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TWI887005B - Gpc3結合分子 - Google Patents

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TWI887005B
TWI887005B TW113122395A TW113122395A TWI887005B TW I887005 B TWI887005 B TW I887005B TW 113122395 A TW113122395 A TW 113122395A TW 113122395 A TW113122395 A TW 113122395A TW I887005 B TWI887005 B TW I887005B
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TW
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cells
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馬修 德雷弗
加布里埃爾 Ｍ 羅曼
莎拉 Ｋ 維曼
姿 英
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美商凱特製藥公司
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Abstract

提供抗體、其片段、嵌合抗原受體(CAR)、及T細胞受體(TCR)，其包含本文所揭示之GPC3結合域中之一或多者。提供包含其之組成物、細胞、及細胞療法。進一步提供治療方法。

Description

GPC3結合分子
本揭露係關於細胞療法之領域，且更具體而言，係關於靶向磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (glypican 3, GPC3)之抗體、CAR、及/或TCR。
人類癌症就其本質而言包含了已發生基因或表觀遺傳轉化而變成異常癌細胞之正常細胞。在此過程中，癌細胞開始表現與正常細胞所表現者不同之蛋白質及其他抗原。此等異常腫瘤抗原可由人體先天性免疫系統使用以特異性靶向及殺滅癌細胞。然而，癌細胞會採用各種機制來防止免疫細胞（諸如T及B淋巴球）成功靶向癌細胞。
當前T細胞療法使用經富集或經修飾人類T細胞以靶向並殺滅患者中之癌細胞。為了增加T細胞及NK細胞靶向並殺滅特定癌細胞之能力，已開發出方法來工程改造T細胞以表現將T細胞或NK細胞導向特定目標癌細胞之構築體。包含能夠與特定腫瘤抗原交互作用之結合域的嵌合抗原受體(CAR)及經工程改造T細胞受體(TCR)讓T細胞能夠靶向及殺滅表現該特定腫瘤抗原之癌細胞。需要靶向並殺滅癌細胞之CAR及TCR，且特別是表現磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)之細胞，諸如肝細胞癌(HCC)細胞。
揭示一種抗體或其抗原結合片段，其包含GPC3結合域，其中GPC3結合域包含SEQ ID NO: 3之重鏈可變區(HCVR)的三個重鏈互補決定區(HCDR)之序列、及SEQ ID NO: 14之輕鏈可變區(LCVR)的三個輕鏈CDR (LCDR)之序列。在實施例中，GPC3結合域結合域包含：第一域，其包含三個重鏈互補決定區（HCDR1、HCDR2、及HCDR3）；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區（LCDR1、LCDR2、及LCDR3），其中(i) HCDR1具有根據SEQ ID NO: 5至7中任一者之序列；(ii) HCDR2具有根據SEQ ID NO: 8至10中任一者之序列；(iii) HCDR3具有根據SEQ ID NO: 11至13中任一者之序列；(iv) LCDR1具有根據SEQ ID NO: 16至18中任一者之序列；(v) LCDR2具有根據SEQ ID NO: 19至21中任一者之序列；且(vi) LCDR3具有根據SEQ ID NO: 22至24中任一者之序列。在實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：第一域，其包含三個重鏈互補決定區(HCDR)；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中：HCDR及LCDR包含：(i)根據SEQ ID NO: 5至7中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 8至10中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 11至13中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 16至18中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 19至21中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 22至24中任一者之LCDR3。在實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：包含三個HCDR之第一重鏈可變域及包含三個LCDR之輕鏈可變域，其中：(i)重鏈可變域與SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 39、或SEQ ID NO: 45至少80%同一；且(ii)輕鏈可變域與SEE ID NO: 14、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 41、或SEQ ID NO: 47至少80%同一。在實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：包含三個HCDR之第一重鏈可變域及包含三個LCDR之輕鏈可變域，其中：(i)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 3至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 14至少80%同一；(ii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 27至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 29至少80%同一；(iii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 33至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 35至少80%同一；或(iv)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 39至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 41至少80%同一；或(v)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 45至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 47至少80%同一。在實施例中，三個HCDR及三個LCDR係由單一多肽構成。在實施例中，其抗原結合片段包含scFv。在實施例中，scFv包含根據SEQ ID NO: 25、31、37、43、或49中之一者之胺基酸序列。
揭示一種嵌合抗原受體，其係由所揭示之抗體或其抗原結合片段構成。在實施例中，嵌合抗原受體進一步包含4-1BB/CD137之跨膜域、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、2B4、CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、NKG2D、或T細胞受體之ζ鏈、或其任何組合。
揭示一種核酸，其編碼所揭示之嵌合抗原受體、抗體、或其抗原結合片段。揭示一種重組載體，其包含所揭示之核酸。在實施例中，核酸及/或重組載體進一步包含編碼顯性負性TGFβ受體(DN TGFβR)之核酸，其包含：來自TGF–β受體之胞外域(ECD)及跨膜域(TMD)，其中重組多肽缺乏在野生型TGF–β受體中存在的負責信號傳導及磷酸化之胺基酸殘基。
揭示一種宿主細胞，其經所揭示之核酸或重組載體轉化。在實施例中，將宿主細胞用以下轉化：編碼所揭示之嵌合抗原受體、抗體、或其抗原結合片段之核酸；及編碼顯性負性TGFβ受體(DN TGFβR)之核酸。在實施例中，將宿主細胞用編碼膜結合IL-15-IL-15Rα壽司(sushi)域嵌合受體之核酸轉化。在實施例中，宿主細胞包含iPSC、T細胞、或NK細胞。揭示一種醫藥組成物，其包含所揭示之T細胞及/或NK細胞。
揭示一種治療有需要之患者之疾病的方法，其包含投予所揭示之T細胞及/或NK細胞、或包含所揭示之T細胞及/或NK細胞的醫藥組成物。在實施例中，疾病係肝細胞癌。揭示一種在對象中誘導免疫反應或使對象針對肝細胞癌免疫之方法，該方法包含向對象投予所揭示之T細胞及/或NK細胞或包含所揭示之T細胞及/或NK細胞之醫藥組成物。在實施例中，T細胞及/或NK細胞對患者係同種異體的。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2021年6月08日申請且標題為「GPC3 Binding Molecules」之美國臨時專利申請案第63/208,274號之優先權，其全文以引用之方式併入本文中。 用語
為了能更輕易理解本揭露，以下先定義某些用語。下列用語及其他用語之額外定義係在本說明書中各處闡述。
如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」、及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
除非有具體陳述或自上下文中明顯可知，如本文中所使用，用語「或(or)」係理解為涵括性的且同時涵蓋「或(or)」與「及(and)」。
在本文中，將使用用語「及/或(and/or)」之處認為是具體揭露兩個指定特徵或組分之各者（包含或不包含另一者）。因此，如用於諸如「A及/或B」之詞組中的用語「及/或」在本文中係意欲包括A及B；A或B；A（單獨）；及B（單獨）。同樣地，如用於諸如「A、B、及/或C」之詞組中的用語「及/或」係意欲涵蓋下列態樣之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A（單獨）；B（單獨）；及C（單獨）。
如本文所使用，用語「例如( e.g.)」僅作為實例所使用，但不意欲限制，且不應解釋為僅參考本說明書中明確列舉之彼等項目。
用語「或更多(or more)」、「至少(at least)」、「多於(more than)」、及類似者，例如「至少一個(at least one)」應理解為包括但不限於至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或多於所述值。亦包括的是任何更大之數目或其間之分數。
相反地，用語「不多於(no more than)」包括少於所述值之各值。例如，「不多於100個核苷酸」包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、及0個核苷酸。亦包括的是任何更小之數目或其間之分數。
用語「複數(plurality)」、「至少二(at least two)」、「二或更多(two or more)」、「至少第二(at least second)」、及類似者係理解為包括但不限於至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。亦包括的是任何更大之數目或其間之分數。
在本說明書各處，詞語「包含(comprising)」或諸如「comprises」或「comprising」之變型將理解為有意涵括所述元素、整數、或步驟、或元素組、整數組、或步驟組，但不排除任何其他元素、整數、或步驟、或元素組、整數組、或步驟組。應理解的是，在本文中以用語「包含」描述的態樣之處，亦另提供以用語「由…所組成(consisting of)」及/或「基本上由…所組成(consisting essentially of)」所描述之類似態樣。
除非特定陳述或從上下文顯而易見，否則用語「約(about)」係指藉由所屬技術領域中具有通常知識者所判定之特定值或組成之可接受誤差範圍內之一值或組成，其將部分取決於該值或組成如何測量或判定，即，測量系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含(comprising essentially of)」可意指根據所屬技術領域中之實踐之一或多個標準差內。「約」或「基本上包含」可意指至多10%之範圍（即±10%）。因此，「約」可理解為在10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、或0.001%內大於或小於所述值。例如，約5 mg可包括在4.5 mg與5.5 mg之間的任何量。此外，特別是關於生物系統或程序，用語可意指至多一個數量級或至多5倍之值。除非另外說明，否則在本揭露中提供特定值或組成時，應假設「約」或「基本上包含」之意義係在該特定值或組成之可接受誤差範圍內。
如本文中所述，任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍、或整數範圍係理解為涵括所述範圍內之任何整數值，並且在適當時亦涵括其分數（諸如整數之十分之一及百分之一），除非另有指示。
本文中所使用之單位、前綴、及符號係使用其國際單位制(SI)公認形式來提供。數字範圍涵括定義該範圍之數字。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語具有與本揭露所相關之技術領域中具有通常知識者一般理解者相同的意義。舉例而言，Juo，「The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology」，2 nded., (2001), CRC Press；「The Dictionary of Cell & Molecular Biology」，5 thed., (2013), Academic Press；及「The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology」，Cammack et al.eds., 2 nded, (2006), Oxford University Press，提供所屬技術領域中具有通常知識者用於本揭露之許多用語的一般詞典。
「投予(administering)」係指使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何各種方法及遞送系統將藥劑實體引入對象中，諸如本文所揭示之經修飾之T細胞或NK細胞。用於本文所揭示之配方的例示性投予途徑包括靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、脊椎、或其他腸胃外投予途徑，例如藉由注射或輸注。片語「腸胃外投予(parenteral administration)」意指除腸內及局部(topical)投予以外的投予模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴內(intralymphatic)、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下(subcuticular)、關節內、囊下、蜘蛛膜下、脊椎內、硬膜外、及胸骨內注射及輸注、以及體內電穿孔。在一些實施例中，配方經由非腸胃外途徑投予，例如經口。其他非腸胃外途徑包括局部、上皮或黏膜投予途徑，例如，鼻內、陰道內、直腸、舌下、或局部。亦可執行投予，例如一次、多次、及/或經過一或多個延伸週期。
用語「經活化(activated)」及「活化(activation)」係指已經足夠刺激以誘導可偵測細胞增生之T細胞的狀態。在一個實施例中，活化亦可與誘導之細胞介素產生及可偵測效應功能相關。用語「經活化T細胞(activated T cell)」尤其係指增生之T細胞。透過單獨TCR產生的信號可能不足以完全活化T細胞，且亦可能需要一或多個二級或共刺激信號。因此，T細胞活化包含透過TCR/CD3複合物之初級刺激信號及一或多個二級共刺激信號。共刺激可藉由已接受初級活化信號之T細胞（諸如透過TCR/CD3複合物之刺激）的增生及/或細胞介素產生來證明。
用語「藥劑(agent)」可指任何類別之分子或實體，其包含或係複數個分子或實體，其中任一者可係例如多肽、核酸、醣、脂質、小分子、金屬、細胞（諸如T細胞或NK細胞或此類細胞之先驅細胞，例如iPSC）、或有機體（例如其部分或提取物）、或其組分。在一些實施例中，藥劑可以單離或純形式使用。在一些實施例中，藥劑可以粗製或不純形式使用。在一些實施例中，藥劑可被提供為群體、集合、或庫，例如可經篩選以識別或表徵其中存在之成員。
用語「同種異體(allogeneic)」係指衍生自一個個體之任何材料，其接著引入相同物種之另一個體，例如同種異體T細胞或NK細胞移植。
用語「抗體(antibody)」(Ab)包括但不限於特異性結合至抗原之醣蛋白免疫球蛋白。一般而言，且抗體可包含至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈，其等藉由二硫鍵或其抗原結合分子互相連接。各H鏈包含重鏈可變區（在本文中縮寫為VH）及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定域，CH1、CH2、及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（在本文中縮寫為VL）及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定域CL。VH及VL區可進一步細分成高度變異區，稱為互補決定區(CDR)，其中散布稱為架構區(FR)之更具保守性的區。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，以下列順序從胺基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合域。Ab之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統之各種細胞（例如效應細胞）及經典補體系統之第一組分(C1q)。一般而言，人類抗體係大約150 kD之四聚體藥劑，由兩個同一之重(H)鏈多肽（各自約50 kD）及兩個同一之輕(L)鏈多肽（各自約25 kD）組成，其等彼此締合成一般稱為「Y形狀」結構。重鏈及輕鏈藉由單一二硫鍵彼此相連或連接；其他兩個二硫鍵將重鏈鉸鏈區彼此連接，使得二聚體彼此連接並形成四聚體。天然產生之抗體亦經醣化，例如在CH2域上。
用語「人類抗體(human antibody)」意欲包含具有可變及恆定域序列之抗體，其由人類免疫球蛋白序列或與其無法區分之序列產生、組裝、或衍生。在一些實施例中，抗體（或抗體組分）可視為「人類」，即使其胺基酸序列包含未由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之殘基或元素（例如藉由體外隨機或位點特異性突變誘發引入之變體，或藉由體內體細胞突變引入之變體）。用語「人源化(humanized)」意欲包含具有可變域之抗體，該可變域之序列衍生自非人類物種（例如小鼠）之可變域，經修飾以更類似於人類生殖系編碼之序列。在一些實施例中，「人源化」抗體包含一或多個實質上具有人類架構域之胺基酸序列的架構域、及一或多個實質上具有與非人類抗體之胺基酸序列相同之胺基酸序列的互補決定區。在一些實施例中，人源化抗體包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常係人類免疫球蛋白恆定域之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體可包含人類重鏈恆定域之C H1、鉸鏈、C H2、C H3、及可選地C H4區。
抗體可包括例如單株抗體、重組產生之抗體、單特異性抗體、多特異性抗體（包括雙特異性抗體）、人類抗體、經工程改造之抗體、人源化抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚體抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、內抗體(intrabody)、抗體融合（在本文中有時稱為「抗體接合物(antibody conjugate)」）、異源接合物抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)、駱駝化抗體(camelized)、親合抗體(affybody)、Fab片段、F(ab’) 2片段、雙硫鍵連接之Fv (sdFv)、抗獨特型(anti-idiotypic)（抗Id）抗體（包括例如抗-抗Id抗體）、微抗體(minibody)、域抗體、合成抗體（在本文中有時稱為「抗體擬似物(antibody mimetic)」）、及任何上述者之抗原結合片段。在某些實施例中，本文所述之抗體係指多株抗體群。抗體亦可包含例如Fab′片段、Fd′片段、Fd片段、經單離CDR、單鏈Fv、多肽-Fc融合、單域抗體（例如鯊魚單域抗體，諸如IgNAR或其片段，及UniAb®單重鏈抗體）、駱駝科動物抗體、單鏈或串聯雙抗體(TandAb®)、Anticalins®、Nanobodies®微抗體、BiTE®、錨蛋白重複蛋白或DARPINs®、Avimers®、DART、類TCR抗體、Adnectins®、Affilins®、Trans-bodies®、Affibodies®、TrimerX®、微蛋白、Fynomers®、Centyrins®、及KALBITOR®。
免疫球蛋白可衍生自通常已知同型中之任一者，包括但不限於IgA、分泌IgA、IgG、IgE、及IgM。IgG亞類亦為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，且包括但不限於人類IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。「同型(isotype)」係指由重鏈恆定區基因編碼之Ab類或亞類（例如IgM或IgG1）。用語「抗體(antibody)」包括舉實例而言天然存在及非天然存在之Ab兩者；單株及多株Ab；嵌合及人源化Ab；人類或非人類Ab；全合成Ab；及單鏈Ab。非人類Ab可藉由重組方法來人源化以減少其在人中之免疫原性。在未明確陳述之情況下，且除非上下文另外指示，否則用語「抗體(antibody)」亦包括任何前述免疫球蛋白之抗原結合片段或抗原結合部分，且包括單價及二價片段或部分及單鏈Ab。
「抗原結合分子(antigen binding molecule)」、「抗原結合部分(antigen binding portion)」、「抗原結合片段(antigen binding fragment)」、或「抗體片段(antibody fragment)」或「抗原結合域(antigen binding domain)」係指包含衍生分子之抗體之抗原結合部分（例如CDR）之任何分子。抗原結合分子可包括抗原互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括但不限於形成自抗原結合分子之Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段、dAb、線性抗體、scFv抗體、及多特異性抗體。肽體(peptibody)（亦即，包含肽結合域之Fc融合分子）係合適抗原結合分子之另一個實例。在一些實施例中，抗原結合分子結合至腫瘤細胞上之抗原。在一些實施例中，抗原結合分子結合至涉及過度增生性疾病之細胞上的抗原或結合至病毒或細菌抗原。在某些實施例中，抗原結合分子係嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。在某些實施例中，抗原結合分子或域結合至磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)。在某些實施例中，抗原結合分子或域係特異性結合至抗原之抗體片段，包括其互補決定區(CDR)之一或多者。在進一步實施例中，抗原結合分子係單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，抗原結合分子或域包含親和性多聚體(avimer)或由親和性多聚體組成。
在一些情況下，CDR與參考抗體（例如本揭露之抗體）中所發現之一個CDR及/或本揭露中所提供之CDR之序列實質上同一。在一些實施例中，CDR與參考CDR（例如在本揭露中提供之CDR）實質上同一，其中與參考CDR相比，其序列同一或含有介於1、2、3、4或5（例如1至5）之間的胺基酸取代。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上同一，其中其顯示與參考CDR至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列同一性（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95至100%）。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上同一，其中其顯示與參考CDR至少96%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列同一性。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上同一，其中相較於參考CDR，CDR內之一個胺基酸經缺失、添加、或取代，而該CDR之其他部分具有與參考CDR之胺基酸序列同一之胺基酸序列。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上同一，其中相較於參考CDR，CDR內之2、3、4、或5（例如2至5）個胺基酸經缺失、添加、或取代，而該CDR之其他部分具有與參考CDR之胺基酸序列同一之胺基酸序列。在各種實施例中，抗原結合片段與參考抗體結合相同抗原。在各種實施例中，抗原結合片段與參考抗體交叉競爭，例如結合至與參考抗體實質上相同或同一之表位。
抗原結合片段可藉由任何手段產生。舉例而言，在一些實施例中，抗原結合片段可藉由完整抗體碎斷而酶促或化學產生。在一些實施例中，抗原結合片段可重組產生（諸如藉由經工程改造之核酸序列之表現）。在一些實施例中，抗原結合片段可完全或部分地合成產生。在一些實施例中，抗原結合片段可具有至少約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190個胺基酸或更多之長度；在一些實施例中，至少約200個胺基酸（例如50至100、50至150、50至200、或100至200個胺基酸）。
用語「可變區(variable region)」或「可變域(variable domain)」可互換使用。可變區一般係指抗體之一部分，通常係輕鏈或重鏈之一部分，一般係成熟重鏈中胺基端的約110至120個胺基及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其在抗體之間的序列差異很大，且係用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列之變異性集中在稱為互補決定區(CDR)之區中，而可變域中更高度保守的區稱為架構區(FR)。不希望受任何特定機制或理論束縛，咸信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之交互作用及特異性。在某些實施例中，可變區係人類可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及人類架構區(FR)。在實施例中，可變區係靈長類（例如非人類靈長類）可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及靈長類（例如非人類靈長類）架構區(FR)。
用語「VL」及「VL域(VL domain)」可互換使用以指抗體或其抗原結合分子之輕鏈可變區。
用語「VH」及「VH域(VH domain)」可互換使用以指抗體或其抗原結合分子之重鏈可變區。
通常使用之CDR之許多定義：Kabat編號、Chothia編號、AbM編號、或Contact編號。AbM定義係Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體所使用之兩者之間之妥協。Contact定義係基於可用複雜晶體結構之分析。 表1. CDR編號
環 Kabat AbM Chothia Contact
L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36
L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55
L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96
H1 H31--H35B（Kabat編號） H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B
H1 H31--H35（Chothia編號） H26--H35 H26--H32 H30--H35
H2 H50--H65 H50--H58 H52--H56 H47--H58
H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101
用語「Kabat編號(Kabat numbering)」及類似用語在所屬技術領域中被認可，且指抗體或其抗原結合分子之重鏈及輕鏈可變區中之編號胺基酸殘基之系統。在某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統判定（參見例如Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA et al.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR一般存在於胺基酸位置31至35，其可選地可包括一或兩個35以後之額外胺基酸（在Kabat編號方案中稱為35A及35B）(CDR1)、胺基酸位置50至65 (CDR2)、及胺基酸位置95至102 (CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR一般存在於胺基酸位置24至34 (CDR1)、胺基酸位置50至56 (CDR2)、及胺基酸位置89至97 (CDR3)。在一特定實施例中，本文所述之抗體之CDR已根據Kabat編號方案判定。
在某些態樣中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案判定，其係指免疫球蛋白結構環之位置（參見例如Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917；Al-Lazikani B et al.,(1997) J Mol Biol 273: 927-948；Chothia C et al.,(1992) J Mol Biol 227: 799-817；Tramontano A et al.,(1990) J Mol Biol 215(1): 175-82；及美國專利第7,709,226號）。一般而言，當使用Kabat編號慣例，Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33、或34處，Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56處，且Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102處，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34處，Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56處，且Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97處。在使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-HI環之結束在H32與H34之間之變化，取決於環的長度（此係因為Kabat編號方案將插入部分置於H35A及H35B處；若35A及35B均不存在，則環在32處結束；若僅存在35A，則環在33處結束；若35A及35B均存在，則環在34處結束）。在一特定實施例中，本文所述之抗體之CDR已根據Chothia編號方案判定。
用語「恆定區(constant region)」及「恆定域(constant domain)」可互換且具有所屬技術領域中通用的含義。恆定區係抗體部分，例如輕鏈及/或重鏈之羧基端部分，其不直接涉及抗體與抗原之結合，但可展現各種效應功能，諸如與Fc受體交互作用。免疫球蛋白分子之恆定區通常具有相對於免疫球蛋白可變域更保守之胺基酸序列。
當參考抗體使用時，用語「重鏈(heavy chain)」可指任何不同類型，例如α、δ、ε、γ、及µ，基於恆定域之胺基酸序列，其各別產生IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM類別之抗體，包括IgG之亞類，例如IgG 1、IgG 2、IgG 3、及IgG 4。
當參考抗體使用時，用語「輕鏈(light chain)」可指任何不同類型，例如基於恆定域之胺基酸序列之κ或λ。輕鏈胺基酸序列係所屬技術領域中所熟知。在特定實施例中，輕鏈係人類輕鏈。
「抗原(antigen)」係指可刺激人類或動物產生抗體或T細胞反應之化合物、組成物或物質，包括組成物（諸如包括腫瘤特異性蛋白質之一者），該等組成物被注射或吸收至人類或動物中。抗原與特定體液或細胞免疫之產物反應，包括藉由異源抗原（諸如所揭示之抗原）所誘導者。「目標抗原(target antigen)」或「所關注之目標抗原(target antigen of interest)」係在其他正常（所欲）細胞之表面上未實質上發現之抗原，且本文所涵蓋之TCR或CAR之結合域經設計以結合至其。所屬技術領域中具有通常知識者將容易地理解，任何大分子包括幾乎所有蛋白質或肽可作為抗原。抗原可內源性表現，亦即由基因體DNA表現，或可重組表現。抗原可對特定組織（諸如癌細胞）具有特異性，或其可廣泛表現。此外，較大分子之片段可充當抗原。在一個實施例中，抗原係腫瘤抗原。在一個具體實施例中，抗原係磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)之全部或片段。「目標(target)」係藉由結合域、抗原結合系統、CAR、或抗原結合劑（例如抗體）結合之任何分子。
「抗原特異性靶向區(antigen-specific targeting region)」(ASTR)係指靶向特定抗原之CAR、抗體、或TCR之區。CAR或TCR上之靶向區係胞外。在一些實施例中，抗原特異性靶向區包含抗體或其功能等效物或其片段或其衍生物，且靶向區之各者靶向不同抗原。靶向區可包含全長重鏈、Fab片段、單鏈Fv (scFv)片段、二價單鏈抗體或雙抗體，其各者對目標抗原具有特異性。然而，許多替代方案，諸如連接細胞介素（其導致識別帶有細胞介素受體之細胞）、親和抗體(affibody)、來自天然存在受體之配體結合域、受體之可溶性蛋白質/肽配體（例如在腫瘤細胞上）、肽、及疫苗，以促使免疫反應，其可各自用於本揭露案之各種實施例中。事實上，如所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解，幾乎任何與具有高親和力之給定抗原結合之分子均可用作抗原特異性靶向區。
「抗原呈現細胞(Antigen presenting cell)」或「APC」係指處理並向T細胞呈現抗原之細胞。例示性APC包含樹突細胞、巨噬細胞、B細胞、某些活化上皮細胞、及能夠TCR刺激及適當T細胞共刺激之其他細胞類型。
「抗腫瘤效應(anti-tumor effect)」係指可呈現為下列之生物效應：腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增生減少、轉移數目減少、整體或無進展存活期增加、預期壽命增加、或改善與腫瘤相關之各種生理症狀。抗腫瘤效應亦可指預防腫瘤出現。
若一者之存在、水平、及/或形式與另一者相關，則兩個事件或實體「相關聯(associated)」。例如，若實體（例如多肽、基因印記、代謝物、微生物等）之存在、水平、及/或形式與疾病、病症、或病況之發生率及/或易感性相關（例如跨越相關群體），則實體被視為與疾病、病症、或病況相關聯。例如，若二或更多個實體直接或間接交互作用，則其等彼此實體上「相關聯」，使得其等彼此係且/或保持在實體上接近（例如結合）。在額外的實例中，彼此實體上相關聯的二或更多個實體係彼此共價鍵聯或連接，或例如藉由氫鍵、凡得瓦交互作用、疏水性交互作用、磁性、及其組合之手段非共價締合。
用語「自體(autologous)」係指任何衍生自相同個體之材料，該材料之後會再重新引入至該個體。例如，本文所述之經工程改造之自體細胞療法(eACT™)方法涉及自患者收集淋巴球，接著將其工程改造以表現例如CAR構築體，接著投予回同一位患者。
「結合親和力(binding affinity)」通常係指分子（例如抗體）之單一結合位點與其結合夥伴(partner)（例如抗原）之間的非共價交互作用之總和的強度。除非另外指示，否則「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對（例如抗體及抗原）之成員之間的1:1交互作用。分子X針對其夥伴Y之親和力通常可由解離常數(K D)表示。親和力可以所屬技術領域中已知之多種方式測量及/或表現，包括但不限於平衡解離常數(K D)及平衡締合常數(K A)。K D係由k off/k on之商計算，而K A係由k on/k off之商計算。k on係指例如抗體至抗原之締合速率常數，且k off係指例如抗體至抗原之解離。k on及k off可藉由所屬領域中具有通常知識者已知之技術判定，諸如BIAcore®或KinExA。
用語「KD」(M)係指特定抗體抗原交互作用之解離平衡常數，或抗體或抗體結合片段與抗原結合之解離平衡常數。K D與結合親和力之間存在反向關係，因此K D值越小，親和力愈高，亦即越強。因此，用語「較高親和力(higher affinity)」或「較強親和力(stronger affinity)」係關於形成交互作用之能力較高且因此K D值較小，且相反地用語「較低親和力(lower affinity)」或「較弱親和力(weaker affinity)」係關於形成交互作用之能力較低且因此K D值較大。在一些情況下，特定分子（例如抗體）與其交互作用夥伴分子（例如抗原X）之結合親和力（或K D）相較於該分子（例如抗體）與另一交互作用夥伴分子（例如抗原Y）之結合親和力高，可表示為藉由將較大K D值（較低或較弱親和力）除以較小K D（較高或較強親和力）而判定之結合比率，例如表示為大5倍或10倍之結合親和力，視情況而定。
用語「k d」（sec -1或1/s）係指特定抗體抗原交互作用之解離速率常數，或抗體或抗體結合片段之解離速率常數。所述值亦稱為k 0ir值。
用語「k a」（M-1 × sec-1或1/M）係指特定抗體抗原交互作用之締合速率常數，或抗體或抗體結合片段之締合速率常數。
用語「K A」（M-1或1/M）係指特定抗體抗原交互作用之締合平衡常數，或抗體或抗體結合片段之締合平衡常數。藉由將k a除以k d來獲得締合平衡常數。
用語「結合(binding)」通常係指或二或更多個實體之間或之中的非共價締合。直接結合涉及實體或部分之間的實體接觸。「間接(indirect)」結合涉及藉由與一或多個中間實體實體接觸之方式的物理交互作用。可在多種情形中之任一者中評估二或更多個實體之間的結合，例如其中在單離中或在更複雜系統（例如當與載體實體共價或以其他方式締合時、及/或在生物系統（諸如細胞）中）之情況下研究交互作用的實體或部份。
用語「免疫特異性結合(immunospecifically bind)」、「免疫特異性辨識(immunospecifically recognize)」、「特異性結合(specifically bind)」、及「特異性辨識(specifically recognize)」係抗體在上下文中之類似用語，且指結合至抗原（例如表位或免疫複合物）之分子，所屬技術領域中具有通常知識者理解此類結合。舉例而言，特異性結合至抗原之分子可結合至其他肽或多肽，通常具有較低親和力，藉由例如免疫檢定、BIACORE ®、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments, Boise, ID)、或所屬技術領域中已知之其他檢定所判定。在特定實施例中，特異性結合至抗原之分子以至少2 logs、2.5 logs、3 logs、4 logs之K A，或大於分子結合至另一抗原時之K A結合至該抗原。相較於結合域、抗體、或抗原結合系統與不是目標之實體（亦即非目標）的締合，結合可包含結合域、抗體、或抗原結合系統與該結合域、抗體、或抗原結合系統之目標的優先締合。在一些實施例中，若結合域、抗體、或抗原結合系統與目標之間的結合，相較於結合域、抗體、或抗原結合系統與非目標之結合大於2倍、大於5倍、大於10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或大於100倍，則結合域、抗體、或抗原結合系統選擇性地結合目標。在一些實施例中，若結合親和力小於約10 -5M、小於約10 -6M、小於約10 -7M、小於約10 -8M、或小於約10 -9M，則結合域、抗體、或抗原結合系統選擇性地結合目標。
在另一實施例中，特異性結合至抗原之分子以約1 × 10 -7M之解離常數(K d)結合。在一些實施例中，當K d係約1 × 10 -9M至約5 × 10 -9M時，抗原結合分子以「高親和力」特異性結合抗原。在一些實施例中，當K d係1 × 10 -10M至約5 × 10 -10M時，抗原結合分子以「非常高親和力」特異性結合抗原。在一個實施例中，抗原結合分子具有10 -9M之K d。在一實施例中，釋放速率小於約1 × 10 -5。在實施例中，抗原結合分子以約l × 10 -10M至約5 × 10 -10M之K d結合GPC3。
在某些實施例中，本文提供一種結合至目標人類抗原之抗體或其抗原結合分子，例如在某些實施例中，抗原結合分子以比結合至另一物種的目標抗原高5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、或更高的親和力結合至GPC3，如藉由例如放射性免疫檢定、表面電漿共振、或動力學排除檢定所測量。在一具體實施例中，結合至目標人類抗原之本文所述之抗體或其抗原結合分子將以小於該抗體或其抗原結合分子與人類抗原結合之10%、15%、或20%與另一物種之目標抗原結合，如藉由例如放射性免疫檢定、表面電漿共振、或動力學排除檢定所測量。
「癌症(cancer)」係指特徵在於本體中異常細胞之未受控生長的廣泛的各種疾病。未經調節細胞分裂及生長導致侵襲鄰近組織之惡性腫瘤形成，且亦可經由淋巴系統或血流轉移至本體之遠端部分。「癌症」或「癌症組織」可包括腫瘤。在一些實施例中，本揭露之方法可用於縮小衍生自例如下列之腫瘤的腫瘤大小：肝癌（包括肝細胞癌(HCC)）、前列腺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮頸上皮內瘤樣病變g3子宮頸鱗狀細胞癌、子宮頸腺癌、卵巢癌、直腸癌、肛門部位癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、多發性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔腔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤(FL)、變化型濾泡淋巴瘤(transformed follicular lymphoma)、脾邊緣區型淋巴瘤(sSMZL)、食道癌（腺癌及鱗狀細胞癌）、乳癌（諸如侵襲性乳癌）、胃癌（諸如產生α胎兒蛋白之胃癌）、脂肪肉瘤、許旺細胞瘤、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、肺癌（包括鱗狀非小細胞肺癌）、結腸癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)（包括非T細胞ALL）、慢性淋巴球性白血病(CLL)、兒童實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘導之癌症（包括由石棉誘導者）、間皮瘤、膽管癌、其他B細胞惡性疾病、多發性骨髓瘤、及該等癌症之組合。特定癌症可回應於化學或輻射療法或癌症可為難治性的。難治性癌症係指手術介入不能修正之癌症，及癌症初始不回應於化學或輻射療法或癌症隨時間推移而變得不反應。
「趨化因子(chemokine)」係一種細胞介素類型，其介導細胞趨化性或方向性移動。趨化因子之實例包括但不限於IL-8、IL-16、伊紅趨素、伊紅趨素-3、巨噬細胞衍生之趨化因子（MDC或CCL22）、單核球趨化蛋白1（MCP-1或CCL2）、MCP-4、巨噬細胞炎性蛋白1α (MIP-1α, MIP-1a)、MIP-1β (MIP-1b)、γ誘導蛋白10 (IP-10)、及胸腺及活化調節趨化因子（TARC或CCL17）。
「嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor)」或「CAR」係指經工程改造以包含結合域之分子及活化免疫細胞（例如T細胞，諸如初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞、NK細胞或其組合）在抗原結合時之手段。CAR亦稱為人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體。在一些實施例中，CAR包含結合域、胞外域、跨膜域、一或多個共刺激域、及胞內信號傳導域。已經基因工程改造以表現嵌合抗原受體之T細胞可稱為CAR T細胞。類似地，已經基因工程改造以表現嵌合抗原受體之NK細胞可稱為CAR NK細胞。
「減少(decrease)」、或「減低(lower)」、或「減輕(lessen)」、或「降低(reduce)」、或「消減(abate)」通常係指相較於由單獨媒劑（亦即活性部份）或對照分子/組成物造成之反應，本文所設想之組成物產生、引發、或造成較小生理反應（亦即下游效應）之能力。「減少」或「降低」量一般係「統計學上顯著的(statistically significant)」量，且可包括下列之1.1、1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、30或更多倍（例如500、1000倍）的減少（包括介於之間及大於1之所有整數及小數點，例如1.5、1.6、1.7、1.8等）：由媒劑、對照組成物產生之反應（參考反應）。
「胞外域(extracellular domain)」（或「ECD」）係指多肽之部分，其當多肽存在於細胞膜中時，應理解為位於細胞膜外之胞外空間中。
如本文中所使用，用語「胞外配體結合域(extracellular ligand-binding domain)」係指能夠結合配體（例如細胞表面分子）之寡肽或多肽。例如，可選擇胞外配體結合域以識別作用為與特定疾病狀態（例如癌症）相關之目標細胞上之細胞表面標記的配體。可作用為配體之細胞表面標記之實例包括與病毒、細菌、及寄生蟲感染、自體免疫疾病、及癌細胞相關者。
CAR之結合域後面可接著「間隔子(spacer)」或「鉸鏈(hinge)」，其係指將抗原結合域移動遠離效應細胞表面以實現適當細胞/細胞接觸、抗原結合、及活化的區(Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419)。CAR中之鉸鏈區通常在跨膜(TM)與結合域之間。在某些實施例中，鉸鏈區係免疫球蛋白鉸鏈區，且可為野生型免疫球蛋白鉸鏈區或改變之野生型免疫球蛋白鉸鏈區。用於本文所描述之CAR中之其他例示性鉸鏈區包括衍生自類型1膜蛋白（諸如CD8α、CD4、CD28、及CD7）之胞外區的鉸鏈區，其可係來自此等分子之野生型鉸鏈區，或可經改變。
「跨膜(transmembrane)」區或域係CAR之一部分，其將胞外結合部分錨定至免疫效應細胞之質膜，並促進結合域與目標抗原之結合。跨膜域可係CD3ζ跨膜域，然而可採用之其他跨膜域包括由CD8α、CD4、CD28、CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、NKG2D、2B4、及CD154獲得者。在某些實施例中，跨膜域係合成，其中其將主要包括疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。
「胞內信號傳導域(intracellular signaling domain)」或「信號傳導域(signaling domain)」係指嵌合抗原受體蛋白之部分，其參與將有效CAR結合至目標抗原之訊息轉導至免疫效應細胞內部以引發效應細胞功能，例如活化、細胞介素產生、增生、及細胞毒性活性，包括細胞毒性因子至結合CAR之目標細胞的釋放、或與胞外CAR域結合之抗原引發的其他細胞反應。用語「效應功能(effector function)」係指細胞之特定功能。T細胞之效應功能，例如可係細胞溶解活性或包括細胞介素之分泌之幫助或活性。因此，用語「胞內信號傳導域(intracellular signaling domain)」或「信號傳導域(signaling domain)」在本文中可互換使用，指蛋白質之部分，其轉導效應功能信號且引導細胞以執行特定功能。雖然通常可採用整個胞內信號傳導域，但在許多情況下，不必使用整個域。在使用胞內信號傳導域之截短部分的程度，只要其轉導效應功能信號，則可使用此類截短部分代替整個域。用語胞內信號傳導域意欲包括足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導域之任何截短部分。胞內信號傳導域亦稱為「信號轉導域」，且通常源自人類CD3或FcRy鏈之部分。
已知透過單獨T細胞受體產生之信號不足於完全活化T細胞且亦需要二級或共刺激信號。因此，T細胞活化可說是藉由兩種不同類別的細胞質信號傳導序列介導：透過T細胞受體起始抗原依賴性初級活化者（初級細胞質信號傳導序列）及以抗原非依賴性方式作用者，以提供二級或共刺激信號（二級細胞質信號傳導序列）。共刺激方式作用之細胞質信號傳導序列可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化域或ITAM之信號傳導域。在本揭露中特別可用的含ITAM之初級細胞質信號傳導序列之實例包括衍生自DAP10、DAP12、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d者。
如本文所用，用語「共刺激信號傳導域(costimulatory signaling domain)」或「共刺激域(costimulatory domain)」係指包含共刺激分子之胞內域之CAR之部分。共刺激分子係除抗原受體或Fc受體以外之細胞表面分子，其提供T淋巴球在結合至抗原時為有效活化及功能所需之第二信號。此類共刺激分子之實例包括CD27、CD28、4-1 BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS (CD278)、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKD2C、2B4、CD137、DAP12、B7-H2、及特異性結合CD83之配位體。因此，雖然本揭露提供衍生自CD28之例示性共刺激域，但亦設想其他共刺激域與本文所述之CAR一起使用。納入一或多種共刺激信號傳導域可增強T細胞及NK細胞表現CAR受體之功效及擴增。胞內信號傳導及共刺激信號傳導域可以任何順序串聯連接至跨膜域之羧基端。
儘管經工程改造以含有來自CD3或FcRγ之信號傳導域的基於scFv之CAR已經顯示遞送用於T細胞活化及效應功能之強效信號，在不存在伴隨共刺激信號之情況下，其不足以引起促使T細胞存活及擴增的信號。含有衍生自CD3ζ或FcRγ之結合域、鉸鏈、跨膜、及信號傳導域之其他CAR與一或多個共刺激信號傳導域（例如衍生自4-1BB、CD28、CD134、及CD278之胞內共刺激域）一起可更有效地引導抗腫瘤活性以及在體外、及動物模型及癌症患者中增加CAR表現性T細胞之細胞介素分泌、裂解活性、存活、及增生(Milone et al., Molecular Therapy, 2009; 17: 1453-1464; Zhong et al., Molecular Therapy, 2010; 18: 413-420; Carpenito et al., PNAS, 2009; 106:3360-3365)。
「共刺激信號(costimulatory signal)」係指與初級信號（諸如TCR/CD3連接）組合之信號引起T細胞反應，諸如但不限於關鍵分子之增生及/或上調或下調。
「共刺激配體(costimulatory ligand)」包括特異性結合T細胞上之同源共刺激分子的抗原呈現細胞上之分子。共刺激配體之結合提供介導T細胞反應之信號，包括但不限於增生、活化、分化、及類似者。除了刺激分子所提供之初級信號外，共刺激配體亦藉由T細胞受體(TCR)/CD3複合物與裝載肽之主要組織相容性複合體(MHC)分子的結合誘導信號。共刺激配體可包括但不限於3/TR6、4-1BB配體、結合鐸(Toll)配體受體之促效劑或抗體、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD30配體、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒進入介導物(herpes virus entry mediator, HVEM)、人類白血球抗原G (HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白樣轉錄本(ILT) 3、可誘導型共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、與B7-H3特異性結合之配體、淋巴毒素β受體、MHC I類鏈相關蛋白A (MICA)、MHC I類鏈相關蛋白B (MICB)、OX40配體、PD-L2、或程式性死亡(PD) L1。共刺激配體包括但不限於與存在於T細胞上之共刺激分子特異性結合之抗體，諸如但不限於4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、與CD83特異性結合之配體、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1)、自然殺手細胞受體C (NKG2C)、OX40、PD-1、或腫瘤壞死因子超家族成員14（TNFSF14或LIGHT）。共刺激配體亦可結合NK細胞上之同源共刺激分子。
「共刺激分子(costimulatory molecule)」係與共刺激配體特異性結合之T細胞（在一些情況下係NK細胞）上之同源結合夥伴，從而介導T細胞之共刺激反應，諸如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於「共刺激分子」係與共刺激配體特異性結合之T細胞上之同源結合夥伴，從而介導T細胞之共刺激反應，諸如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD33、CD45、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 (α; β；δ；ε；γ；ζ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配體、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96 (Tactile)、CDl-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Igα (CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT（腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14）、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1 (CDl la/CD18)、MHC I類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子、SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4)、SLAMF6 (NTB-A; Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。
「保守性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」係其中胺基酸殘基被具有類似側鏈之胺基酸殘基置換者。所屬技術領域中已定義具有側鏈之胺基酸殘基之家族。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如天冬胺酸、麩胺酸）、未帶電極性側鏈（例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈（例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、β-支鏈側鏈（例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）、及芳族側鏈（例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。在某些實施例中，抗體或其抗原結合分子之（多個）CDR內或（多個）架構區內的一或多個胺基酸殘基可用具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。通常而言，若兩個序列在對應位置中含有保守性胺基酸取代，則通常將該兩個序列視為「實質上類似的(substantially similar)」。舉例而言，某些胺基酸通常分類為「疏水性(hydrophobic)」或「親水性(hydrophilic)」胺基酸，及/或具有「極性(polar)」或「非極性(non-polar)」側鏈。用一個胺基酸取代相同類型的另一胺基酸可視為保守性取代。例示性胺基酸分類概述於以下表2及表3中： 表2
胺基酸 3字母 1字母 性質 性質 疏水性指數
丙胺酸 Ala A 非極性 中性 1.8
精胺酸 Arg R 極性 陽性 -4.5
天冬醯胺酸 Asn N 極性 中性 -3.5
天冬胺酸 Asp D 極性 陰性 -3.5
半胱胺酸 Cys C 非極性 中性 2.5
麩胺酸 Glu E 極性 陰性 -3.5
麩醯胺酸 Gln Q 極性 中性 -3.5
甘胺酸 Gly G 非極性 中性 -0.4
組胺酸 His H 極性 陽性 -3.2
異白胺酸 Ile I 非極性 中性 4.5
白胺酸 Leu L 非極性 中性 3.8
離胺酸 Lys K 極性 陽性 -3.9
甲硫胺酸 Met M 非極性 中性 1.9
苯丙胺酸 Phe F 非極性 中性 2.8
脯胺酸 Pro P 非極性 中性 -1.6
絲胺酸 Ser S 極性 中性 -0.8
蘇胺酸 Thr T 極性 中性 -0.7
色胺酸 Trp W 非極性 中性 -0.9
酪胺酸 Tyr Y 極性 中性 -1.3
纈胺酸 Val V 非極性 中性 4.2
表3
不明確胺基酸 3字母 1字母
天冬醯胺酸或天冬胺酸 Asx B
麩醯胺酸或麩胺酸 Glx Z
白胺酸或異白胺酸 Xle J
未指定或未知之胺基酸 Xaa X
「組合療法(combination therapy)」係指對象同時暴露於二或更多個治療方案（例如二或更多種治療部分）之彼等情況。在一些實施例中，二或更多個方案可同時投予；在一些實施例中，可依序投予此類方案（例如第一方案之所有「劑量(dose)」係在投予任何劑量之第二方案之前投予）；在一些實施例中，此類藥劑以重疊給藥方案投予。在一些實施例中，組合療法之「投予(administration)」可涉及對接受在組合中之其他藥劑或療法之對象投予一或多種藥劑或療法。為清楚起見，組合療法不需要將個別藥劑在單一組成物中一起投予（或甚至不需要同時），儘管在一些實施例中，二或更多種藥劑或其活性部分可在組合組成物中一起投予，或甚至在組合化合物中投予（例如作為單一化學複合物或共價實體之一部分）。
「對應於(corresponding to)」可用以藉由與適當之參考分子或組成物比較，指定分子或組成物中之結構元件之位置/身分。例如，在一些實施例中，聚合物中之單體殘基（例如多肽中之胺基酸殘基或多核苷酸中之核酸殘基）可識別為「對應於」在適當之參考聚合物中之殘基。舉例而言，針對簡單起見之目的，多肽中之殘基可使用基於參考相關多肽之標準編號系統指定，使得在位置100處「對應於」殘基之胺基酸（例如不需要實際上為所提供胺基酸鏈中之第100個胺基酸），其對應於在參考多肽中之位置100處發現之殘基。各種序列比對策略係可用的，包含軟體程式，諸如例如BLAST、CS-BLAST、CUDASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM、或SWIPE，其可用於例如根據本揭露識別多肽及/或核酸中之「對應」殘基。
若抗原與第一抗原結合分子之間的交互作用阻擋、限制、抑制、或以其他方式降低參考結合分子與抗原交互作用之能力，則抗原結合分子（諸如抗體、其抗原結合片段、CAR、或TCR）與參考結合分子（諸如抗體或其抗原結合片段）「交叉競爭(cross-compete)」。交叉競爭可完成，例如抗原結合分子與抗原之結合完全阻斷參考結合分子與抗原結合之能力，或其可為部分的，例如抗原結合分子與抗原之結合降低參考抗原結合分子與抗原結合之能力。在某些實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子相同或重疊之表位。在其他實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子不同之表位。許多類型之競爭結合檢定可用以判定一種抗原結合分子是否與另一種爭，例如：固相直接或間接放射免疫檢定(RIA)；固相直接或間接酶免疫檢定(EIA)；夾心競爭檢定(Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素抗生物素蛋白EIA (Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619)；固相直接標記檢定，固相直接標記之夾心檢定(Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用1-125標記之固相直接標記RIA (Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素抗生物素蛋白EIA (Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552)；及直接標示之RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)。
「細胞介素(cytokine)」係指藉由一個細胞回應於與特定抗原接觸而釋放之非抗體蛋白質，其中細胞介素與第二細胞交互作用以介導第二細胞中之反應。細胞介素可藉由胞內源性表現或向對象投予。細胞介素可由免疫細胞（包括巨噬細胞、B細胞、T細胞、及肥大細胞）釋放而傳播免疫反應。細胞介素可誘導接受者細胞中之各種反應。細胞介素可包括體內恆定細胞介素、趨化因子、促炎性細胞介素、效應物、及急性期蛋白。例如，包括介白素(IL) 7及IL-15之體內恆定(homeostatic)細胞介素促進免疫細胞存活及增生，且促炎性細胞介素可促進發炎性反應。體內恆定細胞介素之實例包括但不限於IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、及干擾素(IFN) γ。促發炎細胞介素之實例包括但不限於IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(FGF) 2、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、可溶細胞間黏附分子1 (sICAM-1)、可溶血管黏附分子1 (sVCAM-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、及胎盤生長因子(PLGF)。效應物之實例包括但不限於顆粒酶A、顆粒酶B、可溶性Fas配體(sFasL)、及穿孔素。急性期蛋白之實例包括但不限於C反應蛋白(CRP)及血清類澱粉蛋白A (SAA)。
用語「域(domain)」係指一實體之一部分。在一些實施例中，「域」與實體之結構及/或功能性特徵相關聯，例如使得當域實體與其親本實體之其餘部分分離時，其實質上或完全保留結構及/或功能特徵。在一些實施例中，域可包含實體之一部分，當與（親本）實體分離且與不同（接收者）實體鏈接或連接時，實質上保留及/或賦予接收者實體一或多個結構及/或功能特徵，例如其在親本實體中之特徵。在一些實施例中，域係分子之一部分（例如小分子、碳水化合物、脂質、核酸、或多肽）。在一些實施例中，域係多肽之區段；在一些此類實施例中，域之特徵在於結構元件（例如胺基酸序列或序列域、α-螺旋性狀、β-薄片性狀、捲曲線圈性狀、隨機線圈性狀等），及/或功能性特徵（例如結合活性、酶活性、摺疊活性、信號傳導活性等）。
用語「劑型(dosage form)」可用以指投予至對象之活性劑之物理離散單元（例如抗原結合系統或抗體）。一般而言，各此類單元含有預定量之活性劑。在一些實施例中，此類量係根據已判定當向相關群體投予時與所期望或有益結果相關之給藥方案之適於投予之單位劑量（或其全部部分）。向對象投予之治療組成物或藥劑之總量由一或多個醫學醫師判定，且可涉及投予超過一種劑型。
用語「給藥方案(dosing regimen)」可用於指一組一或多個單位劑量，該組一或多個單位劑量係個別投予至對象。在一些實施例中，給定治療劑具有推薦劑量方案，其可涉及一或多種劑量。在一些實施例中，給藥方案包含複數個劑量，其各者在時間上與其他劑量分開。在一些實施例中，給藥方案包含複數個劑量且連續劑量藉由相等長度之時段彼此分離；在一些實施例中，給藥方案包含複數個劑量且連續劑量藉由至少兩個不同長度之時段彼此分離。在一些實施例中，給藥方案內之所有劑量係相同單位劑量。在一些實施例中，給藥方案內不同劑量係不同量。在一些實施例中，給藥方案包含第一劑量之第一劑量，隨後係不同於第一劑量之第二劑量之一或多個額外劑量。在一些實施例中，週期性調整給藥方案以達成所欲或有益結果。
「效應細胞(effector cell)」係指表現一或多種Fc受體且介導一或多種效應功能之免疫系統之細胞。在一些實施例中，效應細胞可包含但不限於單核球、巨噬細胞、嗜中性球、樹突細胞、嗜酸性球、肥大細胞、血小板、大顆粒淋巴球、蘭格罕細胞(Langerhans' cell)、自然殺手(NK)細胞、T淋巴球、及B淋巴球中之一或多者。效應細胞可屬於任何生物體，包含但不限於人類、小鼠、大鼠、兔、及猴。
「效應功能(effector function)」係指抗體Fc區與Fc受體或配體交互作用之生物結果。效應功能包含但不限於抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP)、及補體介導之細胞毒性(complement-mediated cytotoxicity, CMC)。效應功能可係抗原結合依賴性、抗原結合獨立性、或兩者。ADCC係指藉由免疫效應細胞裂解抗體結合之目標細胞。不希望受任何理論束縛，ADCC通常理解為涉及辨識及隨後殺滅抗體塗佈之目標細胞之Fc受體(FcR)攜帶效應細胞（例如表現在抗體結合之表面抗原上之細胞）。介導ADCC之效應細胞可包含免疫細胞，其包含但不限於自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球中之一或多者。
用語「經工程改造之自體細胞療法(engineered Autologous Cell Therapy)」可縮寫為「eACT™」，亦稱為過繼性細胞轉移(adoptive cell transfer)，係一種程序，藉此收集患者之自身細胞（諸如T細胞）且隨後對其進行基因改造以辨識並靶向在一或多種特定腫瘤細胞或惡性疾病之細胞表面上表現的一或多種抗原。免疫細胞可經工程改造以表現例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。CAR陽性(+)免疫細胞可經工程改造以表現對連接至胞內信號傳導部分（包含至少一個共刺激域及至少一個活化域）之特定腫瘤抗原具有特異性的胞外單鏈可變片段(scFv)。共刺激域可衍生自天然存在之共刺激域或其變體，例如具有截短鉸鏈域(「THD」)之變體，且活化域可衍生自例如CD3ζ。在某些實施例中，CAR經設計以具有兩個、三個、四個、或更多個共刺激域。CAR scFv可經設計以靶向例如GPC3，其係在各種癌細胞上表現之跨膜蛋白。
在一些實施例中，CAR經工程改造，使得共刺激域表示為獨立多肽鏈。實例CAR T細胞療法及構築體描述於美國專利公開案第2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309、及2014/0050708號，其全文以引用方式併入本文中。「過繼性細胞療法(Adoptive cell therapy)」或「ACT」涉及將具有抗腫瘤活性之免疫細胞轉移至對象中，例如癌症患者。在一些實施例中，ACT係涉及使用具有抗腫瘤活性之淋巴球（例如經工程改造之淋巴球）之治療方法。
「表位(epitope)」係指抗體可特異性結合之抗原的局部區域。表位可係例如多肽（線性或連續表位）之連續胺基酸，或表位可例如一起來自一或多個多肽之二或更多個非連續區域（構形、非線性、不連續、或非連續表位）。在某些實施例中，抗體結合之表位可藉由例如NMR光譜術、X射線繞射結晶學研究、ELISA檢定、與質譜測定術交換耦合之氫/氘（例如液相層析電噴霧質譜測定術）、基於陣列之寡肽掃描檢定、及/或突變誘發映射（例如位點引導之突變誘發映射）。對於X射線結晶學，可使用所屬技術領域中已知方法中之任一者來實現結晶（例如Giegé R et al.,(1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350；McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23；Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274；McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303）。抗體：抗原結晶，可使用熟知之X射線繞射技術研究，且可使用電腦軟體改良，諸如X-PLOR（Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.；參見例如Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S. 2004/0014194）、及BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al.,(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)。突變誘發映射研究可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何方法實現。參見例如Champe M et al.,(1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 and Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085針對突變誘發技術之描述，包括丙胺酸掃描突變誘發技術。
參考基因、蛋白質、及/或核酸之「內源性(endogenous)」係指基因、蛋白質、及/或核酸在細胞（諸如免疫細胞）中之天然存在。
「外源(exogenous)」係指引入細胞之藥劑，諸如核酸、基因、或蛋白質，例如來自外部源。即使其編碼在細胞中天然存在之蛋白質，引入細胞中之核酸係外源。此類外源引入編碼蛋白質之核酸可用以增加蛋白質之表現，使其超過在類似條件下（例如未引入外源核酸）自然存在於細胞中之水平。
用語「賦形劑(excipient)」係指可包含在組成物中之藥劑，例如用以提供或促進所欲的同一性或穩定化效應。在一些實施例中，適合的賦形劑可包含例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白土粉、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥之脫脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、或類似物。
如本文所述之材料或實體之「片段(fragment)」或「部分(portion)」具有包含整個例如物理實體或抽象實體之離散部分之結構。在一些實施例中，片段缺乏整個發現之一或多個部分。在一些實施例中，片段由整個發現之特性結構元件、域或部分所組成，或包含其等。在一些實施例中，聚合物片段包含如在整個聚合物中發現之至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多個單體單元（例如殘基），或由其等所組成。在一些實施例中，聚合物片段包含在整個聚合物中發現之單體單元（例如殘基）之至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、25%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或由其等所組成（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）。在一些實施例中，整個材料或實體可稱為片段之「親本(parent)」。
用語「融合多肽(fusion polypeptide)」或「融合蛋白(fusion protein)」通常係指包含至少兩個區段之多肽。一般而言，含有至少兩個此類區段之多肽在下列情況下被視為融合多肽，若兩個區段係下列之部分：(1)非天然包含在相同肽中，及/或(2)先前未在單一多肽中鏈接或連接至彼此，及/或(3)已透過人手之作動而鏈接或連接至彼此。在實施例中，CAR係融合蛋白。在實施例中，TCR係融合蛋白。在實施例中，TGFβ顯性負性受體係融合蛋白。
用語「基因產物(gene product)」或「表現產物(expression product)」通常係指由基因（預先及/或後處理）轉錄之RNA，或由基因轉錄之RNA編碼之多肽（預先及/或後修飾）。
用語「經基因工程改造(genetically engineered)」或「經工程改造(engineered)」係指修飾細胞基因體之方法，其包括但不限於缺失編碼或非編碼區或其部分、或插入編碼區或其部分。在一些實施例中，經修飾之細胞係淋巴球，例如T細胞或NK細胞，其可自患者或供體獲得。在一些實施例中，經修飾之細胞係誘導性多能性幹細胞(iPSC)，其可分化成淋巴球，諸如T細胞或NK細胞。細胞可經修飾以表現外源構築體，諸如例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其併入至細胞基因體中。亦可進行其他基因編輯，例如減少排斥及/或增強細胞適應性。工程改造通常包含人手操縱。舉例而言，當二或更多個序列在自然界中未依此順序鏈接或連接，而係經人手操縱而直接鏈接或連接至彼此時，將多核苷酸視為「經工程改造」。在藉由分子生物學技術操縱細胞之背景下，若細胞或生物體已經操縱使其基因資訊被改變（例如已引入先前不存在之新基因物質，例如藉由轉化、體細胞雜交、轉染、轉導、或其他機制，或改變或移除先前存在之基因物質，例如藉由取代或缺失突變、或藉由其他規程），則將該細胞或生物體視為「經工程改造」。在一些實施例中，結合劑係經修飾之淋巴球，例如T細胞或NK細胞可獲自患者或供體。經工程改造之細胞可經修飾以表現外源構築體，諸如例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其併入至細胞基因體中。經工程改造之多核苷酸或結合劑之後代通常稱為「經工程改造」，即使實際操縱在先前實體上進行。在一些實施例中，「經工程改造」係指已經設計及產生之實體。用語「經設計(designed)」係指藥劑(i)其結構係或經人手選擇；(ii)由需要人手之方法產生；及/或(iii)與天然物質及其他已知藥劑相異。
「T細胞受體」或「TCR」係指存在於T細胞表面上之抗原識別分子。在正常T細胞發展期間，四個TCR基因α、β、γ、及δ之各者可重新排列導致高度不同之TCR蛋白質。
用語「異源(heterologous)」意指來自非天然存在之序列的任何來源。例如，作為共刺激蛋白質之一部分包括的異源序列係非天然存在之胺基酸，亦即與野生型人類共刺激蛋白質不一致。例如，異源核苷酸序列係指野生型人類共刺激蛋白質編碼序列以外的核苷酸序列。
用語「同一性(identity)」係指聚合分子之間的整體相關性，例如在核酸分子之間（例如DNA分子及/或RNA分子）及/或多肽分子之間。與兩個所提供之多肽序列之間的同一性百分比計算的方法係已知的。例如可藉由比對二個序列以用於最佳比較目的來執行兩個核酸或多肽序列之同一性百分比之計算（例如可在第一及第二序列中之一或兩者中引入間隙以用於最佳比對，且可出於比較目的忽略非同一性序列）。接著比較對應位置處之核苷酸或胺基酸。當第一序列中之位置被與第二序列中之對應位置同一之殘基（例如核苷酸或胺基酸）佔據時，則分子在彼位置處係同一的。兩個序列之間的同一性百分比係序列共有的相同位置數目之函數，其可選地考慮間隙數目及各間隙之長度，可能需要引入間隙以達到兩個序列之最佳比對。可使用數學演算法（諸如BLAST（基本局部比對搜尋工具））實現序列之比較或比對及兩個序列之間的同一性百分比之判定。在一些實施例中，若其序列係至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），則聚合分子視為彼此「同源」。
為了計算同一性百分比，被比較之序列一般係以給予序列之間最大匹配的方式比對。可用於判定同一性百分比的電腦程式之一個實例係GCG程式套件，其包括GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)。電腦演算法GAP係用於比對兩個多肽或多核苷酸，以判定其等之序列同一性百分比。序列針對其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配進行比對（如由演算法判定之「匹配跨度(matched span)」）。在某些實施例中，標準比較矩陣（參見Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix)亦由演算法使用。其他演算法亦可用於胺基酸或核苷酸序列之比較，包含在商業電腦程式中可用的演算法，諸如用於核苷酸序列之BLASTN及用於胺基酸序列之BLASTP、gapped BLAST、及PSI-BLAST。例示性的此類程式描述於Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990；Altschul, et al., Methods in Enzymology；Altschul, et al.，「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs，」Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997；Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998；及Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999。除識別類似序列之外，上文所提及之程式通常提供相似性程度之指示。在一些實施例中，兩個序列視為實質上相似若至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多其對應殘基在殘基之相關延伸係相似及/或同一（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）。在一些實施例中，相關延伸係完整序列。在一些實施例中，相關延伸係至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500或更多殘基。具有實質序列類似性之序列可彼此同源。
當提及核酸或其片段時，用語「實質同一性(substantial identity)」或「實質上同一(substantially identical)」指示當與另一核酸（或其互補股）以適當核苷酸插入或缺失進行最佳比對時，在至少約95%（且更佳地至少約96%、97%、98%、或99%）的核苷酸鹼基中有核苷酸序列同一性，如由序列同一性之任何熟知演算法所測量，諸如FASTA、BLAST、或Gap，如以下所論述。在某些情況下，具有與參考核酸分子實質同一性之核酸分子可編碼具有與參考核酸分子編碼之多肽相同或實質上類似之胺基酸序列之多肽。
如應用於多肽，用語「實質類似性(substantial similarity)」或「實質上類似(substantially similar)」意指兩個肽序列當最佳比對（諸如藉由程式GAP或BESTFIT使用預設間隙權重）時，共有至少95%序列同一性，甚至更佳地至少98%或99%序列同一性。較佳地，不同一之殘基位置與保守胺基酸取代不同。
用語「改善(improve)」、「增加(increase)」、「抑制(inhibit)」、及「減少(reduce)」指示相對於基線或其他參考測量之值。在一些實施例中，適當的參考測量可包含在某些系統中的測量（例如在一單個個體中），在其他可比情況下，不存在（例如之前及/或之後）藥劑或治療，或存在適當的可比參考藥劑。在一些實施例中，適當的參考測量可包含在相關劑或治療存在下對所已知或預期的相當系統以相當的方式反應之測量結果。
「免疫反應(immune response)」係指免疫系統細胞（例如，T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突細胞、及嗜中性球）及由任何這些細胞或肝臟所生產之可溶巨分子（包括Ab、細胞介素、及補體）的作用，其會導致對脊椎動物體內之侵犯病原體、受病原體所感染之細胞或組織、癌性或其他異常細胞、或（在自體性或病理性發炎之情況下）正常人類細胞或組織的選擇性靶向、結合、損傷、破壞、及/或消除。
用語「免疫療法(immunotherapy)」係指罹患疾病、或有感染疾病或遭受疾病再發之風險的對象藉由包含誘導、增強、抑制、或以其他方式修改免疫反應之方法的治療。免疫療法之實例包括但不限於NK細胞及T細胞療法。T細胞療法可包括過繼性T細胞療法、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)免疫療法、自體細胞療法、經工程改造之自體細胞療法(eACT™)、及同種異體T細胞移植。然而，所屬技術領域中具有通常知識者會認知到，本文中所揭示之調理方法會增強任何移植T細胞療法之有效性。T細胞療法之實例描述於美國專利公開案第2014/0154228號及第2002/0006409號、美國專利第5,728,388號、及國際專利公開案WO 2008/081035。
免疫療法之T細胞或NK細胞可來自所屬技術領域中已知之任何來源。例如，T細胞及NK細胞可在體外分化自造血幹細胞群（例如iPSC）或可自對象獲得。T細胞及NK細胞可從下列獲得，例如周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹膜、胸膜滲出液、脾臟組織、及腫瘤。此外，T細胞可衍生自所屬技術領域中可用之一或多種T細胞系。T細胞亦可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何數量之技術，諸如FICOLL™分離及/或血球分離來自對象收集之血液之單位獲得。T細胞療法單離T細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號，其以全文以引用方式併入本文中。
用語「體外(in vitro)」係指在一人工環境中發生的事件，例如在測試管、反應容器、細胞培養等中，而非在多細胞生物體內。用語「體外細胞( in vitrocell)」係指離體培養之任何細胞。特定言之，體外細胞可包括T細胞或NK細胞。用語「體內(in vivo)」係指在多細胞生物體（諸如人類或非人類動物）內發生之事件。
用語「單離(isolated)」係指一種物質，其：(1)已自至少一些組分分離，其中其與該物質在較早時間締合或該物質將以其他方式與其相關聯，及/或(2)存在於組成物中，該組成物包含一或多種已知或未知污染物之限制或限定量或濃度。在一些實施例中，經單離物質可自約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或超過約99%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）之其他非物質組分分離，其與該物質在較早時間相關聯，例如該物質先前或以其他方式將與其他組分或污染物相關聯。在某些情況下，若物質存在於包含相同或類似類型之分子之限制或降低量或濃度之組成物中，則單離物質。舉例而言，在某些情況下，若核酸、DNA、或RNA物質存在於包含限制或降低量或濃度之非物質核酸、DNA、或RNA分子之組成物中，則單離核酸、DNA、或RNA物質。舉例而言，在某些情況下，若多肽物質存在於包含限制或降低量或濃度之非物質多肽分子之組成物中，則單離多肽物質。在某些實施例中，量可係例如相對於在組成物中存在之所欲物質所測量之量。在某些實施例中，有限量可係組成物中之物質量不超過100%之量，例如不超過1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%之組成物中之物質量（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）。在某些情況下，組成物相對於所選擇物質係純的或實質上純的。在一些實施例中，經單離物質係約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或超過約99%之純（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）。若其實質上不含其他組分或污染物，則物質係「純」。在一些實施例中，物質仍可被視為「經單離」或甚至「純」，在其已與某些其他組分諸如，例如一或多個載劑或賦形劑（例如緩衝劑、溶劑、水等）組合之後；在此類實施例中，在不包含此類載劑或賦形劑之情況下計算物質之單離百分比或純度。
「連接子(linker)」(L)或「連接子域(linker domain)」或「連接子區(linker region)」係指長度為約1至100個胺基酸之寡肽或多肽區，其例如將CAR、TCR、顯性負性TGFβ受體、及/或scFv之任何域/區連接在一起，或甚至將該等多肽中之一或多者連接在一起。連接子可由可撓性殘基（如甘胺酸及絲胺酸）構成，使得相鄰的蛋白質域可以相對於彼此自由移動。當確保兩個相鄰域不會在空間上彼此干擾係所欲時，可使用較長連接子。連接子可係可裂解或不可裂解。可裂解連接子之實例包括2A連接子（例如T2A）、2A樣連接子或其功能等效物及其組合。在一些實施例中，連接子包括小核糖核酸病毒(picornaviral) 2A樣連接子、豬鐵士古病毒(teschovirus) (P2A)之CHYSEL序列、病毒(T2A)、或其組合、變體、及功能等效物。在其他實施例中，連接子序列可包含Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly (2A)-Pro (2B)域(SEQ ID NO: 2)，其導致2A甘胺酸與2B脯胺酸之間的裂解。在一些實例中，可裂解連接子用以連接CAR或TCR與顯性負性TGFβ受體。對所屬技術領域中具有通常知識者而言其他連接子將顯而易見，且可與本揭露結合使用。連接子可係多元素劑之一部分，其將不同元件彼此連接。舉例而言，多肽包括二或更多個功能或結構域可包含在彼此連接之此類域之間的胺基酸之延伸。在一些實施例中，包含連接子元件之多肽具有通常形式S1-L-S2之總結構，其中S1及S2可係相同或不同且表示藉由連接子彼此相關聯之兩個域。連接子可將CAR或TCR之域/區中之任一者連接或鏈接在一起。在一些實施例中，多肽連接子之長度係至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個胺基酸（例如長度係1至10、1至20、1至30、1至40、1至50、1至60、1至70、1至80、1至90、1至100、10至20、10至30、10至40、10至50、10至60、10至70、10至80、10至90、或10至100個胺基酸）。在一些實施例中，連接子之特徵在於其傾向不採用剛性三維結構，且替代地提供多肽之靈活性。在另一實例中，其可用於連接至或更多待表現之多肽，諸如CAR或TCR及TGFβ-DNR。在一些實例中，CAR或及TGFβ- DNR係藉由可裂解連接子連接。
其他連接子包括非可裂解連接子。使用數個連接子來實現本發明，包括「可撓性連接子」。後者富含甘胺酸。Klein et al., Protein Engineering, Design & Selection Vol. 27, No. 10, pp. 325–330, 2014; Priyanka et al., Protein Sci., 2013 Feb; 22(2): 153–167。
在一些實施例中，連接子係合成連接子。合成連接子可具有約10個胺基酸至約200個胺基酸之長度，例如10至25個胺基酸、25至50個胺基酸、50至75個胺基酸、75至100個胺基酸、100至125個胺基酸、125至150個胺基酸、150至175個胺基酸、或175至200個胺基酸。合成連接子可具有10至30個胺基酸之長度，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個胺基酸。合成連接子可具有30至50個胺基酸之長度，例如30至35個胺基酸、35至40個胺基酸、40至45個胺基酸、或45至50個胺基酸。
在一些實施例中，連接子係可撓性連接子。在一些實施例中，連接子富含甘胺酸（Gly或G）殘基。在一些實施例中，連接子富含絲胺酸（Ser或S）殘基。在一些實施例中，連接子富含甘胺酸及絲胺酸殘基。
用語「淋巴球(lymphocyte)」包括自然殺手(NK)細胞、T細胞、或B細胞。NK細胞係代表固有免疫系統之組分的細胞毒性淋巴球之一種類型。NK細胞會除去腫瘤及受病毒感染之細胞。其透過細胞凋亡或程式性細胞死亡之程序發揮作用。其等之所以稱為「自然殺手」是因為不需要活化即可殺滅細胞。T細胞在細胞介導之免疫性中起作用（無抗體參與）。其T細胞受體(TCR)是自其他淋巴球類型使自身分化出來。胸腺（免疫系統之特化器官）主要負責T細胞之成熟。有六種類型之T細胞，亦即：輔助T細胞（例如CD4+細胞）、細胞毒性T細胞（亦稱為TC、細胞毒性T淋巴球、CTL、T-殺手細胞、細胞毒性T細胞、CD8+ T細胞或殺手T細胞）、記憶T細胞（(i)幹記憶T SCM細胞，類似初級細胞，係CD45RO−、CCR7+、CD45RA+、CD62L+（L-選擇素）、CD27+、CD28+、及IL-7Rα+、但其亦表現大量CD95、IL-2Rβ、CXCR3及LFA-1，且展示記憶體細胞特有之多種功能屬性）；(ii)中央記憶T CM細胞，表現L-選擇素及CCR7，其分泌IL-2但不為IFNγ或IL-4，及(iii)效應記憶T EM細胞，然而，不表現L-選擇素或CCR7，但產生類似IFNγ及IL-4之效應細胞介素）、調節T細胞（Treg、抑制T細胞、或CD4+CD25+調節T細胞）、自然殺手T細胞(NKT)、及γδT細胞。另一方面，B細胞在體液免疫中起作用（具有抗體參與）。其製造抗體及抗原且扮演抗原呈現細胞(APC)之角色，且在由抗原交互作用活化之後轉變成記憶B細胞。在哺乳動物中，未成熟B細胞係在骨髓中形成，因而得到其名稱。
用語「中和(neutralizing)」係指結合至配體且防止或降低該配體之生物效應的抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段直接阻斷配體上之結合位點，或以其他方式透過間接手段（諸如配體中之結構或能量改變）改變配體之結合能力。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段防止其所結合之蛋白質執行生物功能。
「核酸(nucleic acid)」係指核苷酸之任何聚合鏈。核酸可係DNA、RNA、或其組合。在一些實施例中，核酸包含一或多種天然核酸殘基。在一些實施例中，核酸包含一或多種核酸類似物。在一些實施例中，核酸係藉由從天然來源單離、藉由基於互補模板聚合之酶促合成（體內或體外）、在重組細胞或系統中再生、及化學合成中之一或多者來製備。在一些實施例中，核酸係至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多個殘基長（例如20至100、20至500、20至1000、20至2000、或20至5000或更多個殘基）。在一些實施例中，核酸係部分或全單股；在一些實施例中，核酸係部分或全雙股。在一些實施例中，核酸具有包含編碼多肽或係編碼多肽之序列的補體之至少一個元件之核苷酸序列。
「可操作地連接(operably linked)」係指其中所述組分處於允許其等以其預期方式起作用之關係中之鄰接位置。例如，控制元件「可操作地連接」至功能元件係以在相容的條件下達成功能元件之表現及/或活性的方式與該控制元件相關聯。在實施例中，啟動子係可操作地連接至核酸。
「患者(patient)」包括患有癌症（例如多發性骨髓瘤）之任何人類。用語「對象(subject)」及「患者」在本文中可互換使用。
用語「肽(peptide)」、「多肽(polypeptide)」、及「蛋白質(protein)」可互換使用，且係指包含由肽鍵共價連接之胺基酸殘基的化合物。蛋白質或肽含有至少兩個胺基酸，且對可包含蛋白質或肽序列之胺基酸的最大數目沒有限制。多肽包括包含彼此由肽鍵所接合之二或更多個胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文中所使用，該用語係同時指短鏈（在所屬技術領域中亦經常稱為例如肽、寡肽、及寡聚物）及長鏈（在所屬技術領域中通常稱為蛋白質，而蛋白質有許多類型）。「多肽」包括例如生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽之變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括自然肽、重組肽、合成肽、或其組合。
用語「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」係指分子或組成物當向接受者投予時，對其接受者無害，或對其接受者的益處超過任何有害效應。關於用於調配如本文所揭示之組成物的載劑、稀釋劑、或賦形劑，醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、或賦形劑必須與組成物之其他成分相容且對其接受者無害，或對接受者的益處必須超過任何有害效應。用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」意指醫藥上可接受之材料、組成物、或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、或溶劑包封材料，其涉及將藥劑自身體之一個部分攜帶或運輸至另一部分（例如自一個器官至另一個）。在醫藥組成物中存在之各載體在與配方之其他成分相容之情況下必須係「可接受(acceptable)」，且對患者無害，或必須對接受者的益處超過任何有害效應。可作為醫藥上可接受之載劑的材料之一些實例包含：糖，諸如乳糖、葡萄糖、及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油、及黃豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇、及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；洋菜；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無致熱原的水；等張鹽水；林格氏液；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酐；及醫藥配方中採用的其他非毒性相容物質。
用語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指其中活性劑與一或多種醫藥上可接受之載劑調配在一起之組成物。在一些實施例中，活性劑以適於治療方案中投予之單位劑量存在，該治療方案展示當向相關對象或群體投予時達成預定治療效果之統計顯著機率。在一些實施例中，醫藥組成物可經調配用於以固體或液體形式投予，包含但不限於適用於以下形式：經口投予，例如灌劑（水性或非水溶液或懸浮液）、錠劑（例如彼等目標用於口腔、舌下及全身性吸收）、用於施用至舌片之丸劑、粉末、顆粒、膏；腸胃外投予，例如藉由皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射作為例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放配方；局部施用，例如作為乳膏、軟膏或控制釋放貼片、或施用至皮膚、肺或口腔之噴霧；陰道內或直腸內，例如作為栓劑、乳膏或泡沫；舌下；眼；經皮膚；或經鼻、肺及其他黏膜表面。
用語「增生(proliferation)」係指細胞分裂之增加，細胞之對稱或不對稱分裂。在一些實施例中，「增生」係指T細胞之對稱或不對稱分裂。相較於未經處理之樣本中之細胞，當經處理樣本中之細胞數目增加時，發生「增生增加」。
用語「參考(reference)」描述與其進行比較之標準或控制。舉例而言，在一些實施例中，將所關注之藥劑、動物、個體、群體、樣本、序列、或值與作為藥劑、動物、個體、群體、樣本、序列、或值之參考或對照相比較。在一些實施例中，將所關注之測試、測量或判定與參考或對照實質上同時測試、測量及/或判定。在一些實施例中，參考或對照係歷史參考或對照，該歷史參考或對照可選地實施在有形介質中。通常，參考或對照係在與評估對象相當的條件或情況下判定或表徵的。當存在足夠的相似性以證明對所選擇之參考或對照的依賴及/或比較是合理的。
「調節T細胞(regulatory T cell)」（「Treg」、「Treg細胞」、或「Tregs」）係指參與控制某些免疫活性（例如自體免疫、過敏、及對感染之反應）之CD4+ T淋巴球譜系。調節T細胞可調節T細胞群之活性，且亦可影響某些先天性免疫系統細胞類型。Treg可藉由生物標記CD4、CD25、及Foxp3之表現及CD127之低表現識別。天然存在之Treg細胞通常構成約5%至10%周邊CD4+ T淋巴球。然而，腫瘤微環境內之Treg細胞（亦即腫瘤浸潤Treg細胞），Treg細胞可能佔總CD4+ T淋巴球群之多達20至30%。
用語「樣本(sample)」通常係指從所關注源獲得或衍生之材料之等分試樣。在一些實施例中，所關注源係生物或環境源。在一些實施例中，所關注來源可包含細胞或生物體，諸如細胞群、組織、或動物（例如人類）。在一些實施例中，所關注源包含生物組織或流體。在一些實施例中，生物組織或流體可包含羊水、房水、腹水、膽汁、骨髓、血液、乳汁、腦脊髓液、耵聹、乳糜、纓、射精、內淋巴、滲出液、糞便、胃酸、胃液、淋巴液、黏液、心包液、外淋巴液、腹膜液、胸膜液、膿液、風濕液、唾液、皮脂、精液、血清、包皮垢、痰液、滑液、汗液、淚液、尿液、陰道分泌物、玻璃狀液、嘔吐物、及/或其組合或組分。在一些實施例中，生物流體可包含胞內流體、胞外流體、靜脈內流體（血漿）、組織間隙液、淋巴液、及/或移植細胞流體。在一些實施例中，生物流體可包含植物滲出液。在一些實施例中，可獲得生物組織或樣本例如藉由抽吸、活體組織切片（例如細針或組織活體組織切片）、拭子（例如口腔、鼻、皮膚、或陰道拭子）、刮刀、手術、洗滌或灌洗（例如支氣管肺泡、導管、鼻、眼部、口腔、子宮、陰道、或其他洗滌或灌洗）。在一些實施例中，生物樣本包含獲自個體之細胞。在一些實施例中，樣本係藉由任何適當方式直接自所關注來源獲得之「初級樣本(primary sample)」。在一些實施例中，如從上下文中將清楚的，用語「樣本(sample)」係指藉由處理（例如藉由移除一或多種組分及/或藉由添加一或多種劑至）初級樣本而獲得的製劑。此類「經處理樣本」可包含例如核酸或蛋白質，其係萃取自樣本中或藉由使初級樣本經受一或多種技術而獲得，諸如核酸之擴增或反轉錄、某些組分之單離及/或純化等。
「單鏈可變片段」、「單鏈抗體可變片段」或「scFv」抗體指包含僅藉由連接子肽連接之重鏈及輕鏈之可變區的抗體形式。
用語「癌症分期(stage of cancer)」係指癌症進展程度之定性或定量評估。在一些實施例中，用於判定癌症之階段之標準可包含但不限於下列之一或多者：癌症在本體中之位置、腫瘤尺寸、癌症是否已擴散至淋巴結，癌症是否已擴散至本體中之一或多種不同部分等。在一些實施例中，可使用所謂的TNM系統對癌症進行分級，根據該系統T係指主要腫瘤之尺寸及程度，通常稱為原發腫瘤；N係指附近具有癌症之淋巴結的數目；且M係指癌症是否已轉移。在一些實施例中，癌症可稱為0期（存在異常細胞但未擴散至附近組織，亦稱為原位癌或CIS；CIS不是癌症，但可能會變成癌症），I-III期（存在癌症；數目愈高，腫瘤愈大，且其擴散至附近組織之程度越大），或IV期（癌症已擴散至本體之遠端部分）。在一些實施例中，癌症可指定為選自由以下所組成之群組之階段：原位；局部（癌症受限於其開始之地點，不具有其擴散的跡象）；區域（癌症已擴散至附近淋巴結、組織、或器官）；遠端（癌症已擴散至本體之遠端部分）；及未知（不存在足夠資訊以判定該階段）。
「刺激(stimulation)」係指藉由刺激分子與其同源配體之結合誘導的初級反應，其中該結合介導信號轉導事件。「刺激分子(stimulatory molecule)」係T細胞上之分子，例如T細胞受體(TCR)/CD3複合物，其與存在於抗原呈現細胞上之同源刺激配體特異性結合。「刺激配體(stimulatory ligand)」係當存在於抗原呈現細胞（例如APC、樹突細胞、B細胞、及類似者）上時可與T細胞上之刺激分子特異性結合的配體，從而介導T細胞之初級反應，包括但不限於活化、起始免疫反應、增生、及類似者。刺激配體包括但不限於抗CD3抗體（諸如OKT3）、載有肽之MHC I類分子、超促效劑抗CD2抗體、及超促效劑抗CD28抗體。
詞組「治療劑(therapeutic agent)」可指任何藥劑，其在投予生物體時引發所欲藥理效應。在一些實施例中，若其證實跨適當群體之統計顯著效應，則將藥劑視為治療劑。在一些實施例中，適當群體可係模型生物體或人類對象之群體。在一些實施例中，適當群體可藉由各種標準定義，諸如特定年齡組、性別、遺傳背景、預先存在之臨床病況、根據生物標記之存在或不存在等。在一些實施例中，治療劑係可用於減輕、改善、和緩、抑制、預防疾病、病症、及/或病況之一或多種症狀或特徵、延緩其發作、降低其嚴重性、及/或降低其發生率的物質。在一些實施例中，治療劑係在其銷售之前已經過或需要政府機關批准之藥劑，以便投予至人類。在一些實施例中，治療劑係需要醫學處方才能投予至人類之藥劑。
一種治療劑（例如經工程改造之CAR T細胞或NK細胞）之「治療有效量(therapeutically effective amount)」、「有效劑量(effective dose)」、「有效量(effective amount)」、或「治療有效劑量(therapeutically effective dosage)」係任何量，當單獨或與另一治療劑組合使用時，保護對象免受疾病之發作或促進疾病回歸，表現為疾病症狀之嚴重程度降低、疾病無症狀期之頻率及持續時間增加，或預防由於疾病折磨造成的損害或殘疾。促進疾病回歸之治療劑之能力可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之各種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人類對象中、在預測人類功效的動物模型系統中、或藉由在體外檢定中檢定藥劑之活性。
用語「轉導(transduction)」及「轉導(transduced)」係指藉由病毒載體將外來DNA引入細胞中之程序（參見Jones et al.，「Genetics: principles and analysis，」Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)）。在一些實施例中，載體係反轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾司坦-巴爾(Epstein Barr)病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體、或其任何組合。
「轉化(transformation)」係指將外源DNA引入宿主細胞中之任何方法。可使用各種方法在天然或人工條件下進行轉化。轉化可使用任何已知方法來達成，該方法用於插入外來核酸序列至原核或真核宿主細胞中。在一些實施例中，基於被轉化之宿主細胞及/或待插入之核酸來選擇一些轉化方法。轉化方法可包含但不限於病毒感染、電穿孔、及脂質轉染。在一些實施例中，「轉化」細胞係經穩定地轉化，其中所插入之DNA能夠複製作為自主複製質體或作為宿主染色體之部分。在一些實施例中，轉化之細胞可表現引入核酸。
對象之「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指向對象進行之任何類型之干預或過程，或向對象投予活性劑，目的係反轉、緩解、改善、抑制、減緩或預防症狀、併發症或病況之發作、進展、發展、嚴重程度或再發、或與疾病相關聯之生物化學指示。在一個實施例中，「治療(treatment)」或「治療(treating)」」包括部分緩解。在另一實施例中，「治療」包括完全緩解。在一些實施例中，治療可係未展現出相關疾病、病症及/或病況之徵象之對象，及/或僅展現出疾病、病症及/或病況之早期徵象之對象。在一些實施例中，此類治療可係展現出相關疾病、病症及/或病況之一或多種建立徵象之對象。在一些實施例中，治療可係已診斷患有相關疾病、病症及/或病況之對象。在一些實施例中，治療可係已知具有一或多個敏感性因子之對象，該一或多個敏感性因子與相關疾病、病症及/或病況之發展風險增加的統計學上相關。
用語「載體(vector)」係指經修飾以包含或合併所提供核酸序列之接受者核酸分子。一種類型之載體係「質體(plasmid)」，其係指額外DNA可連接之環狀雙股DNA分子。另一種類型之載體係病毒載體，其中額外DNA區段可連接至病毒基因體中。某些載體能夠在其等被引入的宿主細胞中自主複製（例如具有細菌複製起源之細菌載體及游離基因(episomal)哺乳動物載體）。其他載體（例如非游離基因哺乳動物載體）在引入宿主細胞中後可整合至宿主細胞之基因體中，且藉此與宿主基因體一起複製。此外，某些載體包含直接表現可操作性地連接至其之插入基因之序列。此類載體在本文中可稱為「表現載體(expression vector)」。標準技術可用於經工程改造之載體，例如在Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其以引用方式併入本文中。
用語「序列(sequence)」係指任何長度之核苷酸序列，其可係DNA或RNA；可係線性、圓形或支鏈，且可為單股或雙股。用語「供體序列(donor sequence)」係指插入基因體中之核苷酸序列。供體序列可係任何長度，例如長度在2與10,000個核苷酸之間（或其間或以上之任何整數），較佳在長度約100與1,000個核苷酸之間（或其間之任何整數），更佳地長度在約200與500個核苷酸之間。
對於本揭露之目的，「基因(gene)」包括編碼基因產物之DNA區（參見下文），以及調節基因產物之產生的所有DNA區，無論此類調節序列是否相鄰於編碼及/或轉錄序列。因此，基因包括但不必然限於啟動子序列、終止子、轉譯調節序列（諸如核糖體結合位點及內部核糖體進入位點）、強化子、沉默子、絕緣子、邊界元件、複製起源、基質附著位點、及基因座控制區。
「跨膜域(transmembrane domain)」係多肽之域，其包括至少一個連續胺基酸序列，當在哺乳動物細胞中表現且存在於對應內源性多肽中時，該序列穿過脂質雙層。舉例而言，當在哺乳動物細胞中表現且存在於相應之內源性多肽中時，跨膜域可包括一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、或十個連續胺基酸序列，該序列各自穿過脂質雙層。跨膜域可例如包括至少一個（例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、或十個）連續胺基酸序列（當在哺乳動物細胞中表現且存在於對應內源性多肽中時穿過脂質雙層），該等胺基酸序列在脂質雙層中具有α-螺旋二級結構。在一些實施例中，跨膜域可包括二或更多個連續胺基酸序列（當在哺乳動物細胞中表現且存在於對應內源性多肽中時各自穿過脂質雙層），該等胺基酸序列在脂質雙層中形成β-桶狀二級結構。跨膜域之非限制性實例描述於本文中。跨膜域之額外實例係所屬技術領域中已知的。
當用於描述多肽之位置時，詞組「質膜之胞外側(extracellular side of the plasma membrane)」意指多肽包括至少一個穿過質膜之跨膜域及位於胞外空間中之至少一個域（例如至少一個抗原結合域）。
除非具體相反地指示，否則本揭露可使用在本領域之技術範圍內之化學、生物化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、基因學、免疫學、及細胞生物學之方法，其中許多為了說明之目的描述於下文。此類技術在文獻中完整解釋。參見例如Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd Edition, 2001)；Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982)；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, updated July 2008)； Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley–Interscience；Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985)；Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992； Transcription and Translation(B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984)；Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in ImmunologyQ. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991)； Annual Review of Immunology；以及在期刊上之專論，諸如 Advances in Immunology。
本揭露提供抗原結合劑，諸如抗體、嵌合抗原受體(CAR)、及T細胞受體(TCR)，其至少包含結合至磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)之單一抗原結合域，在本文中稱為GPC3結合域。其他情況下，本揭露提供用於治療癌症及/或用於起始或調節免疫反應之方法及組成物。在各種實施例中，GPC3結合域係scFv。例示性GPC3結合域胺基酸序列及編碼其之核酸序列係提供於本文中，例如在表4至表8中。在一些實施例中，本揭露之GPC3結合域係由嵌合抗原受體(CAR)構成。在一些實施例中，本揭露之GPC3結合域係由T細胞受體(TCR)構成。在一些實施例中，本揭露之抗原結合劑係經工程改造之T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，CAR及/或TCR以顯性負性TFGβ受體(DN TFGβ R)表現。在一些實施例中，CAR及/或TCR以膜結合之介白素15 (IL-15)、IL-15Rα壽司域嵌合受體表現。揭示包括GPC3結合域之抗體及其片段，諸如揭示於表4至表8中。
本揭露之各種實施例提供編碼本文所提供之GPC3結合域或GPC3結合劑之載體，例如編碼GPC3結合CAR或TCR之載體。本揭露之各種實施例提供編碼DN TFGβ R之載體，例如編碼GPC3結合CAR及DN TFGβ R之載體。在一些實施例中，DN TFGβ R係在與編碼GPC3結合CAR或TCR之載體不同的載體中編碼。在一些實施例中，DN TFGβ R係在與編碼GPC3結合CAR或TCR相同的載體中編碼。本揭露之各種實施例提供編碼IL-15- IL-15Rα壽司域嵌合受體之載體，例如編碼GPC3結合CAR及IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體之載體。在一些實施例中，IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體係在與編碼GPC3結合CAR或TCR之載體不同的載體中編碼。在一些實施例中，IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體係在與編碼GPC3結合CAR或TCR相同的載體中編碼。
本揭露之各種實施例提供一種GPC3結合劑，其係編碼或表現GPC3結合CAR或TCR之細胞，例如T細胞或NK細胞經工程改造以編碼或表現GPC3結合CAR或TCR。本揭露提供用整合基因進行基因修飾之免疫細胞，例如編碼GPC3結合CAR或TCR之核苷酸序列（例如包含此類核苷酸序列之組成型表現構築體及/或可誘導型表現構築體）。在一些實施例中，免疫細胞經進一步工程改造以表現DN TFGβ R。在實施例中，免疫細胞經進一步工程改造以表現IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體。在一些實施例中，本揭露提供治療具有腫瘤（諸如HCC）之對象的方法，其包含向對象投予本文所述之GPC3結合劑療法及/或本文所述之蛋白質治療劑。在一些實施例中，方法進一步包含投予一或多種額外療法（例如第二結合劑（例如CAR-T細胞、CAR-NK細胞、TCR-T細胞、TIL細胞、同種異體NK細胞、及自體NK細胞）、抗體-藥物接合物、抗體、雙特異性抗體、T細胞接合雙特異性抗體、經工程改造抗體、及/或本文所描述之多肽）。
本揭露之GPC3結合域可包含如本文所述之抗體中所發現之抗原結合序列，例如表4至表8中所揭示之mAb 1至 5。在一些情況下，本揭露之GPC3結合域包含本文所述之GPC3結合域，諸如scFv。除非另有指明，否則應理解本揭露中對GPC3之指稱係關於人類GPC3。
磷脂醯肌醇蛋白聚糖3（GPC3，NCBI基因ID號2719，於2021年4月10日更新，其全文特此以引用方式併入本文中）係磷脂醯肌醇蛋白聚糖相關整合膜蛋白聚醣家族之成員(GRIPS)。GPC3含有經由醣基磷脂醯肌醇鍵錨定至細胞質膜之核心蛋白。GPC3在多種癌症類型中表現，包括肝細胞癌(HCC)及肺鱗狀細胞癌(SCC)。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所提供之至少一個重鏈CDR (HCDR)，例如表4中所揭示之至少一個HCDR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所提供之兩個HCDR，例如表4中所揭示之至少兩個HCDR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所提供之三個HCDR，例如表4中所揭示之三個HCDR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所提供之至少一個輕鏈CDR (LCDR)，例如表4中所揭示之至少一個LCDR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所提供之兩個LCDR，例如表4中所揭示之至少兩個LCDR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所提供之三個LCDR，例如表4中所揭示之三個LCDR。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所提供之至少一個HCDR，例如表4中所揭示之至少一個HCDR；及本文所提供之至少一個LCDR，例如表4中所揭示之至少一個LCDR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所提供之兩個HCDR，例如表4中所揭示之至少兩個HCDR；及本文所提供之兩個LCDR，例如表4中所揭示之至少兩個LCDR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所提供之三個HCDR，例如表4中所揭示之三個HCDR；及本文所提供之三個LCDR，例如表4中所揭示之三個LCDR。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之重鏈可變域之至少一個重鏈架構區（重鏈FR），例如表4至表8中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少一個重鏈FR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之重鏈可變域之兩個重鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少兩個重鏈FR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之輕鏈可變域之至少一個輕鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之至少一個輕鏈FR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之輕鏈可變域之兩個輕鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之至少兩個輕鏈FR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之重鏈可變域之至少一個重鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少一個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之至少一個輕鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之至少一個輕鏈FR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之重鏈可變域之一個重鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少一個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之一個輕鏈FR，例如衍生自與（多個）重鏈FR相同的表4至表8之表。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之重鏈可變域之兩個重鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少兩個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之兩個輕鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之至少兩個輕鏈FR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之重鏈可變域之兩個重鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之重鏈可變域之至少兩個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之兩個輕鏈FR，例如衍生自與（多個）重鏈FR相同的表4至表8表。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR；及本文所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含本文所揭示之重鏈可變域之三個重鏈FR，例如表4至表8中之任一者中所揭示之輕鏈可變域之三個輕鏈FR；及衍生自與（多個）重鏈FR相同的表4至表8之表的三個輕鏈FR。
表4至表8中所提供之例示性抗體序列適用於任何抗體格式，包含例如四聚體抗體、單特異性抗體、雙特異性抗體、抗原結合片段、或結合域。表4至表8中所提供之重鏈可變域及輕鏈可變域及其部分可包含於GPC3結合域中。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含一、二、或三個FR，其一起或各自獨立地與表4至表8中任一者所揭示之重鏈可變域之重鏈可變域之對應FR具有至少75%同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%，例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含一、二、或三個FR，其一起或各自獨立地與表4至表8中任一者所揭示之輕鏈可變域之輕鏈可變域之對應FR具有至少75%同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%）。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含至少一個重鏈可變域，其與表4至表8中任一者所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含兩個重鏈可變域，其各自與表4至表8中所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），其中重鏈可變域可相同或不同。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含至少一個輕鏈可變域，其與表4至表8中任一者所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）。在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含兩個輕鏈可變域，其各自與表4至表8中任一者所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），其中輕鏈可變域可相同或不同。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含至少一個重鏈可變域，其與表4至表8中任一者所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）；及至少一個輕鏈可變域，其與表4至表8中任一者所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）。在某些實施例中，本揭露之GPC3結合域包含一個重鏈可變域，其與表4至表8中任一者所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）；及一個輕鏈可變域，其與表4至表8中任一者所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），其中重鏈可變域及輕鏈可變域可選地衍生自表4至表8中之相同之表。
在各種實施例中，本揭露之GPC3結合域包含兩個重鏈可變域，其各自與表4至表8中所揭示之重鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）；及兩個輕鏈可變域，其各自與表4至表8中所揭示之輕鏈可變域具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），其中在各種實施例中，(i)重鏈可變域之各者可相同或不同；(ii)輕鏈可變域之各者可相同或不同；(iii)至少一個重鏈可變域及至少一個輕鏈可變域可衍生自表4至表8中之相同之表；或(iv)兩個重鏈可變域及兩個輕鏈可變域皆衍生自表4至表8中之相同之表。
表4至表8中之各者表示例示性抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域序列，其包含(i)例示性抗體之重鏈可變域；(ii)編碼重鏈可變域之DNA序列；(iii)根據IMGT、Kabat、及Chothia編號，重鏈可變域之三個重鏈可變域CDR；(iv)例示性抗體之輕鏈可變域；(v)編碼輕鏈可變域之DNA序列；及(vi)根據IMGT、Kabat、及Chothia編號，輕鏈可變域之三個輕鏈可變域CDR。各表中提供之資訊提供架構胺基酸序列、以及編碼各CDR胺基酸序列之核苷酸序列及編碼對應FR胺基酸序列之核苷酸序列。
在各種實施例中，GPC3結合域可包含本揭露之重鏈可變域（例如與表4至表8中任一者之重鏈可變域具有至少75%序列同一性，例如至少80%、85%、90%、95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）、本揭露之輕鏈可變域（例如與表4至表8中任一者之輕鏈可變域具有至少75%序列同一性，例如至少80%、85%、90%、95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）、及連接子（例如根據SEQ ID NO: 59之連接子）。在各種實施例中，GPC3結合域可包含前導序列、本揭露之重鏈可變域（例如與表4至表8中任一者之重鏈可變域具有至少75%序列同一性，例如至少80%、85%、90%、95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）、本揭露之輕鏈可變域（例如與表4至表8中任一者之輕鏈可變域具有至少75%序列同一性，例如至少80%、85%、90%、95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）、及連接子。若提供一種GPC3結合域之胺基酸或核苷酸序列，其包含本揭露之重鏈可變域及本揭露之輕鏈可變域，則連接兩個可變域之連接子鑑於本揭露自序列將係顯而易見的。若提供一種GPC3結合域之胺基酸或核苷酸序列，其包含本揭露之重鏈可變域及本揭露之輕鏈可變域，則前導序列鑑於本揭露將係顯而易見的。為避免疑問，本揭露之重鏈可變域及輕鏈可變域可以任何定向存在，例如其中重鏈可變域係輕鏈可變域之C端之定向，或其中重鏈可變域係輕鏈可變域之N端之定向。在各種實施例中，GPC3結合域可包含根據SEQ ID NO: 59之連接子。
在某些實施例中，本揭露之GPC3結合域包含GPC3結合域，其包含本揭露之重鏈可變域、本揭露之輕鏈可變域、及與SEQ ID NO: 59具有至少75%序列同一性之連接子（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）。在某些實施例中，本揭露之GPC3結合域包含GPC3結合域，其包含根據SEQ ID NO: 59之連接子。在某些實施例中，本揭露之GPC3結合域包含GPC3結合域，其包含本揭露之重鏈可變域、本揭露之輕鏈可變域、及與SEQ ID NO: 79具有至少75%序列同一性之前導序列（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）。在某些實施例中，本揭露之GPC3結合域包含GPC3結合域，其包含根據SEQ ID NO: 79之CSF2RA前導序列(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP; SEQ ID NO: 79)。在實施例中，前導序列可由核酸序列編碼，該核酸序列與與ATGCTGTTATTAGTGACCTCTTTACTGCTGTGTGAGCTGCCCCACCCCGCTTTCCTCCTCATCCCG (SEQ ID NO: 82)具有至少75%序列同一性（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）。在某些實施例中，本揭露之GPC3結合域包含GPC3結合域，其包含本揭露之重鏈可變域、本揭露之輕鏈可變域、本揭露之連接子、及本揭露之前導序列。
基於本文所提供之例示性抗體的本揭露之結合劑（諸如例如Ab 1至5）可以任何片段或格式提供，其包含根據所指示之例示性抗體之重鏈可變域及根據所指示之例示性抗體之輕鏈可變域。 表4：例示性抗體序列1 (mAb1-1)
SEQ ID NO: 描述 序列
3 重鏈可變域 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSS
4 VH (DNA) CAAGTCCAACTGGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTCAAGAAGCCCGGAGCCAGCGTGAAAGTCTCATGTAAAACCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGTCGTGTGACCATGACAGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCTCTGCGTTCTGAGGACACAGCCGTTTACTACTGCGCCAGAGGCAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACATTAGTGACCGTGTCCTCC
5 CDRH1 IMGT (Prot) GYTFTDYY
6 CDRH1 Kabat (Prot) DYYIH
7 CDRH1 Chothia (Prot) GYTFTD
8 CDRH2 IMGT (Prot) IYPGSGNT
9 CDRH2 Kabat (Prot) EIYPGSGNTYYAQKFQ
10 CDRH2 Chothia (Prot) YPGSG
11 CDRH3 IMGT (Prot) ARGNDYDAWFVY
12 CDRH3 Kabat (Prot) GNDYDAWFVY
13 CDRH3 Chothia (Prot) GNDYDAWFVY
14 輕鏈可變域 DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
15 VL (DNA) GACATCGTCATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCCGTGTCTTTAGGCGAAAGAGTGACCATGAACTGCAAGTCCAGCCAGTCTTTACTGAATTCCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCATTCGAGAATCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGACTTTACTTTAACCATCAGCAGCGTGCAAGCTGAGGACGTGGCTGTGTACTATTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAG
16 CDRL1 IMGT (Prot) QSLLNSGTRKNY
17 CDRL1 Kabat (Prot) KSSQSLLNSGTRKNYLA
18 CDRL1 Chothia (Prot) KSSQSLLNSGTRKNYLA
19 CDRL2 IMGT (Prot) WAS
20 CDRL2 Kabat (Prot) WASIRES
21 CDRL2 Chothia (Prot) WASIRES
22 CDRL3 IMGT (Prot) KQSYSLYT
23 CDRL3 Kabat (Prot) KQSYSLYT
24 CDRL3 Chothia (Prot) KQSYSLYT
25 ScFv QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
26 ScFv CAAGTCCAACTGGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTCAAGAAGCCCGGAGCCAGCGTGAAAGTCTCATGTAAAACCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGTCGTGTGACCATGACAGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCTCTGCGTTCTGAGGACACAGCCGTTTACTACTGCGCCAGAGGCAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACATTAGTGACCGTGTCCTCCGGATCCACATCCGGCAGCGGAAAGCCCGGTAGCGGCGAGGGCAGCACCAAAGGAGACATCGTCATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCCGTGTCTTTAGGCGAAAGAGTGACCATGAACTGCAAGTCCAGCCAGTCTTTACTGAATTCCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCATTCGAGAATCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGACTTTACTTTAACCATCAGCAGCGTGCAAGCTGAGGACGTGGCTGTGTACTATTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAG
表5：例示性抗體序列2 (mAb1-2)
SEQ ID NO: 描述 序列
27 重鏈可變域 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSS
28 VH (DNA) CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGCTATACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCAGCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGTGACCATGACTCGTGACACCTCCACCTCCACCGTGTATATGGAGCTGAGCTCTTTAAGGTCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGGAAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACATTAGTGACCGTCAGCTCC
29 輕鏈可變域 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
30 VL (DNA) GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCTGTGTCTTTAGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGAGCTTATTAAATAGCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTCATCTACTGGGCTTCCATCAGAGAGAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACTTTAACCATCTCCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCCGTGTATTACTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAA
31 ScFv QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
32 ScFv CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGCTATACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCAGCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGTGACCATGACTCGTGACACCTCCACCTCCACCGTGTATATGGAGCTGAGCTCTTTAAGGTCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGGAAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACATTAGTGACCGTCAGCTCCGGCTCCACAAGCGGATCCGGCAAACCCGGTAGCGGCGAAGGCAGCACCAAGGGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCTGTGTCTTTAGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGAGCTTATTAAATAGCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTCATCTACTGGGCTTCCATCAGAGAGAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACTTTAACCATCTCCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCCGTGTATTACTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAA
表6：例示性抗體序列3 (mAb1-3)
SEQ ID NO: 描述 序列
33 重鏈可變域 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSS
34 VH (DNA) CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTCTCATGCAAGACCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGCCAAGGTCTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCTATTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGTGACCATGACAGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCTTACGTAGCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCTCGTGGCAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACTCTGGTGACCGTGTCCTCC
35 輕鏈可變域 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
36 VL (DNA) GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGATTCTTTAGCCGTCAGCCTTGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCTTATTAAACTCCGGCACTCGAAAAAACTACCTCGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGTCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCATTCGTGAGAGCGGAGTGCCCGACAGATTTAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGATTTCACTTTAACCATCAGCTCTTTACAAGCTGAGGATGTGGCCGTGTATTACTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATTAAG
37 ScFv QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
38 ScFv CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTCTCATGCAAGACCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGCCAAGGTCTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCTATTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGTGACCATGACAGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCTTACGTAGCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCTCGTGGCAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACTCTGGTGACCGTGTCCTCCGGAAGCACCTCCGGAAGCGGCAAGCCCGGTAGCGGCGAAGGATCCACCAAGGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGATTCTTTAGCCGTCAGCCTTGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCTTATTAAACTCCGGCACTCGAAAAAACTACCTCGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGTCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCATTCGTGAGAGCGGAGTGCCCGACAGATTTAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGATTTCACTTTAACCATCAGCTCTTTACAAGCTGAGGATGTGGCCGTGTATTACTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATTAAG
表7：例示性抗體序列4 (mAb1-4)
SEQ ID NO: 描述 序列
39 重鏈可變域 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGEIYPGSGNTYYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSS
40 VH (DNA) CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAGGTGTCTTGTAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCGAGATCTATCCCGGCAGCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGCCACTTTAACCGCTGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGTTCTCCTCTTTAAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCTCGTGGCAACGACTATGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGTCAAGGAACATTAGTGACAGTGAGCAGC
41 輕鏈可變域 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
42 VL (DNA) GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCTGTGAGCCTTGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGTCTTTACTGAACAGCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCATTCGTGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGAACCGACTTTACTTTAACCATCTCCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCTGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAAATCAAG
43 ScFv QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGEIYPGSGNTYYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
44 ScFv CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAGGTGTCTTGTAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCGAGATCTATCCCGGCAGCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGCCACTTTAACCGCTGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGTTCTCCTCTTTAAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCTCGTGGCAACGACTATGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGTCAAGGAACATTAGTGACAGTGAGCAGCGGATCCACCAGCGGATCCGGCAAGCCCGGTAGCGGAGAAGGCAGCACCAAGGGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCTGTGAGCCTTGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGTCTTTACTGAACAGCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCATTCGTGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGAACCGACTTTACTTTAACCATCTCCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCTGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAAATCAAG
表8：例示性抗體序列5 (mAb1-5)
SEQ ID NO: 描述 序列
45 重鏈可變域 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGEIYPGSGNTYYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSS
46 VH (DNA) CAAGTTCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCTGAAGTGAAGAAGCCCGGCGCTAGCGTCAAAGTCTCATGCAAAACCTCCGGCTACACCTTTACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGTCAAGGTCTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCCCGGCAGCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGCCACTTTAACCGCTGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAAGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGTGGCAACGATTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGACAAGGAACATTAGTGACCGTGTCCAGC
47 輕鏈可變域 DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
48 VL (DNA) GATATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCCGTGTCTTTAGGAGAGAGAGTGACCATGAACTGCAAGAGCAGCCAGTCTTTACTGAACAGCGGCACCAGAAAGAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCATTCGTGAGAGCGGAGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACTTTAACCATCAGCAGCGTGCAAGCTGAGGATGTGGCCGTGTATTACTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTTGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAA
49 ScFv QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGEIYPGSGNTYYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIK
50 ScFv CAAGTTCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCTGAAGTGAAGAAGCCCGGCGCTAGCGTCAAAGTCTCATGCAAAACCTCCGGCTACACCTTTACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGTCAAGGTCTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCCCGGCAGCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGCCACTTTAACCGCTGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAAGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGTGGCAACGATTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGACAAGGAACATTAGTGACCGTGTCCAGCGGCAGCACAAGCGGAAGCGGCAAGCCCGGTAGCGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCCGTGTCTTTAGGAGAGAGAGTGACCATGAACTGCAAGAGCAGCCAGTCTTTACTGAACAGCGGCACCAGAAAGAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCATTCGTGAGAGCGGAGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACTTTAACCATCAGCAGCGTGCAAGCTGAGGATGTGGCCGTGTATTACTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTTGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAA
嵌合抗原受體(CAR)係可引導或重導T細胞或NK細胞（例如患者或供體T或NK細胞）靶向選定抗原之工程改造受體。CAR可經工程改造以識別抗原且當與抗原結合時，活化免疫細胞以攻擊及破壞攜帶抗原之細胞。當這些抗原存在於腫瘤細胞上時，表現該CAR之免疫細胞即可靶向及殺滅該腫瘤細胞。CAR通常包含介導抗原結合之胞外結合域（例如GPC3結合域）、當CAR存在於細胞表面或細胞膜時跨越或理解為跨越細胞膜之跨膜域、及胞內（或細胞質）信號傳導域。
根據至少一個非限制性視圖，已存在至少三個「代(generation)」之CAR組成物。在第一代CAR中，結合域（例如單鏈片段變數、結合域）經由跨膜域鏈接或連接至信號傳導域（例如CD3ζ），該跨膜域可選地包含鉸鏈域及一或多個間隔物。在第二代CAR中，引入共刺激域（CM1，諸如CD28、4-1BB、或OX-40）與信號傳導域（例如CD3ζ）。在第三代CAR中，包含第二共刺激域(CM2)。
TCR係由α鏈及β鏈所構成之異二聚體。TCR信號傳導需要募集產生免疫突觸之信號傳導蛋白質。此外，TCR在質膜處之局部化取決於CD3複合物，其在T細胞中表現。可產生經工程改造單鏈TCR，例如使用CAR構築體之跨膜及信號傳導域、已知之方法及構築體（例如sTCR及TCR-CAR分子，例如TCRβ鏈與CD28 TM及CD28及CD3ζ信號傳導模組之融合）。
本揭露之GPC3結合系統可包含結合GPC3之一或多種抗原結合域。在一些實施例中，抗原結合系統進一步包含共刺激域、及/或胞外域（例如「鉸鏈」或「間隔子」區）、及/或跨膜域、及/或胞內（信號傳導）域、及/或CD3ζ或CD3ε活化域。在一些實施例中，本揭露之GPC3結合系統至少包含結合人類GPC3之結合域、共刺激域、胞外域、跨膜域、及CD3ζ或CD3ε活化域。
在一些實施例中，本揭露之GPC3結合CAR可包含抗原結合系統，其包含前導肽(P)、GPC3結合(B)、共刺激蛋白質之胞外域(E)、跨膜域(T)、共刺激域(C)、第二共刺激域(C′)、及活化域(A)中之一或多者或全部。在一些情況下，GPC3結合CAR係根據以下組態：B E T A。在一些情況下，GPC3結合CAR係根據以下組態：P B E T A。在一些情況下，GPC3結合CAR係根據以下組態：B E T C A。在一些情況下，GPC3結合CAR係根據以下組態：P B E T C A。在一些情況下，GPC3結合CAR係根據以下組態：B E T C C′ A。在一些情況下，GPC3結合CAR係根據以下組態：P B E T C C′ A。在一些實施例中，GPC3結合CAR包含VH及VL，可選地其中CAR係根據以下組態：P-VH-VL-E-T-C-A或P-VL-VH-E-T-C-A。在一些實施例中，VH及VL係藉由連接子(L)連接，可選地其中CAR自N端至C端係根據以下組態：P-VH-L-VL-E-T-C-A或P-VH-L-VL-E-T-C-A。
一或多種抗原結合域判定抗原結合系統之目標。抗原結合系統之結合域可包含任何GPC3結合域，例如本揭露所提供之抗體，例如本揭露之結合域。結合域至少部分使用於嵌合抗原受體中，因為其可經工程改造以與其他CAR組分表現為單鏈之部分。參見例如美國專利第7,741,465號及第6,319,494號以及Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136、Krause et al., J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619-626)；Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797，其中之各者關於CAR中之結合域以引用方式併入本文中。結合域或scFv係單鏈抗原結合片段，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域，該重鏈可變域及輕鏈可變域鏈接或連接在一起。參見例如美國專利第7,741,465號及第6,319,494號以及Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136，其中之各者關於結合域以引用方式併入本文中。當衍生自親本抗體時，結合域可保留一些、保留全部、或基本上保留親本抗體與目標抗原之結合。在一些實施例中，本文所涵蓋之CAR包含抗原特異性結合域，其可係結合在癌細胞上表現之抗原之scFv（鼠類、人類或人源化scFv）。在某些實施例中，scFv結合GPC3。
在某些實施例中，本文所涵蓋之CAR可包含各種域之間的連接子殘基，例如在VH及VL域之間，添加用於分子之適當間隔構形。本文所涵蓋之CAR可包含一、兩個、三個、四個、或五個或更多個連接子。在一些實施例中，連接子之長度係約1至約25個胺基酸、約5至約20個胺基酸、或約10至約20個胺基酸、或任何中介長度之胺基酸。在一些實施例中，連接子係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個胺基酸長。
連接子之說明性實例包括甘胺酸聚合物(G)n；甘胺酸-絲胺酸聚合物(G 1–5S 1–5)n，其中n為至少一、二、三、四、或五之整數；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及所屬技術領域中已知之其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物係相對非結構化，且因此可能夠作為融合蛋白（諸如本文所述之CAR）之域之間的中性繫鏈。甘胺酸甚至比丙胺酸能進入更多的φ–ψ空間，且比具有較長側鏈之殘基限制更少（參見Scheraga, Rev. Computational Chem.11173–142 (1992)）。本文所涵蓋之其他連接子包括惠特洛(Whitlow)連接子（參見Whitlow, Protein Eng. 6(8): 989–95 (1993)）。所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，一些實施例中之CAR的設計可包括全部或部分可撓性之連接子，使得連接子可包括可撓性連接子以及賦予較低可撓性結構之一或多個部分，以提供所欲CAR結構。在一個實施例中，本文所述之構築體中之任一者可包含「GS」連接子。在另一實施例中，本文所述之構築體中之任一者包含「GSG」連接子。在一實例中，甘胺酸-絲胺酸連接子包含胺基酸序列GS (SEQ ID NO: 51)或由其組成，其可由根據GGATCC (SEQ ID NO: 52)或GGGTCC (SEQ ID NO: 53)之核酸序列編碼。在一實例中，甘胺酸-絲胺酸連接子包含胺基酸序列GSG (SEQ ID NO: 54)或由其組成，其可由根據GGCTCTGGA (SEQ ID NO: 55)或之核酸序列編碼。在一實例中，甘胺酸-絲胺酸連接子包含胺基酸序列GGGSGGGS (SEQ ID NO: 56)或由其組成，其可由根據GGCGGTGGAAGCGGAGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 58)之核酸序列編碼。在另一實施例中，本文所述之CAR包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 59 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 59)。在一實施例中，連接子係由核酸序列編碼，該核酸序列與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：根據GGATCCACATCCGGCAGCGGAAAGCCCGGTAGCGGCGAGGGCAGCACCAAAGGA (SEQ ID NO: 60)、GGCTCCACAAGCGGATCCGGCAAACCCGGTAGCGGCGAAGGCAGCACCAAGGGC (SEQ ID NO: 61)、或GGAAGCACCTCCGGAAGCGGCAAGCCCGGTAGCGGCGAAGGATCCACCAAGGGC (SEQ ID NO: 62)、GGATCCACCAGCGGATCCGGCAAGCCCGGTAGCGGAGAAGGCAGCACCAAGGGC (SEQ ID NO: 63)、GGCAGCACAAGCGGAAGCGGCAAGCCCGGTAGCGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC (SEQ ID NO: 64)之核酸序列。
在實施例中，CAR包含進一步包含可變區連接序列之scFv。「可變區連接序列(variable region linking sequence)」係將重鏈可變區與輕鏈可變區連接之胺基酸序列，且提供與兩個子結合域之交互作用相容的間隔子功能，使得所得多肽保留與包含相同之輕及重鏈可變區之抗體對相同目標分子之特異性結合親和力。在一個實施例中，可變區連接序列係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個胺基酸長。
在實施例中，CAR之結合域接著係一或多個「間隔域(spacer domain)」，其係指移動抗原結合域遠離效應細胞表面以使適當的細胞/細胞接觸、抗原結合及活化之區(Patel et al., Gene Therapy,1999; 6: 412-419)。間隔域可衍生自天然、合成、半合成、或重組源。在某些實施例中，間隔域係免疫球蛋白之部分，包括但不限於一或多個重鏈恆定區，例如CH2及CH3。間隔域可包括天然存在之免疫球蛋白鉸鏈區或改變免疫球蛋白鉸鏈區之胺基酸序列。
CAR之結合域可通常接著一或多個「鉸鏈域(hinge domain)」，其在定位抗原結合域遠離效應細胞表面上起作用，以實現適當的細胞/細胞接觸、抗原結合及活化。CAR通常包含結合域與跨膜域之間的一或多個鉸鏈域。鉸鏈域可衍生自天然、合成、半合成、或重組源。鉸鏈域可包括天然存在之免疫球蛋白鉸鏈區或改變免疫球蛋白鉸鏈區之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露之抗原結合系統可包含係來自、或衍生自（例如包含所有或片段）類免疫球蛋白鉸鏈域之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈域來自免疫球蛋白或衍生自免疫球蛋白。在一些實施例中，鉸鏈域係選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、或IgM、或其片段之鉸鏈。鉸鏈可衍生自天然來源或合成來源。適用於本文所述之CAR之鉸鏈域包括衍生自類型1膜蛋白質（諸如CD8α、CD4、CD28及CD7）之胞外區的鉸鏈區，其可係來自此等分子之野生型鉸鏈區，或可改變，例如截短CD28鉸鏈域。鉸鏈可衍生自天然來源或合成來源。在一些實施例中，本揭露之抗原結合系統可包含係來自、或衍生自（例如包含所有或片段）CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A（B細胞抗原受體複合物相關α鏈）、CD79B（B細胞抗原受體複合物相關β鏈）、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4–1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3–ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7–H3)、CD279 (PD–1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK–p46)、CD336 (NK–p44)、CD337 (NK–p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、LFA–1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP–10、ICAM–1、NKp80 (KLRF1)、IL–2Rβ、IL–2Rγ、IL–7Rα、LFA1–1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、a CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、或Toll配位體受體、或其片段或組合。
在實施例中，鉸鏈域包含CD8α鉸鏈區。在實施例中，本文所述之CAR包含來自CD8α之鉸鏈域，該CD8α具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 65 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 65))。在實施例中，來自CD8α之鉸鏈域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCCGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 66)之序列的核酸。
在實施例中，鉸鏈域包含截短之CD28鉸鏈區(CD28T)鉸鏈區，諸如揭示於國際專利申請案：2017年3月31日申請之PCT/US2017/025351，其以全文引用之方式併入本文中。在實施例中，本文所述之CAR包含CD28T鉸鏈域，其具有胺基酸序列，該胺基酸序列與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 67 (LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 67))。在實施例中，CD28T鉸鏈域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據CTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC (SEQ ID NO: 68)之序列的核酸。
此等鉸鏈域之多核苷酸及多肽序列係已知的。在一些實施例中，編碼鉸鏈域之多核苷酸包含與已知核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）同一之核苷酸序列。在一些實施例中，鉸鏈域之多肽序列包含與已知多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）同一之多肽序列。
一般而言，（例如抗原結合系統之）「跨膜域(transmembrane domain)」係指當在細胞表面或細胞膜存在於分子中時，具有存在於膜中之屬性的域（例如跨越一部分或所有細胞膜）。本揭露之抗原結合系統之共刺激域可進一步包含跨膜域及/或胞內信號傳導域。不需要跨膜域中之每一胺基酸存在於膜中。舉例而言，在一些實施例中，跨膜域特徵在於蛋白質之指定段或部分實質上位於膜中。可使用多種演算法分析胺基酸或核酸序列以預測蛋白質子細胞定位（例如跨膜定位）。程式psort (PSORT.org)及Prosite (prosite.expasy.org)係此類程式之例示性。
包含於本文所述之抗原結合系統中之跨膜域的類型不限於任何類型。在一些實施例中，選擇與結合域及/或胞內域天然相關之跨膜域。在一些情況下，跨膜域包含一或多個胺基酸之修飾（例如缺失、插入、及/或取代），例如以避免此類域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合，以最小化與受體複合物之其他成員的交互作用。
跨膜域可衍生自天然或合成來源。在來源係天然之情況下，域可衍生自任何膜結合或跨膜蛋白。例示性跨膜域可衍生自（例如可包含至少一跨膜域）T細胞受體之α、β、或ζ鏈、2B4、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD8α、CD8β、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、TNFSFR25、CD154、4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD276 (B7-H3)、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96 (Tactile)、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DAP-12、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)結合之配位體、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1; CD1-1a/CD18)、MHC第1型分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4)、SLAMF6 (NTB-A; Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。在一些實施例中，跨膜域可為合成（且可例如包含主要疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸）。在一些實施例中，苯丙胺酸之三聯體、色胺酸、及纈胺酸包含在合成跨膜域之各端處。在一些實施例中，跨膜域直接鏈接或連接至細胞質域。在一些實施例中，短寡肽或多肽連接子（例如在長度之2與10個胺基酸之間）可形成跨膜域與胞內域之間的連接。在一些實施例中，連接子係甘胺酸-絲胺酸雙聯體。
在實施例中，本文所述之CAR包含來自CD8α之TM域，其具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 69 (IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 69))。在實施例中，來自CD8α之TM域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTAtTGC (SEQ ID NO: 70)之序列的核酸。
在實施例中，本文所述之CAR包含來自CD28之TM域，其具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 71 (FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 71))。在實施例中，來自CD28之TM域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG (SEQ ID NO: 72)之序列的核酸。
本文所提供之跨膜域之多核苷酸及多肽序列係已知的。在一些實施例中，編碼跨膜域之多核苷酸包含與已知核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）同一之核苷酸序列。在一些實施例中，跨膜域之多肽序列包含與已知多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）同一之多肽序列。可選地，短間隔子可在CAR之任何或一些胞外、跨膜、及胞內域之間形成連接。
已知可在抗原結合至免疫細胞時轉導信號的胞內信號傳導域，其中任一者可包含於本揭露之抗原結合系統中。舉例而言，已知T細胞受體(TCR)之細胞質序列在TCR結合至抗原之後起始信號轉導（參見例如Brownlie et al., Nature Rev. Immunol. 13:257-269 (2013)）。
在一些實施例中，本文所涵蓋之CAR包含胞內信號傳導域。「胞內信號傳導域」係指CAR之部分，其參與將有效CAR結合至目標抗原之訊息轉導至免疫效應細胞內部以引發效應細胞功能，例如活化、細胞介素產生、增生、及細胞毒性活性，包括細胞毒性因子至結合CAR之目標細胞的釋放、或與胞外CAR域結合之抗原引發的其他細胞反應。在一些實施例中，信號傳導域及/或活化域包含基於免疫受體酪胺酸之活化域(ITAM)。含ITAM之細胞質信號傳導序列之實例包含衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d者（參見例如Love et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a002485 (2010); Smith-Garvin et al., Annu. Rev. Immunol. 27:591-619 (2009)）。在某些實施例中，合適的信號傳導域包含但不限於4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83結合之配體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、Ly108)、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1; CD1-1a/CD18)、MHC第1型分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4)、SLAMF6 (NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。
用語「效應功能(effector function)」係指細胞之特定功能。T細胞之效應功能，例如可係細胞溶解活性或包括細胞介素之分泌之幫助或活性。因此，用語「胞內信號傳導域」係指蛋白質之部分，其轉導效應功能信號且引導細胞以執行特定功能。雖然通常可採用整個胞內信號傳導域，但在許多情況下，不必使用整個域。在使用胞內信號傳導域之截短部分的程度，只要其轉導效應功能信號，則可使用此類截短部分代替整個域。用語胞內信號傳導域意欲包括足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導域之任何截短部分。
已知透過單獨TCR產生之信號不足於完全活化T細胞且亦可能需要二級或共刺激信號。因此，T細胞活化可說是藉由兩種不同類別的胞內信號傳導域介導：透過TCR（例如TCR/CD3複合物）起始抗原依賴性初級活化之初級信號傳導域及以抗原非依賴性方式作用之共刺激信號傳導域，以提供二級或共刺激信號。在一些實施例中，本文所設想之CAR包含含一或多個「共刺激信號傳導域」及「初級信號傳導域」之胞內信號傳導域。
可用於本揭露之含ITAM之初級信號傳導域之說明性實例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、DAP12、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d者。在一些實施例中，CAR包含CD3ζ初級信號傳導域及一或多個共刺激信號傳導域。胞內初級信號傳導及共刺激信號傳導域可以任何順序串聯連接至跨膜域之羧基端。在一個實施例中，CAR具有CD3ζ域，該CD3ζ域具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 73。LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 73)。在實施例中，CD3ζ域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：ttgAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCcTAtCAGCAaGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATtTAGGgCGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCcGAaATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCtTGTACAATGAAtTGCAGAAgGATAAGATGGCGGAGGCaTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAtCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAaGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 74)之序列的核酸。
本文所涵蓋之CAR包含一或多個共刺激信號傳導域以增強T細胞表現CAR受體之功效及擴增。如本文所用，用語「共刺激信號傳導域」或「共刺激域」係指共刺激分子之胞內信號傳導域。在一些實施例中，共刺激分子可包括DAP-10、DAP-12、CD27、CD28、CD137(4–IBB)、OX40 (CD134)、CD30、CD40、PD–I、ICOS (CD278)、CTLA4、LFA–1、CD2、CD7、LIGHT、TRIM、LCK3、SLAM、DAPIO、LAG3、HVEM、B7-H3、NKD2C、GITR、CD5、ICAM-l、CDl la、Lck、TNFR-I、TNFR-II、FasR、NKG2C、及B7-H3、及CD83。
在實施例中，CAR包含4–IBB共刺激域，其具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 75。RGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE (SEQ ID NO: 75)。在實施例中，4–IBB共刺激域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據下列之序列的核酸，其可由根據下列之核酸序列編碼：AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAA (SEQ ID NO: 76)。
在實施例中，CAR包含CD28共刺激域，其具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 77。RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 77)。在實施例中，CD28共刺激域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據下列之序列的核酸，其可由根據下列之核酸序列編碼：AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 78)。
本文所述之經工程改造之CAR亦可包含在scFv或抗原結合域之N端處之N端信號肽或標籤。在一個實施例中，可使用異源信號肽。可將抗原結合域或scFV融合至前導或信號肽，其將初生蛋白質引導至內質網且隨後轉位至細胞表面。應理解的是，一旦含有信號肽之多肽在細胞表面表現，信號肽通常在多肽於內質網中處理並轉位至細胞表面之期間被蛋白裂解移除。因此，諸如本文所描述之CAR構築體之多肽作為缺乏信號肽之成熟蛋白通常在細胞表面處表現，而多肽之前驅物形式包括信號肽。可使用所屬技術領域中已知之任何合適的信號序列。類似地，亦可使用所屬技術領域中已知之任何已知標籤序列。在一實施例中，信號序列係CSF2RA信號序列。在實施例中，本文所述之CAR包含CSF2RA信號序列，其具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）；MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 79)、MEWTWVFLFLLSVTAGVHS (SEQ ID NO: 80)、或MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 81)。
CAR之組分可使用生物技術用於等效組分之常規技術交換或「對換(swapped)」。為僅提供幾個非限制性及部分實例，本揭露之CAR可包含如本文所提供之結合域與本文所提供之鉸鏈及本文所提供之共刺激域之組合。在某些實例中，本揭露之CAR可包含如本文所提供之前導序列連同如本文所提供之結合域與本文所提供之鉸鏈及本文所提供之s共刺激域之組合。
本揭露包含接合物，其中本揭露之抗體與治療劑或可偵測部分相關。在各種實施例中，治療劑為如本文所提供之抗癌劑。在某些實施例中，提供之接合物包含一或多個可偵測部分，亦即，以一或多個此類部分「標記」。在一些此類實施例中，本揭露之接合物可用於診斷或成像應用中，例如診斷或成像癌症。各種可偵測部分中之任一者可用於本文所述之標記之抗體接合物中。適合的可偵測部分包含但不限於：各種配位體、放射性核酸；螢光染料；化學發光劑（諸如例如吖啶酯、穩定之二氧環丁烷、及類似物）；生物發光劑；光譜可解析無機螢光半導體奈米晶體（即，量子點）；微粒子；金屬奈米粒子（例如金、銀、銅、鉑等）；奈米簇；順磁性金屬離子；酶類；比色標籤（諸如例如染料、膠態金、及類似物）；生物素；地谷新配質(dioxigenin)；不完全抗原；及抗血清或單株抗體可用之蛋白質。
本揭露包含編碼本文所提供之GPC3結合域之核酸。本揭露包含編碼本文所提供之抗體之核酸，其包含但不限於編碼GPC3結合域之核酸。本揭露包含編碼本文所提供之抗原結合系統之核酸，其包含但不限於編碼GPC3結合嵌合抗原受體之核酸。SEQ ID NO: 4之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 3及5至13中之各者之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 15之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 12及16至24中之各者之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 26之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 25之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 28之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 27之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 30之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 29之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 32之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 31之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 34之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 33之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 36之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 35之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 38之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 37之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 40之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 39之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 42之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 41之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 44之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 43之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 46之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 45之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 48之核酸序列包含及提供對應於且編碼SEQ ID NO: 47之例示性核酸序列。SEQ ID NO: 50之核酸序列包含並提供對應於且編碼SEQ ID NO: 49之例示性核酸序列。
在本文所述之一個實施例中，GPC3結合CAR構築體具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 121。QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIKGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 121)。在實施例中，GPC3結合CAR係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGCTATACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCAGCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGTGACCATGACTCGTGACACCTCCACCTCCACCGTGTATATGGAGCTGAGCTCTTTAAGGTCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGGAAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACATTAGTGACCGTCAGCTCCGGCTCCACAAGCGGATCCGGCAAACCCGGTAGCGGCGAAGGCAGCACCAAGGGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCTGTGTCTTTAGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGAGCTTATTAAATAGCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTCATCTACTGGGCTTCCATCAGAGAGAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACTTTAACCATCTCCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCCGTGTATTACTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAAggGtccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAgcggcggggggcgcagTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 83)之序列的核酸。
在本文所述之一個實施例中，GPC3結合CAR構築體具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 84。QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIKGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 84)。在實施例中，GPC3結合CAR係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTCTCATGCAAGACCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGCCAAGGTCTGGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCTATTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGTGACCATGACAGCCGACACCTCCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCTTACGTAGCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCTCGTGGCAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACTCTGGTGACCGTGTCCTCCGGAAGCACCTCCGGAAGCGGCAAGCCCGGTAGCGGCGAAGGATCCACCAAGGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGATTCTTTAGCCGTCAGCCTTGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCTTATTAAACTCCGGCACTCGAAAAAACTACCTCGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGTCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCATTCGTGAGAGCGGAGTGCCCGACAGATTTAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGATTTCACTTTAACCATCAGCTCTTTACAAGCTGAGGATGTGGCCGTGTATTACTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATTAAGggGtccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAgcggcggggggcgcagTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO:85)之序列的核酸。
在本文所述之一個實施例中，GPC3結合CAR構築體具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 86。QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIKGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 86)。在實施例中，GPC3結合CAR係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CAAGTTCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTCAAGAAGCCCGGAGCCAGCGTGAAAGTCTCATGTAAAACCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGTCGTGTGACCATGACAGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCTCTGCGTTCTGAGGACACAGCCGTTTACTACTGCGCCAGAGGCAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACATTAGTGACCGTGTCCTCCGGATCCACATCCGGCAGCGGAAAGCCCGGTAGCGGCGAGGGCAGCACCAAAGGAGACATCGTCATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCCGTGTCTTTAGGCGAAAGAGTGACCATGAACTGCAAGTCCAGCCAGTCTTTACTGAATTCCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCATTCGAGAATCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGACTTTACTTTAACCATCAGCAGCGTGCAAGCTGAGGACGTGGCTGTGTACTATTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAGggGtccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAgcggcggggggcgcagTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 87)之序列的核酸。
在本文所述之一個實施例中，GPC3結合CAR構築體具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 88。QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGEIYPGSGNTYYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIKGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 88)。在實施例中，GPC3結合CAR係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CAAGTTCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAGGTGTCTTGTAAGACCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCGAGATCTATCCCGGCAGCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGCCACTTTAACCGCTGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGTTCTCCTCTTTAAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCTCGTGGCAACGACTATGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGTCAAGGAACATTAGTGACAGTGAGCAGCGGATCCACCAGCGGATCCGGCAAGCCCGGTAGCGGAGAAGGCAGCACCAAGGGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCTGTGAGCCTTGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGTCTTTACTGAACAGCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCATTCGTGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGAACCGACTTTACTTTAACCATCTCCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCTGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAAATCAAGggGtccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAgcggcggggggcgcagTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 89)之序列的核酸。
在本文所述之一個實施例中，GPC3結合CAR構築體具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 90。VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGEIYPGSGNTYYAQKFQGRATLTADTSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIKGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 90)。在實施例中，GPC3結合CAR係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CAAGTTCAGCTGGTCCAGAGCGGCGCTGAAGTGAAGAAGCCCGGCGCTAGCGTCAAAGTCTCATGCAAAACCTCCGGCTACACCTTTACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGTCAAGGTCTGGAGTGGATCGGCGAGATCTACCCCGGCAGCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGACGTGCCACTTTAACCGCTGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAAGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGTGGCAACGATTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGACAAGGAACATTAGTGACCGTGTCCAGCGGCAGCACAAGCGGAAGCGGCAAGCCCGGTAGCGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCCGTGTCTTTAGGAGAGAGAGTGACCATGAACTGCAAGAGCAGCCAGTCTTTACTGAACAGCGGCACCAGAAAGAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCATTCGTGAGAGCGGAGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACTTTAACCATCAGCAGCGTGCAAGCTGAGGATGTGGCCGTGTATTACTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTTGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAAggGtccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAgcggcggggggcgcagTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 91)之序列的核酸。
經工程改造之T細胞受體(TCR)及嵌合抗原受體(CAR)療法兩者集束T細胞之特異性及免疫治療效果，用於治療各種惡性病。一些研究建議，此等療法可能容易受到由TGF-β抑制T細胞導致的TME中之抑制因子之影響（Bendle et al., J Immunol, 191:3232–3239 (2013)及Vong et al., Blood, 130:1791 (2017)）。本揭露涵蓋將本文所述之DN TGF-β受體與TCR或CAR療法組合使用，作為在TGF-β抑制存在下維持或在一些情況下恢復TCR及/或CAR擴增之方式。
嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法提供對腫瘤進展之另一治療方法。臨床上，試驗主持人已證實CAR擴增及持續性與治療功效相關。不受任何理論束縛，咸信在TME中所發現之TGF–β抑制之T細胞群可能限制對CAR療法無反應之患者中之CAR T細胞擴增及持續性。咸信TME中之所得抑制細胞介素限制CAR細胞功能及擴增。因此，TGF-β可限制治療工程改造T細胞之功效。
將如本文中所述之任何CAR構築體或TCR與DN TGF-β受體組合可恢復、維持或增強受到TGF-β抑制挑戰的CAR T療法之治療效果。因此，在本文所述之一個實施例中，DN TGF–β受體（例如DN TGF–βRI或RII）在T細胞或NK細胞中與GPC3結合CAR共表現，如本文所述。在一些實施例中，DN TGF–β受體（例如DN TGF–βRI或RII）在T細胞或NK細胞中與GPC3結合CAR共表現，如本文所述。在一些實施例中，DN TGF–β受體（例如DN TGF–βRI或RII）在T細胞或NK細胞中與GPC3結合TCR共表現。DN TGF–β受體係描述於國際專利申請案第PCT/US2020/070157號中，其全文特此以引用方式併入本文中。
經工程改造TGF-β受體可包含N端處之N末端信號肽，例如在DN TGF-βRI之胞外配位體結合域之N端處。在一個實施例中，可使用異源信號肽。DN TGF–βRI之胞外域可融合至前導或信號肽，其將初生蛋白質引導至內質網且隨後轉位至細胞表面。應理解的是，一旦含有信號肽之多肽在細胞表面表現，信號肽通常在多肽於內質網中處理並轉位至細胞表面之期間被蛋白裂解移除。因此，諸如DN TGF-βRI之多肽作為缺乏信號肽之成熟蛋白通常在細胞表面處表現，而多肽之前驅物形式包括信號肽。可使用任何合適的信號序列。在本文所述之一個實施例中，DN TGF–βRI包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 92或其部分。MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATA (SEQ ID NO: 92)。
在本揭露中，信號肽作為融合蛋白接合至DN TGF-βRI之胞外抗原結合域之N端。在一個實施例中，DN TGF–βRI包含與下列具有至少75%序列同一性之胞外配體結合域（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：野生型TGF–βRI；及在胞外域TGF–βRI之N端的信號肽，其與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 93之胺基酸序列。MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATALQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVEL (SEQ ID NO: 93)。
經工程改造之DN TGF-βRII構築體亦可包含TGF-βRII之胞外配位體結合域之N端處之N末端信號肽。在一個實施例中，可使用異源信號肽。DN TGF–βRII之胞外域可融合至前導或信號肽，其將初生蛋白質引導至內質網且隨後轉位至細胞表面。應理解的是，一旦含有信號肽之多肽在細胞表面表現，信號肽通常在多肽於內質網中處理並轉位至細胞表面之期間被蛋白裂解移除。因此，諸如DN TGF-βRII之多肽作為缺乏信號肽之成熟蛋白通常在細胞表面處發現，而多肽之前驅物形式包括信號肽。可使用任何合適的信號序列。在本文所述之一個實施例中，本文所述之DN TGF–βRII構築體包含與下列具有至少75%序列同一性之信號序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 94之胺基酸序列或其部分。MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS (SEQ ID NO: 94)。在另一實施例中，信號序列係衍生自群落刺激因子2受體α次單元(CSF2Rα)，其包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 79或其部分。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 79)。本文所述之信號序列亦可選地與任何合適的蛋白質標籤一起使用，包括但不限於：V5標籤、myc標籤、HA標籤、Spot標籤、NE標籤。在本文所述之一個實施例中，信號序列及標籤包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 95。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 95)。在實施例中，信號序列及標籤可由與ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATTCCTGAACAGAAGCTGATAAGTGAGGAGGACTTG (SEQ ID NO: 96)具有至少75%序列同一性核酸序列編碼（例如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）。
應理解，使用此信號肽係例示性的。任何合適的信號肽，如所屬技術領域中熟知，可應用於DN TGF-βRI或RII，以提供免疫細胞中之細胞表面表現。可用的信號肽可衍生自T細胞NK細胞或其前驅細胞中天然表現之細胞表面蛋白質，包括本文中所揭示之多肽之任何信號肽。因此，任何合適的信號肽可用以引導DN TGF-βRI RII以在T細胞或NK細胞之細胞表面處表現。
在實施例中，DN TGF–βRI包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATALQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVELAAVIAGPVCFVCISLMLMVYIRVNRQ (SEQ ID NO: 97)。
在一個實施例中，DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 98之胺基酸序列：MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQ (SEQ ID NO: 98)。
在一實施例中，DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 99之胺基酸序列。TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD (SEQ ID NO: 99)。
在本文所述之一個實施例中，DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：野生型TGF–βRII，如SEQ ID NO: 100之胺基酸序列中所示。TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCY (SEQ ID NO: 100)。
在本文所述之一個實施例中，DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 101之胺基酸序列。TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVIL (SEQ ID NO: 101)。
在本文所述之一個實施例中，DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：如SEQ ID NO: 102之胺基酸序列中所示。TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTCPTISILSFFSVALLVIL (SEQ ID NO: 102)。
T在本文所述之一個實施例中，DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 103。ACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 103)。
在本文所述之一個實施例中，DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性，例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 104之胺基酸序列。TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 104)。
在本文所述之一個實施例中，DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 105之胺基酸序列。TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 105)。
在一實施例中，經工程改造之DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 106之胺基酸序列。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD (SEQ ID NO: 106)。
在一實施例中，經工程改造之DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 107。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEQKLISEEDLTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD (SEQ ID NO: 107)。
在一實施例中，經工程改造之DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID: 108。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 108)。
在一實施例中，經工程改造之DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID: 109。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEQKLISEEDLTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 109)。
在一實施例中，經工程改造之DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID: 110。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 110)。
在一實施例中，經工程改造之DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID: 111。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEQKLISEEDLTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 111)。
在一實施例中，經工程改造之DN TGF–βRII包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID: 112。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 112)。
本揭露設想，編碼本文所揭示之GPC3 CAR及TCR之多核苷酸的表現及包含經工程改造DN TGF–β受體之多核苷酸與GPC3結合CAR、TCR、及其片段、包含其之細胞及組成物、及表現多核苷酸之載體的共表現。
在本文所述之一個實施例中，與DN TGF-β受體連接之GPC3結合CAR具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 113。QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIKGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCY (SEQ ID NO: 113)。在實施例中，GPC3結合CAR係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CAAGTCCAACTGGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTCAAGAAGCCCGGAGCCAGCGTGAAAGTCTCATGTAAAACCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGTCGTGTGACCATGACAGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCTCTGCGTTCTGAGGACACAGCCGTTTACTACTGCGCCAGAGGCAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACATTAGTGACCGTGTCCTCCGGATCCACATCCGGCAGCGGAAAGCCCGGTAGCGGCGAGGGCAGCACCAAAGGAGACATCGTCATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCCGTGTCTTTAGGCGAAAGAGTGACCATGAACTGCAAGTCCAGCCAGTCTTTACTGAATTCCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCATTCGAGAATCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGACTTTACTTTAACCATCAGCAGCGTGCAAGCTGAGGACGTGGCTGTGTACTATTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAGGGGTCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCCGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTATTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAATTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCCTATCAGCAAGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATTTAGGGCGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCCGAAATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCTTGTACAATGAATTGCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCATACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTATCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCCCTGCCCCCTCGCGGCTCTGGAGAGGGCAGAGGCTCTCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCAGGCCCCATGGGAAGAGGTTTACTGAGAGGACTGTGGCCTTTACACATCGTGCTGTGGACTCGTATCGCCAGCACCATCCCCCCCCATGTCCAAAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAATGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACTTGTGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACTTTAGAGACAGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATTTTAGAAGATGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGTTCTTGTTCGTCTGATGAGTGCAACGATAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGATTTACTGCTGGTGATCTTCCAAGTTACCGGCATTTCTTTACTGCCTCCGTTGGGCGTGGCTATCAGCGTGATCATCATCTTCTACTGCTAT (SEQ ID NO: 114)之序列的核酸。
在本文所述之一個實施例中，與DN TGF-β受體連接之GPC3結合CAR具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 115。QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIKGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCY (SEQ ID NO: 115)。在實施例中，GPC3結合CAR係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CAAGTCCAACTGGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTCAAGAAGCCCGGAGCCAGCGTGAAAGTCTCATGTAAAACCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGTCGTGTGACCATGACAGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCTCTGCGTTCTGAGGACACAGCCGTTTACTACTGCGCCAGAGGCAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACATTAGTGACCGTGTCCTCCGGATCCACATCCGGCAGCGGAAAGCCCGGTAGCGGCGAGGGCAGCACCAAAGGAGACATCGTCATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCCGTGTCTTTAGGCGAAAGAGTGACCATGAACTGCAAGTCCAGCCAGTCTTTACTGAATTCCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCATTCGAGAATCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGACTTTACTTTAACCATCAGCAGCGTGCAAGCTGAGGACGTGGCTGTGTACTATTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAGGGGTCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCCGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTATTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAATTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCCTATCAGCAAGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATTTAGGGCGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCCGAAATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCTTGTACAATGAATTGCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCATACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTATCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCCCTGCCCCCTCGCGGCTCTGGAGAGGGCAGAGGCTCTCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCAGGCCCCATGGGAAGAGGTTTACTGAGAGGACTGTGGCCTTTACACATCGTGCTGTGGACTCGTATCGCCAGCACCATCCCCCCCCATGTCCAAAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAATGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACTTGTGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACTTTAGAGACAGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATTTTAGAAGATGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGTTCTTGTTCGTCTGATGAGTGCAACGATAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGATTTACTGCTGGTGATCTTCCAAGTTACCGGCATTTCTTTACTGCCTCCGTTGGGCGTGGCTATCAGCGTGATCATCATCTTCTACTGCTAT (SEQ ID NO: 116)之序列的核酸。
在一個實施例中，與DN TGF-β受體連接之GPC3結合CAR具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 122。QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPGSGNTYYAQKFQGRVTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNDYDAWFVYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYSLYTFGQGTKLEIKGSLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCY (SEQ ID NO: 122)。在實施例中，GPC3結合CAR係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CAAGTCCAACTGGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTCAAGAAGCCCGGAGCCAGCGTGAAAGTCTCATGTAAAACCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGACAAGCCCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGAGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCTACTACGCCCAGAAGTTCCAAGGTCGTGTGACCATGACAGCCGACACCAGCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCTCTGCGTTCTGAGGACACAGCCGTTTACTACTGCGCCAGAGGCAACGACTACGACGCTTGGTTCGTGTACTGGGGCCAAGGAACATTAGTGACCGTGTCCTCCGGATCCACATCCGGCAGCGGAAAGCCCGGTAGCGGCGAGGGCAGCACCAAAGGAGACATCGTCATGACCCAGAGCCCCGATTCTTTAGCCGTGTCTTTAGGCGAAAGAGTGACCATGAACTGCAAGTCCAGCCAGTCTTTACTGAATTCCGGCACTCGAAAAAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCTAGCATTCGAGAATCCGGCGTGCCCGATCGCTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGACTTTACTTTAACCATCAGCAGCGTGCAAGCTGAGGACGTGGCTGTGTACTATTGCAAGCAGTCCTACTCTTTATACACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAGGGGTCCCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTCCGATCAAAAAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAAGGGCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGCGGCTCTGGAGAGGGCAGAGGCTCTCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCAGGCCCCATGGGAAGAGGTTTACTGAGAGGACTGTGGCCTTTACACATCGTGCTGTGGACTCGTATCGCCAGCACCATCCCCCCCCATGTCCAAAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAATGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACTTGTGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACTTTAGAGACAGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATTTTAGAAGATGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGTTCTTGTTCGTCTGATGAGTGCAACGATAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGATTTACTGCTGGTGATCTTCCAAGTTACCGGCATTTCTTTACTGCCTCCGTTGGGCGTGGCTATCAGCGTGATCATCATCTTCTACTGCTAT (SEQ ID NO: 117)之序列的核酸。
除非相反地規定，否則「多肽」、「多肽片段」、「肽」、及「蛋白質」係根據習知含義，即作為胺基酸序列。多肽不限於特定長度，例如其可包含全長蛋白質序列或全長蛋白質之片段，且可包括多肽之轉譯後修飾，例如醣基化、乙醯基化、磷酸化及類似者，以及所屬技術領域中天然存在及非天然存在之其他修飾。在各種實施例中，本文所設想之多肽包含在蛋白質之N端處之信號（或前導）序列，其共轉譯或轉譯後地引導蛋白質之轉移。
多肽包括「多肽變體」。多肽變體可與天然存在之多肽有一或多個取代、缺失、添加、及/或插入之不同。此類變體可係天然存在或可例如藉由修飾上述多肽序列中之一或多者而合成產生。例如，在一些實施例中，可為所欲的是改善經工程改造DN TGF–β受體及經工程改造之GPC3結合CAR及TCR的結合親和力及/或其他生物性質。藉由引入一或多個取代、缺失、添加及/或插入受體。較佳地，本揭露之多肽包括與其具有至少約50%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%、或99%胺基酸同一性之多肽。本揭露之多肽包括與本文所述之參考序列（參見例如序列表）中之任一者具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性之變體，一般而言變體維持參考序列之至少一種生物活性。多肽包括「多肽片段」。多肽片段係指多肽，其可係單體或多聚體，其具有胺基端缺失、羧基端缺失、及/或天然存在或重組產生之多肽之內部缺失或取代。在某些實施例中，多肽片段可包含至少5至約500個胺基酸長之胺基酸鏈。應瞭解，在某些實施例中，片段係至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、或450個胺基酸長。
多肽亦可框內融合或接合至連接子或其他序列，以便於合成、純化或識別多肽（例如聚-His），或增強多肽至固體支撐物之結合。如上所述，本揭露之多肽可以各種方式改變，包括胺基酸取代、缺失、截短、及插入。此類操控之方法通常係所屬技術領域中已知的。例如，參考多肽之胺基酸序列變體可藉由DNA中之突變製備。用於突變誘發及核苷酸序列改變之方法係所屬技術領域中熟知的。參見例如Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488–492)、Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367–382)、美國專利第4,873,192號、Watson, J. D. et al., ( Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)及其中所引用之參考文獻。對於不影響所關注蛋白質之生物活性之適當胺基酸取代的指南可在Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)之模型中發現。
在某些實施例中，變體將含有保守性取代。「保守性取代」係其中用一個胺基酸取代具有類似性質之另一胺基酸者，使得在肽化學技術領域中具有通常知識者將預期多肽之二級結構及疏水性(hydropathic)本質實質上不變。可在本揭露之多核苷酸及多肽之結構中進行修飾，且仍獲得編碼具有所欲特徵之變體或或衍生性多肽之功能性分子。
多肽變體進一步包括醣基化形式、與其他分子之聚集接合物、及與不相關化學部份（例如聚乙二醇化分子）之共價接合物。如所屬技術領域中所已知，共價變體可藉由將官能性連接至在胺基酸鏈中或在N端或C端殘基處發現之基團來製備。變體亦包括等位基因變體、物種變體、及突變蛋白質(mutein)。不影響蛋白質功能活性的區域之截短或缺失亦係變體。
當二或更多個多肽之表現係所欲者，可藉由IRES序列來分離編碼其之多核苷酸序列。在另一實施例中，二或更多個多肽可表現為包含一或多個自裂解多肽序列（諸如T2A多肽）之融合蛋白。在一個實施例中，自裂解多肽序列具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 118。EGRGSLLTCGDVEENPGP (EQ ID NO: 118)。在實施例中，自裂解多肽係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：GAGGGCAGAGGCTCTCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCAGGCCCC (SEQ ID NO: 119)之序列的核酸。在其他實施例中，二或更多種多肽自不同啟動子表現，且可在二或更多個載體中。在一些實施例中，GPC3結合CAR或TCR係在與經工程改造DN TGF–β受體相同的載體中編碼，且係可操作地連接至與經工程改造DN TGF–β受體相同的啟動子，其中序列係由IRES序列分開。在一些實施例中，GPC3結合CAR或TCR係在與經工程改造DN TGF–β受體相同的載體中編碼，係可操作地連接至與經工程改造DN TGF–β受體之啟動子不同的啟動子。在某些實施例中，GPC3結合CAR或TCR係在亦已經工程改造以表現經工程改造之膜結合IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體的細胞上表現，諸如在2021年3月11日申請之美國臨時專利第63/159,610號中所揭示，其全文以引用方式具體併入本文中。在一些實施例中，GPC3結合CAR或TCR係在與經工程改造之膜結合IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體相同的載體中編碼，且係可操作地連接至與經工程改造之膜結合IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體相同的啟動子，其中序列係由IRES序列或可裂解連接子分開。在一些實施例中，GPC3結合CAR或TCR係在與經工程改造之膜結合IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體相同的載體中編碼，係可操作地連接至與經工程改造之膜結合IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體之啟動子不同的啟動子。在一些實施例中，GPC3結合CAR係在與經工程改造之膜結合IL-15-IL-15Rα壽司域嵌合受體不同的載體中編碼。
本揭露之多肽包括融合多肽。在一些實施例中，提供編碼融合多肽之融合多肽及多核苷酸。融合多肽及融合蛋白係指具有至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、或十個或更多個多肽區段之多肽。融合多肽一般將C端連接至N端，儘管其亦可將C端連接至C端、N端連接至N端、或N端連接至C端。融合蛋白之多肽可呈任何順序或指定順序。融合多肽或融合蛋白亦可包括保守修飾之變異體、多型性變異體、等位基因、突變體、子序列、及種間同源物，只要融合多肽之所欲轉錄活性得以保存。融合多肽可藉由化學合成方法或藉由兩個部分之間的化學連接產生，或通常可使用其他常見技術製備。包含融合多肽之連接之DNA序列可操作地連接至如本文其他地方所論述之適合的轉錄或轉譯控制元件。
在一個實施例中，融合夥伴包含有助於以高於天然重組蛋白質之產量表現蛋白質（表現增強子）的序列。可選擇其他融合夥伴以增加蛋白質之溶解度、或使蛋白質靶向所欲胞內區室、或促進融合蛋白通過細胞膜的運輸。
融合多肽可進一步包含在本文所述之多肽域之各者之間的多肽切割信號。此外，多肽位點可放入任何連接子肽序列中。例示性多肽切割信號包括多肽切割識別位點，諸如蛋白酶切割位點、核酸酶切割位點（例如稀有限制酶識別位點、自裂解核酶識別位點）、及自裂解病毒寡肽（參見deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616–26）。
合適的蛋白酶切割位點及自裂解肽係所屬技術領域中具有通常知識者已知的（參見例如Ryan et al., 1997. J Gener. Viral.78, 699–722; Scymczak et al.(2004) Nature Biotech.5, 589–594）。例示性蛋白酶裂解位點包括但不限於以下之裂解位點：馬鈴薯Y病毒(potyvirus) Nia蛋白酶（例如，煙草蝕刻病毒蛋白酶）、馬鈴薯Y病毒HC蛋白酶、馬鈴薯Y病毒Pl (P35)蛋白酶、byovirus Nia蛋白酶、byovirus RNA-2編碼之蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、腸病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、picoma 3C蛋白酶、豇豆花葉病毒(comovirus) 24K蛋白酶、線蟲傳多面體病毒(nepovirus) 24K蛋白酶、類RTSV（水稻東格魯球形病毒）3C蛋白酶、類PYVF（歐洲防風黃點病毒）3C蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa、及腸激酶。由於其高裂解嚴格性，可使用TEV（煙草蝕刻病毒）蛋白酶裂解位點。在其他實施例中，自裂解肽可包括自馬鈴薯Y病毒及心病毒2A肽、FMDV（口蹄疫病毒）、馬鼻炎A病毒、明脈扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)、及豬鐵士古病毒獲得之多肽序列。在其他實施例中，自裂解多肽位點包含2A或2A樣位點、序列、或域(Donnelly et al., 2001. J Gen. Viral. 82:1027–1041)。
一般而言，應理解，任何適當病毒載體可用於轉導本文所述之經工程改造之構築體。在本文中所描述之一個實施例中，用反轉錄病毒載體，例如慢病毒載體轉導細胞（例如T細胞或NK細胞）。如本文中所使用，用語「反轉錄病毒(retrovirus)」係指將其基因體RNA反轉錄成直鏈雙股DNA副本隨後將其基因體RNA共價整合至宿主基因體之RNA病毒。適用於一些實施例之說明性反轉錄病毒包括但不限於：莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈威(Harvey)鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳房腫瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗蘭德(Friend)鼠白血病病毒、鼠幹細胞病毒(MSCV)及勞氏肉瘤病毒(RSV)及慢病毒。
如本文所用，用語「慢病毒(lentivirus)」係指複合物反轉錄病毒之群（或屬）。說明性慢病毒包括但不限於：HIV（人類免疫缺陷病毒；包括HIV類型1及HIV類型2）；梅迪-威司奈(visna-maedi)病毒(VMV)；山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)；馬傳染性貧血病毒(EIAV)；貓免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；及猴免疫缺陷病毒(SIV)。
用語「載體(vector)」在本文中係指能夠轉移或運輸另一核酸分子之核酸分子。轉移之核酸通常連接至例如插入載體核酸分子中。載體可包括引導細胞中之自主複製之序列，或可包括足以允許整合至宿主細胞DNA之序列。可用載體包括例如質體（例如DNA質體或RNA質體）、轉位子、黏接質體、細菌人工染色體、及病毒載體。可用病毒載體包括例如複製缺陷反轉錄病毒及慢病毒。
如所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見，用語「病毒載體」係廣泛用以指包括一般促進核酸分子之轉移或整合至細胞基因體中的病毒衍生核酸元件之核酸分子（例如轉移質體），或指介導核酸轉移之病毒顆粒。除了（多種）核酸外，病毒顆粒一般將包括各種病毒組分，且有時亦包括宿主細胞組分。
用語病毒載體可指能夠將核酸轉移至細胞中之病毒或病毒顆粒、或經轉移之核酸本身。病毒載體及轉移質體含有主要衍生自病毒之結構及/或功能基因元件。用語「反轉錄病毒載體(retroviral vector)」係指含有主要衍生自反轉錄病毒之結構及功能基因元件或其部分之病毒載體或質體。用語「慢病毒載體(lentiviral vector)」係指含有主要衍生自慢病毒之結構及功能基因元件或其部分（包括LTR）之病毒載體或質體。用語「混合載體(hybrid vector)」係指含有反轉錄病毒（例如慢病毒）序列及非反轉錄病毒序列之載體、LTR或其他核酸。在一個實施例中，混合載體係指包含用於反轉錄、複製、整合、及/或包裝之反轉錄病毒（例如慢病毒）序列的載體或轉移質體。
在一些實施例中，用語「慢病毒載體」、「慢病毒表現載體(lentiviral expression vector)」可用以指慢病毒轉移質體及/或傳染性慢病毒顆粒。在本文中提及元件（諸如選殖位點、啟動子、調節元件、異源核酸等）之情況下，應理解此等元件之序列以RNA形式存在於本揭露之慢病毒顆粒中，且以DNA形式存在於本揭露之DNA質體中。在本文所述之一個實施例中，表現載體係慢病毒表現載體。
在前病毒之各端處係稱作「長末端重複序列(long terminal repeat)」或「LTR」之結構。用語「長末端重複序列(LTR)」係指位於反轉錄病毒DNA之端部處之鹼基對之域，該等域在其天然序列背景下係直接重複序列且含有U3、R、及U5區。LTR通常提供對反轉錄病毒基因之表現（例如基因轉錄之促進、起始及多腺苷化）及病毒複製之基本功能。該LTR含有許多調節信號，包括轉錄控制元件、多腺苷化信號、及用於病毒基因體之複製及整合所需之序列。病毒LTR分成稱為U3、R、及U5之三個區。U3區含有增強子及啟動子元件。U5區係引子結合位點與R區之間之序列且含有多腺苷化序列。R（重複）區係側接U3及U5區。LTR由U3、R、及U5區構成，且在病毒基因體之5'及3'端二者處出現。相鄰於5' LTR係基因體（tRNA引子結合位點）之反轉錄及病毒RNA有效包裝成顆粒（Psi位點）所必需之序列。
如本文中所使用，用語「包裝信號(packaging signal)」或「包裝序列(packaging sequence)」係指位於反轉錄病毒基因體內之序列，需要該等序列將病毒RNA插入病毒殼體或顆粒中，參見例如Clever et al., 1995. J of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101–2109。數種反轉錄病毒載體使用病毒基因體殼體化(encapsidation)所需之最小包裝信號（亦稱為psi ['P]序列）。因此，如本文中所使用，用語「包裝序列」、「包裝信號」、「psi」、及符號「P」係用以指稱在病毒顆粒形成期間反轉錄病毒RNA股之殼體化所需之非編碼序列。
在各種實施例中，載體包含經修飾之5' LTR及/或3' LTR。LTR中之任一者或兩者可包含一或多個修飾，包括但不限於一或多個去除、插入或取代。通常對3' LTR進行修飾以藉由使病毒複製缺陷來改善慢病毒或反轉錄病毒系統之安全性。如本文中所使用，用語「複製缺陷(replication–defective)」係指不能完全有效複製使得未產生傳染性病毒粒子之病毒（例如複製缺陷慢病毒後代）。用語「複製勝任(replication–competent)」係指能夠複製使得病毒之病毒複製能夠產生傳染性病毒粒子之野生型病毒或突變型病毒（例如複製勝任慢病毒後代）。
「自失活(self–inactivating)」(SIN)載體係指複製缺陷載體，例如反轉錄病毒或慢病毒載體，其中右(3') LTR增強子-啟動子區（稱作U3區）已經修飾（例如藉由去除或取代）以防止病毒轉錄超過第一輪病毒複製。此係因為右(3') LTR U3區係在病毒複製期間用作左(5') LTR U3區之模板，且因此，不可在無U3增強子-啟動子下進行病毒轉錄。在本揭露之另一實施例中，3'LTR經修飾使得U5區例如經理想poly(A)序列置換。應注意，在本文中亦涵蓋對LTR之修飾，諸如對3'LTR、5'LTR、或3'及5'LTR二者之修飾。
額外安全性增強係藉由將5'LTR之U3區用異源啟動子置換以在病毒顆粒產生期間驅動病毒基因體之轉錄來提供。可使用之異源啟動子之實例包括例如病毒性猴病毒40 (SV40)（例如早期或晚期）、巨細胞病毒(CMV)（例如立即早期）、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、及單純疱疹病毒(HSV)（胸苷激酶）啟動子。典型啟動子能夠以Tat非依賴性方式驅動高水平轉錄。此置換降低重組以產生複製勝任病毒之概率，因為病毒產生系統中不存在完整U3序列。在某些實施例中，異源啟動子具有控制病毒基因體轉錄之方式的額外優勢。舉例而言，異源啟動子可係可誘導，使得病毒基因體之所有或部分之轉錄僅在誘導因子存在時發生。誘導因子包括但不限於一或多種化學化合物或生理條件，諸如培養宿主細胞之溫度或pH。
在一些實施例中，病毒載體包含TAR元件。用語「TAR」係指位於慢病毒（例如HIV）LTR之R區中之「反式活化反應(trans–activation response)」基因元件。此元件與慢病毒反式活化子(tat)基因元件交互作用以增強病毒複製。
「R區(R region)」係指在封端基團開始（即轉錄開始）時開始且在poly A束開始之前立即結束之反轉錄病毒LTR內之區。R區亦定義為側接U3及U5區。R區在反轉錄期間於許可初生DNA自基因體之一端轉移至另一端中起作用。
如本文中所使用，用語「FLAP元件(FLAP element)」係指核酸，其序列包括反轉錄病毒（例如HIV-I或HIV-2）之中心多嘌呤束及中心終止序列（cPPT及CTS）。適合的FLAP元件描述於美國專利第6,682,907號及在Zennou, et al., 2000, Cell, 101: 173中。在HIV-I反轉錄期間，正股DNA在中心多嘌呤束(cPPT)處之中心啟動及在中心終止序列(CTS)處之中心終止導致三股DNA結構：HIV-I中心DNA瓣之形成。儘管不希望受任何理論束縛，但DNA瓣可作用為慢病毒基因體核輸入之順式活化決定位及/或可增加病毒之效價。
在一個實施例中，反轉錄病毒或慢病毒轉移載體包含一或多個輸出元件。用語「輸出元件(export element)」係指順式作用轉錄後調節元件，其調節RNA轉錄本自細胞核至細胞質的運輸。RNA輸出元件之實例包括但不限於人類免疫缺陷病毒(HIV) rev反應元件(RRE)（參見例如Cullen et al., 1991. J Virol. 65: 1053；及Cullen et al., 1991. Cell 58: 423）及B型肝炎病毒轉錄後調節元件(HPRE)。一般而言，將RNA輸出元件置放於基因之3' UTR內，且可作為一或多個副本插入。
在其他實施例中，病毒載體中之異源序列之表現藉由將轉錄後調節元件、有效多腺苷化位點、及可選地轉錄終止信號併入載體中增加。各種轉錄後調節元件可增加異源核酸在蛋白質處之表現，例如伍德查克(woodchuck)肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE; Zufferey et al., 1999, J Virol., 73:2886)；B型肝炎病毒中存在之轉錄後調節元件(HPRE) (Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864)；及類似者(Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766)。
在一些實施例中，載體可包括具有轉錄或轉譯調節活性之調節性寡核苷酸。此類寡核苷酸可用於調節表現之控制之各種基因表現組態中。轉錄調控寡核苷酸可增加（增強）或減少（靜默）重組表現構築體之表現水平。調節性寡核苷酸可以特定方式選擇性調節表現，包括例如賦予組織特異性、發育階段特異性、或多核苷酸之相似表現（包括構成或可誘導表現）。本揭露之調節性寡核苷酸亦可為包含操作地連接至可表現多核苷酸之調節性寡核苷酸之表現載體或重組核酸分子之組分。調節性元件可係自幾個核苷酸至幾百個核苷酸之各種長度。
引導異源核酸轉錄本之有效終止及多腺苷化之元件會增加異源基因表現。轉錄終止信號通常發現在多腺苷化信號之下游。在一些實施例中，載體包含編碼待表現之多肽之多核苷酸之多腺苷化序列3'。如本文中所用，用語「poly A位點」或「poly A序列」表示引導初生RNA轉錄本藉由RNA聚合酶II終止及多腺苷化二者之DNA序列。多腺苷化序列可藉由添加poly A尾至編碼序列之3'端促進mRNA穩定性，且因此促成轉譯效率增加。重組轉錄本之有效多腺苷化係所欲的，因為缺少poly A尾之轉錄本係不穩定且經快速降解。可用於本揭露之載體中之poly A信號之說明性實例包括理想poly A序列（例如AATAAA、ATTAAA、AGTAAA）、牛生長激素poly A序列(BGHpA)、兔β-球蛋白poly A序列(rβgpA)、或所屬技術領域中已知之另一適合的異源或內源性poly A序列。
本文亦描述「密碼子最佳化(codon-optimized)」核酸。「密碼子最佳化」核酸係指已改變之核酸序列，使得密碼子在特定系統（諸如特定物種或物種群組）中之表現係最佳的。舉例而言，可藉由用在物種的基因中更頻繁或最頻繁地使用之密碼子替換原生序列之至少一個、多於一個、或顯著數量之密碼子來最佳化核酸序列，以在哺乳動物細胞或特定哺乳動物物種（諸如人類細胞）中表現。密碼子最佳化不改變經編碼蛋白質之胺基酸序列。
密碼子最佳化核苷酸序列可存在與表現功效相關之改良性質。在一些實施例中，可最佳化待轉錄之DNA序列以促進更有效轉錄及/或轉譯。在一些實施例中，DNA序列可針對順式調節元件（例如，TATA盒、終止信號、及蛋白質結合位點）、人工重組位點、chi位點、CpG二核苷酸含量、陰性CpG島、GC含量、聚合酶滑移位點、及/或相關於轉錄之其他要件進行最佳化；DNA序列可針對隱蔽剪接位點、mRNA二級結構、mRNA之穩定自由能、重複序列、RNA不穩定域、及/或與mRNA處理及穩定性相關之其他要件進行最佳化；DNA序列可針對密碼子使用偏壓、密碼子可調適性、內部chi位點、核糖體結合位點（例如IRES）、早期polyA位點、Shine-Dalgarno (SD)序列、及/或相關於轉譯之其他要件進行最佳化；及/或DNA序列可針對密碼子上下文、密碼子-反密碼子交互作用、轉譯暫停位點、及/或與蛋白質摺疊相關之其他要件進行最佳化。
載體可具有一或多個LTR，其中任何LTR包含一或多個修改，諸如一或多個核苷酸取代、添加、或缺失。載體可進一步包含更多輔助元件中之一者以增加轉導效率（例如cPPT /FLAP）、病毒包裝（例如Psi (Ψ)包裝信號、RRE），及/或增加治療性基因表現之其他元件（例如poly (A)序列），且可以可選地包含WPRE或HPRE。具有通常知識者應瞭解，許多其他不同實施例可自本揭露之現有實施例中形成。
「宿主細胞(host cell)」包括於體內、離體、或體外用本揭露之重組載體或多核苷酸轉染、感染、或轉導之細胞。宿主細胞可包括包裝細胞、生產細胞、及感染病毒載體之細胞。在一些實施例中，向需要療法之對象投予感染本揭露之病毒載體之宿主細胞。在某些實施例中，用語「目標細胞(target cell)」與宿主細胞可互換使用，且指所欲細胞類型之經轉染、感染、或轉導細胞。在一些實施例中，目標細胞係T細胞。
通常需要大規模病毒顆粒產生以達到合理病毒力價。病毒顆粒係藉由將轉移載體轉染至包含病毒結構及/或輔助基因之包裝細胞系中而產生，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx、或nef基因或其他反轉錄病毒基因。
如本文中所使用，用語「包裝載體(packaging vector)」係指缺乏包裝信號之表現載體或病毒載體，且包含編碼一、二、三、四個或更多個病毒結構及/或輔助基因之多核苷酸。一般而言，包裝載體係包括於包裝細胞中，且係經由轉染、轉導、或感染引入細胞中。轉染、轉導、或感染之方法係所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。本揭露之反轉錄病毒/慢病毒轉移載體可經由轉染、轉導、或感染引入包裝細胞系中，以產生生產細胞或細胞系。本揭露之包裝載體可藉由常見方法引入人類細胞或細胞系中，包括例如磷酸鈣轉染、脂質轉染、或電穿孔。在一些實施例中，包裝載體係與顯性可選擇標記一起引入細胞中，諸如新黴素、潮黴素、嘌呤黴素、殺稻瘟菌素(blastocidin)、吉歐黴素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶、或ADA，接著在適當藥物之存在下選擇並分離殖株。可選擇標記基因可實體地連接至由包裝載體編碼之基因，例如由IRES或自裂解病毒肽。
病毒套膜蛋白質(env)判定宿主細胞之範圍，其可能最終藉由自細胞系產生之重組反轉錄病毒感染及轉化。在慢病毒（諸如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、及EIV）之情況下，env蛋白質包括gp41及gp120。在一些實施例中，由本揭露之包裝細胞表現之病毒env蛋白在與病毒gag及pol基因分開的載體上編碼，如先前已描述。
可在本文所描述之實施例中使用的反轉錄病毒衍生之env基因之說明性實例包括但不限於：MLV套膜、IOAI套膜、BAEV、FeLV–B、RDI 14、SSAV、Ebola、仙台病毒、FPV（雞瘟病毒）、及流感病毒套膜。類似地，可利用編碼自RNA病毒（例如，小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)、杯狀病毒科(Calciviridae)、星狀病毒科(Astroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、呼腸孤病毒(Reoviridae)、雙鏈RNA病毒科(Bimaviridae)、反轉錄病毒科(Retroviridae)之RNA病毒科）以及自DNA病毒（肝去氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)、圓環病毒科(Circoviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒(Adenoviridae)、疱疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)、及虹彩病毒科(Iridoviridae)）之套膜之基因。代表性實例包括FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、Rabies、ALV、BIV、BL V、EBV、CAEV、SNV、ChTL V、STLV、MPMV SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CTIO、及EIAV。
在其他實施例中，用於假型化本揭露之病毒之套膜蛋白包括但不限於以下病毒中之任一者：A型流感病毒（諸如H1N1、H1N2、H3N2、及H5Nl（禽流感））、B型流感病毒、C型流感病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、輪狀病毒、諾沃克(Norwalk)病毒群之任何病毒、腸道腺病毒、小病毒、登革熱病毒、猴痘、單股負鏈病毒(Mononegavirale)、狂犬病病毒屬(Lyssavirus)（諸如狂犬病病毒、拉哥斯(Lagos)蝙蝠病毒、莫柯拉(Mokola)病毒、杜文黑基(Duvenhage)病毒、歐洲蝙蝠病毒1及2及澳大利亞蝙蝠病毒、短暫熱病毒屬(Ephemerovirus)、水皰性病毒屬(Vesiculovirus)、水皰性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒（諸如單純疱疹病毒1型及2型）、水痘帶狀疱疹、巨細胞病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、人類疱疹病毒(HHV)、人類疱疹病毒6型及8型、人類免疫缺陷病毒(HIV)、乳頭狀瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒狀病毒（諸如阿根廷出血熱病毒、玻利維亞出血熱病毒、沙比亞相關出血熱病毒、委內瑞拉出血熱病毒、拉沙熱病毒、馬丘波病毒）、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、布尼亞病毒（諸如克里米亞-剛果出血熱病毒）、漢他病毒(hantavirus)、引起腎衰竭的出血熱病毒、裂谷熱病毒、包括埃博拉(Ebola)出血熱及馬爾堡(Marburg)出血熱等的絲狀病毒科(filovirus)、Kyasanur森林病病毒的黃病毒科、鄂木斯克(Omsk)出血熱病毒、蜱傳腦炎病毒及副黏液病毒科（諸如亨德拉(Hendra)病毒及尼帕(Nipah)病毒）、大天花及小天花（天花）、α病毒諸如委內瑞拉馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、SARS相關冠狀病毒(SARS-Co V)、西尼羅河病毒、或任何引起腦炎的病毒。
如本文所用，用語「假型(pseudotype)」或「假型化(pseudotyping)」係指一種病毒，其病毒套膜蛋白已被另一種具有其他特徵的病毒套膜蛋白取代。舉例而言，HIV可能被水皰性口炎病毒G-蛋白質(VSV–G)套膜蛋白質假型化，使HIV感染較廣範圍之細胞，因為HIV套膜蛋白質（藉由env基因編碼）通常將病毒靶向CD4+呈現細胞。
如本文中所使用，用語「包裝細胞系(packaging cell line)」係用以指稱不含有包裝信號之細胞系，但穩定或暫時性表現正確包裝病毒顆粒所必需之病毒結構蛋白及複製酶（例如gag、pol、及env）。可採用任何合適的細胞系以製備本揭露之包裝細胞。一般而言，細胞係哺乳動物細胞。在另一實施例中，用以產生包裝細胞系之細胞係人類細胞。可用以產生包裝細胞系之合適細胞系包括例如CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10Tl/2細胞、FLY細胞、Psi–2細胞、BOSC 23細胞、P A317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HTI080細胞、293細胞、293T細胞、B–50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos–2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞、及211A細胞。
如本文中所使用，用語「生產細胞系(producer cell line)」係指能夠產生重組反轉錄病毒顆粒之細胞系，包含包裝細胞系及包含包裝信號之轉移載體構築體。傳染性病毒顆粒及病毒儲備溶液之產生可使用習知技術進行。製備病毒儲備液之方法係所屬技術領域中已知的，且藉由例如Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628–633、及N. R. Landau et al. (1992) J Virol. 66:5110–5113說明。可使用習知技術自包裝細胞收集傳染性病毒顆粒。例如，可藉由細胞裂解或收集細胞培養物之上清液來收集傳染性顆粒，如所屬技術領域中已知。可選地，若為所欲，可純化所收集之病毒顆粒。合適的純化技術係所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。
使用反轉錄病毒或慢病毒載體藉助於病毒感染而非轉染遞送基因或其他多核苷酸序列稱為「轉導」。在一個實施例中，通過感染及前病毒整合將反轉錄病毒載體轉導至細胞中。在某些實施例中，若目標細胞（例如T細胞或NK細胞）包含藉由使用病毒或反轉錄病毒載體感染遞送至細胞之基因或其他多核苷酸序列，則目標細胞係「經轉導」。在一些實施例中，經轉導細胞包含在其細胞基因體中藉由反轉錄病毒或慢病毒載體遞送之一或多種基因或其他多核苷酸序列。
揭示表現本揭露之構築體中之一或多者的宿主細胞。宿主細胞可以一或多種病毒載體轉導，該病毒載體包含編碼表現經工程改造之TCR及/或CAR之一或多個多肽之核酸序列。可根據本揭露之某些實施例使用的在基因療法中使用之病毒載體相關之其他方法，可見於例如Kay, M.A. (1997) Chest 111 (6 Supp.): 138S–142S; Ferry, N. and Heard, J.M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975–81; Shiratory, Y. et al., (1999) Liver 19:265–74; Oka, K. et al., (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179–86; Thule, P. M. and Liu, J.M. (2000) Gene Ther. 7:1744–52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335–56; Alt, M. (1995) J Hepatol. 23:746–58; Brody, S. L. and Crystal, R.G. (1994) Ann. NY Acad. Sci. 716:90–101；Strayer, D.S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159–2172; Smith–Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43–49；及Lee, H. C. et al., (2000) Nature 408:483–8。
本文所描述之組成物可包含一或多個多核苷酸、多肽、包含其之載體、及T細胞組成物及NK組成物，如本文所涵蓋。本文所述之一個實施例係一種組成物，其包含表現GPC3結合TCR及/或CAR之經修飾T細胞。本文所述之另一實施例係一種組成物，其包含表現d GPC3結合TCR及/或CAR之經修飾NK細胞。組成物包括但不限於醫藥組成物。「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指配製在醫藥學上可接受或生理學上可接受之溶液之組成物，其用於單獨或與一或多種其他療法組合投予至細胞或動物。亦應理解，若所欲，本揭露之組成物可與其他藥劑組合投予，諸如例如細胞介素、生長因子、激素、小分子、化學治療劑、前藥、藥物、抗體、或其他各種醫藥學上活性劑。亦不限於可包括在組成物中之其他組分，其限制條件係額外藥劑不會不利地影響組成物遞送預期療法之能力。
本文中使用詞組「醫藥學上可接受之(pharmaceutically acceptable)」係指在合理的醫療判斷範疇內適合於與人類及動物之組織接觸與合理的效益/風險比相符而不具有過量毒性、刺激、過敏反應、或其他問題或併發症之彼等化合物、材料、組成物、及/或劑型。
如本文所用，「醫藥上可接受之賦形劑、載劑、稀釋劑、或賦形劑(pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient)」包括但不限於任何的佐藥、載劑、賦形劑、助滑劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增味劑、界面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、穩定劑、等張劑、溶劑、界面活性劑、或乳化劑，其已經美國食品藥物管理局(United States Food and Drug Administration)核准可用於人類或馴養動物。例示性醫藥上可接受之載劑包括但不限於糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、及乙酸纖維素；西黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；可可脂、蠟、動物及植物脂肪、石蠟、聚矽氧、皂土、矽酸、氧化鋅；油，諸如花生油、棉籽油、紅花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油、及黃豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇、及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；洋菜；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無致熱原的水；等張鹽水；林格氏液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；及醫藥配方中採用的任何其他相容物質。
在本文所述之一個實施例中，本揭露之組成物包含本文所涵蓋之經修飾之T細胞或NK細胞之量。通常可以說明，包含本文所涵蓋之T細胞或NK細胞之醫藥組成物可以10 2至10 10個細胞/kg體重、10 5至10 9個細胞/kg體重、10 5至10 8個細胞/kg體重、10 5 至10 7個細胞/kg體重、10 7至10 9 個細胞/kg體重、或10 7至10 8個細胞/kg體重（包括彼等範圍內之所有整數值）之劑量投予。細胞數目將取決於組成物之最終用途以及其中所包括之細胞類型。T細胞或NK細胞經修飾以表現經工程改造之TCR或CAR可以此等範圍內之劑量多次投予。細胞對進行療法之患者可係同種異體、同系(syngeneic)、異種、或自體的。若為所欲，治療亦可包括投予如本文所述之促分裂原（例如PHA）或淋巴激素、細胞介素、及/或趨化因子（例如IFN–γ、IL–2、IL–7、IL–15、IL–12、TNF–α、IL–18、及TNF–β、GM–CSF、IL–4、IL–13、Flt3–L、RANTES、MIP1α等），以增強輸注T細胞之植入及功能。
大致上，包含如本文所述活化及擴增之細胞的組成物可用於治療及預防免疫功能不全或免疫抑制之個體中產生之疾病。在一些情況下，包含本文所涵蓋之經修飾之T細胞或NK細胞之組成物用於治療癌症。本文所述之經修飾之T細胞或NK細胞可單獨投予，或作為醫藥組成物與載劑、稀釋劑、賦形劑、及/或其他組分（諸如IL-2、IL-7、及/或IL-15）、或其他細胞介素或細胞群組合投予。在一些實施例中，本文所涵蓋之醫藥組成物包含與一或多種醫藥學或生理學上可接受之載劑、稀釋劑、或賦形劑組合之經基因修飾之T細胞或NK細胞之量。
包含本文所涵蓋之經修飾之T細胞或NK細胞之醫藥組成物可進一步包含緩衝液，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、及類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或聚葡醣、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑（例如氫氧化鋁）；及防腐劑。本揭露之組成物可經調配用於腸胃外投予，例如血管內（靜脈內或動脈內）、腹膜內或肌肉內投予。
液體醫藥組成物（無論是溶液、懸浮液、或其他類似之形式）均可包括下列之一或多者：無菌稀釋劑（諸如用於注射之水）、鹽水溶液，諸如生理鹽水、林格氏溶液、等張氯化鈉、不揮發油（諸如可充當溶劑或懸浮介質之合成單甘油酯或二甘油酯）、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽、或磷酸鹽，以及用於調節張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。腸胃外製劑可封閉在安瓿、拋棄式注射器、或由玻璃或塑膠製成之多劑量小瓶中。亦包括無菌可注射醫藥組成物。
在一些實施例中，本文所涵蓋之組成物包含單獨或與一或多種治療劑組合之經擴增修飾之T細胞或NK細胞組成物之有效量。因此，T細胞或NK細胞組成物可單獨或與其他已知癌症治療組合投予，諸如輻射療法、化學療法、移植、免疫療法、激素療法、光動力療法等。組成物亦可與抗生素及抗病毒劑組合投予。此項技術中可接受此類治療劑作為如本文所述之疾病狀態（諸如癌症）之治療。在一個實施例中，本文所涵蓋之組成物亦可與TGF-β之抑制劑（例如小分子抑制劑LY55299）投予。所涵蓋之例示性治療劑包括細胞介素、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、消炎劑、化學治療劑、放射治療劑、治療性抗體、或其他活性及輔助劑。
在某些實施例中，包含本文中所涵蓋之T細胞或NK細胞之組成物可結合任何數目的化學治療劑來投予。化學治療劑之說明性實例包括但不限於烷化劑，諸如噻替派及環磷醯胺(CYTOXAN™)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)、及優瑞多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphaoramide)、及三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine resume)；氮芥子氣，諸如氯芥苯丁酸、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、黴法蘭(melphalan)、新恩比興(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosurea)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素、放線菌素C (cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、阿黴素(doxorubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎拉黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如胺甲喋呤及5-氟脲嘧啶(5–FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如環胞苷(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5–FU；雄性激素，諸如卡魯睪酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如胺麩精(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；埃夫咪辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基尿素；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴仁；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；伽托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇，例如紫杉醇(TAXOL®, Bristol–Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)及多西他賽(docetaxel) (TAXOTERE®, Rhone–Poulenc Rorer, Antony, France)；氯芥苯丁酸；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP–16)；依弗醯胺；絲裂黴素C (mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊苷；道諾黴素(daunomycin)；胺喋呤；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT–11；拓撲異構酶抑制劑RPS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視網酸衍生物，諸如Targretin™（貝瑟羅汀(bexarotene)）、Panretin™（阿利維A酸(alitretinoin)）；ONTAK™（地尼白介素(denileukin diftitox)）；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱；及以上任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。該定義亦包括抗荷爾蒙劑，其作用為調控或抑制對腫瘤之荷爾蒙作用，諸如抗雌激素，包括例如泰莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基泰莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、克沃昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)、及托瑞米芬(toremifene) (Fareston)；及抗雄性激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、柳菩林(leuprolide)、及戈舍瑞林(goserelin)；及以上任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
可結合本文中所述之組成物使用各種其他治療劑。在一個實施例中，包含T細胞之組成物係與抗發炎劑一起投予。消炎劑或藥物包括但不限於類固醇及糖皮質激素（包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氫化可體松(hydrocortisone acetate)、氫化可體松(hydrocortisone)、氫化可體松、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、曲安奈德(triamcinolone)），非類固醇消炎藥物(NSAIDS)包括阿司匹靈、伊布洛芬、萘普生(naproxen)、胺甲喋呤、柳氮磺胺吡啶、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥物、環磷醯胺、及黴酚酸酯。
在一些實施例中，NSAID係選自由以下組成之群組：伊布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox–2抑制劑（諸如VIOXX® (rofecoxib)及CELEBREX® (celecoxib)）、及唾液酸鹽。例示性止痛劑係選自由以下組成之群組：乙醯胺酚、羥考酮、特拉嗎竇、或鹽酸丙氧芬(proporxyphene hydrochloride)。例示性糖皮質素係選自由以下組成之群組：可體松、地塞米松、氫化可體松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍、或潑尼松。例示性生物反應調節劑包括針對細胞表面標記（例如CD4、CD5等）之分子、細胞介素抑制劑（諸如TNF拮抗劑（例如依那西普(etanercept) (ENBREL®）、阿達木單抗(adalimumab) (HUMIRA®)、及英夫利昔單抗(infliximab) (REMICADE®)）、趨化因子抑制劑、及黏附分子抑制劑。生物反應調節劑包括單株抗體以及分子之重組形式。例示性疾病修飾抗風濕藥物(DMARD)包括硫唑嘌呤、環磷醯胺、環孢素、胺甲喋呤、青黴胺、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥氯喹、金（口服金諾芬(auranofin)及肌內）、及米諾四環素。
在其他實施例中，適用與本文所設想之經CAR或TCR修飾之T細胞或NK細胞組合的治療性抗體包括但不限於阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿夫妥珠單抗(afutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、安那莫單抗(anatumomab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、比伐珠單抗(bivatuzumab)、蘭妥莫單抗(blinatumomab)、本妥昔單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他妥珠單抗(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、克里伏妥珠單抗(clivatuzumab)、康納木單抗(conatumumab)、達他單抗(daratumumab)、德珠單抗(drozitumab)、杜里土單抗(duligotumab)、杜西吉土單抗(dusigitumab)、地莫單抗(detumomab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛珠單抗(dalotuzumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩司昔單抗(ensituximab)、鄂托默單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、法瑞妥珠單抗(farietuzumab)、費拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、非吉單抗(figitumumab)、法蘭土單抗(flanvotumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、加尼圖單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞昔單抗(girentuximab)、格雷巴土木單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、伊姆加土珠單抗(imgatuzumab)、因達西單抗(indatuximab)、英妥珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛瓦土珠單抗(lorvotuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫塞妥莫單抗(moxetumomab)、納那妥單抗(namatumab)、那莫單抗(naptumomab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、諾莫單抗(nofetumomab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉單抗(olaratumab)、奧那組單抗(onartuzumab)、奧普珠單抗(oportuzumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕薩珠單抗(parsatuzumab)、帕曲妥單抗(patritumab)、潘妥莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、平妥莫單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、雷妥莫單抗(racotumomab)、雷曲妥單抗(radretumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、辛圖珠單抗(simtuzumab)、索利托單抗(solitomab)、他卡珠單抗(tacatuzumab)、他普莫單抗(taplitumomab)、泰納莫單抗(tenatumomab)、泰普洛單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、土庫珠單抗(tucotuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、伏司妥珠單抗(vorsetuzumab)、伏妥莫單抗(votumumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)、CC49、及3F8。
在一些實施例中，本文中所述之組成物係結合細胞介素來投予。如本文中所使用，「細胞介素(cytokine)」意指由一個細胞群釋放且作用於另一細胞而作為細胞間介導物之蛋白質的通用用語。此類細胞介素之實例係淋巴激素、單核因子(monokine)、趨化因子、及傳統多肽激素。細胞介素中包括係生長荷爾蒙，諸如人類生長荷爾蒙、N-甲硫胺醯基人類生長荷爾蒙、及牛生長荷爾蒙；副甲狀腺荷爾蒙；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；鬆弛素；前鬆弛素(prorelaxin)；醣蛋白荷爾蒙，諸如濾泡刺激素(FSH)、甲狀腺刺激素(TSH)、及黃體激素(LH)；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；泌乳素；胎盤泌乳原；腫瘤壞死因子–α及–β；密拉氏管抑制物質；小鼠促性腺素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；促血小板生成素(thrombopoietin) (TPO)；神經生長因子，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉換生長因子(TGF)，諸如TGF–α及TGF–β；似胰島素生長因子–I及–II；紅血球生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，諸如干擾素–α、–β、及–γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞–CSF (M–CSF)；顆粒球-巨噬細胞–CSF (GM–CSF)；及顆粒球–CSF (G–CSF)；介白素(IL)，諸如IL–1、IL–1α、IL–2、IL–3、IL–4、IL–5、IL–6、IL–7、IL–8、IL–9、IL–10、IL–11、IL–12；IL–15，腫瘤壞死因子，諸如TNF–α或TNF–β；及其他多肽因子，包括LIF及kit配體(KL)。如本文中所使用，用語細胞介素包括來自自然來源或重組T細胞培養物之蛋白質、及初始序列細胞介素之生物活性等效物。
任何細胞可用作本揭露之多核苷酸、載體、或多肽的宿主細胞。在一些實施例中，細胞可係原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、或高等真核細胞，諸如哺乳動物細胞。合適的原核細胞包括但不限於真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科(Enterobactehaceae)，諸如大腸桿菌屬，例如大腸桿菌；腸桿菌屬；伊文氏桿菌屬；克留氏菌屬；變形桿菌屬；沙氏桿菌屬，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；鋸桿菌屬，例如黏質沙門氏菌(Serratia marcescans)、及志賀桿菌(Shigella)；桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)；假單孢菌屬，諸如綠膿桿菌(P. aeruginosa)；及鏈黴菌屬。在一些實施例中，細胞係人類細胞。在一些實施例中，細胞係免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞係選自由下列所組成之群組：T細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、TCR表現性細胞、自然殺手(NK)細胞、樹突細胞、顆粒球、先天性淋巴細胞、巨核細胞、單核球、巨噬細胞、血小板、胸腺細胞、及骨髓細胞。在一個實施例中，免疫細胞係T細胞。在另一實施例中，免疫細胞係NK細胞。在某些實施例中，T細胞係腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、自體T細胞、經工程改造自體T細胞(eACT™)、異體T細胞、異源T細胞、或其任何組合。不同於抗體療法或獨立的經TCR或CAR修飾之T細胞，T細胞（或如上所述之任何細胞）。
本文所述之另一實施例係一種治療有需要之對象之癌症的方法，其包含投予有效量，例如治療有效量之包含如本文所述之表現TCR或CAR之T細胞或NK細胞之組成物。投予之量及頻率將藉由患者之病況及患者之疾病之類型及嚴重程度等因素來判定，但適當的劑量可藉由臨床試驗判定。
在其他實施例中，提供一種方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量的本文所涵蓋之經修飾之T細胞或包含其之組成物，單獨或與一或多種治療劑組合。在某些實施例中，本揭露之細胞用於治療有患癌風險之患者。因此，本揭露提供治療或預防癌症之方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量之本揭露之經修飾之T細胞。
所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，可能需要多次投予本揭露之組成物，以影響所欲療法。舉例而言，組成物可在1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年、2年、5年、10年、或更久內投予1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、或10次、或更多次。
在某些實施例中，可能所欲投予活化T細胞至對象，且隨後再抽血（或進行血球分離術），根據本揭露從其中活化T細胞，且用此等活化及擴增之T細胞輸注患者。此方法可每幾週進行多次。在某些實施例中，T細胞可由抽取10 cc至400 cc之血液中活化。不受理論束縛，使用此多個血液抽吸/多重輸注方案可用以選擇出某些T細胞群。
本文所涵蓋之組成物之投予可以任何方便的方式進行，包括藉由氣霧劑吸入、注射、攝取、輸血、植入、或移植。在一些實施例中，組成物係腸胃外投予者。如本文中所使用，詞組「腸胃外投予(parenteral administration/administered parenterally)」係指除腸內及局部投予外之投予模式，通常藉由注射，且包括但不限於血管內、靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、腫瘤內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊椎內及胸骨內注射及輸注。在一個實施例中，本文所涵蓋之組成物藉由直接注射至腫瘤、淋巴結、或感染位點向對象投予。
在一個實施例中，向有需要之對象投予有效量之組成物以增加對象對癌症之細胞免疫反應。免疫反應可包括藉由能夠殺死感染細胞、調控T細胞、及輔助T細胞反應之細胞毒性T細胞介導之細胞免疫反應。主要由能夠活化B細胞從而導致抗體產生之輔助T細胞介導之體液免疫反應亦可被誘導。各種技術可用於分析由本揭露之組成物所誘導之免疫反應的類型，該等技術在所屬技術領域中熟知；例如，在免疫學中之電流協定，由下列編輯：John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Eth M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley_amp Sons, NY, N.Y。
在T細胞介導之殺滅之情況下，CAR配位體結合引發CAR信號傳導至T細胞，產生誘導T細胞之多種T細胞信號傳導途徑之活化，以產生或釋放能夠藉由各種機制誘導目標細胞凋亡之蛋白質。此等T細胞介導之機制包括（但不限於）將胞內細胞毒性顆粒自T細胞轉移至目標細胞中，促炎性細胞介素之T細胞分泌可直接誘導目標細胞殺滅（或間接經由募集其他殺手效應細胞），且上調T細胞表面上之死亡受體配位體（例如FasL），其在與目標細胞上的同源死亡受體（例如Fas）結合後誘導目標細胞凋亡。
在實施例中，本文描述一種治療經診斷患有癌症之對象的方法，其包含自對象取出T細胞，將該等T細胞用包含編碼如本文所設想之GPC3結合CAR之核酸的載體基因修飾，從而產生經修飾T細胞群，及向相同對象投予經修飾T細胞群。
在某些實施例中，本揭露亦提供用於在對象中刺激效應細胞介導之對目標細胞群之免疫調節劑反應的方法，包含向對象投予表現編碼GPC3結合CAR分子之核酸構築體的免疫效應細胞群之步驟。
用於投予本文所述之細胞組成物之方法包括任何方法，其可有效導致再引入經離體基因修飾之免疫效應細胞，其在對象中直接表現經工程改造CAR，或再引入免疫效應細胞之經基因修飾之先驅細胞，其在引入對象中時分化成表現GPC3結合CAR分子之成熟免疫效應細胞。一種方法包含將周邊血液T細胞用根據本揭露之核酸構築體離體轉導、及將經轉導之細胞返回對象中。
儘管前述揭露已藉由說明及實例之方式進行詳細說明以用於清晰理解目的，然而根據本揭露之教示對所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見可在不背離隨附申請專利範圍之精神或範圍內進行某些變化及修改。僅以說明性的方式而非限制性的方式提供以下實例。所屬技術領域中具有通常知識者將容易地識別許多非臨界參數，其可改變或修改以產生基本上類似的結果。 實例 實例1 抗GPC3 抗體
將小鼠用GPC3蛋白免疫以產生候選融合瘤。測試融合瘤與不同目標細胞之結合。在此實例及以下實例中所使用之目標細胞係自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC) (Hep3B, SkHep1, K562)或日本研究生物資源保藏中心(Japanese Collection of Research Bioresources, JCRB) (Huh7, JHH5)取得。除K562細胞外，將此等細胞系在DMEM培養基(Gibco)或William’s E培養基中培養，各補充有10%胎牛血清(Corning)及青黴素鏈黴素抗生素(Gibco)。Hep3B細胞表現高水平的人類GPC3。將Hep3B GPC3陰性細胞(GPC3KO)透過GPC3外顯子2之CRISPR KO工程改造並進行殖株選擇(clonally selected)。透過定序及功能檢定驗證GPC3之有效剔除及最小的脫靶效應。SkHep1細胞係GPC3陰性細胞系。Huh7細胞具有GPC3之中/低表現。親本K562細胞係GPC3陰性。將K562 GPC3陽性細胞工程改造以過度表現（使用EF1a啟動子）完全人類GPC3（序列可在Uniport ID NO取得；P51654-1），其係透過慢病毒載體介導之轉導及嘌呤黴素抗性選擇。將小鼠GPC3及人類GPC5蛋白在K562細胞中以類似方式過度表現作為對照，以測試人類GPC3選擇性/特異性。將K562細胞在補充有10%胎牛血清(Corning)及青黴素鏈黴素抗生素(Gibco)之IMDM培養基(Gibco)中，在有或沒有1ug/mL的嘌呤黴素(Sigma)下培養。以懸浮細胞採集親本K562、K562-GPC3、及K562-GPC5細胞。而Hep3B細胞係依照製造商的說明用TrypLE Express (Gibco)、或無酶細胞解離緩衝液(Gibco)採集。
為了判定上清液形式融合瘤之結合，將如表9所示之目標細胞接種於U底96孔盤上且在PBS中洗滌，與Fc阻斷劑(BD Pharmingen)、人類血清之1:50稀釋液、及LIVE/DEAD™可固定近IR死細胞染色試劑(Invitrogen™)培養15分鐘，接著在PBS中洗滌。接著將細胞在4℃下與下列培養30分鐘：於PBS中稀釋4倍的融合瘤上清液、或對照抗體(HN3, Genescript; GPC3-PE, ABIN230197, Antibody Online)或PBS。在PBS中洗滌2次之後，除直接接合的抗體條件外，將全部在4℃下用於PBS中稀釋300倍的與PE接合之山羊抗小鼠二級抗體(Jackson ImmunoResearch)染色30分鐘。在PBS中最終洗滌兩次後，將細胞再懸浮於冷PBS中，並立即在Fortessa細胞儀(Becton Dickinson)上藉由流動式細胞測量術分析。表9顯示基於陰性對照PBS染色圈選(gated)之PE染色陽性之活細胞百分比。結合劑依類似性分成3個類別：部分切割GPC3之結合劑、完整GPC3之結合劑、及僅Hep3B細胞之結合劑。 表9 ：融合瘤結合概況
染色陽性之細胞百分比
融合瘤或一級抗體 K562親本（對照） K562 GPC3+ Hep3B TrypLE Hep3B CDB
陰性對照 PBS 0.1 0.1 1.5 2.1
部分切割GPC3之結合劑 mAb1 0.8 96.2 73.7 99.2
HN3 1.9 89.8 50.6 99.5
mAb2 0.4 94.1 46.8 99.2
mAb4 0.1 94.1 45.7 99.0
mAb6 0.1 94.5 49.1 99.4
mAb7 0.1 94.4 45.8 99.3
mAb8 0.3 95.1 45.5 99.6
mAb9 0.4 94.4 46.7 99.6
mAb11 0.5 93.4 44.2 99.4
mAb12 8.8 95.9 51.4 99.5
mAb16 0.2 95.5 46.1 98.6
mAb17 0.1 94.6 47.8 98.8
完整GPC3之結合劑 mAb5 0.1 60.4 3.7 98.0
mAb10 0.1 56.3 2.8 98.2
mAb18 0.1 27.3 4.1 21.7
僅HeP3B之結合劑 mAb3 0.9 2.3 9.7 23.2
mAb14 0.2 0.6 8.9 19.0
mAb19 0.3 0.4 7.6 17.8
市售對照 AbOnline-PE 22.1 92.7 1.8 2.2
選擇產生能夠結合三個非對照細胞類型之抗體的融合瘤以用於進一步評估。將此等融合瘤之免疫球蛋白之可變域定序，且其中六個識別為獨特序列，其餘對識別為獨特的六個而言係多餘的。 實例2 嵌合抗原受體(CAR) T 細胞
將實例1中所識別之六對獨特的重鏈及輕鏈之輕鏈及重鏈可變區之序列及後續定序mAb1、mAb2、mAb10、mAb14、mAb18、及mAb19以單鏈可變片段(scFv)選殖至具有以下架構之CAR構築體中；scFv - CD8鉸鏈域- CD8跨膜域– 4 1BB共刺激域- CD3ζ信號傳導域，其使用所屬技術領域中已知之標準分子生物學技術。將CAR構築體選殖至用於T細胞轉導之慢病毒載體中。EF1A啟動子係與所有構築體一起使用並測試。測試可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈之兩個不同定向，「VH」後綴指示VH緊隨在信號肽之後的構築體，而「VL」後綴指示VH緊隨在信號肽之後的構築體（參見例如表10）。
嵌合抗原受體(CAR) T細胞係用基於mAb2、mAb10、mAb1、mAb14、mAb19、及mAb18之scFv、連同利用衍生自公開可得的YP7及考曲妥珠單抗(codrituzumab)抗體序列之scFv的對照構築體製造。對於CAR T細胞製造，將CD3+ T細胞藉由負向選擇自健康供體獲得之周邊血液單核細胞中單離，並冷凍於CryoStor ®細胞冷凍保存培養基(Sigma Aldrich ®)中。在慢病毒轉導之前，將CD3泛T細胞解凍，靜置兩小時，用CD3/CD28 Dynabeads ®(ThermoFisher Scientific)活化，接著在補充有100 IU/ml的介白素–2 (IL2) (Miltenyi Biotech)之T細胞培養基（X–VIVO™ (Lonza)，具有5%人類血清(Valley Biomedical)及Glutamax (Gibco)）中靜置整夜。隔天，如本文所述，將細胞用聚凝胺及含有CAR構築體之慢病毒轉導，構築體具有及不具有顯性負性TGFβ受體(TGFβ-DNR)。將細胞以1000g離心90分鐘，接著置於培養箱中。隔天，置換培養基。在額外兩天之後將細胞去珠，並擴展八天。每週更新培養基三次，添加IL-2達完整體積。在製造結束時，將細胞冷凍於CryoStor ®細胞冷凍保存培養基(Sigma Aldrich ®)中。在所有製造中，藉由流動式細胞測量術所測量，大約40至90%細胞呈轉殖基因陽性，平均載體拷貝數係大約0.5至4。以下所述之功能檢定及體內實驗中所使用的細胞係在用100 US/mL IL2解凍並靜置整夜之後執行。 實例3 細胞毒性
在MP儀器(Agilent)上於xCELLigence RTCA檢定中評估如實例2中所述製造之CAR T細胞之細胞毒性。在檢定前一天接種10,000個活目標細胞（Hep3B細胞），且第二天依照製造商之建議，將500個CAR+ T細胞（或未經轉導(UT)）（1: 5及1:20之效應目標(E:T)比）接種在96孔E盤中於目標細胞培養基中。使用所提供之RTCA Pro軟體在6至7內天追蹤細胞毒性，且係以細胞溶解%記述。表10顯示在143h時針對Hep3B細胞之代表終點細胞溶解%。顯示如實例2中所述製造之2個供體（供體1及供體2）之數據。 表10 ：細胞毒性判定
CAR+ T : 目標細胞比 E:T 比1:5 E:T 比1:20
簡稱 供體1 供體2 供體1 供體2
mAb2_VH 100.0 100.0 100.0 81.8
mAb10_VH 24.8 52.2 9.5 12.7
mAb1_VH 100.0 100.0 100.0 98.1
mAb14_VH 100.0 100.0 82.4 61.3
mAb19_VH 3.4 1.6 8.8 7.9
mAb18_VH 4.9 1.4 4.2 6.9
mAb2_VL 4.3 3.3 6.7 7.8
mAb10_VL 5.4 3.6 5.5 5.4
mAb19_VL 4.5 3.7 1.8 1.5
mAb18_VL 0.7 1.4 5.8 3.0
hYP7 100.0 100.0 99.9 98.1
考曲妥珠單抗 100.0 100.0 99.9 90.2
未經轉導 0.0 0.0 3.6 0.0
僅目標細胞 0.0 0.0 0.0 0.0
所有CAR構築體在T細胞中表現良好：53至76%之間的T細胞係CAR+，其中平均載體拷貝數係在0.9至1.6之間。所製造之CAR+及未經轉導T細胞具有相當的記憶表型，惟基於mAb14之CAR T細胞具有較高的非特異性活化/耗竭標記。 表11
第14 天之CAR% VCN 在CD8+ 細胞中之CD25% 在CD8+ 細胞中之CD39% 在CD8+ 細胞中之CD69% 在CD8+ 細胞中之LAG3+% 在CD8+ 細胞中之PD1%
供體1 供體2 供體1 供體2 供體1 供體2 供體1 供體2 供體1 供體2 供體1 供體2 供體1 供體2
mAb2_VH 74.3 74.9 1.21 1.62 13.3 10.1 43.7 71.8 9.62 9.38 10.1 10.8 1.05 1.27
mAb10_VH 61.8 60.1 1.16 0.95 10.7 8.76 36 70.4 8.37 8.22 6.29 8.4 0.56 1.09
mAb1_VH 71.6 65.1 1.39 1.31 12.6 6.39 51.4 74.9 7.88 6.21 7 6.07 0.78 1.27
mAb14_VH 62.2 58.6 1.22 1.28 29.7 19.1 58.1 80.9 14.5 14.4 15.7 16.1 0.95 1.44
mAb19_VH 71.3 66.1 0.97 1.02 17.3 11.5 46.7 74.5 9.13 11.8 9.59 12.5 0.79 1.55
mAb18_VH 62.4 58.3 1.26 1.18 9.26 7.68 36 72.2 3.78 7.7 4.03 7.81 0.39 1.36
mAb2_VL 53.8 55.8 1.05 1.24 7.63 3.61 34 63.3 4.93 4.46 3.55 2.82 0.57 1.48
mAb10_VL 75.8 72.1 1.27 1.20 9.82 6.48 38.4 68.4 7.65 7.31 6.98 6.74 0.65 1.06
mAb19_VL 75.2 71.4 1.15 1.05 13.5 8.11 41.7 72.8 10.8 9.93 8.98 7.71 0.99 1.3
mAb18_VL 69.9 67.6 1.44 1.39 7.92 4.11 38.9 68.7 4.76 6.19 3.57 3.58 0.54 1.17
hYP7 69.9 64.3 1.42 1.36 12.7 6.64 50.3 77.1 9 8.41 7.4 7.32 0.62 1.2
考曲妥珠單抗 77 71 1.35 1.50 11.5 7.2 42.1 71.7 11.3 9.42 9.34 9.39 0.99 1.37
未經轉導 0.05 0.05 0.00 0.00 6.17 3.98 16.7 42.7 3.67 2.87 2.55 3.34 0.62 2.21
實例4 流動式細胞測量術細胞毒性
藉由流動式細胞測量術進一步評估CAR T細胞之細胞毒性。細胞毒性係藉由檢定結束時的死目標細胞%（Hep3B、JHH5、K562-小鼠GPC3、K562-人類GPC5、K562親本、及SKHep1）測量。檢定係用來自如實例2中所述製造之2個健康供體的T細胞運行。對於此檢定，將100,000個經CellTrace Violet染色之目標細胞及100,000個CAR+ T細胞（或未經轉導(NTD)細胞）接種於U底96孔盤中且於目標細胞培養基中。在48h之後，將共培養物洗滌，並用抗體小組染色針對活力（Live/Dead近紅外Invitrogen™）及T細胞標記CD3-BV786、CD8-FITC、CD69-PECy7 (Biolegend)、Myc-AF647 (Cell Signaling)進行染色，且在iQue流動式細胞儀(Intellicyt)上取得樣本。細胞毒性係測量為死目標%，其係藉由CellTrace Violet陽性CD3陰性細胞中之高Live/Dead細胞之%評估。基於mAb14之CAR針對GPC3陰性目標細胞Sk-Hep1具有細胞毒性活性（參見表11）。此外，基於mAb19_VL、YP7、及考曲妥珠單抗之CAR針對過度表現人類GPC5之K562目標細胞具有細胞毒性活性（參見表12）。相比之下，基於mAb2及mAb1之CAR針對Sk-Hep1或過度表現人類GPC5之K562目標細胞不具有類似水平的細胞毒性。選擇基於mAb2及mAb1之CAR以用於進一步評估。 表12 ：細胞毒性判定
供體1 供體2
簡稱 Hep3B JHH5 K562 -小鼠GPC3 K562 -人類GPC5 K562親本 SkHep1 Hep3B JHH5 K562 -小鼠GPC3 K562 -人類GPC5 K562親本 SkHep1
mAb2_VH 87.5 74.2 79.5 26.2 13.3 29 72.9 65.2 88.5 25.2 13.5 26.5
mAb10_VH 84.3 38.6 33.1 25.5 15.2 28.1 77 41.2 49.8 29.7 15.6 27.2
mAb1_VH 88.8 70.5 80.4 23.4 13.9 23.8 75.6 72.3 87.8 25.3 13 29.7
mAb14_VH 85.7 27.9 29.2 29.6 18.8 82.9 78.5 26 31.9 34.1 19.2 73.1
mAb19_VH 41.8 24.6 19.3 23.6 12.9 23.7 51.1 19.4 25.6 27.1 14.7 28.1
mAb18_VH 39.8 22.8 21.3 24 14.6 24.3 49.8 22.3 28.6 29.4 16.3 23
mAb2_VL 85.2 47 29.2 24.8 14.6 32.1 81.5 43.8 31 26.9 13.6 22.8
mAb10_VL 61 33.5 26.5 23.9 14.4 24.9 69.6 32.9 29.8 25.1 13.4 23.8
mAb19_VL 69.2 40.2 38.2 38.8 31.8 22.4 74.5 45.4 69.7 69.8 28 38.8
mAb18_VL 41.5 21.5 18.7 22.1 11.6 23.4 38.4 19.6 21.3 23.3 13 21.7
hYP7 88.9 83 63.6 64.5 13.4 23.8 89.5 81 68.1 71.2 15.1 26
考曲妥珠單抗 90 90.6 22.3 94.6 12.4 27 90.7 72.6 24.8 95.1 13.9 22.2
實例5 人源化CAR 之細胞毒性
各mAb2及mAb1 scFv之人源化版本係藉由將CDR自各mAb選殖至所選與親本鼠類序列同源之人類架構區中來建構。額外人源化版本係藉由將所選胺基酸反轉為其鼠類對應物來製造。將所得10個人源化scFv選殖至含有CAR構築體之慢病毒載體中，如實例1中所述。接著在體外與GPC3表現性目標細胞共培養中，對基於人源化mAb2-1-mAb2-5及mAb1-1- mAb1-5之CAR構築體進行功能性測試。如實例2中所述，製造包括基於mAb2-1-mAb2-5及mAb1-1- mAb1-5之CAR構築體之CAR T細胞。
在MP儀器(Agilent)上於xCELLigence RTCA檢定中評估此等CAR T細胞之細胞毒性。在檢定前一天接種10,000個活目標細胞（Hep3B細胞），且第二天依照製造商之建議，將500或2000個CAR+ T細胞（或未經轉導(UT)）（各別係1:20或1:5之效應目標(E:T)比）接種在96孔E盤中於目標細胞培養基中。使用所提供之RTCA Pro軟體在6至7內天追蹤細胞毒性，且係以細胞溶解%記述。表13顯示在164h時針對Hep3B細胞之代表終點細胞溶解%。顯示2個供體（供體1及供體2）之數據。如表12中所示，CAR T細胞之mAb1家族（親本mAb1及人源化mAb1-1至mAb1-5）具有較CAR之mAb2家族更高的特異性細胞溶解。 表13 ：細胞毒性判定
接種之目標細胞數目 10,000 10,000
目標細胞 Hep3B SkHep1
添加之(CAR) T細胞數目 500 2000
供體T細胞 供體1 供體2 供體1 供體2
簡稱 細胞溶解% SD 細胞溶解% SD 細胞溶解% SD 細胞溶解% SD
hmAb2-1 36.2 5.2 0.0 5.5 4.8 4.1 9.2 12.6
hmAb2-2 28.9 6.8 0.0 3.5 0.0 6.1 12.5 3.6
hmAb2-3 19.3 11.7 0.0 8.7 0.0 5.1 6.8 4.8
hmAb2-4 29.3 3.9 0.0 0.7 0.0 2.7 5.9 7.2
hmAb2-5 29.6 5.2 0.0 14.2 0.0 5.8 5.7 1.2
hmAb1-2 95.7 2.9 91.3 4.8 0.0 3.7 3.4 4.5
hmAb1-3 97.1 0.1 89.4 4.7 0.0 7.3 9.9 3.7
hmAb1-1 96.4 2.1 93.4 4.7 0.0 5.5 5.1 8.3
hmAb1-4 94.9 1.4 89.6 10.5 0.0 2.3 3.0 7.3
hmAb1-5 99.3 1.3 95.0 2.6 0.0 5.7 5.7 6.4
mmAb2 81.1 5.2 71.0 8.8 0.0 2.8 5.6 15.6
mmAb1 96.1 1.5 86.7 0.7 0.0 5.6 0.0 13.3
hYP7 86.2 16.8 46.9 10.0 0.0 0.2 0.3 8.1
NTD 0.0 12.5 0.0 4.8 0.0 5.5 0.0 10.0
實例6 人源化CAR 之流動式細胞測量術細胞毒性
藉由流動式細胞測量術進一步評估含有人源化CAR之T細胞之細胞毒性。細胞毒性係藉由檢定結束時的死目標細胞%（Hep3B、JHH5、K562-小鼠GPC3、K562-人類GPC5、K562親本、及SKHep1）測量。如實例2中所述製造CAR T細胞。對於此檢定，將100,000個經CellTrace Violet染色之目標細胞及100,000個CAR+ T細胞（或未經轉導(NTD)細胞）接種於U底96孔盤中且於目標細胞培養基中。在48h之後，將共培養物洗滌，並用抗體小組染色針對活力（Live/Dead近紅外）及T細胞標記CD3-BV786、CD8-FITC、CD69-PECy7 (Biolegend)、Myc-AF647 (Cell Signaling)進行染色，且在iQue流動式細胞儀(Intellicyt)上取得樣本。細胞毒性係測量為死目標%，其係藉由CellTrace Violet陽性CD3陰性細胞中之高LiveDead細胞之%評估。如表14中所示，基於流動式細胞測量術之細胞毒性檢定證實，人源化hmAb1 CAR T細胞較人源化基於mAb2之CAR T細胞對Hep3B及JHH5目標細胞更具細胞毒性。進一步觀察到，基於hmAb1之CAR T細胞較基於YP7之CAR T細胞更具特異性，後者展示對GPC5之輕微反應性。選擇mAb1以用於進一步評估。 表14 ：細胞毒性判定
簡稱 Hep3B JHH5 K562 2353-小鼠GPC3 K562 2355-人類GPC5 K562親本 SkHep1
hmAb2-1 65.8 28.9 24.2 16.2 26.0 27.1
hmAb2-2 70.8 41.3 23.6 16.9 25.2 31.0
hmAb2-3 75.9 35.8 21.6 16.6 27.5 27.6
hmAb2-4 73.7 47.1 22.5 17.3 28.4 30.3
hmAb2-5 71.7 46.1 25.5 15.3 29.3 30.0
hmAb1-2 89.4 75.7 48.3 18.2 35.3 32.0
hmAb1-3 89.9 72.6 50.5 16.3 27.4 28.9
hmAb1-1 91.1 76.6 53.9 17.7 30.6 33.8
hmAb1-4 89.8 73.4 52.7 16.4 29.1 27.3
hmAb1-5 90.5 76.7 52.9 18.5 30.4 33.4
mmAb2 86.7 68.2 48.5 15.2 26.2 30.1
mmAb1 89.1 72.0 50.7 17.9 30.6 45.8
hYP7 75.2 75.8 28.3 42.2 27.7 29.4
NTD 37.0 17.9 15.3 14.3 22.8 17.6
僅腫瘤 20.0 9.0 13.8 13.1 17.7 13.3
實例7 體內評估
如表15A至表15C及表16中所示，用各種CAR構築體轉導或未經轉導(UT)之T細胞係如上所述製造，並在NSG小鼠之Hep3B異種移植模型中進行體內測試。將2×10 6個Hep3B細胞再懸浮於25% Matrigel中，並在第0天植入NSG小鼠之高腋窩(high axilla)中。此後每三至四天，使用卡尺基於腫瘤寬度及長度測量腫瘤體積。在第14天，當腫瘤達到平均大小約為~150 mm 3時，將動物分成每組8隻小鼠（4隻用於媒劑對照），使得組之間的平均腫瘤體積相當，且用PBS媒劑或未經轉導之T細胞、或GPC3 CAR T細胞經由靜脈內注射以1 x10 6個CAR+ T細胞處理。藉由添加未經轉導細胞使T細胞輸注標準化，使得所有組之間的總T細胞劑量相等。藉由將腫瘤體積在二或更多個連續時間點降低至0之小鼠數目除以組中小鼠數目來計算完全反應百分比。在皮下Hep3B異種移植小鼠模型中，人源化mAb1-1 CAR較其他CAR（包括基於mAb2之CAR）更強效，因為其能夠降低腫瘤體積（表15A至表15C）並產生較其他所測試之CAR更完全的反應（表16）。 表15A ：治療對照
用媒劑(PBS)處理 用未經轉導之T細胞處理
腫瘤後天數 腫瘤體積(mm 3) 腫瘤體積(mm 3)
14 108 126 126 196 196 108 172 196 126 108 108 126
15 126 126 126 196 196 108 196 288 126 172 108 221
18 245 320 288 446 320 172 245 446 288 365 256 320
20 486 550 550 650 650 320 527 936 446 500 365 446
22 527 787 666 787 1008 405 787 1183 650 550 500 600
25 847 1268 1099 1008 1268 726 936 1470 1008 1099 864 1008
27 908 1470 1372 1352 1688 936 1008 1470 1268 1268 1099 1268
29 1224 1470 1688 1437 1800 1008 1080 1268 1568 1099 1268
32 2025 1800 2746 2025 2432 1470 2025 1470 2304
34 2176 2176 2304
表15B ：治療組
用1e6個YP7 CAR T細胞治療 用1e6個mAb1-1 CAR T細胞治療
腫瘤後天數 腫瘤體積(mm 3) 腫瘤體積(mm 3)
14 196 126 88 196 126 126 126 108 126 196 196 126 108 108 88 172
15 288 144 88 320 126 172 221 172 320 288 320 126 108 108 126 172
18 666 320 172 600 446 288 446 405 550 486 527 288 288 126 172 256
20 864 446 256 787 650 405 600 600 600 787 650 550 365 196 256 256
22 1183 600 500 1268 1080 600 787 787 600 847 908 600 550 288 405 405
25 864 221 75 650 446 126 288 365 787 1008 847 600 320 405 288
27 726 75 0 527 320 0 126 172 787 1268 847 600 221 256 108
29 936 0 0 384 108 0 108 108 787 1268 1268 288 196 196 75
32 936 0 0 384 0 0 108 63 1183 1666 1568 550 108 196 0
34 1268 0 0 700 0 0 172 63 1666 2025 2025 936 75 196 0
36 1568 0 0 700 0 0 172 63 1764 936 0 196 0
39 2176 0 0 847 0 0 256 196 2560 1470 0 108 0
41 0 0 908 0 0 256 288 1688 0 0 0
43 0 0 650 0 0 288 288 1800 0 0 0
46 100 0 446 0 88 405 288 2457 0 0 0
49 113 0 446 0 126 405 288 0 0 0
53 198 75 221 0 352 666 405 126 63 88
55 416 144 75 0 600 666 550 126 108 144
57 750 144 126 0 787 864 550 221 126 162
60 1224 320 172 0 787 1099 787 320 196 162
62 1521 405 172 0 1008 1183 936 352 221 270
64 1960 550 172 0 1268 1372 1183 384 288 384
67 2138 787 196 0 1568 1470 1568 700 405 567
69 1268 221 0 1764 1568 2176 847 550 800
71 1688 320 0 2432 2176 1470 787 1089
74 1913 320 0 1568 1008 1521
表15C ：治療組
用1e6個mAb1-5 CAR T細胞治療 用1e6個mAb2 CAR T細胞治療
腫瘤後天數 腫瘤體積(mm 3) 腫瘤體積(mm 3)
14 196 108 144 196 88 108 144 108 196 126 126 126 196 108 144 144
15 288 126 196 320 144 172 288 108 288 196 126 126 288 126 221 288
18 550 256 405 650 446 256 600 172 600 288 126 288 550 256 352 550
20 864 288 600 700 550 288 787 256 650 288 172 405 550 365 486 666
22 1372 550 864 1152 726 405 1008 256 1008 405 256 600 787 550 650 864
25 1372 600 864 1224 787 500 1183 365 1008 446 256 650 1008 666 787 1183
27 2048 650 1008 1764 847 666 1372 550 1183 446 365 787 1268 936 1352 1183
29 847 1470 2025 1080 864 1800 726 1352 600 550 1183 1568 1183 1800
32 1080 1268 1099 2176 1099 1666 787 864 1568 1800 1372 2457
34 1352 2048 2048 1372 2304 1008 1099 2176 2176 2048
36 1568 1688 1268 1372
39 2250 2457 2176
表16
完全反應%
用媒劑(PBS)處理 0
用未經轉導之T細胞處理 0
用1e6個YP7 CAR T細胞治療 50
用1e6個mAb1-1 CAR T細胞治療 37.5
用1e6個mAb1-5 CAR T細胞治療 0
用1e6個mAb2 CAR T細胞治療 0
實例8 CAR T + TGFβ 顯性負性受體
除CAR外，將慢病毒載體構築體工程改造以過度表現TGFβ受體2之截短版本，該版本不具有內部信號傳導域並作用為顯性負性TGFβ受體，且稱為TGFbDNR2。基於mAb1-1及YP7之CAR構築體兩者皆用此TGFbDNR2增強進行測試。如實例2中所述進行CAR-T細胞之製造。CAR T構築體在T細胞中表現良好（在製造結束時，60%與86%之間的CD3+ T細胞係CAR+；載體拷貝數值係在0.8與2之間）。（參見表17）。 表17
CAR+% 載體拷貝數
mAb1-1_DNR2 86 2.03
hYP7_DNR2 60.3 0.79
UTD 0.6 0
在xCELLigence檢定中評估對表現不同水平的GPC3之目標細胞的特異性細胞毒性，包括如實例2中所述之2個GPC3陰性細胞系。CAR T細胞展現出對GPC3表現性目標Hep3B及Huh7之細胞毒性。發現mAb1-1較基於YP7之CAR更具特異性，因為其對GPC3陰性目標細胞Hep3B-GPCKO及Sk-Hep1具有最小細胞溶解（表18）。 表18 ：細胞毒性
效應:目標比 高E:T 低E:T
接種之目標細胞數目 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000
目標細胞 Hep3B Huh7 Hep3B GPC3KO Sk-Hep1 Hep3B Huh7 Hep3B GPC3KO Sk-Hep1
添加之(CAR) T細胞數目 1,000 10,000 10,000 10,000 500 500 500 500
簡稱 細胞溶解%
mAb1-1_DNR2 100 100 10 1 99 44 0 0
hYP7_DNR2 100 100 100 100 100 31 95 3
未經轉導 4 0 9 0 2 0 2 0
目標 0 0 0 0 0 0 0 0
實例9 CAR T + TGFβ 顯性負性受體
在共培養檢定之後，評估TGFbDNR增強之GPC3特異性CAR T細胞之細胞介素分泌。將25,000個目標細胞及25,000個CAR+ T或未經轉導(UTD)細胞接種於平底96孔盤中且於目標細胞培養基中。在24h之後，收集上清液，稀釋50或2倍，且根據製造商之指示藉由Luminex平台及Milliplex MAP套組(EMD Millipore Sigma)測量IFNg。Hep3B細胞表現人類GPC3，而Hep3B-GPC3KO係GPC3陰性。對照「僅T細胞」係不存在目標之對照。用來自1個健康供體之細胞運行實驗。如表19中所示，IFNg濃度係以pg/mL記述。發現mAb1-1_DNR CAR較基於YP7_DNR之CAR更具特異性，因為其對GPC3陰性目標細胞Hep3B-GPC3KO及不存在目標下之IFNg分泌較少。 表19
簡稱 Hep3B Hep3B-GPC3KO 僅T細胞
UTD 30.5 30.5 30.5 30.5 30.5 30.5 7.5 7.8 8.1
mAb1-1_DNR 37710.3 39360.6 44536.0 59.2 30.5 30.5 38.6 30.6 45.5
hYP7_DNR 120842.8 105712.5 101816.5 77435.0 72569.6 66045.7 9805.2 9794.2 9903.2
實例10 體內CAR T + TGFβ 顯性負性受體
用基於mAb1-1_TGFbDNR之CAR構築體轉導或未經轉導(UT)之T細胞係由3個健康供體之白細胞分離術產生。接著如實例7中所述，在皮下Hep3B異種移植小鼠模型中測試T細胞：供體1在腫瘤植入後第19天，供體2及3在腫瘤植入後第17天；CAR T細胞劑量：供體1為2e6/小鼠，或供體2及3為1e6/小鼠；及UT細胞劑量：供體1為5e6 /小鼠，供體2為4e6/小鼠。
腫瘤體積追蹤（供體1為表20且供體2至3為表21）顯示mAb1-1-DNR CAR T細胞能夠在低劑量（2e6或1e6個CAR T細胞/小鼠）下有效地控制腫瘤生長。 表20
用5e6個UT T細胞-供體1處理 用2e6個mAb1-1-DNR CAR T細胞–供體1治療
腫瘤後天數 腫瘤體積(mm3) 腫瘤體積(mm3)
14 107 207 108 138 123 189 149 86 120 82 117 127 106 125 183 135 115 87 108 151
21 219 423 197 268 263 420 159 368 309 188 213 251 192 252 424 390 351 181 223 438
27 693 904 449 559 464 1036 849 295 619 400 200 198 362 311 580 600 252 186 295 547
30 868 1297 716 863 761 1350 982 472 861 725 170 96 133 256 610 497 150 40 274 448
34 1098 1934 986 1295 1108 1764 1421 693 1111 926 67 0 65 144 428 337 83 18 174 187
38 1600 2491 1263 1583 1495 2059 1652 878 1324 1205 79 8 51 80 531 271 63 18 174 121
42 2149 1558 2263 2026 2578 2306 1086 2176 2158 39 14 23 77 570 112 20 0 113 73
45 2123 1459 36 0 18 63 453 144 0 0 113 68
52 1495 0 0 0 108 274 141 0 0 0 75
56 0 0 0 126 172 150 0 0 0 0
59 0 0 0 0 63 144 0 0 0 0
表21
用4e6個UT T細胞-供體2處理 用1e6個mAb1-1-DNR CAR T細胞–供體2治療 用1e6個mAb1-1-DNR CAR T細胞–供體3治療
腫瘤後天數 腫瘤體積(mm3) 腫瘤體積(mm3) 腫瘤體積(mm3)
16 72 76 79 91 93 113 116 188 72 76 81 89 96 110 121 169 74 75 83 86 99 108 131 151
22 95 176 104 133 284 190 242 293 63 170 174 239 239 191 290 226 136 169 129 252 291 348 217 286
28 144 303 204 329 425 474 737 852 51 214 277 235 318 559 436 328 243 224 366 364 667 492 368 468
31 265 587 327 481 753 767 856 1144 0 155 250 145 290 419 392 396 256 492 363 458 757 215 436 459
35 426 816 392 814 1252 888 1136 1423 0 188 108 0 172 420 363 389 298 173 228 210 984 139 334 266
39 729 1330 538 1229 1885 1099 1159 2138 0 250 165 0 172 588 544 414 69 256 83 186 1498 83 415 314
42 1000 1570 709 1637 2312 1375 1283 0 237 229 0 243 545 564 451 163 263 63 83 1800 63 500 442
49 0 315 88 0 117 259 325 231 359 484 0 108 63 857 552
52 0 410 86 0 131 352 256 340 510 795 0 172 63 1022 805
56 0 337 18 0 65 86 112 70 598 932 0 0 69 1197 1051
58 14 285 14 0 63 81 86 69 0 172 93
62 0 225 0 0 0 0 72 85 0 194 227
66 0 262 0 0 0 0 63 81 451 438
實例11 在GPC3 低體內模型中之CAR T + TGFβ 顯性負性受體
產生用基於mAb1-1_TGFbDNR之CAR構築體轉導或未經轉導(UT)之T細胞。接著在皮下Huh7異種移植小鼠模型中測試T細胞。簡言之，用50% Matrigel製備5e6個Huh7腫瘤細胞，並在第0天將其植入NSG MHC_I及MHC-II雙重剔除小鼠之背側。在第10天，招募腫瘤體積在63與110 mm3之間的小鼠並分組分布，使得T細胞給藥時之平均腫瘤體積會是80 mm3。在第10天，小鼠接受總共1.57e7個總T細胞/小鼠，且在CAR T治療之小鼠中，此代表1e7個CAR T細胞/小鼠。亦追蹤其中小鼠接受PBS作為媒劑對照之對照組。
腫瘤體積追蹤（表22）顯示mAb1-1-DNR CAR T細胞能夠有效地控制GPC3低表現腫瘤細胞之腫瘤生長。 表22
用PBS處理 用1e7個匹配UT細胞處理 用1e7個mAb1-1-DNR CAR T細胞治療
腫瘤後天數 腫瘤體積(mm3) 腫瘤體積(mm3) 腫瘤體積(mm3)
7 70 70 70 71 71 71 72 72 73 73 73 74 74 74 75 76 77 77 79 80 82 83 83 83 85 88 90 94
14 85 70 218 111 86 111 63 70 93 108 83 72 76 131 83 63 108 205 307 154 175 203 130 127 398 189 120 144
19 141 63 699 578 91 411 83 135 174 235 129 108 91 411 117 69 99 397 499 300 262 225 275 137 573 426 141 403
21 256 75 868 721 74 292 186 261 319 396 295 183 118 717 186 108 127 598 677 350 270 267 377 196 660 432 164 449
25 776 224 1631 1423 138 613 441 515 578 518 599 519 548 969 405 219 318 1194 1310 198 281 180 211 137 609 286 144 230
30 1244 448 2378 2712 325 837 565 875 796 877 1081 1027 671 1932 598 387 596 1309 1719 63 176 63 108 108 278 147 75 113
33 1507 745 604 1088 614 1160 1185 1298 1476 1349 926 818 624 819 1621 2282 36 109 0 63 36 174 146 51 75
35 2304 1310 1016 1569 1183 1468 1856 1470 1806 1913 1186 1105 1028 1407 2016 32 0 0 0 18 137 282 63 63
39 1435 1684 1524 1738 1906 2772 1963 1783 1549 1430 1704 0 115 0 63 137 126 473 108 108
43 1724 2377 2202 2721 0 211 0 108 324 207 824 139 137
47 0 172 0 119 458 219 1195 173 213
50 0 108 0 224 832 460 1367 200 321
實例12 mAb1-1 之表位定位(Epitope Mapping)
mAb1-1之表位係藉由高質量基質輔助雷射脫附/離子化(MALDI)質譜(MS)分析判定。簡言之，使用具有專用偵測器（經設計以高靈敏度偵測大分子複合物）之Autoflex II MALDI飛行時間(ToF) ToF質譜儀(Bruker)，藉由高質量MALDI光譜法個別分析重組人類GPC3 (rhGPC3)及融合至鼠類IgG2A可結晶片段域之單鏈可變片段(scFv-Fc)。將樣本與芥子酸基質(10 mg/mL) 1:1稀釋並混合於乙腈:水(1:1, v/v)、TFA 0.1%（K200 MALDI套組）中，且點樣在MALDI盤(SCOUT 384)上。在室溫結晶之後，將樣本引入光譜儀分析。
將RhGPC3及mAb1-1 scFv與大量莫耳過量的scFv混合至GPC3，且接著用化學交聯劑之混合物交聯。將樣本與交聯試劑培養3小時。如上製備經交聯樣本並藉由高質量MALDI MS表徵。
接下來，使用一組蛋白酶（亦即胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Asp-N、彈性蛋白酶、及嗜熱菌蛋白酶）消化rhGPC3，且藉由nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS分析進行分析。分析所得肽。最後，使rhGPC3-scFv-Fc複合物藉由同一組蛋白酶經受多酶切割，且使用高解析液相層析質譜法(nLC-LTQ-Orbitrap MS)分析。在rhGPC3與mAb1-1 scFv-Fc之間識別出九種經交聯肽，其指示mAb1-1結合至rhGPC3上之表位，包括胺基酸Thr55、Lys68、Ser74、Arg75、Lys80、Thr84、Arg258、及Ser263，其中胺基酸位置編號與在UniProt資料庫中條目Q8IYG2之編號相同(Q8IYG2_HUMAN) (UniProt Consortium, 2021)。 實例13 mAb1-1 GPC3 親和力之測量
使用具有AMC生物感測器之Sartorius Octet Red96判定mAb1-1 scFv mFc與其目標結合之動力學常數。將mAb1-1 scFv-Fc稀釋至2ug/mL，並在攪動下捕捉至7個AMC生物感測器尖端上。一個生物感測器留空作為參考。兩批464.3、154.8、51.59、17.2、5.73、1.911、及0 nM的重組人類GPC3(Q25-H559)-6xHis (rhGPC3)係用作分析物。測量締合相90秒且測量解離120秒。藉由減去僅暴露於運行緩衝液之控制感測器，將所有測量針對基線漂移校正。使用Octet分析軟體，使用1:1交互作用模型對各分析物批次分開進行全域擬合來分析數據。
對於YP7 scFv mFc檢定，將YP7 scFv mFc捕捉至單一AMC生物感測器尖端上，且在單一500 nM濃度下評估與rhGPC3之結合。測量締合相90秒且測量解離120秒。使用1:1交互作用模型分析YP7之數據，使用單一濃度之個別擬合。
mAb1-1 scFv-Fc對rhGPC3批次1及2之KD值係各別判定為32.7及35.2nM。雖然此等值顯示良好的再現性，但擬合指示在所測量之交互作用中可能存在一些複雜結合。來自單一濃度的分析物，YP7對rhGPC3之KD值係8.73nM。 表23
scFv-Fc rhGPC3 K D(nM) k on(1/Ms) k off(1/s)
mAb1-1 批次1 32.7 2.18 E+05 7.12 E-03
批次2 35.2 2.23 E+05 7.85 E-03
YP7 批次2 8.73 7.73 E+04 6.75 E-04
實例14 mAb1-1 及YP7 與質膜上表現之脫靶蛋白質之結合
將mAb1-1及YP7 scFv-Fc針對與HEK293細胞個別表現之質膜蛋白質庫的結合進行篩選。將HEK293細胞以二重複反向轉染於微陣列載玻片上，微陣列載玻片上點有編碼ZsGreen之表現載體，接著係5484種人類質膜蛋白質或細胞表面繫鏈之分泌蛋白中之一者。額外的載玻片係與編碼371種異二聚體之載體共同排列。作為確保達到最小轉染水平之陽性對照，各載玻片以四重複包括用hEGFR-IRES-ZsGreen1反向轉染之細胞。將微陣列固定並用scFv及抗EGFR染色，且用螢光二級抗體偵測結合。在初始篩選中識別的主要命中在二次篩選中與額外對照一起被確認；將編碼初次命中之載體再排列並在新載玻片上的HEK293細胞中表現，且對固定及未固定之細胞執行篩選。兩個目標皆偵測到與GPC3之中強結合。偵測並確認YP7與CSPG5（異構體1及2）之脫靶弱結合。在二次篩選中及藉由經轉染HEK293細胞之流動式細胞測量術分析偵測並確認mAb1-1與CDH1之脫靶弱結合。 表24
樣本 基因ID 初次篩選（固定細胞） 確認篩選（固定細胞） 確認篩選（活細胞）
Rep 1 Rep 2 Rep 1 Rep 2
mAb1-1 (2 ug/ml) GPC3 強 強 強 強 強
CDH1 V.弱 V.弱 弱 弱 弱
YP7 (10 ug/ml) GPC3 強 中/強 中/強 中/強 N/A
CSPG5（異構體1） 弱 弱 弱 弱 N/A
CSPG5（異構體2） 弱 弱/中 弱 弱/中 N/A
實例15 mAb1-1 與正常人類組織之交叉反應性
使用冷凍切片之人類胎盤發展用mAb1-1 scFv-Fc（測試物品）偵測GPC3表現性組織之特異性染色的方法，Huh7及Hep3B細胞作為陽性對照且SK-HEP1細胞作為陰性對照。接著在來自至少3個供體之冷凍切片上以兩個濃度評估mAb1-1與一小組正常人類組織之結合。陰性對照包括不同特異性之小鼠單株IgG2a（對照物品）以及無染色試劑之條件（檢定對照）。作為陽性對照，將組織用與β 2-微球蛋白結合之多株兔抗體染色（組織驗證）。表25總結結果。mAb1-1不與正常健康組織中之細胞膜結合，除了已記述GPC3表現之胃中的基底黏膜上皮細胞外。 表25
組織 來源 運行 測試物品 (mAb1-1) 對照物品 (MsIgG2a) 檢定對照 組織驗證（組織染色）對照 組織註解/ 非特異性發現
2 µg/mL 0.5 µg/mL 2 µg/mL 0.5 µg/mL
陽性對照材料
Hep3B細胞之冷凍切片 CM1543-1 1,2,4 1-3+ (freq) 1-3+ (freq) Neg Neg Neg NS 兩個濃度的GS-1138451頻繁的陽性對照Hep3B細胞之弱至強膜及細胞質染色。任一濃度的MsIgG2a或在檢定對照載玻片中無陽性對照細胞之染色。
陰性對照材料
SK-HEP-1細胞之冷凍切片 CM1545-1 1,2,4 Neg Neg Neg Neg Neg NS 任一濃度的GS-1138451或MsIgG2a或在檢定對照載玻片中無陰性對照SK-HEP-1細胞之染色。
輔助對照材料
人類胎盤（滋養層）之冷凍切片 HT2652-1 1,2,4 1-3+ (occas) 1-2+ （罕見至occas） Neg Neg Neg NS 2 µg/mL GS-1138451偶爾的滋養層之弱至強膜及細胞質染色。0.5 µg/mL GS-1138451使染色降低至弱至中等且為罕見至偶爾。任一濃度的MsIgG2a或在檢定對照載玻片中無任何人類胎盤組織元素之染色。
Huh-7細胞之冷凍切片 CM1544-1 1,2,4 1-3+ (freq) 1-3+ （occas至freq） Neg Neg Neg NS 2 µg/mL GS-1138451頻繁的Huh-7細胞之弱至強膜及細胞質染色。0.5 µg/mL GS-1138451使染色頻率降低至偶爾至頻繁。任一濃度的MsIgG2a或在檢定對照載玻片中無Huh-7細胞之染色。
一般性註解：除非另有指明，否則所有組織樣品皆判斷為足以解釋。背景染色係由於不完全淬滅之內源性髓過氧化酶或針對個別組織所述之內源性/外源性色素。 載玻片係根據以下方案編號： 載玻片1 (mAb1-1, 2 µg/mL)、 載玻片2 (mAb1-1, 0.5 µg/mL)、 載玻片3 (MsIgG2a, 2 µg/mL)、 載玻片4 (MsIgG2a, 0.5 µg/mL)、 載玻片5（檢定對照[省略一級抗體]）、載玻片6（抗β 2-微球蛋白[組織染色對照]）。
腎上腺 HT 2342-2 1,3,4 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 運行1中之載玻片3中組織遺漏。在運行4中重複染色，且基於在運行4中染色之載玻片的評估進行解釋。
腎上腺 HT 2924-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
腎上腺 HT 2478-1 1,3,4 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 運行1中之載玻片3中組織遺漏。在運行4中重複染色，且基於在運行4中染色之載玻片的評估進行解釋。
膀胱（泌尿） HT 1316-3 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
膀胱（泌尿） HT 1328-4 1,3 NE NE NE NE NE NE 切片中不存在黏膜。組織記錄為未評估(NE)。在運行4中用HT 3128-1置換。
膀胱（泌尿） HT 3128-1 4,5 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 置換HT 1328-4。存在少量黏膜。載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
膀胱（泌尿） HT 1244-13 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
血球細胞 HT 3257 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 殘餘的內源性過氧化酶（顆粒球）。
血球細胞 HT 3014 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 殘餘的內源性過氧化酶（顆粒球）。載玻片4中之稀疏細胞性(cellularity)。
血球細胞 HT 3015 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 殘餘的內源性過氧化酶（顆粒球）。
血管（內皮） 所有組織 在個別組織下詳述
表1
骨髓 HT 2173-2 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中罕見至偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
骨髓 HT 2194-2 1,3,4 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 運行1中之載玻片1中無染色。在運行4中重複染色，且基於在運行4中染色之載玻片的評估進行解釋。
骨髓 HT 2207-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中罕見至偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
小腦 HT 3065-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
小腦 HT 2277-6 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
小腦 HT 2117-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
大腦皮質 HT 614-12 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1中偶爾至頻繁的細胞核染色、及載玻片2中罕見的細胞核染色。細胞核染色有時包括核膜。
大腦皮質 HT 3143-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
大腦皮質 HT 2297-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
子宮頸 HT 2970-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 外口。
子宮頸 HT 2974-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內口及子宮頸內腺體。多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。
子宮頸 HT 2910-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內口及子宮頸內腺體。
食道 HT 2110-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。載玻片1及2中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
食道 HT 2277-7 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
食道 HT 2580-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
眼睛 HT 3048-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 視網膜、脈絡膜、鞏膜。內源性黑色素。
眼睛 HT 2383-4 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 視網膜、脈絡膜、鞏膜。內源性黑色素。
眼睛 HT 3041-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 視網膜、脈絡膜、鞏膜、角膜、結膜。內源性黑色素。
輸卵管(fallopian tube/oviduct) HT 2974-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中黏膜中偶爾至頻繁的細胞核染色及基質細胞中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
輸卵管(fallopian tube/oviduct) HT 2573-1 1,3 M M M M M M 切片中不存在輸卵管。組織記錄為遺漏(M)。在運行4中用HT 2970-1置換。
輸卵管(fallopian tube/oviduct) HT 2970-1 4,5 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 置換HT 2573-1。載玻片1及2中黏膜中偶爾至頻繁的細胞核染色及基質細胞中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
輸卵管(fallopian tube/oviduct) HT 1953-1 1,3 M M M M M M 切片中不存在輸卵管。組織記錄為遺漏(M)。在運行4中用HT 2941-1置換。
輸卵管(fallopian tube/oviduct) HT 2941-1 4,5 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 置換HT 1953-1。載玻片1及2中黏膜中偶爾至頻繁的細胞核染色及基質細胞中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
心臟 HT 2791-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
心臟 HT 1270-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
心臟 HT 2789-2 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
腎臟（腎小球、腎小管） HT 2276-12 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中管腔內容物之非特異性染色；不排除解釋。
腎臟（腎小球、腎小管） HT 1188-6 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
腎臟（腎小球、腎小管） HT 2114-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
大腸（結腸） HT 2169-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
大腸（結腸） HT 2051-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
大腸（結腸） HT 2149-1 1,3 NE NE NE NE NE NE 切片中未充分表示黏膜。組織記錄為未評估(NE)。在運行4中用HT 2170-1置換。
大腸（結腸） HT 2170-1 4,5 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 置換HT 2149-1。多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
肝 HT 1243-9 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內源性膽汁/膽紅素色素。
肝 HT 3057-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內源性膽汁/膽紅素色素。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
肝 HT 3065-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內源性膽汁/膽紅素色素。載玻片1及2中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
淋巴結 HT 2182-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
淋巴結 HT 2165-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 小樣本；判斷為足夠。外源性碳顏料。
淋巴結 HT 2252-1 1,3 M M M M M M 切片中不存在淋巴結。組織記錄為遺漏(M)。在運行4中用HT 2406-1置換。
淋巴結 HT 2406-1 4,5 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 置換HT 2252-1。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。外源性碳顏料。載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
肺 HT 3056-1 1,3 Pos 外源性碳顏料。
上皮細胞、細支氣管（細胞質、細胞質顆粒） 1-2+ （罕見） 1+ （非常罕見） Neg Neg Neg
其他元素 Neg Neg Neg Neg Neg
肺 HT 3131-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 外源性碳顏料。載玻片1中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
肺 HT 3130-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 外源性碳顏料。載玻片1中偶爾至頻繁的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
乳腺（乳房） HT 2345-2 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中導管腺腔中胞外材料之輕微非特異性染色；不排除解釋。
乳腺（乳房） HT 654-6 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中導管腺腔中胞外材料之輕微非特異性染色；不排除解釋。
乳腺（乳房） HT 2349-4 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中導管腺腔中胞外材料之輕微非特異性染色；不排除解釋。
肌肉，橫紋（骨骼） HT 1909-11 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
肌肉，橫紋（骨骼） HT1974-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
肌肉，橫紋（骨骼） HT 1975-2 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 切片亦含有周邊神經。
神經，周邊 HT 3159-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
神經，周邊 HT 3147-1 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
神經，周邊 HT 1179-2 1,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 小樣本；判斷為足夠。
卵巢 HT 2431-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 小樣本；判斷為足夠。
卵巢 HT 2435-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
卵巢 HT 2443-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
胰臟 HT 2248-2 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中偶爾至頻繁的細胞核染色；判斷為不確定特異性
胰臟 HT 2049-2 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
胰臟 HT 2039-2 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中偶爾的腺泡上皮細胞之細胞質之非特異性染色；阻礙但不排除解釋。載玻片1中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
胎盤 HT 2919-1 2,3 Pos 無組織註解。
滋養層（膜、細胞質） 1-3+ (occas) 1-3+ （罕見） Neg Neg Neg
其他元素 Neg Neg Neg Neg Neg
胎盤 HT 2392-1 2,3 Pos 無組織註解。
滋養層（膜、細胞質） 1-3+ (freq) 1-3+ （occas至freq） Neg Neg Neg
其他元素 Neg Neg Neg Neg Neg
胎盤 HT 1702-1 2,3 Pos 無組織註解。
滋養層（膜、細胞質） 1-3+ (occas) 1-3+ （罕見至occas） Neg Neg Neg
其他元素 Neg Neg Neg Neg Neg
前列腺 HT 562-7 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
前列腺 HT 1730-3 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
前列腺 HT 1926-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
垂體 HT 3112-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 腺垂體。載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
垂體 HT 3114-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 腺垂體及神經垂體。載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
垂體 HT 3199-1 2,3 Pos 腺垂體及神經垂體。
上皮細胞、腺垂體（細胞質） 1-3+ （罕見至occas） 1-3+ （罕見至occas） Neg Neg Neg
其他元素 Neg Neg Neg Neg Neg
副甲狀腺 HT 3012-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
副甲狀腺 HT 3153-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
副甲狀腺 HT 3152-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
唾液腺 HT 3061-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 來自組織標記墨水之外源性色素。
唾液腺 HT 3057-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
唾液腺 HT 1226-6 2,3 M M M M M M 切片中不存在唾液腺。組織記錄為遺漏(M)。在運行4中用HT 2297-1置換。
唾液腺 HT 2297-1 4,5 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 置換HT 1226-6。載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
皮膚 HT 2842-3 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
皮膚 HT 2930-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內源性黑色素。
皮膚 HT 2936-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內源性黑色素。
小腸 HT 2965-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
小腸 HT 2662-1 2,3 NE NE NE NE NE NE 切片中不存在黏膜。組織記錄為未評估(NE)。在運行4中用HT 2859-1置換。
小腸 HT 2859-1 4,5 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 置換HT 2662-1。多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
小腸 HT 2697-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。載玻片1及2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
脾臟 HT 1910-11 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。載玻片1中偶爾至頻繁的細胞核染色、及載玻片2中偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
脾臟 HT 2342-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
脾臟 HT 2336-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。載玻片1及2中罕見至偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
脊髓 HT 1047-3 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內源性黑色素。載玻片1及2中罕見至偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。細胞核染色有時包括核膜。
脊髓 HT 2118-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1中偶爾至頻繁的細胞核染色、及載玻片2中罕見至偶爾的細胞核染色；判斷為不確定特異性。細胞核染色有時包括核膜。
脊髓 HT 2884-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中偶爾至頻繁的細胞核染色；判斷為不確定特異性。細胞核染色有時包括核膜。
胃 HT 2939-1 2,3 Pos 樣本僅由黏膜所組成。多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。
上皮細胞、黏膜（基底膜、基底細胞質） 1-2+ （罕見至occas） 1-2+ （罕見） Neg Neg Neg
其他元素 Neg Neg Neg Neg Neg
胃 HT 3162-1 2,3,4 Pos 運行2中之載玻片1中無染色。在運行4中重複染色，且基於在運行4中染色之載玻片的評估進行解釋。
上皮細胞、黏膜（基底膜、基底細胞質） 1-2+ （罕見至occas） 1-2+ （罕見） Neg Neg Neg
其他元素 Neg Neg Neg Neg Neg
胃 HT 3018-1 2,3 Pos 多個載玻片中黏液之非特異性染色；不排除解釋。
上皮細胞、黏膜（基底膜、基底細胞質） 1-2+ （罕見至occas） 1-2+ （罕見至occas） Neg Neg Neg
其他元素 Neg Neg Neg Neg Neg
睪丸 HT 1316-3 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
睪丸 HT 2276-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
睪丸 HT 3064-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
甲狀腺 HT 682-4A 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
甲狀腺 HT 483 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
甲狀腺 HT 478 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1及2中頻繁的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
胸腺 HT 1405-3 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中哈氏小體之輕微非特異性染色；不排除解釋。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
胸腺 HT 1495-12 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
胸腺 HT 1404-3 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 多個載玻片中哈氏小體之輕微非特異性染色；不排除解釋。殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
扁桃腺 HT 2962-2 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
扁桃腺 HT 3122-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 殘餘的內源性過氧化酶（罕見的常駐白血球）。
扁桃腺 HT 3171-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內源性血紅素。
輸尿管 HT 2765-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
輸尿管 HT 2726-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
輸尿管 HT 1763-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 內源性血紅素。載玻片1中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
表2
子宮（子宮內膜） HT 3075-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
子宮（子宮內膜） HT 2910-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 載玻片1中罕見的細胞核染色；判斷為不確定特異性。
子宮（子宮內膜） HT 3074-1 2,3 Neg Neg Neg Neg Neg Pos 無組織註解。
± =模棱兩可，1+ =弱，2+ =中等，3+ =強，4+ =強烈，Neg =陰性，Pos =陽性，M =遺漏，NE =未評估，NS =未染色，occas =偶爾，freq =頻繁。包括頻率調節劑以提供在該位置處之該細胞類型或組織元素之預期數目的近似百分比染色。染色細胞之頻率係識別如下：非常罕見（＜1%的特定細胞類型之細胞）；罕見（1至5%的特定細胞類型之細胞）；罕見至偶爾（＞5至25%的特定細胞類型之細胞）；偶爾（＞25至50%的特定類型之細胞）；偶爾至頻繁（＞50至75%的特定細胞類型之細胞）；頻繁（＞75至100%的特定細胞類型之細胞）。
通常而言，在以下申請專利範圍中，所使用之用語不應被解讀為將申請專利範圍限制為本說明書及申請專利範圍中所揭示之具體實施例，但應被解讀為包括所有可能實施例連同此類申請專利範圍享有的等效物之完整範疇。因此，申請專利範圍不受本揭露限制。
 

          <![CDATA[<110> 美商凱特製藥公司(KITE PHARMA, INC.)]]>
          <![CDATA[<120> GPC3結合分子]]>
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          肽
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          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 3]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 357]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 4]]>
          caagtccaac tggtgcagtc cggagccgag gtcaagaagc ccggagccag cgtgaaagtc       60
          tcatgtaaaa ccagcggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagcc      120
          cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atctaccccg gctccggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggtcg tgtgaccatg acagccgaca ccagcacctc caccgcctac      240
          atggaactgt cctctctgcg ttctgaggac acagccgttt actactgcgc cagaggcaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaacat tagtgaccgt gtcctcc         357
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Asp Tyr Tyr Ile His 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 8]]>
          Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 16]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 9]]>
          Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Tyr Pro Gly Ser Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 112]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 
                          85                  90                  95      
          Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 336]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 15]]>
          gacatcgtca tgacccagag ccccgattct ttagccgtgt ctttaggcga aagagtgacc       60
          atgaactgca agtccagcca gtctttactg aattccggca ctcgaaaaaa ctatttagct      120
          tggtaccagc agaaacccgg ccagccccct aagctgctga tctactgggc tagcattcga      180
          gaatccggcg tgcccgatcg ctttagcggc agcggtagcg gcaccgactt tactttaacc      240
          atcagcagcg tgcaagctga ggacgtggct gtgtactatt gcaagcagtc ctactcttta      300
          tacaccttcg gccaaggaac aaagctggag atcaag                                336
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 17]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說]]>明：合成
          肽
          <![CDATA[<400> 18]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 3]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Trp Ala Ser 
          1           
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 21]]>
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 23]]>
          Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 24]]>
          Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 249]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 25]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                          245                 
          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<211> 747]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 26]]>
          caagtccaac tggtgcagtc cggagccgag gtcaagaagc ccggagccag cgtgaaagtc       60
          tcatgtaaaa ccagcggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagcc      120
          cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atctaccccg gctccggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggtcg tgtgaccatg acagccgaca ccagcacctc caccgcctac      240
          atggaactgt cctctctgcg ttctgaggac acagccgttt actactgcgc cagaggcaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaacat tagtgaccgt gtcctccgga      360
          tccacatccg gcagcggaaa gcccggtagc ggcgagggca gcaccaaagg agacatcgtc      420
          atgacccaga gccccgattc tttagccgtg tctttaggcg aaagagtgac catgaactgc      480
          aagtccagcc agtctttact gaattccggc actcgaaaaa actatttagc ttggtaccag      540
          cagaaacccg gccagccccc taagctgctg atctactggg ctagcattcg agaatccggc      600
          gtgcccgatc gctttagcgg cagcggtagc ggcaccgact ttactttaac catcagcagc      660
          gtgcaagctg aggacgtggc tgtgtactat tgcaagcagt cctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga gatcaag                                          747
          <![CDATA[<210> 27]]>
          <![CDATA[<211> 119]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 27]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<211> 357]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 28]]>
          caagttcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaaaaagc ccggcgccag cgtgaaagtc       60
          tcatgcaagg ccagcggcta taccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atctaccccg gcagcggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgtgaccatg actcgtgaca cctccacctc caccgtgtat      240
          atggagctga gctctttaag gtccgaggat accgctgtgt actactgcgc cagaggaaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaacat tagtgaccgt cagctcc         357
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          多肽
          <![CDATA[<400> 29]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 
                          85                  90                  95      
          Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
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          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 30]]>
          gacatcgtga tgacccagag ccccgattct ttagctgtgt ctttaggcga gagagccacc       60
          atcaactgca agtcctccca gagcttatta aatagcggca ctcgaaaaaa ctatttagct      120
          tggtaccaac agaagcccgg ccagcccccc aagctgctca tctactgggc ttccatcaga      180
          gagagcggcg tgcccgatag attcagcggc agcggctccg gcacagactt cactttaacc      240
          atctcctctt tacaagctga ggacgtggcc gtgtattact gcaagcagtc ctactcttta      300
          tacaccttcg gccaaggaac aaagctggag atcaaa                                336
          <![CDATA[<210> 31]]>
          <![CDATA[<211> 249]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          多肽
          <![CDATA[<400> 31]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 
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          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                          245                 
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          多核苷酸
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          caagttcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaaaaagc ccggcgccag cgtgaaagtc       60
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          atggagctga gctctttaag gtccgaggat accgctgtgt actactgcgc cagaggaaac      300
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          tccacaagcg gatccggcaa acccggtagc ggcgaaggca gcaccaaggg cgacatcgtg      420
          atgacccaga gccccgattc tttagctgtg tctttaggcg agagagccac catcaactgc      480
          aagtcctccc agagcttatt aaatagcggc actcgaaaaa actatttagc ttggtaccaa      540
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          ttacaagctg aggacgtggc cgtgtattac tgcaagcagt cctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga gatcaaa                                          747
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
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          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
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          多核苷酸
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          caagttcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaaaaagc ccggcgccag cgtgaaagtc       60
          tcatgcaaga cctccggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggccaag gtctggagtg gatgggcgag atctaccccg gctccggcaa cacctattac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgtgaccatg acagccgaca cctccaccag caccgcctac      240
          atggaactga gcagcttacg tagcgaggac accgctgtgt actactgcgc tcgtggcaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaactc tggtgaccgt gtcctcc         357
          <![CDATA[<210> 35]]>
          <![CDATA[<211> 112]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 35]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 
                          85                  90                  95      
          Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210> 36]]>
          <![CDATA[<211> 336]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 36]]>
          gacatcgtga tgacccagtc ccccgattct ttagccgtca gccttggaga gagagccacc       60
          atcaactgca agagcagcca gagcttatta aactccggca ctcgaaaaaa ctacctcgct      120
          tggtaccagc agaagcccgg tcagccccct aagctgctga tctactgggc cagcattcgt      180
          gagagcggag tgcccgacag atttagcggc tccggcagcg gcaccgattt cactttaacc      240
          atcagctctt tacaagctga ggatgtggcc gtgtattact gcaagcagtc ctactcttta      300
          tacaccttcg gccaaggaac aaagctggag attaag                                336
          <![CDATA[<210> 37]]>
          <![CDATA[<211> 249]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 37]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                          245                 
          <![CDATA[<210> 38]]>
          <![CDATA[<211> 747]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<40]]>0> 38]]&gt;
          <br/><![CDATA[caagttcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaaaaagc ccggcgccag cgtgaaagtc       60
          tcatgcaaga cctccggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggccaag gtctggagtg gatgggcgag atctaccccg gctccggcaa cacctattac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgtgaccatg acagccgaca cctccaccag caccgcctac      240
          atggaactga gcagcttacg tagcgaggac accgctgtgt actactgcgc tcgtggcaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaactc tggtgaccgt gtcctccgga      360
          agcacctccg gaagcggcaa gcccggtagc ggcgaaggat ccaccaaggg cgacatcgtg      420
          atgacccagt cccccgattc tttagccgtc agccttggag agagagccac catcaactgc      480
          aagagcagcc agagcttatt aaactccggc actcgaaaaa actacctcgc ttggtaccag      540
          cagaagcccg gtcagccccc taagctgctg atctactggg ccagcattcg tgagagcgga      600
          gtgcccgaca gatttagcgg ctccggcagc ggcaccgatt tcactttaac catcagctct      660
          ttacaagctg aggatgtggc cgtgtattac tgcaagcagt cctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga gattaag                                          747
          <![CDATA[<210> 39]]>
          <![CDATA[<211> 119]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 39]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210> 40]]>
          <![CDATA[<211> 357]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 40]]>
          caagttcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ccggtgcctc cgtgaaggtg       60
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          gcccagaagt tccaaggacg tgccacttta accgctgaca ccagcaccag caccgcctac      240
          atggagttct cctctttaag gagcgaggac accgccgtgt attactgcgc tcgtggcaac      300
          gactatgacg cttggttcgt gtactggggt caaggaacat tagtgacagt gagcagc         357
          <![CDATA[<210> 41]]>
          <![CDATA[<211> 112]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 41]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 
                          85                  90                  95      
          Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
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          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 42]]>
          gacatcgtga tgacccagag ccccgattct ttagctgtga gccttggaga gagggccacc       60
          atcaactgca agtcctccca gtctttactg aacagcggca ctcgaaaaaa ctatttagct      120
          tggtaccagc agaaacccgg ccagccccct aagctgctga tctactgggc ctccattcgt      180
          gaaagcggcg tgcccgatag attcagcggc agcggctccg gaaccgactt tactttaacc      240
          atctcctctt tacaagctga ggacgtggct gtgtactact gcaagcagag ctactcttta      300
          tacaccttcg gccaaggaac aaagctggaa atcaag                                336
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 43]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
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                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                          245                 
          <![CDATA[<210> 44]]>
          <![CDATA[<211> 747]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 44]]>
          caagttcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ccggtgcctc cgtgaaggtg       60
          tcttgtaaga ccagcggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggtcaag gtttagagtg gattggcgag atctatcccg gcagcggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgccacttta accgctgaca ccagcaccag caccgcctac      240
          atggagttct cctctttaag gagcgaggac accgccgtgt attactgcgc tcgtggcaac      300
          gactatgacg cttggttcgt gtactggggt caaggaacat tagtgacagt gagcagcgga      360
          tccaccagcg gatccggcaa gcccggtagc ggagaaggca gcaccaaggg cgacatcgtg      420
          atgacccaga gccccgattc tttagctgtg agccttggag agagggccac catcaactgc      480
          aagtcctccc agtctttact gaacagcggc actcgaaaaa actatttagc ttggtaccag      540
          cagaaacccg gccagccccc taagctgctg atctactggg cctccattcg tgaaagcggc      600
          gtgcccgata gattcagcgg cagcggctcc ggaaccgact ttactttaac catctcctct      660
          ttacaagctg aggacgtggc tgtgtactac tgcaagcaga gctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga aatcaag                                          747
          <![CDATA[<210> 45]]>
          <![CDATA[<211> 119]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 45]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210> 46]]>
          <![CDATA[<211> 357]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 46]]>
          caagttcagc tggtccagag cggcgctgaa gtgaagaagc ccggcgctag cgtcaaagtc       60
          tcatgcaaaa cctccggcta cacctttacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggtcaag gtctggagtg gatcggcgag atctaccccg gcagcggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgccacttta accgctgaca ccagcacctc caccgcctac      240
          atggagttca gctctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtggcaac      300
          gattacgacg cttggttcgt gtactgggga caaggaacat tagtgaccgt gtccagc         357
          <![CDATA[<210> 47]]>
          <![CDATA[<211> 112]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 47]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 
                          85                  90                  95      
          Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210> 48]]>
          <![CDATA[<211> 336]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 48]]>
          gatatcgtga tgacccagag ccccgattct ttagccgtgt ctttaggaga gagagtgacc       60
          atgaactgca agagcagcca gtctttactg aacagcggca ccagaaagaa ctatttagct      120
          tggtaccagc agaagcccgg ccagcctccc aagctgctga tctactgggc cagcattcgt      180
          gagagcggag tgcccgacag attcagcggc agcggctccg gcaccgactt tactttaacc      240
          atcagcagcg tgcaagctga ggatgtggcc gtgtattact gcaagcagtc ctactcttta      300
          tacacctttg gccaaggaac aaagctggag atcaaa                                336
          <![CDATA[<210> 49]]>
          <![CDATA[<211> 249]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 49]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                          245                 
          <![CDATA[<210> 50]]>
          <![CDATA[<211> 747]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213>]]> 人工序列
          <![CDATA[<220>]]>
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          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 50]]>
          caagttcagc tggtccagag cggcgctgaa gtgaagaagc ccggcgctag cgtcaaagtc       60
          tcatgcaaaa cctccggcta cacctttacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggtcaag gtctggagtg gatcggcgag atctaccccg gcagcggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgccacttta accgctgaca ccagcacctc caccgcctac      240
          atggagttca gctctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtggcaac      300
          gattacgacg cttggttcgt gtactgggga caaggaacat tagtgaccgt gtccagcggc      360
          agcacaagcg gaagcggcaa gcccggtagc ggcgagggaa gcaccaaggg cgatatcgtg      420
          atgacccaga gccccgattc tttagccgtg tctttaggag agagagtgac catgaactgc      480
          aagagcagcc agtctttact gaacagcggc accagaaaga actatttagc ttggtaccag      540
          cagaagcccg gccagcctcc caagctgctg atctactggg ccagcattcg tgagagcgga      600
          gtgcccgaca gattcagcgg cagcggctcc ggcaccgact ttactttaac catcagcagc      660
          gtgcaagctg aggatgtggc cgtgtattac tgcaagcagt cctactcttt atacaccttt      720
          ggccaaggaa caaagctgga gatcaaa                                          747
          <![CDATA[<210> 51]]>
          <![CDATA[<211> 2]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          肽
          <![CDATA[<400> ]]>51
          Gly Ser 
          1       
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          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 52]]>
          ggatcc                                                                   6
          <![CDATA[<210> 53]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 53]]>
          gggtcc                                                                   6
          <![CDATA[<210> 54]]>
          <![CDATA[<211> 3]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 54]]>
          Gly Ser Gly 
          1           
          <![CDATA[<210> 55]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 55]]>
          ggctctgga                                                                9
          <![CDATA[<210> 56]]>
          <![CDATA[<211> 8]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人]]>工序列
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 56]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210> 57]]>
          <![CDATA[<400> 57]]>
          000
          <![CDATA[<210> 58]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 58]]>
          ggcggtggaa gcggaggagg ttcc                                              24
          <![CDATA[<210> 59]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 59]]>
          Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 
          1               5                   10                  15      
          Lys Gly 
          <![CDATA[<210> 60]]>
          <![CDATA[<211> 54]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 60]]>
          ggatccacat ccggcagcgg aaagcccggt agcggcgagg gcagcaccaa agga             54
          <![CDATA[<210> 61]]>
          <![CDATA[<211> 54]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 61]]>
          ggctccacaa gcggatccgg caaacccggt agcggcgaag gcagcaccaa gggc             54
          <![CDATA[<210> 62]]>
          <![CDATA[<211> 54]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 62]]>
          ggaagcacct ccggaagcgg caagcccggt agcggcgaag gatccaccaa gggc             54
          <![CDATA[<210> 63]]>
          <![CDATA[<211> 54]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 63]]>
          ggatccacca gcggatccgg caagcccggt agcggagaag gcagcaccaa gggc             54
          <![CDATA[<210> 64]]>
          <![CDATA[<211> 54]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 64]]>
          ggcagcacaa gcggaagcgg caagcccggt agcggcgagg gaagcaccaa gggc             54
          <![CDATA[<210> 65]]>
          <![CDATA[<211> 45]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說]]>明：合成
          多肽
          <![CDATA[<400> 65]]>
          Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 
                  35                  40                  45  
          <![CDATA[<210> 66]]>
          <![CDATA[<211> 135]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 66]]>
          accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcaacccctg       60
          tccctgcgcc ccgaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg      120
          gacttcgcct gtgat                                                       135
          <![CDATA[<210> 67]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 67]]>
          Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 68]]>
          <![CDATA[<211> 90]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 68]]>
          ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca       60
          agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc                                        90
          <![CDATA[<210> 69]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 69]]>
          Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 
                      20                  
          <![CDATA[<210> 70]]>
          <![CDATA[<211> 72]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 70]]>
          atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc       60
          accctttatt gc                                                           72
          <![CDATA[<210> 71]]>
          <![CDATA[<211> 27]]>
          <![CDATA[<212>]]> PRT
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 71]]>
          Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210> 72]]>
          <![CDATA[<211> 81]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 72]]>
          ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg       60
          gcctttatta ttttctgggt g                                                 81
          <![CDATA[<210> 73]]>
          <![CDATA[<211> 113]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 73]]>
          Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 
                      100                 105                 110         
          Arg 
          <![CDATA[<210> 74]]>
          <![CDATA[<211> 339]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 74]]>
          ttgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcct atcagcaagg ccagaaccag       60
          ctctataacg agctcaattt agggcgaaga gaggagtacg atgttttgga caagaggcgt      120
          ggccgggacc ccgaaatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcttgtac      180
          aatgaattgc agaaggataa gatggcggag gcatacagtg agattgggat gaaaggcgag      240
          cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt tatcagggtc tcagtacagc caccaaggac      300
          acctacgacg cccttcacat gcaagccctg ccccctcgc                             339
          <![CDATA[<210> 75]]>
          <![CDATA[<211> 40]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 75]]>
          Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 
          1               5                   10                  15      
          Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 
                      20                  25                  30          
          Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 
                  35                  40  
          <![CDATA[<210> 76]]>
          <![CDATA[<211> 123]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 76]]>
          aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa       60
          actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt      120
          gaa                                                                    123
          <![CDATA[<210> 77]]>
          <![CDATA[<211> 41]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 77]]>
          Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 
          1               5                   10                  15      
          Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 
                      20                  25                  30          
          Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 
                  35                  40      
          <![CDATA[<210> 78]]>
          <![CDATA[<211> 123]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 78]]>
          aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc       60
          gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc      120
          tcc                                                                    123
          <![CDATA[<210> 79]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 79]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro 
                      20          
          <![CDATA[<210> 80]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213>]]> 人工序列
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 80]]>
          Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser 
          <![CDATA[<210> 81]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 81]]>
          Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          His Ala Ala Arg Pro 
                      20      
          <![CDATA[<210> 82]]>
          <![CDATA[<211> 66]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 82]]>
          atgctgttat tagtgacctc tttactgctg tgtgagctgc cccaccccgc tttcctcctc       60
          atcccg                                                                  66
          <![CDATA[<210> 83]]>
          <![CDATA[<211> 1422]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 83]]>
          caagttcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaaaaagc ccggcgccag cgtgaaagtc       60
          tcatgcaagg ccagcggcta taccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atctaccccg gcagcggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgtgaccatg actcgtgaca cctccacctc caccgtgtat      240
          atggagctga gctctttaag gtccgaggat accgctgtgt actactgcgc cagaggaaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaacat tagtgaccgt cagctccggc      360
          tccacaagcg gatccggcaa acccggtagc ggcgaaggca gcaccaaggg cgacatcgtg      420
          atgacccaga gccccgattc tttagctgtg tctttaggcg agagagccac catcaactgc      480
          aagtcctccc agagcttatt aaatagcggc actcgaaaaa actatttagc ttggtaccaa      540
          cagaagcccg gccagccccc caagctgctc atctactggg cttccatcag agagagcggc      600
          gtgcccgata gattcagcgg cagcggctcc ggcacagact tcactttaac catctcctct      660
          ttacaagctg aggacgtggc cgtgtattac tgcaagcagt cctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga gatcaaaggg tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca      780
          acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca      840
          gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg      900
          gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc      960
          aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa     1020
          actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt     1080
          gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac     1140
          cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagagg     1200
          cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg     1260
          tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc     1320
          gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag     1380
          gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc                        1422
          <![CDATA[<210> 84]]>
          <![CDATA[<211> 474]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 84]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 
                  275                 280                 285             
          Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
                          325                 330                 335     
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 
                  355                 360                 365             
          Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 
              370                 375                 380                 
          Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 
                          405                 410                 415     
          Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 
                  435                 440                 445             
          Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 
              450                 455                 460                 
          Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
          465                 470                 
          <![CDATA[<210> 85]]>
          <![CDATA[<211> 1422]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 85]]>
          caagttcagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaaaaagc ccggcgccag cgtgaaagtc       60
          tcatgcaaga cctccggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggccaag gtctggagtg gatgggcgag atctaccccg gctccggcaa cacctattac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgtgaccatg acagccgaca cctccaccag caccgcctac      240
          atggaactga gcagcttacg tagcgaggac accgctgtgt actactgcgc tcgtggcaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaactc tggtgaccgt gtcctccgga      360
          agcacctccg gaagcggcaa gcccggtagc ggcgaaggat ccaccaaggg cgacatcgtg      420
          atgacccagt cccccgattc tttagccgtc agccttggag agagagccac catcaactgc      480
          aagagcagcc agagcttatt aaactccggc actcgaaaaa actacctcgc ttggtaccag      540
          cagaagcccg gtcagccccc taagctgctg atctactggg ccagcattcg tgagagcgga      600
          gtgcccgaca gatttagcgg ctccggcagc ggcaccgatt tcactttaac catcagctct      660
          ttacaagctg aggatgtggc cgtgtattac tgcaagcagt cctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga gattaagggg tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca      780
          acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca      840
          gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg      900
          gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc      960
          aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa     1020
          actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt     1080
          gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac     1140
          cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagagg     1200
          cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg     1260
          tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc     1320
          gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag     1380
          gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc                        1422
          <![CDATA[<210> 86]]>
          <![CDATA[<211> 474]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 86]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 
                  275                 280                 285             
          Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
                          325                 330                 335     
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 
                  355                 360                 365             
          Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 
              370                 375                 380                 
          Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 
                          405                 410                 415     
          Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 
                  435                 440                 445             
          Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 
              450                 455                 460                 
          Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
          465                 470                 
          <![CDATA[<210> 87]]>
          <![CDATA[<211> 1422]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 87]]>
          caagttcagc tggtgcagtc cggagccgag gtcaagaagc ccggagccag cgtgaaagtc       60
          tcatgtaaaa ccagcggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagcc      120
          cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atctaccccg gctccggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggtcg tgtgaccatg acagccgaca ccagcacctc caccgcctac      240
          atggaactgt cctctctgcg ttctgaggac acagccgttt actactgcgc cagaggcaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaacat tagtgaccgt gtcctccgga      360
          tccacatccg gcagcggaaa gcccggtagc ggcgagggca gcaccaaagg agacatcgtc      420
          atgacccaga gccccgattc tttagccgtg tctttaggcg aaagagtgac catgaactgc      480
          aagtccagcc agtctttact gaattccggc actcgaaaaa actatttagc ttggtaccag      540
          cagaaacccg gccagccccc taagctgctg atctactggg ctagcattcg agaatccggc      600
          gtgcccgatc gctttagcgg cagcggtagc ggcaccgact ttactttaac catcagcagc      660
          gtgcaagctg aggacgtggc tgtgtactat tgcaagcagt cctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga gatcaagggg tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca      780
          acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca      840
          gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg      900
          gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc      960
          aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa     1020
          actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt     1080
          gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac     1140
          cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagagg     1200
          cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg     1260
          tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc     1320
          gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag     1380
          gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc                        1422
          <![CDATA[<210> 88]]>
          <![CDATA[<211> 474]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 88]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 
                  275                 280                 285             
          Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
                          325                 330                 335     
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 
                  355                 360                 365             
          Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 
              370                 375                 380                 
          Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 
                          405                 410                 415     
          Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 
                  435                 440                 445             
          Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 
              450                 455                 460                 
          Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
          465                 470                 
          <![CDATA[<210> 89]]>
          <![CDATA[<211> 1422]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 89]]>
          caagttcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ccggtgcctc cgtgaaggtg       60
          tcttgtaaga ccagcggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggtcaag gtttagagtg gattggcgag atctatcccg gcagcggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgccacttta accgctgaca ccagcaccag caccgcctac      240
          atggagttct cctctttaag gagcgaggac accgccgtgt attactgcgc tcgtggcaac      300
          gactatgacg cttggttcgt gtactggggt caaggaacat tagtgacagt gagcagcgga      360
          tccaccagcg gatccggcaa gcccggtagc ggagaaggca gcaccaaggg cgacatcgtg      420
          atgacccaga gccccgattc tttagctgtg agccttggag agagggccac catcaactgc      480
          aagtcctccc agtctttact gaacagcggc actcgaaaaa actatttagc ttggtaccag      540
          cagaaacccg gccagccccc taagctgctg atctactggg cctccattcg tgaaagcggc      600
          gtgcccgata gattcagcgg cagcggctcc ggaaccgact ttactttaac catctcctct      660
          ttacaagctg aggacgtggc tgtgtactac tgcaagcaga gctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga aatcaagggg tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca      780
          acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca      840
          gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg      900
          gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc      960
          aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa     1020
          actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt     1080
          gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac     1140
          cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagagg     1200
          cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg     1260
          tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc     1320
          gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag     1380
          gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc                        1422
          <![CDATA[<210> 90]]>
          <![CDATA[<211> 473]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 90]]>
          Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 
                  35                  40                  45              
          Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 
                      180                 185                 190         
          Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 
              210                 215                 220                 
          Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro 
                          245                 250                 255     
          Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 
                  275                 280                 285             
          Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 
              290                 295                 300                 
          Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 
                          325                 330                 335     
          Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 
                      340                 345                 350         
          Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 
                  355                 360                 365             
          Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 
              370                 375                 380                 
          Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 
                          405                 410                 415     
          Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 
                      420                 425                 430         
          Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 
                  435                 440                 445             
          Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 
              450                 455                 460                 
          Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
          465                 470             
          <![CDATA[<210> 91]]>
          <![CDATA[<211> 1422]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 91]]>
          caagttcagc tggtccagag cggcgctgaa gtgaagaagc ccggcgctag cgtcaaagtc       60
          tcatgcaaaa cctccggcta cacctttacc gactactaca tccactgggt ccgacaagct      120
          cccggtcaag gtctggagtg gatcggcgag atctaccccg gcagcggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggacg tgccacttta accgctgaca ccagcacctc caccgcctac      240
          atggagttca gctctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtggcaac      300
          gattacgacg cttggttcgt gtactgggga caaggaacat tagtgaccgt gtccagcggc      360
          agcacaagcg gaagcggcaa gcccggtagc ggcgagggaa gcaccaaggg cgatatcgtg      420
          atgacccaga gccccgattc tttagccgtg tctttaggag agagagtgac catgaactgc      480
          aagagcagcc agtctttact gaacagcggc accagaaaga actatttagc ttggtaccag      540
          cagaagcccg gccagcctcc caagctgctg atctactggg ccagcattcg tgagagcgga      600
          gtgcccgaca gattcagcgg cagcggctcc ggcaccgact ttactttaac catcagcagc      660
          gtgcaagctg aggatgtggc cgtgtattac tgcaagcagt cctactcttt atacaccttt      720
          ggccaaggaa caaagctgga gatcaaaggg tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca      780
          acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca      840
          gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg      900
          gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc      960
          aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa     1020
          actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt     1080
          gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac     1140
          cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagagg     1200
          cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg     1260
          tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc     1320
          gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag     1380
          gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc                        1422
          <![CDATA[<210> 92]]>
          <![CDATA[<211> 33]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 92]]>
          Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr 
                      20                  25                  30          
          Ala 
          <![CDATA[<210> 9]]>3
          <![CDATA[<211> 126]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 93]]>
          Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr 
                      20                  25                  30          
          Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys 
                  35                  40                  45              
          Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys 
              50                  55                  60                  
          Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu 
                  115                 120                 125     
          <![CDATA[<210> 94]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          肽
          <![CDATA[<400> 94]]>
          Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Trp Thr Arg Ile Ala Ser 
                      20          
          <![CDATA[<210> 95]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 95]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 96]]>
          <![CDATA[<211> 96]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 96]]>
          atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg       60
          attcctgaac agaagctgat aagtgaggag gacttg                                 96
          <![CDATA[<210> 97]]>
          <![CDATA[<211> 152]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 97]]>
          Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr 
                      20                  25                  30          
          Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys 
                  35                  40                  45              
          Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys 
              50                  55                  60                  
          Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala 
                  115                 120                 125             
          Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met 
              130                 135                 140                 
          Val Tyr Ile Arg Val Asn Arg Gln 
          145                 150         
          <![CDATA[<210> 98]]>
          <![CDATA[<211> 194]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 98]]>
          Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 
                  35                  40                  45              
          Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 
              50                  55                  60                  
          Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 
                  115                 120                 125             
          Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 
              130                 135                 140                 
          Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu 
                          165                 170                 175     
          Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn 
                      180                 185                 190         
          Arg Gln 
          <![CDATA[<210> 99]]>
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          多肽
          <![CDATA[<400> 99]]>
          Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 
                      100                 105                 110         
          Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 
              130                 135         
          <![CDATA[<210> 100]]>
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          多肽
          <![CDATA[<400> 100]]>
          Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 
                      100                 105                 110         
          Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr 
                          165         
          <![CDATA[<210> 101]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          多肽
          <![CDATA[<400> 101]]>
          Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 
                      100                 105                 110         
          Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Ser Gly Pro Ile Leu Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu 
          145                 150                 155                 
          <![CDATA[<210> 102]]>
          <![CDATA[<211> 162]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 102]]>
          Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 
                      100                 105                 110         
          Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Ser Gly Pro Ile Leu Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Leu 
          <![CDATA[<210> 103]]>
          <![CDATA[<211> 200]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 103]]>
          Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser 
          1               5                   10                  15      
          Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg 
                      20                  25                  30          
          Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln 
                  35                  40                  45              
          Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe 
              50                  55                  60                  
          Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val 
                          85                  90                  95      
          Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala 
                      100                 105                 110         
          Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser 
                  115                 120                 125             
          Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln 
                          165                 170                 175     
          Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 
                  195                 200 
          <![CDATA[<210> 104]]>
          <![CDATA[<211> 359]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 104]]>
          Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 
                      100                 105                 110         
          Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 
                  115                 120                 125             
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          Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys 
                      180                 185                 190         
          Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile 
                  195                 200                 205             
          His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu 
              210                 215                 220                 
          Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile 
                          245                 250                 255     
          Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly 
                      260                 265                 270         
          Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu 
                  275                 280                 285             
          Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser 
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          Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met 
                      340                 345                 350         
          Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 
                  355                 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 105]]>
          Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 
                      100                 105                 110         
          Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Ser Gly Pro Ile Leu Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val 
          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys 
                      180                 185                 190         
          Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp 
                  195                 200                 205             
          Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu 
              210                 215                 220                 
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          Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp 
                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
          Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser 
                  275                 280                 285             
          Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr 
              290                 295                 300                 
          Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln 
                          325                 330                 335     
          Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr 
                      340                 345                 350         
          Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 
                  355                 360         
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 106]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 
                  35                  40                  45              
          Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 
              50                  55                  60                  
          Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 
                  115                 120                 125             
          Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 
              130                 135                 140                 
          Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 
          145                 150                 155                 
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          <![CDATA[<211> 169]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 107]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 
                      100                 105                 110         
          Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 
                  115                 120                 125             
          Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 
              130                 135                 140                 
          Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 
                          165                 
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          多肽
          <![CDATA[<400> 108]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 
                  35                  40                  45              
          Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 
              50                  55                  60                  
          Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 
                  115                 120                 125             
          Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 
              130                 135                 140                 
          Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala 
                          165                 170                 175     
          Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro 
                      180                 185                 190         
          Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu 
                  195                 200                 205             
          Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser 
              210                 215                 220                 
          Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu 
                          245                 250                 255     
          Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro 
                      260                 265                 270         
          Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser 
                  275                 280                 285             
          Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu 
              290                 295                 300                 
          Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro 
          305                 310                 315                 320 
          His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr 
                          325                 330                 335     
          Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro 
                      340                 345                 350         
          Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu 
                  355                 360                 365             
          Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 
              370                 375                 380     
          <![CDATA[<210> 109]]>
          <![CDATA[<211> 391]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 109]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 
                          85                  90                  95      
          Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 
                      100                 105                 110         
          Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 
                  115                 120                 125             
          Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 
              130                 135                 140                 
          Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Ser Gly Pro Ile Leu Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys 
              210                 215                 220                 
          Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile 
          225                 230                 235                 240 
          His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu 
                          245                 250                 255     
          Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu 
                      260                 265                 270         
          Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile 
                  275                 280                 285             
          Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly 
              290                 295                 300                 
          Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu 
                          325                 330                 335     
          Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser 
                      340                 345                 350         
          Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro 
                  355                 360                 365             
          Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met 
              370                 375                 380                 
          Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 
          385                 390     
          <![CDATA[<210> 110]]>
          <![CDATA[<211> 381]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 110]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 
                  35                  40                  45              
          Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 
              50                  55                  60                  
          Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 
                  115                 120                 125             
          Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 
              130                 135                 140                 
          Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala 
                          165                 170                 175     
          Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro 
                      180                 185                 190         
          Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu 
                  195                 200                 205             
          Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser 
              210                 215                 220                 
          Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu 
                          245                 250                 255     
          Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro 
                      260                 265                 270         
          Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser 
                  275                 280                 285             
          Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu 
              290                 295                 300                 
          Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro 
          305                 310                 315                 320 
          His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr 
                          325                 330                 335     
          Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro 
                      340                 345                 350         
          Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu 
                  355                 360                 365             
          Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 
              370                 375                 380     
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 111]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 
                      20                  25                  30          
          Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 
                          85                  90                  95      
          Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 
                      100                 105                 110         
          Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 
                  115                 120                 125             
          Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 
              130                 135                 140                 
          Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Ser Gly Pro Ile Leu Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys 
              210                 215                 220                 
          Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu 
                          245                 250                 255     
          Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp 
                  275                 280                 285             
          Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys 
              290                 295                 300                 
          Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr 
                          325                 330                 335     
          Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro 
                      340                 345                 350         
          Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln 
                  355                 360                 365             
          Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr 
              370                 375                 380                 
          Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 
          385                 390                 
          <![CDATA[<210> 112]]>
          <![CDATA[<211> 384]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 112]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 
                  35                  40                  45              
          Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 
              50                  55                  60                  
          Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 
                  115                 120                 125             
          Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 
              130                 135                 140                 
          Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Pro Ile Leu Leu Thr Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe 
                          165                 170                 175     
          Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg 
                      180                 185                 190         
          Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu 
                  195                 200                 205             
          Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn 
              210                 215                 220                 
          Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln 
                          245                 250                 255     
          Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro 
                      260                 265                 270         
          Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg 
                  275                 280                 285             
          Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala 
              290                 295                 300                 
          Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr 
                          325                 330                 335     
          Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser 
                  355                 360                 365             
          Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 
              370                 375                 380                 
          <![CDATA[<210> 113]]>
          <![CDATA[<211> 684]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 113]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 
                  275                 280                 285             
          Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
                          325                 330                 335     
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 
                  355                 360                 365             
          Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 
              370                 375                 380                 
          Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 
                          405                 410                 415     
          Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 
                  435                 440                 445             
          Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 
              450                 455                 460                 
          Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met 
                          485                 490                 495     
          Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu Trp 
                      500                 505                 510         
          Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn 
                  515                 520                 525             
          Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln 
              530                 535                 540                 
          Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln 
                          565                 570                 575     
          Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu 
                      580                 585                 590         
          Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu 
                  595                 600                 605             
          Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro 
              610                 615                 620                 
          Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp 
          625                 630                 635                 640 
          Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu 
                          645                 650                 655     
          Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly 
                      660                 665                 670         
          Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr 
                  675                 680                 
          <![CDATA[<210> 114]]>
          <![CDATA[<211> 2052]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 114]]>
          caagtccaac tggtgcagtc cggagccgag gtcaagaagc ccggagccag cgtgaaagtc       60
          tcatgtaaaa ccagcggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagcc      120
          cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atctaccccg gctccggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggtcg tgtgaccatg acagccgaca ccagcacctc caccgcctac      240
          atggaactgt cctctctgcg ttctgaggac acagccgttt actactgcgc cagaggcaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaacat tagtgaccgt gtcctccgga      360
          tccacatccg gcagcggaaa gcccggtagc ggcgagggca gcaccaaagg agacatcgtc      420
          atgacccaga gccccgattc tttagccgtg tctttaggcg aaagagtgac catgaactgc      480
          aagtccagcc agtctttact gaattccggc actcgaaaaa actatttagc ttggtaccag      540
          cagaaacccg gccagccccc taagctgctg atctactggg ctagcattcg agaatccggc      600
          gtgcccgatc gctttagcgg cagcggtagc ggcaccgact ttactttaac catcagcagc      660
          gtgcaagctg aggacgtggc tgtgtactat tgcaagcagt cctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga gatcaagggg tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca      780
          acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcaaccc ctgtccctgc gccccgaggc gtgccggcca      840
          gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg      900
          gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttattgc      960
          aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa     1020
          actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt     1080
          gaattgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cctatcagca aggccagaac     1140
          cagctctata acgagctcaa tttagggcga agagaggagt acgatgtttt ggacaagagg     1200
          cgtggccggg accccgaaat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcttg     1260
          tacaatgaat tgcagaagga taagatggcg gaggcataca gtgagattgg gatgaaaggc     1320
          gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttatcagg gtctcagtac agccaccaag     1380
          gacacctacg acgcccttca catgcaagcc ctgccccctc gcggctctgg agagggcaga     1440
          ggctctctgc tgacctgcgg cgacgtggaa gagaacccag gccccatggg aagaggttta     1500
          ctgagaggac tgtggccttt acacatcgtg ctgtggactc gtatcgccag caccatcccc     1560
          ccccatgtcc aaaagagcgt gaacaacgac atgatcgtga ccgacaacaa tggcgccgtg     1620
          aagttccccc agctgtgcaa gttctgcgac gtgaggttca gcacttgtga caaccagaag     1680
          agctgcatga gcaactgcag catcacctcc atctgcgaga agccccaaga agtgtgcgtg     1740
          gccgtgtgga ggaagaacga cgagaacatc actttagaga cagtgtgcca cgaccccaag     1800
          ctgccctacc acgacttcat tttagaagat gccgccagcc ccaagtgcat catgaaggag     1860
          aagaagaagc ccggcgagac cttcttcatg tgttcttgtt cgtctgatga gtgcaacgat     1920
          aacatcatct tcagcgagga gtacaacacc agcaaccccg atttactgct ggtgatcttc     1980
          caagttaccg gcatttcttt actgcctccg ttgggcgtgg ctatcagcgt gatcatcatc     2040
          ttctactgct at                                                         2052
          <![CDATA[<210> 115]]>
          <![CDATA[<211> 684]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 115]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 
                  275                 280                 285             
          Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
                          325                 330                 335     
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 
                  355                 360                 365             
          Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 
              370                 375                 380                 
          Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 
                          405                 410                 415     
          Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 
                  435                 440                 445             
          Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 
              450                 455                 460                 
          Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met 
                          485                 490                 495     
          Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu Trp 
                      500                 505                 510         
          Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn 
                  515                 520                 525             
          Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln 
              530                 535                 540                 
          Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln 
                          565                 570                 575     
          Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu 
                      580                 585                 590         
          Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu 
                  595                 600                 605             
          Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro 
              610                 615                 620                 
          Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp 
          625                 630                 635                 640 
          Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu 
                          645                 650                 655     
          Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly 
                      660                 665                 670         
          Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr 
                  675                 680                 
          <![CDATA[<210> 116]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 116]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Leu Asp Asn Glu Lys 
                          245                 250                 255     
          Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser 
                      260                 265                 270         
          Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val 
                  275                 280                 285             
          Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile 
              290                 295                 300                 
          Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln 
                          325                 330                 335     
          Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Arg Val 
                      340                 345                 350         
          Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 
                  355                 360                 365             
          Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 
              370                 375                 380                 
          Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 
                          405                 410                 415     
          Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 
                      420                 425                 430         
          Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 
                  435                 440                 445             
          Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser 
              450                 455                 460                 
          Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Gly Pro Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His 
                          485                 490                 495     
          Ile Val Leu Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln 
                      500                 505                 510         
          Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val 
                  515                 520                 525             
          Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys 
              530                 535                 540                 
          Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu 
                          565                 570                 575     
          Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His 
                      580                 585                 590         
          Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu 
                  595                 600                 605             
          Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp 
              610                 615                 620                 
          Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn 
          625                 630                 635                 640 
          Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu 
                          645                 650                 655     
          Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr 
                      660                 665                 670         
          <![CDATA[<210> 117]]>
          <![CDATA[<211> 2016]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多核苷酸
          <![CDATA[<400> 117]]>
          caagtccaac tggtgcagtc cggagccgag gtcaagaagc ccggagccag cgtgaaagtc       60
          tcatgtaaaa ccagcggcta caccttcacc gactactaca tccactgggt ccgacaagcc      120
          cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag atctaccccg gctccggcaa cacctactac      180
          gcccagaagt tccaaggtcg tgtgaccatg acagccgaca ccagcacctc caccgcctac      240
          atggaactgt cctctctgcg ttctgaggac acagccgttt actactgcgc cagaggcaac      300
          gactacgacg cttggttcgt gtactggggc caaggaacat tagtgaccgt gtcctccgga      360
          tccacatccg gcagcggaaa gcccggtagc ggcgagggca gcaccaaagg agacatcgtc      420
          atgacccaga gccccgattc tttagccgtg tctttaggcg aaagagtgac catgaactgc      480
          aagtccagcc agtctttact gaattccggc actcgaaaaa actatttagc ttggtaccag      540
          cagaaacccg gccagccccc taagctgctg atctactggg ctagcattcg agaatccggc      600
          gtgcccgatc gctttagcgg cagcggtagc ggcaccgact ttactttaac catcagcagc      660
          gtgcaagctg aggacgtggc tgtgtactat tgcaagcagt cctactcttt atacaccttc      720
          ggccaaggaa caaagctgga gatcaagggg tccctagaca atgagaagag caatggaacc      780
          attatccatg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag      840
          cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca      900
          gtggccttta ttattttctg ggtccgatca aaaaggagca ggctcctgca cagtgactac      960
          atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca     1020
          ccacgcgact tcgcagccta tcgctccctg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc     1080
          cccgcgtacc agcaagggca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag     1140
          gagtacgatg ttttggacaa gaggcgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga     1200
          aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc     1260
          tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac     1320
          cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca agctctgccc     1380
          cctcgcggct ctggagaggg cagaggctct ctgctgacct gcggcgacgt ggaagagaac     1440
          ccaggcccca tgggaagagg tttactgaga ggactgtggc ctttacacat cgtgctgtgg     1500
          actcgtatcg ccagcaccat ccccccccat gtccaaaaga gcgtgaacaa cgacatgatc     1560
          gtgaccgaca acaatggcgc cgtgaagttc ccccagctgt gcaagttctg cgacgtgagg     1620
          ttcagcactt gtgacaacca gaagagctgc atgagcaact gcagcatcac ctccatctgc     1680
          gagaagcccc aagaagtgtg cgtggccgtg tggaggaaga acgacgagaa catcacttta     1740
          gagacagtgt gccacgaccc caagctgccc taccacgact tcattttaga agatgccgcc     1800
          agccccaagt gcatcatgaa ggagaagaag aagcccggcg agaccttctt catgtgttct     1860
          tgttcgtctg atgagtgcaa cgataacatc atcttcagcg aggagtacaa caccagcaac     1920
          cccgatttac tgctggtgat cttccaagtt accggcattt ctttactgcc tccgttgggc     1980
          gtggctatca gcgtgatcat catcttctac tgctat                               2016
          <![CDATA[<210> 118]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說]]>明：合成
          肽
          <![CDATA[<40]]>0> 118]]&gt;
          <br/><![CDATA[Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro 
          <![CDATA[<210> 119]]>
          <![CDATA[<211> 54]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 119]]>
          gagggcagag gctctctgct gacctgcggc gacgtggaag agaacccagg cccc             54
          <![CDATA[<210> 120]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (6)..(10)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (11)..(15)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (16)..(20)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (21)..(25)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (26)..(30)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (31)..(35)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (36)..(40)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (41)..(45)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (46)..(50)]]>
          <![CDATA[<223> 此區可涵蓋1至5個殘基]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> SITE]]>
          <![CDATA[<222> (1)..(50)]]>
          <![CDATA[<223> 此序列可涵蓋1至5個「(G)n(S)n」重複單元，其中n = 1至5]]>
          <![CDATA[<400> 120]]>
          Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser 
                  35                  40                  45              
          Ser Ser 
              50  
          <![CDATA[<210> 121]]>
          <![CDATA[<211> 474]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 121]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala 
                          245                 250                 255     
          Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 
                  275                 280                 285             
          Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
                          325                 330                 335     
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 
                  355                 360                 365             
          Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 
              370                 375                 380                 
          Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 
                          405                 410                 415     
          Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 
                  435                 440                 445             
          Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 
              450                 455                 460                 
          Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
          465                 470                 
          <![CDATA[<210> 122]]>
          <![CDATA[<211> 672]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列說明：合成]]>
          多肽
          <![CDATA[<400> 122]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Ala Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
                          165                 170                 175     
          Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                      180                 185                 190         
          Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu 
              210                 215                 220                 
          Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Leu Asp Asn Glu Lys 
                          245                 250                 255     
          Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser 
                      260                 265                 270         
          Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val 
                  275                 280                 285             
          Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile 
              290                 295                 300                 
          Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln 
                          325                 330                 335     
          Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Arg Val 
                      340                 345                 350         
          Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 
                  355                 360                 365             
          Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 
              370                 375                 380                 
          Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 
                          405                 410                 415     
          Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 
                      420                 425                 430         
          Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 
                  435                 440                 445             
          Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser 
              450                 455                 460                 
          Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Gly Pro Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His 
                          485                 490                 495     
          Ile Val Leu Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln 
                      500                 505                 510         
          Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val 
                  515                 520                 525             
          Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys 
              530                 535                 540                 
          Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu 
                          565                 570                 575     
          Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His 
                      580                 585                 590         
          Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu 
                  595                 600                 605             
          Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp 
              610                 615                 620                 
          Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn 
          625                 630                 635                 640 
          Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu 
                          645                 650                 655     
          Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr
                      660                 665                 670

Claims (16)

  1. 一種嵌合抗原受體，其包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列。
  2. 一種核酸，其編碼如請求項1之嵌合抗原受體。
  3. 如請求項2之核酸，其進一步編碼顯性負性TGFβ受體(DN TGFβR)，其包含：來自TGF-β受體之胞外域(ECD)及跨膜域(TMD)，其中該DN TGFβR缺乏存在於野生型TGF-β受體中負責信號傳導及磷酸化之胺基酸殘基。
  4. 如請求項3之核酸，其中該顯性負性TGFβ受體(DN TGFβR)為DN TGFβRII。
  5. 如請求項3之核酸，其中該顯性負性TGFβ受體(DN TGFβR)包含選自SEQ ID NO：98-104中任一者之胺基酸序列。
  6. 一種重組載體，其包含如請求項2或3之核酸。
  7. 一種宿主細胞，其經如請求項2或3之核酸轉形。
  8. 如請求項7之宿主細胞，其中該宿主細胞進一步經編碼膜結合IL-15-IL-15Rα壽司(sushi)域嵌合受體之核酸轉形。
  9. 如請求項7之宿主細胞，其中該宿主細胞係選自由iPSC、T細胞及NK細胞組成之群。
  10. 一種醫藥組成物，其包含如請求項7之宿主細胞。
  11. 一種如請求項7至9中任一項之宿主細胞之用途，其係用於製備治療患者之表現GPC3之癌症的醫藥品。
  12. 如請求項11之用途，其中該表現GPC3之癌症係選自由以下組成之群：肝細胞癌、肺鱗狀細胞癌、食道癌、頭頸癌、胃癌、黑色素瘤、間皮瘤、子宮頸癌、卵巢癌、乳癌、睪丸癌、膽管癌、結腸癌、脂肪肉瘤、許旺細胞瘤、或其任何組合。
  13. 如請求項12之用途，其中該T細胞及/或該NK細胞對該患者係同種異體的。
  14. 如請求項12之用途，其中該表現GPC3之癌症係肝細胞癌。
  15. 如請求項12之用途，其中該表現GPC3之癌症係肺鱗狀細胞癌。
  16. 一種如請求項7至9中任一項之宿主細胞之用途，其係用於製備在個體中誘導免疫反應之醫藥品。
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