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TWI846416B - 細胞外基質組合物的製造方法 - Google Patents

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TWI846416B
TWI846416B TW112112766A TW112112766A TWI846416B TW I846416 B TWI846416 B TW I846416B TW 112112766 A TW112112766 A TW 112112766A TW 112112766 A TW112112766 A TW 112112766A TW I846416 B TWI846416 B TW I846416B
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三鼎生物科技股份有限公司
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Abstract

本發明公開一種細胞外基質組合物的製造方法。細胞外基質組合物的製造方法包括提供膠體、進行交聯處理、進行單一種細胞培養、進行去交聯處理以及進行提取處理。交聯處理是對膠體加入交聯劑，以得到經交聯的膠體。單一種細胞培養是將單一種細胞種植於經交聯的膠體上，並加入培養液進行培養。去交聯處理是對經交聯的膠體加入去交聯劑，以得到含細胞外基質的去交聯混合液。提取處理是過濾去交聯混合液，以提取液態的細胞外基質組合物。

Description

細胞外基質組合物的製造方法
本發明涉及一種可選擇性的單一細胞源外基質組合物的製造方法，特別是涉及一種用於製備生物墨水之細胞外基質組合物的製造方法。
細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是由細胞合成並分泌至胞外的成分，主要包含纖維、多糖、蛋白聚糖等，用於提供細胞結構上的支撐，並可調控細胞的行為。由於細胞外基質有助於器官形成和組織再生，而被廣泛應用於生醫材料領域。
現有技術中量產細胞外基質的方法是通過將如小鼠肝臟等動物組織絞碎，以取得該組織中多種細胞的複合外基質混合物。儘管該方法易取得高濃度細胞外基質，由於來源因法規及道德倫理因素無法直接採用人類臟器進行提取，並因臟器組織內含多種細胞與組成比例差異，導致無法控制所產出的細胞外基質批次穩定性，致使該方法所生產的細胞外基質所衍生的產品於臨床的應用上有安全性的風險。亦無法透過單一細胞來源以控制細胞外基質批次穩定性。
另外，較少使用的方法是在細胞培養於平面培養皿後，先將細胞培養物冷凍乾燥24小時，再以刮刀將細胞培養物從培養皿上刮除，以將細胞培養物與培養皿分離，隨後從中提取出細胞外基質。然而，由於此種方法 需要進行冷凍乾燥處理而所需的處理時間較長，且在刮除步驟中會產生極高的耗損量並容易受到人為操作影響，從而降低細胞外基質的產量，並同時需要數量極多或使用面積極大的細胞培養皿才可能實現商業量產的可能，但由生產耗時及重耗損量大因此該方法不具備商業效益。
故，如何通過製備方法的改良，來提升細胞外基質的產量，來克服上述的缺陷，已成為該項事業所欲解決的重要課題之一。
本發明所要解決的技術問題在於，針對現有技術的不足提供一種細胞外基質組合物的製造方法，所述方法包括：提供一膠體、進行一交聯處理、進行單一種細胞培養、進行一去交聯處理以及進行一提取處理。所述交聯處理是對所述膠體加入一交聯劑，以得到一經交聯的膠體。所述單一種細胞培養是將單一種細胞種植於所述經交聯的膠體上，並加入一培養液進行培養。所述去交聯處理是對所述經交聯的膠體加入一去交聯劑，以得到含細胞外基質的一去交聯混合液。所述提取處理是對所述去交聯混合液加入一裂解酵素，並進行過濾，以得到一提取的細胞外基質組合物。
在本發明的一實施例中，所述膠體為3至5體積百分比的海藻酸鈉。
在本發明的一實施例中，所述膠體為二維膠體或三維膠體，當所述膠體為二維膠體時，所述二維膠體的高度為10mm至40mm，當所述膠體為三維膠體時，所述三維膠體為微米級球型結構或層狀列印結構，所述微米級球型結構的平均粒徑為0.2mm至2mm。
在本發明的一實施例中，所述交聯劑為氯化鈣、氯化鋇、氯化鋅、碳酸鈣、硫酸鈣或乳酸鈣。
在本發明的一實施例中，所述細胞為人源與動物源的間充質幹細胞、人源肝癌細胞、纖維母細胞或表皮幹細胞。
在本發明的一實施例中，所述培養液包含50μg/ml至100μg/ml的抗壞血酸。
在本發明的一實施例中，所述去交聯劑為檸檬酸鈉或乙二胺四乙酸。
在本發明的一實施例中，在進行所述去交聯處理之前，還進一步包括加入一去細胞液以一去細胞處理。
在本發明的一實施例中，在進行所述提取處理之前，還進一步包括在所述去交聯混合液中加入裂解酵素混合攪拌。
在本發明的一實施例中，所述提取處理是以孔徑為0.22μm的過濾器過濾所述去交聯混合液。
本發明的其中一有益效果在於，本發明所提供的細胞外基質的製造方法，其能通過“所述交聯處理是對所述膠體加入一交聯劑”以及“所述去交聯處理是對所述膠體加入一去交聯劑，以得到含細胞外基質的一去交聯混合液”的技術方案，以提升細胞外基質的產量。
為使能更進一步瞭解本發明的特徵及技術內容，請參閱以下有關本發明的詳細說明與圖式，然而所提供的圖式僅用於提供參考與說明，並非用來對本發明加以限制。
S100~S500:步驟
圖1為本發明細胞外基質組合物的製作方法的流程圖。
圖2A為表示在不同培養方式下，總蛋白濃度之差異的柱狀圖。
圖2B為表示在不同培養方式下，dECM/細胞之差異的柱狀圖。
圖3為表示在不同培養方式下，DNA殘留量之差異的柱狀圖。
圖4A為表示在不同培養方式下，細胞數量之差異的柱狀圖。
圖4B為表示在不同培養方式下，細胞貼附數量之差異的柱狀圖。
圖4C為表示在不同培養方式下，細胞擴散面積之差異的柱狀圖。
圖5A為表示在不同培養方式下，總蛋白濃度之差異的柱狀圖。
圖5B為表示在不同培養方式下，總蛋白濃度之差異的柱狀圖。
圖6為表示在不同培養方式下，DNA殘留量之差異的柱狀圖。
以下是通過特定的具體實施例來說明本發明所公開有關“細胞外基質組合物的製造方法”的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所公開的內容瞭解本發明的優點與效果。本發明可通過其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節也可基於不同觀點與應用，在不背離本發明的構思下進行各種修改與變更。另外，本發明的附圖僅為簡單示意說明，並非依實際尺寸的描繪，事先聲明。以下的實施方式將進一步詳細說明本發明的相關技術內容，但所公開的內容並非用以限制本發明的保護範圍。另外，本文中所使用的術語“或”，應視實際情況可能包括相關聯的列出項目中的任一個或者多個的組合。
參閱圖1所示，本發明的提供一種細胞外基質組合物的製造方法，其至少包括下列幾個步驟：S100：提供膠體、步驟S200：進行交聯處理、步驟S300：進行單一種細胞培養、步驟S400進行去交聯處理以及步驟S500：進行提取處理。
具體而言，步驟S100中提供的膠體可為3至5體積百分比的海藻酸鈉(sodium alginate)，當海藻酸鈉的濃度小於3體積百分比時，交聯處理後形成的膠體質地不夠堅固，當海藻酸鈉的濃度大於5體積百分比時，在交聯處理時會過度成形，不易形成平整的膠體型態。因此，海藻酸鈉的濃度為3至5體積百分比的海藻酸鈉可以在交聯處理之後提供細胞穩定的承載面。
此外，海藻酸鈉的黏度可為1至100cP，以利於平舖在培養容器的底面。在本發明的一實施例中，膠體的高度為10mm至40mm，當膠體高度小於10mm時，在操作過程中膠體容易破裂，若膠體高度大於40mm，則容易導致後續交聯反應不均勻。
在本發明的一實施例中，可進一步在膠體中加入細胞所需的營養成分，例如維生素及生長因子，以刺激刺激細胞增殖和細胞分化，提高細胞的生長速度。
在步驟S200中，對膠體加入交聯劑，使得膠體由原先的膠態轉變為果凍狀的固態，得到經交聯的膠體。交聯劑是能使多個線型分子相互鍵合交聯成網狀結構的物質。在本發明中，交聯劑可含有二價以上的金屬離子。舉例而言，交聯劑可為氯化鈣、、氯化鋇、氯化鋅、碳酸鈣、硫酸鈣或乳酸鈣。在本發明的一較佳的實施例中，交聯劑為5至25體積百分比的氯化鈣溶液，海藻酸鈉：氯化鈣的交聯體積比可為1至8.5，以達到較佳的交聯效果。
此外，步驟S200中的交聯時間可為5至10分鐘，若交聯時間少於5分鐘，只有膠體外圍被固化，導致固化不完整，若交聯時間多於10分鐘，不具經濟效益。交聯溫度可為4至37度C。在交聯處理之後，以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)對膠體清洗兩次，以移除 殘餘的交聯劑。應說明的是，本發明經交聯的膠體之狀態不會再受溫度改變而產生變化。
在步驟S300中，將細胞種植於經交聯的膠體上，並加入培養液進行培養。本發明所採用的細胞可為人源與動物源的間充質幹細胞、肝癌細胞、纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞或表皮幹細胞。種植的細胞密度較佳為51000個細胞/平方公分至85000個細胞/平方公分。
在本發明的一實施例中，培養液的成分可包含甘胺酸(glycine)、L-精胺酸鹽酸鹽(L-arginine hydrochloride)、L-麩醯胺酸(L-glutamine)、L-異白胺酸(L-isoleucine)、L-白胺酸(L-leucine)、L-甲硫胺酸(L-methionine)、L-苯丙胺酸(L-phenylalanine)、L-絲胺酸(L-serine)、L-蘇胺酸(L-threonine)、L-色胺酸(L-tryptophan)、L-纈胺酸(L-valine)、氯化膽鹼(choline chloride)、泛酸鈣(calcium pantothenate)、菸鹼胺(niacinamide)、鹽酸吡哆辛(pyridoxine hydrochloride)、核黃素(riboflavin)、硫胺(thiamine hydrochloride)及D-葡萄糖(D-glucose)。
在本發明一較佳的實施例中，培養液可進一步包含50μg/ml至100μg/ml的抗壞血酸，以增加細胞生長數。換句話說，抗壞血酸在培養液中的濃度可為0.005%至0.01%。
在本發明的一實施例中，單一種細胞培養在pH值為7.2至7.4，5%至10% CO2的環境下培養3至7天。單一種細胞培養完成後，移除培養液，並以PBS清洗1次。在進行步驟S400的去交聯處理之前，可先藉由去細胞液進行去細胞處理，以利於製備生物相容性更佳的細胞外基質。在本發明中，去細胞液可為氫氧化銨(NH4OH)及非離子型表面活性劑的混合液。舉例來說，非離子型表面活性劑可為Triton X-100、十二烷基麥芽糖苷、洋地黄皂苷、tween 20，tween 80等。
在本發明的一較佳實施例中，去細胞處理可以20mM的氫氧化銨與0.5至1體積百分比的Triton X-100處理5至15分鐘，然後以PBS清洗2次。然而，上述所舉的例子只是其中一可行的實施例而並非用以限定本發明。
在步驟S400中，對經交聯的膠體加入去交聯劑，以得到含細胞外基質的去交聯混合液。在本發明的一實施例中，去交聯劑可為檸檬酸鈉或乙二胺四乙酸。舉例而言，去交聯處理是對經交聯的膠體加入0.3M至0.6M的檸檬酸鈉，使檸檬酸鈉的含量為膠體的1.3%至2.6%，並將整個膠體與檸檬酸鈉混合攪拌1至3小時之後，於4℃下反應8至16小時完成膠體去交聯處理，經過去交聯處理之後的膠體呈現液態且含細胞外基質的去交聯混合液。
在步驟S500中，對去交聯混合液進行提取處理，以得到液態的細胞外基質組合物。具體而言，提取處理是以孔徑為0.22μm的過濾器過濾去交聯混合液。較佳地，在進行提取處理之前，可以先在去交聯混合液中加入裂解酵素混合攪拌3至6小時，以增加提取效率。舉例而言，裂解酵素可以是胃蛋白酶(pepsin)、膠原蛋白酶(collagenase)。裂解酵素的用量占的0.4%至1.2%。在本發明中，細胞外基質組合物包含0.12%以上的細胞外基質的總蛋白濃度。
在本發明的一實施例中，為了提供裂解酵素適當的反應環境，可以1N至3N的鹽酸(HCl)將pH值調整至2至4，待完成裂解處理之後，再以氫氧化鈉(NaOH)進行酸鹼中和，將pH值調整至7至8混合攪拌1小時之後再進行過濾。
在本發明的一實施例中，提取處理可包括第一提取處理及第二提取處理。在第一提取處理中，先以10μm的過濾器進行過濾得到第一濾液。隨後在第一濾液中加入去離子水(ddH2O)攪拌10至30分鐘，再進行第二提 取處理。第二提取處理是採用0.22μm的過濾器進行過濾，以得到純度較高的細胞外基質組合物(dECM gel)。較佳地，第一提取處理及第二提取處理採用負壓過濾，以增加提取處理的效率。
需進一步說明的是，步驟S100中提供的膠體可採用二維膠體生產製程或三維膠體生產製程。在二維膠體生產製程中，膠體平舖在培養容器的底面，使得細胞不直接接觸培養容器的承載面。在三維膠體生產製程中，膠體可呈現微米級球型結構或層狀列印結構。二維膠體生產製程與三維膠體生產製程將在下文中詳細描述。
參閱圖2A至2B、圖3及圖4A至圖4C，在本發明的一實施例中，採用二維膠體生產製程，將濃度為4體積百分比的海藻酸鈉鋪平培養皿至膠體層高度為20mm，加入10體積百分比的氯化鈣進行交聯5分鐘，然後使用PBS清洗兩次，以移除殘餘的交聯劑。在膠體層上以51000個細胞/平方公分的密度種植纖維母細胞，培養5天後移除培養液，用PBS清洗一次，加入20mM NH4OH及1體積百分比的Triton X-100處理10分鐘，用PBS清洗兩次。對膠體層加入0.4M檸檬酸鈉後，將整個膠體層與檸檬酸鈉一同倒入燒杯混合攪拌2小時，並置於4℃下反應8小時完成去交聯處理。在提取處理中，將pH值調整為2之後加入240mg的胃蛋白酶混合攪拌3小時，然後將pH值調整為7混合攪拌1小時，隨後以10μm的過濾器進行負壓過濾。最後，加入去離子水至240ml混合攪拌10分鐘，再用0.22μm的過濾器負壓過濾，得到dECM gel。
作為比較例，與本案的差異在於，比較例是直接以51000個細胞/平方公分的密度在培養皿上種植纖維母細胞進行單一種細胞培養，即細胞會直接貼附在培養皿上。在單一種細胞培養5天之後，移除培養液，用PBS清洗一次，加入20mM NH4OH及1體積百分比的Triton X-100處理10分鐘，用PBS 清洗兩次。隨後，將培養皿使用冷凍乾燥機凍乾24小時，再以刮刀將刮取培養皿上凍乾後的細胞粉末進行提取。在提取處理中，將pH值調整為2之後加入240mg的胃蛋白酶混合攪拌3小時，然後將pH值調整為7混合攪拌1小時，隨後以0.22μm的過濾器負壓過濾，得到dECM溶液。
將前述實施例與比較例以Bio-Rad蛋白測定套組測量總蛋白濃度，藉由試劑與蛋白質結合並採用比色法測定吸光值，進一步推算蛋白質濃度，如圖2A及圖2B所示，本發明實施例的總蛋白濃度為38.21±4.65mg，高於比較例的19.00±4.58mg。另外，計算平均每顆細胞所產生的dECM量，本發明實施例為0.76±0.09dECM/cells(ng)，亦高於比較例的0.38±0.09dECM/cells(ng)。由此可見，本發明細胞外基質組合物的製造方法相較於習知方法(比較例)，具有較高的產能。
請參閱圖3所示，係比較本發明實施例與比較例的DNA殘留量。dECM中DNA含量的測定是採用dsDNA Assay Kit將樣品在545nm波長處測定吸光值，計算DNA含量。本發明細胞外基質組合物的製造方法包含去細胞處理，而能在提高產量的同時也具有優異的去細胞效果，使得dECM成品幾乎無DNA殘留。
值得注意的是，將本發明dECM gel用於細胞培養能有助於細胞增長。參閱圖4A至圖4C，在初始為2x105個纖維母細胞的培養皿中，分別加入相同份量的由本發明的二維膠體生產製程製得的dECM gel及比較例製得的dECM溶液培養24小時。如圖4A的結果所示，在加入本發明的dECM gel的實施例中，纖維母細胞披覆有本發明的dECM gel，使得細胞數增加了兩倍以上。也就是說，本發明的二維膠體生產製程製得的dECM gel濃度較高，可幫助細胞快速增生。
進一步參閱圖4B及圖4C，在初始為2x105個纖維母細胞的培養 皿中，分別加入相同份量的由本發明的二維膠體生產製程製得的dECM gel及比較例製得的dECM溶液培養5小時，觀察細胞的貼附及延展狀況。圖4B的結果顯示了加入本發明的dECM gel的實施例中細胞貼附數顯著高於比較例，本發明的dECM gel有助於細胞穩定貼附生長。圖4C的結果則顯示了加入本發明的dECM gel的實施例中，細胞相較於比較例有較大的延展面積。
在本發明的另一實施例中，採用三維膠體生產製程。三維膠體生產製程與前述的二維膠體生產製程大致相同，差別在於二維膠體生產製程是將海藻酸鈉鋪平於培養皿乘載面，而在三維膠體生產製程的一實施例中，膠體可呈現微米級球型結構，微米級球結構的平均粒徑可為0.2mm至2mm，較佳地為0.4mm至1.5mm，且每個微米級球結構的粒徑可以不同，以提高細胞培養量。在三維膠體生產製程的另一實施例中，膠體可呈現層狀列印結構。然而，上述所舉的例子只是其中一可行的實施例而並非用以限定本發明。
參閱圖5A至5B及圖6，在本發明的一實施例中，三維膠體生產製程將膠體製成平均粒徑為0.4mm的微米級球結構。如圖5A及圖5B所示，本發明實施例的總蛋白濃度為73.24±2.64mg，高於比較例的19.00±4.58mg。另外，計算平均每顆細胞所產生的dECM量，本發明實施例為1.46±0.05dECM/cells(ng)，亦高於比較例的0.38±0.09dECM/cells(ng)。由此可見，本發明細胞外基質組合物的製造方法相較於習知方法(比較例)，具有較高的產能，且三維膠體生產製程又更優於二維膠體生產製程。因此，本發明製造細胞外基質組合物的方法可有效節省操作的時間成本，並有效獲取高產量的細胞外基質組合物。
請參閱圖6所示，在三維膠體生產製程中，亦能在進一步提高產量的同時也具有優異的去細胞效果，使得dECM成品幾乎無DNA殘留。
[實施例的有益效果]
本發明的其中一有益效果在於，本發明所提供的細胞外基質組合物的製造方法，其能通過“所述交聯處理是對所述膠體加入一交聯劑”以及“所述去交聯處理是對所述膠體加入一去交聯劑，以得到一含細胞外基質的去交聯混合液”的技術方案，以提升細胞外基質組合物的產量。
由於本發明細胞外基質組合物的製造方法包含交聯與去交聯的步驟，使得膠體能以多元的型態進行細胞培養，進一步提升細胞外基質組合物的產量。此外，三維膠體生產製程相較於二維膠體生產製程具有更多的接觸表面積，即使在原始細胞數量相同的情況下，由於三維膠體生產製程可以提供更佳的細胞生長環境，使細胞生長更快速及完整，而可以更進一步提高細胞外基質組合物的產量。
更進一步來說，細胞外基質較差的凝膠動力學特性限制了其用於3D生物列印的精度。本發明所提供的細胞外基質組合物的製造方法，能製造出具有凝膠性質的dECM gel，黏度為1至100cP，其成分包含蛋白質(Proteins)、細胞因子(Cytokines)、生長因子(Growth factors)等，相較於習知方法製造出的dECM溶液，更適合用於製造生物墨水。
此外，本發明的細胞外基質組合物來自單一種細胞培養，而可以獲得可選擇性的單一細胞源外基質組合物，控制所產出的細胞外基質批次穩定性。
以上所公開的內容僅為本發明的優選可行實施例，並非因此侷限本發明的申請專利範圍，所以凡是運用本發明說明書及圖式內容所做的等效技術變化，均包含於本發明的申請專利範圍內。
S100~S500:步驟

Claims (10)

  1. 一種細胞外基質組合物的製造方法，其包括：提供一膠體；進行一交聯處理，所述交聯處理是對所述膠體加入一交聯劑，以得到一經交聯的膠體；進行一單一種細胞培養，所述單一種細胞培養是將單一種細胞種植於所述經交聯的膠體上，並加入一培養液進行培養；進行一去交聯處理，所述去交聯處理是對所述經交聯的膠體加入一去交聯劑，以得到含細胞外基質的一去交聯混合液；以及進行一提取處理，所述提取處理是對所述去交聯混合液加入一裂解酵素，並進行過濾，以得到一提取的細胞外基質。
  2. 如請求項1所述的方法，其中，所述膠體為3至5體積百分比的海藻酸鈉。
  3. 如請求項1所述的方法，其中，所述膠體為二維膠體或三維膠體，當所述膠體為二維膠體時，所述二維膠體的高度為10mm至40mm，當所述膠體為三維膠體時，所述三維膠體為微米級球型結構或層狀列印結構，所述微米級球型結構的平均粒徑為0.2mm至2mm。
  4. 如請求項1所述的方法，其中，所述交聯劑為氯化鈣、氯化鋇、氯化鋅、碳酸鈣、硫酸鈣或乳酸鈣。
  5. 如請求項1所述的方法，其中，所述細胞為人源與動物源的間充質幹細胞、人源肝癌細胞、纖維母細胞或表皮幹細胞。
  6. 如請求項1所述的方法，其中，所述培養液包含50μg/ml至100μg/ml的抗壞血酸。
  7. 如請求項1所述的方法，其中，所述去交聯劑為檸檬酸鈉或 乙二胺四乙酸。
  8. 如請求項1所述的方法，其中，在進行所述去交聯處理之前，還進一步包括加入一去細胞液以進行一去細胞處理。
  9. 如請求項1所述的方法，其中，所述裂解酵素為胃蛋白酶或膠原蛋白酶，與所述去交聯混合液混合攪拌。
  10. 如請求項1所述的方法，其中，所提取處理是以孔徑為0.22μm的過濾器過濾所述去交聯混和液。
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