[go: up one dir, main page]

TWI847175B - 用於自用於細胞療法應用之基因構築體中識別基因產物變體的方法 - Google Patents

用於自用於細胞療法應用之基因構築體中識別基因產物變體的方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI847175B
TWI847175B TW111124753A TW111124753A TWI847175B TW I847175 B TWI847175 B TW I847175B TW 111124753 A TW111124753 A TW 111124753A TW 111124753 A TW111124753 A TW 111124753A TW I847175 B TWI847175 B TW I847175B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
variant
undesirable
analysis
sequences
variants
Prior art date
Application number
TW111124753A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202304530A (zh
Inventor
喬治 安德拉德
尤金 博洛廷
亞歷山大 Ｓ 法爾克
海濤 廖
Original Assignee
美商凱特製藥公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商凱特製藥公司 filed Critical 美商凱特製藥公司
Publication of TW202304530A publication Critical patent/TW202304530A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI847175B publication Critical patent/TWI847175B/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B35/00—ICT specially adapted for in silico combinatorial libraries of nucleic acids, proteins or peptides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一種用於確保用於細胞療法中之基因產物不會因產生非預期變體而帶有降低功效或毒性之風險的方法。該方法包括對基因構築體執行電腦模擬分析以識別及改變可能造成變體之序列。此外，該方法包括執行體內分析，其係由基於構築體之產物之RNA序列所組成。接著可基於來自RNA序列之間隙讀段執行變體偵測，以判定變體表現水準、變體顯著性。該方法可包括若經識別之變體係不可接受，則重複電腦模擬分析。

Description

用於自用於細胞療法應用之基因構築體中識別基因產物變體的方法
相關申請案之交互參照
本申請案主張2021年7月2日申請之美國臨時專利申請案第63/217,933號之權益，其全部內容特此以引用方式全文併入本文中。
本揭露係關於用於偵測及置換可造成基因構築體中之非所欲變體的序列之方法。
近年來，醫療技術的進展已促成免疫療法的新興使用，以治療不同類型的疾患及病症，包括各種形式的癌症。大致上，免疫療法係藉由刺激或抑制免疫反應來治療疾病。經常將患者本身的生物材料（諸如免疫細胞）之修飾版本重新引入患者體內，以起始及/或補充免疫反應。
例如，經工程改造的免疫細胞已顯示出在治療性療法（具體而言，腫瘤學）中具有所欲的特性。兩主要類型之經工程改造的免疫細胞係含有嵌合抗原受體（稱為「CAR」或「CAR-T」）及T細胞受體（「TCR」）者。此等經工程改造之細胞經工程改造以將抗原特異性賦予該等細胞，同時保留或增強其辨識及殺滅目標細胞的能力。例如，嵌合抗原受體可包含(i)抗原特異性組分（「抗原結合分子」）、(ii)胞外域、(iii)一或多個共刺激域、及(iv)一或多個活化域。各域可係異質的，亦即由衍生自（或對應於）不同蛋白質鏈之序列所組成。
透過使用基因構築體（諸如病毒載體）將遺傳元件引入細胞中係一種產生用於諸如細胞療法之應用的細胞之方法。基因構築體產生及細胞轉導需要多個生物步驟，此等步驟有可能將異質性引入產物。關於病毒載體，病毒包裝、轉導、或轉殖基因轉錄中的缺陷可能引入與預期序列不同的非所欲汙染物。此等「變體(variant)」可能表現意想不到的蛋白質序列，取決於其頻率及本質，可能降低功效，損害製造，或甚至增加諸如毒性之副作用。在轉殖基因開發階段及細胞療法開發期間，減少變體產生的可能性至關重要，以防止可能的計畫失敗。
需要的是一種系統方法，其用於偵測及識別在用於細胞療法應用之基因產物中的造成變體及潛在變體之序列。此外，需要一種用於去風險策略之改良方法，諸如變體表徵及/或DNA序列修飾，以移除偵測到的變體，若識別出變體，則可在迭代(iterative)程序中採用。
簡言之，且大致上，本揭露係關於一種用於建立用於細胞療法中之基因產物的系統及方法。在一個實施例中，該方法包括對基因構築體執行電腦模擬( in silico)分析以識別及改變造成變體之序列。此外，該方法包括執行體內分析，其包括第一RNA定序步驟以識別變體之頻率百分比，且若第一RNA定序步驟識別出基因構築體中之變體頻率大於5%，則重複電腦模擬分析。體內分析可包括第二RNA定序步驟，以識別變體之頻率百分比，且若變體係不可接受，則重複電腦模擬分析。該方法亦可包括基於來自第一RNA定序及第二RNA定序中之至少一者之間隙讀段(gapped read)執行變體偵測，以判定變體表現水準及變體顯著性。若判定變體係不可接受，則可重複電腦模擬分析以建立新的基因構築體。
在所揭示方法之一個實施例中，電腦模擬分析可包括用同義密碼子取代修飾基因構築體中之變體。此外，電腦模擬分析可包括自基因構築體中識別及移除同源序列。在一個實施例中，電腦模擬分析包括識別基因構築體中之相同序列。此外，電腦模擬分析可包括自輸入序列計算子區段組合之矩陣、及獲取各組合之漢明距離(Hamming distance)。該方法之一個實施例包括若取代增加矩陣之總和，則取代隨機同義密碼子。
在一個實施例中，體內分析包括對由基因構築體製成之產物進行RNA定序。在一個實施例中，RNA定序係以多個階段執行，以識別高頻率變體，接著識別低頻率變體。此外，體內分析可包括進行分析，以判定是否應置換低頻率變體。
在該方法之一個實施例中，變體偵測包括自供體樣本萃取RNA。此外，當執行間隙感知比對(gap aware alignment)時，在一個實施例中，可使用三個獨立的比對器。使用Wilcox秩和檢定計算變體顯著性之P值。
本揭露亦涉及一種用於確保用於細胞療法中之基因產物不會因產生非預期變體而帶有降低功效或毒性之風險的方法。該方法包括對基因構築體執行電腦模擬分析以識別及改變可能造成變體之序列。此外，該方法包括執行體內分析，其係由基於構築體之產物之RNA序列所組成。接著可基於來自RNA序列之間隙讀段執行變體偵測，以判定變體表現水準、變體顯著性。該方法可包括若經識別之變體係不可接受，則重複電腦模擬分析。
本揭露之實施例係關於一種用於偵測及置換可造成基因構築體中之非所欲變體的序列之方法。此類方法包括：對該基因構築體執行電腦模擬分析以偵測可造成該非所欲變體的該序列之存在；將偵測到之可造成該非所欲變體的該序列用替代序列置換，其中該替代序列經衍生包含同義密碼子取代；測量由該基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定；且若來自該體內分析之該基因產物中之該非所欲變體的該頻率百分比大於該非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值，則重複該電腦模擬分析步驟及該置換步驟。
本揭露之實施例係關於一種用於建立用於細胞療法中之基因產物的方法。此類方法包括以下步驟：對編碼該基因產物之基因構築體執行電腦模擬分析以識別及改變可造成非所欲變體的序列；將偵測到之可造成該非所欲變體的該序列用替代序列置換，其中該替代序列經衍生包含同義密碼子取代；測量由該基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定；若來自該體內分析之該基因產物中之該非所欲變體的該頻率百分比大於該非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值，則重複該電腦模擬步驟及該置換步驟，以建立新基因構築體；及測量由該新基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該新基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該新基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定。
本技術之其他態樣及優點將由以下實施方式並結合隨附圖式而係顯而易見的，其僅以示例方式說明本技術之原理。
本揭露解決對於一種改良系統及方法的需求，以識別基因構築體中之變體，接著選擇用於細胞療法之基因構築體。以下揭露描述一種系統方法，其用於偵測及識別在用於細胞療法應用之基因產物中的造成變體及潛在變體之序列。當識別出變體時，則可在迭代程序中採用去風險策略，諸如變體表徵及/或DNA序列修飾，以移除偵測到的變體。
將理解的是，本文中之描述僅係例示性及解釋性的，且不對所主張的技術具限制性。在本申請案中，除非另有具體說明，否則單數之使用包括複數。
本申請案中所引用之所有文獻或文獻之部分（包括但不限於專利、專利申請案、文章、書籍、及論文）出於任一目的特此以全文引用之方式明確地併入本文中。如根據本揭露所用，除非另有指示，否則下列用語應理解為具有下列意義：
如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」、及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
除非有具體陳述或自上下文中明顯可知，如本文中所使用，用語「或(or)」係理解為涵括性的且同時涵蓋「或(or)」與「及(and)」。
在本文中，將使用用語「及/或(and/or)」之處認為是具體揭露兩個指定特徵或組分之各者（包含或不包含另一者）。因此，如用於諸如「A及/或B」之詞組中的用語「及/或」在本文中係意欲包括A及B；A或B；A（單獨）；及B（單獨）。同樣地，如用於諸如「A、B、及/或C」之詞組中的用語「及/或」係意欲涵蓋下列態樣之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A（單獨）；B（單獨）；及C（單獨）。
如本文中所使用，用語「例如(e.g.,)」與「亦即(i.e.)」僅意欲以作為範例而不造成限制之方式來使用，並且不應解讀為僅指本說明書中所明示列出的那些項目。
用語「或更多(or more)」、「至少(at least)」、「多於(more than)」、及類似者（例如，「至少一(at least one)」係理解為包括但不限於至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或多於所述值。亦包括的是任何更大之數目或其間之分數。
相反地，用語「不多於(no more than)」包括少於所述值之各值。例如，「不多於100個核苷酸」包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、及0個核苷酸。亦包括的是任何更小之數目或其間之分數。
用語「複數(plurality)」、「至少二(at least two)」、「二或更多(two or more)」、「至少第二(at least second)」、及類似者係理解為包括但不限於至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。亦包括的是任何更大之數目或其間之分數。
除非具體陳述或自上下文明顯可知，如本文中所使用，用語「約(about)」係指值或組成，其係在針對該特定值或組成物之可接受誤差範圍內，如由所屬技術領域中具有通常知識者所判定，其將部分取決於該值或組成如何測量或判定，亦即測量系統之限制。例如，「約」或「大約(approximately)」可意指依據所屬技術領域中之實務在一或多於一個標準偏差內。「約」或「大約」可意指至多10%之範圍（亦即，±10%）。因此，「約」可理解為在大於或小於所述值10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、或0.001%內。例如，約5 mg可包括介於4.5 mg與5.5 mg之間的任何量。此外，特別在關於生物系統或程序時，該用語可意指值的至多一個數量級或至多5倍。當本揭露中提供特定的值或組成時，除非另有陳述，「約」或「大約」之意義應假設為在針對特定值或組成之可接受誤差範圍內。
如本文中所述，任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍、或整數範圍係理解為涵括所述範圍內之任何整數值，並且在適當時亦涵括其分數（諸如整數之十分之一及百分之一），除非另有指示。
本文中所使用之單位、前綴、及符號係使用其國際單位制(SI)公認形式來提供。數字範圍涵括定義該範圍之數字。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語具有與本揭露所相關之技術領域中具有通常知識者一般理解者相同的意義。例如，Juo, “The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology”, 2nd ed., (2001), CRC Press；“The Dictionary of Cell & Molecular Biology”, 5th ed., (2013), Academic Press；及“The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology”, Cammack et al. eds., 2nd ed, (2006), Oxford University Press為所屬技術領域中具有通常知識者提供本揭露中所使用之許多用語的通用詞典。
「投予(administering)」係指使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何各種方法及遞送系統，將劑實際引入至對象。用於本文所揭示之配方的例示性投予途徑包括靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、脊椎、或其他腸胃外投予途徑，例如藉由注射或輸注。用於本文所揭示之組成物的例示性投予途徑包括靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、脊椎、或其他腸胃外投予途徑，例如藉由注射或輸注。如本文中所使用，詞組「腸胃外投予(parenteral administration)」意指腸內及局部投予以外之投予模式（通常藉由注射），且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴內(intralymphatic)、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管(transtracheal)、皮下、表皮下(subcuticular)、關節內、囊下、蜘蛛膜下、脊椎內、硬膜外、及胸骨內注射及輸注、以及體內電穿孔。在一些實施例中，配方係經由非腸胃外途徑（例如，口服）來投予。其他非腸胃外途徑包括局部、上皮或黏膜投予途徑，例如，鼻內、陰道內、直腸、舌下、或局部。投予亦可執行例如一次、複數次、及/或在一或多個延長期間內。在一個實施例中，CAR T細胞治療係經由包含CAR T細胞之「輸注產物(infusion product)」投予。
用語「抗體(antibody)」(Ab)包括但不限於特異性結合至抗原之醣蛋白免疫球蛋白。大致上，抗體可包含由雙硫鍵所互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈、或其抗原結合分子。各H鏈包含重鏈可變區（在本文中縮寫為VH）及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定域，CH1、CH2、及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（在本文中縮寫為VL）及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定域，CL。VH及VL區可進一步細分成稱為互補決定區(CDR)之高度可變區域，其間有稱為架構區(FR)之更具保留性區域。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，以下列順序從胺基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合域。Ab之恆定區可介導免疫球蛋白對宿主組織或因子之結合，包括免疫系統之各種細胞（例如，效應細胞）及典型補體系統之第一組分(C1q)。
抗體可包括例如單株抗體、重組生產之抗體、單特異性抗體、多特異性抗體（包括雙特異性抗體）、人類抗體、經工程改造抗體、人源化抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚體抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、內抗體(intrabody)、抗體融合（在本文中有時稱為「抗體接合物(antibody conjugate)」)、異源接合物抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)、駱駝化(camelized)抗體、親和抗體(affybody)、Fab片段、F(ab’)2片段、雙硫鍵連接之Fv (sdFv)、抗獨特型(anti-idiotypic)（抗Id）抗體（包括例如抗-抗Id抗體）、微抗體(minibody)、域抗體、合成抗體（在本文中有時稱為「抗體擬似物(antibody mimetic)」)、及任何上述者之抗原結合片段。在一些實施例中，本文所述之抗體係指多株抗體群。
「抗原結合分子(antigen binding molecule)」、「抗原結合部分(antigen binding portion)」、或「抗體片段(antibody fragment)」係指包含抗體之抗原結合部分（例如，CDR）的任何分子，該分子係衍生自該抗體。抗原結合分子可包括抗原互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括但不限於形成自抗原結合分子之Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段、dAb、線性抗體、scFv抗體、及多特異性抗體。肽體(peptibody)（亦即，包含肽結合域之Fc融合分子）係合適抗原結合分子之另一個實例。在一些實施例中，抗原結合分子結合至腫瘤細胞上之抗原。在一些實施例中，抗原結合分子結合至涉及過度增生性疾病之細胞上的抗原或結合至病毒或細菌抗原。在一些實施例中，抗原結合分子結合至CD19。在進一步實施例中，抗原結合分子係特異性結合至抗原之抗體片段，包括一或多個其互補決定區(CDR)。在進一步實施例中，抗原結合分子係單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，抗原結合分子包含親合性多聚體(avimer)或由其所組成。
「抗原」係指任何引起免疫反應或能夠由抗體或抗原結合分子所結合之分子。免疫反應可涉及抗體生產、或特定免疫機能健全細胞之活化、或兩者。所屬技術領域中具有通常知識者會輕易理解到，任何巨分子（包括實際上所有蛋白質或肽）皆可作為抗原。抗原可係內源表現的，亦即由基因體DNA所表現，或可係重組表現的。抗原可對於某些組織（諸如癌細胞）具有特異性，或其可係廣泛表現的。此外，較大分子之片段可作為抗原。在一些實施例中，抗原係腫瘤抗原。
用語「中和(neutralizing)」係指結合至配體且防止或降低該配體之生物效應的抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段直接阻斷配體上之結合位點或另行透過間接方式改變配體結合之能力（諸如配體中之結構性或能量性改變）。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段防止其所結合之蛋白質執行生物功能。
用語「自體(autologous)」係指任何衍生自相同個體之材料，該材料之後會再重新引入至該個體。例如，本文所述之經工程改造自體細胞療法(eACT™)方法涉及自患者收集淋巴球，接著將其工程改造以表現例如CAR構築體，接著再投予至相同患者。
用語「同種異體(allogeneic)」係指衍生自一個個體之任何材料，接著將其引入相同物種之另一個體，例如同種異體T細胞移植。
用語「轉導(transduction)」及「經轉導(transduced)」係指經由病毒載體將外部DNA引入至細胞中之程序（參見Jones等人，「Genetics: principles and analysis」，Boston: Jones & Bartlett Publ.(1998)）。在一些實施例中，載體係反轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾司坦-巴爾(Epstein Barr)病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體、或其任何組合。
「癌症(cancer)」係指一組廣泛的各種疾病，其特徵在於體內異常細胞不受控制的生長。不受調控的細胞分裂及生長會導致惡性腫瘤形成，惡性腫瘤會侵犯鄰近組織，且亦可能透過淋巴系統或血液流轉移至身體遠處部位。「癌症」或「癌症組織」可包括腫瘤。在本申請案中，用語癌症係與惡性疾病(malignancy)同義。可藉由本文所揭示之方法治療的癌症之實例包括但不限於免疫系統之癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、及其他白血球惡性疾病。在一些實施例中，本文所揭示之方法可用於縮小衍生自例如下列之腫瘤的腫瘤大小：骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門部位癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、[添加其他實體腫瘤]多發性骨髓瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱膈腔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤(FL)、變化型濾泡淋巴瘤、脾邊緣區型淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)（包括非T細胞ALL）、慢性淋巴球性白血病(CLL)、兒童實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘導之癌症（包括由石棉誘導者）、其他B細胞惡性疾病、及該等癌症之組合。在一些實施例中，癌症係多發性骨髓瘤。在一些實施例中，癌症係NHL。特定癌症可能對化學或放射療法有反應或該癌症可能係難治性的。難治性癌症係指無法藉由外科介入來處理之癌症，並且該癌症一開始對化學或放射療法沒有反應或該癌症隨時間過去變得沒有反應。
如本文中所使用，「抗腫瘤效應(anti-tumor effect)」係指可呈現為腫瘤體積縮小、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增生減少、轉移數目減少、整體或無進展存活期增加、預期壽命增加、或與腫瘤相關之各種生理症狀改善的生物效應。抗腫瘤效應亦可指預防腫瘤發生，例如疫苗。
如本文中所使用，「細胞介素(cytokine)」係指一個細胞回應於與特異性抗原之接觸而釋出的非抗體蛋白質，其中該細胞介素與第二個細胞交互作用而介導該第二個細胞中之反應。如本文中所使用，「細胞介素」意欲指由一個細胞群釋放且作為細胞間介導物作用於另一細胞之蛋白質。細胞介素可由細胞所內源表現或投予至對象。細胞介素可由免疫細胞（包括巨噬細胞、B細胞、T細胞、及肥大細胞）釋放而傳播免疫反應。細胞介素可在受體細胞中誘導各種反應。細胞介素可包括體內恆定細胞介素、趨化因子、促發炎細胞介素、效應物、及急性期蛋白。例如，體內恆定細胞介素（包括介白素(IL) 7及IL-15）會促進免疫細胞存活及增生，而促發炎細胞介素可促進發炎反應。體內恆定細胞介素之實例包括但不限於IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、及干擾素(IFN) γ。促發炎細胞介素之實例包括但不限於IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(FGF) 2、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、可溶細胞間黏附分子1 (sICAM-1)、可溶血管黏附分子1 (sVCAM-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、及胎盤生長因子(PLGF)。效應物之實例包括但不限於顆粒酶A、顆粒酶B、可溶性Fas配體(sFasL)、及穿孔素。急性期蛋白之實例包括但不限於C反應蛋白(CRP)及血清類澱粉蛋白A (SAA)。
「趨化因子(chemokine)」係一種細胞介素類型，其介導細胞趨化性或方向性移動。趨化因子之實例包括但不限於IL-8、IL-16、伊紅趨素、伊紅趨素-3、巨噬細胞衍生之趨化因子（MDC或CCL22）、單核球趨化蛋白1（MCP-1或CCL2）、MCP-4、巨噬細胞炎性蛋白1α (MIP-1α, MIP-1a)、MIP-1β (MIP-1b)、γ誘導蛋白10 (IP-10)、及胸腺及活化調節趨化因子（TARC或CCL17）。
如本文中所使用，「嵌合受體(chimeric receptor)」係指經工程改造表面表現之分子，其能夠辨識特定分子。包含能夠與特定腫瘤抗原交互作用之結合域的嵌合抗原受體(CAR)及經工程改造T細胞受體(TCR)讓T細胞能夠靶向及殺滅表現該特定腫瘤抗原之癌細胞。在一個實施例中，T細胞治療係基於經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之T細胞，其包含(i)抗原結合分子、(ii)共刺激域、及(iii)活化域。共刺激域可包含胞外域、跨膜域、及胞內域，其中胞外域包含可經截短之鉸鏈域。
治療劑（例如，經工程改造CAR T細胞）之「治療有效量」、「有效劑量」、「有效量」、或「治療有效劑量」係當單獨使用或與其他治療劑組合使用時會保護對象免於疾病發作或促進疾病消退之任何量，其係藉由疾病症狀嚴重性減輕、無疾病症狀之頻率及持續期間增加、或導因於罹患疾病之損傷或失能預防而獲得證明。此類用語可互換使用。治療劑促進疾病消退之能力可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之各種方法評估（諸如在臨床試驗期間之人類對象中、在預測於人類中功效之動物模型系統中），或藉由檢定藥劑在體外檢定中之活性評估。
如本文中所使用，用語「淋巴球(lymphocyte)」包括自然殺手(NK)細胞、T細胞、或B細胞。NK細胞係一種細胞毒性(cytotoxic)淋巴球類型，其代表先天免疫系統之主要組分。NK細胞會除去腫瘤及受病毒感染之細胞。其透過細胞凋亡或程式性細胞死亡之程序發揮作用。其等之所以稱為「自然殺手」是因為不需要活化即可殺滅細胞。T細胞在細胞介導之免疫性（無抗體涉及）中扮演主要角色。其T細胞受體(TCR)是自其他淋巴球類型使自身分化出來。胸腺（免疫系統之特化器官）主要負責T細胞之成熟。T細胞有六種類型，即：輔助T細胞（例如CD4+細胞）、細胞毒性T細胞（亦稱為TC、細胞毒性T淋巴球、CTL、T殺手細胞、細胞溶解T細胞、CD8+ T細胞、或殺手T細胞）、記憶T細胞（(i)幹記憶TSCM細胞（如初始細胞）係CD45RO−、CCR7+、CD45RA+、CD62L+（L-選擇素）、CD27+、CD28+、及IL-7Rα+，但其亦表現大量的CD95、IL-2Rβ、CXCR3、及LFA-1，且顯示許多記憶細胞特有之功能屬性）；(ii)中央記憶TCM細胞表現L-選擇素及CCR7，其等分泌IL-2但不分泌IFNγ或IL-4；及(iii)效應記憶TEM細胞，然而其不表現L-選擇素或CCR7，但生產效應細胞介素（如IFNγ及IL-4））、調節T細胞（Treg、抑制性T細胞、或CD4+CD25+調節T細胞）、自然殺手T細胞(NKT)、及γδ T細胞。在另一方面，B細胞在體液免疫性（有抗體涉及）中扮演主要角色。其製造抗體及抗原且扮演抗原呈現細胞(APC)之角色，且在由抗原交互作用活化之後轉變成記憶B細胞。在哺乳動物中，未成熟B細胞係在骨髓中形成，因而得到其名稱。
用語「經基因工程改造(genetically engineered)」或「經工程改造(engineered)」係指修飾細胞基因體之方法，其包括但不限於缺失編碼或非編碼區或其部分、或插入編碼區或其部分。在一些實施例中，經修飾之細胞係淋巴球（例如T細胞），其可獲自患者或捐贈者。細胞可經修飾以表現外源性構築體，諸如例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其等係併入細胞基因體中。
「免疫反應(immune response)」係指免疫系統細胞（例如，T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突細胞、及嗜中性球）及由任何這些細胞或肝臟所生產之可溶巨分子（包括Ab、細胞介素、及補體）的作用，其會導致對脊椎動物體內之侵犯病原體、受病原體所感染之細胞或組織、癌性或其他異常細胞、或（在自體性或病理性發炎之情況下）正常人類細胞或組織的選擇性靶向、結合、損傷、破壞、及/或消除。
用語「免疫療法(immunotherapy)」係指罹患疾病、或有感染疾病或遭受疾病再發之風險的對象藉由包含誘導、增強、抑制、或以其他方式修改免疫反應之方法的治療。免疫療法之實例包括但不限於T細胞療法。T細胞療法可包括過繼性T細胞療法、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)免疫療法、自體細胞療法、經工程改造自體細胞療法(eACT™)、及同種異體T細胞移植。然而，所屬技術領域中具有通常知識者會認知到，本文中所揭示之調理方法會增強任何移植T細胞療法之有效性。T細胞療法之實例係描述於美國專利公開案第2014/0154228及2002/0006409號、美國專利第7,741,465號、美國專利第6,319,494號、美國專利第5,728,388號、及國際專利公開案第WO 2008/081035號。在一些實施例中，免疫療法包含CAR T細胞治療。在一些實施例中，CAR T細胞治療產物係經由輸注投予。
免疫療法之T細胞可來自所屬技術領域中已知之任何來源。例如，T細胞可體外分化自造血幹細胞群，或T細胞可獲自對象。T細胞可得自例如周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜積水、脾臟組織、及腫瘤。此外，T細胞可衍生自所屬技術領域中可得之一或多種T細胞系。T細胞亦可得自使用熟習技藝人士已知之多種技術（諸如FICOLL™分離及/或血球分離術）收集自對象的血液單元。用於T細胞療法之額外單離T細胞方法係揭示於美國專利公開案第2013/0287748號，其全文係以引用方式併入本文中。
用語「經工程改造自體細胞療法(engineered Autologous Cell Therapy)」或「eACT™」（亦稱為過繼性細胞轉移）係一種程序，藉此收集患者自身T細胞隨後對其進行基因改造以辨識並靶向在一或多種特定腫瘤細胞或惡性疾病之細胞表面上表現的一或多種抗原。T細胞可經工程改造以表現例如嵌合抗原受體(CAR)。CAR陽性(+) T細胞經工程改造以表現對連接至胞內信號傳導部分（包含至少一個共刺激域及至少一個活化域）之特定腫瘤抗原具有特異性的胞外單鏈可變片段(scFv)。CAR scFv可經設計以靶向例如CD19，其係由B細胞譜系中之細胞（包括所有正常B細胞及B細胞惡性疾病）表現的跨膜蛋白，包括但不限於非特指型之瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、原發性縱膈腔大B細胞淋巴瘤、高級別B細胞淋巴瘤、及由濾泡淋巴瘤、NHL、CLL、及非T細胞ALL引起之DLBCL。實例CAR T細胞療法及構築體係描述於美國專利公開案第2013/0287748號、第2014/0227237號、第2014/0099309號、及第2014/0050708號中，且此等參考文獻之全文係以引用方式併入本文中。
如本文中所使用，「患者(patient)」包括任何罹患癌症（例如，淋巴瘤或白血病）之人類。用語「對象(subject)」及「患者」在本文中可互換使用。
如本文中所使用，用語「體外細胞(in vitro cell)」係指任何離體培養之細胞。特定而言，體外細胞可包括T細胞。用語「體內( in vivo)」意指在患者內。
用語「肽(peptide)」、「多肽(polypeptide)」、及「蛋白/蛋白質(protein)」可互換使用，並且係指包含由肽鍵所共價連接之胺基酸殘基的化合物。蛋白質或肽含有至少兩個胺基酸，並且對於可包含蛋白質序列或肽序列之胺基酸數目上限沒有限制。多肽包括包含彼此由肽鍵所接合之二或更多個胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文中所使用，該用語係同時指短鏈（在所屬技術領域中亦經常稱為例如肽、寡肽、及寡聚物）及長鏈（在所屬技術領域中通常稱為蛋白質，而蛋白質有許多類型）。「多肽」包括例如生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽之變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括自然肽、重組肽、合成肽、或其組合。
如本文中所使用，「刺激(stimulation)」係指由刺激分子與其同族配體之結合所誘導的初級反應，其中該結合介導信號轉導事件。「刺激分子(stimulatory molecule)」係T細胞上之分子（例如T細胞受體(TCR)/CD3複合物），其與抗原呈現T細胞上存在之同族刺激配體特異性結合。「刺激配體(stimulatory ligand)」係當存在於抗原呈現細胞（例如，APC、樹突細胞、B細胞、及類似者）上時可與T細胞上之刺激分子特異性結合的配體，藉以介導由該T細胞所致之初級反應，包括但不限於活化、起始免疫反應、增生、及類似者。刺激配體包括但不限於抗CD3抗體、裝載有肽之MHC第I型分子、超級促效劑抗CD2抗體、及超級促效劑抗CD28抗體。
如本文中所使用，「共刺激信號(costimulatory signal)」係指與初級信號（諸如TCR/CD3連接）組合時會導致T細胞反應之信號，諸如但不限於關鍵分子之增生及/或向上調控或向下調控。
如本文中所使用，「共刺激配體(costimulatory ligand)」包括抗原呈現細胞上特異性結合T細胞上之同族共刺激分子的分子。共刺激配體之結合提供介導T細胞反應之信號，包括但不限於增生、活化、分化、及類似者。除了刺激分子所提供之初級信號外，共刺激配體亦藉由T細胞受體(TCR)/CD3複合物與裝載肽之主要組織相容性複合體(MHC)分子的結合誘導信號。共刺激配體可包括但不限於3/TR6、4-1BB配體、結合鐸(Toll)配體受體之促效劑或抗體、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD30配體、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒進入介導劑(HVEM)、人類白血球抗原G (HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白樣轉錄本(ILT) 3、可誘導共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、與B7-H3特異性結合之配體、淋巴毒素β受體、MHC第I型鏈相關蛋白A (MICA)、MHC第I型鏈相關蛋白B (MICB)、OX40配體、PD-L2、或程式性死亡(PD) L1。在某些實施例中，共刺激配體包括但不限於與T細胞上存在之共刺激分子特異性結合的抗體，諸如但不限於4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、與CD83特異性結合之配體、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、自然殺手細胞受體C (NKG2C)、OX40、PD-1、或腫瘤壞死因子超家族成員14（TNFSF14或LIGHT）。
「共刺激分子(costimulatory molecule)」係與共刺激配體特異性結合之T細胞上之同源結合夥伴(partner)，從而介導T細胞之共刺激反應，諸如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD33、CD45、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3（α；β；δ；ε；γ；ζ）、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配體、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96 (Tactile)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICOS、Ig α (CD79a)、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LIGHT（腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14）、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1 (CD11a/CD18)、MHC第I型分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子、SLAM (SLAMF1; CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4)、SLAMF6 (NTB-A; Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。
用語「降低(reducing)」及「減少(decreasing)」在本文中可互換使用，並且指示任何小於原始者之改變。「降低」及「減少」係相對用語，需要測量前後之間的比較。「降低」及「減少」包括完全耗盡。同樣地，用語「增加(increasing)」指示高於原始值之任何改變。「增加」、「較高(higher)」、及「較低(lower)」係相對用語，需要測量前後之間及/或參考標準之間的比較。在一些實施例中，參考值係得自一般群體者，其可係一般患者群體。在一些實施例中，參考值來自一般患者群體之四分位數分析(quartile analysis)。
對象之「治療(treatment/treating)」係指對該對象執行之任何類型的介入或程序或向該對象投予活性劑，其中目標為逆轉、減輕、改善、抑制、減緩、或預防與疾病相關之症狀、併發症或病況、或生物化學指標的發作、進展、發展、嚴重性、或再發。在一些實施例中，「治療」包括部分緩解。在另一實施例中，「治療」包括完全緩解。
如本文中所使用，用語「多功能T細胞(polyfunctional T cells)」係指每細胞共分泌至少兩種來自預指定檢測組合(panel)之蛋白質且與所生產之各蛋白質的量配合之細胞（亦即，所分泌蛋白質數量及以何強度分泌之組合）。在一些實施例中，單細胞功能概況係針對各個可評估的經工程改造T細胞群判定。概況可分類為效應組（顆粒酶B、IFN-γ、MIP-1α、穿孔素、TNF-α、TNF-β）、刺激組（GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-21）、調節組（IL-4、IL-10、IL-13、IL-22、TGF-β1、sCD137、sCD40L）、趨化組（CCL-11、IP-10、MIP-1β、RANTES）、及發炎組（IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-17F、MCP-1、MCP-4）。在一些實施例中，各細胞之功能概況使得能夠計算其他度量，包括各樣本根據細胞多功能性之細分（亦即相對於非分泌或單功能細胞，分泌多種細胞介素之細胞的百分比）、及樣本依功能組之細分（亦即樣本中之細胞分泌哪些單功能及多功能組、及其等之頻率）。
如本文中所使用，用語「四分位數(quartile)」或「象限(quadrant)」係統計用語，其描述基於數據值及其等與整組觀察結果之比較來將觀察結果區分為四個定義之區段。
如本文中所使用，用語「研究第0天(Study day 0)」係定義為對象接受第一次CAR T細胞輸注當天。研究第0天前一天將是研究第-1天。招募後及研究第-1天前之任何天將依序給予負整數值。
如本文中所使用，用語「客觀反應(objective response)」係指完全反應(CR)、部分反應(PR)、或無反應。標準係基於修改後的IWG惡性淋巴瘤反應標準(IWG Response Criteria for Malignant Lymphoma)。
如本文中所使用，用語「完全反應(complete response)」係指疾病完全解除，其變為無法藉由放射造影及臨床實驗室評估來偵測到。在給定時間無癌症證據。
如本文中所使用，用語「部分反應(partial response)」係指腫瘤有大於30%之縮小但未完全解除。標準係基於修改後的IWG惡性淋巴瘤反應標準，其中PR係定義為「至多六個最大顯性結或結團塊的直徑乘積之和(SPD)有至少50%減少」。這些結或團塊應根據所有下列者來選擇：其等應在至少2個垂直尺寸是可明確測量的；如果可能，其等應來自身體的不同區域；及其等應包括疾病之縱膈及腹膜後區域，只要涉及這些部位時。
如本文中所使用，用語「無反應(non-response)」係指在CAR T細胞輸注後從未經歷CR或PR之對象。
如本文中所使用，用語「持久反應(durable response)」係指在CAR T細胞輸注後在至少一年追蹤時仍有進行中反應之對象，針對Z1、C3僅採用6個月追蹤，因為針對此世代不再有可用之追蹤。然而，結論仍然相同。
如本文中所使用，用語「復發(relapse)」係指達到完全反應(CR)或部分反應(PR)且隨後經歷疾病進展之對象。
如本文中所使用，CAR T細胞在末梢血液中之擴增及持續性可藉由qPCR分析來監測，例如使用針對CAR之scFv部分（例如，CD19結合域之重鏈）及其鉸鏈/CD28跨膜域的CAR特異性引子。替代地，其可藉由計數CAR細胞/血液體積單位來測量。
如本文中所使用，針對CAR T細胞之排定抽血可在CAR T細胞輸注前、第7天、第2週（第14天）、第4週（第28天）、第3個月（第90天）、第6個月（第180天）、第12個月（第360天）、及第24個月（第720天）。
如本文中所使用，「CAR T細胞峰值(peak of CAR T cell)」係定義為第0天後所達到的血清中CAR+ PBMC/µL之最大絕對數目。
如本文中所使用，「到達CAR T細胞峰值之時間」係定義為第0天至達到CAR T細胞峰值當天的天數。
如本文中所使用，「第0天至第28天CAR T細胞水準之曲線下面積(AUC)」係定義為CAR T細胞水準對第0天至第28天之排定訪視作圖中的曲線下面積。此AUC測量CAR T細胞隨時間之總水準。
如本文中所使用，針對細胞介素之排定抽血係在調理化學療法前或當天（第-5天）、第0天、第1天、第3天、第5天、第7天、每隔一天（如果有的話透過住院）、第2週（第14天）、及第4週（第28天）。
如本文中所使用，細胞介素之「基線(baseline)」係定義為調理化學療法前測量的最後一次值。
如本文中所使用，在第X天相對於基線之倍數變化係定義為
如本文中所使用，「基線後細胞介素峰值(peak of cytokine post baseline)」係定義為在基線（第-5天）後至至多第28天所達到之血清中最高細胞介素水準。
如本文中所使用，CAR T細胞輸注後的「到達細胞介素峰值之時間(time to peak of cytokine)」係定義為第0天至達到細胞介素之峰值當天的天數。
如本文中所使用，第-5天至第28天「細胞介素水準之曲線下面積(AUC)」係定義為細胞介素水準對第-5天至第28天之排定訪視作圖中的曲線下面積。此AUC測量細胞介素隨時間之總水準。假使細胞介素及CAR+ T細胞係在某些離散時間點測量，則可使用梯形法則估計AUC。
如本文中所使用，用語「可忽略的影響(negligible impact)」及其界限將容易地被所屬技術領域中具有通常知識者理解。以非限制性示例方式，所屬技術領域中具有通常知識者將理解，可忽略的影響可意指下列中之一或多者：對嵌合抗原受體之表現的效應在統計學上不顯著、對嵌合抗原受體之治療功效的效應在統計學上不顯著、對患者上嵌合抗原受體之毒性的效應在統計學上不顯著、對嵌合抗原受體之表現及/或功效及/或毒性的影響不超過嵌合抗原受體之表現及/或功效及/或毒性的預定臨限。
將理解，嵌合抗原受體（CAR或CAR-T）及T細胞受體(TCR)可係經基因工程改造的受體。這些經工程改造的受體可根據所屬技術領域中已知之技術插入免疫細胞（包括T細胞）中及由免疫細胞表現。使用CAR，可將單一受體程式化以辨識特異性抗原，且當結合至該抗原時活化免疫細胞以攻擊並破壞帶有該抗原之細胞。當這些抗原存在於腫瘤細胞上時，表現該CAR之免疫細胞即可靶向及殺滅該腫瘤細胞。
CAR可經工程改造以藉由併入與標靶抗原交互作用之抗原結合分子來結合至抗原（諸如，細胞表面抗原）。如本文中所使用，「抗原結合分子(antigen binding molecule)」意指結合指定標靶分子之任何蛋白質。抗原結合分子包括但不限於抗體及其等之結合部分（諸如，免疫功能片段）。肽體(peptibody)（亦即，包含肽結合域之Fc融合分子）係合適抗原結合分子之另一個實例。
較佳地，標靶分子可包括但不限於血源性癌症相關抗原。血源性癌症相關抗原之非限制性實例包括與一或多個癌症相關的抗原，該一或多個癌症選自由下列所組成之群組：急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、少年性骨髓單核球白血病、非典型慢性骨髓性白血病、急性前骨髓細胞白血病(APL)、急性單核母細胞性白血病(acute monoblastic leukemia)、急性紅血球性白血病、急性巨核母細胞白血病、淋巴性白血病、B細胞系急性淋巴母細胞白血病(B-lineage acute lymphoblastic leukemia)、B細胞慢性淋巴球性白血病、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓化生不良症候群(MDS)、骨髓增生性疾病、骨髓性瘤(myeloid neoplasm)、骨髓性肉瘤(myeloid sarcoma)）、及母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。
在一些實施例中，抗原係選自腫瘤相關表面抗原，諸如5T4、α胎兒蛋白(AFP)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、BCMA、B-人類絨毛膜促性腺激素、CA-125、癌胚抗原(CEA)、癌胚抗原(CEA)、CD123、CD133、CD138、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD34、CD4、CD40、CD44、CD56、CD8、CLL-1、c-Met、CMV特異性抗原、CSPG4、CTLA-4、雙唾液酸神經節苷脂GD2、管至上皮黏蛋白、EBV特異性抗原、EGFR變體III (EGFRvIII)、ELF2M、內皮糖蛋白、蝶素B2、表皮生長因子受體(EGFR)、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、上皮腫瘤抗原、ErbB2(HER2/neu)、纖維母細胞相關蛋白(fap)、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、神經膠質瘤相關抗原、醣神經鞘脂質、gp36、HBV特異性抗原、HCV特異性抗原、HER1-HER2、HER2-HER3組合、HERV-K、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、HIV-1套膜醣蛋白gp41、HPV特異性抗原、人類端粒酶反轉錄酶、IGFI受體、IGF-II、IL-11Rα、IL-13R-a2、流感病毒特異性抗原；CD38、胰島素生長因子(IGFl)-l、腸羧基酯酶、κ鏈、LAGA-la、λ鏈、拉薩病毒特異性抗原、凝集素反應性AFP、譜系特異性或組織特異性抗原（諸如CD3、MAGE、MAGE-A1）、主要組織相容性複合體(MHC)分子、呈現腫瘤特異性肽表位之主要組織相容性複合體(MHC)分子、M-CSF、黑色素瘤相關抗原、間皮素、間皮素、MN-CA IX、MUC-1、mut hsp72、經突變p53、經突變p53、經突變ras、嗜中性球彈性蛋白酶、NKG2D、Nkp30、NY-ESO-1、p53、PAP、前列腺酶、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、前列腺特異性抗原、蛋白質、PSMA、RAGE-1、ROR1、RU1、RU2(AS)、表面黏附分子、生存素(surviving)及端粒酶、TAG-72、纖連蛋白之額外域A (EDA)及額外域B (EDB)及肌腱蛋白C之Al域(TnCAl)、甲狀腺球蛋白、腫瘤基質抗原、血管內皮生長因子受體-2 (VEGFR2)、病毒特異性表面抗原（諸如HIV特異性抗原，諸如HIVgpl20）、以及此等表面標記之任何衍生物或變體。
在一些實施例中，標靶分子可包括病毒感染相關抗原。本揭露之病毒感染可由任何病毒引起，包括例如HIV。此可能的標靶分子列表並不意欲具排他性。
本揭露之TCR可結合至例如腫瘤相關抗原。如本文中所使用，「腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen)」係指與選自由下列所組成之群組的一或多個癌症相關聯的任何抗原：腎上腺皮質癌、肛門癌、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、類癌、上皮癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道癌、肝外膽管癌、顱外生殖細胞癌、眼癌、膽囊癌、胃癌、生殖細胞腫瘤、妊娠性滋養層細胞腫瘤、頭頸癌、下咽癌、胰島細胞癌、腎臟癌、大腸癌、喉癌、白血病、唇及口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、惡性間皮瘤、Merkel氏細胞癌、蕈狀肉芽腫、骨髓化生不良症候群、骨髓增生性疾病、鼻咽癌、神經母細胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞癌、胰臟癌、副鼻竇及鼻腔癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、腦垂體癌、漿細胞腫瘤、前列腺癌、橫紋肌瘤、直腸癌、腎細胞癌、腎盂和輸尿管移行細胞癌、唾液腺癌、塞紮里症候群(Sezary syndrome)、皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、胃癌、睾丸癌、胸腺瘤、甲狀腺癌、尿道癌、子宮癌、陰道癌、陰門癌、及威爾姆氏瘤(Wilms' tumor)。
在某些實施例中，本揭露可適用於對血液癌症的標靶分子。在一些實施例中，癌症係白血球細胞者。在其他實施例中，癌症係漿細胞者。在一些實施例中，癌症係白血病、淋巴瘤、或骨髓瘤。在某些實施例中，癌症係急性淋巴母細胞白血病(ALL)（包括非T細胞ALL）、急性淋巴樣白血病(ALL)、及噬血球性淋巴組織細胞增生症(HLH)、B細胞前淋巴球白血病、B細胞急性淋巴樣白血病(「BALL」)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤、Burkitt氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓白血病(CML)、慢性或急性肉芽腫病、慢性或急性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤、濾泡淋巴瘤(FL)、毛細胞白血病、噬血球性症候群（巨噬細胞活化症候群(MAS)、霍奇金氏病、大細胞肉芽腫、白血球黏附缺乏症、惡性淋巴增生病況、MALT淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、意義不明單株免疫球蛋白增高症(MGUS)、多發性骨髓瘤、骨髓化生不良及骨髓化生不良症候群(MDS)、骨髓疾病（包括但不限於急性骨髓白血病(AML)）、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、漿細胞增生性病症（例如無症狀骨髓瘤（燜燃型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤））、漿母細胞淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞贅瘤、漿細胞瘤（例如漿細胞惡液質；孤立性骨髓瘤；孤立性漿細胞瘤；髓外漿細胞瘤；及多發性漿細胞瘤）、POEMS症候群（Crow-Fukase氏症候群；Takatsuki氏症；PEP症候群）、原發性縱膈腔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)、小細胞或大細胞濾泡淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、全身性類澱粉蛋白輕鏈類澱粉變性症、T細胞急性淋巴樣白血病(TALL)、T細胞淋巴瘤、變化型濾泡淋巴瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、或其組合。
本揭露之TCR亦可結合至病毒感染相關抗原。病毒感染相關抗原包含與任何病毒感染相關之抗原，包括例如由HIV引起之病毒感染。
各種實施例係進一步詳細描述於下列小節中。 變體建立
細胞療法產物（包括自體、同種異體、新抗原、及其他類型的產物）具有表現（多個）所欲或經轉染基因以外之RNA及蛋白序列的可能性。此等非標準序列（稱為變體）之表現可因至少兩種不同的機制而發生。
第一機制係RNA剪接，可導致產物表現變體，即使其已用預期基因序列轉染，因為產物被轉錄成RNA產物接著經過剪接。若產物製造程序涉及反轉錄，則RNA剪接亦可使產物被變體序列轉染（在DNA水準），因為RNA可能在被反轉錄成DNA前被剪接，接著轉染至細胞中。
第二機制係同源重組，在反轉錄係製造程序之一部分時發生。在此現象中，主動轉錄反轉錄酶在RNA模板之兩個高度類似（或相同）序列之間「跳躍(jump)」，因而跳過介入序列並產生可稍後轉染至產物中之非標準DNA轉錄本。因為此機制取決於模板中之高度類似序列，所以對於雙順反子CAR產物而言係特別的風險，其中兩個CAR可能具有一些相同的域（例如共刺激域）。
考慮到這兩種機制並研究使用慢病毒載體之習知CAR-T細胞製造程序，發現數個可能產生變體的點。第一，且如圖1之實例中所示，HEK293細胞可用產物及編碼慢病毒之質體轉染，以產生慢病毒載體。由HEK293細胞產生之RNA可在包裝至此等載體前被剪接。第二，慢病毒載體係用於轉染T細胞。此涉及產物序列之反轉錄，在其整合至T細胞基因體前，期間可能發生同源重組。第三，經轉染T細胞（現為CAR-T細胞）表現（多個）CAR，且可在將所表現之CAR mRNA轉譯成蛋白質前將其剪接。
無論起源為何，變體係非所欲的。細胞療法產物中之變體可能幾乎沒有或沒有功效。此外，變體可能造成細胞療法產物辨識不同抗原，因而造成脫靶(off target)毒性。以下係用於預測、偵測、及消除變體以防止此等結果發生之一般流程或程序的不同實施例之描述。
本揭露之實施例係關於一種用於偵測及置換可造成基因構築體中之非所欲變體的序列之方法。此類方法包括：對該基因構築體執行電腦模擬分析以偵測可造成該非所欲變體的該序列之存在；將偵測到之可造成該非所欲變體的該序列用替代序列置換，其中該替代序列經衍生包含同義密碼子取代；測量由該基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定；且若來自該體內分析之該基因產物中之該非所欲變體的該頻率百分比大於該非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值，則重複該電腦模擬分析步驟及該置換步驟。
本揭露之一實施例係關於上述方法，其中間隙感知比對包括使用至少兩個獨立的比對器。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中電腦模擬分析進一步包括：偵測在基因構築體內之複數個同源序列及複數個相同序列中之至少一者，其中複數個同源序列及複數個相同序列中之至少一者可造成基因構築體中之非所欲變體；及置換任何此類偵測到之複數個同源序列及複數個相同序列，其係藉由執行同義密碼子取代之步驟。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中電腦模擬分析進一步包括自基因構築體計算子區段組合之矩陣、及獲取子區段組合之各者之漢明距離。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中電腦模擬分析進一步包括將基因構築體中之複數個隨機同義密碼子用複數個替代序列取代，使得複數個替代序列增加矩陣之總和。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中基因構築體包括編碼嵌合抗原受體之序列。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係基於非所欲變體是否與下列中之至少一者相關來判定：非所欲變體是否對嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響、非所欲變體是否與嵌合抗原受體之結合域的變化相關、及非所欲變體是否先前已表徵為對嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中若非所欲變體對嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響，則非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係0.1%，且其中若非所欲變體與嵌合抗原受體之結合域的變化相關，則非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係0.01%。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中若非所欲變體先前已表徵為對嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響，則不執行重複電腦模擬分析步驟及置換步驟。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其進一步包括識別及移除高頻率變體之亞群及識別低頻率變體之亞群的步驟，且其中體內分析進一步包括進行分析，以判定是否應置換低頻率變體之亞群。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中若偵測到非所欲變體且其不符合上述條件或要求中之任一者，則重複電腦模擬分析步驟及序列移除步驟，以嘗試消除非所欲變體，且/或在額外研究中進一步表徵非所欲變體，以評估對潛在患者的風險。
本揭露之實施例係關於一種用於建立用於細胞療法中之基因產物的方法。此類方法包括以下步驟：對編碼該基因產物之基因構築體執行電腦模擬分析以識別及改變可造成非所欲變體的序列；將偵測到之可造成該非所欲變體的該序列用替代序列置換，其中該替代序列經衍生包含同義密碼子取代；測量由該基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定；若來自該體內分析之該基因產物中之該非所欲變體的該頻率百分比大於該非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值，則重複該電腦模擬步驟及該置換步驟，以建立新基因構築體；及測量由該新基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該新基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該新基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定。
本揭露之一實施例係關於上述方法，其中間隙感知比對包括使用至少兩個獨立的比對器。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中電腦模擬分析進一步包括以下步驟：偵測在基因構築體內之複數個同源序列及複數個相同序列中之至少一者，其中複數個同源序列及複數個相同序列中之至少一者可造成基因構築體中之非所欲變體；及置換任何此類偵測到之複數個同源序列及複數個相同序列，其包含同義密碼子取代之步驟。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中電腦模擬分析進一步包括自基因構築體計算子區段組合之矩陣、及獲取子區段組合之各者之漢明距離。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中電腦模擬分析進一步包括將基因構築體中之複數個隨機同義密碼子用複數個替代序列取代，使得複數個替代序列增加矩陣之總和。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中基因構築體包括編碼嵌合抗原受體之序列。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係基於非所欲變體是否與下列中之至少一者相關來判定：非所欲變體是否對嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響、非所欲變體是否與嵌合抗原受體之結合域的變化相關、及非所欲變體是否先前已表徵為對嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中若非所欲變體對嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響，則非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係0.1%，且其中若非所欲變體與嵌合抗原受體之結合域的變化相關，則非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係0.01%。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中若非所欲變體先前已表徵為對嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響，則不執行重複電腦模擬分析步驟及置換步驟。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其進一步包括識別及移除高頻率變體之亞群及識別低頻率變體之亞群的步驟，且其中體內分析進一步包括進行分析，以判定是否應置換低頻率變體之亞群。
本揭露之一實施例係關於上述方法中之任一者，其中若偵測到非所欲變體且其不符合上述條件或要求中之任一者，則重複電腦模擬分析步驟及序列移除步驟，以嘗試消除非所欲變體，且/或在額外研究中進一步表徵非所欲變體，以評估對潛在患者的風險。
本揭露之一實施例係關於一種用於降低用於細胞療法中之基因產物因產生非所欲變體而帶有降低功效或毒性的風險之風險的方法。此類方法包括以下步驟：對編碼基因產物之基因構築體執行電腦模擬分析以偵測可造成非所欲變體的序列之存在；將偵測到之可造成該非所欲變體的該序列用替代序列置換，其中該替代序列經衍生包含同義密碼子取代；測量由該基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定；且若來自該體內分析之該基因產物中之該非所欲變體的該頻率百分比大於該非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值，則重複該電腦模擬分析步驟及該置換步驟。 變體預測、偵測、及消除
一個實施例揭示一種用於處理變體之一般流程。此流程依賴演算法識別及移除造成潛在變體之序列，亦依賴定序及比對方法測試變體的存在。此流程之基於演算法及定序之部分係在後續章節中進一步詳細描述。
流程之一個實施例的概述係提供於圖2中。此流程使用循環邏輯，致力於在電腦模擬中識別及移除造成變體之序列，若發現變體，則接著進行實體測試及更多的電腦模擬。變體偵測係在多個定序步驟中完成，因此並未將大量精力投入可容易識別為產生變體之構築體序列中。
在此實施例中，流程係建構成具有靈活性。圖2所示之頻率截止係實例，且可使用判定是否需要處理變體之替代方法（在定序章節中論述）。同樣地，可以增加/減少序列步驟中之供體數目或添加/移除額外序列步驟（例如慢病毒載體之定序），以最大化效率或更深入地尋找變體。
參照圖2，在一個實施例中，在任何實體工作前，使計劃的構築體序列經受設計為識別剪接位點及高度同源序列（其可能造成同源重組）的演算法。若其中任一者被識別，則使用其他演算法，以經由同義密碼子取代將其移除（構建體蛋白質序列不改變）。在此初始電腦模擬篩選及修飾完成後，使用單一供體建立小批次測試產物，並使用此批次之RNA序列識別任何高頻率（例如大於約5%）變體。若發現高頻率變體，則在重新嘗試小批次建立及RNA序列之前，由經識別變體的知識指導，重複電腦模擬篩選及修飾程序。若未發現高頻率變體，則使用5至10個供體建立較大批次測試產物，並使用此批次之RNA序列識別任何低頻率(＜ 5%)變體。若發現此等變體中之任一者，則可在電腦模擬上分析序列及表現水準，以判定變體是否存在安全性/功效風險。作為此評估之一實例，僅在1%的產物中出現並導致具有經剪接共刺激域之CAR的變體不太可能成為問題，因為這可能僅導致非常小的功效降低。相比之下，在CAR之SCFv域中的剪接即使百分比很低，亦可能導致脫靶結合並因而產生毒性。若安全性/功效風險無法排除，則可建立表現此等特定變體之產物並進行實體測驗。若此等測試表明存在安全性/功效問題或無法執行，則可在電腦模擬上重新設計構築體序列並重啟整個程序。否則，若未發現低頻率變體，或確認不存在安全性/功效風險，則可准許構築體序列用於進一步開發。 剪接位點預測及移除演算法
在一個實施例中，在此流程之電腦模擬步驟期間，SpliceAI – Jaganathan et al. Cell 2019 (https://github.com/Illumina/SpliceAI)及MaxEntScan – Yeo and Burge, J Comput Biol 2003 (http://hollywood.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html)演算法可用以識別潛在供體及受體剪接位點。其他演算法可用於其他實施例中。
在一個實施例中，若由此等演算法中之任一者識別出構築體中之位點，則可使用同義密碼子取代修飾位點，直到不再偵測到變體，或其預測之剪接可能性大幅降低。此步驟不改變構築體蛋白質序列。同樣地，若已執行定序且偵測到變體，則此等演算法可用以判定變體是否可能由剪接所致，並使用同義密碼子取代以降低變體發生之可能性。 同源識別及移除演算法
由於同源重組係由構築體中高度類似序列驅動，因此本揭露描述用以幫助找出並移除此等序列的演算法及工具。如同剪接位點移除演算法，此等演算法係在初始電腦模擬步驟中運行，且若定序指示同源重組，則可在定序步驟之後重新運行。
為了識別可能造成同源重組之序列，一個實施例包括重複查找器工具。此工具分析並展示構築體序列，並繪出連接所有較給定（使用者設定）長度長之相同序列對的拱形。替代地，此工具可連接給定大小之序列對，且具有由使用者設定之萊文斯坦距離(Levenshtein distance)判斷的給定相似性水準。顯示來自重複查找器工具之輸出展示的螢幕截圖實例係顯示於圖6中。拱形之厚度取決於其連接之相同序列的長度。藉由尋找聚集在一起的拱形群組或厚拱形，使用者可容易地識別高度類似序列，即使其等並不相同。
為了降低給定構築體之所有子區段之間的相似性，一個實施例包括序列發散器工具。此工具採用長度為n（以鹼基對計）之構築體序列及使用者選擇大小為k（亦以鹼基對計）之子區段。工具接著建立在兩個維度上皆為n – k + 1之矩陣。此矩陣中之各位置(x,y)對應於在構築體序列之鹼基x及y處開始的一對子區段。此位置之值係此兩個子區段之間的漢明距離。矩陣之一實例係顯示於圖3中。通過這種設計，矩陣之總和有效地描述構築體序列與自身的相似性。具有許多高度類似子區段之構築體序列的總和將小於大部分子區段彼此不同之構築體序列的總和。此意指降低構築體之所有子區段之間的相似性，因而減低同源重組事件之可能性，係增加此矩陣之總和的問題。序列發散器藉由在整個構築體序列中進行隨機同義密碼子取代，且僅保留增加矩陣之總和的密碼子來實現這點。使用者指定數目的取代係在演算法終止且返回經修飾序列之前進行。使用者可追蹤相對於已嘗試取代數目之矩陣總和，因而瞭解需要多少個步驟。
如圖3之實例中所示，針對給定序列(AACGAACG)及給定子區段大小(4)，計算所有可能的子區段對之漢明距離(HD)。矩陣之總和描述序列之不同子區段彼此之間的相似程度，因此最大化此總和應會降低同源重組之可能性。
在另一實施例中，重複移除器工具可用以幫助防止構築體序列含有任何可能造成同源重組之相同子區段。此工具採用構築體序列及使用者選擇大小為k之子區段（以鹼基對計）。在一個實施例中，重複移除器工具接著進行一種程序，其中從構築體位置1開始，將大小為k之各子區段與構築體中所有其他子區段進行比較。若發現相同的子區段，則該子區段中之隨機同義密碼子取代係用以消除相似性。將此程序循環重複，直到掃描整個構築體未發現任何相同子區段或達到使用者定義之循環次數。此程序之一實例係顯示於圖4中。多次循環重複可能是必要的，因為有可能進行同義密碼子取代以消除一對相同序列，以引入另一對。
如圖4中所示，重複移除器工具將使用者選擇大小（例如6至10個鹼基對）之所有子區段相互比較，以查看其等是否相同。若發現相同的對，則使用同義密碼子取代將其移除。此一直持續到所有相同的對皆被移除，或在本實施例中達到使用者定義之循環次數。
儘管其等具有相同的移除可能造成同源重組之高度類似序列的目標，但序列發散器及重複移除器工具具有不同的方法及可能不同的結果。重複移除器專注於消除相同序列，並以可能產生高度類似（但不相同）序列為代價。相比之下，序列發散器專注於全局降低序列相似性，並以可能留下幾個相同序列為代價。一個實施例之電腦模擬步驟可用兩種工具以任一順序或僅用一種工具完成，此取決於何者對正在開發之特定構築體最有效。在其他實施例中，這兩種工具皆不能用於該程序，而是可使用手動移除經由重複移除器（或重複可視化器）識別高度類似序列。
此等實施例係靈活的，因為上述工具可個別使用或彼此組合使用，且可添加額外工具或功能。例如，所有三種工具皆可設定為忽略彼此在給定距離內的高度類似/相同序列。上述之所以相關是因為一些跡象指示，同源重組事件需要高度類似序列之間的最小距離才能發生。亦可以設定序列發散器及重複移除器工具，使得若已知構築體之某些區域對密碼子使用高度敏感，則此等區域不會改變。最後，可以修改序列發散器工具，以基於模擬退火邏輯，接受或拒絕同義密碼子取代，而非僅接受增加矩陣總和的取代。此可幫助工具更好地找到全域最大值。
在某些實施例中，重複查找器、序列發散器、及重複移除器工具可係個別的電腦模組。在其他實施例中，可將這三個工具程式化至單一模組或電腦中。 基於定序之變體偵測
對於可如何執行RNA定序以識別變體，有一定程度的靈活性。所欲的是定序具有足夠的品質及深度，以允許發現變體。作為一實例，在一個實施例中，可對具有HiSeq 2500定序通道之CAR-T產物進行定序，其每樣本深度為~3億個讀段，且雙端讀段長度為150 bp。
在定序後，應使用一或多個剪接感知比對器將讀段與構築體比對。基於精確比對參數及所使用的比對器，此步驟具有靈活性。此實施例已經同時使用三種不同比對器（STAR、HISAT2、及TopHat2）的良好結果，因為此有助於識別及忽略任一個比對器的錯誤（稍後論述）。
在一個實施例中，在比對後，萃取所有具有間隙比對之讀段（因為此等將指示變體），並轉譯其等將導致之產物蛋白質序列。樣本中之各變體（蛋白質序列與預定序列不同）之百分比係使用下式計算： 其中x係百分比，R係支持變體之讀段數目，n係開讀框(ORF)中之鹼基數目，且d係ORF中各位置之讀取深度（所有讀段）。
在將讀段及樣本之百分比指派給各變體後，此實施例之最終步驟係判定需要進一步研究的變體。此步驟允許一定的靈活性，且應考慮此係初始的小型篩選以識別高度表現之變體、或大型篩選以識別所有變體（參見圖2）。
一個選項係基於讀段數目建立截止。例如，若樣本具有5或更多個支持變體之讀段，則可將樣本視為對該變體呈陽性。另一選項係考慮支持變體之樣本的百分比（如圖2中所示）是否高於某個截止。在這兩種情況下，若使用來自多個供體之樣本，可建立基於多個供體之次要截止。例如，僅考慮來自給定數量或百分比的供體之樣本中呈陽性的變體。在另一實施例中，可以使用統計檢定，諸如Wilcox秩和檢定，其中各供體樣本被視為獨立實驗，以判定供體對給定變體的陽性率是否與0有顯著差異。最後，若使用多個比對器，則基於此等比對器之截止可用以解決任何流程中之不準確性。例如，若樣本在三個比對器中之至少兩者中具有5或更多個支持變體之讀段，則可將樣本視為對該變體呈陽性。替代地，只有當變體用至少兩個流程對多個供體返回正的Wilcox秩和檢定結果時，才考慮該變體。
在變體之統計分析之後，可在諸如整合基因體瀏覽器(Integrated Genomics Viewer, IGV)之程式中對變體支持及正常讀段進行目視檢查。一些明顯的變體可能來自比對誤差，可用目視檢查找出。在該程序之某些實施例中，除了執行剛才描述之檢定外，該程序可包括單離樣本中支持特定變體之所有讀段，且將其置於可容易檢查之單一BAM檔案中。 RNA-seq 剖析及生物資訊分析
在另一實施例中，RNA序列剖析及生物資訊分析包括使用FastQC（版本0.11.7）或類似者之品質控制檢查。使用FastQC之預設參數，基因構築體應通過品質控制。剖析及分析亦可包括比對步驟。為了最大化剪接事件偵測，使用3種不同的剪接感知比對器：STAR（版本2.7.3a）(PMID: 23104886)、HISAT2（版本2.1.0）(PMID: 31375807)、及TopHat2（版本2.1.0）(PMID: 23618408)，將讀段與構築體序列進行比對。可針對各工具產生對應於構築體序列之自訂比對索引。在一個實施例中，比對可在Seven Bridges平台上執行，但亦可在其他計算平台上執行。
在一個實施例中，剖析及分析可包括STAR比對。用於STAR比對之參考索引可使用 genomeGenerate指令生成， genomeSAindexNbases參數設定為5，且所有其他參數設定為其預設值。在一個實施例中，STAR中之比對可使用所有預設參數完成。在一個實施例中，以下指令可用以建立索引，並用STAR工具執行比對： STAR索引指令： STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir ./genomeDir --runThreadN 32 --genomeSAindexNbases 5 –genomeFastaFiles construct_name.fa --limitGenomeGenerateRAM 60000000000 STAR比對指令： STAR --runThreadN 32 --readFilesCommand zcat --genomeDir ./genomeDir --limitBAMsortRAM 0 --outSAMtype BAM Unsorted --readFilesIn R1.fastq.gz R2.fastq.gz
應理解的是，其他指令可用以建立索引並執行比對。
此外，剖析及分析可包括HISAT2比對。在一個實施例中，用於HISAT2比對之參考索引係使用HISAT2版本2.0.1之 hisat2-build指令生成。HISAT2比對可用啟用 --no-softclip --no-unal選項運行，且 --pen-cansplice及 --pen-noncansplice參數設定為0。所有其他參數可設定為其預設值，且隨後使用 Sambamba（版本0.6.6）(PMID: 25697820)將讀段排序。在一個實施例中，以下指令可用以建立索引，並用HISAT2工具執行比對： HISAT2索引指令： hisat2-build -p1 construct_name.fa index/ construct_name _HISAT2-2.0.1 HISAT2比對指令： hisat2 --met-file metrics.txt --no-softclip --no-unal -p 20 --pen-cansplice 0 --pen-noncansplice 0 -x ./index_files_path -1 R1_001.fastq.gz -2 R2_001.fastq.gz -S /dev/stdout
應理解的是，其他指令可用以建立索引，並用HISAT2工具執行比對。
在一個實施例中，剖析及分析步驟可包括TopHat2比對。用於TopHat2比對之參考索引可使用 BowTie2-build指令（版本2.2.6）(PMID: 21154709)或類似者生成。在一個實施例中，可用所有預設參數完成TopHat2比對。以下指令可用以建立索引，並用TopHat2工具執行比對： BowTie2-build指令： bowtie2-build -f construct.fa./ construct_name TopHat2比對： tophat2 --num-threads 1 --output-dir ./tophat_out --no-coverage-search ./construct_name R1_001.fastq.gz R2_001.fastq.gz
在一個實施例中，分析步驟包括處理讀段。在此實施例中，來自各比對方法之經比對讀段可在Seven Bridges平台上進一步處理。首先， SAMtools（版本1.6）(PMID: 19505943)、視圖函數、或類似者可用以移除所有非間隙讀段。隨後可使用 SAMtools（版本1.9），以將BAM檔案格式的剩餘間隙讀段轉換成SAM格式。接下來，可使用R（版本3.6.2）(https://www.R-project.org/)腳本( translate_and_group.R)或類似者，以將來自各間隙讀段之核苷酸序列轉譯成其對應的胺基酸序列。此腳本亦可用以計算支持各獨特間隙事件之讀段的數目。在一個實施例中，可移除具有少於10個鹼基對之突出(overhang)的間隙讀段。在一個實施例中，此腳本利用 Seqinr（版本3.6.1）(ISBN : 978-3-540-35305-8, https://cran.r-project.org/web/packages/seqinr/index.html)程序庫套件，以將間隙DNA序列轉譯為胺基酸序列。 移除非間隙讀段的 SAMtools指令： samtools view –h /path/to/input_bam.ext | awk '{if($0 ~ /^@/ || $6 ~ /N/) {print $0}}' | samtools view -Sb - ＞ input_bam_gapped.bam 將 BAM轉換成 SAM檔案格式的 SAMtools指令： samtools view --output-fmt SAM -o hits_gapped.sam hits_gapped.bam
在一個實施例中，生物資訊分析之最後步驟可使用運行R（版本3.6.2）腳本( app.R)之EC2實例，在Amazon Web Services (AWS) Virtual Private Cloud (VPC)上執行。此腳本導入由s腳本( translate_and_group.R)產生之輸出檔案、連同來自比對之BAM輸出檔案，以計算各間隙事件之發生率。用於此計算之公式係： 其中x係覆蓋百分比，R係支持間隙之讀段數目，n係開讀框(ORF)中之鹼基數目，且d係ORF中各位置之讀取深度。
在一個實施例中， app.R腳本依靠 SAMtools（版本1.10）深度函數，以計算構築體之覆蓋率，並產生BAM檔案（調用 SAMtools視圖函數），其中讀段來自每一獨特間隙事件以用於可視化目的。在此分析後，若間隙事件通過以下過濾標準，則可將此間隙事件視為變體：在3種方法之2種中 p值（無母數單一樣本Wilcoxon秩和檢定）＜ 0.01，此交叉驗證係用以最小化方法特異性人工產物(artifact)。
虛無假設及對立假設係： H 0: µ = 0 H a: µ ≠ 0
在一個實施例中，可選擇p值＜ 0.01之保守臨限以最小化偽陽性率，偽陽性率係由於單一供體中之＜ 5個讀段所支持之大量虛假推定變體，且可能係定序人工產物的結果。 報告產生
在一個實施例中，變體偵測方法可針對各變體產生並展示報告，其包括圖5中所示之以下資訊：1)預期蛋白質產物之序列、2)變體ID或編號、3)標註蛋白質產物（亦即CAR）特徵變化之圖或示意圖、4)所使用之各比對器（例如Tophat、HISAT、STAR）的比對頻率、5)偵測統計顯著性之P值（若有）、及6)與構築體比對之讀段的可視化。
所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解到，本專利標的可在不偏離其精神或基本特性的情況下以其他特定形式體現。因此，在各方面皆應將前述實施例視為說明性，而非將其視為限制本文所述之專利標的。 實例
以下實例揭示可用於RNA定序剖析及生物資訊分析中之潛在套裝軟體的例示性表格、以及可用於所揭示程序中之例示性軟體程式碼部分。 實例 1
此實例提供用於偵測及置換可造成基因構築體中之非所欲變體的序列之方法101的實例。如圖7A中所見，方法101至少包括下列步驟。方法101包括對基因構築體執行電腦模擬分析以偵測可造成非所欲變體的序列之存在的步驟103。方法101亦包括將偵測到之可造成非所欲變體的序列用替代序列置換的步驟105。在步驟105中，替代序列係經由使用同義密碼子取代而衍生。方法101包括測量由基因構築體表現之非所欲變體的頻率百分比的步驟107。步驟107包括對由基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其係藉由對自基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中非所欲變體的頻率百分比係至少部分藉由使用來自RNA定序分析之剪接感知比對器判定。方法101亦包括若來自體內分析107之基因產物中之非所欲變體的頻率百分比大於非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值，則重複電腦模擬分析步驟及置換步驟103、105。
在方法101中，步驟107需要使用至少2個獨立的比對器。此外，方法101較佳地係用於編碼嵌合抗原受體之基因構築體。
在方法101中，若非所欲變體對嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響，則非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係0.1%，且若非所欲變體與嵌合抗原受體之結合域的變化相關，則非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係0.01%。
在方法101中，若非所欲變體先前已表徵為對嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響，則不執行重複電腦模擬分析步驟及置換步驟103、105。 實例 2
此實例提供用於建立用於細胞療法中之基因產物的方法201之實例。如圖7B中所見，方法201至少包括下列步驟。方法201包括對編碼基因產物之基因構築體執行電腦模擬分析以識別及改變可造成非所欲變體的序列的步驟203。方法201亦包括將偵測到之可造成非所欲變體的序列用替代序列置換的步驟205。在步驟205中，替代序列係藉由使用同義密碼子取代而衍生。方法201包括測量由基因構築體表現之非所欲變體的頻率百分比的步驟207。步驟207包括對由基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其係藉由對自基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析。在步驟207中，非所欲變體的頻率百分比係至少部分藉由使用來自RNA定序分析之剪接感知比對器判定。方法201包括若來自體內分析之基因產物中之非所欲變體的頻率百分比大於非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值，則重複電腦模擬分析步驟及置換步驟203、205，以建立新基因構築體。方法201亦包括測量由新基因構築體表現之非所欲變體的頻率百分比的步驟209。步驟209包括對由新基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其係藉由對自新基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中非所欲變體的頻率百分比係至少部分藉由使用來自RNA定序分析之剪接感知比對器判定。
在方法201中，步驟207需要使用至少2個獨立的比對器。此外，方法201較佳地係用於編碼嵌合抗原受體之基因構築體。
在方法201中，若非所欲變體對嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響，則非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係0.1%，且若非所欲變體與嵌合抗原受體之結合域的變化相關，則非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值係0.01%。
在方法201中，若非所欲變體先前已表徵為對嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響，則不執行重複電腦模擬分析步驟及置換步驟203、205。 實例 3
［表1］：用於RNA-seq剖析及生物資訊分析之示例套裝軟體。
套件 版本
FastQC 0.11.7
STAR 2.7.3a
HISAT2 2.1.0、2.0.1
TopHat2 2.1.0
Sambamba 0.6.6
BowTie2 2.2.6
SAMtools 1.6、1.9、1.10
R 3.6.2
Digest 0.6.25
整合基因體瀏覽器(IGV) 2.4.19
bcl2fastq 2.17
實例 4
此實例提供可用於實踐所揭示方法的示例代碼部分。在圖8A中所描繪之示例代碼部分中，x係覆蓋百分比，R係支持間隙之讀段數目，n係開讀框(ORF)中之鹼基數目，且d係ORF中各位置之讀取深度（參見app.R腳本第25至45行）。 實例 5
此實例提供可用於實踐所揭示方法的示例代碼部分。在圖8B中所描繪之示例代碼部分中， app.R腳本依靠 SAMtools（版本1.10）深度函數，以計算構築體之覆蓋率，並產生BAM檔案（調用SAMtools視圖函數），其中讀段來自每一獨特間隙事件以用於可視化目的（參見app.R 48-82）。 實例 6
此實例提供可用於實踐所揭示方法的示例代碼部分。在圖8C中所描繪之示例代碼部分中，選擇p值＜ 0.01之0A保守臨限以最小化偽陽性率，偽陽性率係由於單一供體中之＜ 5個讀段所支持之大量虛假推定變體，且可能係定序人工產物的結果。（參見app.R腳本第131至136行）
本申請案中所引用之所有出版物、專利、專利申請案、及其他文件全文出於所有目以引用方式併入本文中，如同各個別出版物、專利、專利申請案、或其他文件出於所有目經個別指示以引用方式併入。
雖然已說明及描述各種具體實施例/態樣，但應理解的是，可在不脫離本揭露之精神及範疇的情況下進行各種改變。
101:方法 103:步驟 105:步驟 107:步驟 201:方法 203:步驟 205:步驟 207:步驟 209:步驟
本文所主張及/或描述之教示係就例示性實施例來進一步描述。該等例示性實施例係參照圖式來詳細描述。該等實施例係非限制性的例示性實施例，其中相似的元件符號在圖式的若干視圖中均表示類似結構，且其中： 〔圖1〕描繪在細胞療法製造期間建立變體的一種可能性之概述。 〔圖2〕描繪變體預測、偵測、及消除程序之一個實施例。 〔圖3〕描繪可用於所揭示程序中之序列發散器矩陣的實例。 〔圖4〕描繪可用於所揭示程序中之重複移除器工具的例示性程序。 〔圖5〕描繪顯示可用於所揭示程序中之變體報告模板的螢幕截圖實例。 〔圖6〕描繪顯示來自識別相同序列之重複查找器及可視化器(Repeat Finder and Visualizer)工具之輸出的螢幕截圖實例。 〔圖7A〕係流程圖，其描繪根據本揭露之一實施例的用於偵測及置換可造成基因構築體中之非所欲變體的序列之例示性程序。 〔圖7B〕係流程圖，其根據本揭露之一實施例的用於建立用於細胞療法中之基因產物的例示性程序。 〔圖8A〕至〔圖8C〕描繪可用以實踐所揭示方法的示例代碼部分。

Claims (20)

  1. 一種用於偵測及置換可造成基因構築體中之非所欲變體的序列之方法，其包含：對該基因構築體執行電腦模擬分析以偵測可造成該非所欲變體的該序列之存在；將偵測到之可造成該非所欲變體的該序列用替代序列置換，其中該替代序列經衍生包含同義密碼子取代；測量由該基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定；及若來自該體內分析之該基因產物中之該非所欲變體的該頻率百分比大於該非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值，則重複該電腦模擬分析步驟及該置換步驟。
  2. 如請求項1之方法，其包含使用至少兩個獨立的比對器以執行間隙感知比對。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該電腦模擬分析進一步包含：偵測在該基因構築體內之複數個同源序列及複數個相同序列中之至少一者，其中該複數個同源序列及該複數個相同序列中之該至少一者可造成該基因構築體中之非所欲變體；及 置換任何此類偵測到之複數個同源序列及複數個相同序列，其包含同義密碼子取代之步驟。
  4. 如請求項1或2之方法，其中該電腦模擬分析進一步包含自該基因構築體計算子區段組合之矩陣、及獲取該等子區段組合之各者之漢明距離(Hamming distance)。
  5. 如請求項4之方法，其中該電腦模擬分析進一步包含將該基因構築體中之複數個隨機同義密碼子用複數個替代序列取代，使得複數個替代序列增加該矩陣之總和。
  6. 如請求項1或2之方法，其中該基因構築體包含編碼嵌合抗原受體之序列。
  7. 如請求項6之方法，其中非所欲變體的可接受頻率百分比之該預定值係基於該非所欲變體是否與下列中之至少一者相關來判定：該非所欲變體是否對該嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響、該非所欲變體是否與該嵌合抗原受體之結合域的變化相關、及該非所欲變體是否先前已表徵為對該嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響。
  8. 如請求項6之方法，其中若該非所欲變體對該嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響，則該非所欲變體的可接受頻率百分比之該預定值係0.1%，且其中若該非所欲變體與該嵌合抗原受體之結合域的變化相關，則該非所欲變體的可接受頻率百分比之該預定值係0.01%。
  9. 如請求項6之方法，其中若該非所欲變體先前已表徵為對該嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響，則不執行該重複該電腦模擬分析步驟及該置換步驟。
  10. 如請求項1或2之方法，其進一步包含識別及移除高頻率變體之亞群及識別低頻率變體之亞群，且其中該體內分析進一步包含進行分析，以判定是否應置換低頻率變體之該亞群。
  11. 一種用於建立用於細胞療法之基因產物的方法，其包含：對編碼該基因產物之基因構築體執行電腦模擬分析以識別及改變可造成非所欲變體的序列；將偵測到之可造成該非所欲變體的該序列用替代序列置換，其中該替代序列經衍生包含同義密碼子取代；測量由該基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定；若來自該體內分析之該基因產物中之該非所欲變體的該頻率百分比大於該非所欲變體的可接受頻率百分比之預定值，則重複該電腦模擬步驟及該置換步驟，以建立新基因構築體；及測量由該新基因構築體表現之該非所欲變體的頻率百分比，其包含對由該新基因構築體表現之一或多個基因執行體內分析，其包含對自該新基因構築體轉錄的RNA產物執行RNA定序分析，其中該非所欲變體的該頻率百分比係至少部分藉由使用來自該RNA定序分析之剪接感知比對器判定。
  12. 如請求項11之方法，其包含使用至少兩個獨立的比對器以執行間隙感知比對。
  13. 如請求項11或12之方法，其中該電腦模擬分析進一步包含：偵測在該基因構築體內之複數個同源序列及複數個相同序列中之至少一者，其中該複數個同源序列及該複數個相同序列中之該至少一者可造成該基因構築體中之非所欲變體；及置換任何此類偵測到之複數個同源序列及複數個相同序列，其包含同義密碼子取代之步驟。
  14. 如請求項11或12之方法，其中該電腦模擬分析進一步包含自該基因構築體計算子區段組合之矩陣、及獲取該等子區段組合之各者之漢明距離。
  15. 如請求項14之方法，其中該電腦模擬分析進一步包含將該基因構築體中之複數個隨機同義密碼子用複數個替代序列取代，使得複數個替代序列增加該矩陣之總和。
  16. 如請求項11或12之方法，其中該基因構築體包含編碼嵌合抗原受體之序列。
  17. 如請求項16之方法，其中非所欲變體的可接受頻率百分比之該預定值係基於該非所欲變體是否與下列中之至少一者相關來判定：該非所欲變體是否對該嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響、該非所欲變體是否與該嵌合抗原受體之結合域的變化相關、及該非所欲變體是否先前已表徵為對該嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響。
  18. 如請求項16之方法，其中若該非所欲變體對該嵌合抗原受體向細胞表面的輸出產生負面影響，則該非所欲變體的可接受頻率百分比之該預定值係0.1%，且其中若該非所欲變體與該嵌合抗原受體之結合域的變化相關，則該非所欲變體的可接受頻率百分比之該預定值係0.01%。
  19. 如請求項16之方法，其中若該非所欲變體先前已表徵為對該嵌合抗原受體之表現或功能造成可忽略的影響，則不執行該重複該電腦模擬分析步驟及該置換步驟。
  20. 如請求項11或12之方法，其進一步包含識別及移除高頻率變體之亞群及識別低頻率變體之亞群，且其中該體內分析進一步包含進行分析，以判定是否應置換低頻率變體之該亞群。
TW111124753A 2021-07-02 2022-07-01 用於自用於細胞療法應用之基因構築體中識別基因產物變體的方法 TWI847175B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163217933P 2021-07-02 2021-07-02
US63/217,933 2021-07-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202304530A TW202304530A (zh) 2023-02-01
TWI847175B true TWI847175B (zh) 2024-07-01

Family

ID=82786478

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111124753A TWI847175B (zh) 2021-07-02 2022-07-01 用於自用於細胞療法應用之基因構築體中識別基因產物變體的方法
TW113126487A TW202505033A (zh) 2021-07-02 2022-07-01 用於自用於細胞療法應用之基因構築體中識別基因產物變體的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW113126487A TW202505033A (zh) 2021-07-02 2022-07-01 用於自用於細胞療法應用之基因構築體中識別基因產物變體的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230103457A1 (zh)
EP (1) EP4364151A1 (zh)
JP (1) JP2024525485A (zh)
KR (1) KR20240028503A (zh)
CN (1) CN117597738A (zh)
AU (2) AU2022301201C1 (zh)
CA (1) CA3224722A1 (zh)
IL (1) IL309431A (zh)
TW (2) TWI847175B (zh)
WO (1) WO2023278619A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2628173A (en) * 2023-03-17 2024-09-18 Thermo Fisher Scient Geneart Gmbh Methods of producing modified nucleic acid sequences for eliminating adverse splicing events
CN118633552B (zh) * 2024-08-15 2024-10-18 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） 一种鱼类种质资源调配处理方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108604260A (zh) * 2016-01-11 2018-09-28 艾迪科基因组公司 用于现场或基于云的dna和rna处理和分析的基因组学基础架构
TW201932482A (zh) * 2017-11-01 2019-08-16 美商奇諾治療有限公司 對b細胞成熟抗原具特異性之嵌合抗原受體及編碼聚核苷酸

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5728388A (en) 1989-10-03 1998-03-17 Terman; David S. Method of cancer treatment
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US6406699B1 (en) 1999-10-05 2002-06-18 Gary W. Wood Composition and method of cancer antigen immunotherapy
GB0700058D0 (en) 2007-01-03 2007-02-07 Scancell Aps Anti-tumor vaccine based on normal cells
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
WO2012099973A2 (en) 2011-01-18 2012-07-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
EP2532740A1 (en) 2011-06-11 2012-12-12 Michael Schmück Antigen-specific CD4+ and CD8+ central-memory T cell preparations for adoptive T cell therapy
WO2013040557A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna engineered t cells for the treatment of cancer
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
WO2017056094A1 (en) * 2015-09-30 2017-04-06 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Attenuated virus mutated at sites of evolutionarily conserved rna structure

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108604260A (zh) * 2016-01-11 2018-09-28 艾迪科基因组公司 用于现场或基于云的dna和rna处理和分析的基因组学基础架构
TW201932482A (zh) * 2017-11-01 2019-08-16 美商奇諾治療有限公司 對b細胞成熟抗原具特異性之嵌合抗原受體及編碼聚核苷酸

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
期刊 Eung Jun Im, et al., "Recombination-deletion between homologous cassettes in retrovirus is suppressed via a strategy of degenerate codon substitution", Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, Vol.1: 14022, 無, 9 July 2014, doi: 10.1038/mtm.2014.22;期刊 Ji Hyung Hong, et al., "RNA variant identification discrepancy among splice-aware alignment algorithms", PLoS One, Vol.13,No.8: e0201822, 無, 2 August 2018, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201822 *
期刊 Ji Hyung Hong, et al., "RNA variant identification discrepancy among splice-aware alignment algorithms", PLoS One, Vol.13,No.8: e0201822, 無, 2 August 2018, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201822

Also Published As

Publication number Publication date
AU2025205540A1 (en) 2025-08-07
AU2022301201A9 (en) 2024-01-25
WO2023278619A1 (en) 2023-01-05
AU2022301201A1 (en) 2024-01-18
JP2024525485A (ja) 2024-07-12
IL309431A (en) 2024-02-01
CN117597738A (zh) 2024-02-23
TW202304530A (zh) 2023-02-01
CA3224722A1 (en) 2023-01-05
AU2022301201B2 (en) 2025-04-17
US20230103457A1 (en) 2023-04-06
AU2022301201C1 (en) 2025-11-06
TW202505033A (zh) 2025-02-01
EP4364151A1 (en) 2024-05-08
KR20240028503A (ko) 2024-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240288444A1 (en) Biomarkers predictive of cytokine release syndrome
KR102349677B1 (ko) T 세포 요법을 위해 환자를 컨디셔닝하는 방법
CN104427997B (zh) 对cars的抗肿瘤活性的毒性管理
JP2024059707A (ja) 腫瘍微小環境の特性を使用するキメラ受容体ｔ細胞治療
JP2022166297A (ja) 最適化された多機能性ｔ細胞を含むキメラ受容体ｔ細胞を使用する治療
AU2025205540A1 (en) A method for identifying variants in gene products from gene constructs used in cell therapy applications
JP2024016200A (ja) キメラ抗原受容体療法のｔ細胞の増殖動態及びその使用
US20220152104A1 (en) T cell receptors and methods of use thereof
US20220169695A1 (en) T cell receptors and methods of use thereof
US20220168345A1 (en) T cell receptors and methods of use thereof
US20240316201A1 (en) Engineered immune effector cells expressing exogenously introduced cytokines
WO2024220437A2 (en) Compositions and methods for determining the effects of t cell engager
EP4499686A1 (en) Anti-wt1 antigen-binding proteins and uses thereof
HK40011995A (zh) 使用包含優化的多功能t細胞的嵌合受體t細胞進行治療