TWI850037B

TWI850037B - LincRNA-p21及其用途

Info

Publication number: TWI850037B
Application number: TW112128204A
Authority: TW
Inventors: 黃偉謙; 何宥豪; 魏雅鈴; 姚俊旭; 周德陽
Original assignee: 中國醫藥大學
Priority date: 2022-08-02
Filing date: 2023-07-27
Publication date: 2024-07-21
Also published as: JP2025527230A; TW202412819A; WO2024027547A1; AU2023319212A1; CN120457207A; TW202508605A; EP4565700A1

Abstract

本發明提供一種用於治療癌症的組合物，其包含一DDB2抑制劑以及一化療劑，其中該DDB2抑制劑包含來自lincRNA-p21的三個RNA片段。此外，該DDB2抑制劑能增強該癌症對該化療劑的化學敏感性，用於治療對化療無反應的癌症。

Description

LincRNA-p21及其用途

本發明係關於一用於治療癌症的組合物，其中該組合物包含來自lincRNA-p21的三個RNA序列片段以及一化療劑。特別是，該具有DDB2靶向活性的lincRNA-p21之三個RNA序列片段能提高多種癌症對化療劑的敏感性。

針對化療劑的治療所引起的DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)會活化p53以轉錄調控基因表現，其能決定細胞走向老化、細胞週期進展、細胞凋亡或DNA修復的命運。在癌細胞中透過核苷酸切除修復作用(nucleotide excision repair，NER)、鹼基切除修復(base excision repair，BER)、同源重組(homologous recombination，HR)或非同源性末端接合(non-homologous end joining，NHEJ)來實現高度DNA修復活性有助於化療的抗藥性發展。靶向各種DDR或DNA修復的成分已被視為有希望的癌症治療策略。BRCA1/2突變腫瘤對多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)的抑制具有高度敏感性進而導致PARP抑制劑在臨床治療上的成功。因此，透過共同靶向各種DNA修復/DDR路徑來實現加成性致死，為開發新穎且潛在的臨床策略提供了範例。

在DNA修復機制中，NER在順鉑(cisplatin)或阿黴素 (doxorubicin)所誘發的DNA損傷之移除上具有關鍵作用。在化療的刺激下，受損的DNA結合蛋白2(damaged DNA-binding protein 2，DDB2)會因p53的活化而上調來成為識別受損DNA的第一個蛋白質。接著，與DNA結合的DDB2會被多泛素化以及蛋白酶體降解，並將受損的DNA位點轉移給第二個識別蛋白XPC，以進一步招募參與NER的其他DNA修復蛋白。DDB2表現是由DNA損傷劑(包括阿黴素)所誘導，並導致化療抗性(chemoresistance)。DDB2的突變或缺陷會降低對受損DNA的識別以及NER相關蛋白的募集，從而導致DNA修復失敗。此外，PARP1也被報導能透過相互作用以穩定DDB2蛋白表現來促進NER功效。透過抑制DDB2能破壞Rad51的穩定性以增加三陰性乳癌對PARP抑制劑的細胞敏感性，這表明DDB2還具有額外的角色來調控HR。除了DNA修復以外，DDB2活性還發生在腫瘤進展的幾個階段，包括癌細胞增生、存活、上皮間質轉化、遷移和侵襲、以及癌症幹細胞的形成。因此，靶向DDB2是提高化療的化學敏感性以及增加PARP抑制劑的抗癌活性的潛在策略。然而，目前還沒有可用於癌症治療的DDB2抑制劑或調節劑。

儘管核酸療法也可以應用於癌症的治療，但RNA的穩定性、遞送效率以及結構的議題仍然是一個問題，並且RNA療法在治療癌症的策略方面仍然落後於其他療法。

由於大多數長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)的長度至少為200nt，使用lncRNA作為RNA療法的治療策略是相當困難的。因此，lncRNA在臨床實踐中很少受到關注與應用，且多數的lneRNA被認為是疾病標記物而不是治療藥物。

本發明已證明在表現mutp53的乳癌細胞株與臨床樣本的不同亞型中lincRNA-p21和DDB2之間存在負相關。增加的lincRNA-p21會藉由做為Cul-4/DDB1/DDB2 E3接合酶複合物的支架來增強DDB2的多泛素化(poly-ubiquitination)以及蛋白酶體降解。LincRNA-p21下調DDB2被證明可以抑制DNA修復。更重要的是，lincRNA-p21的三個必需序列片段，其包含5’-CUUGU-GUCCCCUUCCCACAG-3’(671nt-690nt；#3)(SEQ ID NO：1)；5’-CAGGGAACCCCUUCAAUCCC-3’(875nt-894nt；#4)(SEQ ID NO：2)；以及5’-UGGGAGCCCCCUUCCUAAAA-3’(2,158nt-2,177nt；#9)(SEQ ID NO：3)，已在不同的結合實驗中驗證可與DDB2蛋白直接相互作用與抑制。結構結合能力的計算也揭露lincRNA-p21短序列片段會影響DDB2的穩定性以及DNA修復的可能性。實驗發現，lincRNA-p21短序列片段或是含有lincRNA-p21短序列片段的外泌體一起合併處理可增強癌細胞中化療所誘發的細胞毒性。

LincRNA-p21短序列片段，可使用外泌體做為遞送系統，其功能為基於lncRNA的DDB2抑制劑，顯示出增強化療敏感性的潛力，並且可能有益於對化療無反應的乳癌或其他癌症類型的患者。

如本文所使用的，術語「一」或「一個」用於描述本發明的元件和組件。這樣做只是為了方便並且給出本發明的一般意義。此描述應被理解為包括一個或至少一個，單數也包括複數，除非明顯有其他意義。

本文所使用的術語「或」可以表示「及/或」。

本發明提供一種核酸分子，其包含一長鏈非編碼RNA-p21(long intergenic non-coding RNA-p21，lincRNA-p21)的序列，其中該lincRNA-p21序列是選自於由CUUGUGUCCCCUUCCCACAG(SEQ ID NO：1)、CAGGGAACCCCUUCAAUCCC(SEQ ID NO：2)以及UGGGAGCCCCCUUCCUAAAA(SEQ ID NO：3)所組成的群組。

本發明也提供一種組合物，其包含一lincRNA-p21的序列，其中該lincRNA-p21的序列是選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3所組成的群組。

此外，本發明進一步提供一種治療癌症的方法，包含向一患有癌症的個體施予一組合物，其中該組合物包含一lincRNA-p21的序列以及一化療劑(chemotherapeutic agent)，其中該lincRNA-p21的序列是選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3所組成的群組。

本發明提供一種組合物用於製備治療癌症之藥物的用途，其中該組合物包含一lincRNA-p21的序列以及一化療劑，其中該lincRNA-p21的序列是選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3所組成的群組。

本發明也提供一種用於治療癌症的組合物，其中該組合物包含一lincRNA-p21的序列以及一化療劑，其中該lincRNA-p21的序列是選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3所組成的群組。

本文所使用的術語「個體」是指動物，尤其是哺乳動物。在一較佳的具體實施例中，該個體為人類。

受損的DNA結合蛋白2(DDB2)是識別DNA損傷以啟動DNA修復並使癌細胞對化療劑產生抗性的重要蛋白質。在本發明中，來自lincRNA-p21的三個短序列片段會干擾DNA損傷修復路徑。此外，lincRNA-p21的序列片段能夠抑制DDB2執行的DNA修復，進而增強化療劑的抗癌效果。因此，該lincRNA-p21的序列片段抑制DDB2的表現以逆轉或降低癌細胞對化療劑的抗性及/或增強癌細胞對化療劑的敏感性。在一具體實施例中，該lincRNA-p21的序列片段透過抑制DDB2的表現來增強該癌症對該化療劑的敏感性。是以，DDB2可以被確定為癌症的治療標靶。在一具體實施例中，該癌症包含具有DDB2高度表現的癌症。在本發明中，該DDB2高度表現的癌症是指腫瘤組織中的DDB2表現量比正常組織的DDB2表現量高出1.5倍以上。在另一具體實施例中，該癌症對該化療劑有較差的反應或抗藥性。在一較佳的具體實施例中，該具有DDB2高度表現的癌症對化療劑有較差的反應或抗藥性。

在某些方面，該化療劑是一抗癌藥物。在一具體實施例中，該癌症為具有抗藥性的癌症。因此，該癌症對化療劑具有抗藥性。在本發明中，提供一種方法來降低用於治療癌症之化療劑的抗藥性，包含向一具有抗藥性的癌症個體施予一組合物，其中該組合物包含一lincRNA-p21的序列與一化療劑，其中該lincRNA-p21的序列是選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3所組成的群組。該lincRNA-p21的序列可以逆轉或降低癌細胞對化療劑的抗性及/或增強癌細胞對化療劑的敏感性。

術語「治療」涵蓋但不限於降低、抑制或限制癌細胞的生長，降低、抑制或限制癌細胞的轉移或癌細胞的侵襲轉移，或降低、抑制或限制癌症或其轉移的一種或多種症狀。

在一具體實施例中，該癌症包含乳癌(breast cancer)、肝癌(liver cancer)、膽管癌(cholangiocarcinoma)、肺癌(lung cancer)、大腸癌(colon cancer)、頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma)、胃癌(stomach adenocarcinoma)和食道癌(esophageal carcinoma)。在一較佳的具體實施例中，該癌症包含乳癌與肝癌。在一更佳的具體實施例中，該癌症包含乳癌。

在另一具體實施例中，該癌症的癌細胞具有p53突變。在一較佳的具體實施例中，該乳癌的癌細胞具有p53突變。在一更佳的具體實施例中，該乳癌的癌細胞為雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性並且具有p53突變。

在一具體實施例中，該乳癌對該化療劑具有較差的反應或抗藥性。

如本文所用，該化療劑是一種可以抑制癌細胞或腫瘤生長的化合物。應理解為，一種或多種化療劑都可以用於本文提出的任何方法。例如，兩種或更多種化療劑、三種或更多種化療劑、四種或更多種化療劑等都可用於本文提供的方法。示例性的化療劑包括但不限於抗癌化合物，例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿黴素(doxorubicin)、5-氟尿略啶(5-fluorouracil)、多烯紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、胺甲葉酸(methotrexate)、泛艾黴素(epirubicin)、順鉑(cisplatin)、卡鉑 (carboplatin)、溫諾平(vinorelbine)、凱希得平(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、易莎平(isabepilone)、賀樂維(eribulin)、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、氮芥子氣(nitrogen mustard)、硫芥子氣(sulfur mustard)、四硝酸鉑(platin tetranitrate)、長春花鹼(vinblastine)、依妥普賽(etoposide)、喜樹鹼(camptothecin)、拓樸異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitors)、以及其衍生物，或一種或多種組合。在一具體實施例中，該化療劑包含卡鉑、順鉑或阿黴素。

在某些方面，該lincRNA-p21的序列片段能有效增強該化療劑的治療效果。如本文所用，術語「增強治療效果」包括顯示如本文所討論的所治療的病況的有益反應或改善的許多主觀或客觀條件中的任何因素。例如，增強化療劑的治療效果包括逆轉或降低癌細胞抗藥性及/或增強抗藥性癌症對化療劑治療的敏感性。另外，例如，增強化療劑的治療效果包括改變抗藥性癌細胞，使得細胞對化療劑不產生抗藥性。另外，例如，增強化療劑的治療效果包括附加地或協同地改善或增加化療劑的活性。

在本發明中，該組合物包含一或多種lincRNA-p21序列片段以及一或多種化療劑。在一具體實施例中，該組合物進一步包含一醫藥上可接受之載體。術語「載體」是指當與化合物或組合物組合時幫助或促進化合物或組合物的製備、儲存、施予、遞送、有效性、選擇性或任何其他特色以達到其預期用途或目的之化合物、組合物、物質或結構。在其他具體實施例中，該醫藥上可接受的載體包含微脂體(liposome)、奈米顆粒(nanoparticle)、外泌體(exosome)、微胞(micelle)、聚合物基質(polymeric matrix)或凝膠基質(gel matrix)。在本發明中，該lincRNA- p21的序列片段被包含在微脂體、奈米顆粒、外泌體、微胞、聚合物基質或凝膠基質中，與微脂體、奈米顆粒、外泌體、微胞、聚合物基質或凝膠基質形成複合物。在一具體實施例中，該醫藥上可接受的載體包含微脂體或外泌體。

在本發明中，該lincRNA-p21的序列片段能夠被裝載至該外泌體中。在另一具體實施例中，該醫藥上可接受的載體包含外泌體，其中該外泌體包含該lincRNA-p21的序列片段。含有該lincRNA-p21的序列片段之外泌體被製備用於治療癌症。此外，該外泌體可與抗人類白血球抗原G(human leukocyte antigen G，HLAG)抗體結合形成抗HLAG外泌體。由於HLAG在多種癌症中都有高度表現，因此使用抗HLAG抗體是為了提高含有該lincRNA-p21的序列片段之外泌體與該化療劑對癌細胞的遞送效率。在一具體實施例中，該組合物進一步包含一用於結合癌細胞上的生物標記之靶向分子。在一較佳的具體實施例中，該靶向分子包含一抗HLAG抗體。因此，該抗HLAG抗體可以與該lincRNA-p21的序列片段或該外泌體結合以形成用於治療癌症的治療複合物。

在本文提供的方法中，該lincRNA-p21的序列片段可以在該化療劑施予該個體之前、同時或之後施予。此外，本發明的組合物可以透過多種途徑中的任何一種進行施予，包括：經由注射(例如，皮下、肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內)、經由連續靜脈輸液、經皮、皮下、透皮、口服(如錠劑、丸劑、液體藥物、可食用軟片條(film strip))、植入滲透泵、栓劑或氣溶膠噴灑。施予途徑包括但不限於局部、皮內、鞘內、病灶內、腫瘤內、膀胱內、陰道內、眼內、直腸內、膀胱內、肺內、顱內、心臟室內、脊柱內、真皮、皮下、關節內、放置體腔內、鼻吸入、肺部吸入、壓入皮膚及電穿孔。施予可以是全身的或局部的。醫藥組合物可以局部遞送至需要治療的區域，例如局部施用或局部注射。也可以使用多次施予及/或劑量。

在本發明中，向該個體施予一治療有效量的含有lincRNA-p21的序列片段以及化療劑之組合物。術語「治療有效量」的定義為產生生理反應所需的任何量。施予的劑量範圍是足夠大到來產生所需效果的劑量範圍，其中疾病或病症的一種或多種症狀會受到影響(例如，減輕或延遲)。劑量不應太大以致引起顯著的不良副作用，例如不想要的交叉反應、過敏反應等。

該lincRNA-p21的序列片段或該化療劑的劑量通常在約0.0001、0.001或0.01mg/kg/天至約1000mg/kg/天的範圍內，但可以更高或更低，其取決於除了其他因素外，組合物的活性、其生物可利用性、施予方式以及上述討論的各種因素。劑量與間隔可單獨調整以提供足以維持治療或預防效果的外泌體之局部及/或全身濃度。例如，該組合物的施予可以每週一次、每週數次(例如每隔一天)、每天一次或每天數次，這取決於除了其他事項外，施予方式、正在治療的特定適應症以及處方醫生的判斷。熟練的技術人員將能夠優化有效的局部劑量，而無需過度實驗。在一具體實施例中，該組合物的治療有效量之範圍為0.01至100mg/公斤體重。在一較佳的具體實施例中，該組合物的治療有效量之範圍為0.1至50mg/公斤體重。在一更佳的具體實施例中，該組合物的治療有效量之範圍為1至10mg/公斤體重。

因此，化療抗藥性是各種癌症於臨床治療所面臨的主要問題。其中，DDB2蛋白所誘導的DNA修復是癌細胞為何對化療不敏感的主要原因之一。本發明主要發現lincRNA-p21可以直接與DDB2結合並引起其降解；因此lincRNA-p21可作為第一個DDB2抑制劑，其可以改善卡鉑、順鉑、阿黴素等臨床化療藥物的效果。

更重要的是，使用不同的實驗模式找到了lincRNA-p21與DDB2蛋白結合所必需的三個基本短序列，電腦預測和計算顯示這三個lincRNA-p21短序列可以與DDB2的區域結合，其與DDB1蛋白相互作用。它們之間的分子界面穩定了Cul-4/DDB1/DDB2複合物的形成。在不需要全長的lincRNA-p21情況下，這三個序列仍可直接與DDB2蛋白結合，促進DDB2的蛋白水解，增加癌細胞對化療藥物的敏感性。由於lincRNA-p21的長度超過3,000個核苷酸；如果使用全長lincRNA-p21作為RNA治療策略，對於產品的合成、遞送和穩定性都相當困難。本發明的另一個重要突破是證明只需三個長度約20個核苷酸的lincRNA-p21短序列片段就可以直接與DDB2結合，並且可以透過分子生物學和分子模擬來分析作用機制。它可以達到降解DDB2蛋白、抑制DNA修復、增強化療敏感性的功能。

更重要的是，本發明利用外泌體來包覆三個lincRNA-p21短序列(exoLinc-p21s)並搭配化療藥物阿黴素來作為藥物遞送模型，證明exoLinc-p21s可以增強化療藥物阿黴素在癌細胞中的毒性和生長抑制。此外，抗HLAG外泌體進一步用作識別癌細胞的RNA遞送系統，外泌體上裝載的抗HLAG抗體可提高exoLinc-p21s與化療藥物對癌細胞的遞送效率。結果證明，抗HLAG外泌體不僅可以達到促進exoLinc-p21s引起 DDB2蛋白水解以及腫瘤細胞毒性的效果，還可以提高遞送至腫瘤的效率，以增加對化療藥物的敏感性。

總結來說，鑑定出與DDB2結合所必需的三個lincRNA-p21短序列(Line-p21s)，並將其開發為首創的DDB2抑制劑，其優勢在於與全長lincRNA-p21相比，合成成本低、穩定性高以及遞送效率高。在分子模擬分析中，Line-p21s已被證明可以穩定DDB2與DDB1蛋白之間的分子界面，並被證明可以直接與DDB2蛋白結合以進行蛋白酶體降解。透過使用α-HLAG抗體的外泌體靶向HLAG表現癌症作為遞送系統，與化療藥物一起包裝的外泌體Line-p21s(exoLinc-p21s)被證明可以增強阿黴素在細胞株以及動物模型中對癌細胞的細胞毒性與生長抑制作用。做為首創的DDB2抑制劑，exoLinc-p21s有潛力被開發為一種新型的基於RNA之化療增敏劑，有益於各種癌症類型的患者。

圖1顯示lincRNA-p21的表現與癌症分期(stage)、腫瘤大小(size)以及ERα狀態呈負相關。圖1A與1B顯示，透過原位雜交技術(in situ hybridization，ISH)所定量出的lincRNA-p21表現在人類乳癌腫瘤的早期階段(IIA期，n=12；IIB期，n=12)高於晚期階段(IIIA期，n=8；IIIB期，n=8)(圖1A)，並且與腫瘤大小呈負相關(圖1B)。圖1C顯示，透過ISH測定所定量出的lincRNA-p21表現在人類乳癌腫瘤中的ERα陰性(n=27)會高於ERα陽性(n=13)。箭頭指出的點為每個核中平均數量的lincRNA-p21表現訊號。Welch雙樣本t檢定：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖2顯示較高的lincRNA-p21是表現於較小的腫瘤大小、ERα陰性的乳癌、以及早期階段的腫瘤，並且有助於乳癌對化療的敏感性。圖2A為Tet-On-LincRNA-p21在腫瘤異種移植小鼠模型的治療時間軸圖表(箭頭：給予0.2mg/mL四環黴素(tetracycline)的起點)(上圖)。圖2A也顯示T-47D人類乳癌異種移植腫瘤的生長速率會受到四環黴素誘導的lincRNA-p21表現所抑制(下圖)。數據代表每組中的三次獨立實驗，並以平均值±標準差表示。採用Student’s t檢定與對照組相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。圖2B、2C和2D顯示卡鉑(50μM)活體外誘導之lincRNA-p21表現與疾病分期(圖2B)和腫瘤大小(n=61)(圖2C)呈負相關，並且在ERα陰性(n=14)會比ERα陽性(n=47)的人類乳癌初代培養組織中具有較高的表現(圖2D)。Welch雙樣本t檢定：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。圖2E顯示lincRNA-p21表現的誘導與乳癌細胞株的化療反應IC₅₀呈負相關。圖2F和2G顯示，在流式細胞分選技術(fluorescence-activated cell sorting，FACS)測定中，lincRNA-p21的異位表現(圖2F)與沉默(圖2G)改變了卡鉑所誘導的T-47D癌細胞凋亡程度。圖2H顯示在MDA-MB-231癌細胞中沉默lincRNA-p21降低了卡鉑誘導的凋亡標記物之表現。圖2I和2J顯示，透過兩個獨立的shRNA來沉默lincRNA-p21可抑制BT-474癌細胞中諾瓦得士(tamoxifen)(圖2I)以及ERα沉默(圖2J)的化療增敏作用，這一點可以透過FACS測定所測量到的凋亡死亡誘發程度來證明。圖2F、2G、2I以及2J中的數據代表至少三次實驗，並顯示為平均值±標準差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001是與對照組相比，採用Student’s t檢定。

圖3顯示lincRNA-p21是調控ERα相關化療抗性的中介物。圖3A與3B顯示圖2I與2J在FACS測定中的原始數據。數據代表至少三次實驗，並顯示為平均值±標準差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001是與對照組相比，採用Student’s t檢定。

圖4顯示lincRNA-p21能減少DNA的修復並且與DDB2表現呈負相關。圖4A顯示，在免疫螢光染色測定中，沉默lincRNA-p21能以時間依賴性模式來減少MDA-MB-231癌細胞中順鉑(50μM)所誘發的順鉑-DNA加合物(adducts)(Pt-(GpG)嘌呤二聚體)之形成。使用ImageJ分析對免疫螢光染色的圖像進行定量。圖4B顯示使用STRING以及Cytoscape 3.8.0分析與ERα陽性表現相關的蛋白質編碼基因網路圖。圖4C顯示，GSE18908數據集中所分析出的DDB2表現在ERα陽性人類乳癌組織中高於ERα陰性人類乳癌組織。Welch雙樣本t檢定：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。圖4D顯示，在Kaplan-Meier存活分析，接受新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy)的ERα陽性乳癌患者中具有較差的整體存活期(overall survival)(OS，n=187)出現較高的DDB2表現。圖4E和4F顯示透過卡鉑(50μM)活體外誘導之DDB2 mRNA表現在ERα陽性(n=47)中會比在ERα陰性(n=14)的人類乳癌初代培養組織中更高(圖4E)，Welch雙樣本t檢定：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，並且與腫瘤大小呈正相關(n=61)(圖4F)。圖4G顯示lincRNA-p21與DDB2被誘導之程度於新輔助治療患者中的化療反應(CR：完全反應(100%減少)，PR：部分反應(>=50%，<100%減少)，SD：穩定疾病(<50%減少)，PD：部分疾病(0%減少)。圖4H和4I顯示化療所誘導的蛋白動態表現 (圖4H)以及DDB2於染色質結合的活性(圖4I)在ERα陽性乳癌細胞株中高於ERα陰性乳癌細胞株。圖4J顯示，在西方墨點法分析中，用兩個獨立的shRNA沈默DDB2能以劑量(左)以及時間(右)依賴性模式來增強BT-474癌細胞中卡鉑誘發的細胞凋亡標記物之表現。圖4K顯示，在FASC測定中，DDB2的沈默增強了卡鉑誘發的T-47D癌細胞之細胞凋亡。數據代表至少三次實驗，並顯示為平均值±標準差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001是與對照組相比，採用Student’s t檢定。

圖5顯示DDB2有助於化療抗性相關的DNA修復功能。圖5A顯示KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)路徑分析中人類乳癌腫瘤中ERα相關基因表現的排名。圖5B顯示，在Kaplan-Meier存活分析中，與ERα陰性/mutp53乳癌患者相比，接受新輔助化療的ERα陽性/mutp53乳癌患者呈現出較高的DDB2表現與較差的整體存活期(OS，n=76)之相關性。圖5C顯示從泛癌症資料庫(pan-cancer database)GEPIA所分析出各種癌症類型中DDB2表現的盒形圖。圖5D顯示在免疫螢光染色測定中使用抗順鉑的修飾DNA抗體以時間依賴性模式檢驗T-47D與MDA-MB-231癌細胞中對順鉑(50μM)反應的DNA修復功能。使用ImageJ分析對免疫螢光染色的圖像進行定量。圖5E顯示化療會在ERα陽性而非ERα陰性乳癌細胞中誘導DDB2的表現。

圖6顯示lincRNA-p21可能靶向DDB2並干擾其入核以達到化療增敏作用。圖6A與6B顯示在核轉位蛋白(nuclear translocated protein)之累積(圖6A)以及染色質結合(聚乙二醇新基苯基醚(Triton)抗性)裂解物(圖6B)中卡鉑(50μM)與阿黴素(0.5μM)誘導的DDB2程度出現在ERα陽性乳癌細胞株，而非ERα陰性乳癌細胞株。

圖7顯示lincRNA-p21透過增強Cul-4/DDB1/DDB2 E3接合酶(ligase)複合物的形成來下調DDB2表現。圖7A顯示卡鉑(50μM)與阿黴素(0.5μM)在ERα陰性MDA-MB-231癌細胞中以時間依賴性模式誘導lincRNA-p21的表現，但在ERα陽性T-47D細胞中則無(上圖和右圖)。相比之下，這些化療藥物則在ERα陽性乳癌細胞中誘導DDB2 mRNA程度(下圖和左圖)。圖7B顯示，在ERα陰性MDA-MB-231癌細胞(右圖)中，卡鉑以時間依賴性模式誘導lincRNA-p21的核轉位(nuclear translocation)，但在ERα陽性T-47D癌細胞(左圖)中則沒有發生。圖7C顯示，在qRT-PCR分析中，lincRNA-p21的異位表現(左圖)與沉默(右圖)不影響T-47D以及MDA-MB-231癌細胞中的DDB2 mRNA的程度。圖7D也顯示在T-47D#Tet-On-LincRNA-p21癌細胞中DDB2 mRNA程度不受lincRNA-p21的誘導而改變。圖7E顯示用蛋白酶體抑制劑MG132(10μM)以時間依賴性模式處理會增加DDB2表現。圖7F顯示西方墨點法測定中圖8D的原始數據。圖7G顯示透過RNA-IP活體內實驗，驗證在MDA-MB-231癌細胞中阿黴素(0.5μM)所誘導的lincRNA-p21能與DDB2(左圖)、DDB1以及Cul-4(右圖)結合。圖7H顯示，在co-IP測定中，用RNase A進行活體外處理可減少卡鉑誘導的DDB2與DDB1以及Cul-4複合物的形成。圖7I顯示，在MG132存在的情況下，沈默lincRNA-p21會降低卡鉑(50μM)所誘導的DDB2蛋白與Cul-4以及DDB1的結合與複合物的形成。圖7J顯示來自卡鉑處理之T-47D癌細胞裂解物中的DDB2能在活體外被生物素化的lincRNA-p21(biotinylated lincRNA-p21)不同片段下拉。點狀圖透露生物素化RNA的輸入相等。圖7K透過RNA-IP分析，在T-47D癌細胞中以RNase A進行活體內實驗消化，顯示卡鉑(50μM)所誘導的lincRNA-p21會與DDB1以及Cul-4以特定的區域結合。圖7A、7C、7D、7G和7K中的數據代表三次實驗，並顯示為平均值±標準差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001是與對照組相比，採用Student’s t檢定。

圖8顯示lincRNA-p21透過做為Cul-4/DDB1/DDB2複合物的支架來增強DDB2蛋白泛素化與降解。圖8A顯示lincRNA-p21的異位表現降低了DDB2蛋白程度。圖8B顯示lincRNA-p21的沈默增加了DDB2蛋白程度。圖8C顯示在T-47D#Tet-On系統的穩定癌細胞克隆中，DDB2蛋白表現被lincRNA-p21的誘導所抑制。圖8D顯示lincRNA-p21的異位表現降低了在CHX(25μM)存在下DDB2蛋白的穩定性。使用ImageJ對西方墨點法分析中所檢驗的DDB2蛋白程度進行定量，並使用α-微管蛋白(α-tubulin)進行標準化。圖8E顯示用MG132(10μM)預處理可防止lincRNA-p21所誘發的DDB2下調。圖8F顯示lincRNA-p21的異位表現增加MG132處理的T-47D癌細胞中DDB2的多泛素化。圖8G與8H顯示，於RNA-IP活體內實驗，ERα陰性MDA-MB-231癌細胞中出現卡鉑(50μM)誘導的DDB2(圖8G)、DDB1以及Cul-4(圖8H)能與lincRNA-p21結合，但在ERα陽性T-47D癌細胞中則沒有出現。圖8I顯示，在co-IP測定中，lincRNA-p21的沈默會減少卡鉑誘導的DDB2與DDB1以及Cul-4複合物的形成。圖8J顯示來自卡鉑處理的T-47D癌細胞裂解物中，DDB2、DDB1以及Cul-4能在活體外實驗被生物素化lincRNA-p21下拉，但不被HOTAIR或α-微管蛋白mRNA作用。點狀圖顯示生物素化RNA的輸入相等。hnRNP-K則作為lincRNA-p21相互作用蛋白的陽性對照組。圖8K的圖解顯示用於RNA下拉(pull-down)實驗的生物素化lincRNA-p21缺失片段(deleted fragments)以及用於RNA-IP實驗的不同區域的引子組(primer sets)。圖8L顯示來自卡鉑處理的T-47D癌細胞裂解物中，DDB2在活體外實驗被生物素化的lincRNA-p21不同缺失片段下拉。點狀圖顯示生物素化RNA的輸入相等。圖8M顯示透過RNA-IP活體內實驗分析，以RNase A進行消化，T-47D癌細胞中卡鉑(50μM)誘導的DDB2會與lincRNA-p21在特定區域的結合。圖8G、8H和8M中的數據代表至少三次實驗，並顯示為平均值±標準差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001是與對照組相比，採用Student’s t檢定。圖8N的圖解顯示lincRNA-p21預測的二級結構(ViennaRNA網路服務器)以及推測與DDB2結合的序列。

圖9顯示三個lincRNA-p21短序列#3、#4以及#9在活體外與DDB2蛋白結合。圖9A-9D顯示，用來自卡鉑處理之T-47D癌細胞裂解物中的DDB2蛋白與單一(圖9A和9B)或複合(圖9C和9D)缺失的生物素化lincRNA-p21突變體進行活體外下拉實驗。點狀圖顯示生物素化RNA的輸入相等。圖9E，在表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)測定中顯示lincRNA-p21短序列#3、#4以及#9與重組DDB2蛋白的劑量依賴性結合活性。圖9F顯示純lincRNA-p21短序列以濃度梯度測定之Ct值作為標準曲線。圖9G顯示lincRNA-p21短序列#3、#4以及#9進入到T-47D癌細胞的轉染效率在不同濃度下是相同的。圖9H顯示，在處理卡鉑、順鉑以及阿黴素的情況下，與三個lincRNA-p21短序列的組合共同處理能顯著增強細胞的毒性。數據代表三次實驗，並顯示為平均值±標準差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001是與對照組相比，採用Student’s t檢定。圖9I顯示用MG132處理可逆轉抑制作用。

圖10顯示lincRNA-p21短序列#3、#4以及#9對乳癌細胞中化療誘發的細胞毒性之影響。圖10A顯示，僅在卡鉑處理的情況下，單獨使用三個lincRNA-p21短序列進行處理會增加細胞毒性，但對順鉑以及阿黴素沒有影響。數據代表三次實驗，並顯示為平均值±標準差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001是與對照組相比，採用Student’s t檢定。圖10B顯示三個lincRNA-p21短序列組合的聯合處理可以抑制DDB2的蛋白表現。圖10C顯示圖9I的原始數據。

圖11顯示透過分子對接計算(computational molecular docking)，對lincRNA-p21短序列與DDB2的N端α-螺旋結合之3D結構建模。圖11A顯示了由RNAComposer六個資料庫(CentroidFold、CONTRAfold、IPknot、RNAfold、RNAstruct以及ContextFold)所計算與預測的三個lincRNA-p21短序列之3D結構。圖11B顯示透過BIOVIA Discovery Studio中的ZDOCK對接模式以每6度產出一個構型計算而生成了2000個構型(pose)。標記的點表示兩個大分子之間的潛在構型，箭頭所指的點是與DDB2具有最高潛在相互作用所選定的lincRNA-p21短序列。圖11C顯示於DDB2N端α螺旋周圍的潛在構型叢集(cluster)。圖11D顯示了三個lincRNA-p21短序列盤繞DDB2之α螺旋的3D結構模型，其α螺旋為負責與DDB1相互作用。圖11E顯示3D結構中lincRNA-p21短序列與DDB2之間的相互作用位點。

圖12顯示透過分子對接計算呈現lincRNA-p21短序列與 DDB2複合的位置。圖12A-12E顯示來自其他資料庫的對接分析結果，以及所標記的點為兩個大分子之間選定的潛在構型。圖12F-12H顯示其他數據庫中lincRNA-p21短序列與DDB2之間最有潛力的構型預測。在圖12F中，青綠色構型來自於5個數據庫(pose 22)，粉色構型來自於contextFold(pose 27)。在圖12G中，青綠色構型來自於4個資料庫(pose 19)，粉色構型來自於contextFold(pose 2)，黃色構型來自於RNAstructure(pose 1)。在圖12H中，青綠色構型來自於4個資料庫(pose 8)，粉色構型來自於contextFold(pose 40)，黃色構型來自於RNAstructure(pose 8)。

圖13顯示外泌體包裹的lincRNA-p21短序列#3、#4以及#9(exoLinc-p21s)能增強乳癌細胞中對化療誘導的細胞毒性。圖13A顯示透過TEM所拍攝的外泌體顆粒。圖13B-13F顯示三個lincRNA-p21短序列(#3+#4+#9)被外泌體所包裹(exoLinc-p21s)，其做為基於外泌體的療法，證明能抑制DNA修復功能(圖13B)、DDB2蛋白功能(圖13C)、生長功能(圖13D)、細胞毒性增強效應(圖13E)，以及抑制異種移植小鼠模型中的腫瘤大小(圖13F)。圖13G與13H顯示有或沒有裝載抗HLAG抗體的exoLinc-p21s之細胞毒性作用(圖13G)以及DDB2蛋白抑制功能(圖13H)。圖13D、13E以及13G中的數據代表至少三次實驗，並顯示為平均值±標準差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001是與對照組相比，採用Student’s t檢定。

圖14顯示有與沒有抗HLAG抗體的外泌體之遞送效率。圖14A顯示exoLinc-p21s對抑制生長功能中的菌落面積以及平均菌落大小。圖14B透過免疫螢光染色測定呈現有與沒有抗HLAG抗體的外泌體以時間依賴性模式之遞送效率。

本發明可以用許多不同的形式來實現並且不應被解釋為限於本文中闡述的實施例。所描述的實施例不應用於限制申請專利範圍中所描述的本發明的範圍。

材料和方法

臨床檢體

在獲得知情同意下，從台灣台中中山醫學大學附設醫院收集總共61個不同乳癌亞型患者的乳癌組織樣本。樣本的收集包含未經篩選的所有乳癌亞型，並且樣本是根據台灣台中中山醫學大學附設醫院的人體研究倫理審查委員會所批准的案號(CS2-18150)來進行使用。組織均質化並且在有或沒有卡鉑的情況下培養5天。接著用TRIzol^TM試劑(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)來製備RNA以及蛋白質裂解物。

組織微陣列與原位雜交實驗

乳癌組織微陣列購自SuperBioChips Laboratories(首爾，韓國)，並進行原位雜交實驗於檢測lincRNA-p21。組織微陣列樣本包括不同乳癌亞型的40位患者。用於原位雜交測定的RNAscope lincRNA-p21(TP53COR1)探針是從Advanced Cell Diagnostics,Inc.,(Newark，CA，美國)所設計並購買的。本發明使用RNAscope 2.5 HD檢測試劑盒-BROWN，並根據製造商的步驟準則篩選乳癌組織中lincRNA-p21的訊號。使用Fiji ImageJ對lincRNA-p21表現的訊號進行定量，並使用細胞核進行標準化以計算探針數量的面積與百分比。

細胞培養

乳癌細胞株MCF7(RRID：CVCL_0031)、T-47D(RRID：CVCL_0553)、BT-474(RRID：CVCL_0179)、SK-BR-3(RRID：CVCL_0033)、MDA-MB-468(RRID：CVCL_0419)和MDA-MB-231(RRID：CVCL_0062)，以及肝癌細胞株HepG2(RRID：CVCL_0027)在Dulbecco’s Modified Eagle培養基中培養，且該培養基包含營養混合物F-12(DMEM/F12，HyClone^TM)(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)、10%胎牛血清(FBS，Gibco，Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)以及HyClone^TM青黴素-鏈黴素溶液。所有細胞株均購自American Type Culture Collection(ATCC)，並在具有5% CO₂的加濕培養箱中於37℃下培養，並透過MycoAlert^TM黴漿菌檢測試劑盒(LT07-318，Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)檢查是否受到黴漿菌(mycoplasma)污染。

抑制劑與試劑

卡鉑(41575-94-4)、(Z)-4-羥基諾瓦得士((Z)-4-hydroxy Tamoxifen)(68047-06-3)、環己醯亞胺(cycloheximide)(CHX，66-81-9)、(S)-MG132(133407-82-6)以及四環黴素(鹽酸鹽(hydrochloride)，64-75-5)購自Cayman Chemical(Michigan，美國)。順鉑(順二胺鉑(II)(cis-diammineplatinum(II))，P4394)與鹽酸阿黴素(doxorubicin hydrochloride)(Sigma-Aldrich，D1515)購自Merck KGaA(Darmstadt，德國)。Clarity^TM western強化化學發光(chemiluminescence，ECL)受質 (substrate)是購自Bio-Rad Laboratories,Inc.,(Hercules，CA，美國)。

抗體

抗DDB2抗體(#5416，RRID：AB_10694497)、抗Ac-p53抗體(K382，#2525S，RRID：AB_330083)、抗p-ERα抗體(Ser118，#2511)、抗HA-Tag抗體(#3724，RRID：AB_1549585)、抗PARP抗體(#9542，RRID：AB_2160739)和抗組蛋白(Histone)H3抗體(#9715，RRID：AB_331563)是購自Cell Signaling Technology,Inc.(Beverly，MA，美國)。抗DDB1抗體(sc-25367，RRID：AB_639050)、抗Cul-4抗體(sc-377188)、抗hnRNP-K抗體(sc-28380)、抗p53抗體(sc-126，RRID：AB_628082)和抗ERα抗體(sc-8002，RRID：AB_627558)是購自Santa Cruz Biotechnology,Inc.,(CA，美國)。抗泛素(ubiquitin)抗體(P4D1-A11)、抗p21WAF1抗體(Calbiochem，OP64，RRID：AB_2335868)、抗α-微管蛋白(α-Tubulin)抗體(T5168，RRID：AB_477579)和抗β-肌動蛋白(β-Actin)抗體(A2228，RRID：AB_476697)是購自Merck KGaA(Darmstadt，德國)。抗凋亡蛋白酶3(Caspase3)抗體(Imgenex IMG-144A，RRID：AB_316677)是購自Novus Biologicals,LLC.,(Centennial，CO，美國)。抗p-組蛋白H2AX抗體(Ser139，AF2288，RRID：AB_2114989)是購自R&D Systems Inc.,(Minneapolis，MN，美國)。

西方墨點法分析

使用Bradford蛋白質測定法(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules，CA，美國)決定總蛋白質裂解物濃度，其中將30μg蛋白質裂解物在樣本緩衝液中於95℃加熱5分鐘。使用電泳緩衝液在SDS-PAGE中分離變性蛋白質，並於轉移緩衝液中轉移至PVDF膜(0.45μM，Millipore，Merck KGaA，Darmstadt，德國)或NC膜(0.22μM，Amersh^TM，GE Healthcare Life Science，Pittsburgh，PA，美國)。將轉移後的膜用具有5%牛奶或BSA的TBST緩衝液進行覆蓋，並在4℃下用指定的初級抗體染色過夜，接著與HRP偶聯的二級抗體一起培養。最後使用ChemiDoc^TM觸摸成像系統(Touch Imaging System)(Bio-Rad)檢測ECL訊號。

RNA萃取與RT-PCR

在指定的實驗處理後，用冰冷的PBS清洗細胞三次並用TRIzol^TM試劑(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)裂解。每1mL TRIzol^TM試劑添加0.2mL氯仿，接著以12,000g離心15分鐘以分離水相、中間相以及有機相來分離總RNA。接下來，透過與0.25-0.5mL異丙醇混合沉澱水相中的RNA，以12,000g離心15分鐘。移除上清液後，用1mL 75%乙醇清洗凝膠狀沉澱兩次，風乾並以DEPC處理過的水溶解。使用1μg總RNA、Invitrogen^TM M-MLV反轉錄酶(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)、隨機六聚體(Random Hexamer)、dNTP、5X M-MLV緩衝液以及DTT來進行反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)。

定量即時PCR

qRT-PCR，使用2X KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix試劑盒(Kapa Biosystems，Wilmington，MA，美國)以特異性引子檢測目標基因的表現。使用LightCycler 480即時PCR系統(Roche Molecular Systems,Inc.,Pleasanton，CA，美國)或Applied Biosystems^TM QuantStudio^TM 5即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)分析循環閾值(threshold cycle)或Ct值。以管家基因(housekeeping gene)作為參考進行標準化來計算ddCt。

RNA免疫沉澱(RNA-IP)測定實驗

將細胞用1%甲醛固定並用1M甘胺酸中和，用冰冷的PBS清洗兩次，然後刮落並用裂解緩衝液(50mM HEPES pH7.5、150mM NaCl、1% Triton X-100、0.1% SDS、1mM DTT、cOmplete^TM蛋白酶抑制劑混合物(1片用於10mL細胞萃取物的蛋白酶抑制劑)(Roche Molecular Systems,Inc.,Pleasanton，CA，美國)以及200U/mL RNaseOUT^TM(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國))進行震盪。在冰上進行3次凍融循環後，裂解液以14,000rpm離心30分鐘，收集上清液進行免疫沉澱。瓊脂糖蛋白A/G預覆蓋1小時，然後與NT2緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1mM MgCl₂和0.5% NP-40)中的抗體混合並培養過夜。接著用NT2緩衝液清洗3次，並與裂解NT2緩衝液(1mM DTT、200U/mL RNaseOUT^TM和20mM EDTA)一起培養且旋轉過夜。將免疫複合物清洗3次，在100μL NT2緩衝液中於70℃下反向交聯5小時。最後，將樣本與0.25mg/mL Sigma-Aldrich蛋白酶K(Merck KGaA，Darmstadt，德國)在55℃下培養30分鐘，並以TRIzol^TM試劑(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)裂解用以RNA萃取和qRT-PCR。

生物素化RNA於活體外轉錄的製備

為了檢驗RNA與目標蛋白(包括DDB1、DDB2、Cul-4和hnRNP-K)於活體外的相互作用，用Invitrogen^TM T7 RNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)以及Biotin RNA Labeling Mix(Roche Molecular Systems,Inc.,Pleasanton，CA，美國)來製備生物素化RNAs(biotinylated RNAs)，其用於生物素下拉(Pull-down)測定。生物素化lincRNA-p21、HOTAIR和微管蛋白RNA是透過使用它們的DNA模板所生成，而它們的DNA模板是用在PCR中以含有T7的引子組來合成的。

生物素下拉測定實驗

對於活體外下拉測定實驗，將3μg生物素標記的RNA加熱至90℃ 2分鐘，並在結構緩衝液(structure buffer)(10mM Tris-HCl至pH7.0、0.1M KCl和10mM MgCl₂)中於室溫下重組20分鐘。細胞(2×10⁷)經過或不經過化療處理，接著打散於核分離緩衝液(1.28M蔗糖、40mM Tris-HCl pH7.5、20mM MgCl₂和4% Triton X-100)中。細胞核沉澱在RIP緩衝液(150mM KCl、25mM Tris-HCl pH7.4、0.5mM DTT、0.5% NP-40、1mM PMSF和cOmplete^TM蛋白酶抑制劑混合物(1片用於10mL細胞萃取物的蛋白酶抑制劑)(Roche Molecular Systems,Inc.,Pleasanton，CA，美國))中雜交以折疊DNA或RNA一小時，接著使用Novagen鏈黴親和素瓊脂糖磁珠(streptavidin agarose beads)(Novagen Corporation，San Diego，CA，美國)將RNA-蛋白質複合物拉下來，並以西方墨點法進行分析。

核與細胞質RNA的分離

在用TD緩衝液刮除細胞前，將細胞以TD緩衝液(137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na₂HPO₄和25mM Tris-HCl pH7.4)清洗兩次，接著在室溫下以最大速度離心30秒。以200μL TD緩衝液清洗沉澱物，以100μL氧釩核糖核苷複合物緩衝液(Vanadyl Ribonucleoside Complex buffer)(20mM VRC；S1402S，New England BioLabs Inc.,Ipswich，MA，美國、10mM Tris-HCl、0.14M NaCl、1.5mM MgCl₂、1mM DTT以及含有0.5% NP-40的TD緩衝液pH8.6)打散，震盪10秒，然後在冰上放置5分鐘。上清液轉移至新的微量離心管(eppendorf centrifuge tube)中並用TRIzol^TM試劑(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)裂解以分離細胞質RNA前，再次震盪細胞，並以最大速度離心30秒。為了分離核RNA，用200μL 0.5% NP-40/TD緩衝液清洗沉澱物，用100μL 0.5% NP-40/TD緩衝液打散，然後用Invitrogen TRIzol^TM試劑來裂解。

Triton萃取測定

卡鉑處理後，用Triton萃取緩衝液(100mM NaCl、300mM蔗糖、3mM MgCl₂、10mM PIPES pH6.8、1mM EGTA pH6.8、0.2%Triton X-100、添加1mM NaVO₄、1mM PMSF、10mM NaF和1ng/mL抑肽酶(aprotinin))在4℃下裂解細胞30分鐘。收集上清液做為Triton可萃取部分(無染色質蛋白)，而收集沉澱物作為Triton抗性部分(染色質結合蛋白)，用Triton萃取緩衝液清洗兩次，接著用NETN緩衝液(20mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5% NP-40、加入1mM NaVO₄、1mM PMSF、10mM NaF和1ng/mL抑肽酶)進一步裂解。兩個部份分別用於檢驗DDB2的遊離形式以及DNA結合形式。

細胞存活測定方案

MTT測定用於檢測細胞存活。在96孔盤中生長的細胞(5×10³)以不同濃度的指定化療藥物處理48或72小時。接著將培養基更換為含有5X Sigma-Aldrich MTT溶液(Merck KGaA，Darmstadt，德國)的無血清培養基，並培養2.5小時。最後用DMSO裂解細胞，並透過ELISA分析儀檢測570nm處的光密度(optical density，OD)。

以免疫細胞學測定(immunocytological assay)對核DNA中的順鉑加合物進行定量

透過抗順鉑修飾的DNA抗體在免疫螢光染色中檢測順鉑加合物來研究lincRNA-p21與DDB2對DNA修復的影響。用順鉑(50μM)處理在指定時間誘發DNA損傷後，用4%多聚甲醛固定細胞，並在PBS清洗後在室溫下用1% Triton X-100覆蓋5-7分鐘。接著利用含1% BSA的PBS在室溫下覆蓋細胞一小時，並用抗順鉑修飾的DNA抗體(Abcam,plc.,Cambridge，英國)在室溫下於黑暗中染色一小時。隨後以二級抗體山羊抗大鼠IgG H&L(Abcam,plc.,Cambridge，英國)在室溫於黑暗中再次染色數小時。最後，以DAPI封固劑(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham，MA，美國)封固細胞，並以螢光顯微鏡(Leica DMIL LED，Leica Microsystems，Wetzlar，德國)觀察染色。使用ImageJ軟體對順鉑加合物的訊號進行定量，並依據細胞核DAPI訊號進行標準化。

大分子對接

DDB2(4E54)的示意圖在蛋白質資料庫(protein data bank，PDB)中找到。短lincRNA-p21#3、#4和#9 3D結構由RNAcomposer資料庫進行預測和創建，並透過BIOVIA Discovery Studio軟體(RRID：SCR_015651)進一步用與DDB2之間的ZDOCK對接模式。對接結果透過BIOVIA Discovery Studio與PyMoL軟體(RRID：SCR_000305)以3D結構呈現。

異種移植小鼠模型

使用乳癌腫瘤異種移植小鼠模型來驗證lincRNA-p21透過Tet-On系統的生長效果，以及exoLinc-p21s以及exoDox之間的協同作用。將T-47D乳癌細胞注射到五週齡雌性BALB/c裸鼠的乳腺脂肪墊(mammary fat pad)中，且該裸鼠在皮下接種前3天已事先於皮下植入含有0.7mg 60天釋放的17β-雌二醇(Innovative Research of America)顆粒。在小鼠腫瘤生長1個月後，確認exoScramble、exoLinc-p21s以及與exoDox聯合治療對腫瘤生長的抑制作用。在治療期間，監測小鼠的活動量並計算四個治療組之間的生存曲線；並用卡尺連續測量腫瘤直徑，和使用公式計算腫瘤體積：體積=長x寬²/2。

統計分析

使用Student’s t檢定或Welch雙樣本t檢定來分析兩個分類變數之間的差異，而透過單因子變異數分析來分析兩個以上類別變數之間的差異。結果以平均值±標準差表示，n

3。p值以雙尾檢定計算，統計顯著差異定義為p<0.05。所有統計分析均使用SigmaPlot 10.0、GraphPad Prism 8或SPSS 21軟體進行。

結果

LincRNA-p21抑制ERα/DDB2相關的DNA修復與化療抗性

LincRNA-p21在調節DDB2介導的DNA修復與化療抗性中的作用仍不清楚。LincRNA-p21的基礎程度在早期(圖1A和1B)、較小尺寸(圖1B)與ERα陰性(圖1C)之乳房腫瘤中相對較高。透過ERα陽性T-47D乳癌細胞中四環黴素誘導表現系統所誘發之lincRNA-p21會抑制異種移植小鼠模型中的腫瘤生長(圖2A)，揭示了其在乳癌中的腫瘤抑制作用。為實驗卡鉑於活體外的治療效果反應，人類乳癌腫瘤初代培養組織中lincRNA-p21的誘導會隨著晚期階段(圖2B)、腫瘤大小(圖2C)和ERα陽性狀態(圖2D)而下降。這些臨床觀察結果表明lincRNA-p21在決定乳癌患者的化療敏感性中發揮關鍵作用。事實上，各種細胞株中化療誘導的lincRNA-p21程度與其對相應化療劑的IC₅₀呈負相關(圖2E)。LincRNA-p21的過量表現增加了卡鉑誘導的ERα陽性T-47D癌細胞之細胞凋亡(圖2F)。相反，ERα陰性MDA-MB-231癌細胞中lincRNA-p21表現的沉默可導致細胞凋亡減少(圖2G)以及卡鉑反應的PARP和凋亡蛋白酶3裂解(圖2H)。此外，沉默lincRNA-p21也減弱了諾瓦得士(圖21和圖3A)以及ERα shRNA(圖2J和圖3B)對卡鉑誘發的細胞凋亡之敏感化作用。因此，lincRNA-p21的過量表現可能會克服ERα相關的化療抗性。

為了進一步證明lincRNA-p21對化療敏感化的DNA修復抑制作用，使用抗順鉑修飾的DNA抗體在免疫細胞學測定中檢驗順鉑-DNA加合物。結果顯示，在順鉑處理的MDA-MB-231癌細胞中，透過shRNA沉默lincRNA-p21會抑制順鉑-DNA加合物的誘發(圖4A)，表示lincRNA-p21能夠透過抑制DNA修復來增加化療敏感性功能。為了確認lincRNA- p21降低ERα介導的DNA修復機制，使用GSE18908資料集來分析人類ERα陽性與陰性乳癌之間不同基因的整體表現(gene expression profiles)。在KEGG路徑所分析的ERα相關路徑中(圖5A)，核苷酸切除修復作用(NER)以及p53訊息傳遞路徑(兩個調節DNA修復與化療敏感性的關鍵路徑)反應於ERα的表現而上調。STRING網路進一步揭示，DDB2(一個已知的NER之靶向p53下游因子)的表現在ERα陽性乳癌中富集(圖4B)，並且可能參與ERα/lincRNA-p21軸調節的化療敏感性與DNA修復功能。此外，ER陽性乳癌組織中的DDB2程度在統計上較高(圖4C)。更重要的是，Kaplan-Meier圖分析揭示了所有乳癌患者中較高的DDB2表現與較差的整體存活期之間存在關聯性(圖4D)，即使接受新輔助化療並具有p53突變狀態之患者(圖5B)亦是如此。此外，DDB2在幾種不同的癌症類型中表現較高，例如肺癌(LUSC)、肝癌(LIHC)、膽管癌(CHOL)、大腸癌(COAD)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSC)、胃癌(STAD)以及食道癌(ESCA)(圖5C)。卡鉑對ERα陽性腫瘤組織中DDB2蛋白表現的活體外誘導也顯著高於ERα陰性腫瘤組織(圖4E)，且與腫瘤大小相關(圖4F)。此外，透過活體外處理卡鉑，誘導較高lincRNA-p21但較低DDB2的患者之乳癌腫瘤與他們對輔助化療的更好臨床反應有關連性(圖4G)，這表明lincRNA-p21可能負向調節DDB2表現以抑制乳癌患者體內NER功能，其與化療敏感性有關。

本發明接下來研究DDB2相關之NER參與在ERα相關的化療抗性。在ER陰性/化療敏感的MDA-MB-231與ER陽性/化療抗性的T-47D癌細胞中，以順鉑處理2小時內來誘發順鉑-DNA加合物，並且這些 DNA損傷在MDA-MB-231癌細胞中持續超過18小時，但在T-47D癌細胞中迅速消失(圖5D)。卡鉑(圖4H和5E)與阿黴素(圖5E)均增加ERα陽性(T-47D和BT-474)乳癌細胞株中DDB2的表現，但沒有增加ERα陰性(MDA-MB-231和SK-BR-3)乳癌細胞株中DDB2的表現。DDB2能辨識並結合細胞核中受損的DNA位點，以作為進一步招募參與NER的其他調節因子之重要啟動器，隨後被蛋白酶體降解以形成DNA修復複合物。因此，化療誘發的核轉位(圖6A)與DDB2的染色質結合活性(圖4I和6B)也在ERα陽性癌細胞株中發現，但在ERα陰性癌細胞株中並未發現。此外，沉默DDB2表現會以劑量以及時間依賴性模式增加PARP或凋亡蛋白酶3裂解(圖4J)，並使ERα陽性癌細胞對卡鉑敏感而誘發細胞凋亡(圖4K)。綜上所述，這些結果表明DDB2是介導ERα相關化療抗性的關鍵NER啟動器，並可以被lincRNA-p21所靶向。

LincRNA-p21做為用於DDB2蛋白酶體降解之Cul-4 E3接合酶複合物的支架

用卡鉑或阿黴素進行處理，在化療敏感性MDA-MB-231癌細胞中會以時間依賴性地增加lincRNA-p21表現，但在化療抗性T-47D癌細胞中不增加，並且與化療誘導的DDB2 mRNA表現呈負相關(圖7A)。卡鉑在MDA-MB-231癌細胞中也增加了lincRNA-p21的核累積，但在T-47D癌細胞中則沒有增加(圖7B)，並且與DDB2的核轉位呈負相關(圖6A)。因此，本發明接下來研究lincRNA-p21是否調控DDB2表現及其潛在的分子機制。有趣的是，DDB2蛋白質程度在T-47D癌細胞中會因lincRNA-p21過量表現而呈劑量依賴性地抑制(圖8A)，並透過在MDA- MB-231癌細胞中沉默lincRNA-p21而增強(圖8B)，但不影響其mRNA程度(圖7C)。同樣的，Tet-On控制系統所誘導的lincRNA-p21也抑制DDB2蛋白，但不抑制RNA程度(圖7D和8C)，這意味著lincRNA-p21會對DDB2的轉錄後下調。蛋白酶體抑制劑MG132增強富含lincRNA-p21的MDA-MB-231癌細胞之DDB2表現(圖7E)。在環己醯亞胺(CHX)存在的情況下，lincRNA-p21過量表現會降低DDB2蛋白穩定性(圖7F和8D)，而MG132能恢復DDB2蛋白穩定性(圖8E)，這暗示lincRNA-p21參與調節DDB2蛋白酶體降解。LincRNA-p21的過量表現增強了T-47D癌細胞中DDB2的多泛素化(圖8F)。接著證實了lincRNA-p21調節DDB2及其E3接合酶Cul-4與轉接蛋白(adaptor protein)DDB1複合物形成中的作用。RNA-IP測定實驗中，在ERα陰性而非ERα陽性乳癌細胞中觀察到lincRNA-p21與DDB2之間對卡鉑(圖8G)與阿黴素(圖7G)所反應的物理交互作用。卡鉑(圖8H)與阿黴素(圖7G)也強烈增加了lincRNA-p21與DDB1的結合，但在活體內僅適度增加了其與Cul-4的結合。DDB2與DDB1以及Cul-4複合物的相互作用在活體外透過RNase A處理而減弱(圖7H)，並可透過於活體內沉默lincRNA-p21使抗DDB2(圖8I)、抗DDB1和抗Cul-4(圖7I)的免疫複合物被破壞。接著，lincRNA-p21與DDB2、DDB1和Cul-4的活體外特異性交互作用也使用生物素化寡核苷酸的RNA下拉測定中得到驗證(圖8J)。總之，這些數據表明lincRNA-p21得以直接結合DDB2/DDB1/Cul-4，並作為E3複合物形成的支架。

為了檢驗lincRNA-p21用以結合DDB2的特定且必需的區域，本發明接下來合成了lincRNA-p21的不同片段(S1：外顯子1，S2：內含子，S3：外顯子2)(圖7J)或缺失片段(F1-F8)(圖8K)用以分析它們與DDB2的結合活性。在活體外RNA下拉實驗中，S1和F3-F8對DDB2表現出更強的結合效力，暗示526-926nt的區域是DDB2結合活性所必需的。在RNA-IP分析中，使用或不使用RNase A進行活體外消化抗DDB2免疫沉澱物中下拉的RNA，接著使用各引子組進行RT-qPCR，以擴增如圖8K所示之不同的區域(P1-P10)。LincRNA-p21在P3、P4、P6、P7以及P9的區域對RNase A消化具有抵抗力，可能是由於與DDB2結合而有所保護，進一步揭示了活體內實驗中潛在的DDB2結合區域(圖8M)。有趣的是，lincRNA-p21對DDB1以及Cul-4的結合區域與DDB2相似(圖7K)。根據文獻，DDB2是一種轉錄因子，與其目標基因的啟動子上特定共通序列具有結合親和力。值得注意的是，這個共通序列可以在lincRNA-p21的P3、P4以及P9區域內找到，並折疊為二級結構(P3、P4以及P9)，這意味著這三段序列是DDB2的潛在結合位點(圖8N)。這些結果暗示，lincRNA-p21序列#3、#4和#9的兩個區域(527至926nt與2099至2287nt)是與DDB2相互作用所必需的。

潛在的lincRNA-p21短序列做為化療增敏的DDB2抑制劑

為了證明lincRNA-p21序列(P3、P4以及P9)在活體外實驗與DDB2相互作用的必要性，剔除了圖9A與9C中星號標記的必需序列。生物素化lincRNA-p21全長探針所拉下的DDB2蛋白質程度會因P3、P4或P9(Del 1、Del 2或Del 3)的單獨剔除而略有減弱(圖9B)，並且幾乎會被所有三個序列的組合突變(Del 1+2+3)所破壞(圖9D)。此外，lincRNA-p21中這些與DDB2結合序列(#3、#4以及#9)所對應的合成 RNA寡核苷酸會以劑量依賴性模式顯示出與重組DDB2蛋白之間具有強力的結合活性，其KD值在SPR分析中為10^-9至10^-8M(圖9E)。所合成的lincRNA-p21短序列與Scramble對照組之表現量在活體外以劑量依賴性模式驗證(圖9F)。接著，本發明將lincRNA-p21短序列瞬間轉染至T-47D癌細胞中，並以qRT-PCR分析檢測遞送效率(圖9G)。與Scramble相比，雖然單一lincRNA-p21短序列(單獨#3、#4或#9)僅表現出較小的化療增敏作用(圖10A)，然而混合三個lincRNA-p21短序列(#3+#4+#9)(Linc-p21s)則能以劑量依賴性模式增強了ER陽性/化療抗性T-47D癌細胞對鉑類藥物以及阿黴素的化療敏感性(圖9H)。此外，Linc-p21s的DDB2靶向作用可透過處理24小時後導致DDB2蛋白表現的下調來得到證實(圖10B)，而MG132預處理可防止上述情況發生(圖9I與10C)。

為了進一步在電腦模擬(in silico)中探索這三個lincRNA-p21短序列與DDB2之間的潛在構型，使用包含六個資料庫CentroidFold、CONTRAfold、IPknot、RNAfold、RNAstruct以及ContextFold的RNAComposer來預測lincRNA-p21短序列(Linc-p21s)的3D結構。有趣的是，獲得了至少四個資料庫(CentroidFold、CONTRAfold、IPknot以及RNAfold)預測出相同結構構型(圖11A)，並將其進一步用於與DDB2蛋白(PDB：4E54)進行分子對接分析。透過使用ZDOCK對接程式計算大分子對接，並篩選來自不同預測資料庫中具有較低Z等級(Rank)分數與較高Z對接(Dock)分數的lincRNA-p21短序列與DDB2結合之潛在構型(圖11B與12A-12E)。接著，這些潛在的構型被分成不同的叢集(圖11C)，具有不同的相互作用模型並呈現在類似的結合區域中。此外，從具有最佳Z等級以及Z對接分數的最大叢集中選擇最有潛力的構型來表示lincRNA-p21短序列與DDB2之間的相互作用(圖11D和12F-12H)。LincRNA-p21短序列與DDB2之間的相互作用位點以及距離也被進行計算(圖11E)。在3D結構中，lincRNA-p21短序列(C8、C9、C10、C11、U12和U13)的核心核苷酸與最可能涉及的DDB2胺基酸(Lys-35、Pro-44、Cys-48、Cys-52和Leu-53)或DDB2其他胺基酸分別透過氫鍵與Pi-烷基來相互作用(圖11E)。在複雜的結構結果中，所有三個lincRNA-p21短序列均與DDB2 N端的α螺旋盤繞，這個區段相當重要且是用以負責與DDB1相互作進而連接E3接合酶Cul-4(圖11D)的位點。LincRNA-p21短序列與DDB2的盤繞可以穩定DDB2/DDB1/Cul-4 E3接合酶複合物的形成並增強DDB2多泛素化以及降解是相當合理的。

外泌體中與化療一起包裹的lincRNAp21短序列顯示出有效的化療增敏作用

基於RNA的治療策略的開發，Linc-p21s的體內遞送效率、腫瘤靶向特異性以及穩定性對於癌症患者至關重要。為了提高Linc-p21s在人體內的遞送效率，外泌體被用作此治療策略的遞送系統。穿透式電子顯微鏡(TEM)分析顯示空外泌體與包裹lincRNAp21的外泌體之間其大小以及形狀並無差異(圖13A)。為了驗證外泌體包裹的Linc-p21s(exoLinc-p21s)在DNA修復中的功能，進行了順鉑-DNA加合物測定，並證明exoLinc-p21s將順鉑-DNA加合物的存在時間從3小時延長至24小時，暗示exoLinc-p21s能夠透過減少DNA修復來提高化療敏感性(圖13B)。在包裹或不包裹阿黴素的外泌體(exoDox)中，透過西方墨點法分析確認了 exoLinc-p21s的能力為抑制阿黴素所誘導的DDB2表現(圖13C)。此外，菌落形成(colony formation)測定中，exoLinc-p21s減少了T-47D乳癌細胞與HepG2(高DDB2表現)肝癌細胞的生長(圖13D與14A)，並且與瞬間轉染系統的結果相似，含有1ng短Linc-p21s的exoLinc-p21s可以協同阿黴素的細胞毒性(圖13E)。在異種移植小鼠模型中，Exo-Linc-p21s也增強了阿黴素的體內抗腫瘤活性(圖13F)。為了增強exoLinc-p21s的腫瘤靶向特異性，將抗HLAG(在大多數腫瘤中高表現)抗體工程化到exoLinc-p21s的表面上以增加腫瘤特異性。事實上，具有抗HLAG抗體的exoLinc-p21在T-47D癌細胞的攝取效率方面確實具有更早且更長的累積(圖14B)。重要的是，抗HLAG抗體工程化的exoLinc-p21表現出比沒有抗HLAG抗體的exoLinc-p21具有更好的細胞毒性作用(圖13G)並且對DDB2蛋白表現有更強的抑制(圖13H)。

綜上所述，本發明的數據證明外泌體中與化療一起包裹的lincRNAp21短序列(exoLinc-p21s)能有效靶向DDB2蛋白以抑制化療增敏的DNA修復功能，這可能是潛在的新型基於RNA的DDB2抑制劑，其用於增強患有各種DDB2表現腫瘤之患者的化療敏感性。

本領域技術人員將前述概述視為用於傳送託管申請資訊的方法的描述。本領域技術人員將認識到，這些僅是說明性的並且許多等同物是可能的。

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Claims

一種組合物，其包含一長鏈非編碼RNA-p21(lincRNA-p21)的序列，其中該lincRNA-p21的序列是選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所組成的群組。
一種組合物用於製備治療癌症之藥物的用途，其中該組合物包含一長鏈非編碼RNA-p21(lincRNA-p21)的序列以及一化療劑，其中該lincRNA-p21的序列是選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所組成的群組。
如請求項2所述的用途，其中該lincRNA-p21的序列透過抑制DDB2的表現來增強該癌症對該化療劑的敏感性。
如請求項2所述的用途，其中該癌症包含具有DDB2高度表現的癌症。
如請求項2所述的用途，其中該癌症對化療劑有較差的反應或抗藥性。
如請求項2所述的用途，其中該癌症包含乳癌與肝癌。
如請求項6所述的用途，其中該乳癌的癌細胞具有p53突變。
如請求項7所述的用途，其中該乳癌的癌細胞為雌激素受體陽性並且具有p53突變。
如請求項2所述的用途，其中該化療劑包含卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)或阿黴素(doxorubicin)。
如請求項2所述的用途，其中該組合物進一步包含一醫藥上可接受的載體。
如請求項10所述的用途，其中該醫藥上可接受的載體包含微脂體(liposome)、奈米顆粒(nanoparticle)、外泌體(exosome)、微胞(micelle)、聚合物基質(polymeric matrix)或凝膠基質(gel matrix)。
如請求項11所述的用途，其中該lincRNA-p21的序列被包含在該外泌體中。
如請求項2所述的用途，其中該組合物進一步包含一用於結合癌細胞上的生物標記之靶向分子。
如請求項13所述的用途，其中該靶向分子包含一抗HLAG抗體。