TWI842984B - 一種間質幹細胞之凍乾粉及其製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明為提供製造一種間質幹細胞之凍乾粉及其大量取得具生長因子的凍乾分泌物製造方法。本發明所使用之技術手段包含一血清飢餓步驟、一上清液收集步驟、一微粒過濾步驟、一凍液添加步驟、一凍乾步驟及一酚群添加步驟。本發明的幹細胞凍乾分泌物及其製造方法可有效生長具EGF、FGF、或KGF生長因子之凍乾分泌物，並改善其氣味，使凍乾粉可應用於面膜或作為保養品塗抹之功用。
Description
本發明之領域為一種幹細胞組合物及其在製造、保存、轉移之方法。在一廣泛態樣中，本發明系透過不同比例之壓力、溫度，使具幹細胞之上清液能從固態昇華變成氣態，並進行低溫乾燥以維持幹細胞凍粉之活性。
針對不同物品的冷凍乾照方式很多，美國專利公開說明書US2019/0282498A1的FREEZE-DRIED PROBIOTIC FOODSTUFFS提到透過冷凍乾燥方式保存具有益生菌的食品，其將益生菌先行塗佈於食物表面上再進行凍乾。又美國專利公開號US20040161478的說明書段落[0017]提到透過冷凍取得繡球花萃取物用以治療關節炎，並詳細說明用10公升沸騰含繡球花酵素的一公斤蒸餾水可在蒸煮30分鐘，濃縮提取液並加以冷凍乾燥得到繡球花凍乾粉130克。又一美國專利公開號US20140056865A1的ADIPOSECOMPOSITION SYSTEMS AND METHODS提到將凍乾或冷凍乾燥的脂肪幹細胞接種在脫礦物質的骨材料上或與之結合，然後冷凍保存，但必須將脂肪幹細胞粘附或粘結到以骨頭的基底或基質上。
綜合上述先前技術及面相可知，冷凍乾燥的步驟需視冷凍物的屬性、冷凍物的後續使用目的、冷凍的溫度區間及待冷凍物活性問題，甚至是添加物的使用都是關鍵。如美國專利公開說明書US2019/0282498A1是對食物上做塗佈益生菌的初步處理，該食物的顆粒較大，分子結構也較大，凍乾之過程主要是把食物當作載體，並使益生菌作為凍乾分泌物連著在其表面，進而方便益生菌被人體攝取，但同樣凍乾概念無法適用在幹細胞領域，因幹細胞在培養過程中是以液態方式存在。另外，美國專利公開號US20040161478揭示透過冷凍取得繡球花萃取物用以治療關節炎，其製造過程是先採以沸騰手段再進行凍乾，然而此方法無法適用在幹細胞領域，因煮沸的高溫會將幹細胞破壞殺死，進而造成幹細胞的細胞分泌物功能喪失。而另一美國專利公開號US20140056865A1的幹細胞治療則是以骨頭移植手術(grafting procedure)的輔助生長為目的，其中凍乾步驟僅將幹細胞作為纖維填充乾燥劑之製作，透過脂肪細胞浸至磷酸鹽緩衝鹽溶液中15至45分鐘，避免幹細胞因為pH值的劇烈改變而死亡，以致無法修復由動物細胞分化之組織。
先前技術所揭露的凍乾步驟除執行上應考量凍乾分泌物及與載體的相容性問題外，當細胞分泌物要在凍乾前進行的分離步驟也很關鍵。目前常見除凍乾方式分離細胞的方式有尺寸排除色譜法(size-exclusion chromatography)，其係一種透過色譜柱中的多個細小孔珠，依照溶液中的分子按其大小分開的色譜法，例如蛋白質和工業聚合物的分離，因聚合物提供良好的摩爾質量分布(MW)結果，被廣泛使
用作聚合物表徵方法。另外一種則為超速離心機(ultracentifugation)，這樣的機器可以在最高約9800km/s的加速度方式，將細胞與其細胞上清液分離開來，但缺點是超速離心機的加速度與所欲提煉出來的細胞量並非線型結果，需仰賴不斷嘗試，才能測試出理想的上清液量，且缺點是不可溶因子，如胞外囊泡(extracellular yesicles)，會堆積或可能因為高速的轉動力量而被撕裂，使細胞的分泌物遭到破壞。
細胞生長因子的激發
本發明在於使用不同先後步驟，透過缺氧、加入血清、透過加溫、降溫放射等物理方式及添加化學劑等方式使細胞釋放生長因子於條件培養液(condition linediumi)，並使特定複數個量測的生長因子訊號激發出來。
本發明相關實施例及採用之步驟請參表1。
生長因子密度與其功效
經本發明實驗證明，表皮生長因子EGF，由33個胺基酸殘基，三個二硫鍵的6個保守的半胱氨酸基序組成，質量約為66200~66250道耳頓，其有絲分裂多肽，存在於許多哺乳動物物種的大量組織和體液中，對多種表皮和上皮細胞有絲分裂作用，包括成纖維細胞、神經膠質細胞、血管和角膜內皮細胞、牛顆粒、HeLa細胞、SV40-3T3細胞和乳腺上皮細胞。
具EGF生長因子的分泌體可使用於皮膚燒傷、糖尿病等引發腳部潰爛的照護，因分泌體能產生刺激皮膚生長的蛋白質，因此具有使傷口、疤痕等癒合平滑功效。一般肌膚呈現內油外乾，甚至還有兩頰、鼻翼等出現紅斑脫屑的脂漏性皮膚炎症狀，具EGF生長因子的分泌體亦具能有快速促進生長或修復之功效。
具大量細胞分泌體纖維母細胞生長因子FGF包含纖維母細胞生長因子-1(FGF-1)及纖維母細胞生長因子-2(FGF-2)，其分子量約為17300~17400道耳頓。特別是鹼性纖維母細胞生長因子，能有效促進傷口癒合，其中包含促進早期的粒狀組織生成、聚葡萄糖胺沉積、Fibronectin生成、纖維母細胞增生、較佳的膠原蛋白交聯、減少疤痕形成、增加癒合皮膚張力、促進血管新生、促進發炎細胞渗透等作用，可覆蓋在1.5x3.5cm2之深度傷口，較一般人工皮膚無法達到具深度傷口相較下為佳。
角質細胞生長因子KGF包含角質細胞生長因子-1(KGF-1)及角質細胞生長因子-2(KGF-2)。角質細胞生長因子-1係由164個胺基酸組成，且分子量約為18996道耳頓。而角質細胞生長因子-2係由170個胺基酸組成，且分子量約19300道耳頓，可減少水分流失。
為方便之後從細胞分泌體過濾出特定功效之生長因子，本發明使孔徑10~100nm之PVDF薄膜，透過滲透壓方式進行過濾，如表2所列。
脂肪細胞預處理
脂肪細胞預處理亦可稱為血清飢餓處理，其主要目的為細胞組織培養、刺激及擴大增生。取得的細胞組織會先經過生理食鹽水沖洗，且利用蛋白酶的溶解，並加入抗生素進行滅菌等步驟，但在上述過程中會因為取得的細胞組織來源不同，使得脂肪細胞預處理的最終效果而有所差異。另外，為求生長因子之表現明顯，經實驗發現欲使用之細胞需經過執行細胞繼代(passage)、擴充至一定次數才能表現出生如表1所列之欲培養之大量生長因子。
〔本發明〕
110:細胞組織
112:上清液
220:組織取得步驟
222:蛋白酶添加步驟
224:培養液添加步驟
226:血清飢餓步驟
227:以纖維培養基進行細胞培養步驟
228:上清液收集步驟
230:過濾步驟
232:離心步驟
234:凍乾液體添加步驟
236:凍乾步驟
238:粉末收集步驟
240:酚群添加步驟
30:培養容器
31:多層纖維質培養基材
32,34:反覆注液及抽液裝置
圖1係本發明之先前離心技術示意圖。
圖2係本發明之製作流程圖。
圖3係本發明之EGF繼代實驗數據圖。
圖4為本發明之以纖維培養基進行細胞培養步驟的操作示意圖。
本發明多個實施例中揭示，一種間質幹細胞之凍乾粉，包含一幹細胞凍乾分泌物及一香荊芥酚群，幹細胞凍乾分泌物包括可溶性因子及不可溶因子，可溶性因子為胞內囊狀構造物，且可溶性因子包含複數個細胞因子及複數個趨化因子，細胞因子係由表皮生長因子EGF、成纖維細胞生長因子FGF及角質細胞生長因子KGF所組成。趨化因子包含C-X3-C基序趨化因子配體1(Fractalkine)。在本發明實施例中，香荊芥酚群具有C10H14O化學式結構。
除此之外，在本發明多個實施例中，一種間質幹細胞之凍乾粉之製作方法包含依順序進行的一血清飢餓步驟226、一以纖維培養基進行細胞培養步驟227、一上清液收集步驟228、一微粒過濾步驟230、一凍乾液體添加步驟234、一凍乾步驟236及一酚群添加步驟238。以下茲以第一至第四實施例進行本發明之技術說明。
第一實施例
以一脂肪細胞組織來源為實施例，組織取得步驟220係以脂肪細胞組織為組織來源，並對細胞組織採重複三十次以上且使用pH值為7.14的磷酸鹽緩衝生理鹽水進行沖洗；在沖洗過程中不得接觸到含有Ca2+及Mg2+之器具。在組織取得步驟220後為一蛋白酶添加步驟222，蛋白酶添加步驟222是經0.065%的type II的膠原酶消化後，將溶解於具Ca2+及Mg2+的磷酸鹽緩衝生理鹽水的脂肪細胞組織濃度5x103cells/cm2至1x104cells/cm2之間，並添加1.5%的鏈黴素及0.5%的兩性黴素B中，並於攝氏30度靜置一小時，並將含細胞濃度之容器真空增加
壓力至200Pa，進行蛋白酶添加步驟222。在蛋白酶添加步驟222進行時，以添加含5至10ug/ml的醣蛋白二聚體(PDGF-BB)、胺基酸和葡萄糖的培養液及Gibco Han製造的營養混合物F12作為培養液添加步驟224。培養液與F12採以1：2之比例，並再採取血清肌餓步驟226及以纖維培養基進行細胞培養步驟227，並將具細胞組織之溶劑置放36小時。置放36小時後，並在於培養液調和後添加5%(v/v)的牛血清於攝氏9度至12度置放五至十天，以每一天更換培養液，並執行細胞繼代(passage)五次。依上述方式處理脂肪細胞組織能使細胞呈現懸浮狀，使較大量的EGF生長因子被激發培養出來。
第二實施例
又以一嗅覺細胞來源為實施例，一組織取得步驟220係採嗅覺細胞組織為細胞來源，並對細胞組織採重複至少二十次但不大於三十次的pH值為7.14的磷酸鹽緩生理鹽水進行沖洗，且沖洗過程中不得接觸到含Ca2+及Mg2+之器具。之後，進行一蛋白酶添加步驟222，以0.065%的type II的膠原酶消化後將溶解於具Ca2+及Mg2+的磷酸鹽緩衝生理鹽水的脂肪細胞組織濃度6x103cells/cm2至1x105cells/cm2間，並添加1.5%的健大黴素及0.5%的兩性黴素B中，並於一小時內透過程式化降溫從攝氏25度至12度，並於12度C靜置半小時。靜置過程中，另透過培養液添加步驟224，利用添加含5至10ug/ml的醣蛋白二聚體(PDGF-BB)、胺基酸和葡萄糖的培養基及Gibco Ham製造的營養混合物F12，培養液與F12採以1：2之比例，再進行血清飢餓步驟226及以纖維培養基進行細胞培養步驟227，並將其細胞組織之溶劑置放36小時。在置放36小時後於培養液調和後添加5%(v/v)的胎牛血清於攝氏9度至12度置放五至十天，以每二天更換培養液，並執行細胞繼代(passage)
五次。依上述方式處理脂肪細胞組織能使細胞呈現懸浮狀，使較大量的KGF生長因子及中度的FGF生長因子被激發培養出來。
前揭實施例為一較佳實施例，但間質幹細胞來源可更換為從齒下牙齒細胞、嗅覺幹細胞、骨髓、臍帶互為替代並重複上述方法激發出具生長因子之細胞分泌液，惟細胞分泌液必須再進行過濾、離心取得上清液。
第三實施例
以一脂肪細胞組織來源為實施例，一組織取得步驟220利用脂肪細胞組織首應先透過重複十次以上的pH值為7.14的磷酸鹽緩衝生理鹽水進行沖洗，且沖洗過程中不得接觸到含Ca2+及Mg2+之器具。之後，進行一蛋白酶添加步驟222，在步驟222進行時，以0.065%的type II的膠原酶消化後將溶解於具Ca2+及Mg2+的磷酸鹽緩衝生理鹽水的脂肪細胞組織濃度5x103cells/cm2至1x104cells/cm2之間，並添加1.5%的金黴素及0.5%的兩性黴素B中，並於攝氏30度靜置一小時。靜置過程中，另透過培養液添加步驟224，另添加含5至10kg/ml的醣蛋白二聚體(PDGF-BB)、胺基酸和葡萄糖的培養基及Gibco Han製造的營養混合物F12，培養液與F12採以1：2之比例再有選擇性地採取血清飢餓步驟226或省略此步驟226僅進行培養液添加步驟224，及進行以纖維培養基進行細胞培養步驟227，並在於培養液調和後添加5%(v/v)的牛血清於攝氏9度至12度置放五至十天，以每二天更換，並執行細胞繼代(passage)九次。依上述方式處理脂肪細胞組織能使細胞呈現懸浮狀，使較大量的EGF生長因子被激發培養出來。
第四實施例
又以一嗅覺細胞來源為實施例，一組織取得步驟220係採嗅覺細胞組織，並對採集之細胞組織採重複至少二十次但不大於三十次的pH值為7.14的磷酸鹽緩衝生理鹽水進行沖洗，且沖洗過程中不得接觸到含Ca2+及Mg2+之器具。之後，進行一蛋白酶添加步驟222，在步驟222進行時，以0.065%的type II的膠原酶消化後將溶解於具Ca2+及Mg2+的磷酸鹽緩衝生理鹽水的脂肪細胞組織濃度6x103cells/cm2至1x104cells/cm2之間，並添加1.5%的健大黴素及0.5%的兩性黴素B中，並於一小時內透過程式化降溫從攝氏25度至12度，並於12度C靜置半小時後再以放射劑量0.5微西弗進行輻射照射，並靜置12小時。靜置12小時後，進行一培養液添加步驟224，利用添加含5至10kg/ml的醣蛋白二聚體(PDGF-BB)、胺基酸和葡萄糖的培養基及Gibco Han製造的營養混合物F12，培養液與F12採以1：2之比例，並再次靜置12小時。在第二次靜置12小時後，選擇性地添加5%(v/v)的胎牛血清於攝氏9度至12度置放五至十天，並以每二天更換重複步驟224及以纖維培養基進行細胞培養步驟227，並執行細胞繼代(passage)九次。依上述方式處理脂肪細胞組織能使細胞呈現懸浮狀，使較大量的KGF生長因子及中度的FGF生長因子被激發培養出來。
以纖維培養基進行細胞培養步驟
請參考圖4，圖4為步驟227的操作示意圖，當利用具有多層纖維質培養基材31的培養容器30進行細胞培養步驟227時，可於較小空間的培養容器30內以堆疊纖維質培養基材31的方式同時培養多組及/或多種細胞；可利用反覆注液及抽液裝置32、34連接培養容器30，以對於具有多層纖維質培養基材31的培養容器30內的培養液進行主動式擾動，進而提升細胞的生長效率及品質。
在步驟227中，當反覆注液及抽液裝置32推動時，會使得培養容器30內的培養液產生擾動，同時反覆注液及抽液裝置34會充注培養液；接著，可推動反覆注液及抽液裝置34，使培養容器30內的培養液產生擾動，同時反覆注液及抽液裝置32會充注培養液。反覆上述動作，可使培養容器30內的培養液持續產生擾動，以提升細胞的生長效率及品質。
在圖4中，反覆注液及抽液裝置32、34係以二支連通於培養容器30的針筒為示例，但不以此為限制，任何可對於培養容器30內的培養液進行主動式擾動的裝置皆可做為本發明實施例適用的反覆注液及抽液裝置32、34；又，反覆注液及抽液裝置32、34可為手動及/或電動抽注裝置，例如手動或電動抽注吸管。
相較於傳統將培養容器放置於律動載台上的擾動方式，本發明實施例利用連接於培養容器30的反覆注液及抽液裝置32、34對於培養容器30內的培養液進行主動式擾動，可明顯減少氣泡的產生，進而避免細胞因為氣泡而受損及死亡。
上清液收集步驟及過濾步驟
經使用吸管執行一上清液收集步驟228後，以大腸桿菌進行重組蛋白生產，並透過一過濾步驟230，將收集之上清液透過一吸入至一容器中，並以滲透壓之方式透過一具1,000至10,000道耳頓的PVDF薄膜以薄膜流延殘留物並過濾出欲凍乾之分泌物。依照表2所列之蛋白分子使用之PVDF孔徑、操作壓力於MPa、操作溫度25℃，過濾約10~100奈米大小之人體內生性蛋白，並有效取得EGF、FGF或KGF生長因子並使凍乾粉得保存兩個月以上。
離心步驟
進行離心步驟232，並採以13000g進行離心機旋轉沉澱分鐘，離心步驟係為裂解組織，避免細胞碎片變得太粘，增加細胞分泌物之沉澱量。
凍乾液體添加步驟
在離心步驟232完成後，將試管上層汁細胞分泌體進行執行一凍乾液體添加步驟234，其係添加微生物凍乾緩衝劑(Microbial Freeze Drying Buffer)、凍乾劑(Lyophilization Reagent)及凍乾指示劑(Freeze Drying Indicator)之凍乾保護劑。添加上述液體之後逕行一凍乾步驟，並在降低溫度至零下10至15度間，並抽空凍乾機之空腔內的空氣，使其空腔呈現真空狀態。前述凍乾保護劑之添加可適用於保存細胞、蛋白質，並透過凍乾保護劑中之有色試劑觀察其冷凍乾燥過程的變色過程，使製作時能即時測量乾燥狀況。
凍乾步驟
凍乾步驟236是透過一壓縮機將位於之空腔之凍液進行降溫至攝氏零下20至30度並使其空腔之氣壓從10Pa增加至600Pa，並等空腔外部凝結之霜出現後開始加熱回溫至零度直到霜消失後再取出粉末，即進行一粉末收集步驟238。透過加壓至600Pa可減少降溫使用之電量，並能調整增壓區間，取得所具特定生長因子之凍乾粉，並維持凍乾粉之品質。
酚群添加步驟
幹細胞凍乾分泌物包含可溶性因子及不可溶因子，可溶性因子包含複數個由EGF、FGF及KGF組成之細胞因子、複數個趨化因子包含C-X3-C基序趨化因子配體1(Fractalkine)，可溶性因子為胞內囊狀構造物。但成品整體聞起來有腥味或臭味，為使後續使用之應用面較
廣，另可增加酚群添加步驟240，即添加一香荊芥花中所含之酚群萃取物，其能保持幹細胞凍乾粉之活性及壓制其臭味而不破壞其生長因子之功效外，香荊芥酚群較一般添加物所含羥基結構少一OH官能基，能減少水分吸附於凍乾粉中，提高凍乾粉之製造品質，並適用於面膜或作為保養品塗抹之功用。
以上所述僅為本發明較佳可行實施例而已，舉凡應用本發明說明書及申請專利範圍所為之等效變化，理應包含在本發明之專利範圍內。
220:組織取得步驟
222:蛋白酶添加步驟
224:培養液添加步驟
226:血清飢餓步驟
227:以纖維培養基進行細胞培養步驟
228:上清液收集步驟
230:過濾步驟
232:離心步驟
234:凍乾液體添加步驟
236:凍乾步驟
Claims (6)
- 一種間質幹細胞之凍乾粉之製作方法，依順序包含下列步驟：提供來自一細胞組織之一細胞混合物，該細胞混合物為經由pH值為7.14的磷酸鹽緩衝生理鹽水進行沖洗該細胞組織至少十次而得，其中該細胞組織為一脂肪細胞組織或一嗅覺細胞組織；一蛋白酶添加步驟，在該磷酸鹽緩衝生理鹽水沖洗後，該細胞組織以0.065%的type II的膠原酶消化，且將該細胞組織溶解於該磷酸鹽緩衝生理鹽水，該細胞組織濃度介於6x103cells/cm2至1x104cells/cm2之間、7x103cells/cm2至1x104cells/cm2，或者8x103cells/cm2至1x104cells/cm2之間；一血清飢餓步驟，再加入醣蛋白二聚體(PDGF-BB)5至10ug/ml，將該細胞組織之溶液置放36小時，隨後添加5%(v/v)的胎牛血清，並於攝氏9度至12度置放五至十天，以每二天更換，並執行五次至九次細胞繼代(passage)以刺激表皮生長因子EGF、成纖維細胞生長因子FGF及角質細胞生長因子KGF之分泌量；一上清液收集步驟，該細胞組織之溶液經離心處理且吸取上清液；一微粒過濾步驟，將收集之上清液透過一吸入口至一容器中，並以滲透壓之方式透過一具1,000至10,000道耳頓的PVDF薄膜以薄膜流延殘留物並過濾出欲凍乾之一分泌物；一凍乾液體添加步驟，在該分泌物中添加一凍乾液體；一凍乾步驟，將該分泌物與該凍乾液體進行凍乾處理，取得所具特定生長因子之一凍乾粉；及 一酚群添加步驟，在該凍乾粉中添加一香荊芥花中所含之酚群萃取物。
- 如請求項1所述之間質幹細胞之凍乾粉之製作方法，其中該上清液收集步驟包含以大腸桿菌進行重組蛋白生產，並以13,000g進行離心機旋轉沉澱。
- 如請求項1所述之間質幹細胞之凍乾粉之製作方法，其中該凍乾液體添加步驟係添加具有微生物凍乾緩衝劑(Microbial Freeze Drying Buffer)、凍乾劑(Lyophilization Reagent)及凍乾指示劑(Freeze Drying Indicator)之凍乾保護劑。
- 如請求項3所述之間質幹細胞之凍乾粉之製作方法，其中該凍乾步驟是透過一壓縮機將位於之空腔之凍液進行降溫至攝氏零下20至30度並使其空腔之氣壓從10Pa增加至600Pa，並等空腔外部凝結之霜出現後開始加熱回溫至攝氏零度直到霜消失後再取出粉末。
- 一種間質幹細胞之凍乾粉，其係利用如請求項1至請求項4之任一項之間質幹細胞之凍乾粉之製作方法所製得，其中該間質幹細胞之凍乾粉包含一幹細胞凍乾分泌物及一香荊芥酚群，該幹細胞凍乾分泌物包括一可溶性因子及一不可溶因子，該可溶性因子為胞內囊狀構造物，且包含複數個細胞因子及複數個趨化因子，該些細胞因子係由表皮生長因子EGF、成纖維細胞生長因子FGF及角質細胞生長因子KGF所組成，該些趨化因子包含C-X3-C基序趨化因子配體1(Fractalkine)。
- 如請求項5所述之間質幹細胞之凍乾粉，其中該香荊芥酚群具有C10H14O化學式結構。
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2021
- 2021-03-10 TW TW110108523A patent/TWI842984B/zh active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Park et. al., "Cytokine Secretion Profiling of Human Mesenchymal Stem Cells by Antibody Array" International Journal of Stem Cells, Vol. 2, No. 1, Korean Society for Stem Cell Research, 2009, p.59-68 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202235613A (zh) | 2022-09-16 |
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