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TWI888659B - 幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途 - Google Patents

幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途 Download PDF

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TWI888659B TW110137987A TW110137987A TWI888659B TW I888659 B TWI888659 B TW I888659B TW 110137987 A TW110137987 A TW 110137987A TW 110137987 A TW110137987 A TW 110137987A TW I888659 B TWI888659 B TW I888659B
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Abstract

本發明關於一種幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途，將一包含幹細胞條件培養基與至少一種細胞激素之組成物施予一癌細胞，以抑制該癌細胞生長；幹細胞條件培養基可為瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基，且至少一細胞激素選自由骨塑型蛋白-4、Dickkopf相關蛋白、干擾素β以及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體所構成之群組。

Description

幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途
本發明係關於幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途，係將幹細胞條件培養基搭配細胞激素共同使用，以有效抑制癌細胞生長。
癌症是一種細胞不正常增生、進而影響生物體正常生理機能的一種疾病，以往治療癌症的方法，包含以手術去除不正常生長的細胞組織、也會以放射線治療或是藥物治療，抑制癌細胞的生長以及誘發癌細胞死亡，但是這些治療方式會同時影響到人體正常細胞的生長、甚至導致正常細胞的死亡，影響患者的正常生理機能、甚至使得癌症患者更為虛弱。
目前雖然也有針對癌症細胞研發專一性更高的標靶藥物，但是並非每種癌症都有對應的標靶藥物，且現有的標靶藥物價格高昂、也會造成患者經濟上很大的負擔；因此研發能應用於多種癌症、且對癌細胞專一性高的治療方法，為目前重要的研究方向。
今發明人有鑑於現有抑制癌細胞生長的藥物或方法於實際使用時仍有多處缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明揭露一種幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途，將一包含幹細胞條件培養基與至少一種細胞激素(Cytokine)之組成物處理一癌細胞，以抑制該癌細胞生長。
於本發明之一實施例中，幹細胞條件培養基為瓦頓式凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell)條件培養基，其製備方法包含：將瓦頓式凝膠間葉幹細胞培養於一培養基中，培養3-5天，收集其培養基並離心過濾處理，以獲得該瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基。
於本發明之一實施例中，該至少一細胞激素係選自由骨塑型蛋白-4(Bone Morphogenetic Protein-4)、Dickkopf相關蛋白(Dickkopf-related protein)、干擾素β(Interferon-β)以及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)所構成之群組。
於本發明之一實施例中，骨塑型蛋白-4的使用濃度介於10-1000 ng/mL，Dickkopf相關蛋白的使用濃度介於10-1000 ng/mL，干擾素β的使用濃度介於1-100 pg/mL，以及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的使用濃度介於1-100 ng/mL。
於本發明之一實施例中，骨塑型蛋白-4的使用濃度為50 ng/mL，Dickkopf相關蛋白的使用濃度為10 ng/mL，干擾素β的使用濃度為10 pg/mL，以及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的使用濃度為1 ng/mL。
於本發明之一實施例中，癌細胞為人類惡性黑色素瘤細胞或是乳癌細胞。
於本發明之一實施例中，乳癌細胞為乳腺癌細胞。
藉此，本發明之幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途，將幹細胞條件培養基搭配細胞激素共同使用，於施予癌細胞後，能有效的抑制癌細胞的生長，且本發明使用的細胞激素，並不會影響正常細胞的生長，具有極高的安全性。
為令本發明之技術手段其所能達成之效果，能夠有更完整且清楚的揭露，茲藉由下述具體實施例，詳細說明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍，請一併參閱揭露之圖式。
一、瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基製備
本案實施例中使用的瓦頓氏凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell，後簡稱WJMSC)，是從財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(後簡稱BCRC)獲得，其BCRC編號為 RM60596，培養於含有20% 胎牛血清(FBS)、4 ng/mL bFGF之α-MEM培養基(後簡稱為α-MEM完全培養基)，並將細胞培養於37℃、提供5%二氧化碳(CO 2)之細胞培養箱中。
進行試驗時，以細胞數2 X 10 5之WJMSC培養於75cm 2flask內，並加入10 mL之α-MEM完全培養基，再將細胞培養於37℃、提供5%二氧化碳(CO 2)之細胞培養箱；培養3 - 4日之後，收取細胞培養基，並將細胞培養基以4℃、轉速2000 rpm之條件離心10分鐘，再將離心後之上清液以0.22 μm之網篩過濾以去除雜質，所獲得之濾液即為WJMSC條件培養基(conditioned medium，後簡稱為WJMSC-CM)；將WJMSC-CM分裝並保存於4°C，並在2日內使用完畢，否則棄之。
二、細胞激素與WJMSC條件培養基影響細胞生長分析
(一)、細胞激素使用濃度測試
此試驗中分別使用人類黑色素瘤A375細胞株以及人類乳腺癌MCF-7細胞株進行試驗，其中A375細胞株以及MCF-7細胞株都是購自於BCRC，A375細胞株的編號為60039，MCF-7細胞株的編號為60436；試驗方式簡述如下：將A375細胞以 1 X 10 4細胞/培養孔的數目，以及將MCF-7細胞以 2 X 10 4細胞/培養孔的數目，分別培養於6孔細胞培養盤，使用的細胞培養基為DMEM完全培養基(含有10% FBS之高葡萄糖DMEM培養基)；培養隔日後，移除細胞培養基，並以PBS緩衝液清洗細胞2次，再加入2 mL新鮮DMEM完全培養基、2 mL上述製備之WJMSC條件培養基、或是2 mL含有不同細胞激素的上述製備之WJMSC條件培養基；於細胞激素處理後8日，計算A375細胞的細胞數，以及於細胞激素處理後的第10日，計算MCF-7細胞的細胞數。
本試驗中使用的細胞激素包含骨塑型蛋白-4(Bone Morphogenetic Protein-4，後簡稱BMP-4)、Dickkopf相關蛋白(Dickkopf-related protein，後簡稱Dkk)、介白素-18(Interleukin-18，後簡稱IL-18)、干擾素β(Interferon-β，後簡稱IFN-β)以及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，後簡稱TRAIL)；又BMP-4的使用濃度為10、50或100 ng/mL，Dkk的使用濃度為10、50或100 ng/mL，IL-18的使用濃度為1、10或50 ng/mL，IFN-β的使用濃度為1、10或50 pg/mL，以及TRAIL的使用濃度為1、5或10 ng/mL。
請參見第一圖，為A375細胞於處理細胞激素後的細胞數試驗結果，其中DMEM組是沒有處理任何細胞激素的組別，作為控制組；WJMSC_CM組則是將細胞培養於WJMSC條件培養基、但未加入任何細胞激素的組別，亦作為控制組。與DMEM組相比，WJMSC_CM組的A375細胞數有明顯下降；處理各種細胞激素的組別，與控制組相比，A375細胞數都有明顯下降的情形；其中BMP-4組，處理50 ng/mL以及處理100 ng/mL之二組別的細胞數差異不大，因此後續以50 ng/mL的濃度處理細胞；IL-18組，三種濃度處理之細胞的數量與WJMSC_CM組相比差異不大，無統計差異，因此不於後續實驗使用；Dkk組，三種濃度處理之細胞的數量差異不大，因此後續以10 ng/mL的濃度處理細胞；INF-β組，處理10 pg/mL以及處理50 pg/mL之二組別的細胞數差異不大，因此後續以10 pg/mL的濃度處理細胞；以及TRAIL組，三種濃度處理之細胞的細胞數差異不大，因此後續以1 ng/mL的濃度處理細胞。
請再參見第二圖，為MCF-7細胞於處理細胞激素後的細胞數試驗結果，其中DMEM組是沒有處理任何細胞激素的組別，作為控制組；WJMSC_CM組則是將細胞培養於WJMSC條件培養基、但未加入任何細胞激素的組別，亦作為控制組。與DMEM組相比，WJMSC_CM組的MCF-7細胞數有明顯下降；處理各種細胞激素的組別，與控制組相比，MCF-7細胞數也有明顯下降的情形；其中BMP-4組，處理50 ng/mL以及處理100 ng/mL之二組別的細胞數差異不大，因此後續以50 ng/mL的濃度處理細胞；IL-18組，三種濃度處理之細胞的數量與WJMSC_CM組相比差異不大，無統計差異，因此不於後續實驗使用；Dkk組，三種濃度處理之細胞的數量差異不大，因此後續以10 ng/mL的濃度處理細胞；INF-β組，處理10 pg/mL以及處理50 pg/mL之二組別的細胞數差異不大，因此後續以10 pg/mL的濃度處理細胞；以及TRAIL組，三種濃度處理之細胞的細胞數差異不大，因此後續以1 ng/mL的濃度處理細胞。
(二)、WJMSC條件培養基與細胞激素共同使用對細胞生長之影響
將WJMSC、A375細胞以及MCF-7細胞，分別以 1 X 10 4細胞/培養孔、1 X 10 4細胞/培養孔，以及 1 X 10 5細胞/培養孔的數目，分別培養於6孔細胞培養盤，WJMSC使用的培養基為α-MEM完全培養基，而A375細胞以及MCF-7細胞使用的培養基為DMEM完全培養基；將細胞培養於37℃、提供5%二氧化碳(CO 2)的培養箱內；隔夜培養後，移除細胞培養基，並且加入含有不同細胞激素的新鮮培養基，再繼續培養5天之後，計算細胞數，以評估細胞的生長情形；此試驗中，WJMSC組作為控制組。
請參見第三圖，為WJMSC處理不同細胞激素後的結果，其中α-MEM組為未添加細胞激素的組別，使用的細胞激素分別為BMP-4、Dkk、INF-β以及TRAIL，激素混合物組則是將上述四種細胞激素混合後、共同處理細胞；此試驗中BMP-4使用濃度為50 ng/mL，Dkk使用濃度為10 ng/mL，INF-β使用濃度為10 pg/mL，以及TRAIL的使用濃度為1 ng/mL；根據第三圖，上述的四種細胞激素，不論是單獨處理，或是共同處理WJMSC，都不會對其的生長產生影響。
以下實驗中，DMEM組中以及α-MEM組，是分別使用這兩種培養基培養的細胞，並無添加任何細胞激素，以作為控制組；WJMSC_CM組為以不添加細胞激素的WJMSC條件培養基培養細胞的組別；激素混合物為同時添加BMP-4、Dkk、INF-β以及TRAIL四種細胞激素的組別；激素混合物/WJMSC_CM組為在WJMSC條件培養基中同時添加四種細胞激素以培養細胞的組別。
請參見第四圖，為A375細胞株的試驗結果，WJMSC_CM組，細胞數量與兩組控制組相比，已有顯著下降的趨勢，統計後p＜0.001；又，激素混合物組與控制組相比，細胞數也顯著下降，統計後p＜0.001；此外，激素混合物/WJMSC_CM組，與激素混合物組相比，細胞數量又顯著下降，其統計後p＜0.001，表示對於A375細胞株，WJMSC條件培養基與四種細胞激素同時作用，能更有效的抑制A375細胞株的生長。第五圖為A375細胞株各組別的顯微鏡照片，可以觀察到激素混合物/WJMSC_CM組的細胞數，明顯少於其他組別。
請參見第六圖，為MCF-7細胞株的試驗結果，WJMSC_CM組，細胞數量與兩組控制組相比，已有顯著下降的趨勢，統計後p＜0.01；又，激素混合物組與控制組相比，細胞數也顯著下降，統計後p＜0.001；此外，激素混合物/WJMSC_CM組，與激素混合物組相比，細胞數量又有明顯下降，其統計後p＜0.01，表示對於MCF-7細胞株，WJMSC條件培養基中與四種細胞激素同時作用，也能更有效的抑制MCF-7細胞株的生長。第七圖為MCF-7細胞株各組別的顯微鏡照片，可以觀察到激素混合物/WJMSC_CM組的細胞數，明顯少於其他組別。
綜上所述，本發明幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途，將WJMSC的條件培養基，搭配細胞激素的共同使用，能有效抑制癌細胞的生長，但是這些細胞激素並不會影響正常細胞的生長情形，使用安全性高。
本發明之幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
無
第一圖：不同細胞激素影響A375細胞生長分析圖。
第二圖：不同細胞激素影響MCF-7細胞生長分析圖。
第三圖：不同細胞激素影響WJMSC生長分析圖。
第四圖：細胞激素搭配幹細胞條件培養基影響A375細胞生長分析圖。
第五圖：細胞激素搭配幹細胞條件培養基影響A375細胞生長顯微鏡觀察照片。
第六圖：細胞激素搭配幹細胞條件培養基影響MCF-7細胞生長分析圖。
第七圖：細胞激素搭配幹細胞條件培養基影響MCF-7細胞生長顯微鏡觀察照片。
無

Claims (5)

  1. 一種幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途，係將一包含幹細胞條件培養基與至少一種細胞激素之組成物處理一癌細胞，以抑制該癌細胞生長；其中，該幹細胞條件培養基為瓦頓式凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell)條件培養基，其製備方法包含：將瓦頓式凝膠間葉幹細胞培養於一培養基中，培養3-5天，收集其培養基並無菌處理，以獲得該瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基；其中，該細胞激素係為骨塑型蛋白-4、Dickkopf相關蛋白、干擾素β以及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體所組成。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該骨塑型蛋白-4的使用濃度介於10-1000 ng/mL，該Dickkopf相關蛋白的使用濃度介於10-1000 ng/mL，該干擾素β的使用濃度介於1-100 pg/mL，以及該腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的使用濃度介於1-100 ng/mL。
  3. 如請求項2所述之用途，其中該骨塑型蛋白-4的使用濃度為50 ng/mL，該Dickkopf相關蛋白的使用濃度為10 ng/mL，該干擾素β的使用濃度為10 pg/mL，以及該腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的使用濃度為1 ng/mL。
  4. 如請求項1所述之用途，其中以該癌細胞為人類惡性黑色素瘤細胞或是乳癌細胞。
  5. 如請求項4所述之用途，其中該乳癌細胞為乳腺癌細胞。
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