TWI865877B - 藉由固相吸附富集微生物核酸與鑑定微生物及/或抗藥基因的檢測系統及方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供一種用於鑑定樣本中目標微生物及/或抗藥基因的檢測系統，其包含細胞裂解單元、目標核酸富集單元、定序編碼單元及與該定序編碼單元連接的序列分析比對單元，其中，該細胞裂解單元用以裂解該樣本中的非目標細胞，並經由該核酸富集單元的固相式核酸吸附裝置移除該非目標細胞的核酸，該定序編碼單元及該序列分析比對單元用以根據經富集的目標微生物核酸的序列取得微生物種類及/或抗藥基因的鑑定結果。本揭露亦提供一種富集目標核酸的方法及鑑定目標微生物及/或抗藥基因的方法。
Description
本揭露關於根據經富集的目標核酸以鑑定微生物及/或抗藥基因的檢測系統，其中涉及透過固相吸附原理從樣本中去除非目標核酸以富集目標（例如微生物）核酸的方法。
快速且精準的病原體及抗藥性鑑定對於改善患者健康及解決微生物抗藥性問題至關重要。目前，用於臨床診斷的「黃金標準」是基於微生物培養的表型分析。然而，從細菌生長到於臨床微生物實驗室分析出初步結果，此診斷方法需耗費至少24小時到數天的時間。對於罹患可能會快速惡化並危及生命的疾病（例如菌血症、敗血症及肺炎等）的患者而言，此方法在初期無法即時提供指引。因此，敗血症患者經常面臨無效或過度的抗生素治療，承受著抗生素的相關毒性，或者因為不當使用抗生素，導致抗藥性病原演化，因而面臨各種多重抗藥性病原的威脅。
目前，適用於快速檢測病原體的技術為核酸擴增技術（nucleic acid amplification technology，NAAT），其已應用於例如敗血症的診斷（如Septifast檢測（Roche Diagnostics））及呼吸道的感染（如FilmArray呼吸道檢測（Biofire Defense））。然而，核酸擴增技術受限於引子設計，因此僅能針對不同的樣本進行不同目標病原體及抗藥基因的規劃。以FilmArray的血液檢測Blood Culture Identification 2（BCID2）平台為例，其僅能偵測預設的33種目標病原體及10種抗藥基因，而無法全面涵蓋種類繁多的病原體及抗藥基因，更無法鑑定稀有病原體與特殊抗藥基因，這使得核酸擴增技術無法完全取代傳統培養方法。因此，迫切需要一種可以快速檢測病原體（例如病毒、細菌及真菌）和盡可能多的抗藥基因的通用診斷技術。
最近，已報導利用次世代定序技術（next-generation DNA sequencing，NGS）的微生物總體基因組定序（metagenomic sequencing）及散彈式核酸擴增測序（shotgun sequencing）可獲得病原菌的訊息，例如Illumina定序平台，在病原體鑑定的研究中顯示其為較具有敏感性與特異性的先進技術。然而Illumina定序使用的是不超過300個鹼基對的短讀序列（short-read sequencing），其不易組裝成完整的病原體基因序列，且容易受到人類基因組及移生菌叢的干擾，因而降低其敏感度及特異性，因此不易自人類核酸所占比例太高的樣本中鑑定病原體的抗藥基因。此外，以Illumina為主的次世代定序技術平台需耗費數十小時的時間來取得較高病原體基因組覆蓋率的定序結果，且其分析流程較為繁複，成本亦高，以致無法即時分析結果而滿足臨床的需求。
對總體基因組定序而言，臨床樣本或血液培養物為具挑戰性的樣本，因其中通常存在大量人類或其他動物的核酸，故僅有少量的序列可用於鑑定病原菌種及抗藥基因，且由於目標DNA序列的豐度低，可能導致檢測病原體的靈敏度低。此外，從大量原始數據中過濾掉宿主序列非常耗時，並且高度依賴於電腦設備的計算能力。
目前已開發出一些在處理樣本時去除非目標核酸的方法。MolYsis Basic 5套組（Molzym，Bremen，德國）利用核酸酶分解非目標核酸，然而萃取出的細菌核酸片段相對較短，因此難以產生長序列讀序（long reads）。NEBNext微生物基因體DNA富集套組（New England Biolabs, Inc.，USA）利用能夠專一性結合人類基因組的甲基化CpG島的單株抗體；然而，人類基因上的甲基化分佈並不均勻，且此套組對於常規檢查而言並不符合成本效益。QIAamp BiOstic菌血症DNA套組（QIAGEN，Hilden，德國）利用多重離心步驟，根據細胞密度的差異分離宿主細胞。
然而，仍然需要提供一種快速且具有成本效益的策略來檢測例如在臨床環境中的病原菌，同時檢測與其致病性和抗生素抗藥性相關的特徵。
有鑑於此，本揭露提供藉由固相吸附方式從樣本中去除非目標核酸，從而富集其中目標核酸的系統及方法。本揭露所提供的系統與方法具有多種應用，例如包括將來自宿主的生物樣本進行預處理後，用以鑑定病原體種類及抗藥基因。
於本揭露的至少一具體實施例中，提供一種用於富集樣本中目標核酸（例如，細菌核酸）的方法，該方法包括：提供含有目標微生物和非目標細胞的樣本，其中該目標微生物和該非目標細胞源自不同物種；添加非離子性界面活性劑至該樣本中，使該非目標細胞裂解並釋出其所含有的非目標核酸；使該樣本與固相吸附劑接觸，以結合該樣本中的游離核酸；以及移除該固相吸附劑及與其結合的核酸，從而富集該樣本中該目標微生物中所含有的目標核酸。
於本揭露的至少一具體實施例中，提供一種用於富集樣本中目標核酸的方法，包括：提供含有目標微生物和非目標細胞的樣本，其中，該目標微生物和該非目標細胞源自不同物種；藉由檢測系統的細胞裂解單元，使該樣本中的該非目標細胞裂解並釋出其所含有的非目標核酸；以及藉由該檢測系統的目標核酸富集單元，移除該非目標核酸，從而富集該樣本中的該目標微生物所含有的該目標核酸。於一些具體實施例中，本揭露的目標核酸富集單元包含具有固相吸附劑的固相式核酸吸附裝置，且該非目標核酸的移除包括：使該樣本與該固相吸附劑接觸，以使該非目標核酸與該固相吸附劑結合；以及移除該固相吸附劑，從而富集該目標核酸。
於本揭露的至少一具體實施例中，該固相吸附劑選自由矽玻璃珠（silica beads）、含矽磁珠（silica magnetic beads）、管柱萃取濾膜、烷基鍵合矽膠、生物炭、纖維素、陰離子交換樹脂及其任意組合所組成的群組。該吸附劑的陽離子部分與核酸的帶負電荷的磷酸基團之間的氫鍵、疏水性相互作用及靜電相互作用可為結合的驅動力。於一些具體實施例中，該固相吸附劑可為含矽磁珠或以含矽磁珠為基礎。於一些具體實施例中，該固相吸附劑可透過任何鹽類及pH值控制，例如使該固相吸附劑於鹼性環境下吸附核酸。於一些具體實施例中，該含矽磁珠的表面可進一步經矽烷基聚合物修飾，其中，該矽烷基聚合物的實例包括，但不限於，四甲基矽氧烷（tetramethoxysilane，TMOS）、四乙基矽氧烷（tetraethoxysilane，TEOS）及3-胺基丙基三乙基矽氧烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）。於一些具體實施例中，本揭露所使用的固相吸附劑不包含抗體。於一些具體實施例中，本揭露的方法不包括基於抗體-抗原原理以吸附或去除樣本中的非目標核酸或游離核酸。
於本揭露的至少一具體實施例中，該非離子性界面活性劑選自由皂素（saponin）、吐溫（Tween）、曲拉通（Triton）、聚氧乙烯（10）油基醚（例如BrijO10）、多元醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯（polyethylene-polypropylene glycol，PEG/PPG）、聚氧乙烯醚、烷基乙醇醯胺、葡萄糖苷、脂肪醇及其任意組合所組成的群組。於一些具體實施例中，該方法進一步包括在鹼性條件下培育該非離子性界面活性劑和該樣本，以將該非目標細胞裂解並使該非目標核酸自該非目標細胞分離。
於本揭露的至少一具體實施例中，該目標核酸可為微生物核酸、細菌核酸、病毒核酸、真菌核酸、藻類核酸、原生動物核酸、病原體核酸及寄生蟲核酸中的至少一者。於一些具體實施例中，該目標核酸可為細菌核酸。於一些具體實施例中，該目標核酸可源自細菌，例如抗生素抗藥性細菌。於一些具體實施例中，該目標核酸可為細菌質體或其片段，例如抗生素抗藥基因。
於本揭露的至少一具體實施例中，該非目標細胞屬於真核生物宿主，諸如動物宿主。於一些具體實施例中，該非目標核酸源自動物宿主。於一些具體實施例中，該動物宿主為哺乳動物宿主。於一些具體實施例中，該樣本中含有哺乳動物宿主核酸及源自該哺乳動物宿主中病原體的核酸。於一些具體實施例中，該樣本獲自人類宿主，並且包括人類宿主核酸和非人類核酸。
於本揭露的至少一具體實施例中，該樣本可為環境樣本，諸如灰塵、土壤、水、空氣、人工水系統或食物樣本。於一些具體實施例中，該樣本可為獲自患有或疑似患有傳染病的宿主的生物樣本。於一些具體實施例中，該傳染病包括，但不限於，菌血症、敗血症及肺炎。
於本揭露的至少一具體實施例中，亦提供一種鑑定樣本中目標微生物及/或抗藥基因的檢測系統，該檢測系統包括：細胞裂解單元，用以裂解該樣本中的非目標細胞，其中，該目標微生物與該非目標細胞源自不同物種；目標核酸富集單元，其包含固相式核酸吸附裝置，用以移除經細胞裂解後的該非目標細胞的核酸，從而富集該樣本中的該目標微生物的核酸；定序編碼單元，用以對該樣本中該目標微生物的該核酸的序列進行解碼；以及序列分析比對單元，其與該定序編碼單元連接，用以接受該定序編碼單元所產生的解碼數據，並將該解碼數據與微生物基因資料庫及/或抗藥基因資料庫進行比對，以取得該目標微生物及/或抗藥基因的鑑定結果。
於本揭露的至少一具體實施例中，該固相式核酸吸附裝置包含固相吸附劑，以及該細胞裂解單元包含非離子性界面活性劑。於一些具體實施例中，該非目標細胞的裂解在鹼性環境下進行。於一些具體實施例中，本揭露所使用的固相吸附劑不包含抗體。於一些具體實施例中，該固相式核酸吸附裝置不包括基於抗體-抗原原理以吸附或移除樣本中的非目標核酸或游離核酸。
於本揭露的至少一具體實施例中，該目標微生物選自由細菌、病毒、真菌、藻類、原生動物、病原體、寄生蟲及其任意組合所組成的群組，以及該非目標細胞屬於真核生物宿主。
於本揭露的至少一具體實施例中，該檢測系統進一步包括目標微生物擴增單元，用以使該樣本中的該目標微生物及其核酸的數量增加。於一些具體實施例中，該目標微生物擴增單元包括血液培養裝置。
於本揭露的至少一具體實施例中，該定序編碼單元為次世代定序平台、高通量定序平台、奈米孔定序（Nanopore sequencing）平台、PacBio定序平台及桑格定序平台中的至少一者。
於本揭露的至少一具體實施例中，該待比對的該解碼數據透過微生物種類比對軟體及/或微生物抗藥基因種類判讀軟體執行以下程序，以辨識微生物種類、抗藥基因及/或預測抗微生物藥物的抗藥性（antimicrobial resistance，AMR）：獲取待比對的該解碼數據中預設長度序列的索引值；校正及組裝微生物基因組與細菌質體序列；根據該索引值從參考基因序列中讀取對應的比對序列；以及判斷該待比對的解碼數據和該比對序列是否相同以產生判斷結果。
於本揭露的至少一具體實施例中，該序列分析比對單元進一步用以分析該目標微生物所攜帶的抗藥基因，例如，抗微生物藥物抗藥基因。於一些具體實施例中，該序列分析比對單元進一步用以計算出包含有效比對序列數、覆蓋率、覆蓋深度、相對豐度及離散程度中的至少一種參數，藉以取得該目標微生物的種類及/或其所攜帶的抗藥基因的鑑定結果。
於本揭露的至少一具體實施例中，該定序編碼單元產生該目標微生物的基因組大小的至少20倍的基因組覆蓋深度的解碼數據。於一些具體實施例中，以該定序編碼單元於例如15分鐘內所產生的解碼數據或該目標微生物的基因組大小至少1倍的基因組覆蓋深度的解碼數據，用以比對占全體讀序1%以上的微生物族群的分佈比例，作為該樣本中該目標微生物的相對豐度的依據。於一些具體實施例中，該序列分析比對單元進一步用以（例如在6小時內）鑑定該目標微生物的質體上的完整抗藥基因亞型種類與數量以及染色體上的突變位點，從而預測該目標微生物對於抗微生物藥物的抗藥性。
於本揭露的至少一具體實施例中，亦提供上述檢測系統的使用方法，包括：提供含有不同物種或源自不同物種的目標微生物和非目標細胞的樣本；藉由該細胞裂解單元，使該樣本中該非目標細胞裂解；藉由該目標核酸富集單元，移除經細胞裂解後的該非目標細胞的核酸，從而富集該樣本中的該目標微生物的核酸；藉由該定序編碼單元，對該目標微生物的該核酸進行定序；以及藉由該序列分析比對單元，取得該目標微生物及/或其所攜帶的抗藥基因的鑑定結果。
於本揭露的至少一具體實施例中，該細胞裂解單元透過添加非離子性界面活性劑至該樣本中，以裂解該非目標細胞。於一些具體實施例中，該目標核酸富集單元透過使固相吸附劑與該樣本接觸，並將結合有該非目標細胞的核酸及/或樣本中游離核酸的固相吸附劑移除，以富集該目標微生物的核酸。
於本揭露的至少一具體實施例中，另提供一種用於鑑定目標微生物及/或抗藥基因的方法，包括：提供經前述方法所富集的該目標核酸，其中，經富集的該目標核酸具有至少2,000個核苷酸的長度；藉由定序檢測對經富集的該目標核酸的序列進行解碼，以取得解碼數據；以及將該解碼數據與微生物基因資料庫及/或抗藥基因資料庫進行比對，以取得該目標微生物及/或其所攜帶的該抗藥基因的鑑定結果。
於本揭露的至少一具體實施例中，亦提供一種用於鑑定生物樣本中的病原體的方法。於一些具體實施例中，本揭露的方法包括：提供來自感染或疑似感染病原體的個體的生物樣本；添加非離子性界面活性劑至該生物樣本中，並在鹼性條件下培育；使該生物樣本與固相吸附劑接觸，以結合源自該個體的非目標核酸；移除該固相吸附劑，從而富集該生物樣本中的病原體核酸；以及藉由定序檢測對經富集的病原體核酸進行定序。於一些具體實施例中，該固相吸附劑進一步結合該樣本中所含有的游離核酸。
於本揭露的至少一具體實施例中，該生物樣本選自由血液、血清、血漿、尿液、痰液、唾液、腦脊液、間質液、黏液、汗液、糞便萃取物、糞便、滑液、眼淚、精液、腹膜液、乳頭抽吸液、乳汁、陰道液及其任意組合所組成的群組。
於本揭露的至少一具體實施例中，基於該生物樣本中目標核酸的量而定，本揭露所提供的方法視需要包括在添加該非離子性界面活性劑之前，先擴增該生物樣本中的微生物、病原體、目標核酸及/或病原體的核酸。舉例而言，該生物樣本源自於患有敗血症的患者，且為已先進行血液培養的血液樣本。於一些具體實施例中，適用於本揭露方法的樣本為經過連續性監測血液培養系統認定為陽性的血液培養樣本（如使用革蘭氏染色法證實出現微生物的血液樣本）。於一些具體實施例中，本揭露所提供的方法進一步包括從血液樣本中移除紅血球。
於本揭露的至少一具體實施例中，該定序檢測選自由次世代定序檢測、高通量定序檢測、奈米孔定序檢測、PacBio定序檢測、桑格定序檢測及其任意組合所組成的群組。於一些具體實施例中，該定序檢測可為奈米孔定序檢測。
於本揭露的至少一具體實施例中，藉由本揭露提供的方法所富集的目標核酸或病原體的核酸具有至少2,000個核苷酸（nt）的長度。舉例而言，待定序的經富集目標核酸或經富集病原體核酸具有至少2,000 nt、至少2,500 nt、至少3,000 nt、至少3,500 nt、至少4,000 nt、至少4,500 nt、至少5,000 nt、至少5,500 nt、至少6,000 nt、至少6,500 nt或至少7,000 nt的長度。
於本揭露的至少一具體實施例中，本揭露所提供的方法導致最初包含在生物樣本中的目標核酸或病原體的核酸富集至少10倍。舉例而言，該方法導致最初包含在生物樣本中的目標核酸或病原體的核酸富集至少10倍、至少10
2倍、至少10
3倍、至少10
4倍或至少10
5倍。於一些具體實施例中，藉由本揭露所提供的富集方法，基於其中的核酸總量計，目標核酸或病原體的核酸佔50%以上，例如55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上及99%以上。
於本揭露的至少一具體實施例中，本揭露所提供的方法進一步包括在定序之前，從該生物樣本中萃取經富集的病原體核酸。於一些具體實施例中，本揭露所提供的方法進一步包括基於定序結果，以鑑定該病原體所攜帶的抗藥基因。於一些具體實施例中，鑑定抗藥基因為以病原體基因組大小的至少20倍（例如至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍及至少70倍）的基因組覆蓋深度進行。
於本揭露的至少一具體實施例中，本揭露的系統與方法可高效率地選擇性去除非目標核酸（例如宿主核酸）以萃取出高純度的病原體DNA，該DNA可用於進行快速定序並產生用於組裝病原體完整基因組的長序列讀序。因此，本揭露可用於消除非目標核酸的干擾以及加速和提升生物資訊學的分析，藉以提升鑑定病原體種類及其抗藥基因的效力。
本說明書詳細地揭露一些具體實施例，以使所屬技術領域中具有通常知識者能夠基於本揭露而利用該等具體實施例。因具體實施例的許多步驟或特徵對所屬技術領域中具有通常知識者而言，基於本揭露將是顯而易見的，故並未詳細討論具體實施例的所有步驟或特徵。
如本揭露中所使用，單數形式「一」及「該」除非本文中另有說明，否則包括多數個體。如本揭露中所使用，術語「及」除非另有說明，否則旨在包含於內。如本文中所使用，術語「或」除非本文中另有說明，否則通常以包括「及/或」的含義使用。
如本文中所使用，術語「約」意為所指明的特性、組成、量、值或參數的偏差程度，諸如基於實驗誤差、測量誤差、近似誤差、計算誤差、平均值的標準偏差、例行微調等。
如本文中所使用，術語「包括」、「具有」、「包含」及「含有」除非另有說明，否則解釋為開放式術語（亦即，意指「包含但不限於」）。
本揭露涉及一種用於富集樣本（例如來自患有或疑似患有傳染病的個體的生物樣本）中目標核酸的方法。於至少一具體實施例中，該樣本包括源自宿主的非目標核酸和源自非宿主來源的目標核酸。於至少一具體實施例中，該方法提高樣本中目標核酸相對於非目標核酸的比率至少10倍。
如本文中所使用，術語「患者」、「宿主」及「個體」可互換使用。術語「個體」意指人類或動物。個體的實例包括，但不限於，人類、猴、小鼠、大鼠、土撥鼠、雪貂、兔、倉鼠、牛、馬、豬、鹿、狗、貓、狐狸、狼、雞、鴯鶓、鴕鳥及魚。於一些具體實施例中，該個體為哺乳動物，例如靈長類動物，諸如人類。
如本文中所使用，術語「生物樣本」意指將透過本文所述的任何方法處理或分析的樣本，其可為從待檢測個體獲得的任何類型的樣本。本文使用的生物樣本包括，但不限於：組織樣本（諸如組織切片及組織的穿刺切片）；細胞樣本（例如，細胞學塗片（諸如巴氏塗片或血液塗片）或透過顯微切割獲得的細胞樣本）；整個生物體的樣本（諸如酵母或細菌樣本）；或細胞分液、片段或胞器（諸如透過裂解細胞並透過離心或其他方式分離其成分而獲得者）。生物樣本的其他實例包括，但不限於，體液樣本，諸如血液、血清、血漿、尿液、痰液、唾液、腦脊液、間質液、黏液、汗液、糞便萃取物、糞便、滑液、眼淚、精液、腹膜液、乳頭抽吸液、乳汁、陰道液或其任意組合。於一些具體實施例中，該血液樣本可為全血或其分液，例如血清或血漿，透過肝素化或EDTA處理以避免血液凝固。
本揭露的方法包括添加非離子性界面活性劑（例如皂素）至樣本中，例如包括宿主核酸和非宿主核酸的生物樣本。於至少一具體實施例中，宿主核酸及非宿主核酸分別包含在源自宿主及非宿主來源的細胞或顆粒中。於至少一具體實施例中，非離子性界面活性劑選擇性地引起宿主細胞及其內膜的裂解，並釋放宿主核酸，使得宿主核酸可以部分或完全地結合至固相吸附劑。非宿主細胞或顆粒（例如病原體）內的核酸基本上保持完整，而不會從生物樣本中被顯著地去除，因此隨後可收集這些核酸，並透過如定序的方式進行分析。透過本文所述的任何方法處理或分析的非宿主核酸具有足夠長的平均長度而可鑑定；亦即，因此可確定該非宿主核酸的序列及/或生物學來源。於至少一具體實施例中，透過本文所述的方法富集的非宿主核酸可各自具有至少2,000個核苷酸的長度。
請參考圖1，其顯示本揭露的至少一具體實施例的檢測系統的示意圖。本揭露的檢測系統10包含細胞裂解單元100、目標核酸富集單元200、定序編碼單元300及序列分析比對單元400。細胞裂解單元100可包含容納樣本的容器101及朝向該容器101設置的非離子性界面活性劑102，其用以裂解該樣本中的非目標細胞，使非目標細胞的核酸自該細胞分離。舉例而言，自人體宿主所採集的待測血液樣本在經血液培養後，可透過三向抽取樣本系統從血液培養瓶中抽取至內含有非離子性界面活性劑的離心管中。
於本揭露的至少一具體實施例中，目標核酸富集單元200可與細胞裂解單元100相連接，以接受經細胞裂解單元100處理後的細胞裂解樣本。目標核酸富集單元200可包含固相式核酸吸附裝置201及核酸萃取裝置202，該固相式核酸吸附裝置201包含固相吸附劑，用以吸附並移除經細胞裂解後的非目標細胞的核酸，從而富集該樣本中的目標微生物的核酸，而後再透過核酸萃取裝置202萃取目標微生物的核酸。舉例而言，請進一步參考圖2，可將固相吸附劑（例如含矽磁珠）添加至樣本中，以吸附樣本中游離的核酸，再經由移除裝置（例如磁座）或利用密度梯度不同來移除固相吸附劑，使樣本中僅留下目標微生物，而後進行目標微生物的核酸萃取。
請再次參考圖1，於本揭露的至少一具體實施例中，定序編碼單元300可與核酸富集單元200相連接，以接受經目標核酸富集單元200處理後的目標微生物的核酸。於本揭露的至少一具體實施例中，定序編碼單元300可包含DNA文庫製備套組301及定序儀302，用以對該目標微生物的核酸序列進行解碼。於至少一具體實施例中，適用於本揭露檢測系統的定序儀包括，但不限於，Flongle定序儀及MinION定序儀。
於本揭露的至少一具體實施例中，序列分析比對單元400可與定序編碼單元300相連接，用以接受該定序編碼單元300所產生的解碼數據，其包含待比對序列（即目標微生物的核酸序列）中預設長度子序列的條碼（barcode）。此外，於本揭露的至少一具體實施例中，序列分析比對單元400可包含微生物鑑定模組401及抗藥基因鑑定模組402。於該微生物鑑定模組401中，該解碼數據與微生物基因資料庫進行比對，以取得該目標微生物的鑑定結果，而抗藥基因鑑定模組402則進一步根據該解碼數據分析該目標微生物所攜帶的抗藥基因。
於本揭露的一些具體實施例中，當判斷該解碼數據及微生物基因資料庫的參考序列是否相同時，可根據該解碼數據的條碼從參考序列中讀取對應的待比對序列，再將待比對序列及參考序列中的鹼基對逐一比對，判斷待比對序列及參考序列中的鹼基是否對應相同。當判斷結果為相同時，則將索引值（index）作為待比對序列的位置資訊；當判斷結果為不同時，則判定待比對序列中存在插入或缺失的鹼基對。於至少一具體實施例中，適用於本揭露檢測系統的微生物基因資料庫包括Centrifuge及Karken2，其等為用以比對包含細菌、病毒、真菌、寄生蟲等的臨床病原資料庫，但不以此為限。
於本揭露的一些具體實施例中，用於進行物種序列比對的資料庫包括病原體基因組資料庫與病原文獻資料庫，原始來源可為公用資料庫，例如國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）。目前，微生物基因資料庫的參考序列總計有細菌與古細菌共5,527種、病毒1,677種、真菌5,523種和寄生蟲865種，亦包含62,602種真核生物等共計69,836種物種。
於本揭露的一些具體實施例中，用於進行抗藥基因比對的資料庫包括抗藥基因體資料庫Resfinder 4.0（Center for Genomic Epidemiology，DTU，丹麥）。目前，抗藥基因資料庫的參考序列總計在質體上有2,690種抗藥基因和染色體上有266種抗藥基因的變異位點，以及包含57種可預測微生物抗藥性的藥物。
再請參考圖3，其顯示本揭露的至少一具體實施例中檢測系統的運作流程，主要包括步驟S1至S4，分別為細胞裂解（S1）、目標核酸富集（S2）、定序編碼（S3）及序列分析比對（S4），各自分別說明如下：
細胞裂解（S1）包括於自環境或宿主所採集的待測樣本中添加非離子性界面活性劑，以將樣本中的非目標細胞裂解；
目標核酸富集（S2）包括使用固相吸附劑結合非目標細胞的核酸，並於移除該固相吸附劑後，萃取樣本中的目標核酸；
定序編碼（S3）包括使用文庫製備套組建構定序文庫，並搭配定序儀進行定序，進而利用鹼基辨識程式產生解碼數據；以及
序列分析比對（S4）包括將該解碼數據與微生物基因資料庫及/或抗藥基因資料庫進行比對，以取得目標微生物及/或抗藥基因的鑑定結果。
本揭露使用的材料和其他方法流程詳細描述於下文。
（1）宿主核酸的固相式吸附
當BACTEC（BD）系統中的血液培養物的培育被標記為陽性時，取2 mL血液培養液於室溫下與1× 紅血球裂解緩衝液反應5分鐘，以去除血液中的紅血球。隨後，將經反應的溶液以3,000 × g離心10分鐘以初步清除碎片。將上清液丟棄後，以250 μL的磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）重新懸浮團塊（pellet）。接著，在懸浮液中加入1 mL的非離子界面活性劑（例如皂素、吐溫（Tween）、曲拉通（Triton）、聚氧乙烯（10）油基醚、多元醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯、聚氧乙烯醚、烷基乙醇醯胺、葡萄糖苷、脂肪醇等），以5%的皂素添加至懸浮液為例，最終濃度達2.2%。於室溫下培育10分鐘後，以6,000 × g離心5分鐘後丟棄上清液，再以200 μL的磷酸鹽緩衝液重新懸浮團塊。於懸浮液中加入100 μL的固相可逆固定化（solid-phase reversible immobilization，SPRI）磁珠，然後移液5分鐘。靜置於磁座後收集上清液。將上清液以3,000 × g離心3分鐘後，以200 μL的磷酸鹽緩衝液重新懸浮團塊。
（2）細菌DNA的萃取
為了從經預處理的團塊中萃取用於奈米孔定序的細菌DNA，採用市售套組並大致上參酌Qiagen手冊中QIAamp血液及組織基因組DNA所描述的流程，但改善溶菌酶（lysozyme）和溶葡萄球菌素（lysostaphin）流程，以減少處理步驟和周轉時間。溶菌酶和溶葡萄球菌素被推薦用於革蘭氏陽性菌和「難裂解」細菌的DNA萃取。此兩種酶均會破壞肽聚醣細胞壁，進而導致裂解。此外，溶菌酶會水解N-乙醯胞壁酸及N-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵，而溶葡萄球菌素會破壞葡萄球菌細胞壁中五甘胺酸橋（pentaglycine bridge）的甘胺酸-甘胺酸鍵。由於細胞壁結構的差異，葡萄球菌細胞壁對溶菌酶具有抗性，因此使用溶葡萄球菌素，而非溶菌酶，方可從金黃色葡萄球菌中產生足夠的DNA。
萃取DNA後，以SPRI磁珠去除較短的DNA片段及清除聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）抑制物與定序反應抑制物。使用Qubit Broad Range雙股DNA（dsDNA）定量套組及Qubit螢光計評估DNA濃度，定量範圍為2至1,000 ng/μL。使用NanoDrop分光光度計評估DNA純度及污染程度。建議的樣本純度為A
260/A
230＞ 2.0及A
260/A
280＞ 1.8。
（3）用於奈米孔定序的文庫製備
將每個經萃取的DNA樣本調整成80 ng/μL，吸取5 μL的樣本（約400 ng）加上2.5 μL的水，使總體積為7.5 μL。將Oxford Nanopore公司所開發的Rapid Barcoding套組（SQK-RBK004）取出置於離心管架上於室溫下溶解，充分震盪後短暫離心並置於冰盒上備用。
在0.2 mL的離心管中分別加入總體積為7.5 μL的樣本與2.5 μL的標籤條碼接頭1至96、定序接頭及動力蛋白。在連接標籤條碼接頭的過程中，連續96個樣本內不能重複使用同一個標籤條碼接頭。
接著，將樣本置於聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）機器，進行30℃、1分鐘與80℃、1分鐘的反應，而後置於冰盒上，將所有已標籤完成的樣本混合。以Agencourt AMPure XP磁珠進行DNA純化。磁珠使用前須先手搖使其混合均勻，取60 μL的磁珠加入前一個步驟的反應液，並以指尖輕彈管壁混合均勻後放置於混合儀（mixer）中，翻轉混合5分鐘。之後，將離心管置於磁座上10分鐘，待磁珠完全吸附後取出管內的反應液，並以200 μL的70%酒精清洗磁珠2次。之後再以25 μL不含DNA酶的純水打散磁珠，使DNA溶於水中，並利用磁座再次吸附及移除磁珠，以獲得純化的DNA文庫。
（4）奈米孔定序數據分析
將奈米孔定序晶片（flow cell）（R9.4.1 FLO-MIN106，Oxford Nanopore）從4℃取出至室溫，待回溫後放進MinION定序儀，以Flow Cell Priming套組進行上機定序。將一管沖洗緩衝液（flush buffer，FB）以及沖洗繫繩試劑（flush tether，FLT）從-20℃取出回溫震盪混合後，取30 μL的FLT加入FB緩衝液，配置成定序啟動混合液（priming mixture）。取800 μL的定序啟動混合液加入晶片上的啟動孔（priming port），並靜置5分鐘。
取出12 μL經製備的DNA文庫加入37.5 μL的定序緩衝液（SQB buffer）以及25.5 μL裝載珠（loading bead），形成總體積75 μL的定序混合液，以微量吸管分注器混合並避免氣泡產生。在上機前再取200 mL的定序啟動混合液加入啟動孔後，將製備完成的定序混合液緩慢滴入樣本孔（sample port）中，關閉試劑孔及樣本孔後，蓋上定序儀進行定序。
使用軟體MinKNOW v4.2.4收集數據。鹼基檢出（base calling）為使用Guppy執行條碼區分（barcode de-multiplexing）和FASTQ檔輸出。使用Porechop v0.2.3從讀序中修剪轉接子（adaptor）序列，該程式使用條碼解多工運行。僅保留Guppy和Porechop條碼箱（barcode bin）認定的讀序，以降低交叉條碼污染的風險。MinKNOW平台所產生的定序數據以及每個檔案的所有序列均使用預設的設定輸出。定序運行開始後大約2小時產生第一個輸出的檔案，直到運行10小時。對於此項工作，每個輸出的檔案都被單獨處理，以持續追蹤從定序開始後經過的時間。
（5）依分類學分類
原始定序讀序（≥ 2,000 bp）由使用預設設定（部分命中的最小長度（min_hitlen）= 22；每個讀序最多k = 5個不同分配；沒有首選/排除的分類群）的比對軟體Centrifuge 1.0.4或Kraken2，執行細菌、古細菌、病毒和人類的參考基因序列中讀取對應的比對序列以進行分類學上的分類。
根據獲取的待比對序列中預設長度子序列的條碼（barcode），從參考基因序列中讀取對應的比對序列，將所得的序列資料透過比對軟體Centrifuge 1.0.4或Kraken2的臨床病原體資料庫進行分類，保留比對長度大於序列全長80%，且比對區域錯配鹼基數小於或等於10%的序列，並計算出病原體分類所佔的比例，以所佔比例大於總讀序中的1%篩選為該樣本內存在的病原體類別。
（6）總體基因組組裝及抗藥基因搜尋
當定序數據收集完成後，接著進行預處理及鹼基檢出，然後進行總體基因組組裝。多種組譯器（assembler）適用於長讀序總體基因組數據的組裝，其中包括長讀序組裝軟體，諸如Canu及Flye。此外，透過使用Racon及Medaka（採用神經網路以辨識和校正奈米孔同聚物錯誤，產出共有序列）及Homopolish（透過同源基因錯誤校正（homologous polishing）軟體去除奈米孔定序中的系統錯誤），可以針對單獨的長讀序進行錯誤校正。使用BLAST與ResFinder 4.0資料庫搜尋原始定序讀序（≥ 300 bp）及標記為質體的組裝重疊群（contig）。僅保留具有≥ 90%相似性、E值≤ 10
-6及資料庫條目覆蓋率≥ 60%的命中。
將組裝後的序列與包含微生物抗藥基因的資料庫進行比對，並統計比對到微生物基因組與抗藥基因序列的檢測參數，以計算出包含有效比對序列數（即在屬/種與抗藥基因水平比對上，該物種與基因的序列數）、覆蓋率（即檢測到的微生物核酸序列長度佔微生物與抗藥基因整個基因組序列長度的百分比）、覆蓋深度（即基因組上覆蓋範圍內的鹼基平均深度）、相對豐度（在屬/種水平上檢測到的微生物佔整個樣本中檢測到相同類型微生物的比重）及離散程度中的至少一種參數在內的檢測結果，並輸出該檢測分析。
以下藉由特定的具體實施例進一步說明本揭露的特點及功效，但非用於限制本揭露的範圍。
實施例1：去除非目標核酸的評估
於此實施例中，含有克雷伯氏肺炎菌（
K. pneumoniae）ST11菌株（KPC160111）或金黃色葡萄球菌（
S. aureus）的人類血液樣本經過人類核酸的固相式吸附預處理後，進行定量聚合酶連鎖反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）及奈米孔定序。
結果表明，固相式吸附的預處理使樣本中的細菌核酸富集。如下表1所示，在經預處理的樣本中，人類核酸減少至對照樣本的0.005倍至0.016倍，而細菌核酸增加至對照樣本的2.34倍至5.78倍。
表1、以qPCR評估的宿主及細菌核酸量
Cq：量化循環
| 血液中測試物 | qPCR測定 | 樣本 | 複本1 | 複本2 | 平均 | Cq | 倍數 |
| 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌 | 未經去除 | 15.02 | 15.04 | 15.03 | 2.53 | 5.78 |
| 經去除 | 11.21 | 13.79 | 12.50 | ||||
| 人類 | 未經去除 | 22.81 | 22.87 | 22.84 | -7.69 | 0.005 | |
| 經去除 | 30.76 | 30.29 | 30.53 | ||||
| 金黃色葡萄球菌 | 金黃色葡萄球菌 | 未經去除 | 10.82 | 13.85 | 12.34 | 1.23 | 2.34 |
| 經去除 | 9.05 | 13.17 | 11.11 | ||||
| 人類 | 未經去除 | 19.21 | 20.13 | 19.67 | -5.97 | 0.016 | |
| 經去除 | 25.56 | 25.71 | 25.64 |
此外，奈米孔定序的結果表明，從預處理樣本中獲得的讀序數量、讀序長度（包括平均讀序長度、讀序長度中位數及N50）及總鹼基數均顯著高於對照樣本（表2）。
表2、預處理樣本中細菌核酸的品質
N50：於總基因組長度的50%，最短重疊群的序列長度。
| 血液中測試物 | 樣本 | 平均讀序 長度（bp） | 平均讀序 品質（Q） | 讀序長度中位數（bp） | 讀序數量 | N50 | 總鹼基數 |
| 克雷伯氏肺炎菌 | 未經去除 | 5,613 | 13.6 | 3,038 | 84,376 | 11,470 | 473,680,706 |
| 經去除 | 9,833 | 12.8 | 6,467 | 168,409 | 17,242 | 1,656,087,432 | |
| 金黃色葡萄球菌 | 未經去除 | 4,774 | 13.7 | 2,570 | 13,959 | 9,765 | 66,640,453 |
| 經去除 | 8,713 | 13 | 5,536 | 111,447 | 15,610 | 971,092,018 |
就奈米孔定序後的細菌核酸比例而言，下表3顯示，含有克雷伯氏肺炎菌的經預處理樣本中的非目標核酸（即人類核酸）的比例從63.09%顯著降低至0.13%，含有金黃色葡萄球菌的經預處理樣本中則從75.35%降低至0.11%；另一方面，細菌核酸的比例從28.34%增加至82.01%（克雷伯氏肺炎菌）和從20.72%增加至81.14%（金黃色葡萄球菌）。
表3、奈米孔定序後的細菌核酸比例
| 血液中測試物 | 樣本 | 總讀序 | 可分類讀序 | 人類讀序 | 目標讀序 | 無法分類讀序 |
| 克雷伯氏肺炎菌 | 未經去除 | 84,376 | 81,865 | 53,234 （63.09%） | 23,910 （28.34%） | 2,511 |
| 經去除 | 168,409 | 161,348 | 221 （0.13%） | 138,110 （82.01%） | 7,061 | |
| 金黃色葡萄球菌 | 未經去除 | 13,959 | 13,573 | 10,518 （75.35%） | 2,904 （20.72%） | 386 |
| 經去除 | 111,447 | 106,364 | 118 （0.11%） | 90,424 （81.14%） | 5,083 |
實施例2：細菌種類及抗藥基因的鑑定
於此實施例中，以人類核酸的固相式吸附或市售套組（即MolYsis Basic 5套組、NEBNext微生物基因體DNA富集套組及QIAamp BiOstic菌血症DNA套組）預處理含有克雷伯氏肺炎菌或金黃色葡萄球菌的人體血液，然後進行qPCR、奈米孔定序及抗藥基因搜尋。
與市售套組相比，經本揭露提供的固相式吸附預處理的樣本中，透過奈米孔定序所產生的讀序長度（包括平均讀序長度及讀序長度中位數）最長（下表4和下表5）。
表4、含克雷伯氏肺炎菌（具有29個抗藥基因）的血液樣本以不同的方法預處理
對照組：血液樣本未經去除非目標核酸的預處理；Molysis：MolYsis Basic 5套組；NEB：NEBNext微生物基因體DNA富集套組；QiAamp BB：QIAamp BiOstic菌血症DNA套組；TCDC：本揭露所提供的方法。
表5、含有金黃色葡萄球菌（具有2個抗藥基因）的血液樣本以不同方法預處理
對照組：血液樣本未經去除非目標核酸的預處理；Molysis：MolYsis Basic 5套組；NEB：NEBNext微生物基因體DNA富集套組；QiAamp BB：QIAamp BiOstic菌血症DNA套組；TCDC：本揭露所提供的方法。
| 方法 | DNA（ng/μL） | 平均讀序長度（bp） | 讀序長度中位數（bp） | 讀序數量 | 總鹼基數 |
| 對照組 | 30.7 | 5,074 | 2,413 | 37,619 | 190,883,881 |
| Molysis | 5.9 | 1,438 | 187 | 2,376 | 3,416,680 |
| NEB | 14.7 | 4,223 | 2,300 | 3,765 | 1,222,820,069 |
| QiAamp BB | 28 | 2,383 | 1,618 | 342,288 | 815,884,192 |
| TCDC | 32.8 | 9,921 | 6,788 | 498,615 | 4,946,906,836 |
| 方法 | DNA（ng/μL） | 平均讀序長度（bp） | 讀序長度中位數（bp） | 讀序數量 | 總鹼基數 |
| 對照組 | 30.6 | 2,293 | 921 | 10,549 | 24,197,739 |
| Molysis | 93.8 | 821 | 185 | 7,475 | 6,143,528 |
| NEB | 10.2 | 541 | 221 | 11,929 | 6,459,450 |
| QiAamp BB | 94.4 | 1,603 | 888 | 585,887 | 935,519,573 |
| TCDC | 11.8 | 2,618 | 1,299 | 298,892 | 782,622,266 |
此外，如圖4A及圖4B所示，於使用本揭露方法預處理的樣本中，細菌核酸的比例遠高於使用其他市售套組預處理的樣本。舉例而言，利用奈米孔定序得到的序列數據藉由Centrifuge資料庫對物種分佈進行鑑定，結果表明於使用本揭露方法預處理的樣本中，人類核酸的比例僅約為1%，而細菌核酸的比例可達85%（克雷伯氏肺炎菌）或63%（金黃色葡萄球菌）。由此可見，與市售套組相比，本揭露的方法顯著增加預處理樣本中細菌核酸的比例。
另外，如圖5A所示，克雷伯氏肺炎菌攜帶的29個抗藥基因均可在6小時內的定序鑑定完成，說明採用本揭露所提供的預處理方法，6小時內定序的讀序序列達到克雷伯氏肺炎菌基因組大小20倍的覆蓋深度，已足夠檢測出完整的抗藥基因。同樣地，圖5B顯示金黃色葡萄球菌攜帶的2個抗藥基因可在2小時內的定序鑑定完成，其達到金黃色葡萄球菌基因組大小的20倍覆蓋深度。與QiAamp BB套組相比，其需要6小時的定序才能獲得足夠覆蓋深度的讀序序列以進行檢測，而以NEB套組預處理的樣本於10小時內所獲得的讀序序列仍不足以鑑定2個抗藥基因。
實施例3：臨床檢體的評估
於此實施例中，對中國醫藥大學附設醫院提供的36份人類血液樣本進行非目標核酸固相式吸附的預處理，然後進行病原體的鑑定和抗藥基因的檢測。
結果如下表6所示，其中百分比代表讀序分佈的比例。可以發現，在36份的血液檢體中，33例表明本揭露方法所鑑定出的病原體與微生物培養所鑑定出的病原體一致；此外，在樣本中含有多於一種病原體（例如第4、12及20號樣本）或其中的病原體屬於同屬的不同物種（例如第7、13、18、24、26、31、35及36號樣本）的情況下，樣本中的次要病原體或物種也可以透過本揭露的方法來鑑定。傳統微生物培養通常只能在一次實驗中鑑定出其中一種菌株，而透過本揭露的方法則可同時鑑定出樣本中的所有菌株。因此，雖然第7、14及24號樣本此3個病例的鑑定結果與微生物培養的結果不一致，然而透過本揭露方法所鑑定的結果會更接近真實的感染情形。
此外，本揭露方法所檢測到的抗藥基因也與傳統抗生素敏感性試驗（antibiotic susceptibility test，AST）的結果一致。
表6、傳統微生物培養與本揭露方法在病原體鑑定方面的比較
G：革蘭氏陽性（+）；革蘭氏陰性（-）；Y：酵母菌；MRSA：抗甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant
Staphylococcus aureus）；CR：抗碳青黴烯類；VRE：抗萬古黴素腸球菌屬（vancomycin-resistant Enterococcus）。
| 樣本編號 | G | 傳統微生物培養 | 以本揭露方法鑑定 （經分類讀序 ＞ 1%） | 備註 |
| 1 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（77.7%） | |
| 2 | - | 大腸桿菌 | 大腸桿菌（75.6%） | |
| 3 | - | 鮑氏不動桿菌 （ Acinetobacter baumannii） | 鮑氏不動桿菌（62.9%） | |
| 4 | + | 金黃色葡萄球菌 | 金黃色葡萄球菌（53%）/ 大腸桿菌（25%） | MRSA |
| 5 | - | 大腸桿菌 | 大腸桿菌（65.6%） | |
| 6 | + | 金黃色葡萄球菌 | 金黃色葡萄球菌（56%） | MRSA |
| 7 | + | 金黃色葡萄球菌 | 表皮葡萄球菌（ S. epidermidis）（47%）/ 金黃色葡萄球菌（17%）/ 模仿葡萄球菌（ S. simulans）（1.1%）/ 約氏乳酸桿菌（ Lactobacillus johnsonii）（3.2%）/ 尿氣球菌（ Aerococcus urinaeequi）（1.8%）/ 克雷伯氏肺炎菌（1.1%） | MRSA |
| 8 | - | 奇異變形桿菌 （ Proteus mirabilis） | 奇異變形桿菌（58%） | |
| 9 | - | 大腸桿菌 | 大腸桿菌（58%） | |
| 10 | - | 大腸桿菌 | 大腸桿菌（68%） | |
| 11 | - | 大腸桿菌 | 大腸桿菌（92.8%） | |
| 12 | - | 大腸桿菌 | 大腸桿菌（86%）/ 屎腸球菌（ Enterococcus faecium）（1.9%） | |
| 13 | - | 假單胞菌屬 （ Pseudomonas） | 假單胞菌屬BJP69（55%）/ 戀臭假單孢菌（ P. putida）（18.5%）/ 蒙氏假單胞菌（ P. monteilii）（1.4%）/ 綠膿桿菌（ P. aeruginosa）（1.1%）/ 霍氏腸桿菌（ Enterobacter hormaechi）（1.1%） | |
| 14 | + | 表皮葡萄球菌 （ Staphylococcus epidermidis） | 頭狀葡萄球菌（ S. capitis）（47.8%）/ 人葡萄球菌（ S. hominis）（25.5%）/ 金黃色葡萄球菌（1.41%） | |
| 15 | + | 屎腸球菌 （ Enterococcus faecium） | 屎腸球菌（97%） | |
| 16 | - | 鮑氏不動桿菌 | 鮑氏不動桿菌（58.0%） | CR |
| 17 | - | 鮑氏不動桿菌 | 鮑氏不動桿菌（68.8%） | CR |
| 18 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（76.7%）/ 變異克雷伯氏菌（ K. variicola）（1.7%）/ 克雷伯氏擬肺炎菌（ K. quasipneumoniae）（1.2%）/ 大腸桿菌（2.6%） | CR |
| 19 | + | 金黃色葡萄球菌 | 金黃色葡萄球菌（94%） | MRSA |
| 20 | - | 鮑氏不動桿菌 | 鮑氏不動桿菌（67.3%）/ 屎腸球菌（5.0%） | CR |
| 21 | - | 大腸桿菌 | 大腸桿菌（90.4%） | CR |
| 22 | + | 屎腸球菌 | 屎腸球菌（96.5%） | VRE |
| 23 | - | 產氣腸桿菌 （ Klebsiella aerogenes） | 產氣腸桿菌（93%） | CR |
| 24 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏擬肺炎菌（60.9%）/ 克雷伯氏肺炎菌（7.1%） | CR |
| 25 | - | 變異克雷伯氏菌 | 變異克雷伯氏菌（86.9%） | CR |
| 26 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（67.5%）/ 變異克雷伯氏菌（1.4%） | CR |
| 27 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（75.1%）/ 大腸桿菌（2.9%） | CR |
| 28 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（80.6%） | CR |
| 29 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（67.6%）/ 大腸桿菌（2.0%） | CR |
| 30 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（81.8%） | CR |
| 31 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（74.2%）/ 變異克雷伯氏菌（1.1%） | CR |
| 32 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（62.4%）/ 大腸桿菌（1.2%） | CR |
| 33 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（65.3%）/ 大腸桿菌（3.2%） | CR |
| 34 | - | 克雷伯氏肺炎菌 | 克雷伯氏肺炎菌（81.5%）/ 大腸桿菌（3.2%） | CR |
| 35 | Y | 禿髮念珠菌 （ Candida glabrata） | 禿髮念珠菌（55.4%）/ 大腸桿菌（2.2%） | |
| 36 | Y | 白色念珠菌 （ Candida albicans） | 白色念珠菌（51.3%）/ 大腸桿菌（1.2%） |
進一步地，第4、17、19、21、22、29號樣本分別以本揭露方法進行抗藥基因檢測後，結果如圖6所示，可在約2至6小時的定序時間內收集到其個別菌種基因組大小約20倍的覆蓋深度，並可完成其個別菌種所攜帶的所有抗藥基因的鑑定。
另一方面，對於本揭露的方法相對於黃金標準培養及/或用於病原體鑑定的PCR測試的性能準確性評估，則是將中國醫藥大學附設醫院所提供的42名菌血症患者的44份血液樣本先以非目標核酸固相式吸附預處理，然後進行病原體鑑定。
細菌病原體鑑定的結果如下表7所示，其中使用的兩個參考標準為：（1）臨床黃金標準－使用基質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）；以及（2）BIOFIRE血液培養鑑定（BCID2，Filmarray），其為通過美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）、CE-體外診斷醫療器材（CE -
in vitrodiagnostic devices，CE-IVD）和澳洲藥品管理局（Therapeutic Goods Administration，TGA）認證的多重PCR系統，能夠快速準確地自動檢測與血流感染相關的病原體和抗生素抗藥基因。
表7、本揭露方法（即TCDC檢測系統）與參考標準方法（即MALDI-TOF MS及Filmarray BCID2）之間病原體鑑定的比較
*不一致者以文字表示
| MALDI-TOF MS | Filmarray BCID2 平台檢測結果的樣本數量 | TCDC檢測結果的 樣本數量 （經分類讀序＞1%） | ||
| 鑑定種類 | 樣本數量 | |||
| 革蘭氏陰性菌 | 克雷伯氏肺炎菌 | 7 | 7 | 7 |
| 變棲克雷伯菌（ Klebsiella variicola） | 1 | 克雷伯氏肺炎菌 * | 1 | |
| 弗氏檸檬酸桿菌 （ Citrobacter freundii） | 2 | 腸桿菌科 | 2 | |
| 黏質沙雷氏桿菌 （ Serratia marcescens） | 3 | 3 | 3 | |
| 深紅沙雷氏菌（ Serratia rubidaea） | 1 | 腸桿菌科 | 1 | |
| 陰溝腸桿菌（ Enterobacter cloacae） | 1 | 1 | 1 | |
| 奧斯陸莫拉菌（ Moraxella osloensis） | 1 | 0 | 1 | |
| 大腸桿菌 | 11 | 11 | 11 | |
| 綠膿桿菌 | 3 | 3 | 3 | |
| 鮑氏不動桿菌 | 2 | 2 | 2 | |
| 桂林不動桿菌 （ Acinetobacter guillouiae） | 1 | 0 | 1 | |
| 嗜麥芽窄食單胞菌 （ Stenotrophomonas maltophilia） | 1 | 1 | 1 | |
| 總計 | 34 | 28 | 34 | |
| 革蘭氏陽性菌 | 金黃色葡萄球菌 | 1 | 1 | 1 |
| 乙型鏈球菌（Group B Streptococcus） | 1 | 1 | 1 | |
| 屎腸球菌 | 3 | 3 | 3 | |
| 總計 | 5 | 5 | 5 | |
| 多重 菌種 | 大腸桿菌 克雷伯氏肺炎菌 雞腸球菌（ Enterococcus gallinarum） | 1 | 1 | 1 |
| 克雷伯氏肺炎菌 陰溝腸桿菌 | 1 | 1 | 1 | |
| 雞腸球菌 白色念珠菌 | 1 | 1 | 1 | |
| 奇異變形桿菌 克雷伯氏肺炎菌 表皮葡萄球菌 | 1 | 1 | 1 | |
| 產氣腸桿菌 克氏檸檬酸桿菌（ Citrobacter cronae） | 1 | 產氣腸桿菌 大腸桿菌 | 產氣腸桿菌 克氏檸檬酸桿菌 | |
| 總計 | 5 | 4 | 5 |
由上可知，本揭露方法在鑑定無論是革蘭氏陽性、陰性單一菌種或多重菌種樣本的表現均符合預期，與臨床黃金標準的測試結果有100%一致性；舉例而言，標準測試結果顯示44份樣本中有7份樣本的病原體為克雷伯氏肺炎菌，而本揭露方法同樣可檢測出有7份樣本中的病原體為克雷伯氏肺炎菌。
相較之下，由於Filmarray BCID2平台中所設計的引子數量導致可偵測的生物體豐度有限，從結果發現其無法鑑別臨床樣本中的奧斯陸莫拉菌（
Moraxella osloensis）和桂林不動桿菌（
Acinetobacter guillouiae），而針對弗氏檸檬酸桿菌（
Citrobacter freundii）及深紅沙雷氏菌（
Serrita rubidaea）則是無法鑑別至菌種名；此外，對於一個含有變棲克雷伯菌（
Klebsiella variicola）的樣本則鑑別成克雷伯氏肺炎菌。下表8顯示這些檢測結果不一致的樣本經其他方法檢測後的比較結果，並使用奈米孔定序全長16S rRNA序列進行菌種分類確認，其中百分比代表讀序分佈的比例。
表8、以本揭露方法（即TCDC檢測系統）與參考標準方法（即MALDI-TOF MS及奈米孔定序16S rRNA全基因）針對Filmarray BCID2平台無法鑑別病原體的樣本進行病原體鑑定的比較
NA：不適用
| 樣本編號 | MALDI-TOF MS | Filmarray BCID2平台 | 奈米孔定序16S rRNA | TCDC檢測系統 （經分類讀序 ＞ 1%） | ||
| 2-1 | 弗氏檸檬酸桿菌 | 腸桿菌目 | 穆氏檸檬酸桿菌（ Citrobacter murliniae） | 40% | 弗氏檸檬酸桿菌群 -弗氏檸檬酸桿菌 | 90% 53% |
| 吉氏檸檬酸桿菌（ Citrobacter gillenii） | 23% | -葡萄牙檸檬酸桿菌（ Citrobacter portucalensis） | 24% | |||
| 弗氏檸檬酸桿菌 | 18% | -楊格檸檬酸桿菌（ Citrobacter youngae） | 3% | |||
| 布拉格檸檬酸桿菌 （ Citrobacter braakii） | 16% | 大腸桿菌 | 2% | |||
| 4 | 奧斯陸莫拉菌 | NA | 奧斯陸莫拉菌 | 99% | 奧斯陸莫拉菌 | 53% |
| 大腸桿菌 | 2% | |||||
| 11 | 深紅沙雷氏菌 | 腸桿菌目 | 深紅沙雷氏菌 | 97% | 深紅沙雷氏菌 | 91% |
| 12 | 變棲克雷伯菌 | 腸桿菌目 克雷伯氏肺炎菌 | 變棲克雷伯菌 克雷伯氏肺炎菌 | 53% 41% | 變棲克雷伯菌 克雷伯氏肺炎菌 | 85% 2% |
| 13 | 桂林不動桿菌 | NA | 桂林不動桿菌 深紅沙雷氏菌 | 84% 9% | 桂林不動桿菌 | 80% |
44份樣本的檢測統計結果如下表9所示，總體來說，本揭露方法對於革蘭氏陰性、陽性菌樣本的鑑定結果與臨床培養結果相符合，陽性檢出率為100%，而對於混合菌樣本的陽性檢出率亦為100%，具高度的一致性。至於Filmarray BCID2平台則只鑑定出28份樣本為革蘭氏陰性菌，陽性檢出率僅82%，對於混合菌的樣本則為80%。另，本揭露方法對於陰性樣本則無任何的菌株被檢出，且人類基因序列比例皆低於1%，顯示本揭露方法的準確性符合預期。
表9、本揭露方法（即TCDC檢測系統）與Filmarray BCID2平台對照參考標準方法（即微生物培養）的病原體陽性檢出率比較結果
*括號內數字為與微生物培養方法的鑑定結果一致的樣本數
| 病原菌種類鑑定一致性 | |||
| 檢測平台種類 | 單一菌種 | 多重菌種 | |
| 革蘭氏陰性菌：34份樣本 | 革蘭氏陽性菌：5份樣本 | 5份樣本 | |
| Filmarray BCID2 平台 | 82%（28） * | 100%（5） | 80%（4） |
| TCDC 檢測系統 | 100%（34） | 100%（5） | 100%（5） |
細菌所攜帶的抗藥基因的鑑定結果如下表10所示，其中使用的兩個參考標準為：（1）由可用培養物與抗生素敏感性試驗（AST）組成的臨床黃金標準；（2）BIOFIRE BCID2平台（Filmarray），其為通過血流感染認證的多重PCR系統。
表10、本揭露方法（即TCDC檢測系統）與參考標準方法（即微生物培養及Filmarray BCID2）之間的抗微生物藥物抗藥基因的比較
*S：易感；R：抗性；I：中等。**AM：安比西林（ampicillin）；AN：阿米卡星；（amikacin）；CIP：塞普沙辛（ciprofloxacin）；CMZ：頭孢每他唑（cefmetazole）；CTX：頭孢唑肟（cefotaxime）；CZ：頭孢若林（cefazolin）；DAP：達托黴素（daptomycin）；ETP：厄他培南（ertapenem）；FEP：革菌素（cefepime）；GM：建它黴素（gentamicin）；GMS：建它黴素-協同（gentamicin-Syn）；IPM：亞胺培南（imipenem）；LZD：利奈唑胺（linezolid）；LVX：左旋氧氟沙星（levofloxacin）；MEM：美羅培南（meropenem）；P：青黴素（penicillin）；SAM：安比西林-舒巴坦（ampicillin-sulbactam）；SXT：曲美普林/磺胺甲噁唑（trimethoprim/sulfamethoxazole）；TEC：替考拉寧（teicoplanin）；TGC：替加環素（tigecycline）；TZP：必倍西林/達梭黴素（piperacillin/tazobactam）；VA：萬古黴素（vancomycin）。***NA：不適用。****ND：無法檢測。
| 樣本編號 | 微生物培養 | 微生物培養 AST結果** | Filmarray BCID2 | TCDC檢測系統 | ||||||||
| 1 | 克雷伯氏肺炎菌 | S *：TGC、GM、AN、CMZ R：AM、SAM、TZP、CZ、CTX、FEP、CIP、LVX、SXT、MEM、ETP、IPM | CTX-M 類OXA-48 | aadA16、aph（3'）-Ia、aph（6）-Id、aph（3''）-Ib、blaOXA-48、blaSHV-1、blaCTX-M-15、blaTEM-1C、fosA、aac（6'）-Ib-cr、qnrB6、ARR-3、tet（A）、tet（D）、OqxA、OqxB、qacE、dfrA7、dfrA27、sul1、sul2 | ||||||||
| 2-1 | 弗氏檸檬酸桿菌 | S：GM、AN、TZP、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM、SAM、CZ、CMZ | ND **** | blaCMY-124、qnrB13 | ||||||||
| 2-2 | 黏質沙雷氏桿菌 | S：GM、AN、TZP、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM、SAM、CZ、CMZ | ND | aac（6'）-Ic、blaSRT-2、tet（41） | ||||||||
| 3 | 陰溝腸桿菌 | S：TGC、GM、AN、TZP、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、SXT R：AM、SAM、CZ、CMZ、IPM | ND | blaMIR-2、fosA | ||||||||
| 4 | 奧斯陸莫拉菌 | NA *** | ND | aac（6'）-Ib3、blaIMP-26、mph（E）、msr（E）、qacE、sul1 | ||||||||
| 5 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、CMZ、TZP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM、CZ、CTX、FEP I：SAM | ND | tet（B）、mdf（A）、blaCTX-M-3 | ||||||||
| 6 | 大腸桿菌 | S：AN、CIP、LVX R：GM、AM、SAM、TZP、CZ、CMZ、CTX、FEP、SXT、ETP、IPM | KPC VanA/B | aph（6）-Id、aph（3''）-Ib、ant（6）-Ia、aac（3）-IId、aadA1、aadA2、aph（3'）-III、aac（6'）-aph（2''）、aac（6'）-Il、floR、cmlA1、blaTEM-1B、blaSHV-11、blaKPC-2、blaCMY-2、sul2、sul3、dfrA12、fosA、VanHAX、VanC1XY、mdf（A）、erm（42）、msr（C）、tet（A）、tet（L）、tet（M）、tet（S） | ||||||||
| 克雷伯氏肺炎菌 | S：AN、SXT R：GM、AM、SAM、TZP、CZ、CMZ、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM | |||||||||||
| 雞腸球菌 | S：P、GMS、LZD、DAP R：VA、TEC | |||||||||||
| 7 | 金黃色葡萄球菌 | S：CC、VA、TEC、LZD、DAP、D、SXT、DAP、FA R：P、OX、E、CIP I：TE | mecA/C和MREJ（MRSA） | aac（6'）-aph（2''）、aadD、aph（3'）-III、ant（6）-Ia、blaZ、mecA、lnu（A）、mph（C）、msr（A）、qacA、tet（K） | ||||||||
| 8 | 綠膿桿菌 | S：AN、CAZ、FEP、 R：GM、CIP、LVX、IPM、TZP、SXT | ND | aadA3、aac（6'）-Ib3、aph（3'）-IIb、blaCARB-2、blaPAO、blaOXA-494、fosA、sul1、qacE、crpP、catB7 | ||||||||
| 9 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、SAM、CZ、CMZ、TZP、CTX、ETP、IPM、FEP R：AM、CIP、LVX、SXT | ND | tet（A）、aph（6）-Id、aph（3''）-Ib、blaTEM-1B、aadA5、sul1、sul2、mph（A）、qacE、dfrA17、mdf（A） | ||||||||
| 10 | 克雷伯氏肺炎菌 | S：TGC、GM、AN、CMZ、SAM、TZP、CZ、CTX、FEP、CIP、LVX、SXT、MEM、ETP、IPM R：AM | ND | blaOKP-B-2、blaACT-6、OqxA、OqxB、fosA | ||||||||
| 陰溝腸桿菌 | S：TGC、GM、AN、TZP、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM、SAM、CZ、CMZ | |||||||||||
| 11 | 深紅沙雷氏菌 | S：GM、AN、TZP、CMZ、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM、SAM、CZ | ND | ND | ||||||||
| 12 | 變棲克雷伯菌 | S：GM、AN、TZP、SAM、CZ、CMZ、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM | ND | blaLEN22、fosA、OqxA、OqxB | ||||||||
| 13 | 桂林不動桿菌 | S：TGC R：SAM、GM、CIP、LVX、CAZ、FEP、IPM、MEM、TZP、SXT I：AN | ND | aph（3'）-VI、aph（3'）-VIb、aph（3'）-Ia、aac（3）-IId、aph（6）-Id、blaNDM-1、blaOXA-274、blaOXA-58、tet（39）、sul2 | ||||||||
| 14 | 黏質沙雷氏桿菌 | S：SXT R：AM、SAM、CZ、CMZ、GM、TZP、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM I：AN | VIM | aac（6'）-Ic、ant（2''）-Ia、aac（6'）-Ib3、aph（3'）-Ia、blaSRT-2、blaVIM-1、blaOXA-10、qnrS1、tet（41）、sul1、qacE、catB3 | ||||||||
| 15 | 克雷伯氏肺炎菌 | S：TGC、GM、AN R：AM、SAM、TZP、CZ、CMZ、CTX、FEP、CIP、LVX、SXT、MEM、ETP、IPM | CTX-M KPC | aph（6）-Id、aph（3''）-Ib、blaTEM-67、blaCTX-M-14、blaCTX-M-65、blaKPC-2、blaSHV-11、tet（A）、sul2、fosA | ||||||||
| 16 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、SAM、CMZ、TZP、ETP、IPM、SXT R：AM、CZ、CTX、FEP、CIP、LVX | CTX-M | aph（6）-Id、aph（3''）-Ib、blaCTX-M-27、mph（A）、sul1、sul2、tet（A）、qacE、mdf（A） | ||||||||
| 17 | 克雷伯氏肺炎菌 | S：GM、AN、TZP、SAM、CZ、CMZ、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM | ND | blaSHV-1、OqxA、OqxB、fosA | ||||||||
| 18 | 綠膿桿菌 | S：AN、CAZ、FEP、GM、CIP、LVX、IPM、TZP R：SXT | ND | aph（3'）-IIb、blaPAO、blaOXA-488、catB7、fosA | ||||||||
| 19 | 黏質沙雷氏桿菌 | S：SXT、CMZ、GM、TZP、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP R：AM、AN、SAM、CZ I：IPM | ND | aac（6'）-Ic、blaSRT-2、tet（41） | ||||||||
| 20 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、CMZ、TZP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM、CZ、CTX、FEP I：SAM | CTX-M | blaTEM-1B、blaCTX-M-27、mdf（A） | ||||||||
| 21 | 乙型鏈球菌 | S：P、VA R：CC | ND | aph（3'）-lll、ant（6）-Ia、erm（B）、mre（A）、tet（M） | ||||||||
| 22-1 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、CMZ、TZP、CTX、FEP、ETP、IPM、SXT R：AM、CIP、LVX I：SAM、CZ | ND | blaTEM-1B、mdf（A） | ||||||||
| 22-2 | 綠膿桿菌 | S：AN、CAZ、FEP、GM、CIP、LVX、TZP R：IPM、MEM、SXT | VanA/B | aph（3'）-llb、blaIPO、blaOXA-50、catB7、crpP、fosA | ||||||||
| 23 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、CMZ、TZP、、CZ、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM R：AM、SXT I：SAM | ND | aph（3''）-lb、aph（6）-ld、blaTEM-1B、dfrA14、mdf（A）、sul2 | ||||||||
| 24 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、CMZ、TZP、CZ、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM I：SAM | ND | blaTEM-1B、mdf（A）、tet（B） | ||||||||
| 25 | 大腸桿菌 | S：AN、CMZ、TZP、CZ、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：GM、AM I：SAM | ND | blaTEM-1B、aac（3）-lld、mdf（A） | ||||||||
| 26 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、CMZ、TZP、CZ、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT、AM、SAM | ND | mdf（A） | ||||||||
| 27 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、TZP、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM、SAM、CZ、CMZ、CTX | ND | aph（6）-ld、aph（3''）-lb、blaCMY-2、mdf（A）、tet（A）、sul2、floR | ||||||||
| 28 | 克雷伯氏肺炎菌 | S：TGC、GM、AN、CMZ、SAM、TZP、CZ、CTX、FEP、CIP、LVX、SXT、MEM、ETP、IPM R：AM | ND | blaSHV-11、fosA、OqxA、OqxB | ||||||||
| 29 | 克雷伯氏肺炎菌 | S：TGC R：GM、AN、CMZ、AM、SAM、TZP、CZ、CTX、FEP、CIP、LVX、SXT、MEM、ETP、IPM | CTX-M KPC NDM | aac（3）-lld、aph（3''）-lb、aph（6）-ld、aadA1、rmtB、aac（6'）-lb-cr、catB3、blaTEM-67、blaCTX-M-14、blaSHV-11、blaTEM-1B、blaOXA-1、blaNDM-1、blaKPC-2、dfrA14、sul1、sul2、fosA、qacE、qnrB1、tet（A） | ||||||||
| 30 | 屎腸球菌 白色念珠菌 | S：LZD、GMS R：P、VA、TEC I：DAP | VanA/B | aac（6'）-aph（2''）、aac（6''）-li、aph（3'）-lll、ant（6）-la、dfrG、VanHAX、msr（C）、tet（M）、tet（L） | ||||||||
| 31-1 | 屎腸球菌 | S：LZD R：P、GMS、VA、TEC I：DAP | VanA/B | VanHAX、aac（6'）-Ii、msr（C）、dfrG、erm（B）、ant（6）-Ia、aac（6'）-aph（2''）、cat（pC194）、aph（3'）-III、ant（6）-Ia | ||||||||
| 31-2 | 產氣克雷伯氏菌 | S：GM、AN、TZP、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT R：AM、SAM、CZ I：CMZ | FosA | |||||||||
| 32 | 奇異變形桿菌 克雷伯氏肺炎菌 表皮葡萄球菌 | S：CMZ、AM、SAM、GM、AN、TZP、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM R：SXT I：CZ | mecA/C | aph（6）-Id、aph（3''）-Ib、aadA2、aac（3）-IId、aph（3'）-Ia、aac（6'）-aph（2''）、aadD、aph（3'）-IIIa、ant（6）-Ia、cat、floR、cat（pC221）、OqxA、OqxB、blaDHA-1、blaTEM-1B、blaSHV-11、blaZ、sul1、sul2、dfrA1、fosA、vga（A）LC、mph（A）、erm（C）、qacA、qnrB4、tet（A） | ||||||||
| S：AN、TZP、FEP、CIP、LVX、SXT、MEM、ETP、IPM R：GM、AM、SAM、CZ、CTX、CMZ | ||||||||||||
| 33 | 大腸桿菌 | S：GM、AN、TZP、CMZ、SXT、ETP、IPM R：AM、SAM、CZ、CIP、LVX、CTX、FEP | CTX-M | blaCTX-M-55、mdf（A） | ||||||||
| 34 | 克雷伯氏肺炎菌 | S：TGC、AN、FEP、CIP、LVX、IPM R：CMZ、AM、SAM、TZP、CZ、CTX、SXT I：GM、ETP | ND | aph（3'）-Ia、aadA2、aac（3）-IId、aph（6）-Id、floR、blaSHV-65、blaTEM-1B、blaDHA-1、sul1、sul2、dfrA12、fosA、mph（A）、qacE、qnrB4、OqxA、OqxB | ||||||||
| 35 | 克雷伯氏肺炎菌 | S：TGC、AN、SXT R：GM、CMZ、AM、SAM、TZP、CZ、CTX、MEM、ETP、IPM、FEP、CIP、LVX | CTX-M KPC | aph（6）-Id、aph（3''）-Ib、aac（3）-IId、blaKPC-2、blaSHV-11、blaTEM-1B、blaCTX-M-14、sul2、fosA | ||||||||
| 36 | 鮑氏不動桿菌 | R：SAM、AN、LVX、FEP、GM、CIP、CAZ、IPM、MEM、TZP、SXT I：TGC | ND | armA、aadA1、aac（6'）-Ib3、aph（3'）-Ia、aph（6）-Id、aph（3''）-Ib、aadA24、aac（3）-Ia、catB8、blaADC-25、blaOXA-23、blaTEM-1D、blaOXA-66、sul1、mph（E）、msr（E）、qacE、tet（B） | ||||||||
| 37 | 克氏檸檬酸桿菌 | S：GM、SAM、AN、TZP、CTX、FEP、CIP、LVX、ETP、IPM、SXT、CMZ、CZ R：AM | ND | blaCKO-1 | ||||||||
| 38 | 鮑氏不動桿菌 | R：SAM、AN、LVX、FEP、GM、CIP、CAZ、IPM、MEM、TZP、SXT I：TGC | ND | aph（3'）-Ia、aadA1、aac（3）-Ia、armA、aac（6'）-Ib3、aph（6）-Id、aph（3''）-Ib、catB8、blaOXA-23、blaOXA-66、blaTEM-1D、blaADC-25、sul1、mph（E）、msr（E）、qacE、tet（B） | ||||||||
| 39 | 頭狀葡萄球菌 | NA | mecA/C | aac（6'）-aph（2''）、aadD、mecA、blaZ、fosB、erm（C）、qacA、fusB | ||||||||
| 40 | 嗜麥芽窄食單胞菌 | S：LVX、MI、SXT R：CAZ | ND | aph（3''）-IlC、aac（6'）-lz | ||||||||
| 41 | 屎腸球菌 | S：GMS、LZD R：P、VA、TEC I：DAP | VanA/B | aph（3'）-lll、ant（6）-Ia、aac（6'）-li、Inu（B）、Isa（E）、dfrG、VanHAX、msr（C）、tet（M）、tet（L） |
根據上表10的鑑定結果，下表11進一步顯示以傳統檢測為基準，使用本揭露方法所檢測的樣本分別與對AmpC β-內醯胺酶（AmpC β-lactamase）、超廣效β-內醯胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）、碳青黴烯抗藥性（carbapenem-resistant）、抗萬古黴素腸球菌屬（VRE）、抗甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等具有較強的抗生素抗藥性的樣本進行比較。具體而言，經由傳統抗生素敏感性試驗（AST）記錄到44份樣本中有6個是對AmpC β-內醯胺酶具有抗性、7個是對超廣效β-內醯胺酶具有抗性、12個具有碳青黴烯抗藥性、4個是抗萬古黴素腸球菌屬以及1個是抗甲氧西林金黃色葡萄球菌。本揭露方法在此樣本的質體中鑑定出359個抗藥基因及其染色體上的抗藥性相關突變，鑑定率皆為100%。在此等抗藥基因及突變中，Filmarray BCID2平台僅檢測到23個抗藥基因，而未能進一步分析此等抗藥基因的亞型，其鑑定率分別為0%、43%、50%、100%、100%。
表11、本揭露方法（即TCDC檢測系統）與 Filmarray BCID2平台之間的抗微生物藥物抗藥性（antimicrobial resistance，AMR）的統計
*括弧內數字代表與藥敏測試一致的抗藥性菌株數目 / 總樣本數
| 抗藥性預測率 | ||||||
| 抗藥基因數量 | AmpCβ-內醯胺酶 | ESBL | 碳青黴烯抗藥性 | VRE | MRSA | |
| Filmarray BCID2平台 | 23 | 0% （0/6） * | 43% （3/7） | 50% （6/12） | 100% （4/4） | 100% （1/1） |
| TCDC檢測系統 | 359 | 100% （6/6） | 100% （7/7） | 100% （12/12） | 100% （4/4） | 100 （1/1） |
此等結果表明，本揭露的系統與方法能用於快速進行病原體種類的鑑定，且能在2至4小時的定序時間內獲得足以進行抗藥基因鑑定所需的20倍覆蓋率的序列，用以進行基因組組裝及精準預測抗生素敏感性。綜上所述，本揭露的系統與方法藉由採用固相式吸附，可從血液培養樣本中去除人類或其他來源的非目標核酸，用以獲得高純度的細菌DNA。經萃取的高純度細菌DNA可用於奈米孔定序平台進行快速定序，以生成長序列讀序，因而能夠快速取得足夠組裝細菌基因組的核酸序列覆蓋深度，再經由即時生物資訊的分析流程，完整鑑定出細菌種類及其所攜帶的抗微生物藥物抗藥基因。
一般而言，微生物培養後進行抗生素敏感性試驗（AST）需要3天以上的周轉時間（圖7），相較之下，經本揭露的固相式吸附預處理2小時的血液培養檢體可用於奈米孔定序，2至6小時內即可鑑定出其中的病原菌及其所攜帶的抗藥基因。換言之，透過本揭露的系統與方法，在血液培養陽性訊號出現後4至10小時之內即可獲得所需的資訊來選擇合適的抗生素。此外，與GeneXpert、FilmArray等市售的快速檢測系統相比，本揭露的系統與方法可用於鑑定相對較大範圍的已知細菌種類及抗藥基因，顯示其增加的鑑定應用性。
因此，本揭露提供鑑定病原體物種與抗藥基因的快速檢測平台，可即時向醫療人員提供相關資訊以用於精準選擇有效的抗微生物藥物，從而有助於提高疾病的治癒率，並降低無效用藥所導致的抗藥性菌株的出現及傳播。
對所屬技術領域中具有通常知識者來說顯而易見的是，隨著技術的進步，可以各種方式實現本揭露的基本概念。因此，實施例並不限於上述示例；相反地，在不違背本揭露的範圍下可有多種變化。
以上描述的實施例可以彼此任意地組合使用。數個實施例可以組合在一起以形成另一個實施例。本揭露的系統與方法可以包括上述實施例中的至少一個。應當理解，上述益處和優點可以涉及一個實施例或數個實施例。本揭露範圍的實施例不限於解決任何或所有所述問題的實施例或具有任何或所有所述益處和優點的實施例。
10:檢測系統
100:細胞裂解單元
101:容器
102:非離子性界面活性劑
200:目標核酸富集單元
201:固相式核酸吸附裝置
202:核酸萃取裝置
300:定序編碼單元
301:DNA文庫製備套組
302:定序儀
400:序列分析比對單元
401:微生物鑑定模組
402:抗藥基因鑑定模組
S1、S2、S3、S4:用於鑑定樣本中目標微生物的檢測系統的運作流程步驟
為了充分理解本揭露，應結合附圖參照以下詳細描述。
圖1為本揭露的至少一具體實施例的檢測系統的示意圖。
圖2為透過本揭露的至少一具體實施例的檢測系統所進行的微生物核酸富集流程示意圖。
圖3為本揭露的至少一具體實施例的檢測系統的運作流程圖。
圖4A及圖4B分別為針對含有克雷伯氏肺炎菌（
Klebsiella pneumoniae）（圖4A）或金黃色葡萄球菌（
Staphylococcus aureus）（圖4B）的血液培養樣本，使用本揭露的方法或市售套組進行預處理後，該等樣本中宿主核酸及目標細菌核酸的比例分佈圖。Ctrl：對照組，不進行預處理；Molysis：MolYsis Basic 5套組；NEB：NEBNext微生物基因體DNA富集套組；QiaBB：QIAamp BiOstic菌血症DNA套組；TCDC：本揭露的方法。
圖5A和圖5B分別顯示針對含有克雷伯氏肺炎菌（圖5A）或金黃色葡萄球菌（圖5B）的血液培養樣本，使用本揭露的方法或市售套組進行預處理後，該等樣本的奈米孔讀取時間與所鑑定出的抗藥基因數量之間的關係。Ctrl：對照組；NEB：NEBNext微生物基因體DNA富集套組；QiAamp BB：QIAamp BiOstic菌血症DNA套組；TCDC：本揭露的方法。
圖6顯示臨床樣本經本揭露的方法進行預處理後，該等樣本的奈米孔讀取時間與所鑑定出的抗藥基因數量之間的關係。
圖7顯示傳統血液培養、Filmarray檢測平台、次世代總體基因組定序和本揭露的方法（TCDC）所需的週轉時間的比較。
10:檢測系統
100:細胞裂解單元
101:容器
102:非離子性界面活性劑
200:目標核酸富集單元
201:固相式核酸吸附裝置
202:核酸萃取裝置
300:定序編碼單元
301:DNA文庫製備套組
302:定序儀
400:序列分析比對單元
401:微生物鑑定模組
402:抗藥基因鑑定模組
Claims (8)
- 一種用於鑑定樣本中目標微生物及/或抗藥基因的檢測系統，包括：細胞裂解單元，用以裂解該樣本中的非目標細胞，其中，該目標微生物與該非目標細胞源自不同物種，以及該細胞裂解單元包含選自由皂素、聚氧乙烯(10)油基醚、多元醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯、聚氧乙烯醚、烷基乙醇醯胺、葡萄糖苷、脂肪醇及其任意組合所組成群組的非離子性界面活性劑；目標核酸富集單元，其包含固相式核酸吸附裝置，用以移除經細胞裂解後的該非目標細胞的核酸，從而富集該樣本中的該目標微生物的核酸；定序編碼單元，用以對該樣本中該目標微生物的該核酸的序列進行解碼；以及序列分析比對單元，其與該定序編碼單元連接，用以接受該定序編碼單元所產生的解碼數據，並將該解碼數據與微生物基因資料庫及/或抗藥基因資料庫進行比對，以取得該目標微生物及/或其所攜帶的抗藥基因的鑑定結果。
- 如請求項1所述的檢測系統，其中，該固相式核酸吸附裝置包含選自由矽玻璃珠、含矽磁珠、管柱萃取濾膜、烷基鍵合矽膠、生物炭、纖維素、陰離子交換樹脂及其任意組合所組成群組的固相吸附劑。
- 一種用於富集樣本中目標核酸的方法，包括：提供含有目標微生物和非目標細胞的樣本，其中，該目標微生物和該非目標細胞源自不同物種；藉由檢測系統的細胞裂解單元，添加非離子性界面活性劑至該樣本中，選擇性地使該樣本中的該非目標細胞裂解並釋出其所含有的非目標核酸，其 中，該非離子性界面活性劑選自由皂素、聚氧乙烯(10)油基醚、多元醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯、聚氧乙烯醚、烷基乙醇醯胺、葡萄糖苷、脂肪醇及其任意組合所組成的群組；以及藉由該檢測系統的目標核酸富集單元，移除該非目標核酸，從而富集該樣本中的該目標微生物所含有的該目標核酸。
- 如請求項3所述的方法，其中，該目標核酸富集單元包含具有固相吸附劑的固相式核酸吸附裝置，以及該非目標核酸的移除包括：使該樣本與該固相吸附劑接觸，以使該非目標核酸與該固相吸附劑結合；以及移除該固相吸附劑，從而富集該目標核酸。
- 如請求項3所述的方法，其中，該樣本為選自由血液、血清、血漿、尿液、痰液、唾液、腦脊液、間質液、黏液、汗液、糞便萃取物、糞便、滑液、眼淚、精液、腹膜液、乳頭抽吸液、乳汁、陰道液及其任意組合所組成群組的生物樣本，或為選自由灰塵、土壤、水、空氣、人工水系統、食物及其任意組合所組成群組的環境樣本。
- 一種用於鑑定目標微生物及/或抗藥基因的方法，包括：提供經請求項3所述的方法所富集的該目標核酸，其中，經富集的該目標核酸具有至少2,000個核苷酸的長度；藉由定序檢測對經富集的該目標核酸的序列進行解碼，以取得解碼數據；以及將該解碼數據與微生物基因資料庫及/或抗藥基因資料庫進行比對，以取得該目標微生物及/或其所攜帶的該抗藥基因的鑑定結果。
- 如請求項6所述的方法，其中，該定序檢測選自由次世代定序檢測、高通量定序檢測、奈米孔定序檢測、PacBio定序檢測、桑格定序檢測及其任意組合所組成的群組。
- 如請求項6所述的方法，其中，該目標核酸的序列解碼包括藉由該定序檢測產生該目標微生物的基因組大小至少20倍的基因組覆蓋深度的解碼數據。
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| CN113564227A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-10-29 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法 |
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2022
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