TWI848125B - 使用經修改之氧化準則製備寡核苷酸之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種用於產生混合P=O/P=S主鏈寡核苷酸之方法，該方法包含應用新穎的氧化準則，根據以下流程將式I之中間體亞磷酸三酯化合物選擇性氧化為式II之磷酸二酯化合物
Description
本發明係關於一種用於產生混合P=O/P=S主鏈寡核苷酸之新穎方法，該方法包含根據以下流程將式I之中間體亞磷酸三酯化合物氧化為式II之磷酸二酯化合物
其中該氧化遵循特定氧化準則。
寡核苷酸合成在原理上係將核苷酸殘基逐步添加至生長鏈之5'-端直至組裝成所需序列。
通常，各添加稱為合成週期且在原理上由化學反應組成
a1
) 使固體載體上之受保護羥基解阻隔，
a2
) 將作為活化胺基磷酸酯之第一核苷與固體載體上之游離羥基偶合，
a3
) 氧化或硫化各別P-連接之核苷(亞磷酸三酯)以形成各別磷酸二酯(P=O)或各別硫代磷酸酯(P=S)；
a4
) 視情況封端固體載體上之任何未反應之羥基；
a5
) 使附接至固體載體之第一核苷之5'羥基解阻隔；
a6
) 將作為活化胺基磷酸酯之第二核苷偶合以形成各別P-連接之二聚體；
a7
) 氧化或硫化各別P-連接之二核苷酸(亞磷酸三酯)以形成各別磷酸二酯(P=O)或各別硫代磷酸酯(P=S)；
a8
) 視情況封端任何未反應之5'羥基；
a9
) 重複先前步驟a5
至a8
直至組裝成所需序列。
寡核苷酸合成之原理為此項技術中所熟知(參見例如寡核苷酸合成(Oligonucleotide synthesis)；維基百科(Wikipedia)，免費百科全書；https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis，2016年3月15日)。
氧化步驟通常用包含碘、有機溶劑(其通常係吡啶)及水之氧化溶液進行。
然而，觀察到當已施加新鮮製備之氧化溶液時，不僅發生式I之中間體亞磷酸三酯化合物氧化成式II之磷酸二酯化合物之所需氧化，而且，作為副反應，存在於分子中之硫代磷酸酯核苷酸間鍵可受核苷酸間鍵處之P=S至P=O轉換之影響，其導致式II之化合物內磷酸二酯鍵之含量高於預期。
因此，本發明之目標係尋找一種氧化準則，其允許將式I之亞磷酸三酯化合物選擇性氧化為式II之磷酸二酯化合物而不影響硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
已發現，可使用用於產生混合P=O/P=S主鏈寡核苷酸之方法達到本發明之目標，該方法包含使用藉由混合碘、有機溶劑及水所獲得之氧化溶液，根據以下流程將式I之中間體亞磷酸三酯化合物氧化為式II之磷酸二酯化合物
且特徵在於該氧化溶液已熟化足以將式I之亞磷酸三酯化合物選擇性氧化為式II之磷酸二酯化合物而不會氧化硫代磷酸酯核苷酸間鍵之時間段。
闡述以下定義以說明且定義用於描述本發明之不同術語之意義及範疇。
術語「C1-6
烷基」表示具有1至6個碳原子且在一更特定實施例中1至4個碳原子之單價直鏈或分支鏈飽和烴基。典型實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基，較佳地係甲基或乙基。
如本文中所使用之術語寡核苷酸被定義為技術人員一般將其理解為包含兩個或更多個共價鍵聯之核苷酸之分子。為了用作治療上有價值之寡核苷酸，寡核苷酸通常以10至40個核苷酸，較佳地10至25個核苷酸之長度合成。
寡核苷酸可由視情況經修飾之DNA或RNA核苷單體或其組合組成。
如本文所使用之視情況經修飾係指相比於等效DNA或RNA核苷，藉由引入糖部分或核鹼基部分之一或多個修飾而經修飾之核苷。
典型修飾可以係糖部分或鎖核酸(LNA)中之2'-O-(2-甲氧基乙基)-取代((2'-MOE)取代)，其係經修飾RNA核苷酸，其中核糖部分經連接2'氧及4'碳之額外橋修飾。
術語經修飾之核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾之「單元」或經修飾之「單體」互換使用。
DNA或RNA核苷酸通常藉由將兩個核苷酸共價偶合在一起之磷酸二酯(P=O)或硫代磷酸酯(P=S)核苷酸間鍵連接。
根據本發明，至少一個核苷酸間鍵必須由硫代磷酸酯(P=S)組成。因此，在一些寡核苷酸中，所有其他核苷酸間鍵可由磷酸二酯(P=O)組成，或在其他寡核苷酸中，核苷酸間鍵之序列不同且包含磷酸二酯(P=O)及硫代磷酸酯(P=S)核苷酸間鍵兩者。
因此，術語混合P=O/P=S主鏈寡核苷酸係指至少一個核苷酸間鍵必須由硫代磷酸酯(P=S)組成之寡核苷酸。
核鹼基部分可由各對應核鹼基之字母代碼(例如A、T、G、C或U)指示，其中各字母可視情況包括具有等效功能之經修飾核鹼基。例如，在例示性寡核苷酸中，對於LNA核苷，核鹼基部分用大寫字母A、T、G及Me
C (5-甲基胞嘧啶)描述，且對於DNA核苷，核鹼基部分用小寫字母a、t、g、c及Me
C描述。經修飾核鹼基包括但不限於攜帶保護基之核鹼基，該等保護基例如係第三丁基苯氧基乙醯基、苯氧基乙醯基、苯甲醯基、乙醯基、異丁醯基或二甲基甲脒基(dimethylformamidino) (參見維基百科，胺基磷酸酯之合成(Phosphoramidit-Synthese)，https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese，2016年3月24日)。
較佳地，該寡核苷酸係由視情況經修飾之DNA或RNA核苷單體或其組合組成且長度係10至40、較佳地10至25個核苷酸。
寡核苷酸合成之原理為此項技術中所熟知(參見例如寡核苷酸合成(Oligonucleotide synthesis)；維基百科，免費百科全書；https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis，2016年3月15日)。
大規模寡核苷酸合成如今使用電腦控制之合成儀以自動化方式進行。
通常，寡核苷酸合成係固相合成，其中待組裝之寡核苷酸經由其3'-端羥基共價結合至固體載體材料且在鏈組裝之全過程中與其保持附接。合適之載體係市售之巨孔聚苯乙烯載體，如來自GE Healthcare之Primer support 5G或來自Kinovate之NittoPhase®HL載體。
自樹脂之後續裂解可用濃氨水進行。磷酸酯及核苷酸鹼基上之保護基亦在此裂解程序內移除。
如上文所概述，用於產生混合P=O/P=S主鏈寡核苷酸之方法包含使用藉由混合碘、有機溶劑及水所獲得之氧化溶液，根據以下流程將式I之中間體亞磷酸三酯化合物氧化為式II之磷酸二酯化合物
且特徵在於該氧化溶液已熟化足以將式I之亞磷酸三酯化合物選擇性氧化為式II之磷酸二酯化合物而不會氧化硫代磷酸酯核苷酸間鍵之時間段。
混合P=O/P=S主鏈寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
氧化溶液通常係可藉由混合碘、有機溶劑及水所獲得之溶液。
有機溶劑可選自吡啶或經C1-6
烷基取代之吡啶(例如二甲基吡啶)，但較佳地選自吡啶。可存在另一種有機溶劑，諸如四氫呋喃。
氧化溶液係市售的，例如來自Sigma Aldrich (Merck)之氧化劑溶液。或者，可使用市售之碘及吡啶製備新鮮溶液。
吡啶或經C1-6
烷基取代之吡啶與水之體積比可在1:1至20:1、較佳地5:1至15:1之範圍內變化，但更佳地為9:1。
氧化溶液中之碘濃度可在10 mM至100 mM之範圍內，更佳地在20 mM至50 mM之範圍內。
熟化之最佳時段在很大程度上由氧化溶液熟化時之溫度決定。低熟化溫度導致較長之熟化時段，而較高的熟化溫度則顯著地縮短熟化時間。
已發現，氧化溶液之熟化可在20℃至100℃之溫度下、但較佳地在30℃至60℃之溫度下進行。
氧化溶液之熟化所需之時間段必須足以實現式I之亞磷酸三酯化合物選擇性氧化為式II之磷酸二酯化合物而不會氧化硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
通常，氧化溶液可熟化至少1天、3天、5天、10天、15天或至少20天之時間段。
如所提及，該時間段可在很大程度上視熟化溫度而變化，且對於30℃至35℃之熟化溫度而言，可在10天與150天之間變化，更通常地在20天與60天之間變化，而對於60℃至65℃之熟化溫度而言，可在1天與30天之間變化，更通常地在2天與15天之間變化。
通常，熟化伴隨著電導率(µS/cm)之增加及pH之降低。在本發明之另一實施例中，本發明之方法包含監測參數pH及電導率以確定足以將式I之亞磷酸三酯化合物選擇性氧化為式II之磷酸二酯化合物而不會氧化硫代磷酸酯核苷酸間鍵之時間段。
氧化反應中所使用之氧化劑之量可在1.1當量與15當量之間，更佳地1.5當量與4.5當量之間，最佳地2當量與4當量之間選擇。
通常，氧化反應溫度在15℃與27℃之間、更佳地在18℃與24℃之間。
藉助於說明，寡核苷酸可選自：
5'-Me C S Me U O Me C O A O G S
TS
AS
AS Me
CS
AS
TS
TS
GS
AS Me
CS A O Me C O Me C O A S Me C
-3'
加下劃線之殘基係2'-MOE核苷。硫代磷酸酯及磷酸二酯鍵之位置分別由S及O指示。應注意2'-O-(2-甲氧基乙基)-5-甲基尿苷(2'-MOE MeU)核苷有時稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)核糖胸苷(2'-MOE T)。
本文所揭示之化合物具有以下核鹼基序列：
SEQ ID No. 1: cucagtaacattgacaccac
實例 實例 1
5'-Me C S Me U O Me C O A O G S
TS
AS
AS Me
CS
AS
TS
TS
GS
AS Me
CS A O Me C O Me C O A S Me C
-3'之合成
藉由標準胺基磷酸酯化學法，使用AKTA Oligopilot 100及Primer Support Unylinker (NittoPhase LH Unylinker 330)以2.20 mmol之規模在固相上產生寡核苷酸。一般而言，採用1.4當量之DNA/2'-MOE-胺基磷酸酯。其他試劑(二氯乙酸、1-甲基咪唑、4,5-二氰基咪唑、乙酸酐、苯乙醯基二硫化物、吡啶、三乙胺)以市售來源原樣使用，且製備適當濃度之試劑溶液(參見下表1)。使用氫氧化銨實現裂解及去除保護基以得到粗製寡核苷酸。表 1 ： 標準試劑溶液
| 解阻隔 | 甲苯中之10%二氯乙酸(v/v) |
| 胺基磷酸酯 | 於乙腈中之0.2 M |
| NMI/DCI活化劑 | 乙腈中之1.0 M 4,5-二氰基咪唑/0.1 M 1-甲基咪唑 |
| 氧化劑 | 9:1吡啶/水(v/v)中之0.05 M碘；購自Sigma Aldrich或新鮮製備(參見實例) |
| 硫醇化 | 3-甲基吡啶/乙腈(1:1 v/v)中之0.2 M苯乙醯基二硫化物 |
| 封端A | 2:3:5(v/v/v)之1-甲基咪唑/吡啶/乙腈 |
| 封端B | 1:4(v/v)之乙酸酐/乙腈 |
| 胺洗液 | 乙腈中之50%三乙胺(v/v) |
| 裂解及去除保護基 | 28-32%氫氧化銨水溶液 |
實例 2
氧化劑熟化實驗實例 2.1
使用購買之氧化劑溶液表 2 ：
1
係指獲取來自商業溶液之等分試樣用於使用測試(use-test)且開始熱處理剩餘溶液之時間點。此與溶液之製備時間不同。2
溶液在30-35℃下不熟化但在1-15℃下自t=0開始儲存。3
係指相對於質譜分析法所測定之所需化合物之分子質量具有16 Da之質量差的分子的百分比，亦即其中1個P=S鍵已轉化為P=O鍵之彼等分子之百分比。
| 氧化劑批次1 | 氧化劑批次2 | ||||
| 實例 | 30-35℃下之熟化時間(天) | 總(P=O)1 3 含量(%) | 實例 | 30-35℃下之熟化時間(天) | 總(P=O)1 3 含量(%) |
| 2.1 | 01 | 7.8 | 3.1 | 01 | 14.8 |
| 2.2 | 3 | 3.5 | 3.2 | 3 | 9.3 |
| 2.3 | 6 | 1.8 | 3.3 | 6 | 4.5 |
| 2.4 | 9 | 1.7 | 3.4 | 9 | 3.4 |
| 2.5 | 162 | 4.5 | 3.5 | 162 | 11.6 |
實例 2.2
使用新鮮製備之氧化劑溶液：a) 碘溶液之製備
在室溫下將1.00 kg水添加至8.00 kg吡啶中。添加127 g碘。添加0.827 kg吡啶用於沖洗，且在乾氮氣之正壓下攪拌混合物1小時。b) 碘溶液之熟化
● 在30-35℃下熟化：
在30-35℃下將800 mL等分試樣儲存於琥珀色玻璃瓶中直至使用為止。
● 在60-65℃下熟化：
在乾氮氣之正壓下將物質保持於60-65℃之夾套式玻璃反應器中直至使用為止。表 3
：(在30-35℃下熟化)
表 4
(在60℃至65℃下熟化)
1
係指溶液之製備完成時之時間點。2
係指相對於質譜分析法所測定之所需化合物之分子質量具有16 Da之質量差的分子的百分比，亦即其中1個P=S鍵已轉化為P=O鍵之彼等分子之百分比。
| 在30℃至35℃下熟化之氧化劑批次 | ||||
| 實例 | 30-35℃下之熟化時間(天) | 總(P=O)1 2 含量(%) | pH | 電導率(µS/cm) |
| 2.6 | 01 | 15.0 | 7.31 | 186 |
| 2.7 | 9 | 8.2 | 6.38 | 1144 |
| 2.8 | 17 | 4.3 | 6.33 | 1440 |
| 2.9 | 29 | 2.0 | 6.21 | 1576 |
| 3.0 | 59 | 1.5 | 6.35 | 1654 |
| 3.1 | 122 | 1.2 | 6.18 | 1633 |
| 在60℃至65℃下熟化之氧化劑批次 | ||||
| 實例 | 60-65℃下之熟化時間(天) | 總(P=O)1 2 含量(%) | pH | 電導率(µS/cm) |
| 3.2 | 01 | 15.0 | 7.31 | 186 |
| 3.3 | 1 | 8.3 | 6.34 | 1215 |
| 3.4 | 3 | 1.5 | 6.21 | 1718 |
| 3.5 | 10 | 1.3 | 6.18 | 1970 |
| 3.6 | 30 | 1.2 | 6.09 | 2144 |
Claims (8)
- 一種用於產生混合P=O/P=S主鏈寡核苷酸之方法，該方法包含使用藉由混合碘、有機溶劑及水所獲得之氧化溶液，根據以下流程將式I之中間體亞磷酸三酯化合物氧化為式II之磷酸二酯化合物
- 如請求項1之方法，其中該有機溶劑係吡啶或經C1-6烷基取代之吡啶。
- 如請求項2之方法，其中吡啶或經C1-6烷基取代之吡啶與水之體積比係1：1至20：1。
- 如請求項2或3之方法，其中該氧化溶液中之碘濃度係10mM至100mM。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該方法包含監測pH及電導率以 確定足以將該式I之亞磷酸三酯化合物選擇性地氧化為該式II之磷酸二酯化合物而不會氧化硫代磷酸酯核苷酸間鍵之時間段。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中氧化反應中所使用之氧化劑之量係在1.1當量與15當量之間。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中氧化反應之反應溫度係在15℃與27℃之間選擇。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該寡核苷酸由視情況經修飾之DNA或RNA核苷單體或其組合組成且長度係10至40個核苷酸。
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