TWI874225B - 多胺的檢測方法及檢測套組，以及癌症的體外診斷方法 - Google Patents

Abstract

一種多胺的檢測方法，用以解決習知檢測方法無法用以檢測多胺的問題。該多胺的檢測方法，包含：提供一待測樣品，該待測樣品含有多胺；將該待測樣品及一衍生試劑溶解於一工作溶媒中，以形成一待反應液，該衍生試劑具有一異硫氰酸酯官能基；使該待反應液中的多胺與該衍生試劑的異硫氰酸酯官能基進行一硫代胺基甲醯化反應，以獲得一衍生溶液，該衍生溶液包含一硫脲衍生物；及偵測該硫脲衍生物，以獲得一多胺強度值。藉此可以有效檢測該待測樣品中的多胺。本發明另關於應用於實施該多胺的檢測方法的檢測套組，以及應用該多胺的檢測方法的癌症的體外診斷方法。

Description

多胺的檢測方法及檢測套組，以及癌症的體外診斷方法

本發明係關於一種檢測方法，尤其是一種多胺的檢測方法。本發明另關於應用於實施該多胺的檢測方法的檢測套組，以及應用該多胺的檢測方法的癌症的體外診斷方法。

多胺（polyamine）為具有兩個以上的氨基（amino group）的有機化合物，最常見的例子為亞精胺［（spermidine），屬於三胺（triamine）］、四胺精胺［（spermine），屬於四胺（tetraamine）］及二者的雙胺類前驅物─腐胺［（putrescine），屬於二胺（diamine）］。

多胺能夠進行質子化反應（protonation）而形成帶正電的分子（cationic molecule），該些帶正電的分子能夠結合核酸（nucleic acid）與染色質（chromatin），進而影響一系列的細胞傳遞路徑。當細胞內的多胺合成（biosynthesis）被抑制時，細胞的生長就會嚴重受阻或停止，而在生長旺盛的癌症組織中，多胺的合成與分泌均會明顯增加，因此多胺的含量被認為是多種癌症的生物標記。

又，已知長期攝取高含量多胺，亦會使體內的多胺含量隨之提升，進而增加罹癌的風險，亦有減少攝取膳食中多胺以治療癌症的方法［稱為多胺阻斷療法（polyamine blocking therapy，簡稱為PBT）］，因此若能夠針對食品中的多胺含量進行檢測，亦能夠提供人們飲食攝取的參考。

然而，由於大多數的多胺為高極性物質，且不具有特異的紫外光發光團，亦缺乏螢光特性，使多胺難以以習知檢測方法進行檢測。有鑑於此，仍有必要提升一種多胺的檢測方法及檢測套組。

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種多胺的檢測方法，係可以有效檢測一待測樣品中的多胺者。

本發明的次一目的是提供一種多胺的檢測方法，係可以縮短檢測的時程者。

本發明的又一目的是提供一種多胺的檢測套組，係應用於實施如前述的多胺的檢測方法者。

本發明的再一目的是提供一種癌症的體外診斷方法，係應用如前述的多胺的檢測方法者。

本發明全文所記載的元件及構件使用「一」或「一個」之量詞，僅是為了方便使用且提供本發明範圍的通常意義；於本發明中應被解讀為包括一個或至少一個，且單一的概念也包括複數的情況，除非其明顯意指其他意思。

本發明的多胺的檢測方法，可以包含：提供一待測樣品，該待測樣品含有多胺；將該待測樣品及一衍生試劑溶解於一工作溶媒中，以形成一待反應液，該衍生試劑具有一異硫氰酸酯官能基；使該待反應液中的多胺與該衍生試劑的異硫氰酸酯官能基進行一硫代胺基甲醯化反應，以獲得一衍生溶液，該衍生溶液包含一硫脲衍生物；及偵測該硫脲衍生物，以獲得一多胺強度值。

據此，藉由使該待測樣品中的多胺的胺基與該衍生試劑（具有異硫氰酸酯官能基的異硫氰酸鹽）進行該硫代胺基甲醯化反應，進而可以獲得該硫脲衍生物，該硫脲衍生物能夠經由各種習知方法偵測其存在（例如，以液相層析法、氣相層析法等方式分離後，利用紫外光光譜法、螢光光譜法、或質譜分析法進行偵測），因此本發明的多胺的檢測方法具有良好的靈敏度、精密度及準確度，能夠降低該待測樣品的使用量，為本發明之功效。

本發明的多胺的檢測方法，其中，該衍生試劑可以為4-二甲基胺-萘基異硫氰酸酯、1-萘基異硫氰酸酯、苯甲基萘基異硫氰酸酯或烯丙基萘基異硫氰酸酯。如此，藉由該衍生試劑的選用，可以提升該待反應液中的多胺與該衍生試劑的異硫氰酸酯官能基反應而形成的硫脲衍生物的含量，進而能夠提升多胺的檢測效果。

本發明的多胺的檢測方法，其中，該工作溶媒可以為乙腈、丙酮、二甲基亞碸、吡啶、二甲基甲醯胺、二甲基丙烯基脲、環丁碸、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、1,3-二氧環戊烷、碳酸二甲酯或水。如此，藉由該工作溶媒的選用，可以提升該待測樣品及該衍生試劑的溶解效果，進而能夠提升多胺的檢測效果。

本發明的多胺的檢測方法，另可以包含：以微波的方式加熱該待反應液，以驅使該硫代胺基甲醯化反應的進行。舉例而言，能夠以100～750 W的微波該待反應液。如此，藉由以微波提供能量，能夠加速該硫代胺基甲醯化反應的進行，進而提升多胺的檢測效率。

本發明的多胺的檢測方法，另可以包含：於該待反應液中加入一鹼劑，續使溶解有該鹼劑之待反應液進行該硫代胺基甲醯化反應。舉例而言，該鹼劑可以為氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、4-二甲氨基吡啶或三乙胺。如此，藉由該鹼劑的添加，能夠使多胺的氨基發生去離子化作用（deprotonation），提升該氨基的親核性（nucleophilicity），能夠加速該硫代胺基甲醯化反應的進行，進而提升多胺的檢測效率。

本發明的多胺的檢測方法，另可以包含：於該衍生溶液中加入一移除試劑，使該移除試劑去除該衍生溶液中的脂溶性干擾物，並形成一上層溶液及一下層溶液，該下層溶液包含該硫脲衍生物，該移除試劑為與該衍生溶液不互溶，且logP介於3.5～7.0之間的一溶劑。舉例而言，該移除試劑可以為正己烷、正辛烷、正癸烷或十二烷。如此，藉由該移除試劑的添加，能夠有效移除過量的衍生試劑，避免過量的衍生試劑影響後續的分析結果，進而提升多胺的檢測精準度。

本發明的多胺的檢測方法，另可以包含：於該衍生溶液中加入一質子提供劑及一發泡鹽，使該質子提供劑與該發泡鹽反應形成二氧化碳氣體，並形成一上層溶液及一下層溶液，該上層溶液包含該硫脲衍生物。舉例而言，該質子提供劑可以為檸檬酸、氯化銨、硫酸銨或磷酸二氫鈉，該發泡鹽可以為碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、碳酸鉀或碳酸鈉。如此，藉由該質子提供劑與該發泡鹽的添加，可以產生二氧化碳氣體，能夠促進該衍生溶液中各分子的分散性，進而提升多胺的檢測效率。

本發明的多胺的檢測方法，另可以包含：在加入該質子提供劑及該發泡鹽之後，及形成該上層溶液及該下層溶液之前，將該衍生溶液置於一冷卻浴中。如此，藉由該冷卻浴能夠促進該上層溶液及該下層溶液的有效分層，進而能夠有效分離該硫脲衍生物，進而提升多胺的檢測精準度。

本發明的多胺的檢測方法，另可以包含：於該衍生溶液中加入一移除試劑、一質子提供劑及一發泡鹽，使該移除試劑去除該衍生溶液中的脂溶性干擾物，及使該質子提供劑與該發泡鹽反應形成二氧化碳氣體，並形成一上層溶液、一中層溶液及一下層溶液，該中層溶液包含該硫脲衍生物，該移除試劑為與該衍生溶液不互溶，且logP介於3.5～7.0之間的一溶劑。舉例而言，該移除試劑可以為正己烷、正辛烷、正癸烷或十二烷，該質子提供劑可以為檸檬酸、氯化銨、硫酸銨或磷酸二氫鈉，而該發泡鹽可以為碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、碳酸鉀或碳酸鈉。如此，藉由該移除試劑的添加，能夠有效移除過量的衍生試劑，避免過量的衍生試劑影響後續的分析結果，進而提升多胺的檢測精準度；而藉由該質子提供劑與該發泡鹽的添加，可以產生二氧化碳氣體，能夠促進該衍生溶液中各分子的分散性，進而提升多胺的檢測效率。

本發明的多胺的檢測方法，另可以包含：在加入該移除試劑、該質子提供劑及該發泡鹽之後，及形成該上層溶液、該中層溶液及該下層溶液之前，將該衍生溶液置於一冷卻浴中。如此，藉由該冷卻浴能夠促進該上層溶液、該中層溶液及該下層溶液的有效分層，進而能夠有效分離該硫脲衍生物，進而提升多胺的檢測精準度。

本發明的多胺的檢測套組，可以包含：一衍生試劑，具有一異硫氰酸酯官能基；及一工作溶媒，為可以溶解該衍生試劑及多胺的一溶劑。

據此，該檢測套組係能夠應用於實施如前述之多胺的檢測方法，有效地與多胺共同形成安定性良好的硫脲衍生物，工者因而可以因應需求選用各種習知方法來偵測該硫脲衍生物（例如，以液相層析法、氣相層析法等方式分離後，利用紫外光光譜法、螢光光譜法、或質譜分析法進行偵測），為本發明之功效。

本發明的多胺的檢測套組，其中，該衍生試劑可以為4-二甲基胺-萘基異硫氰酸酯、1-萘基異硫氰酸酯、苯甲基萘基異硫氰酸酯或烯丙基萘基異硫氰酸酯。如此，藉由該衍生試劑的選用，可以提升該待反應液中的多胺與該衍生試劑的異硫氰酸酯官能基反應而形成的硫脲衍生物的含量，進而能夠提升多胺的檢測效果。

本發明的多胺的檢測套組，該工作溶媒可以為乙腈、丙酮、二甲基亞碸、吡啶、二甲基甲醯胺、二甲基丙烯基脲、環丁碸、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、1,3-二氧環戊烷、碳酸二甲酯或水。如此，藉由該工作溶媒的選用，可以提升該待測樣品及該衍生試劑的溶解效果，進而能夠提升多胺的檢測效果。

本發明的多胺的檢測套組，另可以包含：一鹼劑，為可以溶於該工作溶媒中的一鹼性化合物。舉例而言，該鹼劑可以為氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、4-二甲氨基吡啶或三乙胺。如此，藉由該鹼劑的添加，能夠使多胺的氨基發生去離子化作用（deprotonation），提升該氨基的親核性（nucleophilicity），能夠加速該硫代胺基甲醯化反應的進行，進而提升多胺的檢測效率。

本發明的多胺的檢測套組，另可以包含：一移除試劑，為logP介於3.5～7.0之間的一溶劑。舉例而言，該移除試劑可以為正己烷、正辛烷、正癸烷或十二烷。如此，藉由該移除試劑的添加，能夠有效移除過量的衍生試劑，避免過量的衍生試劑影響後續的分析結果，進而提升多胺的檢測精準度。

本發明的多胺的檢測套組，另可以包含：一質子提供劑，用以提供氫離子；及一發泡鹽，用以與該質子提供劑進行一酸鹼中和反應以形成二氧化碳氣體。舉例而言，該質子提供劑可以為檸檬酸、氯化銨、硫酸銨或磷酸二氫鈉，該發泡鹽可以為碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、碳酸鉀或碳酸鈉。如此，藉由該質子提供劑與該發泡鹽的添加，可以產生二氧化碳氣體，能夠提升該衍生溶液中各分子的分散性，有助於鹽析作用的進行。

本發明的多胺的檢測套組，另可以包含：一移除試劑，為logP介於3.5～7.0之間的一溶劑；一質子提供劑，用以提供氫離子；及一發泡鹽，用以與該質子提供劑進行一酸鹼中和反應以形成二氧化碳氣體。舉例而言，該移除試劑可以為正己烷、正辛烷、正癸烷或十二烷，該質子提供劑可以為檸檬酸、氯化銨、硫酸銨或磷酸二氫鈉，而該發泡鹽可以為碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、碳酸鉀或碳酸鈉。如此，藉由該移除試劑的添加，能夠有效移除過量的衍生試劑，避免過量的衍生試劑影響後續的分析結果，進而提升多胺的檢測精準度；而藉由該質子提供劑與該發泡鹽的添加，可以產生二氧化碳氣體，能夠提升該衍生溶液中各分子的分散性，有助於鹽析作用的進行。

本發明的癌症的體外診斷方法，可以包含：以如前述之多胺的檢測方法，於體外檢測取自一疑似患者之一生物樣品中的多胺的含量，以獲得一檢測值；及比較該生物樣品的該檢測值與一參考值，當該檢測值高於該參考值顯示該疑似患者罹患癌症。舉例而言，該癌症可以為肝癌、前列腺癌、胰臟癌、大腸直腸癌、乳癌、淋巴瘤、纖維肉瘤、肺癌、胃癌或口腔癌。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式作詳細說明。

請參照第1圖所示，本發明之第一實施例的多胺的檢測方法可以包含：一樣品提供步驟S1、一衍生步驟S2及一分析步驟S3。

詳而言之，該樣品提供步驟S1中，係提供含有多胺的一待測樣品。舉例而言，該待測樣品可以來自一食品樣品或來自一生物樣品（例如一血液樣品、一尿液樣品、一唾液樣品、一腦脊髓液樣品或一口腔組織樣品）。當該待測樣品的基質過於複雜，例如包含蛋白質等大分子時，工者能夠先混合該待測樣品及一蛋白質沉澱劑（protein precipitant），該蛋白質沉澱劑可以為氫氧化鈉（sodium hydroxide，NaOH）、乙腈（acetonitrile）、甲醇（methanol）、乙醇（ethanol）、鹽酸（hydrochloric acid，HCl）或硫酸銨（ammonium sulfate，(NH ₄) ₂SO ₄）等，使該待測樣品中的蛋白質形成一蛋白質沉澱物，並藉由離心（例如，15,000 rpm、2分鐘）去除該蛋白質沉澱物以獲得一上清液，該上清液即可以作為後續之衍生步驟S2所使用之待測樣品。

該衍生步驟S2中，工者係能夠以具有一異硫氰酸酯官能基（isothiocyanate group）的異硫氰酸鹽（isothiocyanate）作為一衍生試劑（derivatization reagent），將該衍生試劑溶於一工作溶媒（working solution）中，並於其中加入該待測樣品，即可以配製獲得一待反應液，如此，使該衍生試劑與該待測樣品中的多胺進行如第2圖所示的硫代胺基甲醯化反應（thiocarbamoylation），以獲得一衍生溶液，該衍生溶液中包含一硫脲衍生物（thiourea derivative）。舉例而言，該待反應液中，該衍生試劑可以為4-二甲基胺-萘基異硫氰酸酯（4-dimethylamino-naphthylisothiocyanate，簡稱為DNITC，具有如第3圖所示之化學結構式）、1-萘基異硫氰酸酯（1-naphthyl isothiocyanate，簡稱為NITC，具有如第4圖所示之化學結構式）、苯甲基萘基異硫氰酸酯（benzyl isothiocyanate，簡稱為BITC，具有如第5圖所示之化學結構式）或烯丙基萘基異硫氰酸酯（ally isothiocyanate，簡稱為AITC，具有如第6圖所示之化學結構式）等異硫氰酸鹽，且於該待反應液中，該衍生試劑的濃度可以介於5～15 mM之間。又，該工作溶媒為可以溶解該衍生試劑及該待測樣品中的多胺的一溶劑，進而能夠與該衍生試劑及多胺共同形成該待反應液，舉例而言，該工作溶媒可以為乙腈（acetonitrile，簡稱為ACN）、丙酮（acetone）、二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，簡稱為DMSO）、吡啶（pyridine）、二甲基甲醯胺（dimethylformamide，簡稱為DMF）、二甲基丙烯基脲（dimethylpropyleneurea，簡稱為DMPU）、環丁碸（sulfolane）、四氫呋喃（tetrahydrofuran，簡稱為THF）、1,2-二甲氧基乙烷（1,2-dimethoxyethane，簡稱為DME）、1,3-二氧環戊烷（1,3-dioxolane，簡稱為DOL）、碳酸二甲酯（dimethyl carbonate，簡稱為DMC）或水等溶劑。

為了加速該硫代胺基甲醯化反應的進行，工者可以於該待反應液中加入一鹼劑（base），該鹼劑係為可以溶於該工作溶媒中的一鹼性化合物，以藉由該鹼劑的添加，使多胺的氨基能夠發生去離子化作用（deprotonation），提升該氨基的親核性（nucleophilicity），進而加速該硫代胺基甲醯化反應的進行。舉例而言，該鹼劑可以為氫氧化鈉（sodium hydroxide，NaOH）、碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，NaHCO ₃）、碳酸鈉（sodium carbonate，Na ₂CO ₃）、4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，簡稱為DMAP）或三乙胺（triethylamine，簡稱為TEA）等鹼性化合物，且於該待反應液中，該鹼劑的濃度可以介於5～75 mM之間。

又，為了加速該硫代胺基甲醯化反應的進行，工者亦可以加熱該待反應液，例如可以將該待反應液置於20～60℃的溫度下10分鐘～24小時，或者藉由微波的方式加熱該待反應液，例如使用功率為100～750 W的微波爐，對該待反應液微波0.5～10分鐘。

接著，於該分析步驟S3中，工者可以將該衍生溶液作為一待測溶液，利用各種習知方法來偵測該待測溶液中的硫脲衍生物，以獲得一多胺強度值，並以該多胺強度值來評估該待測樣品中是否包含多胺，甚或是該待測樣品中的多胺之含量多寡。舉例而言，工者能夠以液相層析法、氣相層析法等方式分離後，利用紫外光光譜法、螢光光譜法或質譜分析法來偵測該待測溶液中的硫脲衍生物；例如以結合紫外光偵測器之高效液相層析法（high performance liquid chromatography with ultraviolet detector，簡稱為HPLC-UV）、結合二極體陣列偵測器之高效液相層析法（high performance liquid chromatography with diode-array detector，簡稱為HPLC-DAD）、結合螢光偵測器之高效液相層析法（high performance liquid chromatography with fluorescence detector，簡稱為HPLC-FLD）、液相層析質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，簡稱為LC-MS）、液相層析串聯式質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，簡稱為LC-MS/MS）、基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜分析法（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，簡稱為MALDI-TOF MS）、氣相層析質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，簡稱為GC-MS）及結合火焰電離偵測器之氣相層析法（gas chromatography-flame ionization detector，簡稱為GC-FID）等方法來進行偵測。

舉例而言，在以液相層析法進行分離時，可以使用C18管柱（2.1 mm×50 mm；粒徑為2.7 μm）作為固定相（stationary phase），及使用如第1表所示的混合溶液作為移動相（mobile phase）進行梯度沖提（gradient elution），沖提流速為180 μL/min。

第1表、用以層析分離該待測溶液的梯度沖提程序

時間（min）	混合溶液
溶液A （0.15%甲酸水溶液）	溶液B （甲醇）
0.0→6.0	80%→60%	20%→40%
6.0→7.0	60%→40%	40%→60%
7.0→11.8	40%→40%	60%→60%
11.8→13.3	40%→0%	60%→100%
13.3→20.0	0%→0%	100%→100%

再請參照第7圖所示，由於在進行該分析步驟S3時，該待測溶液（該衍生溶液）中可能含有過量添加的衍生試劑（具有異硫氰酸酯官能基的異硫氰酸鹽），於本發明之第二實施例的多胺的檢測方法可以於該衍生步驟S2及該分析步驟S3之間，另執行一移除步驟S4。

該移除步驟S4中，工者係於該衍生溶液中加入一移除試劑（removing reagent），該移除試劑為與該衍生溶液不互溶，且logP介於3.5～7.0之間的一溶劑，如此可以去除該衍生溶液中的衍生試劑（具有異硫氰酸酯官能基的異硫氰酸鹽）等脂溶性干擾物，並且可以使該衍生溶液分層而形成一上層溶液與一下層溶液，該下層溶液包含該硫脲衍生物。舉例而言，該移除試劑可以為正己烷（hexane）、正辛烷（octane）、正癸烷（decane）或十二烷（dodecane）等溶劑，且針對總體積約為100～500 μL的衍生溶液，該移除試劑的添加量可以介於100～1,000 μL之間。又，在該衍生溶液中包含大量脂溶性干擾物的情況下，工者亦可以選擇連續執行多次的移除步驟S4，即在取得該下層溶液之後，再次加入該移除試劑，使該下層溶液得以分層而形成另一上層溶液及另一下層溶液，此時，該另一下層溶液中包含該硫脲衍生物。

在該移除步驟S4之後，工者則可以取包含該硫脲衍生物的下層溶液作為該待測溶液，並如前述之利用各種習知方法來偵測該待測溶液中的硫脲衍生物，進而獲得該多胺強度值。

續請參照第8圖所示，為去除該衍生溶液中非期望的陰陽離子，於本發明之第三實施例的多胺的檢測方法可以於該衍生步驟S2及該分析步驟S3之間，另執行一鹽析步驟S5。

該鹽析步驟S5中，工者係於該衍生溶液中加入一質子提供劑（proton donor）及一發泡鹽（effervescent salt），該質子提供劑用以提供氫離子（hydrogen ion），該發泡鹽則用以解離形成陰離子及陽離子，並與該質子提供劑進行一酸鹼中和反應（neutralization）以形成二氧化碳氣體。在將該質子提供劑及該發泡鹽加入該衍生溶液之後，即可以於該衍生溶液中形成二氧化碳氣體（以氣泡的形式存在），如此能夠提升該衍生溶液中各分子的分散性，有助於鹽析作用（salting-out）的進行；此時，在該質子提供劑與該發泡鹽的共同作用下，該衍生溶液可以分層而形成一上層溶液與一下層溶液，該上層溶液包含該硫脲衍生物。舉例而言，該質子提供劑可以為檸檬酸（citric acid）、氯化銨（ammonium chloride，NH ₄Cl）、硫酸銨（ammonium sulfate，(NH ₄) ₂SO ₄）或磷酸二氫鈉（sodium dihydrogen phosphate，NaH ₂PO ₄）等，而該發泡鹽可以為碳酸氫鉀（potassium bicarbonate，KHCO ₃）、碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，NaHCO ₃）、碳酸氫銨（ammonium bicarbonate，NH ₄HCO ₃）、碳酸鉀（potassium carbonate，K ₂CO ₃）或碳酸鈉（sodium carbonate，Na ₂CO ₃），且針對總體積約為100～500 μL的衍生溶液，該質子提供劑的添加量可以介於5～75 mg之間，且該發泡鹽的添加量可以介於5～75 mg之間。

值得注意的是，於該鹽析步驟S5中，在加入該質子提供劑及該發泡鹽之後，且在形成該上層溶液及該下層溶液之前，工者可以將該衍生溶液置於一冷卻浴中［（cooling bath），溫度介於-70～0℃之間］，藉此可以促進該衍生溶液的有效分層。

在該鹽析步驟S5之後，工者則可以取包含該硫脲衍生物的上層溶液作為該待測溶液，並如前述之利用各種習知方法來偵測該待測溶液中的硫脲衍生物，進而獲得該多胺強度值。

另請參照第9圖所示，於本發明之第四實施例的多胺的檢測方法可以於該衍生步驟S2及該分析步驟S3之間，另執行一鹽析移除步驟S6。

該鹽析移除步驟S6中，工者係於該衍生試劑中同時加入該移除試劑、該質子提供劑及該發泡鹽，該移除試劑、該質子提供劑及該發泡鹽的作用、種類、添加量均可以如前所述，於此不再贅述。在加入該移除試劑、該質子提供劑及該發泡鹽之後，該衍生溶液可以分層而形成一上層溶液、一中層溶液與一下層溶液，該中層溶液包含該硫脲衍生物。同樣地，在加入該移除試劑、該質子提供劑及該發泡鹽之後，且在形成該上層溶液、該中層溶液與該下層溶液之間，工者可以將該衍生溶液置於該冷卻浴中，以促進該衍生溶液的有效分層。

接著，工者即可以取包含該硫脲衍生物的中層溶液作為該待測溶液，並如前述之利用各種習知方法來偵測該待測溶液中的硫脲衍生物，進而獲得該多胺強度值。

依據前述，基於相同的技術概念下，本發明之第一實施例的多胺的檢測套組可以包含：該衍生試劑及該工作溶媒，該衍生試劑為具有異硫氰酸酯官能基的異硫氰酸鹽，該工作溶媒則為可以溶解該衍生試劑及該待測樣品中的多胺的溶劑。又，該衍生試劑及該工作溶媒的作用、具體實例可以如上所述，於此不再贅述。

又，為了加速該硫代胺基甲醯化反應的進行，該多胺的檢測套組另可以包含該鹼劑，該鹼劑係為可以溶於該工作溶媒中的鹼性化合物，其作用、具體實例亦可以如上所述，於此不再贅述。

對應如第7圖所示的第二實施例的多胺的檢測方法，本發明之第二實施例的多胺的檢測套組除該衍生試劑及該工作溶媒之外，另可以包含該移除試劑，該移除試劑為logP介於3.5～7.0之間的溶劑，其作用、具體實例可以如上所述，於此不再贅述。

對應如第8圖所示的第三實施例的多胺的檢測方法，本發明之第三實施例的多胺的檢測套組除該衍生試劑及該工作溶媒之外，另可以包含該質子提供劑及該發泡鹽，該質子提供劑用以提供氫離子，該發泡鹽則用以與該質子提供劑進行該酸鹼中和反應以形成二氧化碳氣體，二者的作用、具體實例可以如上所述，於此不再贅述。

對應如第9圖所示的第四實施例的多胺的檢測方法，本發明之第四實施例的多胺的檢測套組除該衍生試劑及該工作溶媒之外，另可以包含該移除試劑、該質子提供劑及該發泡鹽，該移除試劑、該質子提供劑及該發泡鹽的性質、作用及具體實例均可以如前所述，於此不再贅述。

值得注意的是，藉由前述之多胺的檢測方法（及應用於實施該多胺的檢測方法的檢測套組）可以用於檢測來自一哺乳生物之生物樣品，該多胺的檢測方法（及該多胺的檢測套組）更可以應用於檢測一疑似患者體內的多胺之含量，藉此評估該疑似患者是否罹患癌症。詳言之，首先自該疑似患者取得該生物樣品，並於體外（ in vitro），以如前述之多胺的檢測方法偵測該生物樣品中的多胺的含量，以獲得一檢測值；及比較該生物樣品的該檢測值與一參考值，當該檢測值高於該參考值顯示該疑似患者罹患癌症。

舉例而言，Shirakawa等人發表健康成人的紅血球中的亞精胺為15.04 ± 3.63 ng/g、精胺為8.82 ± 3.12 ng/g，而在胰臟癌患者的紅血球中的亞精胺為47.15 ± 25.97 ng/g、精胺為12.27 ± 9.44 ng/g，且在大腸直腸癌患者的紅血球中的亞精胺為31.97 ± 23.29 ng/g、精胺為41.59 ± 37.57 ng/g，顯示胰臟癌患者及大腸直腸癌患者的紅血球中的多胺之檢測值高於參考值（健康成人之生物樣品的檢測值）（Cancer. 1980 Jan 1;45(1):108-11）；Ishikawa等人另發表健康成人的口腔組織中的腐胺為1048.98 ± 626.75 ng/g、亞精胺為1260.77 ± 883.12 ng/g，而在口腔癌患者的口腔組織中的腐胺為7867.86 ± 6073.54 ng/g、亞精胺為3573.15 ± 3718.40 ng/g，亦顯示口腔癌患者的口腔組織中的多胺之檢測值高於參考值（健康成人之生物樣品的檢測值）（Sci Rep. 2016 Aug 19:6:31520）；此外，於肝癌、前列腺癌、乳癌、淋巴瘤、纖維肉瘤、肺癌或胃癌等多種癌症中亦有相關的研究報導。

為證實該多胺的檢測方法係能夠用於檢測該待測樣品中的多胺的含量，遂進行以下試驗：

（A）衍生試劑的選擇

本試驗係取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為1 mM的腐胺、1 mM的亞精胺及1 mM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑，溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到各組的衍生溶液。接著，取1 μL的衍生溶液，以薄層層析法（thin layer chromatography，簡稱為TLC）於254 nm波長下觀察是否有該硫脲衍生物的生成，並定量該硫脲衍生物的含量。

本試驗各組所選用的衍生試劑係如第2表所示，其中第A5、A6組的衍生試劑非屬於具有異硫氰酸酯官能基的異硫氰酸鹽。

第2表、本試驗各組所選用的衍生試劑

組別	衍生試劑	化學結構式
A1	4-二甲基胺-萘基異硫氰酸酯（DNITC）	第3圖
A2	1-萘基異硫氰酸酯（NITC）	第4圖
A3	苯甲基萘基異硫氰酸酯（BITC）	第5圖
A4	烯丙基萘基異硫氰酸酯（AITC）	第6圖
A5	N,N-二甲基-1-萘胺（DNA）	第10圖
A6	萘（naphthalene）	第11圖

請參照第12圖所示，使用具有異硫氰酸酯官能基的異硫氰酸鹽作為該衍生試劑的第A1～A4組均有該硫脲衍生物的生成，其中以第A1組的衍生試劑（DNITC）的效果為佳。值得注意的是，比較第A1、A5組的衍生試劑可以得知，該硫代胺基甲醯化反應確實是透過該衍生試劑的異硫氰酸酯官能基來進行，且比較第A2、A6組的衍生試劑亦可以得到相同的結論。

（B）鹼劑的選擇

本試驗係取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液（包含濃度為10 mM的鹼劑，溶於水中），在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到各組的衍生溶液。接著，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑（正辛烷）以及包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，靜置於-20℃的溫度下3分鐘，取8 μL的中層溶液作為各組的待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

本試驗各組所選用的鹼劑係如第3表所示，其中，第B0組為未加入該鹼劑的組別。

第3表、本試驗各組所選用的鹼劑

組別	鹼劑
B0	－
B1	氫氧化鈉（NaOH）
B2	碳酸氫鈉（NaHCO 3）
B3	碳酸鈉（Na 2CO 3）
B4	4-二甲氨基吡啶（DMAP）
B5	三乙胺（TEA）

請參照第13圖所示，加入該鹼劑確實有助於提升該硫代胺基甲醯化反應的進行，因而能夠形成較多的硫脲衍生物（第B1～B5組），且其中以第B1組之氫氧化鈉（NaOH）的效果為佳。

（C）微波瓦數的選擇

本試驗係取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，加熱該待反應液，續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到各組的衍生溶液。接著，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑（正辛烷）以及包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，靜置於-20℃的溫度下3分鐘，取8 μL的中層溶液作為各組的待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

本試驗各組所選用的加熱方式係如第4表所示，其中，第C0組為以30℃的乾浴（dry bath）進行加熱，其他組別則是調整微波的瓦數。

第4表、本試驗各組所選用的加熱方式

組別	加熱方式
C0	30℃乾浴
C1	微波（100 W、5分鐘）
C2	微波（300 W、5分鐘）
C3	微波（550 W、5分鐘）
C4	微波（750 W、5分鐘）

請參照第14圖所示，以微波進行加熱確實有助於提升該硫代胺基甲醯化反應的進行，因而能夠形成較多的硫脲衍生物（第C1～C4組），且其中以第C2組之300 W的效果為佳。

（D）移除試劑的選擇

本試驗係取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到各組的衍生溶液。接著，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑以及包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，靜置於-20℃的溫度下3分鐘，取8 μL的中層溶液作為各組的待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

本試驗各組所選用的移除試劑係如第5表所示，其中，第D0組為未加入該移除試劑的組別。

第5表、本試驗各組所選用的移除試劑

組別	移除試劑
D0	－
D1	正己烷
D2	正辛烷
D3	正癸烷
D4	十二烷

請參照第15圖所示，加入該移除試劑確實有助於去除多餘的衍生試劑（殘餘物）（第D1～D4組），且其中以第D2組之正辛烷的效果為佳。

（E）移除步驟的操作次數

本試驗係取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到各組的衍生溶液。

接著，於第E1組的衍生溶液加入500 μL的移除試劑（正辛烷）以及包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，靜置於-20℃的溫度下3分鐘，取8 μL的中層溶液作為第E1組的待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

於第E2組的衍生溶液加入500 μL的移除試劑（正辛烷）之後，移除上層溶液，再加入500 μL的移除試劑（正辛烷）以及包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，靜置於-20℃的溫度下3分鐘，取8 μL的中層溶液作為第E2組的待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

於第E3組的衍生溶液加入500 μL的移除試劑（正辛烷）之後，移除上層溶液，再加入500 μL的移除試劑（正辛烷）之後，移除上層溶液，第三次加入500 μL的移除試劑（正辛烷）時，同時加入包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，靜置於-20℃的溫度下3分鐘，取8 μL的中層溶液作為第E3組的待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

又，本試驗第E0組為未加入該移除試劑的組別。

第6表、本試驗各組所執行的移除步驟的次數

組別	移除步驟的次數
E0	0
E1	1
E2	2
E3	3

請參照第16圖所示，執行多次的移除步驟確實有助於去除多餘的衍生試劑（殘餘物）（第E2～E3組）。

（F）質子提供劑的選擇

本試驗係取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到各組的衍生溶液。接著，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑（正辛烷）以及包含該質子提供劑（如第7表所示；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，靜置於-20℃的溫度下3分鐘，取8 μL的中層溶液作為各組的待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

第7表、本試驗各組所選用的質子提供劑

組別	質子提供劑
F1	檸檬酸
F2	氯化銨（NH 4Cl）
F3	硫酸銨（(NH 4) 2SO 4）
F4	磷酸二氫鈉（NaH 2PO 4）

請參照第17圖所示，藉由使用前述的質子提供劑均能夠分離該硫脲衍生物（第F1～F4組），且其中以第F1組之檸檬酸的效果為佳。

（G）發泡鹽的選擇

本試驗係取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到各組的衍生溶液。接著，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑（正辛烷）以及包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（如第8表所示；10 mg）的混合粉末，靜置於-20℃的溫度下3分鐘，取8 μL的中層溶液作為各組的待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

第8表、本試驗所選用的發泡鹽

組別	發泡鹽
G1	碳酸氫鉀（KHCO 3）
G2	碳酸氫鈉（NaHCO 3）
G3	碳酸氫銨（NH 4HCO 3）
G4	碳酸鉀（K 2CO 3）
G5	碳酸鈉（Na 2CO 3）

請參照第18圖所示，藉由使用前述的發泡鹽均能夠分離該硫脲衍生物（第G1～G5組），且其中以第G1組之碳酸氫鉀（KHCO ₃）的效果為佳。

（H）冷卻浴的效果

本試驗係取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到各組的衍生溶液。

接著，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑（正辛烷）以及包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，於-20℃的溫度下靜置3分鐘，取8 μL的中層溶液作為第H1組的待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

第H2組的待測溶液，則是在取得該衍生溶液之後，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑（正辛烷）以及包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，於室溫下靜置3分鐘所獲得的中層溶液，同樣取8 μL，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析。

第9表、本試驗各組的反應溫度

組別	溫度
H0	約25℃
H1	-20℃

請參照第19圖所示，藉由冷卻浴可以使該衍生溶液有效分層，因而可以提升該硫脲衍生物的分離效果（第H1組）。

（I）高效液相層析圖譜

第I1組待測樣品：取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到該衍生溶液，作為第I1組待測樣品。

第I2組待測樣品：取100 μL的水（不含腐胺、亞精胺及精胺），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到該衍生溶液。接著，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑（正辛烷）之後，移除上層溶液，再加入500 μL的移除試劑（正辛烷）之後，移除上層溶液，第三次加入500 μL移除試劑（正辛烷）時，同時加入包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，於-20℃的溫度下靜置3分鐘，以得到中層溶液，作為第I2組待測樣品。

第I3組待測樣品：取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到該衍生溶液。接著，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑（正辛烷）之後，移除上層溶液，再加入500 μL的移除試劑（正辛烷）之後，移除上層溶液，第三次加入500 μL移除試劑（正辛烷）時，同時加入包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，於-20℃的溫度下靜置3分鐘，以得到中層溶液，作為第I3組待測樣品。

分別取8 μL的各組待測樣品，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析，結果如第20圖所示，第I1組待測樣品中雖然存在各多胺的硫脲衍生物（如波峰1、2、3所示），惟含有更多的衍生試劑（DNITC），而在經過處理之第I3組待測樣品中，則已去除大部分的衍生試劑（DNITC），且仍存在有清晰的代表各多胺的硫脲衍生物的波峰。

（J）硫脲衍生物的安定性測試

本試驗係取100 μL的多胺溶液（包含濃度分別為200 μM的腐胺、200 μM的亞精胺及200 μM的精胺，溶於水中），加入200 μL的衍生試劑溶液［包含濃度為10 mM的衍生試劑（DNITC），溶於工作溶媒（乙腈）中］及25 μL的鹼液［包含濃度為10 mM的鹼劑（氫氧化鈉），溶於水中］，在混合均勻以形成該待反應液之後，以微波的方式加熱該待反應液（300 W、5分鐘），續靜置於冰浴中以終止該硫代胺基甲醯化反應的進行，以得到各組的衍生溶液。接著，於該衍生溶液中加入500 μL的移除試劑（正辛烷）以及包含該質子提供劑（檸檬酸；25 mg）與該發泡鹽（碳酸氫鉀；10 mg）的混合粉末，靜置於-20℃的溫度下3分鐘，收取中層溶液。

每隔3小時自該中層溶液中取8 μL作為該待測溶液，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析，比較24小時內代表各多胺的硫脲衍生物的波峰的波峰下面積（area under a peak）的變化，結果如第21圖所示，於24小時內，代表各多胺的硫脲衍生物的濃度均沒有明顯改變，顯示該硫脲衍生物的安定性良好。

（J）確效評估

本試驗係以濃度為1、5、25、100及200 μM的多胺溶液進行測試，獲得該待測溶液之後，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析，經線性迴歸計算獲得的線性迴歸方程式及決定係數（coefficient of determination，記為R ²）如第10表所示。

第10表、異批次與同批次間的線性迴歸方程式及決定係數

	待測樣品	線性迴歸方程式	決定係數
同批次	腐胺	y＝0.0058x＋0.0060	0.9999
亞精胺	y＝0.114x＋0.0162	0.9999
精胺	y＝0.0119x＋0.0023	0.9998
異批次	腐胺	y＝0.0059x＋0.0058	0.9999
亞精胺	y＝0.0107x＋0.0190	0.9998
精胺	y＝0.0121x－0.0010	0.9999

請參照第10表所示，無論是同批次間的分析或者是異批次間的分析，決定係數均大於0.9998，顯示該多胺的檢測方法於1～200 μM的濃度範圍內具有良好的線性關係。

接著，以濃度為3、20及120 μM的多胺溶液進行測試，獲得該待測溶液之後，以高效液相層析法（narrow-bore HPLC-UV）進行後續分析，並計算異批次間與同批次間分析結果的相對標準偏差（relative standard deviation，簡稱為RSD）及相對誤差（relative error，簡稱為RE），記錄於第11表。

第11表、同批次與異批次間的相對標準偏差及相對誤差

	濃度（μM）	同批次	異批次
RSD（%）	RE（%）	RSD（%）	RE（%）
腐胺	3	2.96	-1.80	3.84	1.21
20	1.04	0.15	4.72	-3.11
120	0.53	0.53	1.13	-0.91
亞精胺	3	5.41	-1.21	2.30	-6.82
20	1.08	3.65	5.92	0.72
120	2.01	3.92	3.23	-0.42
精胺	3	3.14	-4.15	4.79	5.59
20	1.84	-2.20	4.58	1.39
120	3.10	3.23	2.02	-10.9

請參照第11表所示，於同批次的分析中，相對標準偏差均小於5.41%、相對誤差均小於-4.15%，而於異批次的分析中，相對標準偏差均小於5.92%、相對誤差均小於-6.82%，顯示該多胺的檢測方法具有良好的準確度（accuracy）及精密度（precision），即具有良好的可信度（reliability）。

（K）食品樣品的檢測結果

將市售的糙米、小麥、蕎麥、燕麥、黃豆及紅酒，經研磨、蛋白質沉澱等前處理之後，以如前述的多胺的檢測方法進行分析，結果如第12表所示。

第12表、食品樣品的檢測結果

食品樣品	多胺	濃度（mg/kg）	RSD（%）
糙米	腐胺	N.D.	－
亞精胺	2.55	7.49
精胺	9.96	2.00
小麥	腐胺	6.40	2.26
亞精胺	11.62	3.63
精胺	12.31	1.59
蕎麥	腐胺	4.07	2.08
亞精胺	17.45	2.22
精胺	20.78	4.46
燕麥	腐胺	3.47	4.85
亞精胺	6.43	0.62
精胺	4.01	3.12
黃豆	腐胺	12.79	5.28
亞精胺	83.95	1.85
精胺	24.35	3.82
紅酒1	腐胺	1.22	17.29
亞精胺	2.05	1.47
精胺	4.19	2.29
紅酒2	腐胺	7.91	2.34
亞精胺	4.27	0.72
精胺	5.91	7.65

如第12表所示，該多胺的檢測方法確實能夠應用於檢測食品樣品中的多胺含量。

（L）細胞株樣品的檢測結果

本試驗選用DU145（前列腺癌）、T24（膀胱癌）、Hep3B（肝癌）、Huh7（肝癌）、HA22T（肝癌）、Mahlavu（肝癌）等癌症細胞株，將前述細胞裂解之後，以如前述的多胺的檢測方法進行分析，結果如第13表所示。

第13表、細胞株樣品的檢測結果

細胞株樣品	多胺	濃度（ng/10 7cell）	RSD（%）
DU145	腐胺	1202.19	2.45
亞精胺	1645.28	2.79
精胺	1436.08	3.89
T24	腐胺	542.30	9.53
亞精胺	450.88	5.67
精胺	N.D.	－
Hep3B	腐胺	2045.40	0.97
亞精胺	1436.79	1.65
精胺	2881.44	5.36
Huh7	腐胺	3732.80	5.48
亞精胺	630.65	7.61
精胺	2701.00	6.10
HA22T	腐胺	3298.51	2.06
亞精胺	787.20	3.07
精胺	2243.30	4.63
Mahlavu	腐胺	373.00	0.36
亞精胺	89.52	5.11
精胺	531.39	1.78

如第13表所示，該多胺的檢測方法確實能夠應用於檢測細胞株樣品中的多胺含量。

（K）全血樣品的檢測結果

本試驗選用來自五名健康受試者的全血樣品，經蛋白質沉澱等前處理之後，以如前述的多胺的檢測方法進行分析，結果如第14表所示。

第14表、全血樣品的檢測結果

全血樣品	多胺	濃度（μM）
受試者1	亞精胺	12.82±0.44
精胺	2.16±0.31
受試者2	亞精胺	12.52±0.24
精胺	6.83±0.53
受試者3	亞精胺	12.62±0.14
精胺	5.74±0.13
受試者4	亞精胺	10.56±0.35
精胺	4.48±0.47
受試者5	亞精胺	16.87±0.15
精胺	6.31±0.86

如第14表所示，該多胺的檢測方法確實能夠應用於檢測全血樣品中的多胺含量。

綜上所述，藉由使該待測樣品中的多胺的胺基與該衍生試劑（具有異硫氰酸酯官能基的異硫氰酸鹽）進行該硫代胺基甲醯化反應，進而可以獲得該硫脲衍生物，該硫脲衍生物能夠經由各種習知方法偵測其存在（例如，以液相層析法、氣相層析法等方式分離後，利用紫外光光譜法、螢光光譜法、或質譜分析法進行偵測），因此本發明的多胺的檢測方法具有良好的靈敏度、精密度及準確度，能夠降低該待測樣品的使用量，為本發明之功效。

又，該檢測套組係能夠應用於實施如前述之多胺的檢測方法，有效地與多胺共同形成安定性良好的硫脲衍生物，工者因而可以因應需求選用各種習知方法來偵測該硫脲衍生物（例如，以液相層析法、氣相層析法等方式分離後，利用紫外光光譜法、螢光光譜法、或質譜分析法進行偵測），為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當包含後附之申請專利範圍所記載的文義及均等範圍內之所有變更。又，上述之數個實施例能夠組合時，則本發明包含任意組合的實施態樣。

﹝本發明﹞ S1:樣品提供步驟 S2:衍生步驟 S3:分析步驟 S4:移除步驟 S5:鹽析步驟 S6:鹽析移除步驟

［第1圖］ 本發明之第一實施例的多胺的檢測方法的流程圖。 ［第2圖］ 多胺與衍生試劑（異硫氰酸鹽）之硫代胺基甲醯化反應的化學方程式。 ［第3圖］ 衍生試劑4-二甲基胺-萘基異硫氰酸酯的化學結構式。 ［第4圖］ 衍生試劑1-萘基異硫氰酸酯的化學結構式。 ［第5圖］ 衍生試劑苯甲基萘基異硫氰酸酯的化學結構式。 ［第6圖］ 衍生試劑烯丙基萘基異硫氰酸酯的化學結構式。 ［第7圖］ 本發明之第二實施例的多胺的檢測方法的流程圖。 ［第8圖］ 本發明之第三實施例的多胺的檢測方法的流程圖。 ［第9圖］ 本發明之第四實施例的多胺的檢測方法的流程圖。 ［第10圖］    N,N-二甲基-1-萘胺的化學結構式。 ［第11圖］    萘的化學結構式。 ［第12圖］    試驗（A）中，各組衍生溶液中的硫脲衍生物的相對強度柱狀圖。 ［第13圖］    試驗（B）中，各組待測溶液中的硫脲衍生物的相對強度柱狀圖。 ［第14圖］    試驗（C）中，各組待測溶液中的硫脲衍生物的相對強度柱狀圖。 ［第15圖］    試驗（D）中，各組待測溶液中的硫脲衍生物的相對強度柱狀圖。 ［第16圖］    試驗（E）中，各組待測溶液中的硫脲衍生物的相對強度柱狀圖。 ［第17圖］    試驗（F）中，各組待測溶液中的硫脲衍生物的相對強度柱狀圖。 ［第18圖］    試驗（G）中，各組待測溶液中的硫脲衍生物的相對強度柱狀圖。 ［第19圖］    試驗（H）中，各組待測溶液中的硫脲衍生物的相對強度柱狀圖。 ［第20圖］    試驗（I）中，各組待測溶液的高效液相層析圖譜。波峰1、2、3分別指腐胺、亞精胺及精胺所形成之硫脲衍生物；波峰DNITC為衍生試劑（DNITC）所形成的波峰。 ［第21圖］    試驗（J）中，各組待測溶液的硫脲衍生物的相對強度變化折線圖。

S1:樣品提供步驟 S2:衍生步驟 S3:分析步驟

Claims (28)

1. 一種多胺的檢測方法，包含： 提供一待測樣品，該待測樣品含有多胺； 將該待測樣品及一衍生試劑溶解於一工作溶媒中，以形成一待反應液，該衍生試劑具有一異硫氰酸酯官能基； 使該待反應液中的多胺與該衍生試劑的異硫氰酸酯官能基進行一硫代胺基甲醯化反應，以獲得一衍生溶液，該衍生溶液包含一硫脲衍生物；及 偵測該硫脲衍生物，以獲得一多胺強度值。
2. 如請求項1之多胺的檢測方法，其中，該衍生試劑為4-二甲基胺-萘基異硫氰酸酯、1-萘基異硫氰酸酯、苯甲基萘基異硫氰酸酯或烯丙基萘基異硫氰酸酯。
3. 如請求項1之多胺的檢測方法，其中，該工作溶媒為乙腈、丙酮、二甲基亞碸、吡啶、二甲基甲醯胺、二甲基丙烯基脲、環丁碸、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、1,3-二氧環戊烷、碳酸二甲酯或水。
4. 如請求項1之多胺的檢測方法，另包含：以微波的方式加熱該待反應液，以驅使該硫代胺基甲醯化反應的進行。
5. 如請求項4之多胺的檢測方法，其中，以100～750 W的瓦數微波該待反應液。
6. 如請求項1之多胺的檢測方法，另包含：於該待反應液中加入一鹼劑，續使溶解有該鹼劑之待反應液進行該硫代胺基甲醯化反應。
7. 如請求項6之多胺的檢測方法，其中，該鹼劑為氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、4-二甲氨基吡啶或三乙胺。
8. 如請求項1之多胺的檢測方法，另包含：於該衍生溶液中加入一移除試劑，使該移除試劑去除該衍生溶液中的脂溶性干擾物，並形成一上層溶液及一下層溶液，該下層溶液包含該硫脲衍生物，該移除試劑為與該衍生溶液不互溶，且logP介於3.5～7.0之間的一溶劑。
9. 如請求項1之多胺的檢測方法，另包含：於該衍生溶液中加入一質子提供劑及一發泡鹽，使該質子提供劑與該發泡鹽反應形成二氧化碳氣體，並形成一上層溶液及一下層溶液，該上層溶液包含該硫脲衍生物。
10. 如請求項9之多胺的檢測方法，另包含：在加入該質子提供劑及該發泡鹽之後，及形成該上層溶液及該下層溶液之前，將該衍生溶液置於一冷卻浴中。
11. 如請求項1之多胺的檢測方法，另包含：於該衍生溶液中加入一移除試劑、一質子提供劑及一發泡鹽，使該移除試劑去除該衍生溶液中的脂溶性干擾物，及使該質子提供劑與該發泡鹽反應形成二氧化碳氣體，並形成一上層溶液、一中層溶液及一下層溶液，該中層溶液包含該硫脲衍生物，該移除試劑為與該衍生溶液不互溶，且logP介於3.5～7.0之間的一溶劑。
12. 如請求項11之多胺的檢測方法，另包含：在加入該移除試劑、該質子提供劑及該發泡鹽之後，及形成該上層溶液、該中層溶液及該下層溶液之前，將該衍生溶液置於一冷卻浴中。
13. 如請求項8或11之多胺的檢測方法，其中，該移除試劑為正己烷、正辛烷、正癸烷或十二烷。
14. 如請求項9或11之多胺的檢測方法，其中，該質子提供劑為檸檬酸、氯化銨、硫酸銨或磷酸二氫鈉。
15. 如請求項9或11之多胺的檢測方法，其中，該發泡鹽為碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、碳酸鉀或碳酸鈉。
16. 一種多胺的檢測套組，包含： 一衍生試劑，具有一異硫氰酸酯官能基；及 一工作溶媒，為可以溶解該衍生試劑及多胺的一溶劑。
17. 如請求項16之多胺的檢測套組，其中，該衍生試劑為4-二甲基胺-萘基異硫氰酸酯、1-萘基異硫氰酸酯、苯甲基萘基異硫氰酸酯或烯丙基萘基異硫氰酸酯。
18. 如請求項16之多胺的檢測套組，其中，該工作溶媒為乙腈、丙酮、二甲基亞碸、吡啶、二甲基甲醯胺、二甲基丙烯基脲、環丁碸、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、1,3-二氧環戊烷、碳酸二甲酯或水。
19. 如請求項16之多胺的檢測套組，另包含：一鹼劑，為可以溶於該工作溶媒中的一鹼性化合物。
20. 如請求項19之多胺的檢測套組，其中，該鹼劑為氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、4-二甲氨基吡啶或三乙胺。
21. 如請求項16之多胺的檢測套組，另包含：一移除試劑，為logP介於3.5～7.0之間的一溶劑。
22. 如請求項16之多胺的檢測套組，另包含： 一質子提供劑，用以提供氫離子；及 一發泡鹽，用以與該質子提供劑進行一酸鹼中和反應以形成二氧化碳氣體。
23. 如請求項16之多胺的檢測套組，另包含： 一移除試劑，為logP介於3.5～7.0之間的一溶劑； 一質子提供劑，用以提供氫離子；及 一發泡鹽，用以與該質子提供劑進行一酸鹼中和反應以形成二氧化碳氣體。
24. 如請求項21或23之多胺的檢測套組，其中，該移除試劑為正己烷、正辛烷、正癸烷或十二烷。
25. 如請求項22或23之多胺的檢測套組，其中，該質子提供劑為檸檬酸、氯化銨、硫酸銨或磷酸二氫鈉。
26. 如請求項22或23之多胺的檢測套組，其中，該發泡鹽為碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、碳酸鉀或碳酸鈉。
27. 一種癌症的體外診斷方法，包含： 以如請求項1～15中任一項之多胺的檢測方法，於體外檢測取自一疑似患者之一生物樣品中的多胺的含量，以獲得一檢測值；及 比較該生物樣品的該檢測值與一參考值，當該檢測值高於該參考值顯示該疑似患者罹患癌症。
28. 如請求項27之癌症的體外診斷方法，其中，該癌症為肝癌、前列腺癌、胰臟癌、大腸直腸癌、乳癌、淋巴瘤、纖維肉瘤、肺癌、胃癌或口腔癌。