時間為21天(n=86，9至40天之範圍)在第二治療週期之前收集樣品T1，且在中值時間為42天(n=66，37至84天之範圍)在第三週期之前收集樣品T2。對於60名患者收集兩種治療後樣品。
圖4A-4E顯示根據一些實施例之用於確定分子進展之ctDNA之連續評估。圖4A顯示針對患者LS030178檢測之CNA之全基因體圖。在治療開始前13天收集T0基線抽血，且在治療開始後21天收集T1。圖4B顯示與CNA相比，正規化片段長度展示相反之模式。圖4C顯示在每一基因體位置之正規化片段長度與推測之拷貝數之間總體上存在強負相關(Spearman’s rho=-0.57,P<1E-10)。圖4D顯示患者LS030178在隨訪時間點T1及T2具有TFR之增加，其在指示進行性疾病之成像之前係可檢測的。圖4E顯示對療法有反應之患者LS030093在T1及T2顯示TFR之顯著降低，此與顯示部分反應之稍後成像一致。
ctDNA之連續量測顯示治療早期之快速變化。使用WG分析評估腫瘤分數之變化以定量基線與處理後樣品之間之TFR。在治療開始後早期觀察到TFR之實質變化(圖4A-4D)。患者LS030178展現在第一療法週期之後在時間T1時TFR快速增加至2.4之實例，指示自基線之顯著增加，之後在時間T2時甚至更大之增加(圖4A-4D)。該患者具有染色體1(1q)之長臂之體細胞增益，其可為乳癌中最常見之臂級異常之一。此外，藉由片段化模式確證CNAs之強模式(圖4B-4C)。相反，患者LS030093在時間T1顯示TFR降低，且然後在時間T2顯示較大之降低(圖4E)。
樣品之亞組具有WGS及WGBS二者，且該等WGS及WGBS用於測試TFR是否可在定序方案間等同地定量。圖9顯示根據一些實施例，定序方案間之腫瘤分數比之比較。該圖顯示13名參與者之20個處理後樣品之結果，該等樣品用WGS及WGBS二者處理。在第一次FUI時具有PD之患者之兩個樣品具有不一致之分子進展分類，TFR之量測結果接近調用邊界。TFR值在WGS與WGBS之間高度一致，使得能夠分析包 括用兩種方案分析之樣品之完整同類群組。
圖5A-5C顯示根據一些實施例，在第一或第二療法週期之後之ctDNA評估預測進展。圖5A顯示第一次FUI時之成像結果(藉由RECIST 1.1評估之SLD)與分子進展之ctDNA評估的比較，該分子進展由任一治療後樣品之TFR之可靠增加指示(靈敏度=54%，特異性=100%，PPV=100%，NPV=85%)。腳注病例顯示明顯之臨床進展。圖5B顯示與PD或非PD之放射照相或臨床評估相比，在T1(左)及T2(右)時進展者及未進展者之TFR，此顯示在每一時間點之預測性能。圖5C顯示對於分子進展之患者，分子進展之檢測較由標準護理成像檢測進展日期早之中值時間為40天(在-21至103天之範圍內)。
跟蹤早期時間點之腫瘤分數之變化預測第一次隨訪反應評估時之進展。在第一次FUI及臨床評價時，92名患者中有26名患有臨床PD，且66名患者患有非PD。為了評價ctDNA分析之預測值，吾人對於所有患者比較分子進展分類與第一次FUI時之臨床評估(圖5A)。在T1或T2時具有分子進展之所有14名患者皆患有PD，且同樣在66名非PD患者中，皆無分子進展。包括時間點T1及T2之分析之靈敏度為54%，且特異性為100%。在T1時之靈敏度為42%，且在T2時之靈敏度為61%(圖5B)。在靈敏度及抽血定時之間無統計上顯著關係。圖10顯示根據一些實施例之採樣定時及靈敏度。該圖顯示在第一次FUI時患有PD之26名參與者之42個樣品的分子進展及血液樣品定時(雙樣品Kolmogorov-Smirnov測試，P=0.15)。在分子進展被調用之情形下，首次鑑別到分子進展之時間點較由成像檢測進展早之中值時間為40天(圖5C)。
在第一次FUI時患有PD之12名患者中，其中成像與進展之 分子評估之間存在差異，3名患者未檢測到確信CNA，2名患者之腫瘤分數無顯著變化，且7名患者之腫瘤分數降低。對於與腫瘤分數降低之不一致情形，存在多種代表之癌症類型(3種乳癌、2種肺癌、1種腎癌、1種肉瘤癌)、治療(4種化學療法、1種免疫療法、1種內分泌療法、單獨1種靶向療法)及治療線(3種一線、2種二線、1種三線及1種五線)。另外，WGS與WGBS之間之預測性能無顯著差異(表S3)。
圖6A-6I顯示根據一些實施例，療程早期之分子反應評估與有利之PFS有關。圖6A顯示完整同類群組(n=92)具有211天之中值PFS。圖6B顯示在T1或T2自cfDNA檢測到分子進展之患者(n=14，中值PFS=62天)與無分子進展之患者(n=78，中值PFS=263天；HR=12.6[95% CI：5.8至27.3]；對數秩P<1E-10)相比具有顯著更差之PFS。圖6C-6D顯示基於接受有或無化學療法之免疫療法之患者(n=34；對數秩P=2E-12)(圖6C)、接受有或無靶向療法之化學療法之患者(n=42；對數秩P=7E-6)(圖6D)之治療模式的亞組分析。圖6E-6F顯示基於肺癌患者(n=40；對數秩P=8E-8)(圖6E)及乳癌患者(n=25；對數秩P=3E-4)(圖6F) 之癌症類型之亞組分析。圖6G顯示在基於分子進展解釋預測後，具有MMR之患者具有顯著更長之PFS(Cox P=0.011)。圖6H-6I顯示具有穩定疾病或部分反應之患者之亞組分析，該部分反應藉由放射照相術在第一次FUI時測定(n=65)，藉由反應狀態(對數秩P=0.4)(圖6H)或MMR(對數秩P=0.02)(圖6I)分層。
在治療早期藉由cfDNA評估之分子反應模式與PFS相關。對於患者之完整同類群組，中值PFS為211天(圖6A)。在T1或T2(n=14)具有分子進展之患者具有較短之PFS，HR=12.6(95% CI為5.8-27.3；對數秩P=7E-16)及63天之中值PFS，相比之下，無分子進展之患者(n=78)具有263天之中值PFS(圖6B)。
基於腫瘤來源及治療類型，在患者之亞組中探索分析之預測性能。在接受免疫療法之34名患者中，與未鑑別到分子進展之患者(在167天隨訪之中值後未達到中值PFS，對數秩P=2E-12)相比，在具有分子進展之患者中PFS顯著較短(中值PFS=57天)，此與完整同類群組一致(圖6C)。化學療法亞組之結果相似，在分子進展之患者中中值PFS為56天且無進展之患者中中值PFS為212天(圖6D；n=42；對數秩P=7E-6)。
對於具有兩個最大亞組之分子進展之患者，PFS亦顯著更短，該兩個最大亞組為肺癌(圖6E；對數秩P=8E-8)及乳癌(圖6F；對數秩P=3E-4)。對於混合癌症類型(胃腸癌、泌尿生殖系統癌、黑色素瘤及肉瘤)之其餘亞組亦係如此(對數秩P=5E-6)。圖11顯示根據一些實施例之其他癌症之分子反應評估及PFS。該圖顯示非肺非乳癌(n=27；對數秩P=5E-6)，如圖6E-6F中所繪製。第一次FUI時之進展預測亦在該等亞組間具有相當之性能(表S4)。總之，該等資料指示，分析在多種不同癌症類型 及治療模式之間係有效的。
此外，結果展現，在治療過程早期之大量減少與改良之PFS相關。在分析未顯示分子進展之78名患者中，27名患者在任一治療後時間點具有MMR。值得注意的是，在T1時鑑別MMR之所有病例中，若該時間點可用，則在T2亦觀察到該發現(n=12)。在7個病例中，例如對於患者LS030093，自基線之TFR在T1時未達到10倍降低，但在T2達到(圖4E)。與無MMR及無分子進展之患者(n=51；中值PFS為211天)相比，具有MMR之患者具有更長之PFS(圖6G，未達到中值PFS)。在解釋基於分子進展之預測(分層Cox：分子進展P=4E-9，MMR P=0.011)之後，MMR顯著預測PFS，指示在早期定量ctDNA動力學中對於預測長期治療效能之價值。
接下來，評估MMR之預測值連同放射照相反應監測。對於在第一次FUI時未顯示放射照相進展之患者(n=65)，在第一次FUI時之基於RECIST 1.1之部分反應相對於穩定疾病具有PFS之有限預後價值(圖6H；對數秩P=0.4；HR=0.67[95% CI為0.28至1.60])。然而，在相同亞組中，具有MMR之患者具有實質更長之PFS(圖6I；對數秩P=0.02；HR=0.28[95% CI為0.09至0.84])，其在第一次FUI時調整用於放射照相評估後亦係顯著的(分層Cox：部分反應P=0.36，MMR P=0.016)。圖12A-12B顯示根據一些實施例，在第一次FUI時非PD患者之MMR及PFS。該等圖顯示具有放射照相部分反應(n=30)(圖12A)或穩定疾病(n=35)(圖12B)之所有患者之結果。
甲基化程度之縱向變化可補充腫瘤分數變化。全域低甲基化可為腫瘤基因體之標誌，且cfDNA中全域甲基化程度之增加可與無進展相關，此乃因其可指示ctDNA之比例降低。重要的是，可在ctDNA中檢測到在腫瘤中觀察到之表觀遺傳模式(包括總體全域低甲基化)。為了評估甲基化變化之潛力以鑑別對療法之早期反應，對兩個實例性患者(圖7A-7B)回溯性地檢查自基線至治療後之全基因體甲基化程度之變化，該兩個患者係一個在第一次FUI時具有非PD調用(LS030083)且一個係在第一次FUI時具有PD調用(LS030078)。與第一次FUI時之臨床評估一致，對於LS030083觀察到甲基化程度之顯著增加(圖7A)，而在LS030078中觀察到降低(圖7B)。對於患者LS030078，基於CNA及局部片段化變化觀察到清楚分子進展(TFR=2.01)，而在LS030083中不可檢測到CNA。
圖7A-7B顯示根據一些實施例，甲基化可向CNA提供正交信號用於反應監測。該等圖顯示基線(黑線)及T1或T2(橙線)時患者 LS030083(圖7A)及LS030078(圖7B)在全基因體1百萬鹼基倉中之平均甲基化程度之分佈。
患有晚期惡性病之患者可需要仔細治療監測以評估治療效能、提高生活品質及限制藥物毒性。然而，使用臨床及放射照相評估之疾病監測之目前方法可需要若干月來確信地確定治療反應。此處，評估改良之全基因體cfDNA分子反應分析之效用，其分析基線時及治療之初始週期期間之縱向ctDNA量測值，以預測對療法之反應。該技術以100%之特異性及陽性預測值(PPV)預測疾病進展，指示該分析能夠以高置信度及可靠性在比目前護理方法標準早6週之中值時間時預測疾病進展。該發現指示，在療程早期進展之晚期腫瘤可反映為在藉由當前成像時間表及解釋可檢測之靶病灶之大小、輪廓或密度之可見變化之前很久在血液中可觀察到之信號。
該等結果指示若干其他關鍵發現。首先，基於血液之全基因體ctDNA分子分析似乎藉由超越腫瘤特異性點突變及融合之靶向評估之外而一致地在多種腫瘤及治療類型中預測疾病進展。具體地，具有最大患者數量(肺癌及乳腺癌)之兩個同類群組之亞組分析展現統計上顯著之發現，其亦在非肺及非乳房患者中共同觀察到。在不同治療(包括接受化學療法或免疫療法之患者)中遇到類似之預測值。
該等發現表明，本揭示內容之方法及系統代表用於某些患者同類群組(例如，僅用免疫療法治療之彼等)之改良之基於CNA之方法。第二，結果展現，與TFR無變化或減少較小之患者相比，具有MMR之患者具有更長之PFS，指示對療法之初始反應程度存在定量價值。在獲得之資料中，與部分反應相對於穩定疾病之RECIST 1.1分類相比，PFS與藉由 分析量測之反應程度更強相關，指示在一些情形下在第一次FUI時部分反應相對於穩定之放射照相術評估可具有有限之長期預後價值。鑑別MMR之額外預後價值支持整合連續cfDNA樣品之成像及分析以提供疾病控制之延長持續時間之早期指示的潛力。
用cfDNA之連續量測之分子反應監測對於評估疾病控制及疾病進展二者皆具有潛在臨床益處。舉例而言，若觀察到MMR，則可使用當前治療方案有效之早期保證來限制臨床成像之頻率。相反，基於血液之分子進展之早期預測可指導腫瘤學家中止無效治療，藉此減少可避免之副作用及經濟毒性。藉由加速臨床決策環，可為患者提供變為替代、潛在有效療法之機會。該評估算法可增加具有適當體能狀態之患者參與包括臨床試驗之多線療法之可用性。此外，基於血液之分析為患者提供便利，此乃因在每一治療週期期間常規地收集血液樣品。
儘管分析之特異性非常高(此係在晚期設置中臨床效用之關鍵性能度量)，但藉由包括其他特徵(例如癌症相關之表觀遺傳信號)，可提高靈敏度、特別係在最早時間點。舉例而言，在患者LS030083中，自基線至治療後全基因體甲基化程度存在顯著增加，此與在第一次FUI時之非PD調用一致，但尚未檢測到CNA(圖7A)。因此，該等基於甲基化之信號可與片段長度及拷貝數資訊一起併入分析中，以增加具有低腫瘤分數之樣品之分析靈敏度。然而，即使具有額外正交信號，亦可存在來自不產生足夠ctDNA之腫瘤(例如，非脫落腫瘤)、在最早治療週期期間尚未進展之腫瘤及/或其中藉由ctDNA分析及成像之分子進展不一致之腫瘤的殘存偽陰性率。此外，擴展之患者同類群組可用於確認分析之腫瘤及治療不可知性質。此外，可實施預測工具之前瞻性驗證。可檢查獨立驗證同類群組以 評估使用適應性臨床試驗設計之治療改變如何可藉由使用基於血液之分子反應評估更快地切換至不同治療臂來限制成本及改良長期患者結果。
總之，結果展現，與護理臨床評估標準相比，用低通定序分析全基因體ctDNA之連續監測方法產生具有高度特異性及PPV之臨床預測。另外，在多種腫瘤及治療類型中，發現係一致的，且ctDNA減少之程度與長期臨床結果相關。此非侵入性工具可更準確地使晚期癌症患者與早期之潛在有效療法匹配，藉此限制與無效治療相關之副作用及成本。
實例2：使用cfDNA甲基化及片段長度追蹤治療
使用本揭示內容之方法及系統，基於分析cfDNA片段來開發模型，以瞭解患者對癌症療法之反應。
一般而言，腫瘤源cfDNA(ctDNA)之片段比來自非癌組織之cfDNA短。ctDNA亦具有較低之總體甲基化程度。因此，開發模型以使用該資訊來確證拷貝數異常(CNA)之調用。
評估甲基化模式與CNA調用一致之程度及片段長度模式與CNA調用一致之方式。在實踐中，此係藉由定量所有基因體組格中之平均甲基化及/或片段長度(例如，基因體中每500千鹼基區)與該區中之拷貝數之間之相關性對來自個體(例如，患者)之每一文庫進行。
在具有正確地稱為CNA之真正癌症患者中，預期之觀察結果係腫瘤之拷貝數與平均甲基化分數及平均片段長度之間存在反相關性。此係由於在具有拷貝數增益(例如，在腫瘤中之拷貝數係3或更大，相比之下，在所有非腫瘤細胞中有2個拷貝)之區中，血液中之cfDNA之更大部分係腫瘤源。相反，在腫瘤僅有一個拷貝之基因體區中，預期更高之片段長度及甲基化，此乃因較小部分之cfDNA源自腫瘤細胞。
如藉由Spearman’s rho(或另一選擇為，相關性之另一統計測試，例如Pearson’s R)量測之該等相關性係數係評估樣品之CNA調用之特定組是否係真正腫瘤源而非由於定序資料中之噪音而產生之獨立方法。此允許CNA調用之改良之特異性，藉此導致更少之偽陽性，且最終導致實施患者對療法有反應或無反應之縱向監測之更有效方法。
因此，使用本揭示內容之方法及系統，cfDNA之片段長度及/或甲基化資料被用於改良CNA調用之特異性。
實例3：基於cfDNA之組合全基因體及甲基化信號監測腫瘤進展
使用本揭示內容之方法及系統，基於自cfDNA樣品之全基因體定序及甲基化識別定序(甲基-seq)獲得之兩種信號之組合實施腫瘤進展。舉例而言，可基於酶促甲基-SEQ分析經由以下方法計算腫瘤進展之組合評分。
首先，測定基於CNA之腫瘤分數比(TFR)。此可藉由分析基線時間點時患者之第一cfDNA樣品及隨後之隨訪時間點時患者之第二cfDNA樣品且然後將隨訪時間點之讀取深度文庫與患者之基線時間點進行比較來進行。
接下來，如實例4所述，基於甲基化分析確定第二癌症相關信號。接下來，將全基因體及甲基化信號組合成第一隨訪時間點與基線時間點之間之腫瘤分數之倍數變化的組合預測。全基因體及甲基化信號可使用多種方法組合，該等方法包括使用邏輯式回歸、使用對數轉換值之加權平均值(例如，等效於幾何平均值)或考慮特定患者概況中之每一量測之估計統計精密度的加權平均值。
為了便於使用，可將組合比率正規化、縮放或轉換成便利 標度上之組合分數，例如0至200之標度。舉例而言，此可藉由使用以下轉換來實施：評分=max_score/(1+1/比率)。100之評分係基線評分，評分愈高指示結果愈差(例如，更多之腫瘤進展及更低之分子反應)，且評分愈低指示結果愈好(例如，較少或無腫瘤進展及較高之分子反應)。基於該評分評估，將患者分配至三個類別之一：分子進展、主要分子反應(MMR)及無進展或無主要分子反應。
分子進展(MP)定義為腫瘤分數之統計學顯著增加，而MMR可定義為自基線時間點至隨訪時間點腫瘤分數之顯著(例如，至少10X)減少。
圖13A-13B顯示患者同類群組中該三個患者類別(MP、MMR及既非MP亦非MMR)中之每一者的Kaplan-Meier無進展存活(PFS)及總體存活(OS)圖之實例。該等圖顯示存活曲線彼此高度分離。此外，分子進展之預測以高特異性預測放射照相進展。
實例4：基於cfDNA之甲基化信號監測腫瘤進展
使用本揭示內容之方法及系統，可使用多種不同之方法自cfDNA樣品之甲基化概況提取癌症相關信號，且基於癌症相關信號監測腫瘤進展。舉例而言，該等方法可包含量測來自CpG島、島岸、PMD、啟動子、基因體、重複元件、已知癌症基因及單一CpG位點中之甲基化分數之信號。具體而言，藉由CNA調用之正交方法針對具有已知腫瘤分數之一組樣品訓練使用具有強正則化之線性回歸之甲基化腫瘤分數模型(或另一種模型)，將來自cfDNA之CNA資料併入該等腫瘤進展方法中展現有利地以增加之靈敏度(與使用全基因體資料相比)改良腫瘤進展之監測。
甲基化信號提取可包含鑑別所有文庫，其中可自CNA模式 確信地確定來自癌症患者之給定cfDNA樣品之腫瘤組分、或樣品來自未受影響之對照個體之事實。
接下來，對於每一該文庫，自甲基化定序資料確定基因體中所有CpG島(或另一選擇為，另一類區，例如島岸或啟動子)中之平均甲基化分數。可藉由例如cfDNA樣品之全基因體亞硫酸氫鹽定序或酶促甲基定序產生甲基化定序資料。
接下來，使用適宜交叉驗證方法(例如，留一參與者交叉驗證)針對甲基化模式對已知腫瘤分數進行正則化，實施回歸或建模(例如，線性回歸、簡單回歸、二元回歸、貝氏線性回歸、多項式回歸、高斯過程回歸、二元回歸、邏輯式回歸、非線性回歸等)。自該等結果，使用本揭示內容之方法及系統，可基於甲基化模式產生cfDNA樣品之腫瘤分數之預測。
即使在CNA信號低或不可檢測之情形下，甲基化信號方法亦產生cfDNA中甲基化分數之估計值。然後將甲基化信號用於組合評分模型(例如，如實例3中所述)，及/或在時間點(例如，基線時間點及一或多個隨後之隨訪時間點)之間進行比較。
可使用其他方法自cfDNA樣品中提取癌症相關甲基化信號。舉例而言，可使用主要組分分析來計算權重(例如，可觀察到第一、最顯著之主要組分與癌症高度相關，或者可能係子序列主要組分，此取決於資料中存在什麼其他變化)。作為另一實例，在應用主要組分分析之前，可基於片段長度過濾定序讀段，由此富集腫瘤源讀數。作為另一實例，可在甲基化單倍型區塊中測定甲基化單倍型負荷(MHL)，且可計算逆MHL(類似於MHL，但針對未甲基化區塊)。該等方法中之任一者或組合 可用於自定序或甲基-seq資料產生癌症相關甲基化信號。該等中之任一者或組合可用作本文所述之腫瘤分數建模之輸入。
實例5：使用cfDNA預測腫瘤基因表現用以預測治療反應
甲基化在調節基因表現中可起強作用。通常，可觀察到基因啟動子區中之甲基化抑制基因表現。舉例而言，癌症中異常甲基化之一個態樣係喪失致癌基因啟動子甲基化之正常高程度，此可導致癌基因之過度表現並因此導致更大癌狀態。具體而言，基因之MAGE(黑色素瘤相關之抗原)家族係許多癌症類型中此異常甲基化之原型。因此，例如在開發藥物候選物以靶向該等過表現之致癌基因之一之情形下，藉由液體生檢分析個體之cfDNA之甲基化狀態來測試基因過表現之能力可為有利的。
使用本揭示內容之方法及系統，經由個體之生物樣品之液體生檢分析量測目標基因在腫瘤及健康組織上之平均總甲基化程度。在MAGE基因之情形下，已知除睪丸外之所有正常成人組織中甲基化程度係組成性高的。因此，當在MAGE啟動子處觀察到甲基化降低時，此可能指示個體之腫瘤。圖14A-14C顯示在三個MAGE基因(MAGEA1、MAGEA3及MAGEA4)觀察到之甲基化之強平均減少的實例。如圖14A-14C中所見，在複數個患者之三種不同MAGE基因中觀察到甲基化之強烈平均減少，其超過低甲基化之全基因體程度。該結果指示，對於血液中具有足夠循環腫瘤DNA(ctDNA)(例如腫瘤來源之cfDNA)之患者，存在一組在正常組織中經甲基化抑制之基因。對於該組基因，可使用本揭示內容之方法及系統分析及量測腫瘤中之低甲基化及表現。
總之，腫瘤細胞可展示種系表現基因(例如MAGE之啟動子)之異常低甲基化，此導致其過表現，藉此導致癌症患者之不良後果、 結果及預後。使用本揭示內容之方法及系統，檢測該等基因之低甲基化，此允許個性化選擇靶向療法，該等靶向療法經由液體生檢靶向該等基因(例如，不需要腫瘤組織生檢或其他侵入性分析)。
可藉助一或多種算法實施本揭示內容之方法及系統。算法可在由中央處理單元205執行時藉助軟體來實現。該算法可例如處理WGS資料以測定cfDNA分子之拷貝數異常(CNA)及片段長度、處理CNA以測定CNA概況變化、處理片段長度以藉由定量在療程中來自患者之多個樣品中特定CNA信號強度之變化來測定片段長度概況變化。如圖15A及15B中所示，該等方法可較不易於出現由基於CNA分開定量單獨樣品中之腫瘤分數引起的某些錯誤模式。
儘管已在本文中顯示並闡述本發明之較佳實施例，但彼等熟習此項技術者將瞭解，此等實施例僅作為實例來提供。本發明亦非意欲受本說明書內提供之具體實例限制。儘管已參考上述說明書闡述了本發明，但對本文實施例之說明及闡釋並非意欲視為具有限制意義。彼等熟習此項技術者現將構想出許多變化、改變及替代，而並不背離本發明。此外，應瞭解，本發明之所有態樣皆並非限於本文中所闡述之特定繪示、構形或相對比例，該等繪示、構形或相對比例依賴於各種條件及變量。應瞭解，可在實踐本發明中採用本文所述本發明實施例之各種替代實施例。因此考慮本發明亦應覆蓋該等替代形式、修改形式、變化形式或等效形式。以下申請專利範圍意欲界定本發明之範圍並由此涵蓋此等申請專利範圍及其等效內容範圍內之方法及結構。

Claims (20)

  1. 一種在活體外評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，其包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前；基於該第一MS資料測定該基因體之一或多個基因座中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；獲得跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二MS資料測定該基因體之一或多個基因座中之每一者之甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較跨越該一或多個基因座之該第一甲基化概況與跨越該一或多個基因座之該第二甲基化概況；至少部分地基於該等各別甲基化概況測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
  2. 如請求項1之方法，其中該等第一及第二甲基化概況包含5-羥甲基胞 嘧啶狀態、5-甲基胞嘧啶狀態、基於富集之甲基化評估、中值甲基化程度、模式甲基化程度、最大甲基化程度或最小甲基化程度。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該第一或第二體液樣品選自由以下組成之群：血液、血清、血漿、玻璃體、痰、尿液、眼淚、汗液、唾液、精液、黏膜分泌物、黏液、脊髓液、腦脊髓液(CSF)、胸水、腹膜液、羊水及淋巴液。
  4. 如請求項1之方法，其中獲得該第一MS資料包含實施該第一複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第一複數個定序讀數，或其中獲得該第二MS資料包含實施該第二複數個cfDNA分子之甲基化定序以生成第二複數個定序讀數。
  5. 如請求項4之方法，其中該甲基化定序包含全基因體亞硫酸氫鹽定序或全基因體酶促甲基-seq。
  6. 如請求項4之方法，其中該甲基化定序包含TET輔助之吡啶硼烷定序(TAPS)、Tet輔助之亞硫酸氫鹽定序(TABS)、氧化亞硫酸氫鹽定序(oxBS-Seq)、APOBEC耦合之表觀遺傳定序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沈澱(MeDIP)定序、羥甲基化DNA免疫沈澱(hMeDIP)定序、甲基化陣列分析、簡化代表性亞硫酸氫鹽定序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羥甲基化定序。
  7. 如請求項4之方法，其進一步包含將該第一或第二複數個定序讀數與 參考基因體比對，藉此產生複數個比對之定序讀數。
  8. 如請求項4之方法，其進一步包含富集該基因體之該區之該第一或第二複數個cfDNA分子。
  9. 如請求項4之方法，其中該基因體之該區包含以下中之一或多者：CpG島、CpG島岸、患者特異性部分甲基化結構域、常見部分甲基化結構域、啟動子、基因體、均勻間隔之全基因體組格及轉座元件。
  10. 如請求項4之方法，其中該基因體之該區包含該基因體之複數個非重疊區。
  11. 如請求項4之方法，其中測定該第一或第二腫瘤分數包含比較甲基化分數概況與一或多個參考甲基化分數概況，其中該一或多個參考甲基化分數概況係自額外cfDNA分子獲得，該等額外cfDNA分子係自無癌症之額外個體之額外體液樣品獲得或衍生。
  12. 如請求項4之方法，其進一步包含當該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數大於1、大於1.1、大於1.2、大於1.3、大於1.4、大於1.5、大於1.6、大於1.7、大於1.8、大於1.9、大於2、大於3、大於4或大於5時，檢測該腫瘤狀態包含該個體之腫瘤進展。
  13. 如請求項4之方法，其進一步包含當該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分 數小於0.01、小於0.05、小於0.1、小於0.2、小於0.3、小於0.4或小於0.5時，檢測該個體之主要分子反應(MMR)。
  14. 如請求項4至13中任一項之方法，其進一步包含當未檢測到腫瘤進展時，確定該個體腫瘤無進展。
  15. 如請求項1之方法，其中該等第一及第二複數個cfDNA分子係來自該個體之免疫細胞。
  16. 如請求項1之方法，其中該檢測之腫瘤狀態為腫瘤進展、無進展、消退或復發。
  17. 如請求項1之方法，其中該等第一及第二MS資料係藉由定序裝置或電腦處理器獲得。
  18. 如請求項1之方法，其中該個體患有腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、腎癌、肝膽道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、甲狀腺癌或尿路癌。
  19. 一種用於評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的電腦系統，其包含：資料庫，其經構形以儲存(i)跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個 cfDNA分子係在第一時間點自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前，及(ii)跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；及一或多個可操作地耦合至該資料庫之電腦處理器，其中該一或多個電腦處理器個別地或共同地經程式化以：基於該第一MS資料測定該基因體之該區中之一或多個基因座中之每一者的甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；基於該第二MS資料測定該基因體之該區中之一或多個基因座中之每一者的甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較跨越該一或多個基因座之該第一甲基化概況與跨越該一或多個基因座之該第二甲基化概況；至少部分地基於該等各別甲基化概況，測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
  20. 一種非暫時性電腦可讀媒體，其包含機器可執行指令，該等機器可執行指令在由一或多個電腦處理器執行時實施評估患有癌症之個體之腫瘤狀態的方法，該方法包含：獲得跨越基因體之一區之第一複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第一甲基化定序(MS)資料，其中該第一複數個cfDNA分子係在第一時間點 自該個體之第一體液樣品獲得或衍生，其中該第一時間點係在向該個體投與經設計以治療該癌症之治療劑之前；基於該第一MS資料測定該基因體之該區中之一或多個基因座中之每一者的甲基化概況，藉此獲得第一甲基化概況；獲得跨越該基因體之該區之第二複數個無細胞DNA(cfDNA)分子之第二MS資料，其中該第二複數個cfDNA分子係在第二時間點自該個體之第二體液樣品獲得或衍生，其中該第二時間點係在向該個體投與該治療劑之後；基於該第二MS資料測定該基因體之該區中之一或多個基因座中之每一者的甲基化概況，藉此獲得第二甲基化概況；比較跨越該一或多個基因座之該第一平均甲基化分數概況與跨越該一或多個基因座之該第二平均甲基化分數概況；至少部分地基於該等各別甲基化概況測定該個體在該第一時間點之第一腫瘤分數或該個體在該第二時間點之第二腫瘤分數；及至少部分地基於該第一腫瘤分數或該第二腫瘤分數檢測該個體之腫瘤狀態。
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