TWI846095B

TWI846095B - 抗cd47-cldn18.2雙特異性抗體及其用途

Info

Publication number: TWI846095B
Application number: TW111139359A
Authority: TW
Inventors: 黃應峰; 郎國竣; 譚永聰; 邵喆; 張瑞霞; 閆閏; 王濤; 許俊彥; 胡宇豪; 張文海
Original assignee: 大陸商寶船生物醫藥科技（上海）有限公司; 大陸商三優生物醫藥（上海）有限公司
Priority date: 2021-10-19
Filing date: 2022-10-18
Publication date: 2024-06-21
Also published as: TW202321297A; KR20240118746A; EP4421092A1; US20250257128A1; WO2023065594A1; EP4421092A4; JP2024541118A; CN116267016A; CN115991784A; CN116267016B

Abstract

本發明屬於生物醫藥領域。具體地，本發明涉及抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體及其用途。

Description

抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體及其用途

本發明屬於生物醫藥領域，具體地，本發明涉及抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體及其用途。

CD47是一種廣泛表達於細胞表面的跨膜糖蛋白，屬於免疫球蛋白超家族，可與訊息調節蛋白α(Signal regulatory proteinα，SIRPα)、血小板活化素(Thrombospondin-1，TSP1)以及整合素(Integrin)相互作用，介導細胞凋亡、增殖、免疫等一系列的反應。已經證實，透過使用抗CD47抗體阻斷CD47-SIRPα通路能夠有效地介導對腫瘤細胞的吞噬作用，從而在體內抑制各種血液腫瘤和實體腫瘤的生長。然而，CD47不僅在腫瘤細胞上高表達，在正常細胞上，例如紅血球上也有大量CD47的表達，標靶CD47的療法可能會引發不期望的副作用。現有技術中公開的一些抗CD47抗體(參見例如US20160304609)結合紅血球，這不僅引發嚴重的貧血反應，而且在給藥上需要高達30mg/kg的給藥劑量，這些特性給抗CD47抗體的臨床應用帶來了極大的挑戰。

CLDN18屬於Claudins蛋白家族成員，由Shoichiro Tsukita等在1998年發現，其是構成上皮細胞緊密連接的重要分子，決定了上皮細胞的滲透性，也起到阻擋細胞膜表面蛋白和脂質擴散的作用(Gunzel,D.and A.S.Yu(2013)Physiol Rev 932：525-569)。人的CLDN18基因具有兩個不同的1號外顯子，轉錄後經過可變剪接最終生成僅在N端具有不同序列的兩個蛋白亞型CLDN18.1和CLDN18.2。由於其在腫瘤細胞和正常組織中的表達特異性，CLDN18.2目前已經成為非常有潛力的抗腫瘤藥物作用靶點。WO2016165762A1公開了抗CLDN18.2抗體IMAB362(Zolbetuximab)，其在胃癌臨床二期試驗中表現出比標準化療顯著延長生存期(13.2對8.4個月)，在CLDN18.2高表達患者中優勢更明顯。

WO2021003082A1公開了抗CLDN18.2和CD47雙特異性抗體，其基本不結合人紅血球。但仍然需要開發新的標靶CLDN18.2和CD47的雙特異性抗體，為癌症治療提供更多的可能性。

在一方面，本發明提供一種雙特異性抗體，其包含結合CD47的第一抗原結合部分以及結合CLDN18.2的第二抗原結合部分，其中所述第一抗原結合部分包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述重鏈可變區包含：1)HCDR1，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；2)HCDR2，其包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；和3)HCDR3，其包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列；並且，所述輕鏈可變區包含：1)LCDR1，其包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列；2)LCDR2，其包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列；和3)LCDR3，其包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列。

在一實施方案中，所述第二抗原結合部分包含結合CLDN18.2的免疫球蛋白單可變結構域(VHH)。優選地，所述免疫球蛋白單可變結構域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列。

在又一方面，本發明提供一種分離的多核苷酸，其編碼本發明的雙特異性抗體。

本發明還提供一種表達載體，其包含本發明的多核苷酸。

在另一方面，本發明提供一種宿主細胞，其包含本發明的多核苷酸或表達載體。

本發明還涉及抗體綴合物，其包含與至少一種治療劑綴合的本發明的雙特異性抗體。

在又一方面，本發明涉及一種藥物組合物，其包含本發明的雙特異性抗體或者抗體綴合物，以及藥學上可接受的載劑。

本發明還涉及本發明的雙特異性抗體、抗體綴合物或者藥物組合物在製備用於治療癌症的藥物中的用途。

圖1顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的示意性結構；圖2a和圖2b顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體與紅血球上CD47的結合活性，其中，圖2a顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體在15μg/mL的濃度下與紅血球上CD47的結合活性，圖2b顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體在150μg/mL的濃度下與紅血球上CD47的結合活性；圖3a和圖3b顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體在表達單靶點和雙靶點的腫瘤細胞上的結合活性，其中，圖3a顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體在NUGC-4細胞上的結合活性，圖3b顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體在hCLDN18.2-NUGC-4細胞上的結合活性；圖4a、圖4b和圖4c顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體在表達單靶點和雙靶點的腫瘤細胞上的阻斷人CD47與受體SIRPα結合的能力，其中，圖4a顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體B10在NUGC-4細胞上的阻斷人CD47與受體SIRPα結合的能力，圖4b顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體B10在hCLDN18.2-NUGC-4細胞上的阻斷人CD47與受體SIRPα結合的能力，圖4c顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體B8、B9、B10、B11和B12在hCLDN18.2-NUGC-4細胞上的阻斷人CD47與受體SIRPα結合的能力；圖5a和圖5b顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體在小鼠體內對腫瘤生長的抑制作用，其中，圖5a顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體B10在10.6mg/kg的給藥劑量下在小鼠體內對腫瘤生長的抑制作用，圖5b顯示抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體B10在5.3mg/kg的給藥劑量下在小鼠體內對腫瘤生長的抑制作用；以及圖6顯示透過生物發光報告基因法測定的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的ADCP活性。

[定義]

在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的蛋白質和核酸化學、分子生物學、細胞和組織培養、微生物學、免疫學相關術語和實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。

如本文所用，表述「包括」、「包含」、「含有」和「具有」是開放式的，表示包括所列舉的元素、步驟或組分但不排除其他未列舉的元素、步驟或組分。表述「由......組成」不包括未指定的任何元素、步驟或組分。表述「基本上由......組成」是指範圍限於指定的元素、步驟或組分，加上不顯著影響要求保護的主題的基本和新穎性質的任選存在的元素、步驟或組分。應當理解，表述「基本上由......組成」和「由......組成」涵蓋在表述「包括」的含義之內。

如本文所用，「抗體」指免疫球蛋白或其片段，其透過至少一個抗原結合位點特異性結合抗原表位。在本文中，抗體的定義涵蓋抗原結合片段。術語「抗體」包括多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人抗體、非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單域抗體以及抗原結合片段。抗體可以是合成的(例如透過化學偶聯或生物偶聯產生的)、酶促處理得到的或重組產生的。本文所提供的抗體包括任何免疫球蛋白類型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類(例如，IgG2a和IgG2b)。抗體可以是「單價」、「二價」、「三價」或「四價」或更多價抗體，是指其包含1、2、3、4個或更多個抗原結合位點。

如本文所用，「全長抗體」通常包含四條多肽：兩條重鏈(HC)和兩條輕鏈(LC)。每條輕鏈從N端(胺基酸端)到C端(羧基端)包含「輕鏈可變區(VL)」和「輕鏈恆定區(CL)」。每條重鏈從N端至C端包含「重鏈可變區(VH)」以及「重鏈恆定區(CH)」。一般而言，全長抗體的重鏈恆定區從N端至C端可以包含CH1-鉸鏈區(hinge)-CH2-CH3。在某些免疫球蛋白類型(例如IgM和IgE)中，重鏈恆定區從N端至C端可以包含CH1-鉸鏈區-CH2-CH3-CH4。

輕鏈可變區和重鏈可變區各自可以包含三個高度可變的「互補決定區(CDR)」和四個相對保守的「框架區(FR)」，並且從N端至C端以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的次序連接。在本文中，輕鏈可變區的CDR(CDRL或LCDR)可以稱為LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區的CDR(CDRH或HCDR)可以稱為HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在本發明中，CDR的胺基酸序列均是按照AbM定義規則所示出的(本發明的申請專利範圍中也是按照AbM定義規則所示出的序列)。但是，本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(參見例如Chothia,C.et al.,Nature,342,877-883(1989)；和Al-Lazikani,B.et al.,J.Mol.Biol.,273,927-948(1997))、基於抗體序列可變性的Kabat(參見例如Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)、AbM(Martin,A.C.R.and J.Allen(2007)“Bioinformatics tools for antibody engineering,”in S.Dübel(ed.),Handbook of Therapeutic Antibodies.Weinheim：Wiley-VCH Verlag,pp.95-118)、Contact(MacCallum,R.M.et al.,(1996)J.Mol.Biol.262：732-745)、IMGT(Lefranc,M.-P.,2011(6),IMGT,the International ImMunoGeneTics Information System Cold Spring Harb Protoc.；和Lefranc,M.-P.et al.,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))，以及基於利用大量晶體結構的鄰近傳播分群法(affinity propagation clustering)的North CDR定義。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的「CDR」及「互補決定區」應理解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明的申請專利範圍中請求保護的範圍是基於AbM定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。

因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，所述抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含所述的具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。

如本文所用，術語「框架區」和「構架區」可以互換使用。如本文中所使用的，術語「框架區」、「構架區」或「FR」殘基是指抗體可變區中除瞭如上定義的CDR序列以外的那些胺基酸殘基。

如本文所用，「單域抗體(sdAb)」或「納米抗體」是指包含單個免疫球蛋白可變結構域(單可變結構域)作為功能性抗原結合片段的抗體。與全長抗體的可變區類似，單可變結構域通常包含形成抗原結合位點的CDR1、CDR2和CDR3以及起支持作用的框架區。單可變結構域可以例如是重鏈抗體的可變結構域(variable domain of heavy-chain antibody，VHH)、鯊魚的IgNAR可變結構域、人輕鏈抗體可變結構域和重鏈抗體可變結構域。

如本文所用，「抗體依賴性細胞介導的細胞吞噬作用」或「ADCP」是指細胞介導的過程，其中表達Fcγ受體(FcγR)的非特異性細胞毒性細胞(例如單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和樹突狀細胞)識別結合至靶細胞(如腫瘤細胞)的抗體，並且隨後作為效應細胞吞噬靶細胞(如腫瘤細胞)。在一些實施方案中，本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體介導針對表達CLDN18.2(特別是表達CD47和CLDN18.2)的癌細胞的ADCP。

如本文所用，胺基酸序列的「百分比(%)序列相同性」、「序列相同性」具有本領域公認的定義，其指透過序列比對(例如透過人工檢視或可公知的算法)確定的兩個多肽序列之間相同的百分比。可以使用本領域技術人員已知的方法確定，例如使用可公開獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、Clustal Omega和FASTA軟件。

在本文中，「源自」或「衍生自」參考胺基酸序列的胺基酸序列與參考胺基酸序列的部分或者全部相同或同源。例如，衍生自人免疫球蛋白的重鏈恆定區的胺基酸序列可以與其所源自的人免疫球蛋白重鏈恆定區的野生型序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列相同性。

可以修飾多肽中的非關鍵區域(例如抗體的CDR區、框架區的非關鍵胺基酸、恆定區的胺基酸)，例如進行一個或多個胺基酸的取代、添加和/或缺失，而不改變多肽的功能。本領域技術人員應當理解多肽中非關鍵區域的胺基酸可以用合適的保守胺基酸取代，並且一般不改變其生物活性(參見，例如Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。合適的保守取代是本領域技術人員熟知的。在某些情況下，胺基酸取代是非保守取代。本領域技術人員應當理解，可以對抗體或抗體片段進行胺基酸突變或修飾來改變其性能，例如改變抗體糖基化修飾的類型，改變形成鏈間二硫鍵的能力，或者為抗體綴合物的製備提供活性基團。包含這類胺基酸突變或修飾的抗體或其抗原結合片段也涵蓋在本發明的雙特異性抗體的範圍之內。

本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體或者編碼其的多核苷酸可以是分離的。如本文所用，表述「分離的」是指物質(例如多核苷酸或多肽)與其存在的來源或環境是分離的，即基本上不包含其他任何成分。

在本文中，術語「多核苷酸」和「核酸」可以互換用於表示包含至少兩個連接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚體或聚合物，通常可以包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

在本文中，「載體」是用於將外源多核苷酸導入宿主細胞的媒介，當載體轉化入適當的宿主細胞時，外源多核苷酸得以擴增或表達。載體通常保持游離，但是可以設計為使基因或其部分整合入基因組的染色體。如本文所用，載體的定義涵蓋質體、線性化質體、病毒載體、黏質體、噬菌體載體、噬菌粒(phagemid)、人工染色體(例如，酵母人工染色體和哺乳動物人工染色體)等。病毒載體包括但不限於逆轉錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體、痘病毒載體和桿狀病毒載體等。

如本文所用，術語「表達」是指產生RNA和/或多肽。

如本文所用，「表達載體」指能夠表達感興趣的多核苷酸(包括DNA和RNA)的載體。例如，在表達載體中，可以將編碼感興趣多肽的多核苷酸序列(包括DNA和RNA)與能夠影響多核苷酸序列表達的調控序列(如啟動子和核醣體結合位點)可操作地連接。調控序列可以包含啟動子和終止子序列，並且任選地可以包含複製起點、選擇標記、增強子、多腺苷酸化訊號等。表達載體可以是質體、噬菌體載體、重組病毒或其他載體，當引入適當的宿主細胞時，導致感興趣的多核苷酸的表達。合適的表達載體是本領域技術人員公知的。本領域技術人員可以根據需要將表達載體製備為在宿主細胞中可複製、在宿主細胞中保持游離或者整合入宿主細胞基因組的載體。

如本文所用，「宿主細胞」是用於接受、保持、複製或擴增載體的細胞。宿主細胞還可以用來表達多核苷酸或載體所編碼的多肽。宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。原核細胞例如大腸桿菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，真菌細胞例如酵母細胞或曲霉屬、昆蟲細胞(如S2果蠅細胞或Sf9)以及動物細胞(如成纖維細胞、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、NSO細胞或HEK293細胞)。

如本文所用，術語「治療」指對疾病/症狀的改善，例如使疾病/症狀減輕或消失、防止或減緩疾病/症狀的發生、進展和/或惡化。因此，治療包括預防、治療和/或治愈。

如本文中所使用的，術語「藥學上可接受的載劑」是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載劑，其是本領域公知的(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania：Mack Publishing Company,1995)，並且包括但不限於：pH調節劑、表面活性劑、佐劑、離子強度增強劑、稀釋劑、維持滲透壓的試劑、延遲吸收的試劑、防腐劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液。表面活性劑包括但不限於陽離子、陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80。離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。防腐劑包括但不限於各種抗細菌試劑和抗真菌試劑，例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。維持滲透壓的試劑包括但不限於糖、氯化鈉及其類似物。延遲吸收的試劑包括但不限於單硬脂酸鹽和明膠。稀釋劑包括但不限於水、水性緩衝液(如緩衝鹽水)、醇和多元醇(如甘油)等。防腐劑包括但不限於各種抗細菌試劑和抗真菌試劑，例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。穩定劑具有本領域技術人員通常理解的含義，其能夠穩定藥物中的活性成分的期望活性，包括但不限於谷氨酸鈉、明膠、SPGA(Sucrose-Phosphate-Glutamate-Albumin)、醣類(如山梨醇、甘露醇、澱粉、蔗糖、乳糖、葡聚醣、或葡萄糖)、胺基酸(如穀氨酸、甘氨酸)、蛋白質(如乾燥乳清、白蛋白或酪蛋白)或其降解產物(如乳白蛋白水解物)等。

如本文所用，哺乳動物的實例包括但不限於人、非人靈長類動物、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、羊、羊駝、狗、貓等。在本文中，術語「受試者」是指哺乳動物，例如人。在一些實施方案中，受試者是人。在一些實施方案中，受試者是癌症患者、懷疑患有癌症或處於患癌風險中的人或者動物。

[抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體]

本發明提供一種抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體，其包含結合CD47的第一抗原結合部分以及結合CLDN18.2的第二抗原結合部分，其中所述第一抗原結合部分包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述重鏈可變區包含：1)HCDR1，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或其變體；2)HCDR2，其包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或其變體；和3)HCDR3，其包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列或其變體；以及所述輕鏈可變區包含：1)LCDR1，其包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列或其變體；2)LCDR2，其包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列或其變體；和3)LCDR3，其包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列或其變體；其中，所述變體與其所源自的序列相比具有1個或2個胺基酸的取代、添加和/或缺失。

在一具體實施方案中，第一抗原結合部分包含特異性結合CD47的第一抗原結合部分，所述第一抗原結合部分包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述重鏈可變區包含：1)HCDR1，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；2)HCDR2，其包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；和3)HCDR3，其包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列；並且所述輕鏈可變區包含：1)LCDR1，其包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列；2)LCDR2，其包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列；和3)LCDR3，其包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列。

在一實施方案中，所述VH包含：1)SEQ ID NO：10的胺基酸序列；或者2)與SEQ ID NO：10具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的胺基酸序列；和/或所述VL包含：1)SEQ ID NO：11的胺基酸序列；或者2)與SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的胺基酸序列。

在一實施方案中，所述VH包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，並且所述VL包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列。

第一抗原結合部分可以包含任何形式的抗原結合片段，例如scFv、dsFv、scdsFv、Fab、Fab'或F(ab')2。根據本發明，第一抗原結合部分特異性結合至癌細胞表面的CD47而不結合或基本不結合紅血球上的CD47，使得本發明的雙特異性抗體不會引起紅血球凝集。

第二抗原結合部分可以包含任何形式的抗原結合片段，包括但不限於scFv、dsFv、scdsFv、Fab、Fab'、F(ab')2和單可變結構域。在一些實施方案中，第二抗原結合部分包含特異性結合CLD18.2的免疫球蛋白單可變結構域。與CLD18.2特異性結合的免疫球蛋白單可變結構域描述於例如CN112480248A和WO2020238730A1，其內容整體援引加入本文。在一實施方案中，所述免疫球蛋白單可變結構域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列或其變體；CDR2，其包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列或其變體；以及CDR3，其包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列或其變體；其中，所述變體與其所源自的序列相比具有1個或2個胺基酸的取代、添加和/或缺失。在一具體實施方案中，所述免疫球蛋白單可變結構域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在一實施方案中，所述免疫球蛋白單可變結構域包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列。在又一實施方案中，所述免疫球蛋白單可變結構域包含與SEQ ID NO：12的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，第一抗原結合部分和第二抗原結合部分透過接頭連接。接頭可以是肽接頭或化學鍵，優選肽接頭。示例性的肽接頭可以包括但不限於聚甘氨酸(G)、聚丙氨酸(A)、聚絲氨酸(S)或其組合，例如GGAS、 GGGS、GGGSG或者(G﹁4S)n，其中n為1-20的整數。優選地，n為1-5的整數。在一具體實施方案中，肽接頭包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的胺基酸序列。

在一些實施方案中，本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體進一步包含免疫球蛋白恆定區。免疫球蛋白恆定區可以是任何物種的免疫球蛋白的重鏈恆定區(CH)和輕鏈恆定區(CL)。重鏈恆定區可以衍生自任何亞型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類(例如，IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白的重鏈恆定區或其組合。在優選的實施方案中，重鏈恆定區至少包含Fc區，例如IgG1的重鏈恆定區可以包括：鉸鏈區的全部或部分-CH2-CH3或者CH1-鉸鏈區-CH2-CH3。輕鏈恆定區可以衍生自λ(Lambda)輕鏈或κ(Kappa)輕鏈恆定區。在一優選實施方案中，重鏈恆定區為人IgG1的重鏈恆定區。在一實施方案中，重鏈恆定區包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。在一優選實施方案中，輕鏈恆定區為人κ輕鏈恆定區。在一實施方案中，輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列。

在一實施方案中，第一抗原結合部分的VH和VL分別融合至重鏈恆定區和輕鏈恆定區的N端，並且第二抗原結合部分的單可變結構域任選地透過接頭融合至所述VH的N端、所述VL的N端、所述重鏈恆定區的C端或者所述輕鏈恆定區的C端。

在一些實施方案中，抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含第一抗原結合部分的VH和重鏈恆定區，第二多肽包含第一抗原結合部分的VL和輕鏈恆定區，第二抗原結合部分的單可變結構域任選地透過接頭融合至所述VH或VL的N端或者所述重鏈恆定區或輕鏈恆定區的C端。在一實施方案中，單可變結構域任選地透過接頭融合至所述VH 的N端或者所述重鏈恆定區的C端，所述第一多肽又可以稱為融合重鏈。在一實施方案中，融合重鏈具有如下所述式(I)或式(III)的結構。在另一實施方案中，第二抗原結合部分的單可變結構域任選地透過接頭融合至所述VL的N端或輕鏈恆定區的C端，所述第二多肽又可以稱為融合輕鏈。在一實施方案中，融合輕鏈具有如下所述式(IV)或式(VI)的結構。

在一實施方案中，第一多肽具有式(I)的結構：VH-CH-Linker-VHH 式(I)，第二多肽具有式(II)的結構：VL-CL 式(II)，其中VH和VL分別為如上所述第一抗原結合部分的重鏈可變區和輕鏈可變區；VHH為如上所述免疫球蛋白單可變結構域；CH和CL分別為如上所述重鏈恆定區和輕鏈恆定區；Linker為接頭。

在一實施方案中，第一多肽具有式(I)的結構，其包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列；第二多肽具有式(II)的結構，其包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列。

在一實施方案中，第一多肽具有式(III)的結構：VHH-Linker-VH-CH 式(III)，第二多肽具有式(II)的結構，其中VHH為如上所述免疫球蛋白單可變結構域；VH為如上所述第一抗原結合部分的重鏈可變區；CH為如上所述重鏈恆定區；式(II)如上所定義；Linker為接頭。

在一實施方案中，第一多肽具有式(III)的結構，其包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列；第二多肽具有式(II)的結構，其包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列。

在一實施方案中，第一多肽具有式(III)的結構，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；第二多肽具有式(II)的結構，其包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列。

在又一實施方案中，第一多肽具有式(III)的結構，第二多肽具有式(IV)的結構：VHH-Linker-VL-CL 式(IV)，其中式(III)如上所定義；VHH為如上所述免疫球蛋白單可變結構域；VL為如上所述第一抗原結合部分的輕鏈可變區；CL為如上所述輕鏈恆定區；Linker為接頭。

在一實施方案中，第一多肽具有式(III)的結構，其包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列；第二多肽具有式(IV)的結構，其包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列。

在另一實施方案中，第一多肽具有式(V)的結構：VH-CH 式(V)，第二多肽具有式(IV)的結構，其中式(IV)如上所定義；VH為如上所述第一抗原結合部分的重鏈可變區；CH為如上所述重鏈恆定區；Linker為接頭。

在一實施方案中，第一多肽具有式(V)的結構，其包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；第二多肽具有式(IV)的結構，其包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列。

在另一實施方案中，第一多肽具有式(V)的結構，第二多肽具有式(VI)的結構：VL-CL-Linker-VHH 式(VI)，其中式(V)如上所定義；VHH為如上所述免疫球蛋白單可變結構域；VL為如上所述第一抗原結合部分的輕鏈可變區； CL為如上所述輕鏈恆定區；Linker為接頭。

在一些實施方案中，本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體能夠：1)阻斷癌細胞表面的CD47結合至SIRPα；2)誘導巨噬細胞對表達CD47和CLDN18.2的癌細胞的吞噬；和/或3)結合表達CD47和CLDN18.2的癌細胞而不結合或基本不結合紅血球。

[多核苷酸、載體和宿主細胞]

在另一方面，本發明提供一種分離的多核苷酸，其包含編碼本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的多核苷酸序列。

可以利用本領域已知的方法獲得本發明的多核苷酸，例如，分離自噬菌體展示文庫、酵母展示文庫、免疫動物、永生化的細胞(例如，小鼠B細胞雜交瘤細胞、EBV介導的永生化B細胞)或者化學合成。本發明的多核苷酸可以針對用於表達的宿主細胞進行密碼子優化。

在又一方面，本發明還提供包含本發明的多核苷酸的載體。在一些實施方案中，將本發明的多核苷酸複製入表達載體。表達載體可以進一步包含額外的多核苷酸序列，例如調控序列和抗生素抗性基因。表達載體還可以包含編碼額外的多肽的多核苷酸序列。額外的多肽可以是例如促進抗體或抗原結合片段的檢測和/或分離的多肽，包括但不限於親和標籤(例如聚組氨酸標籤(His6)或穀胱甘肽S-轉移酶(GST)標籤)、包含蛋白酶切割位點的多肽和報告蛋白(例如螢光蛋白)。

在一實施方案中，本發明的多核苷酸製備為重組核酸。可使用本領域眾所周知的技術製備重組核酸，例如化學合成、DNA重組技術(例如聚合酶鍊式反應(PCR)技術)等(參見Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis.(1989).Molecular cloning：a laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

本發明的多核苷酸可以存在於一種或多種表達載體中。在一些實施方案中，表達載體為DNA質體，例如用於在細菌、酵母或哺乳動物細胞中表達的DNA質體。在另一些實施方案中，表達載體為病毒載體。在其他實施方案中，表達載體為噬菌體載體或噬菌粒載體。

本發明還提供一種宿主細胞，其包含至少一種如上所述的多核苷酸或載體。可以採用本領域已知的各種方法將本發明的多核苷酸或表達載體導入合適的宿主細胞中。這類方法包括但不限於脂質體轉染、電穿孔、病毒轉導和磷酸鈣轉染等。

在優選的實施方案中，宿主細胞用於表達本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體。宿主細胞的實例包括但不限於原核細胞(例如細菌，例如大腸桿菌)和真核細胞(例如酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞)。

適合於抗體表達的哺乳動物宿主細胞包括但不限於骨髓瘤細胞、HeLa細胞、HEK細胞(例如HEK 293細胞)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和其他適於表達抗體的哺乳動物細胞。

本發明還提供一種產生本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的方法，其包括以下步驟：(I)在合適條件下培養本發明的宿主細胞以表達抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體，以及 (II)從宿主細胞或其培養物分離所述抗體。

在一些實施方案中，使用單一的載體，其包含編碼重鏈和輕鏈的多核苷酸序列。在一些實施方案中，使用兩種載體，其中一種載體編碼抗體的輕鏈，而另一種編碼抗體的重鏈。在一些實施方案中，宿主細胞還包含伴侶質體，其可以幫助提高抗體的溶解性、穩定性和/或折疊。從宿主細胞或其培養基中分離和純化抗體的技術是本領域技術人員所熟知的。

[抗體綴合物]

本發明還提供一種抗體綴合物，其包含與至少一種治療劑綴合的本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體。抗體-藥物綴合物(ADC)是一種典型的抗體綴合物，其中所述治療劑可以例如為細胞毒性劑。

如本文所用，「綴合」是指兩個或多個部分透過共價或非共價作用相互連接。在優選的實施方案中，所述綴合是共價綴合。

治療劑可以選自細胞毒性劑、治療性抗體(例如與另外的抗原特異性結合的抗體或其抗原結合片段)、放射性同位素、寡核苷酸及其類似物(例如乾擾RNA)、生物活性肽、蛋白毒素(例如白喉毒素、蓖麻毒素)和酶(例如脲酶)。

細胞毒性劑是指抑制或降低細胞的活性、功能和/或殺死細胞的物質。細胞毒性劑的實例可以包括但不限於：類美登素(maytansinoid)(例如美登素(maytansine)、奧利斯他汀類(例如MMAF、MMAE、MMAD)、多司他汀(duostatin)、念珠藻環肽(cryptophycin)、長春花生物鹼類(例如長春鹼、長春新鹼)、秋水仙鹼類、海兔毒素類、紫杉烷、紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽、烯二炔類抗生素、細胞鬆弛素類、喜樹鹼類、蒽環類抗生素(例如道諾黴素(daunorubicin)、二羥基蒽二酮(dihydroxyanthracindione)、多柔比星(doxorubicin))、細胞毒性抗生素(例如絲裂黴素(mitomycin)、放線菌素(actinomycin)、倍癌黴素(duocarmycin)(例如CC-1065)、金黴素(auromycin)、多黴素(duomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、內孢黴素(endomycin)、酚黴素(phenomycin))、阿黴素、柔紅黴素、卡奇黴素、順鉑(cisplatin)、溴化乙錠(ethidiumbromide)、博來黴素、絲裂黴素、光輝黴素、普拉地內酯、鬼臼毒素、依托泊苷(etoposide)、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他濱、巰嘌呤、噴司他丁、氟達拉濱、克拉屈濱、奈拉濱、卡莫司汀、洛莫司汀、甲氨蝶呤、苯丙氨酸氮芥、替尼泊苷(tenoposide)、糖皮質激素等。

放射性同位素可以選自例如212Bi、213Bi、131I、125I、111In、177Lu、186Re、188Re、153Sm、90Y。用放射性同位素標記的抗體又可稱為放射免疫綴合物。

在優選的實施方案中，所述生物活性多肽是具有治療活性、結合活性或酶活性的多肽或蛋白。生物活性多肽的非限制性實例可以包括但不限於：蛋白毒素(例如白喉毒素、蓖麻毒素)、酶(例如脲酶、辣根過氧化物酶)、細胞因子。

在一實施方案中，治療劑為具有抗腫瘤生物活性的分子。具有抗腫瘤生物活性的分子包括但不限於細胞毒性劑、化療劑、放射性同位素、免疫檢查點抑制劑、標靶腫瘤特異性抗原的抗體和其他抗腫瘤藥物。在優選一實施方案中，治療劑為細胞毒性劑。在又一優選實施方案中，治療劑為放射性同位素。

可以利用本領域已知的任何技術將治療劑與本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體透過接頭綴合。所述接頭可以包含用於共價綴合的活性基團，例如胺、羥胺、馬來醯亞胺基、羧基、苯基、硫醇、巰基或羥基。接頭可為可切割的或不可切割的。可切割的接頭例如酶可切割的接頭(例如，包含蛋白酶切割位點的肽)、pH敏感的接頭(例如，腙類接頭)或可還原的接頭(例如，二硫鍵)。

在一實施方案中，接頭包含選自胺、羥胺、馬來醯亞胺基、羧基、苯基、硫醇、巰基和羥基的活性基團。在一實施方案中，接頭為化學鍵。在一實施方案中，接頭包含胺基酸或2-10個胺基酸組成的肽。胺基酸可以是天然或非天然胺基酸。

在一些實施方案中，在與本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體綴合之前，先將治療劑和接頭綴合形成中間體。在一些實施方案中，中間體透過與本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的巰基形成硫醚鍵而連接。這類中間體的結構和製備方法以及使用其製備抗體綴合物的方法描述於例如國際專利申請公開號WO2019114666，其相關內容整體援引加入本文。

[藥物組合物]

本發明還提供藥物組合物，其包含本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體或者抗體綴合物，以及藥學上可接受的載劑。

藥學上可接受的載劑可以包括但不限於：稀釋劑、粘合劑和膠粘劑、潤滑劑、崩解劑、防腐劑、媒介物、分散劑、助流劑、甜味劑、包衣、賦形劑、防腐劑、抗氧化劑(如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚、檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等)、增溶劑、膠凝劑、軟化劑、溶劑(例如，水、酒精、乙酸和糖漿)、緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和乙酸鹽緩沖劑)、表面活性劑(例如非離子表面活性劑，例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆或聚乙二醇)、抗細菌劑、抗真菌劑、等滲劑(例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖)、吸收延遲劑、螯合劑和乳化劑。對於包含抗體或者抗體綴合物的組合物而言，合適的載劑可以選自緩沖劑(例如檸檬酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、組氨酸緩衝液、組氨酸鹽緩衝液)、等滲劑(例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖)、非離子表面活性劑(例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆)或其組合。

本文提供的藥物組合物可以為多種劑型，包括但不限於固體、半固體、液體、粉末或凍乾形式。優選地，所述藥物組合物適合於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(如透過注射或輸注)。對於包含抗體或者抗體綴合物的組合物而言，優選的劑型通常可以為例如注射液和凍乾粉。

可透過本領域已知的任何方法，例如透過全身或局部施用，將本文提供的藥物組合物給藥於受試者。給藥途徑包括但不限於腸胃外(例如，靜脈內、腹膜內、皮內、肌肉內、皮下或腔內)、局部(例如瘤內)、硬膜外或粘膜(例如鼻內、口服、陰道、直腸、舌下或局部)。本領域技術人員應當理解，確切的給藥劑量將取決於各種因素，例如藥物組合物的代謝動力學性質、治療的持續時間、特定化合物的排泄速率、治療目的、給藥途徑和受試者的狀況，例如患者的年齡、健康狀況、體重、性別、飲食、病史，以及醫學領域公知的其他因素。給藥方法可以為例如注射或輸注。

作為一般性指導，本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的給藥劑量範圍可以為約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至20mg/kg受試者體重。例如，給藥劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重，10mg/kg體重或20mg/kg體重，或在1-20mg/kg範圍內。示例性的治療方案需要每週給藥一次、每兩週一次、每三週一次、每四周一次、每月一次、每3個月一次、每3-6個月一次、或起始給藥間隔略短後期給藥間隔加長。給藥方式可以是靜脈滴注。

[治療]

在又一方面，本發明涉及本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體、抗體綴合物或者藥物組合物在製備用於治療受試者中疾病的藥物中的用途。

本發明還涉及本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體、抗體綴合物或者藥物組合物，其用於治療疾病。

本發明還提供一種治療受試者中疾病的方法，所述方法包括向所述受試者給藥治療有效量的本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體、抗體綴合物或者藥物組合物。

在一實施方案中，如上所述的疾病為癌症。如本文所用，「癌症」包括但不限於血液癌和實體瘤。癌症還可以是轉移性癌。「轉移」是指癌細胞從其原始部位擴散到身體的其他部分。例如，抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體可以用於治療CLDN18.2陽性的癌症。在優選的實施方案中，抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體用於治療CD47和CLDN18.2陽性的癌症。在一些實施方案中，所述癌症為胃癌。

[試劑盒]

本發明還提供試劑盒，其包含本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體、抗體綴合物或者藥物組合物，以及使用說明。試劑盒還可以包含合適的容器。在某些實施方案中，試劑盒還包含給藥的裝置。通常，試劑盒還包括標籤，其用於表明試劑盒內容物的預期用途和/或使用方法。術語「標籤」包括在試劑盒上或與試劑盒一起提供的或以其他方式隨試劑盒提供的任何書面的或記錄的材料。

[有益效果]

本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體可以實現以下的有益效果中的至少一個：1)阻斷癌細胞表面的CD47結合至SIRPα；2)誘導巨噬細胞對表達CD47和CLDN18.2的癌細胞的吞噬；3)介導針對表達CLDN18.2的癌細胞的ADCP；和4)結合表達CD47和CLDN18.2的癌細胞而不結合或基本不結合紅血球。

此外，相比於單獨標靶CD47的單株抗體，本發明的抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體對CD47和CLDN18.2陽性的腫瘤細胞有更高的結合活性，並且對CD47和SIRPα相互作用阻斷效果更強。

[實施例]

以下實施例旨在僅對本發明進行舉例說明，因此並不應被視為以任何方式限制本發明。

[材料與方法]

1.抗體表達質體的構建

透過DNA重組技術製備編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA片段，隨後將其分別複製至表達載體pcDNA3.4-TOPO(Invitrogen)以獲得抗體的重鏈和輕鏈表達質體。在大腸桿菌DH5α中擴增並隨後提取和純化抗體重鏈和輕鏈表達質體。

2.抗體的表達和純化

所有抗體透過ExpiCHO瞬轉表達系統(Thermo Fisher，A29133)表達(參見WO2020238730A1)，並採用MabSelect SuRe LX(GE，17547403)進行親和純化。

3.SDS-PAGE鑑定抗體純度

還原溶液製備：將2μg的待測抗體或IPI(Ipilimlumab；對照)加入5×SDS上樣緩衝液(含有終濃度為5mM的DTT)中，100℃乾浴加熱10min，冷卻到室溫後，12000rpm離心5min，取上清。將上清加入Bis-tris 4-15%梯度膠(金斯瑞)中進行蛋白凝膠電泳。隨後透過考馬斯亮藍染色使蛋白條帶顯色，脫色後用EPSON V550彩色掃描儀掃描，透過ImageJ按照峰面積歸一法計算蛋白條帶純度。

4.SEC-HPLC鑑定抗體純度

Agilent HPLC 1100色譜柱(XBridge BEH SEC 3.5μm，7.8mm I.D.×30cm，Waters)流速設為0.8mL/min，進樣體積20μL，VWD檢測器波長為280nm和214nm。流動相採用150mmol/L磷酸緩衝液，pH 7.4，所有樣品均使用流動相稀釋成0.5mg/mL，然後依次進樣空白溶液和样品溶液。按照面積歸一法計算樣品中高分子聚集物、抗體單體和低分子聚集物的百分比。

5.差示掃描螢光法鑑定抗體穩定性

差示掃描螢光法(differential scanning fluorimetry；DSF)能夠根據蛋白質圖譜中的螢光變化過程提供有關蛋白質結構穩定性的信息，檢測蛋白的構型變化，獲得蛋白質的熔解溫度(Tm)。

製備待測抗體樣品溶液0.2mg/mL，並以PBS和IPI(Ipilimlumab；0.2mg/mL)作為對照。測試樣品一式三份以19μL/孔加入96孔板(Nunc)中，然後在每個孔中加入1μL的100×SYPRO orange染料，用微量分注器吹打混勻，準備上機。樣品熱穩定測試採用ABI 7500 FAST RT-PCR儀器，試驗類型選擇熔解曲線，採用連續模式，掃描溫度範圍為25~95℃，升溫速率為1%，25℃平衡5min，在升溫過程中採集數據，報告基團選擇「ROX」，淬滅基團選擇「None」，反應體積20μL，以熔解曲線一階導數的第一個峰谷對應的溫度確定為抗體的熔解溫度Tm。

[實施例1-抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的設計]

本實施例描述了示例性抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體：其中，結合CLDN18.2的臂採用一種特異性識別人CLDN18.2而不識別CLDN18.1的抗CLDN18.2單域抗體NA3S-H1(CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：13、14和15；VHH的胺基酸序列示於SEQ ID NO：12)，結合CD47的臂採用抗CD47人源化抗體A7H3L3的抗原結合結構域(HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：4、5和6；LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：7、8和9；重鏈可變區的胺基酸序列示於SEQ ID NO：10，輕鏈可變區的胺基酸序列示於SEQ ID NO：11)。將抗體A7H3L3的重鏈可變區融合至人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：2)形成抗體A7H3L3的重鏈，輕鏈可變區融合至人κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO：3)形成抗體 A7H3L3的輕鏈。抗CLDN18.2單域抗體NA3S-H1已經公佈於WO2020238730A1，其體外ADCC和CDC的細胞殺傷效應以及在人CLDN18.2-HEK29T-SCID腫瘤移植模型上的腫瘤抑制試驗都表現出了極好的藥效。人源化抗體A7H3L3與紅血球上的CD47結合很弱，是比較理想用於雙特異性抗體的候選抗體，同時雙特異性抗體的設計因為結合CLDN18.2會使得抗CD47抗體A7H3L3結合臂更好的結合表達雙靶點的腫瘤細胞，同時更好的阻斷SIRPα抑制性訊號。

根據抗CLDN18.2單域抗體(VHH)NA3S-H1的價數、位置以及接頭(Linker)的長度進行了雙特異性抗體設計，設計了5種雙特異性抗體(分別為B8-B12)，示例性雙特異性抗體結構如表1和圖1所示，對應的胺基酸序列提供於表2中，其中Linker1的序列為GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：22)，Linker2的序列為GGGGS(SEQ ID NO：23)。

[實施例2-抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體與紅血球上CD47的結合活性]

透過流式細胞術測定雙特異性抗體在紅血球上是否有結合。使用申請人自研的另一抗CD47抗體F4AM4-IgG1(在附圖中簡稱為F4AM4；重鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO：24，輕鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO：25)作為陽性對照抗體。F4AM4-IgG1在(本實施例的實驗開展之前進行的)一系列功能驗證實驗中表現出強結合紅血球的CD47，因而在本實施例中被選用作陽性對照。

具體方法如下：從1mL抗凝處理的人血液中分離紅血球，離心後吸去上清，PBS潤洗兩次後，加入1mL PBS並重懸。使用PBS將紅血球稀釋至1×10⁷/mL，以每孔50μL吸取紅血球加入到96孔圓底細胞培養板中，然後等體積加入梯度稀釋的待測抗體，充分混勻，置於4℃培養1h。接著再用FACS緩衝液潤洗三次，加入PE標記的山羊抗人IgG Fc抗體(Abcam，ab98596)0.5μg，在4℃培養1h。其後，經FACS緩衝液潤洗三次，並向細胞中加入200μL FACS緩衝液重懸細胞，最後透過流式細胞儀(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)檢測結合至紅血球上抗體的量(表示為平均螢光強度(MFI))。

抗體對紅血球的結合活性示於圖2a和2b。如圖2a和2b所示，即使在非常高的濃度(150μg/mL)下，相對於F4AM4-IgG1在紅血球上的強結合，所有抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體幾乎都不結合紅血球或者結合活性極低；在高濃度(15μg/mL)下，B9、B10和B11與陰性對照IgG1對紅血球的結合沒有顯著差異，具體數值見表3。由此可見，本發明的雙特異性抗體對紅血球上的CD47結合活性較低，基本不會引發紅血球凝集。

[實施例3-抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體在表達單靶點和雙靶點的腫瘤細胞上的結合活性]

透過流式細胞術測定了抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體B10對NUGC-4細胞(表達內源CD47，購自BNCC菌種庫，編號BNCC341962)和hCLDN18.2-NUGC-4細胞(採用慢病毒轉染的方式構建過表達外源人CLDN18.2(胺基酸序列SEQ ID NO：1)的胃癌細胞株NUGC-4，同時表達內源CD47)的結合活性。作為比較，還測定了抗體1F8(WO2018075857A1中1F8抗體)和F4AM4-IgG1對這兩種細胞株的結合活性。人IgG1用作同種型陰性對照。

具體方法如下：取1×105個NUGC-4細胞或hCLDN18.2-NUGC-4細胞，低速離心(300g)去上清；將離心管底部的細胞透過配製好的FACS緩衝液(含體積百分比為2% FBS的1×PBS緩衝液)潤洗一次，然後向潤洗後的細胞中加入梯度稀釋的待測抗體，在4℃培養1h；接著再用上述FACS緩衝液潤洗三次，加入PE標記的山羊抗人IgG Fc抗體(Abcam，ab98596)0.5μg，在4℃培養1h；然後將細胞用FACS緩衝液潤洗三次後用200μL FACS緩衝液重懸，最後透過流式細胞儀(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)檢測結合至紅血球上抗體的量(表示為平均螢光強度(MFI))。

抗體對NUGC-4細胞和hCLDN18.2-NUGC-4細胞的結合活性分別示於圖3a和3b。如圖3a所示，雙特異性抗體B10在腫瘤細胞NUGC-4上的結合活性較弱，且稍弱於抗體1F8。如圖3b所示，雙特異性抗體B10在CD47和CLDN18.2都表達的hCLDN18.2-NUGC-4細胞上具有明顯優於抗體1F8的結合活性。基於此，雙特異性抗體B10雖然在CD47單靶點表達的細胞上結合弱於1F8，然而在CD47和CLDN18.2雙靶點表達的細胞上結合卻優於1F8。該結果證明了雙特異性抗體B10可同時結合腫瘤細胞中的CLDN18.2和CD47，增加了結合腫瘤細胞的能力。

[實施例4-抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體在表達單靶點和雙靶點的腫瘤細胞上阻斷CD47與SIRPα結合的能力]

透過流式細胞術測定了抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體阻斷NUGC-4和hCLDN18.2-NUGC-4細胞上CD47與SIRPα結合的能力。作為比較，還測定了抗體1F8、F4AM4-IgG1和A7H3L3阻斷NUGC-4和hCLDN18.2-NUGC-4腫瘤細胞上CD47與SIRPα結合的能力。

具體方法如下：取1×10⁵個NUGC-4細胞或hCLDN18.2-NUGC-4細胞，低速離心(300g)去上清。將離心管底部的細胞透過配製好的FACS緩衝液(含2% FBS的1×PBS緩衝液)潤洗一次；然後向潤洗後的細胞中加入梯度稀釋的待測抗體，培養1h；用FACS緩衝液潤洗細胞兩次後加入100μL的1μg/mL SIRPα-mFc(ACRO，SIA-H52A8)，在4℃培養1h；經FACS緩衝液潤洗三次，加入100μL 1：200稀釋的PE標記的羊抗鼠Fc二抗(Abcam，ab98742)，在4℃培養1h後離心去上清，向細胞中加入200μL FACS緩衝液重懸細胞，最後透過流式細胞儀(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)檢測結合至細胞上的SIRPα-mFc的量(表示為平均螢光強度(MFI))。

在NUGC-4細胞上的結果如圖4a所示：抗體F4AM4-IgG1能夠有效的阻斷CD47與SIRPα的結合，IC₅₀為0.033μg/mL(0.226nM)；抗體1F8具有較弱的阻斷效果，IC₅₀為15.36μg/mL(105.6nM)；而雙特異性抗體B10幾乎沒有阻斷能力。

在hCLDN18.2-NUGC-4細胞上的結果如圖4b所示：抗體F4AM4-IgG1在此腫瘤細胞上依然具有強的阻斷能力，IC₅₀為0.056μg/mL(0.383nM)；相比於在NUGC-4細胞上的阻斷能力，雙特異性抗體B10在hCLDN18.2-NUGC-4細胞上的阻斷能力顯著提高，並且優於抗體1F8；B10和 1F8阻斷hCLDN18.2-NUGC-4上CD47與SIRPα結合的IC₅₀分別為0.765μg/mL(4.476nM)和11.98μg/mL(82.34nM)；另外，抗CLDN18.2單域抗體NA3S-H1因為只結合CLDN18.2，因而沒有任何阻斷效果。基於此，雙特異性抗體B10雖然在CD47單靶點表達的細胞上的阻斷活性弱於抗體1F8，然而在CD47和CLDN18.2雙靶點表達的細胞上阻斷活性明顯優於抗體1F8，將發揮更強的阻斷CD47與受體SIRPα結合的能力。

還測定了其它的雙特異性抗體在hCLDN18.2-NUGC-4細胞上的阻斷能力，結果如圖4c所示。在雙特異性抗體B8-B12中，雙特異性抗體B10具有最強的阻斷活性。

[實施例5-抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的體內抑瘤實驗]

5.1 體內抑瘤實驗1

6-7週齡雌性裸鼠(16-18g)飼養在恆溫恆濕的獨立通風盒內，飼養室溫度21-24℃，濕度30-53%。將3×106個hCLDN18.2-NUGC-4細胞對裸鼠進行左側腋窩皮下注射(第0天)，待小鼠皮下荷瘤體積達到300-400mm³左右時(第20天)，剔除腫瘤體積差異較大的小鼠樣本，然後依據腫瘤體積進行隨機分組(每組8隻小鼠)：分別是PBS處理組、NA3S-H1單抗給藥組、A7H3L3單抗給藥組、NA3S-H1+ A7H3L3聯合給藥組和雙特異性抗體B10給藥組。以NA3S-H1單抗5mg/kg作為標準，其它所有藥物均採用等摩爾劑量進行給藥，即分別為A7H3L3單抗9.4mg/kg、NA3S-H1+ A7H3L3聯合5mg/kg+9.4mg/kg、雙特異性抗體B10 10.6mg/kg。每個星期兩次給藥，分別是腹膜內註射(i.p.)和靜脈注射(i.v.)兩種方式交替給藥。隨時觀察和記錄腫瘤長(mm)和寬(mm)，計算其腫瘤體積(V)，計算方式為：V=(長×寬2)/2，抑瘤率TGI(%)=(1-給藥組腫瘤平均體積/PBS處理組腫瘤平均體積)×100%。

抗體抑瘤的結果如圖5a和表4所示，從中可以看出：在此等摩爾劑量下，NA3S-H1單抗給藥組幾乎沒有表現出腫瘤抑制效果，其它組都表現出一定的腫瘤抑制效果，其中雙特異性抗體B10的效果最好，在第39天之前達到接近54.54%的抑瘤率，腫瘤大小接近第20天腫瘤初始體積，且優於聯合用藥(A7H3L3+NA3S-H1(9.4+5mpk))的結果，這表明雙特異性抗體B10對CLDN18.2的結合可以增強其對CD47和SIRPα結合的阻斷效果。

5.2 體內抑瘤實驗2

隨機分組(每組8隻小鼠)：分別是PBS處理組，單抗NA3S-H1給藥組，雙特異性抗體B10給藥組。在接種當天(第0天)進行首次給藥，每個星期給藥兩次，以NA3S-H1單抗2.5mg/kg作為標準，雙特異性抗體B10採用等摩爾劑量進行給藥，即5.3mg/kg。其餘與實施例5.1一致。

結果如圖5b所示，在此等摩爾劑量下，NA3S-H1單抗給藥組表現出一定的腫瘤抑制效果，抑瘤率約為54.99%(第34天)；雙特異性抗體B10組所有小鼠中的腫瘤被完全抑制，抑瘤率接近100%(第34天)。該結果證明了雙特異性抗體B10的腫瘤抑制效果顯著優於抗CLDN18.2單抗NA3S-H1。

[實施例6-抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的理化性質測定]

6.1 SDS-PAGE純度鑑定

採用還原SDS-PAGE鑑定雙特異性抗體B10的純度。雙特異性抗體B10的重鏈和輕鏈主帶的表觀相對分子量分別是65kD左右和25kD左右，符合預期大小，且純度約90%。

6.2 SEC-HPLC純度鑑定

使用SEC-HPLC檢測雙特異性抗體B10的單體純度。透過SEC-HPLC測定的雙特異性抗體B10的單體純度大於94%。

6.3 雙特異性抗體B10的DSF熱穩定性檢測

採用DSF法檢測了雙特異性抗體B10的Tm值，以評估其熱穩定性。結果表明，雙特異性抗體B10具有兩個熔解峰，第一個峰Tm值為69.85±0.06℃，第二個峰Tm值為80.60±0.16℃，表明雙特異性抗體B10具有良好的熱穩定性。

[實施例7-抗CD47-CLDN18.2雙特異性抗體的ADCP活性]

抗體依賴性細胞介導的細胞吞噬作用(ADCP)是治療性抗體對抗病毒感染或者腫瘤細胞的一種重要作用機制。本實驗透過生物發光報告基因法評估本發明雙特異性抗體的ADCP活性。該方法以基因工程改造的Jurkat細胞(BPS Bioscience Inc.，71273)作為效應細胞，該細胞穩定表達FcγRIIa受體和由NFAT應答元件驅動表達螢光素酶(Int Immunopharmacol.2021 Nov；100：108-112.)。抗體在識別靶細胞後，透過與效應細胞表面的FcγRIIa結合，激發細胞內NFAT應答元件，NFAT應答元件則驅動螢光素酶的表達。螢光素酶的活性可以透過生物發光法定量。

分別將待測樣品(B10、A7H3L3、NA3S-H1)稀釋至初始反應濃度200nM，以2倍梯度稀釋10個梯度。將稀釋好的樣品加至96孔白底板，每孔50μL，每個濃度梯度設置3重複。在96孔白底板的邊緣孔補加150μL/孔的PBS溶液。隨後向所述96孔白底板加入5 105個/mL的hCLDN18.2-NUGC-4細胞(靶細胞)，50μL/孔，室溫培養30min。然後加入1.5 106個/mL如上所述的效應細胞，50μL/孔。將96孔白底板在37℃ 5% CO2培養箱中培養6h。檢測：取出96孔白底板，室溫靜置30min。加入檢測試劑螢光素酶底物(Bio-Glo^TM Luciferase Assay System Promega G7940)，50μL/孔，室溫避光反應5-10min，透過酶標儀檢測發光強度(表示為相對光單位(RLU))。將抗體濃度的對數對相應濃度下RLU值作圖，利用Graphpad Prism軟件分析數據，並且計算EC₅₀值。

實驗結果：從圖6和表5中可以看出，靶細胞為hCLDN18.2-NUGC-4細胞時，與抗CD47單抗A7H3L3和抗CLDN18.2單抗NA3S-H1相比，本發明雙特異性抗體B10表現出更高的ADCP活性。

儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，但本領域技術人員將理解：根據本文公開的所有教導，可以對細節進行各種修改和變動，並且這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的保護範圍由所附申請專利範圍及其任何等同物給出。

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Claims

一種雙特異性抗體，其包含結合CD47的一第一抗原結合部分以及結合CLDN18.2的一第二抗原結合部分，其中所述第一抗原結合部分包含一重鏈可變區(VH)和一輕鏈可變區(VL)，所述重鏈可變區包含：1)HCDR1，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；2)HCDR2，其包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；和3)HCDR3，其包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列；並且所述輕鏈可變區包含：1)LCDR1，其包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列；2)LCDR2，其包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列；和3)LCDR3，其包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列；所述第二抗原結合部分包含結合CLDN18.2的免疫球蛋白單可變結構域(VHH)，其中所述免疫球蛋白單可變結構域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
如請求項1所述的雙特異性抗體，其中所述重鏈可變區包含：1)SEQ ID NO：10的胺基酸序列；或者2)與SEQ ID NO：10具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的胺基酸序列；和/或所述輕鏈可變區包含： 1)SEQ ID NO：11的胺基酸序列；或者2)與SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列相同性的胺基酸序列。
如請求項1所述的雙特異性抗體，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，並且所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
如請求項1所述的雙特異性抗體，其中所述免疫球蛋白單可變結構域包含：1)SEQ ID NO：12的胺基酸序列；或者2)與SEQ ID NO：12的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的胺基酸序列。
如請求項1-4中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分和所述第二抗原結合部分透過一接頭連接。
如請求項1-4中任一項所述的雙特異性抗體，其進一步包含免疫球蛋白的一重鏈恆定區(CH)和一輕鏈恆定區(CL)。
如請求項6所述的雙特異性抗體，其中所述重鏈恆定區為人IgG1的重鏈恆定區，和/或所述輕鏈恆定區為人κ輕鏈恆定區。
如請求項6所述的雙特異性抗體，其中所述重鏈恆定區包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列；和/或所述輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列。
如請求項1所述的雙特異性抗體，其包含一第一多肽和一第二多肽，其中所述第一多肽從N端至C端具有如下結構：VH-CH-Linker-VHH，所述第二多肽從N端至C端具有如下結構：VL-CL，其中VH和VL分別為如請求項1-3任一項中所定義的所述重鏈可變區和所述輕鏈可變區；VHH為如請求項1或4中所定義的免疫球蛋白單可變結構域；CH和CL分別為免疫球蛋白的重鏈恆定區和輕鏈恆定區；Linker為接頭。
如請求項9所述的雙特異性抗體，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列。
一種分離的多核苷酸，其編碼如請求項1-10中任一項所述的雙特異性抗體。
一種表達載體，其包含如請求項11所述的多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項11所述的多核苷酸或如請求項12所述的表達載體。
一種抗體綴合物，其包含與至少一種治療劑綴合的如請求項1-10中任一項所述的雙特異性抗體。
一種藥物組合物，其包含如請求項1-10中任一項所述的雙特異性抗體或者如請求項14所述的抗體綴合物，以及藥學上可接受的載劑。
一種如請求項1-10中任一項所述的雙特異性抗體、如請求項14所述的抗體綴合物或者如請求項15所述的藥物組合物在製備用於治療癌症的藥物中的用途。
如請求項16所述的用途，其中所述癌症為胃癌。