TWI875357B - 抗gm2ap抗體及其應用 - Google Patents

Abstract

本文揭露特異性結合GM2活化蛋白（GM2-activator protein，GM2AP）的重組抗體或其抗原結合片段。該重組抗體或其抗原結合片段包含含有3個輕鏈互補決定區（LCDR1至3）胺基酸序列的輕鏈可變區（LCVR）及含有3個重鏈互補決定區（HCDR1至3）的重鏈可變區（HCVR），其序列如本文實施例所揭露者。本文亦提供編碼其之多核苷酸、載體、宿主細胞、套組，以及評估個體罹患肺癌的風險的方法。

Description

抗GM2AP抗體及其應用

電子提交序列表之參照

本件申請案的序列表為ST.26 XML格式，其透過EFS-Web以電子形式提交，檔案名為「11262-USI.xml」，創建日期為2022年8月31日，而大小為29.6 Kb。透過EFS-Web所提交的這份序列表是說明書的一部分並且以全文引用的方式併入本文。

本文係關於一種新穎重組抗體或其任意抗原結合片段。具體來說，本文係關於一種針對GM2活化蛋白（GM2AP）的新穎重組抗體或其任意抗原結合片段及其應用，特別是在評估個體罹患肺癌風險的應用。

肺癌是全球癌症死亡的主要原因。肺癌通常起始於肺部的某些部份和支氣管內壁的細胞，如肺泡或細支氣管。肺癌可能是由吸煙、吸入二手煙、在家中或工作場所接觸石棉或氡等物質、接受胸部放射治療以及有肺癌家族史等原因所引起。肺癌主要有兩種類型，如非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），分別約占肺癌的85%和15%。非小細胞肺癌的主要亞型有鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌。鱗狀細胞癌有時也被稱為燕麥細胞癌。由於缺乏有效的早期檢測工具且晚期治療效果不佳，肺癌的5年生存率僅為15%。

大多數肺癌患者確診時已處於第III期和第IV期，無法藉由手術徹底根治腫瘤。雖然標靶藥物、化療、放療有一定的治療價值，但難以實現長期存活。因此，對早期肺癌進行有效的篩檢是提高患者存活率的關鍵。肺癌的重要篩檢方法包括影像學檢查、生物標記和活組織檢驗。為了降低肺癌的死亡風險，電腦斷層掃描（CT/LDCT）是一種常見的篩檢方法，但它的假陽性率較高，需要輔以其他侵入性檢查來確認。因此，開發肺癌生物標記檢測來與CT/LDCT篩檢結合，可能是提高篩檢準確性和診斷為肺癌的有效方法。

先前的研究顯示，肺癌患者尿液或血清中GM2-活化蛋白（GM2AP）的表現高於健康對照組，因此，GM2AP可能是肺癌的潛在診斷生物標記。GM2AP是一種小型單體蛋白，含有一個Asn連接糖基化的位點。其先被合成為前體，然後在 ³²Ser處被糖基化、修飾及裂解而成為成熟的形式。成熟的GM2AP是一種糖蛋白，其脫糖形式（deglycosylated form）的分子量為17.6 kDa。 作為一種輔因子，GM2AP具有至少三個功能性特徵，包括被稱為β-cup的疏水性袋狀結構（hydrophobic pocket）、寡糖結合點和與Hex A交互作用的區域。與Hex A交互作用的區域有助於溶酶體β己糖胺脢A（Hex A）將GM2神經節苷脂（GM2 ganglioside）降解為GM3。然而，只有三分之一所合成的GM2AP被分泌出來。 細胞可以透過與碳水化合物無關的機制，由各種細胞如表皮角質細胞和纖維母細胞來重新抓取GM2AP。缺乏功能性的GM2AP是GM2神經節苷脂病AB變體（一種嚴重的溶酶體儲存障礙）患者組織中，GM2神經節苷脂異常積累的原因。GM2AP的遺傳性缺損也與神經節苷脂和涉及腫瘤發展的腫瘤相關神經節苷脂之量的改變有關。腫瘤相關神經節苷脂是初始致癌轉化的結果，在誘發侵襲和轉移中發揮作用。腫瘤細胞係合成並在其微環境中脫落神經節苷脂，這導致血清中腫瘤相關的神經節苷脂量有提高。此外，已知神經節苷脂在細胞生長、黏附、細胞-細胞相互作用和訊號傳導中表現出調節作用。

有鑒於現有技術之需要，本文係提供以下實施例。

在一實施例中，本文提供一種特異性結合GM2活化蛋白（GM2AP）的重組抗體或其抗原結合片段，其中該重組抗體或其抗原結合片段包含：(a)輕鏈可變區（LCVR），包括各自獨立地選自由下列所組成之群組的三個輕鏈互補決定區（LCDR1至3）胺基酸序列：SEQ ID NO：16至18、22至24，及28至30；以及(b)重鏈可變區（HCVR），包括各自獨立地選自由下列所組成之群組的三個重鏈互補決定區（HCDR1至3）胺基酸序列：SEQ ID NO：19至21、25至27，及31至33。

較佳地，該LCVR包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：4、6和8，及/或該HCVR包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：5、7和9。

更佳地，該LCVR/HCVR對分別包含以下之胺基酸序列對：SEQ ID NOs: 4/5、6/7、8/7、6/9或8/9。

更佳地，該LCDR1/LCDR2/LCDR3/HCDR1/HCDR2/HCDR3分別包含SEQ ID NO：16/17/18/19/20/21、22/23/24/25/26/27、28/29/30/25/26/27、22/23/24/31/32/33，或28/29/30/31/32/33的胺基酸序列。

在前述任一種實施例中，該重組抗體或其抗原結合片段係選自由下列所組成之群組：雙體（diabody）、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、經雙硫鍵穩定之Fv片段（disulfide stabilized Fv fragment，dsFv）、(dsFv) ₂、雙特異性dsFv (dsfv-dsfv’)、經雙硫鍵穩定之雙體（disulfide stabilized diabody，ds diabody）、單鏈抗體分子（single-chain antibody molecule，scfv）、scfv二聚體（scfv dimer，雙價雙體（bivalent diabody））及其任意組合。

在前述任一種實施例中，該重組抗體或其抗原結合片段係選自由下列所組成之群組：單株抗體、多特異性抗體、小鼠抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體及其任意組合。

較佳地，該重組抗體或其抗原結合片段係人類抗體或小鼠抗體。較佳地，該重組抗體或其抗原結合片段係人類抗體。

在一實施例中，本文提供編碼任一種本文所提及之重組抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。該多核苷酸包含選自由SEQ ID NO：10至15所組成之群組的核酸序列。

較佳地，編碼該LCVR的核酸序列係選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：10、12和14，及/或編碼該HCVR的核酸序列係選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：11、13及15。

在前述任一種實施例中，該LCVR/HCVR係分別由下列核酸序列對所編碼：SEQ ID NO：10/11、12/13、14/13、12/15或14/15。

在一實施例中，本文提供一種載體，其包含任一種本文所提及之多核苷酸。

在一實施例中，本文提供一種宿主細胞，其包含任一種本文所提及之載體。

較佳地，宿主細胞係選自下列所組成之群組：中國倉鼠卵巢細胞 （Chinese Hamster Ovary (CHO) cell）、NSO 細胞、BHK 細胞、SP2/0 細胞、HEK 293 細胞、HEK 293 EBNA 細胞、PER.C6® 細胞、COS 細胞、239F 細胞、SF9 細胞、SF21 細胞及其組合。

在一實施例中，本文提供一種套組，用以在生物樣品中偵測作為肺癌的生物標記之GM2活化蛋白（GM2AP），其中該套組包含本文中所提及之重組抗體或其抗原結合片段。

較佳地，該套組更包含受質及二級抗體，該二級抗體接合訊號產生單元並與該重組抗體或其抗原結合片段的Fc域結合。受質係經配置為與訊號產生單元進行反應並產生一訊號。

在前述任一種實施例中，該生物樣品包含全血、血清、血漿、尿液或其組合。較佳地，該生物樣品係尿液。

在前述任一種實施例中，該訊號產生單元包含輻射性標誌、螢光標誌、磷光標誌、化學冷光標誌或標籤性酵素。較佳地，標籤性酵素可包含辣根過氧化酶（horseradish peroxidase）或鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）。

在前述任一種實施例中，當訊號產生單元為辣根過氧化酶時，受質為四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）。

在前述任一種實施例中，套組進一步包含阻斷溶液（blocking solution）。較佳地，阻斷溶液包含脫脂牛奶、牛血清白蛋白或酪蛋白。

在前述任一種實施例中，套組進一步包含清洗溶液（wash solution）。較佳地，清洗溶液包含磷酸鹽緩衝液（Phosphate buffered saline，PBS）、Tris緩衝液（Tris-buffered saline，TBS）、含有清潔劑（detergent）的PBS或含有清潔劑（detergent）的TBS。

在一實施例中，本文提供一種評估個體罹患肺癌的風險之方法，包含以下步驟：(a) 以本文所提及之重組抗體或其抗原結合片段或本文所提及之套組判定生物樣品中GM2AP的含量；(b) 判定該生物樣品中總蛋白質的含量或肌酸酐的含量；(c) 將該GM2AP的含量除以該總蛋白質的含量或該肌酸酐的含量以計算G/T比值；以及(d) 根據該G/T比值判定該個體罹患肺癌的風險。

在前述任一種實施例中，該生物樣品包含全血、血清、血漿、尿液或其組合。較佳地，該生物樣品係尿液。

在前述任一種實施例中，該步驟(a)更包含以下步驟：(a-1) 將重組抗體或其抗原結合片段施用至生物樣品；(a-2) 將生物樣品與接合有可偵測標籤的二級抗體共同孵育；(a-3)偵測可偵測標籤；以及(a-4) 基於步驟(a-3)的結果判定生物樣品中GM2AP的含量。

在前述任一種實施例中，該二級抗體係結合至該重組抗體或其抗原結合片段的Fc域。

在前述任一種實施例中，可偵測標籤包含鹼性磷酸酶或辣根過氧化酶。

在前述任一種實施例中，該步驟(a-3)係藉由以下所執行：將該可偵測標籤與四甲基聯苯胺（TMB）溶液共同孵育，並在OD ₄₅₀判定其吸光度。

在前述任一種實施例中，該步驟(b)係藉由以下所執行：偵測該生物樣品中總蛋白質的含量及判定OD ₅₆₂的吸光度，其中該總蛋白質的含量係透過二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）測定法偵測。

在前述任一種實施例中，該步驟(b)係藉由以下所執行：偵測該生物樣品中總蛋白質的含量及判定OD ₅₉₅的吸光度，其中該總蛋白質的含量係透過布拉德福（Bradford）蛋白質測定法偵測。

在前述任一種實施例中，當該G/T比值大於200.00 ng/mg時，該個體被診斷為罹患肺癌。

在前述任一種實施例中，當該G/T比值介於20.00 ng/mg至200.00 ng/mg之間時，該個體被判定為肺癌的高風險族群。

較佳地，當該G/T比值介於30.00 ng/mg至200.00 ng/mg之間時，該個體被判定為肺癌的高風險族群。

更佳地，當該G/T比值介於30.587 ng/mg至200.00 ng/mg之間時，該個體被判定為肺癌的高風險族群。

本文之上述和其他方面係以下述其他實施例進行更詳細的描述。咸應理解，本發明可以用不同形式所表徵，不應該被理解為侷限於本文所述的實施方案。相反的，提供這些實施例是為了更徹底及完整地揭露本發明，並向本案所屬技術領域具有通常知識者充分傳達本發明的範圍。

本文所使用之術語只是為了描述特定的實施方案，並非意圖限制本發明。在本文敘述和附隨之申請專利範圍中，除非上下文有明確的相反指示，否則單數形式的「一」（「a」、「an」）和「該」也包括複數形式。

如本文所用，術語「包括（comprises、comprising）」、「包含（includes、including）」、「含有（has、having）」、「含括（contains、containing）」、「其特徵在於」或其任何其他變體，旨在涵蓋非排他性的包含，但須遵守明確指出的任何限制。舉例來說，由所列單元組成的組成物、混合物、方式或方法不一定只限於這些單元，還可能包括未明確列出者，或該組成物、混合物、方式或方法所固有的其他單元。

轉折性用語「由…組成」排除了任何未指明的單元、步驟或組成分。如果在請求項中，這將使請求項中僅限於包含所述的那些材料，但通常與之相關的雜質除外。當「由…組成」這一片語出現在請求項的某一子句中，而非緊跟在其標的之後時，它只限制該子句中規定的要素；其他要素並不被排除在整個請求項之外。

若使用例如「包括」這樣的開放性用語來定義一項發明或其一部分，那麼咸應理解，除非另有說明，否則該描述應該被解釋為也以「由…組成」一詞來描述這樣的發明。

如本文所使用的，術語「約」係用於表示一個數值包括例如測量設備的固有誤差變化、用於確定該數值的方法、或研究對象之間存在的變化。通常情況下，該術語是指包括約為或小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的變異性，其取決於具體情況。

請求項中使用的術語「或」是指「及/或」，除非有明確指出僅限替代物或替代物是互斥的，即便本文支持僅限替代物和「及/或」的定義。

本文所用術語「個體」是指人類或動物。示例性的個體可以是人類、猿類、狗、豬、牛、貓、馬、山羊、綿羊、嚙齒動物和其他哺乳動物。

本文所提術語「抗體」包括完整的抗體和任何抗原結合片段（即「抗原結合部分」）或其單鏈。「抗體」是指由至少兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）藉由雙硫鍵相互連接的糖蛋白，或其抗原結合部分。 每條重鏈由一個重鏈可變區（此處縮寫為VH）和一個重鏈恆定區（此處縮寫為CH）組成。重鏈恆定區由三個結構域組成，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈由一個輕鏈可變區（在此縮寫為VL）和一個輕鏈恆定區組成。 輕鏈恆定區由一個結構域C _L組成。V _H和V _L區可以進一步細分為高度變異區域，稱為互補決定區（CDR），穿插有較保守的區（稱為框架區（FR））。 每個V _H和V _L由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列 ：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區包含一個與抗原交互作用的結合域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞（如效應子細胞）和古典補體系統的第一組份（C1q）。

「表位」或「抗原決定簇（antigenic determinant）」是抗原分子的一部分，負責與抗體的抗原結合結構域進行特定的相互作用。抗原結合結構域可以由一或多個抗體可變結構域提供。一個抗原結合結構域可以包括至少一個抗體輕鏈可變區（VL）和至少一個抗體重鏈可變區（VH）。一個抗原結合結構域也可以只包括VH或只包括VL區。特言之，在本文中，表位可以是人類GM2AP的一個特定結構域或結構域的組合。

術語「互補決定區（CDR）」被定義為抗體中可變鏈的一部分，這些分子在此與它們的特定抗原結合。在本文中，重鏈中的CDR區通常被稱為CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，而在輕鏈中則為CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。它們是從胺基末端到羧基末端的方向依次編號。

框架區和CDR的範圍是根據Kabat等人（參見Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991）和ImMunoGeneTics數據庫（IMGT）（參見Lefranc, Nucleic Acids Res 29:207-9, 2001; 以及線上imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=O&Option=humanlg）來定義。

在本文中「Kabat系統」是指根據Kabat (1991；Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th edit.，NIH publication No.91-3242U.S. Department of Health and Human Services)和Chothia (1987；J.Mol.Biol.196，901-917)以一致的方式對殘基進行編號的標準。這個編號系統被所屬技術領域具有通常知識者廣泛使用，並且是基於序列的變異性和可變結構域區域的三維環狀結構，這對抗原結合活性很重要。輕鏈或重鏈的所有殘基在Kabat系統中有不同的位置；即Kabat系統適用於CDR以及框架區。任何抗體的特定殘基的位置可以根據Kabat系統進行編號。根據Kabat系統識別VH和VL鏈的CDR區的規則顯示在www.bioinf.org.uk/abs。

IMGT獨特編號系統是Kabat系統的替代品，其允許比較可變域，無論抗原受體、鏈的類型或物種為何（Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997)/Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc, M.-P., Pomrnie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp.lmmunol., 27, 55-77 (2003)）。在IMGT獨特編號系統中，保守的胺基酸總是有相同的位置，例如半胱胺酸23（1st-CYS），色胺酸41（CONSERVED-TRP），疏水性胺基酸89，半胱胺酸104（2nd-CYS），苯丙胺酸或色胺酸118（J-PHE或J-TRP）。IMGT獨特編號系統提供了框架區（FR1 IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：位置39至55，FR3-IMGT：位置66至104，FR4-IMGT：位置118至128）和互補決定區（CDRl-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117）的標準化劃定。由於空隙代表未被佔用的位置，CDR IMGT的長度（顯示在括號內，用點分隔，例如[8.8.13]）成為關鍵資訊。IMGT獨特編號系統用於20個圖形表示，指定為IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. and Lefranc, M.-P. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]，以及IMGT/3Dstructure-DB中的三維結構[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Tcell receptor and MHC structural data.  Nucl.  Acids.  Res., 32, D208-D210 (2004)]。

本文所用的術語「抗原結合片段」是指一種抗體片段，例如雙體（diabody）、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、經雙硫鍵穩定之Fv片段（disulfide stabilized Fv fragment，dsFv）、(dsFv) ₂、雙特異性dsFv (dsfv-dsfv’)、經雙硫鍵穩定之雙體 （disulfide stabilized diabody，ds diabody）、單鏈抗體分子（single-chain antibody molecule，scfv）、scfv二聚體 （scfv dimer，雙價雙體（bivalent diabody）），由包括一或多個CDR的抗體的一部分形成的多特異性抗體，或任何其他與抗原結合但不包括完整的抗體結構的抗體片段。抗原結合片段能夠與其母體抗體或母體抗體片段（例如，母體scFv）所結合的相同抗原進行結合。在某些情況下，一個抗原結合片段可以包括一或多個來自特定人類抗體的CDR，嫁接到來自於一或多個不同人類抗體的框架區。在某些情況下，一個抗原結合片段可以包括一或多個來自特定小鼠抗體的CDR，嫁接到來自於一或多個不同小鼠抗體的框架區。

在上述抗原結合片段中，Fab係指一個具有輕鏈和重鏈可變區、輕鏈恆定區、重鏈第一恆定區（CH1）的結構，並且具有一個抗原結合位點。Fab’與Fab不同，Fab’有一個鉸鏈區，包括重鏈CH1結構域C端的至少一個半胱胺酸殘基。當Fab’的鉸鏈區的半胱胺酸殘基藉由雙硫鍵連接時，就會產生F(ab’) ₂。

Fv是一個最小的抗體片段，只具有重鏈可變區和輕鏈可變區。生產Fv片段的重組技術是本技術領域內所周知的。「單鏈Fv抗體」或「scFv」是指由一個輕鏈可變區和一個重鏈可變區直接或通過肽連接子序列相互連接組成的工程化抗體。雙鏈Fv可以有一個結構，其中重鏈可變區藉由非共價鍵與輕鏈可變區相連。單鏈Fv一般可形成二聚體結構，如雙鏈Fv，其中重鏈可變區藉由肽連接子與輕鏈可變區共價連接，或者重鏈和輕鏈可變區在其C端直接連接。該連接子可以是包括任何1至100個或2至50個胺基酸的肽連接子，而對其有用的適當序列是本技術領域內所周知的。

抗原結合片段可以用蛋白酶獲得（例如，整個抗體可以用木瓜蛋白酶消化以獲得Fab片段，或者可以用胃蛋白酶消化以獲得F(ab’) ₂片段），或者可以透過基因重組技術來製備。

本文所使用的術語「單株抗體」或「單株抗體組成物」是指具有均一分子組成的抗體分子的製備物。一個單株抗體組成物對一個特定的表位顯示出單一的結合特異性和親和力。

本文所用的術語「小鼠抗體」旨在包括具有可變區的抗體，其中框架和CDR區都來自鼠類種系免疫球蛋白序列。此外，如果該抗體包含一個恆定區，該恆定區也來自鼠類種系免疫球蛋白序列。本發明的小鼠抗體可以包括鼠類種系免疫球蛋白序列沒有編碼的胺基酸殘基（例如，透過體外或體內體細胞突變以隨機或定點誘變所引入的突變）。然而，本文所使用的術語「小鼠抗體」並不包括CDR序列來自另一哺乳動物物種，如人類的種系，被嫁接到小鼠框架序列的抗體。

本文所用的術語「人類抗體」旨在包括具有可變區的抗體，其中框架和CDR區都來自人類種系免疫球蛋白序列。此外，如果該抗體包含一個恆定區，該恆定區也來自人類種系免疫球蛋白序列。本發明的人類抗體可以包括人類種系免疫球蛋白序列沒有編碼的胺基酸殘基（例如，透過體外或體內體細胞突變以隨機或定點誘變所引入的突變）。然而，本文所使用的術語「人類抗體」並不包括CDR序列來自另一哺乳動物物種，如小鼠的種系，被嫁接到人類框架序列的抗體。

術語「小鼠單株抗體」是指顯示單一結合特異性的抗體，其可變區中的框架和CDR區均來自小鼠種系免疫球蛋白序列。

術語「人類單株抗體」是指顯示單一結合特異性的抗體，其可變區中的框架和CDR區均來自人類種系免疫球蛋白序列。

本文使用的術語「重組」旨在包括通過重組技術來製備、表現、建立或分離的所有分子，例如使用轉染到宿主細胞的重組表現載體所表現的多特異性分子（例如雙特異性分子）、從轉基因為人類免疫球蛋白基因的動物（例如小鼠）中分離的多特異性分子（例如。雙特異性分子）（例如，參見Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295）或透過任何其他涉及將人類或小鼠免疫球蛋白和/或MHC基因序列拼接（splicing）到其他DNA序列的方法所製備、表現、建立或分離的多特異性分子。這種重組的多特異性分子可以包括具有衍生自人類種系或鼠類種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗原結合域。

本文所使用的術語「重組小鼠抗體」包括所有透過重組技術所製備、表現、建立或分離的小鼠抗體，例如：(a) 從小鼠或由其製備的融合瘤（下文進一步描述）中分離的抗體，(b) 從轉型為表現小鼠抗體的宿主細胞中分離的抗體，例如從轉染瘤（transfectoma），(c) 從重組的、組合的小鼠抗體庫中分離出來的抗體，以及(d) 透過任何其他涉及小鼠免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接的方法製備、表現、建立或分離的抗體。這樣的重組小鼠抗體具有可變區，其中框架和CDR區來自小鼠種系免疫球蛋白序列。然而，在某些實施例中，這樣的重組小鼠抗體可以進行體外誘變（in vitro mutagenesis），因此，重組小鼠抗體的V _H和V _L區域的胺基酸序列雖然衍生自於小鼠種系V _H和V _L序列並與之相關，但可能不會天然存在在體內的小鼠抗體種系庫（human antibody germline repertoire）中。

本文所使用的術語「重組人類抗體」包括所有透過重組技術所製備、表現、建立或分離的人類抗體，例如：(a) 從轉基因或轉染色體為人類免疫球蛋白基因的動物（如小鼠）或由其製備的融合瘤（下文進一步描述）中分離的抗體，(b) 從轉型為表現人類抗體的宿主細胞中分離的抗體，例如從轉染瘤（transfectoma），(c) 從重組的、組合的人類抗體庫中分離出來的抗體，以及(d) 透過任何其他涉及人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接的方法製備、表現、建立或分離的抗體。這樣的重組人類抗體具有可變區，其中框架和CDR區來自人類種系免疫球蛋白序列。然而，在某些實施例中，這樣的重組人類抗體可以進行體外誘變（in vitro mutagenesis）（或者，當使用人類Ig序列的轉基因動物時，係進行體內體細胞誘變），因此，重組人類抗體的V _H和V _L區域的胺基酸序列雖然衍生自於人類種系V _H和V _L序列並與之相關，但可能不會天然存在在體內的人類抗體種系庫（human antibody germline repertoire）中。

術語「人源化抗體」指的是由非人類物種產生的抗體，包括經過修飾的蛋白質序列，以增加其與人類天然產生抗體之變體的相似性。人源化過程可能是必要的，以避免在人類中施用非人類來源的抗體時產生不希望的免疫原性效應。相較之下，這裡提到的術語「嵌合抗體」是指將一個物種的抗原結合區（即VH和VL）與另一物種的恆定結構域融合而製成的抗體。

術語「序列同一性百分比（%）」或「同源性（homology）」被定義為候選序列中與參考序列中的胺基酸殘基或核苷酸相同的百分比，其係在校準排列（alignment）序列之後，並於必要時引入間隙以達到最大的序列同一性百分比，並排除保守的核酸替換。用以比較序列的最佳排列（alignment）除了手工操作外，還可以透過本技術領域已知的局部同源算法或使用這些算法的電腦程式（如BLAST P）來產生。

術語「二辛可寧酸（bicinchoninic acid）測定法」或「BCA測定法」也稱為「史密斯測定法」。它是一種測定溶液中蛋白質總濃度（0.5 μg/mL 至 1.5 mg/mL）的生化測定法。總蛋白質濃度透過樣品溶液從綠色到紫色的顏色變化與蛋白質濃度成比例來表示，然後可以使用比色技術在562 nm處進行測量。

術語「布拉德福（Bradford）蛋白質測定法」是指用於測定溶液中蛋白質總濃度的生化測定法。布拉德福蛋白質測定法是基於考馬斯亮藍 G-250 染料的吸光度變化。總蛋白質濃度透過樣品溶液從棕色到藍色的顏色變化與蛋白質濃度成比例來表示，然後可以使用比色技術在595 nm處進行測量。

下述實施例所提及之核苷酸及胺基酸序列係綜整於表1至4中。 表 1.  GM2AP 的胺基酸序列

SEQ ID NO:	名稱	序列
1	GM2AP	MQSLMQAPLLIALGLLLAAPAQAHLKKPSQLSSFSWDNCDEGKDPAVIRSLTLEPDPIIVPGNVTLSVMGSTSVPLSSPLKVDLVLEKEVAGLWIKIPCTDYIGSCTFEHFCDVLDMLIPTGEPCPEPLRTYGLPCHCPFKEGTYSLPKSEFVVPDLELPSWLTTGNYRIESVLSSSGKRLGCIKIAASLKGI
2	GM2AP	MQSLMQAPLLIALGLLLAAPAQAHLKKPSQLSSFSWDNCDEGKDPAVIRSLTLEPDPIIVPGNVTLSVVGSTSVPLSSPLKVDLVLEKEVAGLWIKIPCTDYIGSCTFEHFCDVLDMLIPTGEPCPEPLRTYGLPCHCPFKEGTYSLPKSEFVVPDLELPSWLTTGNYRIESVLSSSGKRLGCIKIAASLKGI
3	GM2AP	MQSLMQAPLLIALGLLLAAPAQAHLKKPSQLSSFSWDNCDEGKDPAVIRSLTLEPDPIIVPGNVTLSVMGSTSVPLSSPLKVDLVLEKEVAGLWIKIPCTDYIGSCTFEHFCDVLDMLIPTGEPCPEPLRTYGLPCHCPFKEGTYSLPKSEFVVPDLELPSWLTTGNYRIESVLSSSGKRLGCIKIAASLKGIRHHHHHHHH

表 2. 本文所例示之重組抗體的胺基酸片段

SEQ ID NO:	名稱	序列 ( 粗體: CDR1; 斜體: CDR2; 有框: CDR3)
4	21-2B5-F8 LCVR	DIVMTQTASSVYVTPGESVSISCRST KSLLHSNGDTYLYWFLQRPGQSPQLLIY RMSNLAPGVPDRFSGGGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLE
5	21-2B5-F7 HCVR	EIQLQQSGAELVRPGTSVKISCMAS GYSFTGYNMNWVRQSHGRSLEWIGN INPYFGSPNYNQKFKGKATLTLDRSSNTAYMQLNRVTSEDSAVYYCASRQLGLGDTMDYWGQGTSVTVSS
6	21-4E3-C81 LCVR	DIVMTQSHKFMSTSVGDRVTITCKAS QDVSTAVGWYQQKPGQSPKLLIY WASTRHTGVPDRFTGSRFGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYITPWTFGGGTKLE
7	21-4E3-C81 HCVR	QVQLQQPGADFVKPGASVKLSCKAS GYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGN IYPGSGSTNYNEKFKNKATLTIDTSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCSRSTLYSYDDGSWGQGTTLTVSS
8	21-4E3-C82 LCVR	DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRAS QEISGDLSWLQQKPDGTIKRLIY AASTLASGVPKRFSGSRSGSDYSLTISGLESEDFADYYCLQYVSYPFTFGSGTKLE
9	21-4E3-C82 HCVR	QIQLQQSGPELGKPGASVKISCKAS DYTFTDFYISWVKQRPGQGLEWIGW IYPLDDHTKYNEKFKGKATLTVDISSNTVYMQLSSLTSEDSAVYFCARIYGYAMDYWGQGTSVTVSS

表 3. 編碼本文所例示之重組抗體的 LCVR/HCVR 的核苷酸序列

SEQ ID NO:	名稱	序列
10	21-2B5-F8 LCVR	gatattgtgatgacccagaccgcttcctccgtgtatgtgacccctggcgagtccgtgtccatttcctgccgctccaccaagtccctgctgcactccaacggcgacacctacctgtattggttcctgcagaggccaggccagtctccccagctgctgatctacaggatgagcaatctggcaccaggagtgcctgacagattcagcggaggaggatccggaaccgcctttacactgcggatctctagagtggaggccgaggatgtgggcgtgtactattgtatgcagcacctggagtatccttttacctttggagccgggactaaactggaa
11	21-2B5-F7 HCVR	gagatccagctgcagcagtctggagcagagctggtgcggccaggcacctctgtgaagatcagctgcatggcctccggctactctttcacaggctataacatgaattgggtgcggcagtcccacggcagatctctggagtggatcggcaacatcaatccctacttcggctcccctaactataatcagaagtttaagggcaaggccaccctgacactggacaggagctccaacaccgcctacatgcagctgaatcgcgtgacaagcgaggattccgccgtgtactattgtgcaagcaggcagctgggactgggcgacaccatggattattggggccagggcacctccgtgacagtgtctagc
12	21-4E3-C81 LCVR	gacatcgtgatgacccagtctcacaagttcatgtctacaagcgtgggcgacagggtgaccatcacatgcaaggcatcccaggacgtgagcaccgcagtgggatggtaccagcagaagccaggccagagccctaagctgctgatctattgggcatccaccaggcacacaggcgtgccagacagattcaccggctccagatttggcacagattacaccctgacaatcagctccgtgcaggccgaggatctggccctgtactattgtcagcagcactatatcaccccctggacatttggcggcggcacaaagctggag
13	21-4E3-C81 HCVR	caggtgcagctgcagcagccaggagcagacttcgtgaagcctggagcctccgtgaagctgtcttgcaaggccagcggctacacctttacaagctattggatcaactgggtgaagcagaggccaggacagggactggagtggatcggcaatatctaccccggctccggctctaccaactataatgagaagttcaagaacaaggccaccctgacaatcgataccagctcctctacagcctacatgcagctgagctccctgacctctgacgatagcgccgtgtactattgtagcagatccacactgtactcctatgacgatggctcttggggccagggcaccacactgacagtgtctagc
14	21-4E3-C82 LCVR	gacatccagatgacccagagcccaagctccctgtctgccagcctgggagagagggtgtccctgacatgcagggcatctcaggagatcagcggcgacctgtcctggctgcagcagaagcccgatggcaccatcaagcggctgatctacgcagcatctacactggcaagcggagtgcctaagcggttctccggctctagaagcggctccgattattccctgaccatctctggcctggagagcgaggactttgccgattactattgtctgcagtacgtgtcctatcccttcacctttggctctggcacaaagctggag
15	21-4E3-C82 HCVR	cagatccagctgcagcagtctggaccagagctgggcaagcctggagcctctgtgaagatcagctgcaaggcctccgactacaccttcacagacttctacatcagctgggtgaagcagaggccaggacagggactggagtggatcggctggatctaccccctggacgatcacaccaagtataacgagaagttcaagggcaaggccaccctgacagtggacatcagctccaataccgtgtacatgcagctgtctagcctgacaagcgaggactccgccgtgtacttttgtgccagaatctacggctatgccatggattattggggccagggcacctccgtgacagtgtcctct

表 4. 本文所例示之重組抗體的胺基酸片段

SEQ ID NO:	名稱	序列
16	21-2B5-F8 LCDR1	KSLLHSNGDTY
17	21-2B5-F8 LCDR2	RMS
18	21-2B5-F8 LCDR3	MQHLEYPFT
19	21-2B5-F7 HCDR1	GYSFTGYN
20	21-2B5-F7 HCDR2	INPYFGSP
21	21-2B5-F7 HCDR3	ASRQLGLGDTMDY
22	21-4E3-C81 LCDR1	QDVSTA
23	21-4E3-C81 LCDR2	WAS
24	21-4E3-C81 LCDR3	QQHYITPWTF
25	21-4E3-C81 HCDR1	GYTFTSYW
26	21-4E3-C81 HCDR2	IYPGSGST
27	21-4E3-C81 HCDR3	SRSTLYSYDDGS
28	21-4E3-C82 LCDR1	QEISGD
29	21-4E3-C82 LCDR2	AAS
30	21-4E3-C82 LCDR3	LQYVSYPFT
31	21-4E3-C82 HCDR1	DYTFTDFY
32	21-4E3-C82 HCDR2	IYPLDDHT
33	21-4E3-C82 HCDR3	ARIYGYAMDY

以下描述根據本文的某些示例性實施例。 重組抗 GM2AP 抗體或其抗原結合片段

根據本文的一個實施例，本文提供了一種重組抗體，其能特異性地結合GM2活化蛋白（GM2AP）（「抗GM2AP抗體」）或其抗原結合片段。本實施例的GM2AP可包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的胺基酸序列。本實施例的抗GM2AP抗體或其抗原結合片段可與SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之胺基酸57至70的一或多個胺基酸殘基進行特異性結合。較佳地，抗GM2AP抗體或其抗原結合片段可於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的胺基酸57至70與GM2AP特異性結合。換言之，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的胺基酸57至70形成本實施例中抗GM2AP抗體或其抗原結合片段的表位。

如本文所用，「與GM2AP特異性結合」的抗體是指與GM2AP結合的抗體，其結合值K _D小於1x 10 ^-8M，小於1x 10 ^-9M，小於1x 10 ^-10M，小於1x 10 ^-11，或甚至更小。

抗GM2AP抗體或其抗原結合片段可包括一個輕鏈可變區（LCVR）和一個重鏈可變區（HCVR）。在一些實施方案中，LCVR可包括與SEQ ID NO：4、6或8具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）同一性的胺基酸序列。同時，HCVR較佳係包括與SEQ ID NO：5、7或9具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）同一性的胺基酸序列。更佳地，該LCVR和HCVR對可以分別包括與SEQ ID NO：4/5、6/7、8/7、6/9或8/9具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）同一性的胺基酸序列對。

此外，LCVR可包括三個輕鏈互補決定區（LCDR1、LCDR2和LCDR3）。LCDR1、LCDR2和LCDR3中的每一個都可以包括與SEQ ID NO：16、17、18、22、23、24、28、29或30至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）同一性的胺基酸序列。同時，HCVR可包括三個重鏈互補決定區（HCDR1、HCDR2和HCDR3）。HCDR1、HCDR2和HCDR3中的每一個可以包括與SEQ ID NO：19、20、21、25、26、27、31、32或33至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）同一性的胺基酸序列。

更佳地，LCDR1/LCDR2/LCDR3可分別具有與SEQ ID NO：16/17/18、22/23/24或28/29/30為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）同一性的的胺基酸序列。此外，HCDR1/HCDR2/HCDR3可以分別具有與SEQ ID NO：19/20/21、25/26/27或31/32/33為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）同一性的胺基酸序列。再更佳的是，LCDR1/LCDR2/LCDR3/HCDR1/HCDR2/HCDR3可以分別具有與SEQ ID NO ：16/17/18/19/20/21、22/23/24/25/26/27、28/29/30/25/26/27、22/23/24/31/32/33或28/29/30/31/32/33為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）同一性的胺基酸序列。

此處所用之抗GM2AP抗體或其抗原結合片段可為雙體（diabody）、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、經雙硫鍵穩定之Fv片段（disulfide stabilized Fv fragment，dsFv）、(dsFv) ₂、雙特異性dsFv (dsfv-dsfv’)、經雙硫鍵穩定之雙體（disulfide stabilized diabody，ds diabody）、單鏈抗體分子（single-chain antibody molecule，scfv）、scfv二聚體（scfv dimer，雙價雙體（bivalent diabody））或其任意組合。此外，抗GM2AP抗體或其抗原結合片段可為單株抗體、多特異性抗體、小鼠抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體或其任意組合。較佳地，重組抗體或其抗原結合片段係人類抗體或小鼠抗體。較佳地，重組抗體或其抗原結合片段係人類抗體。 編碼重組抗 GM2AP 抗體或其抗原結合片段之多核苷酸，以及包含其之載體與宿主細胞

根據本文的一個實施例，還提供了一種多核苷酸，其編碼本文中提到的任何一種抗GM2AP抗體或其抗原結合片段。 該多核苷酸可包括與SEQ ID NO：10至15具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）同一性的核酸序列。在一些實施方案中，編碼前述實施例之重組抗體或其抗原結合片段的LCVR的核酸序列可與SEQ ID NO：10、12或14具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）的同一性。同時，編碼前述實施例之重組抗體或其抗原結合片段的HCVR的核酸序列可以與SEQ ID NO：11、13或15有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）的同一性。

此外，前述實施例的抗GM2AP抗體或其抗原結合片段的LCVR/HCVR對，可分別由與SEQ ID NO：10/11、12/13、14/13、12/15或14/15為至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98、99%或100%（或兩者之間的任何百分比）的核酸序列對所編碼。

在一些實施方案中，多核苷酸與編碼前述胺基酸序列者實質上相同。實質上相同的序列可以是多形態序列（polymorphic sequences），即族群中的替代序列或等位基因。實質上相同的序列也可以包括誘變的序列，包括包含沉默突變的序列。突變可以包括一或多個核苷酸殘基的變化，一或多個核苷酸殘基的缺失，或一或多個額外核苷酸殘基的插入。基於核酸編碼的退行性，實質上相同的序列也可以包括在本文所公開的胺基酸序列中任何指定胺基酸位置上編碼相同胺基酸的各種核苷酸序列。

基於本文的目的，還提供了一種包含上述多核苷酸的載體。此外，還提供了包含如上所述載體的宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞可以是真核細胞，較佳是人工選擇或基因工程化的。真核細胞可包括但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO細胞、BHK細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6®細胞、COS細胞、239F細胞、SF9細胞、SF21細胞及其組合。

一般來說，多核苷酸、載體和包含其之宿主細胞可用於產生前述實施例所提供的抗GM2AP抗體或其抗原結合片段。特言之，本實施例的多核苷酸可以是，例如，DNA或RNA，可以包含或不包含內含子序列。較佳地，多核苷酸可以是cDNA分子。

本實施例的多核苷酸可以藉由所屬技術領域已知的任何方法分離和獲得。例如，若抗體的核苷酸序列是已知的，編碼抗體的多核苷酸可以由化學合成的寡核苷酸組裝而成。舉例來說，這將涉及合成重疊之寡核苷酸（其含有編碼抗體的部分的序列），黏合（annealing）並連接這些寡核苷酸，然後透過PCR來擴增所連接的寡核苷酸。本文所揭露的多核苷酸也可以從任何其他合適的核酸來源產生，如抗體cDNA文庫，或從任何表現抗體的組織或細胞（如從選擇表現抗體的融合瘤細胞）所分離的cDNA文庫。編碼由宿主細胞（如融合瘤）製造的抗GM2AP抗體的輕鏈和重鏈的cDNA，可以藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術來獲得。對於使用噬菌體展示技術（phage display techniques）所獲得的抗體，編碼前述實施例所提供的抗GM2AP抗體的多核苷酸，可以從庫的各種噬菌體殖株中回收。在一些實施方案中，任何揭露的多核苷酸或分離的核酸可被納入表現載體中。用於在各種人類和動物細胞類型中表現的適當載體是本技術領域已知的。在一些實施方案中，係提供包括載體的宿主細胞。適當的宿主細胞例如包括，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO細胞、BHK細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6®細胞、COS細胞、239F細胞、SF9細胞、SF21細胞及/或其他人類或非人類細胞株。在一些實施方案中，當在培養基中培養時，宿主細胞可以瞬時或穩定地表現載體上的多核苷酸或分離的核酸，從而提供一種產生本文所揭露的抗體或片段的方法。

當獲得編碼V _H和V _L片段的DNA片段時，這些DNA片段可以藉由標準的重組DNA技術來進一步操作，例如將可變區基因轉換為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼V _L或V _H的DNA片段與另一個DNA分子，或編碼另一種蛋白質的片段，如抗體恆定區或可撓性連接子，係進行可操作性連接。術語「可操作性連接」在此係指兩個DNA片段以功能性的方式連接，例如使兩個DNA片段編碼的胺基酸序列保持在讀取框內（in-frame），或使蛋白質在所需啟動子的控制下進行表現。

藉由將編碼V _H區的DNA與另一個編碼重鏈恆定區（CH1、CH2和CH3）的DNA分子進行可操作性連接，可以將分離出來的編碼V _H區的DNA轉換成全長的重鏈基因。小鼠和人類（或其他哺乳動物）重鏈恆定區基因的序列在本技術領域是已知的（例如，參見Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242），包含這些區域的DNA片段可以透過標準PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。在一些實施方案中，重鏈恆定區是選自於在IgG1同型。對於Fab片段重鏈基因，編碼V _H的DNA可以與另一個只編碼重鏈CH1恆定區的DNA分子進行可操作性連接。

編碼V _L區的經分離DNA可以藉由編碼V _L的DNA與另一個編碼輕鏈恆定區CL的DNA分子進行可操作性連接，而轉換為全長的輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。小鼠和人類（或其他哺乳動物）輕鏈恆定區基因的序列在本技術領域是已知的（例如，參見Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242），包含這些區域的DNA片段可以透過標準PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可以是kappa或lambda恆定區。

為了建立scFv基因，編碼V _H和V _L的DNA片段係可操作性地連接另一個編碼可撓性連接子的片段，例如編碼胺基酸序列（Gly4-Ser） ₃，致使V _H和V _L序列可以作為一個連續的單鏈蛋白來表現，而V _L和V _H區由可撓性連接子連接（例如，參見Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et at., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554）。 偵測作為肺癌生物標記的 GM2AP 之套組

根據本文的一個實施例，還提供了一種用於檢測生物樣品中GM2活化蛋白（GM2AP）的套組。該套組可包括本文中提到的抗GM2AP抗體或其抗原結合片段。較佳地，該實施例的套組可進一步包括受質（substrate）和二級抗體，該抗體與訊號產生單元接合（conjugate），並結合至抗GM2AP抗體或其抗原結合片段的Fc結構域。受質被配置為與訊號產生單元進行反應以產生訊號。此外，套組還可進一步包括阻斷溶液及/或清洗溶液。較佳地，阻斷溶液可包括脫脂牛奶、牛血清白蛋白或酪蛋白，清洗溶液可包括磷酸鹽緩衝液（Phosphate buffered saline，PBS）、Tris緩衝液（Tris-buffered saline，TBS）、含有清潔劑（detergent）的PBS或含有清潔劑（detergent）的TBS。

在某些實施方案中，生物樣品包含全血、血清、血漿、尿液或其組合。較佳地，生物樣品係尿液。此外，訊號產生單元可包含輻射性標誌、螢光標誌、磷光標誌、化學冷光標誌或標籤性酵素。較佳地，標籤性酵素可包含辣根過氧化酶（horseradish peroxidase）或鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）。

更佳地，若訊號產生單元為辣根過氧化酶，則受質為四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）。

在某些實施方案中，套組可更偵測總蛋白質的含量或肌酸酐的含量。

在前述任一實施方案中，用於偵測GM2AP含量及/或總蛋白質的含量或肌酸酐的含量之套組包括但不限於ELISA套組、生物感測器、生物晶片、快篩。 用於評估個體罹患肺癌的風險的方法

本文還提供了一種藉由前述抗GM2AP抗體或其抗原結合片段，或更具體地說，藉由前述實施例的套組來檢測生物樣品中的GM2活化蛋白（GM2AP）來評估個體罹患肺癌的風險的方法。本實施例的方法可包括以下步驟： (a) 以本文所述之重組抗體或其抗原結合片段或套組判定生物樣品中GM2AP的含量； (b) 判定該生物樣品中總蛋白質的含量或肌酸酐的含量； (c) 將GM2AP的含量除以總蛋白質的含量或肌酸酐的含量以計算G/T比值；以及 (d) 根據G/T比值判定個體罹患肺癌的風險。

在一些實施例中，步驟(a)可更包括以下步驟： (a-1) 將重組抗體或其抗原結合片段施用至生物樣品； (a-2) 將所述生物樣品與接合有可偵測標籤的二級抗體共同孵育； (a-3)偵測所述可偵測標籤；以及 (a-4) 基於步驟(a-3)的結果判定生物樣品中該GM2AP的含量。

為了本文之目的，生物樣品可包含全血、血清、血漿、尿液或其組合，且二級抗體係結合至該抗GM2AP抗體或其抗原結合片段的Fc域。較佳地，生物樣品係尿液。在一些實施例中，可偵測標籤可包含鹼性磷酸酶。同時，步驟(a-3)可藉由以下方式來執行：將可偵測標籤與對硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate）溶液共同孵育，並在OD ₄₀₅測量其吸光度。

或者，可偵測標籤可包含辣根過氧化酶，而步驟(a-3)可藉由以下方式來執行：將可偵測標籤與四甲基聯苯胺（TMB）溶液共同孵育，並在OD ₄₅₀測量其吸光度。

在一些實施例中，步驟(b)可藉由以下所執行：偵測生物樣品中總蛋白質的含量及判定OD ₅₆₂的吸光度，其中總蛋白質的含量係透過二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）測定法進行偵測。

或者，步驟(b)可以藉由以下所執行：偵測生物樣品中總蛋白質的含量及判定OD ₅₉₅的吸光度，其中該總蛋白質的含量係透過布拉德福（Bradford）蛋白質測定法進行偵測。

在一些實施例中，當G/T比值大於200.00 ng/mg時，個體被診斷為罹患肺癌。或者，當G/T比值介於20.00 ng/mg至200.00 ng/mg之間時，個體被判定為肺癌的高風險族群。較佳地，當G/T比值介於30.00 ng/mg至200.00 ng/mg之間時，個體被判定為肺癌的高風險族群。更佳地，當G/T比值介於30.587 ng/mg至200.00 ng/mg之間時，個體被判定為肺癌的高風險族群。

對於本技術領域具有通常知識者來說，顯然可以對所揭露之實施例進行各種修飾和變化。以下實驗例係旨在示例性說明。 實驗例

以下個實驗例所用之材料可商購獲得，或是由所屬技術領域具有通常知識者從與相關之可商購獲得材料所簡單獲得而無須過度實驗。 抗人類 GM2AP 小鼠抗體之產生與純化

人類GM2AP基因源自NCBI蛋白質資料庫。GM2AP的胺基酸序列列於表1。在本文中，GM2AP或GM2AP的胜肽片段被腹腔注射到BALB/C小鼠體內以產生單株抗體。 具體來說，在一個實施方案中，與(GlcNAc) ₂Fuc(Man) ₃連接的GM2AP(SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2)被用來在待測個體中誘發抗體。在另一個實施方案中，為方便純化，用聚His標記（如8個組胺酸）的GM2AP（SEQ ID NO: 3）被用於誘發個體的抗體。也可以應用其他標籤，如FLAG、Myc、HA等。

為了產生特異性識別GM2AP的單株抗體，簡言之，重組GM2AP（SEQ ID NO：3）在SF9細胞和/或SF21細胞中進行表現。所表現的重組GM2AP透過Ni Excell管柱加以純化（緩衝液A：0.3M氯化鈉，25mM磷酸鈉，20mM咪唑，pH8.0；緩衝液B：0.3M氯化鈉，25mM磷酸鈉，500mM咪唑，pH8.0；透析緩衝液：0.3M氯化鈉，25mM磷酸鈉，pH8.0）。SF21細胞裂解液首先透過0.22 μM膜來過濾。用緩衝液A對Ni Excell柱進行預平衡，然後將過濾的細胞裂解液裝載至管柱中。用緩衝液A清洗管柱，用4%、8%、16%、50%和100%的緩衝液B從管柱上洗脫重組GM2AP。收取16%和8%的組分並在透析緩衝液中進行透析。

經純化的GM2AP被腹腔注射到BALB/C小鼠體內以產生單株抗體。之後，犧牲小鼠，將活化的脾臟細胞與黑色素瘤細胞融合，以產生融合瘤。將所有融合瘤殖株中對GM2AP顯示出最高的親和力的殖株，腹腔注射到小鼠體內以產生腹水，用以擴增抗體。在所有殖株中顯示出對GM2AP的最高親和力的抗體殖株被進一步選擇用於進一步研究，例如殖株編號21-2B5-F7、21-2B5-F8、21-4E3-C81、21-4E3-C82等。

此外，對殖株編號21-2B5-F7、21-2B5-F8、21-4E3-C81及21-4E3-C82的小鼠抗體進行序列分析。LCVR/HCVR的胺基酸序列及對應的CDRs（LCDR1至3和HCDR1至3）顯示在表2。編碼這些單株抗體的LCVR/HCVR的核酸序列顯示在表3。 重組 GM2AP 抗體之產生與純化

特異性結合GM2AP的重組抗GM2AP抗體的LCDR、HCDR、LCVR和HCVR的核酸和胺基酸序列列於表2至4。

在本文中，重組抗GM2AP抗體經過密碼子優化並合成，用於用pcDNA3.4-TOPO（Thermo Fisher Scientific）載體在哺乳動物細胞中表現，將該載體轉染到Expi293細胞(Thermo Fisher Scientific )中。其他適合的宿主細胞包括但不限於239F細胞、BHK細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6®細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、SF9細胞、SF21細胞及其組合。經轉染的細胞在1 L培養基中在37 °C、125 rpm、8% CO ₂環境下生長。在轉染後144小時收穫經轉染的細胞，並在4℃下以2,000 × g離心1小時。接著，將上清液透過0.22 μm過濾器來過濾。

重組抗GM2AP抗體可以用蛋白質G親和管柱(GE Healthcare)快速且可靠地純化。依照製造商的說明書將過濾的上清液裝載到蛋白質G管柱上，使用PBS平衡管柱（結合緩衝液）並使用0.7%乙酸（洗脫緩衝液）洗脫抗體。透過測量280 nm處的吸光度來監測洗脫。 非變性及 SDS-PAGE 分析

以不含二硫蘇糖醇（DTT）的上樣緩衝液或含有0.55 M β-巰基乙醇（BME）的樣品緩衝液稀釋重組抗GM2AP抗體（5 μg），加至10 %非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）或十二烷基硫酸鈉（SDS）PAGE的各個泳道中，並在室溫（RT）下以0.25%考馬斯藍染色30分鐘，並在RT下用ddH ₂O脫色2小時。重組抗GM2AP抗體包括GBF1、GEC1、GEC2、GEC3和GEC4（列於下表5）。 表 7. 抗 GM2AP 抗體

抗體	LCVR/HCVR
GBF1	21-2B5-F8 LC/21-2B5-F7 HC
GEC1	21-4E3-C81 LC/21-4E3-C81 HC
GEC2	21-4E3-C82 LC/21-4E3-C81 HC
GEC3	21-4E3-C81 LC/21-4E3-C82 HC
GEC4	21-4E3-C82 LC/21-4E3-C82 HC

捕獲抗體的製備

以塗佈緩衝液（0.05 M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液，pH 9.6，Sigma）稀釋重組抗GM2AP抗體，例如GBF1、GEC1、GEC2、GEC3或GEC4，以製備5 μg的終濃度/mL塗佈試劑。在96孔盤的每孔中加入100 μL塗佈試劑。貼上密封膜（Bersing）後，將96孔盤在4℃下培養16至20小時。孵育後，將各孔中的液體完全移除，接著用清洗緩衝液將每個孔清洗數次。最後貼上密封膜，在-20℃下保存。 偵測抗體的製備

使用HRP接合套組（Abcam）將辣根過氧化物酶（HRP）接合至偵測抗體。將50 µg經純化的抗GM2AP抗體（例如GBF1、GEC1、GEC2、GEC3或GEC4）與5 µL修飾劑和100 µg HRP混合物混合，產生接合混合物。接著根據製造商的說明書猝滅接合混合物的接合反應。經HRP接合的偵測抗體與甘油混合，在-20℃下保存。此外，訊號產生單元包含輻射性標誌、螢光標誌、磷光標誌、化學冷光標誌或標籤性酵素。較佳地，標籤性酵素包含HRP或鹼性磷酸酶。 生物樣品的採集

從台灣取得100名健康捐贈者和100名肺癌患者的人類尿液樣品。表6顯示了研究族群，包括健康捐贈者和肺癌患者。健康組尿液樣品顯示男性58例、女性42例，平均年齡50歲（範圍20至79歲）；患者尿液樣品也顯示男性58例、女性42例，平均年齡69歲（範圍38至93歲）。所有尿液樣本均收集10 mL在收集管中。接著，將尿液樣品在4°C下以1,000 × g離心5分鐘，以去除細胞汙染物和碎片。將上清液收集在15 mL滅菌離心管中，並儲存於-80 °C直至進一步分析。另外，生物樣品可包括全血、血清、血漿或其組合。 G/T 比值的偵測和計算方法

在本實施例中，提供了透過重組抗GM2AP抗體檢測和計算尿液樣品或其他生物樣品中G/T比值的方法。此方法包括以下步驟：(a)將上述產生的重組抗體施用至生物樣品；(b)將該生物樣品與接合有可偵測標籤的二級抗體共同孵育；(c)偵測該可偵測標籤；(d)測定該生物樣本中GM2AP的含量和總蛋白或肌酸酐含量；(e) 將該GM2AP的含量除以該總蛋白質的含量或該肌酸酐的含量以計算G/T比值。圖2顯示了人類尿液樣品的收集以及上述G/T比值的偵測和計算方法。 用三明治 ELISA 偵測尿液中的 GM2AP

以96孔盤進行三明治ELISA，每孔以0.5 μg經純化的捕獲抗體在RT下塗佈10分鐘。阻斷後，將人類尿液樣品稀釋10倍至200倍，加入被捕獲抗體塗佈的各孔中，在37℃下孵育1小時。清洗後，在每孔中加入0.42 µg HRP接合的偵測抗體（每孔 100 µL）。透過在每孔中添加100 µL四甲基聯苯胺（TMB，Thermo Fisher Scientific）顯色10分鐘，接著在每孔中添加100 µL 2N 硫酸（sigma）以終止顯色反應，然後測量450 nm處的吸光度。重組GM2AP透過2倍序列稀釋進行稀釋。使用相同的捕獲偵測抗體對和含量，以及相同的96孔盤進行三明治ELISA，以計算人類尿液樣品中GM2AP的含量。此外，捕獲-偵測抗體對有20種配對組合，以偵測人類或哺乳動物生物樣品中GM2AP的含量。 二辛可寧酸蛋白質測定法用於偵測尿液中的總蛋白

二辛可寧酸（BCA）蛋白質測定法是按照Pierce BCA蛋白質測定套組（Thermo Fisher Scientific）製造商的說明書，透過96孔盤用ELISA進行的。以牛血清白蛋白（BSA）作為標準品，以2倍序列稀釋進行定量，並測量562 nm處的吸光度，繪製線性反應曲線。此反應曲線可以準確測定總蛋白濃度。BCA蛋白質測定法係將人類尿液稀釋10倍至200倍，與BSA線性反應曲線相對應，計算人類尿液樣品中總蛋白質含量。另一種蛋白質測定法是布拉德福（Bradford）蛋白質測定法，它也使用BSA作為標準來定量並產生線性反應曲線，並測量595 nm處的吸光度。 G/T 比值的計算

在同一生物樣本中，G/T比值係透過以下等式計算的。 G/T比值可作為辨識肺癌高危險群或診斷肺癌的指標。G/T比值的臨床數據可以進一步進行統計分析。此外，如下式所示，G/T比值也可以透過將總蛋白質含量替換為肌酸酐含量來計算。 統計分析

所有數據均以平均值 ± 標準差（SEM）來表示。使用easyROC進行統計分析。接收器操作特徵（receiver operating characteristic，ROC）曲線顯示區分患者和健康捐贈者的G/T比值的靈敏度和特異性之間的分界。以Mann-Whitney U檢定評估G/T比值與肺癌患者之間的相關性。 p值小於0.05被認為是統計學上顯著的。 結果 重組 GM2AP 抗體之產生

五種重組抗體（GBF1、GEC1、GEC2、GEC3和GEC4，列於表5）均包含輕鏈可變區（LCVR）以及重鏈可變區（HCVR），此輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區（LCDR1至3）序列，此重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區（HCDR1至3）序列（表2至4）。在本實施例中，所有重組抗體的輕鏈恆定區均為小鼠κ恆定區，所有重組抗體的重鏈恆定區均與小鼠IgG1連接。為了確認重組抗GM2AP抗體的產生和純化，透過非變性PAGE和SDS-PAGE分析了五種重組抗體（GBF1、GEC1、GEC2、GEC3 和 GEC4，列於表5）。圖1顯示非變性PAGE和SDS PAGE上的GBF1、GEC1、GEC2、GEC3和GEC4條帶。如圖1所示，GBF1的輕鏈和重鏈的分子量分別為24.3和49.0 kDa；GEC1和GEC3的輕鏈分子量均為23.9 kDa；GEC2和GEC4的輕鏈分子量均為23.6kDa；GEC1和GEC2的重鏈分子量均為48.7 kDa；GEC3和GEC4的重鏈分子量均為48.8kDa。 偵測尿液樣品中 GM2AP 和總蛋白質

將重組GM2AP進行2倍序列稀釋，以進行ELISA分析，包括但不限於直接、間接、三明治和競爭型。較佳地，三明治ELISA似乎比其他類型具有更高的靈敏度和特異性。在本實施例中，使用20個不同的捕獲－偵測抗體對來偵測重組GM2AP的含量。圖3顯示了以GBF1為捕獲抗體，GEC3為HRP接合的偵測抗體所偵測到的GM2AP的標準曲線，該標準曲線可用於計算來自健康捐贈者和肺癌患者的尿液樣品中的GM2AP濃度。

此外，將BSA進行2倍序列稀釋，以透過ELISA讀取器進行BCA蛋白質測定法進行偵測。圖4顯示了用於計算來自健康捐贈者和肺癌患者的尿液樣品中的總蛋白質濃度的BSA標準曲線。 尿液樣品中的 G/T 比值

以ELISA分析法測定從100名健康捐贈者和100名肺癌患者所獲得的尿液樣品中的G/T比值。表6顯示所有肺癌患者的G/T比值的平均值為92.61 ± 61.3 ng/mg，所有健康捐贈者的G/T比值的平均值為15.52 ± 22.2 ng/mg。此結果顯示，健康男性尿液中的平均G/T比值與健康女性相比沒有統計學上的差異（p ＞ 0.05），但男性患者尿液中的平均G/T比值顯著高於女性患者（p ＜ 0.05）。此外，與健康捐贈者相比，尿液中的G/T比值增加了5.97 ± 2.8倍。 表6.尿液中G/T 比值水平的分佈。

		G/T 比值(ng/mg)
		尿液
參數	n	平均值 ± SD	p 值
健康捐贈者
年齡
中位數，50歲（範圍，20至79歲）	100	15.52±22.2
性別
男性	58	16.52±23.7	0.5969
女性	42	14.13±20.3
肺癌患者
年齡
中位數，69歲（範圍，38至93歲）	100	92.61±61.3	3.36x10 -185
性別
男性	58	104.80±68.3	0.0187
女性	42	75.77±45.8

健康捐贈者和肺癌患者的尿液樣品中的G/T比值的ROC曲線分析顯示在圖5，在30.587 ng/mg 的分界點處的AUC為0.949，且這些結果預測正確率為95%，其提供 100.0%的靈敏度和85.0%的特異性。如圖5D所示，有15個來自健康捐贈者的尿液樣品，其G/T比值高於分界點，特別是其中一個的G/T比值為115.99 ng/mg。另一方面，表6顯示，有25個來自男性患者的尿液樣品的G/T比值高於104.80 ng/mg，以及15個來自女性患者的尿液樣品的G/T比高於75.77 ng/mg。如圖5D所示，來自患者的9個尿液樣品的G/T比值均高於200.00 ng/mg。這些結果顯示肺癌患者尿液中的G/T比值顯著增加（p ＜ 0.05）。因此，G/T比值可作為兩個指標，其一是當比值高於200.00 ng/mg時用於診斷肺癌，其二是當比值高於預定的分界點（例如，30.587 ng/mg）時可用於識別肺癌高危險群。

這種新的檢測方法可以輔助任何醫學影像，包括但不限於CT、LDCT、X射線、磁振造影（MRI）、正子斷層掃描（PET）及其組合，在肺癌潛在患者的臨床診斷中用以篩選和診斷肺癌。此外，這種新方法還可以應用於多種生物樣品，例如全血、血清、血漿或其組合，並開發各種篩選和檢測套組，例如但不限於ELISA套組、生物感測器、生物晶片和快篩。

無需進一步闡述，咸信本技術領域具有通常知識者可以根據上述描述，最大限度地利用本發明。因此，所述具體實例應被理解為僅僅是說明性的，而非以以任何方式限制本文的其餘部分。

本文引用的所有參考文獻（例如出版物或專利或專利申請案）均通過引用將其整體併入本文，其程度與每個單獨的參考文獻（例如出版物或專利或專利申請案）具體和單獨地指出藉由引用將其整體併入本文的程度相同，以用於所有目的。其他實施例係涵括在後附之申請專利範圍中。

無

圖1顯示五種抗GM2AP抗體殖株GBF1、GEC1、GEC2、GEC3及GEC4的非變性PAGE及SDS PAGE分析的染色結果。

圖2顯示評估個體罹患肺癌風險方法的流程。

圖3顯示以GBF1為捕獲抗體、GEC3為接合HRP的偵測抗體，藉由三明治ELISA法偵測GM2AP的標準曲線。

圖4顯示藉由BCA蛋白質分析法與ELISA讀取器偵測BSA的標準曲線。

圖5顯示了健康捐贈者和肺癌患者尿液樣品中G/T比值的ROC曲線分析。在30.587 ng/mg的分界點，尿液中G/T比值的AUC為 0.95 (A)，靈敏度為 100.0%，特異性為85.0% (B)。折線圖（C）和點長條圖（D）顯示了健康捐贈者和肺癌患者尿液樣品中G/T比值的分佈情況。

無

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Claims (20)

1. 一種特異性結合GM2活化蛋白(GM2-activator protein，GM2AP)的重組抗體或其抗原結合片段，其中該重組抗體或其抗原結合片段包含：一輕鏈可變區(LCVR)，包括三個輕鏈互補決定區(LCDR1至3)；以及一重鏈可變區(HCVR)，包括三個重鏈互補決定區(HCDR1至3)；其中LCDR1/LCDR2/LCDR3/HCDR1/HCDR2/HCDR3各依序包含SEQ ID NO：16/17/18/19/20/21之胺基酸序列。
2. 根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段，其中該LCVR包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列，且該HCVR包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。
3. 根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段，其中：該重組抗體或其抗原結合片段係選自由下列所組成之群組：雙體(diabody)、Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv片段、經雙硫鍵穩定之Fv片段(disulfide stabilized Fv fragment，dsFv)、(dsFv)₂、雙特異性dsFv(dsfv-dsfv’)、經雙硫鍵穩定之雙體(disulfide stabilized diabody，ds diabody)、單鏈抗體分子(single-chain antibody molecule，scfv)、scfv二聚體(scfv dimer，雙價雙體(bivalent diabody))及其任意組合；或該重組抗體或其抗原結合片段係選自由下列所組成之群組：單株抗體、多特異性抗體、小鼠抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體及其任意組合。
4. 一種套組，用以在生物樣品中偵測GM2活化蛋白(GM2AP)，GM2AP係肺癌的生物標記，其中該套組包含根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段。
5. 根據請求項4之套組，更包含受質及二級抗體，該二級抗體接合訊號產生單元並與該重組抗體或其抗原結合片段的Fc域結合。
6. 根據請求項4之套組，其中該生物樣品包含全血、血清、血漿、尿液或其組合。
7. 根據請求項4之套組，其中該訊號產生單元包含輻射性標誌、螢光標誌、磷光標誌、化學冷光標誌或標籤性酵素。
8. 根據請求項7之套組，其中該標籤性酵素包含辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)或鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)。
9. 根據請求項8之套組，其中當該訊號產生單元為辣根過氧化酶時，該受質為四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)。
10. 根據請求項4之套組，更包含阻斷溶液(blocking solution)，該阻斷溶液包含脫脂牛奶、牛血清白蛋白或酪蛋白。
11. 根據請求項4之套組，更包含清洗溶液(wash solution)，該清洗溶液包含磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline，PBS)、Tris緩衝液(Tris-buffered saline，TBS)、含有清潔劑(detergent)的PBS或含有清潔劑(detergent)的TBS。
12. 一種評估個體罹患肺癌的風險之方法，包含：(a)以根據請求項1之重組抗體或其抗原結合片段或以根據請求項4之套組判定生物樣品中GM2AP的含量；(b)判定該生物樣品中總蛋白質的含量或肌酸酐的含量；(c)將該GM2AP的含量除以該總蛋白質的含量或該肌酸酐的含量以計算G/T比值；以及(d)根據該G/T比值判定該個體罹患肺癌的風險；其中當該G/T比值大於200.00ng/mg時，該個體被診斷為罹患肺癌；當該G/T比值介於20.00ng/mg至200.00ng/mg之間時，該個體被判定為肺癌的高風險族群。
13. 根據請求項12之方法，其中該生物樣品包含全血、血清、血漿、尿液或其組合。
14. 根據請求項12之方法，其中該步驟(a)更包含：(a-1)將該重組抗體或其抗原結合片段施用至該生物樣品；(a-2)將該生物樣品與接合有可偵測標籤的二級抗體共同孵育；(a-3)偵測該可偵測標籤；以及(a-4)基於該步驟(a-3)的結果判定該生物樣品中該GM2AP的含量。
15. 根據請求項14之方法，其中該二級抗體係結合至該抗體或其抗原結合片段的Fc域。
16. 根據請求項14之方法，其中該可偵測標籤包含鹼性磷酸酶或辣根過氧化酶。
17. 根據請求項14之方法，其中該步驟(a-3)係藉由以下所執行：將該可偵測標籤與四甲基聯苯胺(TMB)溶液共同孵育，並在OD₄₅₀判定其吸光度。
18. 根據請求項12之方法，其中該步驟(b)係藉由以下所執行：偵測該生物樣品中總蛋白質的含量及判定OD₅₆₂的吸光度，其中該總蛋白質的含量係透過二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)測定法偵測。
19. 根據請求項12之方法，其中該步驟(b)係藉由以下所執行：偵測該生物樣品中總蛋白質的含量及判定OD₅₉₅的吸光度，其中該總蛋白質的含量係透過布拉德福(Bradford)蛋白質測定法偵測。
20. 根據請求項12之方法，其中當該G/T比值介於30.587ng/mg至200.00ng/mg之間時，該個體被判定為肺癌的高風險族群。