TWI848739B - 源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明主要揭示一種自椎間盤取得髓核细胞並於體外放大培養的方法。本發明的次一目的為提供一種以上述方法所得的髓核細胞用以製造治療下背痛的醫藥組成物的用途，經由包含該髓核細胞的醫藥組成物的應用以治療慢性下背痛。
Description
本發明係關於細胞放大培養方法的技術領域，尤指一種源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法及其用途之技術領域。
椎間盤組織(Intervertebral disc)位於椎體骨(Vertebra)之間，由纖維環(Annulus fibrosus)及髓核組織(Nucleus pulpous)所組成，可緩衝椎體間因活動造成的摩擦。椎間盤退化症(Degenerated disc disease)常引起下背痛(Low back pain)，好發於三十到五十歲的成年人個體，嚴重者造成椎間盤塌陷。根據統計，80%的成年人都有過下背痛的經驗，其中約有四分之一的人因為背痛而影響到工作。
一般椎間盤退化症於初期病徵發生時，臨床醫師會先給予病人服用止痛藥物，以暫時性減輕病患的生理疼痛。目前常使用的藥物包括 非類固醇抗發炎止痛藥 (NSAID)、乙醯胺酚 (Acetaminophen)、類固醇類藥物等，但這類藥物使細胞分泌平衡失調並有可能會產生腸胃方面的副作用。椎間盤退化嚴重者則需要進行椎間盤置換性治療，但人工椎間盤植入物其材質為高分子聚合物混和金屬物質，且無生物相容性易造成更嚴重之副作用發生。上述這些方法都無法直接針對退化的椎間盤進行治療，且患者的生活品質亦沒有顯著的改善。
當椎間盤結構受損或退化時，髓核組織可能變得不穩定，並可能因負重或壓力的增加而向外突出或甚至穿過纖維環而跑到外面。這種突出的髓核組織因此壓迫到周圍的神經結構，例如脊髓或神經根，而引起疼痛、放射性疼痛、麻木或肌肉無力等症狀。因此，椎間盤突出與髓核組織的位置和壓力之間存在著密切的關係。
本案發明人鑑於現今椎間盤退化症的治療方式的限制和缺點，以及基於椎間盤退化與髓核組織之間的關係，所以本案發明人希望能夠於椎間盤退化的初期，自患者椎間盤的髓核組織中取得髓核细胞並於體外放大培養後並將其凍存，待患者有需求時，再將其解凍後重新培養並植入患者的患部，使其在患者患部生長，而不會發生免疫排斥，進而達成髓核組織再生和治療椎間盤退化的目的。因此，本案之發明人乃極力加以研究發明，而終於研發完成本發明之一種於體外放大培養源自椎間盤的髓核细胞的方法和一種由前述方法所得的髓核細胞用以製造治療下背痛的醫藥組成物的用途。
本發明之主要目的在於提供一種於體外放大培養源自椎間盤的髓核细胞的方法，其包含: a) 提供一髓核組織(nucleus pulposus)； b) 以一酵素水解該髓核組織，並以過篩和離心的方式將未水解的該髓核組織與從組織脫落之初代髓核細胞予以分離； c) 將b)中所得的所述初代髓核細胞進行初代培養； d) 當c)中進行初代培養的所述初代髓核細胞達到一細胞密度後，取出所述初代髓核細胞進行繼代培養； e)以一或多個基因的表現量從d)中進行繼代培養的所述初代髓核細胞中篩選出髓核細胞，其中，所述一或多個基因為選自以下基因模組中的基因:髓核發育基因、軟骨分化基因、髓核專一特異基因、髓核退化基因及纖維環專一特異基因；以及 f) 將e)中所得的所述髓核細胞進行放大培養。
上述方法中，該髓核發育基因為KDM4E，該軟骨分化基因包括: SOX9、COL2A1、Agc1，該髓核專一特異基因為PAX1，該髓核退化基因為SAA1，以及該纖維環專一特異基因為CD90。
此外，於上述方法中，用以水解該髓核組織的該酵素為膠原蛋白酶(collagenase)、胰蛋白酶(trypsin)或其組合，並且當c)中進行初代培養的所述初代髓核細胞於0~14天後達到50~100%細胞密度後，較佳為於5~7天後達到80~90%細胞密度後，取出所述初代髓核細胞進行繼代培養。
進一步，於上述方法中，所述基因的表現量是以定量聚合酶連鎖反應 (qPCR)、北方墨點法 (Northern blotting)、西方點墨法 (Western blotting) 或DNA微陣列 (DNA microarray) 進行檢測。
同時，本發明的次一目的為提供一種以上述方法所得的髓核細胞用以製造治療下背痛的醫藥組成物的用途，其中該醫藥組成物包含醫藥學上可接受之載劑。
藉由該醫藥組成物可將由一患者的髓核組織中所得的該髓核細胞於放大培養後，重新移植入該患者的患部，即椎間盤退化的部位，使其在患部中生長，通過髓核組織的再生以達成治療的目的，並使接受移植的該患者避免產生免疫排斥的可能性。
本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，否則皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。本發明將以下面的實施例予以示範闡明，但僅為例示而非限制，本發明不受下述實施例所限制。除非另有說明，本發明所用之材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。
實施例一 髓核組織 (Nucleus pulposus)檢體的處理 1. 首先在醫院開刀房，經手術以無菌方式取出椎間盤退化症或椎間盤突出患者之髓核組織，置於內含一抗生素組成物合併生理食鹽水之無菌密閉承載器中，然後送至人體細胞組織優良操作規範(Good Tissue Practice，GTP)實驗室的無菌操作台中進行處理； 2. 記錄髓核組織的檢體重量和該檢體的患者之基本資料； 3. 將該檢體置於含有2 mL P0 medium (第0繼代的培養基，medium of passage number 0 ) 之10cm dish (培養皿)中，再將該檢體切成平均小於1 mm
3之小塊；其中一個10cm dish 中約含5g的檢體，若檢體較多，則依此比例將髓核組織分為數盤培養皿，其中P0 medium 包括如下成分: DMEM(杜貝卡氏改良依格培養基)、Human Platelet Lysate(人類血小板裂解液)以及Antibiotic(抗生素)； 4. 配製膠原蛋白酶(collagenase)溶液: 7 mL P0 medium +1 mL type I collagenase (第一型膠原蛋白)，即該膠原蛋白酶溶液中P0 medium和type I collagenase的比例為7 : 1 (體積比)； 5. 將配製好的膠原蛋白酶溶液加入到含有切碎的髓核組織的培養皿中，每一盤培養皿中加入8ml 的膠原蛋白酶溶液，並在37℃ 、5% CO
2的培養箱中隔夜(overnight)培養； 6. 於隔夜培養後，將每一培養皿中的髓核組織檢體以100 µm 細胞過濾器 (cell strainer) 過篩，並且過篩時可用10 mL 針筒的活塞輕磨組織，研磨完畢後，以10 mL DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline，杜氏磷酸鹽緩衝液) 清洗cell strainer； 7. 將過篩後所收集到的細胞懸浮液，以200xg 的轉速於室溫離心5 分鐘，並移除上清液； 8. 再以20 mL DPBS 清洗(wash)所得的沉澱細胞(cell pellet) 2 次； 9. 然後再將所得的沉澱細胞(cell pellet)重新懸浮(resuspend)於2 mL P0 medium中，再以台酚藍(trypan blue) 進行細胞計數，計算獲得之細胞數及其存活率(80~99%) ； 10. 取5-10 X 10
5之細胞數種到含10 mL P0 medium 的10cm dish 中，此時之細胞為P0 (第0繼代的細胞 ，cells of passage number 0)，即初代髓核細胞，並培養於37℃ 、5% CO
2的培養箱中進行初代培養； 11. 持續觀察該初代髓核細胞的生長狀況，並於第三天時移除舊的P0 medium 後，以6 mL DPBS 清洗一次，再加入10 mL 新的P0 medium 繼續培養；以及 12. 於該初代髓核細胞培養0~14天後達到50~100%細胞密度後，或較佳為培養5~7天後細胞密度可達80~90% ，此時便可取出所述初代髓核細胞進行第一次繼代培養。
實施例二 初代髓核細胞的繼代培養(subculture) 1. 當實施例一中的初代髓核細胞的細胞密度達到50~100%或較佳為80~90% 時，則進行繼代培養； 2. 移除舊的P0 medium ，並以6 mL DPBS 清洗附著於10cm dish底部的初代髓核細胞2 次； 3. 於10cm dish中加入1 mL 0.05% 的trypsin-EDTA (胰蛋白酶-乙二胺四乙酸)，並在37℃ 、5% CO
2的培養箱中使其於37℃下作用3 分鐘； 4. 作用完畢後，以手輕拍10cm dish，使該初代髓核細胞脫離10cm dish的底部； 5. 加入4 mL P0 medium 至10cm dish中，以中和trypsin(胰蛋白酶)，然後收集懸浮於P0 medium中的該初代髓核細胞，置於離心管中並於室溫下以200xg的轉速離心5 分鐘； 6. 移除離心管中的上清液後，將該初代髓核細胞重新懸浮於適當體積之培養基(culture medium)中。依比例調整重新懸浮該初代髓核細胞所需的culture medium的體積， 例如每1~2 盤10cm dish的該初代髓核細胞重新懸浮於1 mL culture medium，其中culture medium包括如下成分: DMEM以及Human Platelet Lysate； 7. 以trypan blue 進行細胞計數，確認該初代髓核細胞數目及其存活率(80~99%) ； 8. 將重新懸浮的該初代髓核細胞以每盤10cm dish中含有1x10
6的細胞數之比例，以10ml 的culture medium進行繼代培養，此時的該初代髓核細胞為P1 (即第1繼代的細胞 ，cells of passage number 1) 。 9. 約每3~4 天進行一次繼代培養，即重複上述步驟1~8。
實施例 三 基因表現的評估 1. 在以上述實施例二中的繼代培養方法進行P2 (第2繼代的細胞)、P3 (第3繼代的細胞)、P4 (第4繼代的細胞)的繼代培養時，收集約5x10
5的初代髓核細胞，並以10 mL DPBS清洗2 次； 2. 將所收集的該初代髓核細胞重新懸浮於1 mL DPBS中，並轉置於離心管中，然後於室溫中以200xg 的轉速離心5 分鐘； 3. 移除離心管中的上清液，並加入1 mL GENEzol至離心管中，然後將離心管中的樣品保存於 -80 ℃；以及 4. 抽取上述步驟3樣品(初代髓核細胞)中的RNA，並以qPCR (定量聚合酶連鎖反應，quantitative polymerase chain reaction)檢測樣品中初代髓核細胞的各個基因的表現量，其中所檢測的各個基因為選自以下五類基因模組中的基因: I.髓核發育基因、II.軟骨分化基因、III.髓核專一特異基因、IV.髓核退化基因及V.纖維環專一特異基因。進一步，該髓核發育基因為KDM4E，該軟骨分化基因包括: SOX9、COL2A1、Agc1，該髓核專一特異基因為PAX1，該髓核退化基因為SAA1，以及該纖維環專一特異基因為CD90。
實施例四 細胞凍存 1. 當該初代髓核細胞持續被放大培養到P2 或P3時，當細胞密度到達80~90% ，即可進行細胞的凍存； 2. 自10cm dish移除舊的culture medium，並用6 mL DPBS 清洗 2 次； 3. 於10cm dish中加入1 mL trypsin-EDTA，並在37℃ 、5% CO
2的培養箱中使其於37℃下作用3 分鐘； 4. 作用完畢後，以手輕拍10cm dish，使該P2 或P3初代髓核細胞脫離該10cm dish的底部； 5. 加入4 mL culture medium 至10cm dish中，以中和trypsin，然後收集懸浮於culture medium中的該P2 或P3初代髓核細胞，置於離心管中並於室溫下以200xg的轉速離心5 分鐘； 6. 移除離心管中的上清液後，將該P2 或P3初代髓核細胞重新懸浮於適當體積之culture medium中。依比例調整重新懸浮該P2 或P3初代髓核細胞所需的culture medium的體積， 例如每1~2 盤10cm dish的該P2 或P3初代髓核細胞重新懸浮於1 mL culture medium中； 7. 以trypan blue 進行細胞計數，確認該P2 或P3初代髓核細胞數目及其存活率(80~99%) ； 8. 將離心管中重新懸浮於culture medium的該P2 或P3初代髓核細胞，於室溫下以200xg轉速離心5 分鐘，然後移除上清液； 9. 以2X10
6/ml 的細胞濃度，將該P2 或P3初代髓核細胞重新懸浮於適當體積之細胞凍存液； 10. 將該P2 或P3初代髓核細胞懸浮液以1 mL/vial 的比例分裝到冷凍小管中；以及 11. 將冷凍小管放入細胞漸凍盒中，再將細胞漸凍盒放入-80℃冰箱中，並於隔天將冷凍小管轉移至液態氮中保存。
以下表一為上述各實施例中所使用的試劑來源: 表一
| 產品名 | 公司名稱 | 型號 | 內容物 |
| 1. 基礎培養基 | |||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜貝卡氏改良依格培養基)，High Glucose (高葡萄糖) | GENEDireX | CC103-0500 | Sodium Pyruvate (丙酮酸鈉) Glutamine (麩醯胺酸) Phenol Red (酚紅) |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11995-040 | Sodium Pyruvate Glutamine Phenol Red |
| 2. 血清 | |||
| Human Platelet Lysate (人類血小板裂解液) | EliteCell | EPA-500 | |
| Human Platelet Lysate | EliteCell | EPAGMP -500 | |
| 3. 抗生素 | |||
| Antibiotic (抗生素) Antimycotic (抗黴劑) | cellgro | 30004141 | penicillin G (青黴素G) streptomycin sulfate (硫酸鏈黴素) amphotericin B (雙性殺黴素B) |
| Antibiotic Antimycotic | Gibco | 15240-062 | penicillin G streptomycin sulfate amphotericin B |
| 4. 緩衝 溶液 | |||
| PBS (磷酸鹽緩衝液) | Omics bio | IB3012 | NaCl、KCl、KH 2PO 4、Na 2HPO 4 |
| DPBS (杜氏磷酸緩衝溶液) | Gibco | 14190-0144 | NaCl、KCl、KH 2PO 4、Na 2HPO 4 |
| 5. 酵素 | |||
| 2.5% Trypsin (胰蛋白酶) | cellgro | 27419007 | |
| Collagenase I (膠原蛋白酶) | SIGMA | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| 6. 細胞凍存液 | |||
| BAMBANKER | GC LYMPHOTEC | BB01 | |
| CryoStor CS10 | Biolife | 210102 | |
| 7. 染劑 | |||
| trypan blue (台酚藍) | SIGMA | 72-57-1 |
實施例五 初代髓核细胞之髓核發育基因:KDM4E的表現量 圖1所示為於不同年齡層中以上述實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞，以實施例三的基因表現的評估方法分析所得的髓核發育基因:KDM4E的表現量的結果。由圖1中的長條圖可以看到，由小於35歲和36-50歲年齡層中所得的初代髓核细胞，其髓核發育基因:KDM4E的表現量係高於大於51歲年齡層者。且由該專一的髓核發育基因:KDM4E的表現，可以證實該等由本發明實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞，確實皆是經髓核組織(Nucleus pulpous)的發育過程而來。
實施例六 初代髓核细胞之軟骨分化基因: SOX9、COL2A1和Agc1的表現量 圖2A至2C所示為於不同年齡層中以上述實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞，以實施例三的基因表現的評估方法分析所得的軟骨分化基因: SOX9、COL2A1和Agc1的表現量的結果。由圖2A中的長條圖可以看到，由小於35歲年齡層中所得的初代髓核细胞，其軟骨分化基因: SOX9的表現量明顯高於36-50歲和大於51歲年齡層者，其中SOX9為軟骨分化中重要的前期轉錄因子。由圖2B中的長條圖可以看到，由小於35歲和36-50歲年齡層中所得的初代髓核细胞，其軟骨分化基因: COL2A1的表現量係高於大於51歲年齡層者，且小於35歲年齡層者的COL2A1基因的表現量亦明顯高36-50歲和大於51歲年齡層者，其中COL2A1為軟骨分化中重要的軟骨基質基因。圖2C中的長條圖可以看到，以本發 明放大培養方法所得的初代髓核细胞，於不同年齡層中其軟骨分化基因: Agc1的表現量高低依序為，小於35歲年齡層者最高，36-50歲年齡層者次之，而大於51歲年齡層者最低，其中Agc1為軟骨分化中重要的軟骨基質基因。此外，由上述圖2A至2C中亦可以得知，由本發明上述實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞皆具有和髓核組織相關的重要軟骨分化基因的表現，且其表現量隨著年齡的增加而遞減。
實施例七 初代髓核细胞之髓核專一特異基因: PAX1的表現量 圖3所示為於不同年齡層中以上述實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞，以實施例三的基因表現的評估方法分析所得的髓核專一特異基因: PAX1的表現量的結果。由圖3中的長條圖可以看到， 由小於35歲年齡層中所得的初代髓核细胞，其髓核專一特異基因: PAX1的表現量明顯高於36-50歲和大於51歲年齡層者，其中髓核專一特異基因: PAX1為髓核組織的前驅細胞基因，越年輕者的髓核組織，其髓核專一特異基因: PAX1的表現量越高，而表現量越高亦代表著髓核組織的修復能力越高。因此，由圖3中可知，由本發明上述實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞皆具有和髓核組織的修復能力相關的PAX1基因的表現，且其表現量於年輕者中顯著較高。
實施例八 初代髓核细胞之髓核退化基因: SAA1的表現量 圖4所示為於不同年齡層中以上述實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞，以實施例三的基因表現的評估方法分析所得的髓核退化基因: SAA1的表現量的結果。由圖4中的長條圖可以看到，以本發明放大培養方法所得的初代髓核细胞，於不同年齡層中其髓核退化基因: SAA1的表現量高低依序為，大於51歲年齡層者最高，36-50歲年齡層者次之，而小於35歲年齡層者最低，其中SAA1表現於髓核退化和髓核細胞凋亡的時候，隨年齡的增加而表現增加。因此，由圖4中可知，本發明上述實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞，其髓核退化基因: SAA1的表現量呈現出年齡越大者表現越高，亦即由本發明之方法所放大培養的初代髓核细胞具有髓核組織中細胞所表現的特性。
實施例九 初代髓核细胞之纖維環專一特異基因: CD90的表現量 圖5所示為於不同年齡層中以上述實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞，以實施例三的基因表現的評估方法分析所得的纖維環專一特異基因: CD90的表現量的結果。由圖5中的長條圖可以看到，以本發明放大培養方法所得的初代髓核细胞，於不同年齡層中其纖維環專一特異基因: CD90的表現量皆非常低，亦即以此纖維環專一特異基因: CD90非常低的表現量可以反向驗證(說明)，以本發明放大培養方法所得的初代髓核细胞非源自於纖維環。
以下表二為於不同年齡層中以上述實施例一至二的放大培養方法所得的初代髓核细胞，以實施例三的基因表現的評估方法分析所得的五類基因模組:髓核發育基因、軟骨分化基因、髓核專一特異基因、髓核退化基因及纖維環專一特異基因表現量的結果。 表二
表二中所示者為，圖1至圖5長條圖所代表的數據，其中數據是於各個年齡層中所得的基因表現量數據的平均值。而綜合圖1至圖5以及表二中顯示的數據結果，我們可以清楚的知道，藉由本發明所提供的一種於體外放大培養源自椎間盤的髓核细胞的方法中的，初代髓核细胞的放大培養方法和基因表現的評估方法，即利用五類基因模組:髓核發育基因、軟骨分化基因、髓核專一特異基因、髓核退化基因及纖維環專一特異基因的表現量，可以得到具有修復髓核組織功能的髓核細胞，然後可以所得的該髓核細胞製造治療下背痛的醫藥組成物，並經由包含該髓核細胞的醫藥組成物的應用來治療因椎間盤退化症所引起的慢性下背痛。
實施例十 源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法及其用途的流程 圖6所示為本發明源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法及其用途的流程圖，首先如實施例一所述的技術內容，經手術以無菌方式由椎間盤退化症或椎間盤突出患者的脊椎取得髓核組織檢體，然後以無菌恆溫運送的方式，將該髓核組織檢體運送至人體細胞組織優良操作規範實驗室的無菌操作台中進行該髓核組織檢體的處理，最後得一初代髓核細胞；再以實施例二中所述的初代髓核細胞的繼代培養方法，將由實施例一中所得的初代髓核細胞進行繼代培養，放大所得的該初代髓核細胞，接著以實施例三所述的基因表現的評估方法，評估所述初代髓核細胞，同時對所述初代髓核細胞進行無菌安全測試，確認所述初代髓核細胞沒有被汙染，例如被黴漿菌(Mycoplasma)所汙染，然後以前述基因表現的評估和無菌安全測試的結果，針對由該患者之髓核組織檢體所得的初代髓核細胞中是否具有具再生能力的髓核細胞和其他髓核細胞特性製作一個人化報告，並依此報告使用該具再生能力和其他髓核細胞特性的髓核細胞，針對該患者客製化一治療下背痛(椎間盤退化症或椎間盤突出)的醫藥組成物，最後將該醫藥組成物植入該患者的患部，使該具再生能力的髓核細胞在患者患部生長，進而達成髓核組織再生和治療椎間盤退化或椎間盤突出的目的。
上述說明已完整且清楚地說明本發明之一種源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法及其用途。必須加以強調的是，上述之詳細說明係針對本發明可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
圖1為於不同年齡層中以本發明源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法所得的髓核細胞，其髓核發育基因:KDM4E的表現量； 圖2A為於不同年齡層中以本發明源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法所得的髓核細胞，其軟骨分化基因:SOX9的表現量； 圖2B為於不同年齡層中以本發明源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法所得的髓核細胞，其軟骨分化基因:COL2A1的表現量； 圖2C為於不同年齡層中以本發明源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法所得的髓核細胞，其軟骨分化基因:Agc1的表現量； 圖3為於不同年齡層中以本發明源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法所得的髓核細胞，其髓核專一特異基因:PAX1的表現量； 圖4為於不同年齡層中以本發明源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法所得的髓核細胞，其髓核退化基因:SAA1的表現量； 圖5為於不同年齡層中以本發明源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法所得的髓核細胞，其纖維環專一特異基因:CD90的表現量；以及 圖6所示為本發明源自椎間盤的髓核细胞的放大培養方法及其用途的流程圖。
Claims (4)
- 一種於體外放大培養源自人類椎間盤的髓核細胞的方法，其包含：a)提供一髓核組織(nucleus pulposus)；b)以一酵素水解該髓核組織，並以過篩和離心的方式將未水解的該髓核組織與初代髓核細胞予以分離；c)將b)中所得的所述初代髓核細胞進行初代培養；d)當c)中進行初代培養的所述初代髓核細胞達到80~90%的細胞密度後，取出所述初代髓核細胞進行繼代培養；e)以定量聚合酶連鎖反應(qPCR)檢測d)中進行繼代培養的所述初代髓核細胞的基因的表現量，其中，所檢測的基因包括：髓核發育基因KDM4E、軟骨分化基因SOX9、COL2A1和Agc1、髓核專一特異基因PAX1、髓核退化基因SAA1及纖維環專一特異基因CD90，並以KDM4E、SOX9、COL2A1、Agc1和PAX1表現量高且SAA1及CD90表現量低的所述初代髓核細胞作為具再生能力的髓核細胞；以及f)將e)中所得的具再生能力的所述髓核細胞進行放大培養。
- 如請求項1所述的方法，其中，用以水解該髓核組織的該酵素為膠原蛋白酶、胰蛋白酶或其組合。
- 如請求項1所述的方法，其中，所述基因的表現量進一步以下列方法進行檢測：北方墨點法(Northern blotting)、西方點墨法(western blotting)或DNA微陣列(DNA microarray)。
- 一種由如請求項1所述的方法所得的髓核細胞用以製造治療下背痛的醫藥組成物的用途。
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