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TWI871300B - 藉由將藥物物質和藥物產品過程整體化的生物製劑製造之連續製造過程 - Google Patents

藉由將藥物物質和藥物產品過程整體化的生物製劑製造之連續製造過程 Download PDF

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TWI871300B
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Abstract

本發明提供了一種生物製劑製造過程，該過程將藥物物質和藥物產品過程連接成一個整體化、連續的過程。

Description

藉由將藥物物質和藥物產品過程整體化的生物製劑製造之連續製造過程
一種生物製劑製造過程，該過程將藥物物質（drug substance）和藥物產品（drug product）過程連接成一個整體化、連續的過程。
從藥物物質（drug substance）到藥物產品（drug product）的填充/精加工通常是兩部分的過程，一般在藉由冷凍/解凍步驟將藥物物質轉化為藥物產品時分開。純化的生物製藥目的蛋白向藥物物質（DS）並且然後向藥物產品（DP）的轉化通常涉及通過超濾和滲濾（UFDF）單元操作，在合適的配製物緩衝液中將目的蛋白濃縮至所需水平。在UFDF之後，藉由一個或多個降低生物負載的過濾器處理濃縮的、配製的蛋白，通常進入貯存容器中。將一種或多種另外的賦形劑（通常是增強蛋白穩定性的賦形劑）添加到濃縮的、配製的蛋白中，成為藥物物質，再藉由一種或多種降低生物負載的過濾器在無菌容器中處理該藥物物質。通常在此時對該藥物物質進行採樣，以根據釋放規格測試某些藥物物質屬性。然後將該藥物物質冷凍以儲存或易於轉移到另一個製造設施。當需要時，將藥物物質材料解凍、集中到配製物容器中，藉由一個或多個降低生物負載的過濾器進行混合和處理，得到過濾的原料藥物產品（bulk drug product）。然後將過濾的原料藥物產品進行無菌過濾，並轉移到無菌設施中進行填充/精加工操作。在此填充/精加工步驟中，重複進行另一輪屬性和/或釋放測定，以針對釋放規格評估屬性，並確認在經過藥物產品製備過程後藥物產品的品質/特徵未發生變化，該過程中的一些係藥物物質已完成的屬性測試所共有的。
此過程涉及重複的工作，從而導致製造成本和材料浪費的增加；與連續製造平台不相容的多個貯存/儲存步驟；多餘的過濾步驟以及冷凍和解凍單元操作，所有該等都有可能導致藥物物質損失和/或不穩定。因此，需要一種更具成本效益的、連續的、整體化轉化將純化的生物製藥目的蛋白轉化為藥物物質並且然後轉化為藥物產品，這允許減少所需和所使用的設備和材料的尺寸和數量；這樣做的益處係減少了製造設施的空間佔用（footprint），或允許使用製造吊艙（pod）或其他緊湊系統，減少建立和操作製造設施的時間和成本以及屬性測試的合併。本文描述的發明藉由提供用於生物製劑製造的完全整體化的、連續的製造過程來滿足此需求，該製造過程藉由消除和/或組合從UFDF到藥物產品填充/精加工的過程步驟將藥物物質和藥物產品過程整體化。
本發明提供了一種用於生產重組生物治療劑的整體化、連續之方法，該方法包括提供純化的重組目的蛋白；藉由超濾來濃縮或稀釋該純化的重組蛋白；藉由滲濾對該純化的重組蛋白進行緩衝液交換至所需配製物；藉由超濾進一步稀釋或濃縮配製的重組蛋白，直到達到目標濃度；一旦達到該目標濃度，就添加或組合至少一種增強穩定性的賦形劑；對所得的原料藥物物質（bulk drug substance）進行過濾以減少生物負載；對所得的原料藥物產品進行無菌過濾；以及對無菌的原料藥物產品進行填充和精加工操作；其中該純化的重組蛋白和該原料藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。
在一個實施方式中，將該增強穩定性的賦形劑同時添加（added in-line）到該配製的重組蛋白中。在一個實施方式中，將該增強穩定性的賦形劑直接添加到超濾和滲濾（UFDF）滯留物加料槽中。在相關的實施方式中，一旦達到該目標濃度，就將該增強穩定性的賦形劑直接同時添加到該UFDF滯留物加料槽中。在另一個實施方式中，該增強穩定性的賦形劑係非離子型洗滌劑或表面活性劑。在一個實施方式中，該增強穩定性的賦形劑係基於聚氧乙烯（PEO）的表面活性劑。在一個實施方式中，該增強穩定性的賦形劑選自聚山梨酯80和聚山梨酯20。在一個實施方式中，至少一種增強穩定性的賦形劑的濃度為從0.001%至0.1%（重量/體積）。在一個實施方式中，將該原料藥物產品收集在儲存容器中。在一個實施方式中，將該原料藥物產品遞送到無菌處理設施。在相關的實施方式中，該無菌處理設施包括至少一個填充站。在另一個相關的實施方式中，該無菌處理設施包括至少一個不戴手套的無菌隔離器。在另一個實施方式中，將該原料藥物產品收集在儲存容器中，並直接遞送到該無菌處理設施。在相關的實施方式中，將該儲存容器連接到該無菌處理設施。在另一個相關的實施方式中，將含有該原料藥物產品的儲存袋、或處理該原料藥物產品的過濾器的輸出連接到不戴手套的無菌隔離器。在另一個相關的實施方式中，該無菌處理設施具有與含有該原料藥物產品的儲存容器、或處理該原料藥物產品的過濾器單元的輸出的連接。在一個實施方式中，用無菌的原料藥物產品填充初級藥物產品容器。在相關的實施方式中，將該初級藥物產品容器密封、貼標籤和包裝。在一個實施方式中，在一個或多個步驟之間存在連續流。在一個實施方式中，將來自UFDF和/或減少生物負載過濾的池收集到儲存容器中。在一個實施方式中，將該配製的重組蛋白稀釋，直到達到目標濃度。在一個實施方式中，將該配製的重組蛋白藉由超濾濃縮，直到達到目標濃度。在一個實施方式中，使用穩定的纖維素基親水性膜進行該超濾，該膜負載高達72 g/m2 膜面積。在一個實施方式中，在目標濃度小於或等於3.20 mg/ml下，使用穩定的基於親水性膜進行該超濾。在一個實施方式中，使用穩定的纖維素基親水性膜進行該超濾，該膜的目標過量濃度（overconcentration）為初始濃度的1.1x至2.5x。在一個實施方式中，使用再生纖維素、鹼穩定的膜進行該超濾和滲濾，該膜負載高達170 g/m2 膜面積。在一個實施方式1中，使用再生纖維素、鹼穩定的膜進行該超濾和滲濾，該膜的中間目標過量濃度小於或等於9 g/L、具有高達13個滲濾體積（diavolume）。在一個實施方式中，本文描述的方法進一步包括至少一個病毒過濾操作。在一個實施方式中，在該UFDF操作之後進行至少一個病毒過濾操作。在相關的實施方式中，在將該增強穩定性的賦形劑同時添加到該配製的重組蛋白中或在將該增強穩定性的賦形劑增強穩定性的賦形劑添加到UFDF滯留物槽中後，進行至少一個病毒過濾操作。在一個實施方式中，對具有5 g/L或更小的配製物濃度的雙特異性T細胞銜接子（engager）進行該病毒過濾操作。在一個實施方式中，病毒過濾器選自親水性聚偏二氟乙烯（PVDF）中空纖維過濾器、銅銨再生纖維素中空纖維過濾器、或聚醚碸（PES）細小病毒滯留過濾器。在另一個相關的實施方式中，至少一個病毒過濾操作還包括預過濾器。在另一個相關的實施方式中，該預過濾器係深層過濾器（depth filter）。在一個實施方式中，在無菌過濾之前，添加一種或多種另外的純化的重組目的蛋白或藥物物質。在一個實施方式中，該純化的目的蛋白係抗原結合蛋白。在一個實施方式中，該抗原結合蛋白係多特異性蛋白。在一個實施方式中，該多特異性蛋白係雙特異性抗體。在一個實施方式中，該雙特異性蛋白係雙特異性T細胞銜接子。在一個實施方式中，該雙特異性T細胞銜接子係半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子。在相關的實施方式中，該雙特異性T細胞銜接子的一個結合結構域對選自EGFRvIII、MSLN、CDH19、DLL3、CD19、CD33、CD38、FLT3、CDH3、BCMA、PSMA、MUC17、CLDN18.2、或CD70的靶細胞上的腫瘤相關表面抗原具有特異性。在相關的實施方式中，該雙特異性T細胞銜接子選自博納吐單抗（blinatumomab）、帕妥昔珠單抗（pasotuxizumab）、AMG103、AMG330、AMG212、AMG160、AMG420、AMG-110、AMG562、AMG596、AMG427、AMG673、AMG675、或AMG701。
本發明還提供了一種藥物組成物，該藥物組成物包含來自本文描述的方法的藥物產品。
本發明還提供了一種用於生產重組蛋白藥物產品之方法，該方法包括將表現目的蛋白的細胞擴增到N-1期；用所擴增的細胞接種和/或加料生物反應器，並培養該細胞以表現重組目的蛋白；通過收穫單元操作回收該重組蛋白；通過至少一個捕獲層析單元操作純化該收穫的重組蛋白；通過至少一個精製層析單元操作純化該重組蛋白；對該純化的重組蛋白進行超濾和滲濾單元操作，該超濾和滲濾單元操作包括藉由超濾來濃縮或稀釋該純化的重組蛋白；藉由滲濾對該純化的重組蛋白進行緩衝液交換至所需配製物；藉由超濾進一步稀釋或濃縮配製的純化的重組蛋白，直到達到目標濃度，將一種或多種增強穩定性的賦形劑直接添加到含有該配製的純化的重組蛋白的UFDF滯留物加料槽中，得到配製的藥物物質；對該配製的藥物物質進行單一單元操作以降低生物負載，得到過濾的原料藥物產品；無菌過濾該原料藥物產品；用無菌的原料藥物產品填充初級藥物產品容器；以及對該初級藥物產品容器進行密封、貼標籤和包裝；其中該重組蛋白和該藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。
本發明還提供了藥物組成物，該藥物組成物包含本文描述的方法的重組蛋白藥物產品。
本發明還提供了一種用於減少藥物產品生產過程的製造空間佔用之方法，該方法包括對純化的重組目的蛋白進行超濾和滲濾（UFDF）單元操作直至達到目標濃度；將至少一種增強穩定性的賦形劑直接添加到該UFDF滯留物加料槽中；對該原料藥物物質進行單一單元操作以降低生物負載，然後進行無菌過濾；對無菌的原料藥物產品進行填充和精加工單元操作；其中該重組蛋白和該藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。在一個實施方式中，將含有該原料藥物產品的儲存容器連接到無菌處理設施。在一個實施方式中，無菌處理設施具有與含有該原料藥物產品的儲存容器、或處理該原料藥物產品的過濾器的輸出的連接。在一個實施方式中，在一個或多個步驟之間存在連續流。在一個實施方式中，在該UFDF單元操作之後進行至少一個病毒過濾單元操作。
本發明還提供了一種用於在重組治療蛋白製造期間減少藥物物質損失和/或不穩定之方法，該方法包括對純化的重組目的蛋白進行UFDF單元操作；一旦達到目標濃度，就將至少一種增強穩定性的賦形劑添加到UFDF滯留物加料槽中；對UFDF池進行單一過濾以降低生物負載，得到原料藥物物質；其中該重組蛋白和該藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。
本發明還提供了一種用於減少包含重組雙特異性T細胞銜接子的組成物中病毒污染物之方法，該方法包括提供樣本，該樣本包含小於7.0 g/L的重組雙特異性T細胞銜接子，該銜接子的pH小於或等於6.0、具有23-45 mS/cm的電導率；對該樣本進行病毒過濾單元操作，該病毒過濾單元操作包括單獨的病毒過濾器、或與深層過濾器或表面改性的膜預過濾器組合的病毒過濾器；以及在池中或作為流收集包含該重組雙特異性T細胞銜接子的病毒過濾器洗脫液。在一個實施方式中，該雙特異性T細胞銜接子係半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子。在一個實施方式中，該樣本包含層析柱池或流出物流。在一個實施方式中，池或流的pH係4.2-6。
本發明還提供了根據本文描述的方法生產的純化的、重組半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子。
本發明還提供了一種用於在製造重組雙特異性T細胞銜接子期間減少高分子量種類之方法，該方法包括提供樣本，該樣本包含小於7 g/L重組雙特異性T細胞銜接子，該銜接子的pH小於或等於6.0、具有23-45 mS/cm的電導率；對該樣本進行病毒過濾單元操作，該病毒過濾單元操作包括與深層過濾器組合的病毒過濾器；以及在池中或作為流收集該病毒過濾器洗脫液；其中與使用包括單獨的病毒過濾器、或與表面改性的膜預過濾器組合的病毒過濾器的病毒過濾單元操作相比，過濾器洗脫液池中高分子量種類的百分比降低。在一個實施方式中，該雙特異性T細胞銜接子係半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子。
本發明還提供了一種用於在製造重組雙特異性T細胞銜接子期間在病毒過濾單元操作中減少通量衰減和降低高分子量種類之方法，該方法包括提供樣本，該樣本包含小於或等於1.75 g/L的重組雙特異性T細胞銜接子，該銜接子的pH為4.2-6.0，電導率為23-45 mS/cm；對該純化的重組雙特異性T細胞銜接子進行病毒過濾單元操作，該病毒過濾單元操作包括與深層過濾器組合的病毒過濾器；以及在池中或作為流收集該過濾器洗脫液；其中與包括單獨的病毒過濾器、或與表面改性的膜預過濾器組合的病毒過濾器的病毒過濾單元操作相比，過濾器洗脫液池或流中高分子量種類的百分比降低。在一個實施方式中，該雙特異性T細胞銜接子係半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子。
本發明還提供了一種用於生產純化的、配製的重組雙特異性T細胞銜接子之方法，該方法包括；通過一種或多種層析單元操作純化收穫的重組雙特異性T細胞銜接子；對該純化的重組雙特異性T細胞銜接子進行超濾和滲濾單元操作，得到濃度 ≤5 g/L的配製的雙特異性T細胞銜接子，並且對該配製的雙特異性T細胞銜接子進行病毒過濾單元操作；獲得純化的、配製的重組雙特異性T細胞銜接子。在一個實施方式中，該配製的雙特異性T細胞銜接子的濃度為 ≤ 3.2 g/L。在一個實施方式中，該配製的雙特異性T細胞銜接子的濃度為 ≤ 1.79 g/L。在一個實施方式中，該雙特異性T細胞銜接子係半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子。在一個實施方式中，用穩定的纖維素基親水性膜或再生纖維素膜進行超濾滲濾單元操作。在一個實施方式中，用穩定的纖維素基親水性膜進行該超濾滲濾單元操作，該膜在初始超濾目標濃度高達3.20 g/L下負載高達71.4 g/m2 膜面積。在一個實施方式中，用再生纖維素膜進行該超濾滲濾單元操作，該膜負載高達170 g/m2 膜面積、具有高達9 g/L的中間目標過量濃度、具有高達13個滲濾體積。在一個實施方式中，用親水性聚偏二氟乙烯（PVDF）中空纖維過濾器、銅銨再生纖維素中空纖維過濾器、或聚醚碸（PES）細小病毒滯留過濾器進行該病毒過濾單元操作。在一個實施方式中，使用銅銨再生纖維素中空纖維過濾器和濃度 ≤ 3.2 g/L的配製的雙特異性T細胞銜接子進行該病毒過濾單元操作。在一個實施方式中，該配製的雙特異性T細胞銜接子的濃度為 ≤ 1.79 g/L。在一個實施方式中，使用親水性聚偏二氟乙烯（PVDF）中空纖維過濾器和濃度 ≤ 1.79 g/L的配製的雙特異性T細胞銜接子進行該病毒過濾單元操作。
無
[圖1]：(A) 顯示了從DS過程中的UFDF操作到DP填充的典型常規處理步驟。常規過程可分為十個步驟或階段。如 (B) 所示，本文描述的發明將步驟或階段的數量減少到五個。 [圖2]： 與回收%最小值相比，進行多運行中心點運行1至3後的NWP恢復%。黑色條係多運行中心點運行。灰色斑點柱係回收%最小值。 [圖3]：在配製物緩衝液基質-銅銨再生纖維素過濾器中運行的通量衰減與載量，pH 4.2-高濃度[空心黑色圓]、pH 4.2-高容量[黑色空心三角形]、pH 4.2-延長貯存（Extended hold）[黑色空心方形]、pH 4.2-中心點[灰色實心圓]、pH 4.2-PVDF過濾器[黑色實心圓]、和pH 5.0-低濃度[圖案填充菱形] [圖4]： 產品質量數據銅銨再生纖維素過濾器，pH 4.2中心點[黑色條]、pH 4.2高濃度[灰色條]、pH 4.2延長貯存[白色無填充條]、pH 4.2高容量[實心菱形網格條]、pH 4.2 PVDF過濾器[有圓圖案的條]、pH 5.0低濃度[方形網格條]。A：HMW%；B：片段%；C：鹼性D%酸性。 [圖5]： 0.001-m2 20N過濾銅銨再生纖維素過濾器的通量與負載挑戰，1.77 g/L的產品[空心黑色三角形]、3.15 g/L[灰色實心菱形]、和6.82 g/L[空心黑色圓]、[實心黑色方形]。所有負載材料以19 PSI過濾。 [圖6]：層析緩衝液基質運行中分子A的產品質量數據-1.77 g/L、pH 5、23高壓[黑色條]，3.2 g/L、pH 5、23[灰色條]，1.77 g/L、pH 5、28[白色無填充條]，1.77 g/L、pH 5、23低壓[有虛線圓的條]，6.82 g/L、pH 5.3、28[方形網格條]，6.82 g/L、pH 4.5、28[淺灰色條]，1.77 g/L、pH 5、23中壓[實心菱形網格條]。 [圖7]： BiTE® A 在中點pH、低濃度、低電導率條件下的水力性能（pH 5.0、23 mS/cm、1.75 g/L）。單獨VPro[實心黑色圓]、VPro + Shield[實心黑色三角形]、VPro + Shield H[空心方形]、VPro + VPF[實心灰色圓]、和VPro + X0SP[空心黑色三角形]。 [圖8]：BiTE A® 在低pH、高和低的濃度以及電導率條件下的水力性能（pH 4.2、23或28 mS/cm、1.75或7 g/L）。VPro[實心黑色圓]，VPro + X0SP低pH[空心黑色三角形]，VPro + Shield低pH[實心黑色三角形]，VPro + X0SP高濃度、低pH[實心灰色三角形]，VPro + Shield H高濃度、低pH[空心圓]，VPro + Shield高濃度、低pH[黑色空心方形] [圖9]：BiTE A® 在高pH、低和高的濃度以及電導率條件下的水力性能（pH 6.0、23或28 mS/cm、1.8或7 g/L）。VPro[實心圓]，VPro + Shield H 高pH、低濃度[實心三角形]，VPro + X0SP[灰心實心三角形]高pH、高濃度，VPro + Shield H[空心圓]高pH、高濃度，VPro + Shield[空心方形]高pH、高濃度。 [圖10]：A：分子A的HMW%產品質量數據-1.75 g/L，pH 5[黑色條]、pH 4.2[灰色條]和pH 6.0[有圖案的條]。 B：分子A的HMW%產品質量數據-7 g/L，pH 6[黑色條]和pH 4.2[灰色條]。 C：分子A的Rce（片段%）產品質量數據-1.75 g/L，pH 5[黑色條]、pH 4.2[灰色條]和pH 6.0[有圖案的條] D：分子A的Rce（片段%）產品質量數據-7 g/L，pH 6.0[黑色條]和pH 4.2[灰色條] E：分子A的CEX酸性（%）產品質量數據-1.75 g/L，pH 5[黑色條]、pH 4.2[灰色條]和pH 6.0[有圖案的條]。 F：分子A的CEX鹼性（%）產品質量數據-1.75 g/L，pH 5[黑色條]、pH 4.2[灰色條]和pH 6.0[有圖案的條]。 G：分子A的CEX酸性（%）產品質量數據-7 g/L，pH 6[黑色條]和pH 4.2[灰色條]。 H：分子A的CEX鹼性（%）產品質量數據-7 g/L，pH 6[黑色條]和pH 4.2[灰色條]。 [圖11]：mAb[實心方形]和 1) BiTE® A X0SP/VPro[灰色三角形]、2) BiTE® A VPF/VPro[空心黑色圓]在中點pH和濃度的水力性能。 [圖12]：mAb[實心方形]和BiTE® A X0SP/VPro[灰色三角形]在高pH和高濃度的水力性能。 [圖13]：BiTE® B 在pH 5.9、31 mS/cm、1.8 g/L、單獨VPro[實心黑色圓]、VPro + Shield[實心黑色三角形]、VPro + Shield H[空心方形]、和VPro + VPF[實心灰色圓]、和VPro + X0SP[空心黑色三角形]的水力性能。 [圖14]：BiTE® B 在pH 5.9、45 mS/cm、1.81 g/L、VPro + Shield H[空心黑色方形]、VPro + X0SP[實心灰色三角形]的水力性能。在pH 4.2、31 mS/cm、VPro + Shield H[實心黑色方形]、VPro + X0SP[實心黑色三角形]的水力性能。 [圖15]：BiTE® B 產品品質HMW%定位點pH 5.9[黑色條]、低pH 4.2[灰色條]、和高電導率-45 mS/cm[有圖案的條]。具體實施方式
本文描述的是用於生物製劑製造的過程，該過程的優點在於消除或組合了製造藥物物質（DS）和藥物產品（DP）所需的步驟，從而實現用於生物製劑生產的完全整體化、端到端、連續製造過程。通過藥物產品填充/精加工，在UFDF操作之後，此過程僅需要一個降低生物負載的過濾步驟和一個無菌過濾步驟。現在將穩定化賦形劑（如通常在UFDF池的第一次降低生物負載的過濾之後添加的聚山梨酯80（PS80））直接組合到UFDF操作中，從而消除了專門用於賦形劑添加和第二次降低生物負載的過濾的整個單元操作。然後將過濾的原料藥物產品轉移到填充位置，在此處將其無菌過濾並用於填充初級藥物產品容器，然後對該初級藥物產品容器進行密封、貼標籤和包裝。材料從藥物物質製造位置到藥物產品處理位置的轉移和隨後的藥物產品填充發生在過程操作範圍所支持的貯存時間和貯存溫度內。這消除了費時的冷凍和解凍單元操作。
如圖1所示，本發明將典型製造過程中的步驟或階段的數量從十個減少到五個。本文描述的本發明還消除了對來自多個冷凍容器中的藥物物質的集中、配製物稀釋、賦形劑添加和藥物物質解凍之後的類似操作的需要。還消除了對無菌過濾之前的配製物貯存槽（hold tank）的需要。本發明允許使用相同的藥物物質收集容器或直接轉移，以遞送至和/或連接至藥物產品填充/精加工位置，並在收集原料藥物產品樣本以進行釋放測定時使用。
本發明還允許消除對配製的蛋白和/或藥物物質和藥物產品的多餘釋放採樣，並允許對兩者共有屬性的測定僅進行一次，如在藥物產品填充/精加工階段，在此階段可以將它們與其他藥物產品屬性測試組合。
本發明還藉由消除多餘的單元操作、不必要的收集和/或儲存容器、以及冷凍和對冷凍的原料藥物物質解凍和儲存的需要，降低了與人工和設備相關的成本。本發明支持模組化和靈活的設施設計以及小型設備的使用。上游和下游單元操作能以連續或半連續的方式在較小規模上完成。本發明還使得即時製造（製造活動的更大靈活性）可用於其中產品具有低庫存需求或受季節性或其他需求變化影響的情況。本發明由於消除、組合和/或連接各種單元操作、減少所需設備尺寸、消除對單元操作的物理隔離需要、免除設施設計、消除對分開的淨化空間（gowning space）和空氣處理器（導致病毒過濾前後製造空間）的需要，能夠使過程空間佔用最小化。本發明提供了將產品從細胞培養物轉移到藥物物質的連續製造過程，該過程可以利用無菌的單次使用組分。該連續製造過程可以是封閉過程。
本發明提供了一種用於生產重組生物治療劑的整體化、連續之方法，該方法包括提供純化的重組目的蛋白；藉由超濾來濃縮或稀釋該純化的重組蛋白；藉由滲濾對該純化的重組蛋白進行緩衝液交換至所需配製物；藉由超濾進一步稀釋或濃縮配製的重組蛋白，直到達到目標濃度；一旦達到該目標濃度，就添加或組合至少一種增強穩定性的賦形劑；對所得的原料藥物物質進行過濾以減少生物負載；對所得的原料藥物產品進行無菌過濾；以及對無菌的原料藥物產品進行填充和精加工操作；其中該純化的重組蛋白和該原料藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。
本發明提供了一種用於生產重組蛋白藥物產品之方法，該方法包括將表現目的蛋白的細胞擴增到N-1期；培養表現重組蛋白的細胞；通過收穫單元操作回收該重組蛋白；通過至少一個捕獲層析單元操作純化該收穫的重組蛋白；通過至少一個精製層析單元操作純化該重組蛋白；藉由超濾來濃縮或稀釋該純化的重組蛋白；藉由滲濾對該純化的重組蛋白進行緩衝液交換至所需配製物；藉由超濾進一步濃縮或稀釋配製的純化的重組蛋白，直到達到目標濃度，然後添加一種或多種增強穩定性的賦形劑；對配製的藥物物質進行單一單元操作以降低生物負載，得到過濾的原料藥物產品；無菌過濾該原料藥物產品；用無菌的原料藥物產品填充初級藥物產品容器；以及對該初級藥物產品容器進行密封、貼標籤和包裝；其中該重組蛋白和該藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。
如本文所用，「藥物物質」係指純化的重組蛋白，其旨在為疾病的診斷、治癒、減輕、治療或預防提供藥理活性或其他直接作用或旨在影響人體任何部分的結構或任何功能。通常，藥物物質包含來自其中添加一種或多種增強穩定性的賦形劑的UFDF單元操作的（配製蛋白。「純化的重組蛋白」或「純化的蛋白」可互換使用，並且是指從會干擾其治療、診斷、預防或其他用途的不合需要的蛋白、多肽、雜質和/或其他污染物中純化出來的重組蛋白。
如本文所用，「藥物產品」係指可以含有一種或多種藥物物質聯合一種或多種藥學上或生理學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑的最終劑型。「原料藥物產品」或「過濾的原料藥物產品」可互換使用，並且用於指降低生物負載過濾後的藥物物質。
在一個實施方式中，本發明提供了藉由本文描述的方法製得的藥物物質和藥物產品。
純化的重組蛋白通常在轉化為藥物物質之前要經過UFDF單元操作。通常將超濾分為兩部分：初始超濾步驟，其中重組蛋白被部分濃縮或稀釋，然後藉由使用滲濾的緩衝液交換將重組蛋白與一種或多種藥學上或生理上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑一起配製；以及第二超濾步驟，使配製的重組蛋白達到最終藥物產品所需的目標濃度。
對於其中通常需要將重組蛋白濃縮以達到最終藥物產品所需的目標濃度的模式，例如對於單株抗體，在初始超濾步驟中的濃縮程度取決於藥物產品所需的目標值。 通常，初始超濾步驟使濃度達到所需最終目標值的約一半。在該第一步驟中的濃縮程度可以根據情況、所需的最終目標劑量、重組蛋白的性質和/或其他因素或大或小。對於第二超濾步驟，目標濃度可以為20 mg/ml至40 mg/ml或高於藥物產品的所需最終濃度，以考慮第二超濾系統中的任何滯留；例如，滯留量越高，設定的濃度越高；滯留量越低，設定的濃度越低或越接近所需藥物產品濃度。
對於其中重組蛋白濃度可能高於藥物產品的所需最終濃度的高效模式（如雙特異性T細胞銜接子），可以在UFDF單元操作期間將重組蛋白稀釋至所需最終濃度。
UFDF過濾器係本領域熟知且常見的，並且可以從許多來源商購獲得。有許多可獲得的材料類型：再生纖維素Pellicon（麻塞諸塞州丹弗斯的密理博西格瑪公司（MilliporeSigma，Danvers，MA））、穩定纖維素、Sartocon® Slice、Sartocon® ECO Hydrosart® （德國戈廷根的賽多利斯公司（Sartorius，Goettingen，Germany））、聚醚碸（PES）膜、Omega（紐約華盛頓港的頗爾公司（Pall Corporation，Port Washington，NY））。根據淨化規模，典型的過濾器尺寸範圍從小於0.11 m2 面積到1.14 m2 面積及以上。可以使用多個過濾器，達到UFDF系統的貯存器、橇（skids）或物理設置將允許實現生產過程的所需目標或被實現生產過程的所需目標所需要的生產能力。例如，在臨床生產情況下，過濾器組合的範圍為11.4 m2 面積或更大，而對於商業生產規模，該範圍可以達到 ＞ 40 m2 面積。
雙特異性T細胞銜接子（BiTE® ）係高效的，且在純化過程期間易於聚集。BiTE® 易於聚集，這會影響在UFDF操作期間的濃度。已經發現，在具有13個滲濾體積、濃度高達170 g/m2 膜面積下，再生纖維素膜負載半衰期延長的BiTE® 仍在產品特徵內。此外，每次循環負載高達71.4 g/m2 的HLE BiTE® 後，用緩衝液沖洗穩定的纖維素基膜足夠乾淨，並且至少在三個循環中、無論在更高的負載和高初始濃度下都不會影響未來的膜性能。這允許在不使用腐蝕性化學清洗溶液（氫氧化鈉）的情況下、在兩次循環之間用緩衝液沖洗來實現TFF過濾器的最佳回收利用，並允許更快的處理。
對於雙特異性T細胞銜接子，可以將穩定的纖維素基膜負載至初始目標濃度，該初始目標濃度係目標濃度的2.5x。在一個實施方式中，目標過量濃度係1.1x至2.5x。在一個實施方式中，目標過量濃度係1.1x至1.5x。在一個實施方式中，目標過量濃度係1.5x至2.5x。
通常在進行第二超濾步驟之前，藉由滲濾進行緩衝液交換成所需的配製物緩衝液。將包含來自第一超濾濃度的純化的重組蛋白的緩衝液交換為包含一種或多種藥學上或生理上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑的緩衝液，這係藥物產品配製物所需的並將作用以實現最終藥物產品中的某些所需結果，如在隨後的步驟（包括但不限於過濾、填充、凍乾、冷凍、包裝、儲存、運輸、遞送、解凍和/或投與）期間維持產品品質、穩定性和/或完整性。緩衝液也可以用於調節屬性，如最終藥物產品的滲透壓、電導率和/或蛋白濃度。配製物的組分可以提供對藥物產品的保護，並且可能需要增強和/或減少藥物產品的特定屬性，如針對降解途徑進行保護；促進水溶性；降低毒性和/或反應性；提供快速清除；降低免疫原性；充當冷凍保護劑或凍乾保護劑；穩定天然構象以維持功效、效力、安全性；保護免受化學和物理降解；蛋白穩定化以減少表面張力、蛋白表面和蛋白之間的相互作用；減少疏水相互作用；優化條件，如pH、離子強度；以及緩衝和穩定。賦形劑通常以一種或多種緩衝溶液的形式製備。
藥學上或生理上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑可包括但不限於以下一種或多種：無菌稀釋劑，如注射用水；鹽溶液，如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉；固定油，如合成的單或雙甘油酯，可以用作溶劑或懸浮介質；聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸或麩胱甘肽 ；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；非離子型表面活性劑；洗滌劑；乳化劑；多肽或胺基酸，如甘胺酸；緩衝液，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，用於調節張力的試劑，如氯化鈉或右旋糖；佐劑（例如，氫氧化鋁）；和防腐劑。可以在第二超濾步驟期間或在UFDF單元操作後添加對於濃縮或過濾敏感、或出於任何其他原因可能需要特殊處理或考慮的賦形劑。
通常，在UFDF單元操作之後，對UFDF池進行過濾以降低生物負載、並且然後收集到外部貯存槽中，在該貯存槽中進行向UFDF池中添加增強穩定性的賦形劑的單元操作並且然後再次過濾以減少配製的藥物物質的生物負載。
如本文描述，本發明消除了對單獨的單元操作的需要，該單獨的單元操作將增強穩定性的賦形劑（例如聚山梨酯80）添加至含有降低生物負載的UFDF池的外部貯存槽，並再次過濾。本發明提供了將此類增強穩定性的賦形劑直接添加或組合到UFDF滯留物槽中。將賦形劑添加到UFDF滯留物槽中時，不需要通過UFDF過濾器。可以關閉過濾器的入口，使得賦形劑不與UFDF過濾器相互作用。在一個實施方式中，將一種或多種增強穩定性的賦形劑添加到配製的重組蛋白中或與其組合。在一個實施方式中，將一種或多種增強穩定性的賦形劑同時添加到配製的重組蛋白中。在相關的實施方式中，將一種或多種增強穩定性的賦形劑直接添加到超濾和滲濾（UFDF）滯留物槽中。在一個實施方式中，一旦達到目標濃度，就將一種或多種賦形劑添加到配製的重組蛋白中或與其組合。在一個實施方式中，一旦達到目標濃度，就將一種或多種賦形劑同時添加到配製的重組蛋白中。該一種或多種賦形劑也可以與直接流入貯存容器的UFDF池同時添加。在一個實施方式中，將增強穩定性的賦形劑和UFDF池分別添加到儲存容器中。
增強穩定性的賦形劑包括但不限於非離子型表面活性劑、洗滌劑和/或乳化劑。非離子型表面活性劑包括但不限於基於聚氧乙烯（PEO）的表面活性劑、聚環氧乙烷-聚環氧丙烷的嵌段共聚物；聚氧乙烯（20）山梨聚糖單油酸酯；聚山梨酯20和80，Tween® 20和Tween® 80；聚乙二醇（PEG），普朗尼克（pluronics）；泊洛沙姆，如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407。
在一個實施方式中，該增強穩定性的賦形劑係非離子型洗滌劑或表面活性劑。在一個實施方式中，增強穩定性的賦形劑係基於聚氧乙烯（PEO）的表面活性劑。在一個實施方式中，增強穩定性的賦形劑選自聚山梨酯80或聚山梨酯20。
增強穩定性的賦形劑的量取決於藥物產品的所需最終配製物。例如，聚山梨酯80的典型範圍係0.001%至0.1%（重量/體積）。在一個實施方式中，在藥物物質配製物緩衝液中聚山梨酯80的濃度為0.01%（重量/體積）。對於溶液可能很黏稠的賦形劑（如聚山梨酯80），在配製物緩衝液中稀釋至0.01%可以降低黏度，並簡化沖洗管線和降低生物負載的過濾器。
在本發明的一個實施方式中，可以在降低生物負載的過濾和/或無菌過濾之前添加一種或多種另外的配製的重組蛋白和/或藥物物質，以最終形成組合藥物產品。
在UFDF單元操作並添加任何增強穩定性的賦形劑後，將藥物物質過濾以降低生物負載，並將池收集到貯存容器（如已消毒的單次使用儲存袋）中。在將藥物物質添加到降低生物負載的過濾器中之前，可以用含有目標濃度的穩定化賦形劑的配製物緩衝液沖洗將UFDF單元連接到降低生物負載的單元的管線，然後用相同的緩衝液使降低生物負載的過濾器飽和。這有助於在配製的重組蛋白中達到穩定化賦形劑的準確濃度。如本文所用，降低生物負載係指使藥物物質不含最終藥物產品中不需要的微生物。合適的過濾器係已知的並且廣泛用於降低生物負載如SHC和PVDF過濾器以及通用0.2微米過濾器，並且可以從許多來源商購獲得。
在典型的生物製劑製造過程中，藥物物質將被冷凍以用於儲存或易於運輸到藥物處理設施。本發明消除了冷凍和解凍的單元操作，藥物物質向藥物產品的轉化係立即且連續的。這可用於連續的、整體化、端到端的治療性生物製劑製造平台，自動化平台，以最少或無需操作員介入操作的平台，即時製造平台、其中藥物產品需求可變或有限、或不需要或不可能維持冷凍藥物物質庫存的生產平台。這還減少了屬性測試的數量和時間，因為在藥物產品填充/精加工階段只能進行一次藥物物質和藥物產品之間的共有屬性。還消除了在轉換為原料藥物產品所需的冷凍/解凍後的藥物物質的任何另外的處理。
在UFDF單元操作之後，可以進行一個或多個另外的單元操作，如病毒過濾。多特異性模式（部分由於其高度特異性的設計和功能）可以在低濃度下達到所需的治療效力，這與需要高得多的濃度才能達到所需效力的單株抗體不同。特別地，一些雙特異性抗體（如雙特異性T細胞銜接子）在非常低的濃度下即可達到所需效力，並且因此可以具有 ＜ 10 g/L的藥物物質配製物濃度，而對於大多數治療性單株抗體而言，藥物物質配製物的濃度要高得多，為70 g/L或更高。在如此高濃度下，配製的抗體溶液可以迅速堵塞病毒過濾器。
由於病毒過濾器的孔徑很小，高濃度配製物（如包含單株抗體的那些）會以低得多的體積污染過濾器。對於 ＞ 10 g/L的高濃度抗體配製物，處理此類溶液所需的過濾器或膜面積將使其不適於製造用途。在單株抗體處理的典型操作順序中，病毒過濾通常在精製步驟之後進行，即在製造過程中抗體池處於最稀薄狀態處進行。隨後的UFDF操作濃縮抗體配製物。對於在UFDF之前和之後均處於低濃度的效力高效雙特異性T細胞銜接子，已經發現，如本文描述，無論病毒過濾器和UFDF操作的順序如何，處理配製的雙特異性T細胞銜接子所需的過濾器或膜面積對於病毒過濾都是合理的，並且配製的BiTE® 的病毒過濾係可能的。
本發明還提供了一種用於減少包含重組雙特異性T細胞銜接子的組成物中病毒污染物之方法，該方法包括提供樣本，該樣本包含小於7.0 g/L的重組雙特異性T細胞銜接子，該銜接子的pH小於或等於6.0、具有23-45 mS/cm的電導率；對該樣本進行病毒過濾單元操作，該病毒過濾單元操作包括單獨的病毒過濾器、或與深層過濾器或表面改性的膜預過濾器組合的病毒過濾器；以及在池中或作為流收集包含該重組雙特異性T細胞銜接子的病毒過濾器洗脫液。
本發明還提供了一種用於在製造重組雙特異性T細胞銜接子期間減少高分子量種類之方法，該方法包括提供樣本，該樣本包含小於7 g/L重組雙特異性T細胞銜接子，該銜接子的pH小於或等於6.0、具有23-45 mS/cm的電導率；對該樣本進行病毒過濾單元操作，該病毒過濾單元操作包括與深層過濾器組合的病毒過濾器；以及在池中或作為流收集該病毒過濾器洗脫液；其中與使用包括單獨的病毒過濾器、或與表面改性的膜預過濾器組合的病毒過濾器的病毒過濾單元操作相比，過濾器洗脫液池中高分子量種類的百分比降低。
本發明還提供了一種用於生產純化的、配製的重組雙特異性T細胞銜接子之方法，該方法包括；通過一種或多種層析單元操作純化收穫的重組雙特異性T細胞銜接子；對該純化的重組雙特異性T細胞銜接子進行超濾和滲濾單元操作，得到濃度 ≤5 g/L的配製的雙特異性T細胞銜接子，並且對該配製的雙特異性T細胞銜接子進行病毒過濾單元操作；獲得純化的、配製的重組雙特異性T細胞銜接子。
如本文描述，藉由病毒過濾操作成功地處理了包含雙特異性T細胞銜接子藥物物質的低濃度藥物物質配製物。具有 ＜10 g/L、較佳的是 ≤5 g/L的濃度的配製的雙特異性T細胞銜接子在本發明之內。較佳的是，具有 ≤ 0.10 g/L、 ≤ 0.5g/L、 ≤ 1g/L、 ≤ 2g/L、 ≤ 3g/L、 ≤ 4g/L的濃度的配製的雙特異性T細胞銜接子。在一個實施方式中，濃度 ≤ 3.5 g/L。在一個實施方式中,濃度係 ≤ 1.79 g/L。在一個實施方式中，濃度係1.59 g/L – 3.16 g/L。係在一個實施方式中，配製的雙特異性T細胞銜接子的濃度係1.59 g/L – 1.79 g/L。在一個實施方式中，配製的雙特異性T細胞銜接子的濃度係1.79 g/L – 3.16 g/L。在一個實施方式中，配製的雙特異性T細胞銜接子的濃度係1.59 g/L。在一個實施方式中，配製的雙特異性T細胞銜接子的濃度係1.79 g/L。在一個實施方式中，配製的雙特異性T細胞銜接子的濃度係3.2 g/L。
在一個實施方式中，本發明提供了對配製的多特異性蛋白、包括穩定性增強劑的配製的多特異性蛋白、包含多特異性蛋白的原料藥物物質、和/或包含多特異性蛋白的原料藥物產品進行病毒過濾。在一個實施方式中，多特異性蛋白係雙特異性抗體。病毒過濾步驟之後可以進行降低生物負載和/或無菌過濾。穩定性增強劑可以添加至病毒過濾池。視需要，病毒過濾池可以短期儲存在2ºC-8ºC或長期儲存在-70ºC。
單元操作可以藉由病毒過濾步驟、降低生物負載過濾或無菌過濾步驟、或藉由填充/精加工操作連續或半連續地連接。病毒過濾和病毒後過濾步驟可以在與病毒前過濾步驟相同的空間中進行。
非包膜的病毒很難滅活而不對所製造的蛋白治療劑產生風險，但是可以藉由基於尺寸的過濾方法除去此類病毒，其中使用小孔徑的過濾器去除病毒顆粒。病毒過濾可以使用微米或奈米過濾器（如從Plavona® （伊利諾州芝加哥的旭化成株式會社（Asahi Kasei，Chicago，IL））、Virosart® （德國戈廷根的賽多利斯公司（Sartorius，Goettingen，Germany））、Viresolve® Pro（麻塞諸塞州柏林頓的密理博西格瑪公司（MilliporeSigma，Burlington，MA））、PegasusTM Prime（紐約華盛頓港的頗爾生物技術（Pall Biotech，Port Washington，NY））、CUNO Zeta Plus VR，（明尼蘇達州聖保羅（St. Paul，Mn）的3M公司）獲得的那些）進行，並且可以發生在生物製造過程的下游操作中一個或多個步驟中。通常，病毒過濾在UFDF操作之前進行，但也可以在UFDF之後進行。
雙特異性T細胞銜接子（如HLE BiTE® ）係高效的，且在純化過程期間易於聚集。雙特異性T細胞銜接子可能對純化條件敏感，並且易於聚集，這可能導致病毒過濾操作期間載量降低和通量衰減增加。預過濾器可以與病毒過濾器組合使用，以説明消除產品池或洗脫液流中的某些污染物，然後再將池或洗脫液應用於病毒過濾器，從而在病毒過濾操作期間保持連續流動並延長過濾器的使用壽命。預過濾器可商購獲得，並且包括表面改性聚醚碸膜過濾器，如Viresolve® Pro Shield、Viresolve® Pro Shield H），以及深層過濾器，如Viresolve® 預過濾器和Millistak+® HC Pro X0SP，所有都來自密理博西格瑪公司（麻塞諸塞州伯靈頓）。如本文描述，已經發現深層過濾器預過濾器對於雙特異性T細胞銜接子的病毒過濾操作特別有效。
與雙特異性抗體的下游處理相關的資訊不是很多，因此經常應用為單株抗體開發的平台（Shulka和Norman, 第26章 Downstream Processing of Fc Fusion Proteins, Bispecific Antibodies, and Antibody-Drug Conjugates [Fc融合蛋白、雙特異性抗體和抗體藥物軛合物的下游處理], 在第二版Process Scale Purification of Antibodies [抗體的生產規模純化] 中, Uwe Gottswchalk編輯, p559-594, John Wiley & Sons [約翰威立父子公司], 2017）。然而，該等過程對雙特異性蛋白（如重組雙特異性T細胞銜接子）的執行方式不一定與對單株抗體的相同。如本文描述，當處理重組半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子蛋白（特別是半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子蛋白）時，僅向病毒過濾器中添加預過濾器並不能完全改善性能。已經發現，藉由將半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子蛋白的濃度限制在小於7.0 g/L，pH小於或等於6.0，具有23-45 mS/cm的電導率，對該蛋白進行病毒過濾單元操作，該病毒過濾單元操作包括單獨病毒過濾器、或與深層過濾器預過濾器或表面改性的膜預過濾器組合的病毒過濾器，性能得到改善。特別地，與使用單獨病毒過濾器或與表面改性的膜預過濾器組合的病毒過濾器相比，使用與病毒過濾器組合的深層過濾器預過濾器可減少通量衰減和/或降低HMW%。
本發明還提供了一種用於在製造重組雙特異性T細胞銜接子期間在病毒過濾單元操作中減少通量衰減和降低高分子量種類之方法，該方法包括提供樣本，該樣本包含小於或等於1.75 g/L的重組雙特異性T細胞銜接子，該銜接子的pH為4.2-6.0，電導率為23-45 mS/cm；對該純化的重組雙特異性T細胞銜接子進行病毒過濾單元操作，該病毒過濾單元操作包括與深層過濾器組合的病毒過濾器；以及在池中或作為流收集該過濾器洗脫液；其中與包括單獨的病毒過濾器、或與表面改性的膜預過濾器組合的病毒過濾器的病毒過濾單元操作相比，過濾器洗脫液池或流中高分子量種類的百分比降低。
在一個實施方式中，池或流的pH係4.0至6.0。在一個實施方式中，池或流的pH係4.2至6.0。在相關的實施方式中，池或流的pH係4.2至5.9。在相關的實施方式中，池或流的pH係4.2至5.0。在一個實施方式中，池或流的pH係5.0至6.0。在一個實施方式中，池或流的pH係5.0至5.9。在一個實施方式中，池或流的電導率係23至45。在一個實施方式中，池或流的電導率係23至32。在一個，池或流的電導率係23至28。在一個實施方式中，半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度係1.75至7.0 g/L。在一個實施方式中，半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度係7.0 g/L。在一個實施方式中，半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度係1.75 g/L。在相關的實施方式中，該半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度係1.75至1.18 g/L。
在一個實施方式中，pH係5.0，半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度的濃度係1.75 g/L。在相關的實施方式中，pH係6.0，半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度係7.0 g/L且電導率係28 mS/cm。在一個實施方式中，pH係5.9，半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度係1.81 g/L且電導率係31.36至45 mS/cm。在一個實施方式中，pH係4.2至5.9，半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度係1.75至1.81 g/L且電導率係23至45 mS/cm。在一個實施方式中，pH係4.2至5.0，半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度的濃度係1.75 g/L且電導率係23 mS/cm。在一個實施方式中，pH係5.9，半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的濃度的濃度係1.81 g/L且電導率係31.36至45 mS/cm。在一個實施方式中，純化的重組半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子小於或等於7.0 g/L，並且pH小於或等於6.0，具有23至45 mS/cm的電導率
在一個實施方式中，病毒過濾單元操作包括與深層過濾器預過濾器組合的病毒過濾器。在相關的實施方式中，該深層過濾器預過濾器係吸收式深層過濾器或合成式深層過濾器。在一個實施方式中，病毒過濾單元操作包括與表面改性的膜預過濾器組合的病毒過濾器。在相關的實施方式中，該病毒過濾單元操作包括與表面改性聚醚碸膜預過濾器組合的病毒過濾器。在一個實施方式中，該病毒過濾單元操作僅包括病毒過濾器。
還對過濾的原料藥物產品進行降低生物負載過濾和/或無菌過濾，以確保不含活微生物，並且然後引入無菌處理設施，在其中用於填充初級藥物產品容器，然後對該初級藥物產品容器進行密封、貼標籤和包裝。
無菌處理設施係指維護有可能影響藥物產品無菌性的污染物來源最小的設施。這種設施可以是具有一個或多個用於藥物產品填充/精加工的填充站的專用潔淨室，每個填充站包括一個或多個帶有多個針頭的自動填充機，以同時填充多個藥物產品容器。無菌處理設施也可以是獨立的不戴手套的無菌隔離器站。這種站可以位於開放式大廳製造設施（open ball-room manufacturing facility）中，特別地，這種站可以位於藥物物質製備區域處或在其附近。用於液體和凍乾藥物產品的此類別模組化不戴手套的無菌隔離器包括但不限於Vanrx（加拿大不列顛哥倫比亞省的巴納比（Barnaby，British Columbia，Canada））。此類系統允許開發不需要操作員介入的連續系統。在完全封閉的隔離器內進行機械化材料處理、填充和封閉活動的小規模模組化工作站可以允許減小製造工廠的規模，並且還可以使用模組化和可重構空間使用的更大的靈活性，但可能需要一些操作員介入。本發明允許利用現有的單次使用元件來創建完全機械化的新流程，其中在不戴手套的隔離器內部無菌填充，空間佔用比低成本費用的傳統內置設施小。
本發明提供了一種用於減少藥物產品生產過程的製造空間佔用之方法，該方法包括對純化的重組目的蛋白進行UFDF單元操作直至達到目標濃度；將至少一種增強穩定性的賦形劑直接添加到UFDF滯留物槽中；對該原料藥物物質進行單一單元操作以降低生物負載，然後進行無菌過濾；對原料藥物產品進行填充和精加工單元操作；其中該重組蛋白和該藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。病毒過濾單元操作可以在UFDF操作之前或之後進行。
在本發明的一個實施方式中，將原料藥物產品遞送到無菌處理設施，在填充/精加工之前在該無菌處理設施中進行無菌過濾。在一個實施方式中，該無菌處理設施包括至少一個填充站。在一個實施方式中，過濾的原料藥物產品在儲存容器中，該容器可以遞送到無菌處理設施。在另一個實施方式中，該儲存容器可以直接連接到該無菌處理設施。在一個實施方式中，藥物產品被過濾到直接遞送和/或連接到無菌處理設施的儲存袋中。在一個實施方式中，原料藥物產品可以經由管道或其他連接從降低生物負載過濾中直接遞送到無菌處理設施。
在一個實施方式中，將原料藥物產品遞送到無菌處理設施，該無菌處理設施可以是機械化單元，例如像不戴手套的無菌隔離器。在一個實施方式中，機械化單元具有與含有或處理原料藥物產品的儲存容器或過濾器的連接。將藥物物質處理與藥物產品處理直接互連（特別是藉由直接連接到機械化填充器上）的能力提供了減少過程空間佔用的機會。藉由壓縮過程、去除多餘的或不必要的設備或過程步驟、消除藥物物質的冷凍/解凍，允許設計和實現具有3,000平方英尺或更小空間佔用的過程。
在本發明的一個實施方式中，用無菌的原料藥物產品填充初級藥物產品容器。在另一個實施方式中，將該初級藥物產品容器密封、貼標籤和包裝。在一個實施方式中，初級藥物產品容器係小瓶，安瓿瓶，藥筒，注射器或含有注射器的裝置，或其他合適的儲存或遞送裝置、儀器或系統。
本發明提供了一種用於在重組治療蛋白製造期間減少藥物物質損失和/或不穩定之方法，該方法包括對純化的重組目的蛋白進行UFDF單元操作；一旦達到目標濃度，就將至少一種增強穩定性的賦形劑添加到UFDF滯留物槽中；對UFDF池進行單一過濾以降低生物負載，得到原料藥物物質；其中該重組蛋白和該藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。病毒過濾單元操作可以在UFDF操作之前或之後進行。
構成藥物物質的蛋白係各種相互作用之間微妙的平衡的結果，該相互作用包括形成並維持其折疊的三維結構的共價鍵、疏水相互作用、靜電相互作用、氫鍵、凡得瓦力。蛋白的折疊狀態僅比未折疊狀態稍穩定一點，並且蛋白環境的變化可能會觸發降解或失活，這直接影響到產品的品質。
本發明減少了消除生物負載過濾步驟的數量，這有利於減少由於過濾期間的體積滯留而造成的產品損失，以及避免由於可能由多次過濾導致的剪切誘導的PQ變化而對產品品質和蛋白結構造成任何影響。這樣做的益處還在於它簡化了製造過程，使其與連續製造平台更加相容；減少了藥物物質製造設施的空間佔用，並可能減少製造時間線，使更快地獲得包裝好的藥物產品。與典型的生物製劑製造平台相比，還節省成本和減少浪費，在該平台上，從UFDF單元操作到藥物產品填充/精加工，可以使用三個或多個降低生物負載的過濾器和相關聯的貯存槽或收集容器。
本發明的方法消除了解凍的藥物物質的冷凍、冷凍儲存、解凍、混合和集中，即「冷凍和解凍單元操作」。製造期間原料藥物物質的冷凍和解凍可能不利於蛋白穩定性並影響產品品質。冰-液介面、低溫濃縮（液體冷凍時蛋白的濃縮會導致蛋白結構的變化）、賦形劑結晶、ph變化（由於緩衝液組分的選擇性沈澱，蛋白的不穩定）、蛋白濃度增加可能導致聚集或沈澱、冷變性（在低溫下自發展開）、容器表面相互作用，來自容器的可濾出物和可浸出物。(Rathore和Rajan, Biotechnol. Prog.[生物技術進展] 24： 504-514, 2008)。
術語「多核苷酸」或「核酸分子」在全文中可互換使用，並且包括單鏈和雙鏈核酸，並且包括基因組DNA、RNA、mRNA、cDNA或合成來源的或與通常在自然界中發現的序列無關的一些其組合。術語「分離的多核苷酸」或「分離的核酸分子」具體是指合成來源的序列或自然界中通常不存在的序列。包含規定序列的分離的核酸分子除表現目的蛋白的序列以外還可以包括針對高達十種或甚至高達二十種其他蛋白或其部分的編碼序列，或可以包括控制所敘述核酸序列的編碼區的表現的可操作地連接的調節序列，和/或可以包括載體序列。包含核酸分子的核苷酸可以是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或者任一類型核苷酸的經修飾形式。該修飾包括鹼基修飾，如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，如2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵修飾，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯及胺基磷酸酯。
如本文所用，術語「分離的」意指 (i) 不含至少一些通常與其一起被發現的蛋白或多核苷酸，(ii) 基本上不含來自相同來源的其他蛋白或多核苷酸，例如來自相同物種，(iii) 與至少約50%的在自然界與其相關的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(iv) 可操作地與在自然界與其不相關的多肽相關（藉由共價或非共價相互作用），或 (v) 在自然界中不存在。
術語「多肽」或「蛋白」在全文中可互換使用，並且是指包含藉由肽鍵彼此連結的兩個或更多個胺基酸殘基的分子。多肽和蛋白還包括具有天然序列的胺基酸殘基的一個或多個缺失、插入和/或取代的大分子，即包括由天然存在細胞和非重組細胞產生的多肽或蛋白；或藉由基因工程化細胞或重組細胞產生，並且包括具有天然蛋白的胺基酸序列的胺基酸殘基的一個或多個缺失、插入和/或取代的分子。多肽和蛋白還包括如下胺基酸聚合物，其中一種或多種胺基酸為相應天然存在的胺基酸和聚合物的化學類似物。多肽和蛋白還包括修飾，該修飾包括但不限於糖基化、脂質附著、硫酸化、麩胺酸殘基的γ-羧化、羥基化和ADP核糖基化。術語「分離的蛋白」，「分離的重組蛋白」或「純化的重組蛋白」可以互換使用，並且是指從會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途的蛋白或多肽或其他污染物中純化出來的目的多肽或蛋白。特別地，由使用如本文描述的本發明處理的重組目的蛋白製成的藥物物質和藥物產品可以被稱為「重組蛋白藥物產品」、「重組生物治療劑」。
多肽和蛋白可能具有科學意義或商業意義，包括蛋白治療劑。目的蛋白尤其包括分泌型蛋白、非分泌型蛋白、胞內蛋白或膜結合蛋白。目的蛋白可以使用本文描述的方法藉由重組動物細胞系生產，並且可以被稱為「重組蛋白」或「重組蛋白治療劑」。所表現的一種或多種蛋白可以在細胞內產生或被分泌到培養基中，從培養基中可以回收和/或收集該蛋白。目的蛋白可以包括例如藉由結合靶、特別是下面列出的那些中的靶而發揮治療作用的蛋白，包括從其衍生的靶、與其相關的靶及其修飾。
目的蛋白可以包括「抗原結合蛋白」。「抗原結合蛋白」係指包括抗原結合區或抗原結合部分的蛋白或多肽，該抗原結合區或抗原結合部分對與其結合的另一分子（抗原）具有強親和力。抗原結合蛋白涵蓋抗體、肽體、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物、融合蛋白（包括單鏈可變片段（scFv）和雙鏈（雙價）scFv、DARPins® 、突變蛋白（muteins）、多特異性蛋白、雙特異性蛋白、xMAb、和嵌合抗原受體（CAR或CAR-T）以及T細胞受體（TCR））。
「多特異性」、「多特異性蛋白」和「多特異性抗體」在本文用於指重組工程化以同時結合和中和同一抗原上的至少兩個不同抗原或至少兩個不同表位的蛋白。例如，多特異性蛋白可以被工程化以靶向與針對腫瘤的靶向細胞毒性劑或感染劑組合的免疫效應子。已發現該等多特異性蛋白可藉由將免疫效應子細胞重定向至腫瘤細胞、藉由阻斷信號傳導途徑修飾細胞信號傳導、靶向腫瘤血管生成、阻斷細胞介素、以及作為藥物的預靶向遞送媒介物（如遞送化學治療劑、放射性標記（以改善檢測靈敏度）和奈米顆粒（定向到特定的細胞/組織，如癌細胞））而用於多種應用，如在癌症免疫療法中。
最常見和最多樣化的多特異性蛋白係結合兩種抗原的蛋白，在本文中稱為「雙特異性」、「雙特異性蛋白」和「雙特異性抗體」。雙特異性蛋白可分為兩大類：免疫球蛋白G（IgG）樣分子和非IgG樣分子。IgG樣分子保留Fc介導的效應子功能，如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）、補體依賴性細胞毒性（CDC）和抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP），Fc區有助於改善溶解性和穩定性並且促進一些純化操作。非IgG樣分子較小，可增強組織穿透力（參見Sedykh等人, Drug Design, Development and Therapy [藥物設計、開發與療法] 18(12), 195-208, 2018；Fan等人, J Hematol & Oncology [血液與腫瘤學雜誌] 8:130-143, 2015；Spiess等人, Mol Immunol [分子免疫學] 67, 95-106, 2015；Williams等人, 第41章 Process Design for Bispecific Antibodies in Biopharmaceutical Processing Development [生物製藥處理開發中雙特異性抗體的過程設計], Design and Implementation of Manufacturing Processes [製造過程的設計與實現], Jagschies等人編輯, 2018, 第837-855頁。雙特異性蛋白有時被用作具有對不同抗原或表位數目的結合特異性的另外組分的框架，增加了分子的結合特異性。
包括雙特異性抗體的雙特異性蛋白的形式正在不斷發展，並且包括但不限於四源雜交瘤（quadromas）、杵臼結構（knobs-in-holes）、交叉單株抗體（cross-Mabs）、雙可變結構域IgG（DVD-IgG）、IgG-單鏈Fv（scFv）、scFv-CH3 KIH、雙功能Fab（DAF）、半-分子交換、κλ-體、串聯scFv、scFv-Fc、雙抗體、單鏈雙抗體（sc雙抗體）、sc雙抗體-CH3、三抗體、微型抗體、微型體、TriBi微型體、串聯雙抗體、sc雙抗體-HAS、串聯scFv-毒素、雙親和重定向分子（dual-affinity retargeting molecules，DARTs）、奈米抗體、奈米抗體-HSA、對接和鎖定（DNL）、鏈交換工程化結構域 SEED體（SEEDbody）、三功能抗體（Triomab）、白胺酸拉鍊（LUZ-Y）、XmAb® ；Fab-臂交換、DutaMab、DT-IgG、電荷對（charged pair）、Fcab、正交Fab、IgG（H）-scFv、scFV-（H）IgG、IgG（L）-scFV、IgG（L1H1）-Fv、IgG（H）-V、V（H）-IgG、IgG（L）-V V（L）-IgG、KIH IgG-scFab、2scFV-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zy體、DVI-Ig4（四位一體）、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFV、F（ab’）2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙抗體-Fc、雙抗體-Fc、胞內抗體、ImmTAC、HSA體（HSABody）、IgG-IgG、Cov-X-體、scFv1-PEG-scFv2、雙特異性T細胞銜接子（BiTEs® ）和半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子（HLE BiTEs）（Fan, 同上；Spiess, 同上；Sedykh, 同上；Seimetz等人, Cancer Treat Rev[癌症治療評論] 36(6) 458-67, 2010；Shulka和Norman, 第26章 Downstream Processing of Fc Fusion Proteins, Bispecific Antibodies, and Antibody-Drug Conjugates [Fc融合蛋白、雙特異性抗體和抗體藥物軛合物的下游處理], 在第二版Process Scale Purification of Antibodies [抗體的生產規模純化] 中, Uwe Gottswchalk編輯, p559-594, John Wiley & Sons [約翰威立父子公司], 2017；Moore等人, MAbs 3:6，546-557，2011）。
在一些實施方式中，包括雙特異性T細胞接合物（BiTE® ）抗體構建體，其係由兩個柔性連接的抗體衍生的結合結構域製成的重組蛋白構建體（參見WO 99/54440和WO 2005/040220）。構建體的一個結合結構域對靶細胞上選定的腫瘤相關表面抗原（如EGFRvIII、MSLN、CDH19、DLL3、CD19、CD33、CD38、FLT3、CDH3、BCMA、PSMA、MUC17、CLDN18.2、或CD70）具有特異性；第二結合結構域對CD3（T細胞上的T細胞受體複合物的亞基）具有特異性。BiTE® 構建體還可以包括在CD3鏈的N末端處結合背景無關表位（context independent epitope）的能力（WO 2008/119567），以更特異性地激活T細胞。半衰期延長的BiTE®構建體係BiTE®抗體構建體，該構建體包括小雙特異性抗體構建體與較大蛋白的融合物，其較佳的是不會干擾BiTE® 抗體構建體的治療效果。雙特異性T細胞銜接子的實例包括雙特異性Fc-分子，例如US 2014/0302037、US 2014/0308285、WO 2014/151910和WO 2015/048272中所描述的。替代性策略係使用與雙特異性分子融合的人血清白蛋白（HAS）或者僅人白蛋白結合肽的融合物（參見例如WO 2013/128027、WO 2014/140358）。另一種HLE BiTE® 策略包括融合與靶細胞表面抗原結合的第一結構域、與人和/或獼猴CD3e鏈的胞外表位結合的第二結構域以及作為特異性Fc模式的第三結構域（WO 2017/134140）。
在一些實施方式中，雙特異性蛋白可能包括博納吐單抗、卡妥索單抗（catumaxomab）、厄妥瑪索單抗（ertumaxomab）、索利托單抗（solitomab）、targomiRs、魯吉珠單抗（lutikizumab）（ABT981）、伐努賽珠單抗（vanucizumab）（RG7221）、壬托魯單抗（remtolumab）（ABT122）、ozoralixumab（ATN103）、floteuzmab（MGD006）、帕妥昔珠單抗（AMG112、MT112）、lymphomun（FBTA05）、（ATN-103）、AMG103（抗-CD19 x 抗-CD3 BiTE® 抗體）AMG211（MT111、Medi-1565）（抗-癌坯抗原 x 抗-CD3抗體）、AMG330（抗-CD33 x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG212（抗-PSMA x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG160 （抗-PSMA x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG420（B1836909），（抗-BCMA x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG-110（MT110）、AMG562（抗-CD19 x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG596（抗-EGFRvIII x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG427 （半衰期延長的抗-FLT3 x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG673（半衰期延長的抗-CD33 x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG675（半衰期延長的抗-DLL3 x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG701（半衰期延長的抗-BCMA x 抗-CD3 BiTE® 抗體）、AMG 424（抗-CD38 抗-CD3 Xmab）、MDX-447、TF2、rM28、HER2Bi-aATC、GD2Bi-aATC、MGD006、MGD007、MGD009、MGD010、MGD011（JNJ64052781）、IMCgp100、銦標記的IMP-205、xm734、LY3164530、OMP-305BB3、REGN1979、COV322、ABT112、ABT165、RG-6013（ACE910）、RG7597（MEDH7945A）、RG7802、RG7813（RO6895882）、RG7386、BITS7201A（RG7990）、RG7716、BFKF8488A（RG7992）、MCLA-128、MM-111、MM141、MOR209/ES414、MSB0010841、ALX-0061、ALX0761、ALX0141；BII034020、AFM13、AFM11、SAR156597、FBTA05、PF06671008、GSK2434735、MEDI3902、MEDI0700、MEDI7352、以及其分子或變體或類似物，和上述任何一種的生物仿製藥。
雙特異性蛋白還包括三特異性抗體、四價雙特異性抗體、不含抗體組分多特異性蛋白（如雙抗體、三抗體或四抗體、微型體）、和能夠結合多個靶標的單鏈蛋白。Coloma, M.J.等人, Nature Biotech [自然生物技術]. 15 (1997) 159-163
scFv係單鏈抗體片段，它具有連接在一起的抗體重鏈和輕鏈的可變區。參見美國專利號7,741,465和6,319,494以及Eshhar等人, Cancer Immunol Immunotherapy [癌症免疫學免疫療法](1997) 45： 131-136。scFv保留了親本抗體與靶抗原特異性相互作用的能力。
術語「抗體」包括任何同種型或亞類的糖基化免疫球蛋白和非糖基化免疫球蛋白，或者其與完整抗體競爭特異性結合的抗原結合區。除非另外說明，否則抗體包括人的、人源化的、嵌合的、多特異性的、單株的、多株的、特異性IgG（heteroIgG）、雙特異性的抗體、及其寡聚物或抗原結合片段。抗體包括lgG1型、lgG2型、lgG3型或lgG4型。還包括具有抗原結合片段或抗原結合區的蛋白，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、雙抗體、Fd、dAb、最大抗體（maxibody）、單鏈抗體分子、單結構域VH H、互補決定區（CDR）片段、scFv、雙抗體、三抗體、四抗體和至少包含足以使特異性抗原與靶多肽結合的免疫球蛋白的一部分的多肽。
還包括人的、人源化的和其他抗原結合蛋白，如人抗體和人源化抗體，該抗原結合蛋白當投與人時不會產生明顯有害的免疫反應。
還包括經修飾的蛋白，如經非共價鍵、共價鍵或者共價鍵和非共價鍵兩者化學修飾的蛋白。還包括進一步包含一種或多種譯後修飾的蛋白，其可以藉由細胞修飾系統或由酶和/或化學方法離體引入或以其他方式引入的修飾製得。
目的蛋白還可以包括重組融合蛋白，該重組融合蛋白包括例如多聚化結構域，如白胺酸拉鍊、捲曲螺旋、免疫球蛋白的Fc部分等。還包括包含分化抗原的全部或部分胺基酸序列的蛋白（稱為CD蛋白）或其配位基或與該等中的任一個實質上相似的蛋白。
在一些實施方式中，蛋白可以包括群落刺激因子，如粒細胞群落刺激因子（G-CSF）。此類G-CSF試劑包括但不限於Neupogen® （非格司亭）和Neulasta® （培非格司亭）。還包括紅血球生成刺激劑（ESA），如Epogen® （依伯汀α）、Aranesp® （達貝泊汀α）、Dynepo® （依伯汀δ）、Mircera® （甲氧基聚乙二醇-依伯汀β）、Hematide® 、MRK-2578，INS-22，Retacrit® （依伯汀ζ）、Neorecormon® （依伯汀β）、Silapo® （依伯汀ζ）、Binocrit® （依伯汀α）、依伯汀αHexal、Abseamed® （依伯汀α）、Ratioepo® （依伯汀θ）、Eporatio® （依伯汀θ）、Biopoin® （依伯汀θ）、依伯汀α、依伯汀β、依伯汀ζ、依伯汀θ和依伯汀δ、依伯汀ω、依伯汀ι、組織纖溶酶原激活劑、GLP-1受體激動劑、以及前述任何內容的分子或其變體或類似物和生物仿製藥。
在一些實施方式中，蛋白可以包括與一種或多種CD蛋白、HER受體家族蛋白、細胞黏附分子、生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子（TGF）、胰島素樣生長因子、骨誘導因子、胰島素和胰島素相關蛋白、凝血蛋白和凝血相關蛋白、群落刺激因子（CSF）、其他血液和血清蛋白血型抗原特異性結合的蛋白；受體、受體相關蛋白、生長激素、生長激素受體、T細胞受體；神經營養因子、神經營養蛋白、鬆弛素（relaxin）、干擾素、介白素、病毒抗原、脂蛋白、整合素、類風濕因子、免疫毒素、表面膜蛋白、轉運蛋白、歸巢受體、位址素、調節蛋白和免疫黏附素。
在一些實施方式中，單獨或以任何組合結合以下中的一種或多種的蛋白：CD蛋白（包括但不限於CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD70、CD123、CD133、CD138、CD171和CD174）、HER受體家族蛋白（包括例如HER2、HER3、HER4和EGF受體）、EGFRvIII、細胞黏附分子（例如LFA-1、Mol、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和α v/β 3整合素）、生長因子（包括但不限於例如血管內皮生長因子（「VEGF」））；VEGFR2、生長激素、促甲狀腺激素、卵泡刺激素、黃體生成素、生長激素釋放因子、甲狀旁腺激素、米勒管抑制物質（mullerian-inhibiting substance）、人巨噬細胞炎性蛋白（MIP-1-α）、促紅血球生成素（EPO）、神經生長因子（如NGF-β）、血小板源性生長因子（PDGF）、成纖維細胞生長因子（包括例如aFGF和bFGF）、表皮生長因子（EGF）、Cripto、轉化生長因子（TGF）（尤其包括TGF-α和TGF-β（包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5））、胰島素樣生長因子-I和胰島素樣生長因子-II（IGF-I和IGF-II）、des(1-3)-IGF-I（腦IGF-I）和骨誘導因子、胰島素和胰島素相關蛋白（包括但不限於胰島素、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素原和胰島素樣生長因子結合蛋白）；（凝血蛋白和凝血相關蛋白，尤其如，VIII因子、組織因子、範威爾邦德（von Willebrand）因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、纖溶酶原激活劑（如尿激酶和組織纖溶酶原激活劑（「t-PA」））、邦巴辛（bombazine）、凝血酶、血小板生成素和血小板生成素受體、群落刺激因子（CSF）（尤其包括以下物質：M-CSF、GM-CSF和G-CSF）、其他血液和血清蛋白（包括但不限於白蛋白、IgE和血型抗原）、受體和受體相關蛋白（包括例如flk2/flt3受體、肥胖（OB）受體、生長激素受體和T細胞受體）；（x）神經營養因子，包括但不限於骨源性神經營養因子（BDNF）和神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-5或神經營養蛋白-6（NT-3、NT-4、NT-5或NT-6）；（xi）鬆弛素A鏈、鬆弛素B鏈和鬆弛素原、干擾素（包括例如干擾素α、干擾素β和干擾素γ）、介白素（IL）（例如IL-1至IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-23、IL-12/IL-23、IL-2Ra、IL1-R1、IL-6受體、IL-4受體和/或IL-13受體、IL-13RA2或IL-17受體、IL-1RAP；(xiv) 病毒抗原，包括但不限於AIDS包膜病毒抗原、脂蛋白、降鈣素、升糖素、心鈉素、肺表面活性劑、腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子-β、腦啡肽酶、BCMA、IgKappa、ROR-1、ERBB2、間皮素、RANTES（受激活調節的正常T細胞表現與分泌因子）、小鼠促性腺激素相關肽、DNA酶、FR-α、抑制素和活化素、整合素、蛋白A或D、類風濕因子、免疫毒素、骨成形性蛋白質（BMP）、超氧化物歧化酶、表面膜蛋白、衰變加速因子（DAF）、AIDS包膜、轉運蛋白、歸巢受體、MIC（MIC-a、MIC-B）、ULBP 1-6、EPCAM、位址素、調節蛋白、免疫黏附素、抗原結合蛋白、生長激素、CTGF、CTLA4、嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin）-1、MUC1、CEA、c-MET、密蛋白（Claudin）-18、GPC-3、EPHA2、FPA、LMP1、MG7、NY-ESO-1、PSCA、神經節苷脂GD2、神經節苷脂GM2、BAFF、ICOS、OPGL（RANKL）、肌生成抑制素、Dickkopf-1（DKK-1）、Ang2、NGF、IGF-1受體、肝細胞生長因子（HGF）、TRAIL-R2、c-Kit、B7RP-1、PSMA、NKG2D-1、計劃性細胞死亡蛋白1和配位基、PD1和PDL1、甘露糖受體/hCGβ、丙型肝炎病毒、間皮素dsFv[PE38軛合物、嗜肺軍團菌（lly）、IFN γ、γ干擾素誘導蛋白10（IP10）、IFNAR、TALL-1、胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin 9型（PCSK9）、幹細胞介素、Flt-3、降鈣素基因相關肽（CGRP）、OX40L、α4β7、血小板特異性（血小板糖蛋白Iib/IIIb（PAC-1）、轉化生長因子β（TFGβ）、透明帶精子結合蛋白3（ZP-3）、TWEAK、TSLP、血小板衍生的生長因子受體α（PDGFRα）、硬化蛋白（sclerostin）、Jagged-1、以及任何前述內容的生物活性片段或變體。
AMG506（FAPx4-1BB靶向DARPin® ）、AMG592（IL2突變蛋白Fc融合物）、AMG890（干擾RNA Lp(a)）、AMG 119（DLL3 CART）。
在另一個實施方式中，蛋白包括阿昔單抗（abciximab）、阿達木單抗（adalimumab）、阿德木單抗（adecatumumab）、阿柏西普（aflibercept）、阿侖單抗（alemtuzumab）、阿利庫單抗（alirocumab）、阿那白滯素（anakinra）、阿塞西普（atacicept）、巴厘昔單抗（basiliximab）、貝利木單抗（belimumab）、貝伐單抗（bevacizumab）、生物素單抗（biosozumab）、博納吐單抗（blinatumomab）、本妥昔單抗（brentuximab vedotin）、布羅達單抗（brodalumab）、莫坎妥珠單抗（cantuzumab mertansine）、康納單抗（canakinumab）、西妥昔單抗（cetuximab）、塞妥珠單抗（certolizumab pegol）、可那木單抗（conatumumab）、達利珠單抗（daclizumab）、迪諾舒單抗（denosumab）、依庫麗單抗（eculizumab）、依決洛單抗（edrecolomab）、依法利珠單抗（efalizumab）、依帕珠單抗（epratuzumab）、埃侖單抗（erenumab）、依那西普（etanercept）、維卡塞肽（etelcalcetide）、依伏庫單抗（evolocumab）、加利昔單抗（galiximab）、蓋尼塔單抗（ganitumab）、吉妥珠單抗（gemtuzumab）、戈利木單抗（golimumab）、替伊莫單抗（ibritumomab tiuxetan）、英夫利昔單抗（infliximab）、易普利姆瑪（ipilimumab）、艾塞吉珠單抗（ixekizumab）、樂地單抗（lerdelimumab）、魯昔單抗（lumiliximab）、馬帕木單抗（ mapatumumab）、磷酸莫特沙尼（motesanib diphosphate）、莫羅單抗-CD3（muromonab-CD3）、那他珠單抗（natalizumab）、奈西立肽（nesiritide）、尼妥珠單抗（nimotuzumab）、納武單抗（nivolumab）、奧瑞珠單抗（ocrelizumab）、奧法木單抗（ofatumumab）、奧馬珠單抗（omalizumab）、奧普瑞介白素（oprelvekin）、帕利珠單抗（palivizumab）、帕尼單抗（panitumumab）、派姆單抗（pembrolizumab）、帕妥珠單抗（pertuzumab）、培克珠單抗（pexelizumab）、蘭尼單抗（ranibizumab）、利妥木單抗（rilotumumab）、利妥昔單抗（rituximab）、羅米司亭（romiplostim）、洛莫索珠單抗（romosozumab）、沙格司亭（sargamostim）、特折魯單抗（tezepelumab）、托珠單抗（tocilizumab）、托西莫單抗（tositumomab）、曲妥單抗（trastuzumab）、tratuzumap（tratuzumap）、優特克單抗（ustekinumab）、維多珠單抗（vedolizumab）、維西珠單抗（visilizumab）、伏洛昔單抗（volociximab）、紮木單抗（zanolimumab）、紮魯木單抗（zalutumumab）、以及前述任何內容的生物仿製藥。
根據本發明的蛋白涵蓋所有前述內容，並且進一步包括包含上述任何抗體的1、2、3、4、5或6個互補決定區（CDR）的抗體。還包括這樣的變體，其包括與目的蛋白的參考胺基酸序列具有70%或更高、特別是80%或更高、更特別是90%或更高、再更特別是95%或更高、具體是97%或更高、更具體是98%或更高、再更具體是99%或更高同一性的胺基酸序列的區。在這方面的同一性可以使用多種熟知的且容易獲得的胺基酸序列分析軟體來確定。較佳的軟體包括實施史密斯-沃特曼（Smith-Waterman）演算法的那些軟體，該軟體被認為係搜索和比對序列問題的令人滿意的解決方案。還可以採用其他演算法，特別是在速度係重要考慮因素的情況下。可以用於此方面的用於DNA、RNA和多肽的比對和同源性匹配的常用程式包括FASTA、TFASTA、BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTN、PROSRCH、BLAZE和MPSRCH，後者係用於在MasPar製造的大規模並行處理器上執行的史密斯-沃特曼演算法的實施方式。
本文中還提供包含如上文所述的至少一種核酸分子的呈質體、表現載體、轉錄盒或表現盒形式的表現系統和構建體，和包含此類表現系統或構建體的宿主細胞。如本文所用，「載體」意指適合用於將資訊編碼蛋白轉移和/或轉運至宿主細胞和/或特定位置和/或宿主細胞內的區室的任何分子或實體（例如，核酸、質體、噬菌體、轉座子、黏粒、染色體、病毒、病毒衣殼、病毒體、裸DNA、複合DNA等）。載體可以包括病毒和非病毒載體、非附加型哺乳動物載體。載體通常被稱為表現載體，例如，重組表現載體和選殖載體。可以將載體引入宿主細胞以允許載體自身的複製，並從而擴增其中包含的多核苷酸的拷貝。選殖載體可含有序列組分，該序列組分通常包括但不限於複製起點、啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列和選擇性標記物。該等元件可以由熟悉該項技術者適當選擇。
一種或多種「細胞」包括任何原核或真核細胞。細胞可以是離體細胞、體外細胞或體內細胞，可以是單獨的或作為高級結構（如組織或器官）的一部分。細胞包括「宿主細胞」，也稱為「細胞系」，它們經基因工程化以表現具有商業或科學意義的多肽。宿主細胞典型地源自來自原代培養物的譜系，其可在培養中維持無限時間。基因工程化宿主細胞涉及用重組多核苷酸分子轉染、轉化或轉導細胞，和/或以其他方式改變（例如，藉由同源重組和基因激活或重組細胞與非重組細胞的融合）以引起宿主細胞表現所需的重組多肽。用於遺傳工程細胞和/或細胞系以表現目的多肽的方法和載體係熟悉該項技術者熟知的；例如，各種技術在Current Protocols in Molecular Biology [分子生物學現代方法]，Ausubel等人編輯（Wiley & Sons [約翰威立父子公司], 紐約, 1990，和季度更新）；Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊]（Cold Spring Laboratory Press [冷泉實驗室出版社], 1989）；Kaufman, R. J.，Large Scale Mammalian Cell Culture [大規模哺乳動物細胞培養], 1990, 第15-69頁。
宿主細胞可以是任何原核細胞（例如大腸桿菌）或真核細胞（例如酵母、昆蟲或動物細胞（例如CHO細胞））。可經由常規轉化或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。
在一個實施方式中，該細胞係宿主細胞。宿主細胞當在適當條件下培養時表現目的蛋白，該目的蛋白隨後可以自培養基收集（若宿主細胞將其分泌至培養基中）或直接由產生它的宿主細胞收集（若其並非分泌的）。適當宿主細胞的選擇將取決於多種因素，如所需表現水平、活性所需要或必需的多肽修飾（如糖基化或磷酸化）和折疊成生物活性分子的容易性。
「培養」（「culture」或「culturing」）係指細胞在多細胞生物體或組織外部的生長和繁殖。哺乳動物細胞的合適培養條件係本領域已知的。細胞培養基和組織培養基可互換地用於指在體外細胞培養期間適合宿主細胞生長的培養基。典型地，細胞培養基含有緩衝液、鹽、能源、胺基酸、維生素和痕量必需元素。可以使用能夠支持適當宿主細胞在培養中生長的任何培養基。可以將細胞培養基進一步補充其他組分以最大化特定培養的宿主細胞中的細胞生長、細胞活力和/或重組蛋白生產，該細胞培養基係可商購的，並且包括RPMI-1640培養基、RPMI-1641培養基、杜爾貝科改良伊格爾培養基（DMEM）、伊格爾最低必需培養基、F-12K培養基、哈姆F12培養基、伊思考夫改良的杜爾貝科培養基、麥考伊5A培養基、Leibovitz L-15培養基和無血清培養基如EX-CELL™300系列等，該培養基可以從美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection）或SAFC生物科學公司（SAFC Biosciences）和其他供應商處獲得。細胞培養基可以是無血清、無蛋白、無生長因子和/或無蛋白腖的培養基。還可以藉由添加營養來富集細胞培養物，並以高於其通常的、推薦的濃度使用。
在培養過程中可以使用各種培養基配方，例如，以促進從一個階段（例如，生長階段或生長期）過渡到另一階段（例如，生產階段或生產期）和/或優化細胞培養期間的條件（例如在灌注培養過程中提供的濃縮培養基）。生長培養基配製物可用於促進細胞生長並使蛋白表現最小化。生產培養基配製物可用於促進目的蛋白的生產和細胞的維持，同時使新細胞的生長減至最少。飼料培養基，典型地是包含在細胞培養物生產期過程中消耗的較高濃度組分（如營養素和胺基酸）的培養基，可用於補充和維持活性培養物，特別是分批加料、半灌注或灌注模式的培養物。這種濃縮的飼料培養基可以包含大多數細胞培養基組分，例如，其正常量的約5×、6×、7×、8×、9×、10×、12×、14×、16×、20×、30×、50×、100×、200×、400×、600×、800×或甚至約1000×。
生長期可以在比生產期更高的溫度下進行。例如，生長期可以在約35°C至約38°C的第一溫度下進行，並且生產期可以在約29°C至約37°C，視需要約30°C至約36°C或約30°C至約34°C的第二溫度下進行。此外，可以在溫度變化之前和/或之後的同時添加蛋白產生的化學誘導劑，如像咖啡因、丁酸酯和六亞甲基雙乙醯胺（HMBA）。如果在溫度變化後添加誘導劑，則可以在溫度變化後1小時至5天，視需要在溫度變化後1至2天添加誘導劑。
宿主細胞可以懸浮或黏附形式培養，附著在固體基質上。可以在帶有或不帶有微載體的流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶、搖瓶或攪拌式生物反應器中建立細胞培養
細胞培養能以分批、分批加料、連續、半連續或灌注模式進行。哺乳動物細胞（如CHO細胞）可以在生物反應器中以小於100 ml至小於1000 ml的小規模培養。可替代地，可以使用含有1000 ml至20,000升以上培養基的大規模生物反應器。大規模細胞培養，如用於蛋白治療劑的臨床和/或商業規模生物製造的細胞培養，可維持數週甚至數月，在此期間細胞產生所需的一種或多種蛋白。
然後可以從細胞培養基中收穫所產生的表現的重組蛋白。從懸浮細胞中收穫蛋白的方法係本領域已知的，並且包括但不限於酸沈澱、加速沈降（如絮凝）、使用重力分離、離心、聲波分離、過濾（包括使用超濾器、微濾器、切向流過濾器、替代切向流過濾器、深度過濾器和沖積過濾器的膜過濾）。藉由本領域已知的氧化還原折疊過程的方法，從細胞質中的包涵體中回收由原核生物表現的重組蛋白。
然後，可以使用一個或多個單元操作從任何雜質，如剩餘的細胞培養基、細胞提取物、不需要的組分、宿主細胞蛋白、表現不正確的蛋白等中純化或部分純化收穫的蛋白。術語「單元操作」係本領域的術語，並且意指可以在從液體培養基中純化的重組蛋白的過程中進行的功能步驟。例如，一個操作單元可以涉及過濾（例如，從包括重組蛋白的流體中去除污染物細菌、酵母、病毒或分枝桿菌和/或顆粒物質）、捕獲、表位標籤去除、純化、貯存或儲存、精製、病毒滅活、調節包括重組蛋白的液體的離子濃度和/或pH、以及去除不需要的鹽。
例如，單元操作可包括，例如但不限於捕獲、純化、精製、病毒滅活、病毒過濾、和/或調節含有重組目的蛋白的濃度和配製物。單元操作還可以包括處理步驟之間的貯存或存儲步驟。可以將單一單元操作設計為在同一操作中完成多個目標，如捕獲和病毒滅活。
捕獲單元操作包括利用樹脂和/或含有與重組目的蛋白結合的試劑的膜進行捕獲層析，例如親和層析、尺寸排阻層析、離子交換層析、疏水相互作用層析（HIC）、固相金屬親和層析（IMAC）等。此類材料係本領域已知的並且可以是商購的。親和層析可以包括蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L結合捕獲機制等，例如，底物結合捕獲機制、抗體或抗體片段結合捕獲機制、適配子結合捕獲機制、和輔助因子結合捕獲機制。特別地，WO 2019118426中描述了使用蛋白L的雙特異性T細胞銜接子的連續上游製造過程。重組目的蛋白可以用聚組胺酸標籤標記隨後使用咪唑藉由IMAC純化，或者使用表位（諸如FLAG® ）標記隨後使用針對該表位的特異性抗體進行純化。
一個或多個捕獲單元操作包括病毒滅活和/或病毒過濾。為了確保患者安全，在製造蛋白治療劑時，病毒滅活和病毒過濾係純化過程的必要部分。可以從流出物流、洗脫液、池、貯存或儲存容器中獲得要進行病毒滅活和病毒過濾的流體。
包膜的病毒易受滅活方法（如熱滅活/巴氏消毒法、pH滅活、UV和γ射線照射、使用高強度廣譜白光、添加化學滅活劑、表面活性劑、和溶劑/洗滌劑處理）的影響，使它們不再感染細胞、複製和/或繁殖。一種用於實現病毒滅活的方法係在低pH或其他溶液條件下孵育以實現病毒滅活。在低pH病毒滅活之後，可以進行中和單元操作，該操作將重新調節經過病毒滅活的溶液至更符合後續單元操作要求的pH值。隨後還可以進行過濾，如深層過濾，以除去任何產生的渾濁或沈澱。
「精製」在本文用於指進行一個或多個層析步驟以從包括接近最終所需純度的重組蛋白的流體中去除殘留的污染物和雜質，如DNA、宿主細胞蛋白；產物特異性雜質、變體產物和聚集體和病毒吸附。例如，可以藉由使包括重組蛋白的流體流過一種或多種層析柱或一種或多種膜吸收劑，使其選擇性結合目標重組蛋白或存在於包括重組蛋白的流體中的污染物或雜質，以結合和洗脫模式進行精製。在此實例中，一種或多種層析柱或膜吸收劑的洗脫液/濾液包括重組蛋白。
精製層析單元操作使用的樹脂和/或膜含有能以「流通模式」（其中目的蛋白包含在洗脫液中並且污染物和雜質結合到層析介質上）或「結合並洗脫模式」使用的試劑，其中目的蛋白結合到層析介質上並且在污染物和雜質流過層析介質或從層析介質上洗掉後洗脫。此類層析方法的實例包括離子交換層析（IEX），如陰離子交換層析（AEX）和陽離子交換層析（CEX）；疏水相互作用層析（HIC）；混合模式或多模式層析（MM）、羥基磷灰石層析（HA）；反相層析和凝膠過濾。
可以測量關鍵屬性和性能參數，以更好地指導有關製造期間每個步驟性能的決策。該等關鍵屬性和參數可以即時監測、近即時監測和/或事後監測。可以測量主要的關鍵參數，如消耗的培養基組分（如葡萄糖）、累積的代謝副產物（如乳酸和氨）的水平、和與細胞維持和存活相關的參數，如溶解氧含量。關鍵屬性，如比生產率、活細胞密度、pH、莫耳滲透壓濃度、外觀、顏色、聚集、產率百分比和滴定度，可在過程中和過程後進行監測。可以使用已知技術和可商購的設備進行監測和測量。
本發明消除了對濃縮的、配製的藥物物質和藥物產品的多餘釋放採樣的需要，並允許對兩者共有屬性的測定僅進行一次，如在藥物產品填充/精加工階段，在此階段可以將它們與其他藥物產品屬性測試組合。
儘管在本申請中使用的術語係本領域中的標準術語，但是本文提供了某些術語的定義以確保申請專利範圍的含義的清楚性和確定性。單位、前綴和符號可能會用它們的國際單位制（SI）接受形式表示。本文列舉的數字範圍包括定義範圍的數字，並且包括並支持所定義範圍內的每個整數。除非另外指示，否則本文所述的方法及技術可根據本領域中熟知的常規方法且如貫穿本說明書所引用及論述的各種通用及更特定參考文獻中所描述來進行。參見，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], Cold Spring Harbor, N.Y.[紐約州冷泉港] (2001) 和 Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology [分子生物學實驗指南], Greene Publishing Associates [格林出版公司] (1992)，以及 Harlow 和 Lane Antibodies: A Laboratory Manual[抗體：實驗室手冊] Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], Cold Spring Harbor, N.Y [紐約州冷泉港] (1990)。在本申請中所引用的所有文件或文件的部分，包括但不局限於專利、專利申請、論文、書籍、和專著，都藉由引用清楚地併入本文。在本發明的一個實施方式中描述的內容可以與本發明的其他實施方式組合。
本發明在範圍上不受本文所述的特定實施方式的限制，該等特定實施方式旨在作為本發明各個方面的單個說明，並且功能上等效的方法和組分也在本發明的範圍內。實際上，除了本文中顯示和描述的那些之外，根據前述描述和附圖，本發明的各種修改對於熟悉該項技術者將變得顯而易見。這類修改旨在包含在所附申請專利範圍的範圍內。實例 實例 1 連接 DS-DP 操作
進行50 L生物反應器運行以產生重組單株抗體，並藉由一系列純化單元操作進行正向處理，直到獲得病毒過濾池。UFDF使用的是Akta flux 6橇（新澤西皮斯卡塔韋的通用電氣醫療集團（GE Healthcare，Piscataway，NJ）。使用Millipore Pellicon盒式貯存器來容納30kD UFDF膜，該膜的總面積為1.14 m2 （麻塞諸塞州伯靈頓的密理博西格瑪公司（Millipore Sigma，Burlington，MA）。Opticap XL 600無菌高容量過濾器（麻塞諸塞州伯靈頓的密理博西格瑪公司）用作降低生物負載的過濾器。將最終藥物物質收集在Mobius單次使用混合袋（麻塞諸塞州伯靈頓的密理博西格瑪公司）中。
將病毒過濾池用作UFDF操作、添加聚山梨酯80（PS80）和最終0.2微米過濾的起始材料。在開始操作之前，將橇和其他與產品接觸的元件保持在0.2 N氫氧化鈉中過夜。用於滲濾的配製物緩衝液和最終的蛋白配製物的組成為272 mM脯胺酸、pH 4.1的10 mM乙酸鹽。在配製物緩衝液中製備1% PS80儲備液，並將其添加到最終UFDF沖洗緩衝液和滯留物槽中的最終蛋白池中，以使最終DS中的PS80重量/體積達到0.01%。
在開始UFDF操作之前，先進行DIW沖洗，然後檢查滲透側流體的pH值以確保將氫氧化物被沖掉。用DIW沖洗後，測量歸一化水滲透率（NWP）以確保過濾器符合通過標準。將病毒過濾池裝入UFDF橇中，並且以70 mg/mL濃度為目標進行超濾1（UF1）操作。用等於10 滲濾體積（DV）的配製物緩衝液以70 mg/mL進行滲濾（DF）。DF後，將滲濾池重新循環大約10分鐘，並使用Solo VPE從滯留物槽中測試樣本的蛋白濃度。在UF2操作中，使用蛋白濃度和數量來計算實現蛋白池濃度提高至175 mg/mL所需的體積減少量。在濃縮期間，加料壓力、TMP和通量以將TMP維持在約15 psi的方式進行控制。在獲得175 mg/mL的UF2目標後，計算最終DS濃度為145 mg/mL時要達到的目標體積。添加所需量的沖洗緩衝液以達到140 mg/mL的目標最終濃度
計算在滯留槽中達到0.01% w/v PS80所需的PS80儲備液的量，並將其直接添加到滯留槽中的蛋白溶液中。出於此目的，使用在配製物緩衝液中製備的1% PS 80儲備溶液。
製備了配製物緩衝液中的0.01%重量/體積的PS80儲備溶液，並以約80 L/m2 沖洗降低生物負載的過濾器（Opticap XL 600），以用PS80飽和了過濾器上的電荷位。過濾器的出口與Y相連，方式為將Y的一個臂連接到沖洗緩衝袋以收集沖洗緩衝液，並將另一臂與Mobius袋連接以收集最終DS。藉由將空氣泵入過濾器，去除了SHC過濾器外殼中剩餘的痕量緩衝液。從過濾器中去除剩餘的緩衝液後，將沖洗緩衝液收集袋夾緊，並開始在產品收集袋中進行DS過濾。過濾之前，直接從滯留物槽獲得最終DS濃度樣本，並獲得三個濃度測量值。
將兩個病毒過濾池（子批次）組合在一起，以成為一個UFDF/DS/DP批次。DS和DP之間常見的產品品質測定僅進行一次測試。比較了藥物物質和藥物產品過程的品質目標產品特徵，均在規格範圍內。
然後使用0.2 µ降低生物負載的過濾器對UFDF/DS/DP批次進行過濾，然後收集到儲存袋中。將袋連接到Vanrx SA25單元（加拿大不列顛哥倫比亞省本拿比（Burnaby，British Columbia，Canada）），並且在填充/精加工藥物產品之前對原料藥物產品進行無菌過濾。實例 2 緩衝液清潔後 UFDF 膜循環
本實驗使用按比例縮小的單次使用穩定化纖維素基親水性膜對超濾-滲濾性能進行了評估，並在製造中的單次使用UFDF橇的平衡緩衝液清洗代表後重複使用了膜，以確定循環和加料條件對UFDF過程和產品品質性能的影響，其中使用了半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子加料流。
在處理之前，將包含半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子HLE BiTE® 的多模式陰離子（MMA）柱中的冷凍洗脫液池材料解凍。然後將洗脫液池材料負載到三個平衡的、穩定的、纖維素基的親水性膜上，Sartocon Slice 200 ECO（10 kD MWCO截留）（德國戈廷根的賽多利斯公司（Sartorius，Goettingen，Germany）），柱（A，B，C），膜面積為0.018 m2 ，加料壓力在20-36 psi範圍內，首次運行時負載71.4 g/m2 。將樣本濃縮（UF1）到0.5 g/L到4 g/L範圍內的中間目標，初始濃度目標參見表1，將樣本用10體積的配製物緩衝液、10 mM乙酸鹽、180 mM NaCl、在pH 5.0下進行滲濾。在池容器中回收樣本，然後進行系統追蹤（chases）以將池回收到足夠在回收容器中進行混合和採樣的體積。然後根據需要用配製物緩衝液將TFF池稀釋至1-2 g/L的目標濃度。
在第一循環後，將膜用平衡緩衝液、100 mM乙酸鹽、180 mM NaCl在pH 5.0下沖洗，並在每個膜上進行歸一化水滲透率（normalized water permeability）[NWP]測試以確定膜的一致性。歸一化水滲透率（NWP）係清潔後膜清潔度的確定。在標準壓力和溫度條件下測量乾淨水通過膜的通量。通過每個膜的乾淨水通量速率以每小時每個膜面積的升數來測量（L/m2 -h）。水通量除以跨膜壓力即為歸一化水滲透率或NWP（L/m2 -h-巴）。將NWP值與初始（預處理）水平進行比較，並可以分析其隨時間的趨勢。
將UFDF洗脫液收集為所有運行的原料池，並分析產品品質。在病毒濾液中評估產品品質屬性：使用尺寸排阻超高效液相層析（SE-UHPLC）確定高分子量（HMW）雜質，使用毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉（CE-SDS或r-CE）分析在還原條件下確定片段（Clips），並且使用陽離子交換高效液相層析（CEX-HPLC）確定電荷特徵、酸性和鹼性變體。
然後，對膜B和C進行兩個以上的循環，如表1所概述。
在高負載下，所有膜均受到挑戰，負載了71.4 g/m2 膜面積，而不是典型的55 g/m2 。運行1係在單一Sartocon膜（A）上進行的一個完整循環，而對該膜沒有進行任何另外的循環。運行2-4係在單一Sartocon膜（B）上進行的，沒有腐蝕性化學清洗，僅在循環之間進行緩衝液沖洗，每次運行在三天的時間段內連續進行一天，每天一個循環（運行之間暫停10到12個小時）。運行5-7係在單一Sartocon膜（C）上進行的，沒有腐蝕性化學清洗，僅在循環之間進行緩衝液沖洗，並且快速連續的、在循環之間沒有任何暫停的進行該運行。所有實驗均使用AKTA橫流UF/DF橇（伊利諾州芝加哥的通用電氣醫療集團（GE Healthcare，Chicago，Ill））進行。 [表1]：膜運行的實驗細節。
運行 編號 運行描述 實驗條件 初始 [UF1] 濃度目標（ mg/mL ）
1 低濃度（Low Con） A 單一膜並且僅進行一個循環，其中一旦收集了最終池就進行緩衝液沖洗。    1.95
2 高濃度（High Con） B 第一循環，其中一旦收集了最終池就進行緩衝液沖洗，其中不含腐蝕性化學清洗。    3.20
3 中心點1 其後一天進行第二循環（暫停10-12小時）。再次，一旦收集了最終池就進行緩衝液沖洗，其中不含腐蝕性清洗。 2.30
4 中心點2 其後一天進行第三循環（暫停10-12小時）。在收集最終池後，不進行沖洗或清洗。 2.30
5 多運行中心 點1 C 第一運行，其中一旦收集了最終池就進行緩衝液沖洗。 2.30
6 多運行中心點2 運行5完成後立即開始第二運行。一旦收集了最終池就進行緩衝液沖洗。 2.30
7 多運行中心點3 運行6完成後立即進行第三運行。收集最終池後不進行緩衝液沖洗或腐蝕性清洗。 2.30
圖2顯示了從多運行中心點1[運行5]開始的每次運行後Sartocon膜的NWP回收百分比值。還顯示了，在過程表徵期間在類似的膜上進行的20個循環後觀察到的最小NWP回收%。多運行中心點3[運行7]後NWP回收%高於最低回收%。此觀察結果表明，在三個循環之間，在運行之間僅進行緩衝液清洗就足以保持NWP回收%遠高於20個循環中觀察到的最小值。這進一步提供了數據，即使不進行任何類型的腐蝕性化學清洗[例如，不使用氫氧化鈉CIP]，膜也不會損失滲透性並且足以在僅進行緩衝液沖洗後再用於處理，至少持續三個循環。
表2匯總了所有進行的運行的負載和最終池的產品品質值（HMW%、片段%、酸性%、鹼性%）。所有運行的最終池HMW%，無論較高的負載和較高的初始濃度都是相當的。總體而言，如在該等實驗中建模的穩定化纖維素基親水性膜的產品品質性能滿足了臨床和商業過程的需求和規格。從過程性能的角度來看，用平衡緩衝液沖洗膜也足以進行另外的循環負載，直至71.4 g/m2 。 [表2]：所有運行的產品質量數據：HMW%、片段%、酸性%和鹼性%
HMW
運行描述 負載池 最終池
低濃度 2.88% 0.81%
高濃度 2.97% 0.86%
中心點1 3.00% 0.74%
中心點2 2.23% 0.25%
多運行中心點1‐3 3.15% 0.34%
片段 %
   負載池 最終池
低濃度 3.751 2.65
高濃度 2.314 2.808
中心點1 2.669 3.436
中心點2 4.747 3.047
多運行中心點1‐3 3.843 2.435
酸性
   負載池 最終池
低濃度 2.31% 2.50%
高濃度 2.40% 2.56%
中心點1 2.42% 2.56%
中心點2 2.33% 2.53%
多運行中心點1‐3 2.33% 2.50%
鹼性
   負載池 最終池
低濃度 17.57% 16.99%
高濃度 17.62% 17.14%
中心點1 17.59% 17.14%
中心點2 18.42% 17.42%
多運行中心點1‐3 17.71% 17.36%
實例 3 UFDF 的高膜負載和增加的滲濾體積
本實驗使用半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子分子加料流，使用再生纖維素膜評估了超濾-滲濾性能，該再生纖維素膜特別受到高膜負載和增加的滲濾體積量對產品品質性能的挑戰。
在處理之前，將包含半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子的多模式陰離子（MMA）層析柱的冷凍洗脫液池材料解凍。然後將洗脫液池材料負載到再生纖維素膜（Pellicon 3（10 kD MWCO截留）（麻塞諸塞州丹佛斯的EDM密理博公司（EDM Millipore，Danvers，MA））上，膜面積為0.0088 m2 。實驗條件總結在表3中。所有實驗均使用AKTA橫流UF/DF橇（伊利諾州芝加哥的通用電氣醫療集團（GE Healthcare，Chicago，Ill））進行。
將過濾器用100 mM乙酸鹽、180 mM NaCl、pH 5.0平衡。膜平衡後，將洗脫液池材料濃縮至所需的初始濃度，參見表3，加料流量為 ≥ 10 L/m2 。濃縮後，將池材料用10或13個滲濾體積的配製物緩衝液、10 mM麩胺酸、9%蔗糖、pH 4.2進行滲濾，參見表3。將產品回收到池容器中，然後進行系統追蹤，以將池回收到足夠的體積，以在回收容器中進行和採樣。然後用配製物緩衝液將TFF池稀釋至目標濃度。 [表3]：高負載和高滲濾體積的實驗細節（DV）
運行 編號 運行描述 負載（g/m2 ） 滲濾體積[DV] 初始[UF1]濃度 目標（mg/mL）
1 85 g/m2 _10DV 85 10 5.0
2 110 g/m2 _10DV 110 10 2.5
3 110 g/m2 _13DV 110 13 7.0
4 170 g/m2_13DV 170 13 8.5
與其他運行相比，運行4具有最高的MHW%，但低於可接受的品質目標 ＜ 5%，表4。 [表4]：所有運行的產品質量數據：HMW%、片段%、酸性%和鹼性%
HMW%
運行描述 負載池 最終池
85 g/m2 _10DV 1.8 0.6
110 g/m2 _10DV 3.3 0.5
110 g/m2 _13DV 3.3 1.7
170 g/m2 _13DV 3.7 2.1
片段 %
   負載池 最終池
85 g/m2 _10DV 1.12 1.03
110 g/m2 _10DV 1.99 2.46
110 g/m2 _13DV 1.87 1.95
170 g/m2 _13DV 1.70 1.4
酸性 %
   負載池 最終池
85 g/m2 _10DV 2.8 3.1
110 g/m2 _10DV 2.4 2.4
110 g/m2 _13DV 3.4 3.4
170 g/m2 _13DV 3.3 3.4
鹼性 %
   負載池 最終池
85 g/m2 _10DV 14.1 14.2
110 g/m2 _10DV 20.9 20.5
110 g/m2 _13DV 21.1 20.4
170 g/m2 _13DV 21.4 20.7
實例 4 配製的雙特異性 T 細胞銜接子的病毒過濾
本實驗證明了在配製物緩衝液中對半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子（HLE BiTE® ）進行了病毒過濾。
在恒定壓力下，使用過濾器系列中的親水性聚偏二氟乙烯（PVDF）中空纖維過濾器（PlavonaTM ，生物實驗公司（BioEx））和銅銨再生纖維素中空纖維過濾器（Planova 20N）、0.001 m2 病毒去除過濾器（伊利諾州葛籣維爾的旭化成生物處理公司（Asahi Kasei Bioprocesses，Glenville，Ill）），在配製物緩衝液（9%蔗糖，10 Mm麩胺酸，pH 4.2）中，以不同濃度對半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子針對過程和產品品質性能進行評估。過濾器系列包括壓力調節器，該壓力調節器連接到壓力儲存器，該壓力儲存器具有與病毒去除過濾器連接的閥。病毒去除過濾器可直接至連接到天平的收集容器。將過濾器系列連接到電腦進行數據收集，並連接到壓縮空氣源以進行壓力調節。
藉由測量預定時間間隔收集的濾液量[mL或L]，然後除以所使用的過濾器的有效過濾表面積來確定體積載量。根據暫態通量除以初始通量，然後從1中減去該值來確定通量衰減（通量衰減 = 1- 通量損失 = 1-[J/J0]）。初始通量-J0係緩衝液滲透率，因此通量衰減相對於-J0進行了歸一化，並以百分比表示。將病毒濾液收集為原料池用於所有運行，並分析產品品質。特別地，在病毒濾液中評估產品品質屬性：使用尺寸排阻超高效液相層析（SE-UHPLC）確定高分子量（HMW）雜質，使用毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉（CE-SDS或r-CE）分析在還原條件下確定片段，並且使用陽離子交換高效液相層析（CEX-HPLC）確定電荷特徵、酸性和鹼性變體。
使用等分試樣的加料材料（解凍的或新鮮的）進行實驗，並在表5中提供的運行1-6中每一個的條件下運行。加料材料為含有用10 mM麩胺酸、9%蔗糖、pH 4.2配製的雙特異性T細胞銜接子的純化的洗脫液池。 [表5]：配製物緩衝液基質的實驗運行細節
運行 過濾器 濃度（ g/L ） 加料描述 加料條件 過濾壓力（ PSI ）
1 20 N 3.12 高濃度 新鮮的，pH 4.2 17
2 BioEX 1.79 BioEx中心點 VF運行當天解凍，pH 4.2 49.5
3 20 N 1.79 中心點 VF運行當天解凍，pH 4.2 19
4 20 N 1.79 高容量 VF運行當天解凍，pH 4.2
5 20 N 1.79 延長貯存 將樣本在室溫下貯存36小時，pH 4.2
6 20 N 1.59 低濃度 調整pH至5.0
表6顯示了按加料條件分開的每個運行的水力性能。結果顯示為歸一化通量衰減（與緩衝液滲透率相比）隨體積載量（L/m2 ）的變化。 [表6]：配製物緩衝液基質-過濾總結結果
Planova 過濾器細節    溶液細節 載量（ L/m2 ） 通量衰減（ % ）
運行 類型 濃度（ g/L ）
1 20 N 3.12 36 73.3
2 BioEX 1.79 171 70.7
3 20 N 1.79 201 47.3
4 1.79 501 80
5 1.79 201 46.2
6 1.59 77 78
圖3顯示了不同加料條件對體積載量的影響。對於所有運行，除了高濃度和高pH運行外，加料條件（新鮮、延長貯存和高容量）對通量衰減均無影響。 產品品質
在較高濃度（運行1）和pH值增加（運行6）下，HMW增加，導致分別73%和78%的通量衰減。PVDF過濾器在200 L/m2 時的過濾性低於通量衰減更高的銅銨再生纖維素過濾器，參見圖4 A HMW%、4B 片段%、4C 鹼性%和4D 酸性%。
在第二個實驗中，在層析池緩衝液（100 mM乙酸鹽，180 mM氯化鈉，pH 5.0）中，配製了半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子，並針對過程和產品品質性能進行了評估。在過濾器系列中使用了0.001m2 （伊利諾州葛籣維爾的旭化成公司（Asahi，Glenville，Ill））的銅銨再生纖維素中空纖維病毒去除過濾器（PlavonaTM 20N）。使用等分試樣的加料材料、在如表7中提供的運行7-13中每一個的條件下進行實驗。 [表7]：層析池緩衝液基質的實驗細節
運行編號 濃度（ mg/mL ） 加料描述 加料條件（ pH ，電導率） 壓力（ psig ）
7 1.77 中心點 5，23 19
8 3.15 中等濃度，中心點 5，23 19
9 1.77 中心點，高電導率 5，28 19
10 1.77 低壓 5，28 14
11 6.82 高濃度，高pH 5.3，28 19
12 6.82 高濃度，低pH， 4.54，28 19
13 1.77 中壓 5，23 17
圖5顯示了層析緩衝液基質中濃度、pH和電導率的影響。在pH 5.0時，兩種濃度（1.77 g/L和3.15 g/L）的通量衰減都在13%以內（表8在pH 5.3時，濃度為6.82 g/L時，通量衰減最小（3%），而在pH 4.5下，通量衰減顯著（32%）。這可能歸因於聚集體的增加（ ＞ 20％，在低pH下，圖6A。在測試條件下，電導率對病毒過濾沒有影響。無論壓力（14、17或19 psi）如何，通量衰減最小（表8）。 [表8]：層析緩衝液基質的過濾結果
運行編號 濃度（ mg/mL ） 加料條件（ pH ，電導率） 載量 （ L/m2 ） 在 150 L/m2 處的通量衰減（ % ）
7 1.77 5，23 202 10
8 3.15 5，23 204 13
9 1.77 5，28 404 1
10 1.77 5，28 203 3
11 6.82 5.3，28 172 3
12 6.82 4.54，28 182 32
13 1.77 5，23 204 2
儘管與層析緩衝液中的運行相比，配製物緩衝液基質中的通量較差，但仍在可接受的使用範圍內。實例 5 在病毒過濾期間雙特異性 T 細胞銜接子的過程和產品品質性能
病毒過濾器通常在兩種模式中的一種下運行，第一種係恒定壓力模式，在這種模式下，藉由使用壓力調節器使進入的壓力保持恒定。在這種模式下，通量隨時間而下降，並且體積載量增加[L/m2 ]並以通量衰減與體積載量[L/m2 ]的關係繪製。在第二種恒定流量模式中，藉由使用泵以恒定流速推動加料負載使通量保持恒定。在這種模式下，壓力會隨時間而增加，同時體積載量增加[L/ m2 ]。通常將其以阻力[滲透率的倒數]與體積載量[L/m2 ]的關係繪製。
本實驗評估了在恒定壓力模式下正常流動過濾中的病毒過濾，並會擴展到在恒定流量模式下進行，以及在有和沒有各種預濾器的情況下，加料條件[pH、電導率和濃度]對病毒過濾器水力性能和產品品質屬性的影響，針對半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子（HLE BiTE® A）加料流。
已對Viresolve® Pro（VPro）（一種聚醚碸（PES）（3.1 cm2 細小病毒滯留過濾器）病毒過濾器）進行單獨測試，以及與以下四種過濾器組合測試：兩種表面改性預過濾器：Viresolve® Pro Shield（Shield）（3.1 cm2 ）和Viresolve® Pro Shield H（Shield H）（3.1 cm2 ），表面改性聚醚碸膜過濾器；以及兩個深層過濾器：Viresolve® Prefilter（VPF）（5cm2 ）（一種吸附式深層過濾器）和Millistak +® HC Pro X0SP（X0SP）（5cm2 /3.1cm2 ）（一種合成式深層過濾器，由雙層矽膠助濾劑和聚丙烯腈纖維組成），均來自密理博西格瑪公司（麻塞諸塞州伯靈頓）。
針對該等過濾器組合的過程和產品品質性能評估了半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子BiTE® A。
使用通過壓力調節器連接的壓縮空氣源進行實驗，該壓力調節器連接到具有閥的加壓加料容器，該閥連接到表面改性的膜預過濾器或深層過濾器，該過濾器又連接到病毒過濾器。作為對照，將加料容器閥直接連接到單獨病毒過濾器裝置上。該病毒過濾器可直接至連接到天平的收集容器。將過濾器系列連接到電腦進行數據收集，並連接到壓縮空氣源以進行壓力調節。
將病毒過濾器的加料側壓力設置為恒定的30 psi，並以預定的時間間隔測量濾液體積。在過濾器設置期間，病毒過濾器裝置和表面改性的膜預過濾器或深層過濾器裝置分別在30 psi下用水沖洗。然後連接病毒過濾器裝置和預過濾器或深層過濾器裝置，並在30 psi下進行緩衝液沖洗。每個病毒過濾器和預過濾器或深層過濾器裝置的平均水和緩衝液流速以及滲透率都被記錄，且在建議的限值之內。
藉由測量預定時間間隔收集的濾液量[mL或L]，然後除以所使用的過濾器的有效過濾表面積來確定體積載量（VPro裝置為3.1 cm2）。根據暫態通量除以初始通量，然後從1中減去該值來確定通量衰減（通量衰減 = 1- 通量損失 = 1-[J/J0]）。初始通量-J0係緩衝液滲透率，因此通量衰減相對於-J0進行了歸一化，並以百分比表示。將病毒濾液收集為原料池用於所有運行，並分析產品品質。特別地，在病毒濾液中評估產品品質屬性：使用尺寸排阻超高效液相層析（SE-UHPLC）確定高分子量（HMW）雜質，使用毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉（CE-SDS或r-CE）分析在還原條件下確定片段，並且使用陽離子交換高效液相層析（CEX-HPLC）確定電荷特徵、酸性和鹼性變體。
將加料材料（含有BiTE® A的純化的洗脫液池）在處理前解凍。解凍後，將加料材料的等分試樣調節至如表9中所描述的目標條件（pH、電導率、濃度）。表10中提供了運行1-16中每一個的條件。 [表9]：加料設計條件
處理流體 pH 電導率 （ mS/cm ） 濃度 （ g/L ） 緩衝液 組分
BiTE® A（中點pH，低濃度） 5 23 1.75 100 mM乙酸鈉，180 mM NaCl
BiTE® A（低pH，低濃度） 4.2 23 1.75 100 mM乙酸鈉，180 mM NaCl
BiTE® A（高pH，低濃度） 6 23 1.75 100 mM乙酸鈉，180 mM NaCl
BiTE® A（高 濃度，低pH） 4.2 28 7 100 mM乙酸鈉，180 mM NaCl
BiTE® A（高 濃度，高pH） 6 28 7 100 mM乙酸鈉，180 mM NaCl
[表10]：實驗運行條件基於表10
運行編號 名稱 [ 預過濾器 + 病毒過濾器組合 ] pH 電導率 （ mS/cm ） 濃度 （ g/L ）
1 單獨VPro（中點pH，低濃度） 5.0 23 1.75
2 VPro + Shield（中點pH，低濃度） 5.0 23 1.75
3 VPro + Shield H（中點pH，低濃度） 5.0 23 1.75
4 單獨VPro（低pH，低濃度） 4.2 23 1.75
5 VPro + Shield（低pH，低濃度） 4.2 23 1.75
6 VPro + VPF（中點pH，低濃度） 5.0 23 1.75
7 單獨VPro（高pH，低濃度） 6.0 23 1.75
8 VPro + Shield H（高pH，低濃度） 6.0 23 1.75
9 VPro + X0SP（中點pH，低濃度） 5.0 23 1.75
10 VPro + X0SP（低pH，低濃度） 4.2 23 1.75
11 VPro + X0SP（低pH，高濃度） 4.2 23 7
12 VPro + Shield（低pH，高濃度） 4.2 28 7
13 VPro + Shield（高pH，高濃度） 6.0 28 7
14 VPro + Shield H（低pH，高濃度） 4.2 28 7
15 VPro + Shield H（高pH，高濃度） 6.0 28 7
16 VPro + X0SP（高pH，高濃度） 6.0 28 7
圖7-9顯示了按加料條件分開的每個運行的水力性能。結果顯示為歸一化通量衰減（與緩衝液滲透率相比）隨體積載量（L/m2 ）的變化。表11和圖7-9給出了過濾結果的總結。表12給出了產品品質屬性HMW%（SEC）、片段%（rCE）和酸性和鹼性電荷特徵（CEX）的總結。 [表11]：所有BiTE® A運行的體積載量數據
運行 運行 / 條件 載量（ L/m2 ） 通量衰減 %
1 VPro（1.75g/L，pH 5，23 mS/cm） 248.7 40.0
2 Shield + VPro（1.75g/L，pH 5，23 mS/cm） 519.4 23.7
3 Shield H + VPro（1.75g/L，pH 5，23 mS/cm） 441.3 27.7
4 VPro（1.75g/L，pH 4.2，23 mS/cm） 268.7 80.0
5 Shield + VPro（1.75g/L，pH 4.2，23 mS/cm） 484.5 79.3
6 VPF + VPro（1.75g/L，pH 5，23 mS/cm） 252.3 10.8
7 VPro（1.75g/L，pH 6，23 mS/cm） 195.0 21.8
8 Shield H + VPro（1.75g/L，pH 6，23 mS/cm） 258.7 19.5
9 X0SP + VPro（1.75 g/L，pH 5，23 mS/cm） 242.3 7.4
10 X0SP + VPro（1.75g/L，pH 4.2，23 mS/cm） 311.9 13.4
11 X0SP + VPro（7 g/L，pH 4.2，23 mS/cm） 67.7 85.5
12 Shield + VPro（7 g/L，pH 4.2，23 mS/cm） 58.7 87.9
13 Shield + VPro（7 g/L，pH 6，28 mS/cm） 50.6 95.9
14 Shield H+ VPro（7 g/L，pH 4.2，28 mS/cm） 58.1 87.8
15 Shield H+ VPro（7 g/L，pH 6，28 mS/cm） 55.5 95.9
16 X0SP + VPro（7 g/L，pH 6，28 mS/cm） 69.4 92.7
產品品質結果： [表12]. BiTE® A的產品品質[SEC、CEX和rCE測定]
樣本條件 SEC HMW %    rCE （片段%）    CEX（酸性）    CEX（鹼性）
  
(1) VPro（pH 5，1.75g/L，23 mS/cm） 2.93 2 3.30 18.5
(2) Shield + VPro（1.75g/L，pH 5，23 mS/cm） 2.53 2.2 3.30 18.6
(3) Shield H + VPro（1.75g/L，pH 5，23 mS/cm） 2.87 2.2 3.30 18.7
(4) VPro（pH 1.75g/L，4.2，23 mS/cm） 3.09 2.2 3.30 18.8
(5) Shield + VPro（pH 1.75g/L，4.2，23 mS/cm） 2.85 2.4 3.30 18.8
(6) VPF + VPro（1.75g/L，pH 5，23 mS/cm） 2.37 3 3.20 18.2
(7) VPro（1.75g/L，pH 6，23 mS/cm） 2.97 2.2 3.40 18.5
(8) Shield H + VPro（1.75g/L，pH 6，23 mS/cm） 2.82 2.3 3.30 18
(9) X0SP + VPro（1.75g/L，pH 5，23 mS/cm） 0.92 2.4 3.30 17.9
(10) X0SP + VPro（pH 1.75g/L，4.2，23 mS/cm） 2.47 3.4 3.50 19.3
(11) X0SP + VPro（7 g/L，pH 4.2，23 mS/cm） 3.31 3.3 3.70 17.8
(12) Shield + VPro（7 g/L，pH 4.2，23 mS/cm） 4.03 2.9 3.8 18.3
(13) Shield + VPro（7 g/L，pH 6，28 mS/cm） 2.88 3.7 4.6 16.4
(14) Shield H + VPro（7 g/L，pH 4.2，28 mS/cm） 4.54 2.2 3.6 18.3
(15) Shield H + VPro（7 g/L，pH 6，28 mS/cm） 2.83 2.8 4.3 16.2
(16) X0SP + VPro（7 g/L，pH 6，28 mS/cm） 0.70 2.1 4.7 15.3
BiTE ® A 的 VPro 負載 PQ
(A) 1.75 g/L，pH 5，23 mS/cm， 2.96 2.4 4.1 16.7
(B) 7 g/L，pH 4.2，23 mS/cm 3.84 2.6 4.1 17.1
(C) 7 g/L，pH 4.2，28 mS/cm 4.40 3.2 4.1 17.0
(D) 7 g/L，pH 6，28 mS/cm 2.92 2.6 4.8 15.9
結果
1) BiTE® A的中點pH、低濃度、和低電導率（pH 5、電導率 23 mS/cm、1.75 g/L） 水力性能
對於BiTE® A（pH 5，電導率 23 mS/cm，1.75 g/L）運行1-3、6和9（表10），在中點pH、低濃度和低電導率條件下對單獨的病毒過濾器以及與表面改性的膜預過濾器和深層過濾器（Shield、Shield H、VPF和X0SP）組合的病毒過濾器進行了測試。與深層過濾器（VPF或X0SP）組合的病毒過濾器在通量衰減約10%時達到穩態。與表面改性膜過濾器（Shield或Shield H）組合的病毒過濾器顯示出更多的初始污染，但在通量衰減約25%-30%時也達到了穩態。無表面改性的膜預過濾器或深層過濾器的單獨的病毒過濾器具有250 L/m2 的載量，並且觀察到通量衰減為40%。參見表11（運行1-3、6和9），圖7。 產品品質
在測試的組合中，與深層過濾器（X0SP）組合的病毒過濾器對產品品質的影響最大，將聚集體水平（HMW%）降低至0.9%。參見表12（運行1-3、6和9），圖10A、10C、10E、10G、負載品質，表12（行（A））。
2) 低pH、低濃度、低電導率條件（pH 4.2，23 mS/cm，1.75 g/L） 水力性能
在低pH、低濃度和低電導率條件下（pH 4.2、23 mS/cm，1.75 g/L），測試單獨的病毒過濾器或與深層過濾器（X0SP）和表面改性的預過濾器（Shield）組合的病毒過濾器（表10，運行4、5和10）。低pH條件對病毒過濾器和深層過濾器的組合影響不大，在300 L/m2時通量衰減降至約15%，並顯示出輕微的污染。單獨的病毒過濾器和與表面改性的預過濾器組合的病毒過濾器都經歷了80%的通量衰減，並在低pH條件下顯示出顯著的污染。參見表11（運行4、5和10），圖8。 產品品質
由於具有更好的聚集體去除能力，與單獨的病毒過濾器或與表面改性的預過濾器組合的病毒過濾器（分別具有80%的通量衰減）相比，病毒過濾器與深層過濾器組合的通量衰減僅為15%。各種組合的片段和電荷特徵相似，參見表12（運行4、5和10），圖10A、10C、10E和10G。
3) 高pH、低濃度、低電導率（1.75g/L，pH 6，23 mS/cm） 水力性能
在低濃度、高pH、低電導率條件下（1.75 g/L，pH 6，23 mS/cm）測試了單獨的病毒過濾器或與表面改性的預過濾器（Shield H）組合的病毒過濾器，表10（運行7和8）。單獨的病毒過濾器或與表面改性的預過濾器組合的病毒過濾器都具有約為20%的通量衰減。 產品品質
與表面改性的預過濾器組合的病毒過濾器在去除聚集體方面沒有比單獨的病毒過濾器更好。兩種組合的電荷特徵和片段均相似。參見表12(運行7和8),圖10A、10C、10E、10G。
4) 低pH、高電導率、高濃度（7 g/L，pH 4.2，23 mS/cm） 水力性能
在低pH和高濃度條件下（7 g/L，pH 4.2，23 mS/cm）測試了與深層過濾器（X0SP）和兩個表面改性的預過濾器（Shield和Shield H）組合的病毒過濾器，參見表10（運行11、12和14）。所有這三種組合的通量衰減都超過80%，參見表11（運行11、12和14），圖8。 產品品質
沒有一種組合能夠更有效地去除在該等條件下產生的聚集體的增加，在這三種中，病毒過濾器和預過濾器的組合在去除聚集體方面係最好的，參見表12（運行11、12和14）。在三種預過濾器條件下，電荷特徵和片段相似，參見表12（運行11、12和14），圖10B、10D和10F，表12（行（B）和（D））。
5) 高pH、高電導率、高濃度（7 g/L，pH 6，28 mS/cm） 水力性能
在高pH、高電導率和濃度條件下（7 g/L，pH 6，28 mS/cm）測試了與合成式深層過濾器（X0SP）和兩個表面改性的預過濾器（Shield和Shield H）組合的病毒過濾器，參見表10（運行13、15和16）。所有這三種組合的通量衰減都超過90%，參見表11，圖9，運行13、15和16。 產品品質
病毒過濾器和合成式深層過濾器的組合將聚集體水平降低到顯著低的水平，即0.07%，將聚集體水平降低到非常低的水平，即0.07%，參見表12（運行13、15和16），圖10B、10D、10E、10H、表12（行（C））。
觀察到，在中點pH 5.0和低電導率（pH 5，23 mS/cm，聚集體水平3.8%）下7 g/L濃縮的加料被滴定到pH 6.0，和高電導率（28 mS/cm）時，與滴定至低pH 4.2、高和高電導率（28 mS/cm）相比，聚集體的水平更低。在pH 6.0時，負載聚集體水平為2.92%，而在低pH（pH 4.2）條件下為4.4%。可能存在最大閾值聚集體水平，與深層過濾器（X0SP）組合的病毒過濾器可從該閾值降低，這可能是在高pH值時過濾器仍可降低聚集體水平的原因，儘管通量仍然很高。但是在低pH值時，它超出了理論上的最高水平。實例 6 病毒過濾比較雙特異性 T 細胞銜接子和單株抗體
使用病毒過濾器和深層過濾器的組合，針對過程和產品品質性能比較了半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子BiTE® A、和單株抗體（Mab A）。對於BiTE® A和Mab A，病毒過濾器係Viresolve® Pro（VPro），聚醚碸（PES）（3.1 cm2 ）細小病毒滯留過濾器，將其與吸收式深層過濾器Viresolve® 預過濾器，（VPF）（5cm2 ）組合進行了測試，所有均來自密理博西格瑪公司（麻塞諸塞州伯靈頓）。
還使用VPro病毒過濾器和合成式深層過濾器Millistak+® HC Pro X0SP（X0SP）（5cm2 /3.1cm2 ）的組合測試了BiTE® A，兩者均來自密理博西格瑪公司（麻塞諸塞州伯靈頓）。
BiTE® A的負載濃度為低濃度（1.75 g/L），中點pH 5.0和中點電導率23 mS/cm，參見實例5（運行6和9）。對於Mab A，將含有Mab A的洗脫液池調整至中點pH 6.7，電導率20mS/cm，和負載濃度為12.4 g/L。 水力性能
對於Mab A，病毒過濾器和吸收式深層過濾器的組合能夠達到 ＞ 1000 L/m2 ，其中通量衰減大約為約40%（4小時的處理時間），而BiTE® A（與病毒過濾器/預過濾器組合）能夠達到 ＞ 250 L/m2 ，但通量衰減大約為約10%。由於加料的限制，無法獲得BiTE® A的更多數據。圖11顯示了pH和加料流濃度的歸一化通量衰減與體積載量（L/m2 ）的關係。在低濃度和中至高pH[5或更高]，BiTE A（甚至在實例7中為BiTE B）下，使用VPF或合成式預過濾器時獲得的體積載量類似於抗體。 產品品質
對於Mab A，負載池和病毒濾液池的樣本顯示HMW%實際上沒有差異。對於BiTE® A，病毒過濾器和合成式深層過濾器的組合降低了病毒過濾器池中的聚集體水平（HMW%），參見表12（運行9和行（A））。
使用VPro病毒過濾器和合成式深層過濾器（X0SP）的組合，還對BiTE® A進行了更高的負載濃度、pH和電導率（7 g/L，pH，6.0和28 mS/cm）的測試，如實例5（運行16）中所描述。圖11顯示了高pH和高加料流濃度的歸一化通量衰減與體積載量（L/m2 ）的關係。對於Mab A，負載池和病毒濾液池顯示HMW%實際上沒有差異。對於更高的濃度和pH BiTE® A，病毒過濾器與合成式深層過濾器的組合能夠顯著降低病毒濾液池中的聚集體水平，參見表12（運行16和行（D）），圖10A。
與在高濃度BiTE® A（7 g/L）、高pH（6.0）和電導率（28 mS/cm）下（具有較低的體積載量和顯著的通量衰減）相比，在中點pH（6.7）和電導率（20 mS/cm）下更容易過濾包含Mab A（12.7 g/L）的加料流，從而實現相對較高的體積載量以及最小通量衰減，參見表11（運行13、15和16）。可能是在高濃度下，BiTE® A的聚集體含量與Mab A有所不同，後者在過濾前和過濾後池中的聚集體（%HMW）含量沒有變化。對於BiTE® A，預過濾器去除了一些聚集體，但可能殘留一些更高形式的聚集體，這可能是導致過濾性低的原因。
低加料濃度BiTE® A和Mab A的過濾性相似，參見圖11。然而，即使加料濃度低，預過濾器也能去除一些與BiTE® A相關的聚集體，並且殘留的聚集體的含量可能使得BiTE® A的過濾性相對較高，並且在較小通量衰減（10%）下實現了高體積載量[ ＞250 L/m2 ]，參見圖10A和表12（運行9）。對於BiTE® ，合成式深層過濾器對從負載中去除聚集物非常敏感，在濾液池中為2.96%（參見表12，行（A））至0.92%（參見表12，運行9），而吸收式深層過濾器在相同條件下降低至2.37%（參見表12，運行6）。吸收式深層過濾器和合成式深層過濾器之間的總體差異在於，一個係合成式，在該等條件下，該合成式過濾器可能更適合去除BiTEs® 形成的聚集體類型。實例 7 BiTE ® B 的病毒過濾性能
本實驗評估了在恒定壓力模式下正常流動過濾中的病毒過濾，以及在有和沒有各種預濾器的情況下，加料條件[pH、電導率和濃度]對病毒過濾器水力性能和產品品質屬性的影響，針對半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子（HLE BiTE® B）分子加料流，如實例6中所描述。
如實例6中所描述，測試單獨的Viresolve® Pro（VPro）、聚醚碸（PES）（3.2 cm2 ）細小病毒滯留病毒過濾器，以及與以下的組合：表面改性的聚醚碸膜預過濾器Viresolve® Pro Shield H（Shield H）（3.2 cm2 ）；以及兩個深層過濾器，一個吸附式深層過濾器Viresolve® 預過濾器（VPF）（5cm2 ）和一個合成式深層過濾器Millistak+® HC Pro X0SP（X0SP，由雙層矽膠纖維和聚丙烯腈纖維組成）（5cm2 ），均來自密理博西格瑪公司（麻塞諸塞州伯靈頓）。過濾病毒後，針對產品品質和性能評估BiTE® B。實驗中使用的加料條件示於表13中，且基於加料條件的運行條件提供於表14中。 [表13] 加料設計條件
處理流體 pH 電導率 （ mS/cm ） 濃度 （ g/L ） 緩衝液 組分
BiTE® B（中點pH） 5.9 31.36 1.81 100 mM MES/MES-鈉、290 mM NaCl
BiTE® B （高 電導率） 5.9 45 1.81 100 mM MES/MES-鈉、290 mM NaCl
BiTE® B（低pH） 4.2 31.36 1.81 100 mM MES/MES-鈉、290 mM NaCl
[表14] 實驗運行條件
運行編號 過濾器組合 pH 電導率 （mS/cm） 濃度 （g/L）
17 單獨VPro 5.9 31.36 1.81
18 Shield H + VPro 5.9 31.36 1.81
19 VPF + VPro 5.9 31.36 1.81
20 X0SP + VPro 5.9 31.36 1.81
21 Shield H + VPro 5.9 45 1.81
22 X0SP + VPro 5.9 45 1.81
23 Shield H + VPro 4.2 31.36 1.81
24 X0SP + VPro 4.2 31.36 1.81
僅針對病毒濾液池中的高分子量聚集體獲得BiTE® B的產品品質特徵，表16。對於中點pH和低電導率條件（pH 5.9，1.81 g/L，31.36 mS/cm）（表14，運行17-20），與病毒過濾器和吸收式深層過濾器（VPF）或表面改性的預過濾器（Shield H）的組合相比，病毒過濾器與合成式深層過濾器（X0SP）的組合去除了更高百分比的聚集體（表15，運行17-20）。病毒過濾器與任一個預過濾器的組合都不會導致顯著的通量衰減（參見圖13，表15（運行17-20））。
對於低pH、低電導率條件（1.81 g/L，pH 4.2，31.36 mS/cm）（運行23、24），與病毒過濾器和表面改性的預過濾器的組合的80%通量衰減相比，病毒過濾器和合成式深層過濾器的組合具有20%的通量衰減（參見圖14，表15，運行23-24）。從產品品質的角度來看，與合成式深層過濾器組合的病毒過濾器（1.6%）（參見表16，運行24）比與表面改性的預過濾器組合的病毒過濾器（2.1%）（表16，運行23-24）在去除高分子量聚集體方面稍好，參見圖15。
對於高pH、高電導率條件（1.81 g/L，pH 5.9，45 mS/cm）（表14，運行21-22），與合成式深層過濾器或表面改性的預過濾器組合的病毒過濾器具有非常低的通量衰減，分別為3.7%和5.2%（參見圖14，表15（運行21-22）），但是從產品品質的角度來看，病毒過濾器與合成式預過濾器的組合在去除高分子量聚集體方面的效果非常好，最終值為0.3%，而病毒過濾器與表面改性的預過濾器的組合為1.8%，效果不是很好（參見表16（運行21-22），圖15）。在中點pH、低電導率條件下，較高的電導率似乎並未顯著改變水力性能和聚集體去除性能（表16，運行20與運行22相比）。 [表15]顯示了體積載量和通量衰減%的總結
運行 條件 載量（ L/m2 ） 通量衰減 %
17 單獨VPro（1.81 g/L，pH 5.9，31.36 mS/cm） 323.0 20.9
18 VPro + Shield H（1.81 g/L，pH 5.9，31.36 mS/cm） 319.8 6.9
19 VPro + VPF（1.81 g/L，pH 5.9，31.36 mS/cm） 313.4 9.1
20 VPro + X0SP（1.81 g/L，pH 5.9，31.36 mS/cm） 315.0 6.3
21 VPro + Shield H（1.81 g/L，pH 5.9，45 mS/cm） 109.7 5.2
22 VPro + X0SP（1.81 g/L，pH 5.9，45 mS/cm） 316.2 3.7
23 VPro + Shield H（1.81 g/L，pH 4.2，31.36 mS/cm） 196.1 82.6
24 VPro + X0SP（1.81 g/L，pH 4.2，31.36 mS/cm） 311.0 19.8
[表16]：產品品質結果
運行編號 條件類型 SE-HPLC HMW % SE-HPLC MAIN %
17 單獨VPro（1.81 g/L，pH 5.9，31.36 mS/cm） 1.9 98.1
18 VPro + Shield H（1.81 g/L，pH 5.9，31.36 mS/cm） 1.9 98.1
19 VPro + VPF（1.81 g/L，pH 5.9，31.36 mS/cm） 1.3 98.7
20 VPro + X0SP（1.81 g/L，pH 5.9，31.36 mS/cm） 0.5 99.5
21 VPro + Shield H（1.81 g/L，pH 5.9，45 mS/cm） 1.8 98.2
22 VPro + X0SP（1.81 g/L，pH 5.9，45 mS/cm） 0.3 99.7
23 VPro + Shield H（1.81 g/L，pH 4.2，31.36 mS/cm） 2.1 97.9
24 VPro + X0SP（1.81 g/L，pH 4.2，31.36 mS/cm） 1.6 98.4
對於BiTE B，在中點pH條件下，單獨病毒過濾器能夠在相對較低的通量衰減下提供良好的體積載量，添加預過濾器可以降低通量衰減。然而，合成式預過濾器可顯著減少聚集體。在中點pH和高電導率下，表面改性和合成式深層預濾器在低通量衰減下均表現良好，具有高體積載量，但只有合成式深層過濾器能夠顯著去除聚集體。
在低pH和低電導率下，只有合成式深層過濾器提供高體積載量以及最小通量衰減，而表面改性的預過濾器則具有顯著的通量衰減，並且與合成式深層預過濾器相比，達到的載量相對較小。在這種條件下，所有測試的預過濾器都無法顯著去除聚集體。
無

Claims (15)

  1. 一種用於生產重組生物治療劑的整體化、連續之方法，該方法包括提供純化的重組目的蛋白；藉由超濾來濃縮或稀釋該純化的重組蛋白；藉由滲濾對該純化的重組蛋白進行緩衝液交換至所需配製物；藉由超濾進一步稀釋或濃縮配製的重組蛋白，直到達到目標濃度；一旦達到該目標濃度，就添加或組合至少一種非離子型洗滌劑或表面活性劑到滯留物加料槽中；對所得的原料藥物物質進行過濾以減少生物負載；對所得的原料藥物產品進行無菌過濾；和對無菌的原料藥物產品進行填充和精加工操作；其中該純化的重組蛋白和該原料藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中將該非離子型洗滌劑或表面活性劑同時添加到該配製的重組蛋白中，視情況其中一旦達到該目標濃度，就將該非離子型洗滌劑或表面活性劑直接同時添加到該UFDF滯留物加料槽中。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中：(a)該非離子型洗滌劑或表面活性劑係基於聚氧乙烯(PEO)的表面活性劑或選自聚山梨酯80和聚山梨酯20；及/或(b)該至少一種非離子型洗滌劑或表面活性劑的濃度為從0.001%至0.1%(重量/體積)。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中將該原料藥物產品收集在儲存容器中，視情況其中將該原料藥物產品收集在儲存容器中，並直接遞送到該無菌處理設施，視情況其中將該儲存容器連接到該無菌處理設施。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中將該原料藥物產品遞送到無菌處理設施，視情況其中：(a)該無菌處理設施包括至少一個填充站或至少一個不戴手套的無菌隔離器，視情況其中將含有該原料藥物產品的儲存袋、或處理該原料藥物產品的過濾器的輸出連接到不戴手套的無菌隔離器；及/或(b)該無菌處理設施具有與含有該原料藥物產品的儲存容器、或處理該原料藥物產品的過濾器單元的輸出的連接。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中：(a)用無菌的原料藥物產品填充初級藥物產品容器，視情況其中將該初級藥物產品容器密封、貼標籤和包裝；及/或(b)在一個或多個步驟之間存在連續流；及/或(c)將來自UFDF和/或減少生物負載過濾的池收集到儲存容器中；及/或(d)使用穩定的纖維素基親水性膜進行該超濾，該膜負載高達72g/m2膜面積，或在目標濃度小於或等於3.20mg/ml下，使用穩定的基於親水性膜進行該超濾，或使用穩定的纖維素基親水性膜進行該超濾，該膜的目標過量濃度為初始濃度的1.1x至2.5x；或(e)使用再生纖維素、鹼穩定的膜進行該超濾和滲濾，該膜負載高達170g/m2膜面積，或使用再生纖維素、鹼穩定的膜進行該超濾和滲濾，該膜的中間目標過量濃度小於或等於9g/L、具有高達13個滲濾體積。
  7. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，該方法進一步包括至少一個病毒過濾操作。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中：(a)在該UFDF操作之後或將該非離子型洗滌劑或表面活性劑同時添加到該配製的重組蛋白中或在將該非離子型洗滌劑或表面活性劑添加到UFDF滯留物槽中後，進行至少一個病毒過濾操作，視情況其中對具有5g/L或更小的配製物濃度的雙特異性T細胞銜接子進行該病毒過濾操作；及/或(b)病毒過濾器選自親水性聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纖維過濾器、銅銨再生纖維素中空纖維過濾器、或聚醚碸(PES)細小病毒滯留過濾器；及/或(c)至少一個病毒過濾操作還包括預過濾器，視情況其中該預過濾器係深層過濾器。
  9. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中在無菌過濾之前，添加一種或多種另外的純化的重組目的蛋白或藥物物質。
  10. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該純化的目的蛋白係抗原結合蛋白，視情況係多特異性蛋白，視情況係雙特異性抗體，視情況係雙特異性T細胞銜接子。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中：(a)該雙特異性T細胞銜接子係半衰期延長的雙特異性T細胞銜接子；及/或(b)該雙特異性T細胞銜接子的一個結合結構域對選自EGFRvIII、MSLN、CDH19、DLL3、CD19、CD33、CD38、FLT3、CDH3、BCMA、PSMA、 MUC17、CLDN18.2、或CD70的靶細胞上的腫瘤相關表面抗原具有特異性；及/或(c)該雙特異性T細胞銜接子選自博納吐單抗、帕妥昔珠單抗、AMG103、AMG330、AMG212、AMG160、AMG420、AMG-110、AMG562、AMG596、AMG427、AMG673、AMG675、或AMG701。
  12. 一種用於生產重組蛋白藥物產品之方法，該方法包括將表現目的蛋白的真核細胞擴增到N-1期；用所擴增的細胞接種和/或加料生物反應器，並培養該細胞以表現重組目的蛋白；通過收穫單元操作回收該重組蛋白；通過至少一個捕獲層析單元操作純化該收穫的重組蛋白；通過至少一個精製層析單元操作純化該重組蛋白；對該純化的重組蛋白進行超濾和滲濾單元操作，該超濾和滲濾單元操作包括藉由超濾來濃縮或稀釋該純化的重組蛋白；藉由滲濾對該純化的重組蛋白進行緩衝液交換至所需配製物；藉由超濾進一步稀釋或濃縮配製的純化的重組蛋白，直到達到目標濃度，將一種或多種非離子型洗滌劑或表面活性劑直接添加到含有該配製的純化的重組蛋白的UFDF滯留物加料槽中，得到配製的藥物物質；對該配製的藥物物質進行單一生物負載降低單元操作，得到過濾的原料藥物產品；無菌過濾該原料藥物產品； 用無菌的原料藥物產品填充初級藥物產品容器；和對該初級藥物產品容器進行密封、貼標籤和包裝；其中該重組蛋白和該藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。
  13. 一種用於減少藥物產品生產過程的製造空間佔用之方法，該方法包括對純化的重組目的蛋白進行超濾和滲濾(UFDF)單元操作直至達到目標濃度；將至少一種非離子型洗滌劑或表面活性劑直接添加到該UFDF滯留物加料槽中；對該原料藥物物質進行單一生物負載降低單元操作，然後進行無菌過濾；對無菌的原料藥物產品進行填充和精加工單元操作；其中該重組蛋白和該藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中：(a)將含有該原料藥物產品的儲存容器連接到無菌處理設施，視情況其中無菌處理設施具有與含有該原料藥物產品的儲存容器、或處理該原料藥物產品的過濾器的輸出的連接；及/或(b)在一個或多個步驟之間存在連續流；及/或(c)在該UFDF單元操作之後進行至少一個病毒過濾單元操作。
  15. 一種用於在重組治療蛋白製造期間減少藥物物質損失和/或不穩定之方法，該方法包括對純化的重組目的蛋白進行UFDF單元操作； 一旦達到目標濃度，就將至少一種非離子型洗滌劑或表面活性劑添加到UFDF滯留物加料槽中；對UFDF池進行單一過濾以降低生物負載，得到原料藥物物質；其中該重組蛋白和該藥物物質都不經過冷凍和解凍單元操作。
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