TWI734095B - ｄＮＭＰ激酶及使用此激酶製備核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本案係提供一種源自於嗜熱嗜熱菌P23噬菌體的dNMP激酶，其具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列。本發明更提供一種使用本發明dNMP激酶製備(去氧)核醣核苷雙磷酸的方法，包括混合(a)核醣核苷單磷酸(NMP)或去氧核醣核苷單磷酸(dNMP)、(b)腺苷三磷酸(ATP)或去氧腺苷三磷酸(dATP)及(c)本發明dNMP激酶，在一高溫、鹼性環境下進行反應，產生核醣核苷雙磷酸(NDP)或去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)。此外，本發明更提供一種去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)的製備方法。
Description
本發明係有關於一種核醣核酸的製備，且特別有關於一種新穎之dNMP激酶(deoxynucleoside monphosphate)、使用此dNMP激酶製備(去氧)核醣核苷雙磷酸(NDP或dNDP)、(去氧)核醣核苷三磷酸(NTP或dNTP)的方法。
核苷酸是由一個五碳醣、含氮鹼基以及一至三個磷酸根所組成的化合物，在生物體中是相當重要的分子。就基因層面而言，去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)可以拿來組成DNA，核醣核苷酸則用來組成RNA。在商業上，目前核苷酸已應用於食物增味劑、動物的飼料、傷口癒合及化妝品等，用途相當廣泛。
隨著PCR的發展與生物技術等等的應用，dNTP在研究單位及商業應用上的需求量逐年上升，然而現今市面上所販售的dNTP主要是以化學方式合成，僅有少部分文獻記載了生物製成。
化學合成的方法是將dNMP鹽類以溶解性很好的二甲基甲醯胺(dimethylformamide)處理過後使用三-正丁基胺進行初步的磷酸根還化，之後再加入含氮鹼基合成dNTP，最後以吡啶pyridine進行有機相及水相的分離，整體的反應時間約2個小時，產率依照dNTP種類差異而有20%到
50%左右的差異。
化學合成法在純化及分離的步驟具有很高的複雜性，需要分離未反應完的鹽類、磷酸溶液、DMF還有反應中所產生的副產物。此外，在反應中所使用的吡啶以及DMF都是有機毒物，會對人體及環境造成危害。
有鑑於此，為解決上述問題，業界亟需一種無環境汙染、低反應時間、高產率且簡單的dNTP合成法及系統。因此，本發明係提供一種新穎之蛋白質，其係具備dNMP激酶活性、以及使用此蛋白製備(去氧)核醣核苷雙磷酸的方法，和使用此蛋白製備(去氧)核醣核苷三磷酸的方法。
本發明係提供一種分離之蛋白質，該蛋白質具有dNMP激酶(dNMP kinase,NMK)活性，其具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
SEQ ID NO：1之胺基酸序列如下所示：
在本發明一實施例中，該蛋白質為源自嗜熱菌噬菌體之蛋白質。
在本發明一實施例中，該蛋白質為源自嗜熱菌P23噬菌體(Thermus P23 phage)之蛋白質。
本發明係提供一種前述蛋白質作為激酶之用途，係用於轉換
一核醣核苷單磷酸(NMP)為一核醣核苷雙磷酸(NDP)之用途，或用於轉換一去氧核醣核苷單磷酸(dNMP)為一去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)之用途。
本發明進一步提供一種使用前述蛋白質製備核醣核苷雙磷酸或去氧核醣核苷雙磷酸的方法，包括：(i)混合(a)一核醣核苷單磷酸(NMP)或一去氧核醣核苷單磷酸(dNMP)、(b)一腺苷三磷酸(ATP)或一去氧腺苷三磷酸(dATP)及(c)前述蛋白質；以及(ii)在一高溫與一鹼性環境下進行反應，產生核醣核苷雙磷酸(NDP)或去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)。
本發明更進一步提供一種去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)的製備方法，包括：(i)混合一去氧核醣核苷單磷酸(dNMP)、一腺苷三磷酸(ATP)及前述蛋白質，在一高溫與一鹼性環境下進行反應，以產生去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)；以及(ii)混合該去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)、一磷酸根及一磷酸轉移酶，以產生去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)。
在本發明一實施例中，前述磷酸根包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)或乙醯磷酸(AcP)。
在本發明一實施例中，磷酸轉移酶包括丙酮酸激酶或乙酸激酶。
在本發明一實施例中，前述高溫環境為50℃以上。
在本發明一實施例中，前述高溫環境為50~75℃。
在本發明一實施例中，前述高溫環境為80~100℃。
在本發明一實施例中，前述鹼性環境為pH6.5以上。
在本發明一實施例中，前述鹼性環境為pH 6.5~9。
在本發明一實施例中，前述鹼性環境為pH 5~7。
第1圖為本發明生物反應合成法之一實施例示意圖。
第2圖顯示本發明嗜熱菌P23噬菌體NMK在不同pH值下的酵素活性。
第3圖顯示本發明嗜熱菌P23噬菌體NMK在不同溫度下的酵素活性。
第4A-4D圖為高效能液相層析儀的紫外線(UV)圖譜。以高效能液相層析儀分析嗜熱菌P23噬菌體NMK所生成的去氧腺苷雙磷酸(dADP)、去氧胸腺苷雙磷酸(dTDP)、去氧胞苷雙磷酸(dCDP)及去氧鳥苷雙磷酸(dGDP)。
第5A-5D圖為高效能液相層析儀的紫外線(UV)圖譜。以高效能液相層析儀分析二磷酸激酶(NDP kinase,NDK)，以嗜熱菌P23噬菌體NMK所生成的dNDP作為反應原料，以生成去氧腺苷雙磷酸(dATP)、去氧胸腺苷雙磷酸(dTTP)、去氧胞苷雙磷酸(dCTP)及去氧鳥苷雙磷酸(dGTP)。
第6A-6B圖為1%瓊脂凝膠電泳分析圖。本發明嗜熱菌P23噬菌體NMK所合成之dNTP可進行PCR反應。
本發明係提供一種分離之蛋白質，其具有dNMP激酶(dNMP kinase,NMK)之活性。本發明之分離之蛋白質自嗜熱菌P23噬菌體(Thermus P23 phage)，具有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
SEQ ID NO：1之胺基酸序列如下所示：
本發明提供分離之蛋白質，包含SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列，進一步包含該蛋白質的變異體，所述蛋白質的變異體係指具有一或多個胺基酸取代、刪除或添加後所衍生之該蛋白質，且該蛋白質同樣具備dNMP激酶之活性，所述蛋白質的變異體及其用途，應視為等同本發明均等範圍。
本發明dNMP激酶的氨基酸序列中具有高比例的精氨酸(Arg)，有良好的熱穩定性。Arg的側鏈分支中的胍基團(guanidinium group)利用共振(resonance)的方式與周圍的胺基酸形成穩定的氫鍵，而且Arg也含有一個亞甲基基團，可增強胺基酸間的疏水性作用力，這些鍵結都對結構的熱穩定性有幫助。此外，Arg的解離常數(pKa)最高可達12，在高溫下能以帶電荷的形態存在，維持與附近胺基酸的鍵結與作用力來穩定蛋白質的結構與熱穩定性。
在一實施例中，本發明dNMP激酶的Arg比例為8.5%以上，較佳為6~8%，更佳為8~12%。
本發明dNMP激酶具有良好的活性可將dNMP或NMP轉化成dNDP或NDP。在一實施例中，本發明dNMP激酶具有熱穩定性及活性，特別是在50℃~65℃時具有良好活性。
在另一實施例中，本發明在pH6.5~7.0時具有良好活性。
本發明另提供一種使用本發明dNMP激酶製備核醣核苷雙磷酸(NDP)或去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)的方法。本發明之方法包括：混合(a)核醣核苷單磷酸(NMP)或去氧核醣核苷單磷酸(dNMP)、(b)一腺苷三磷酸(ATP)或去氧腺苷三磷酸(dATP)以及(c)本發明之dNMP激酶，在一高溫、鹼性環境下進行反應，產生核醣核苷雙磷酸(NDP)或去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)。
本發明所述之核醣核苷雙磷酸(NDP)包括腺苷雙磷酸(ADP)、胸腺苷雙磷酸(TDP)、胞苷雙磷酸(CDP)及/或鳥苷雙磷酸(GDP)；去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)包括去氧腺苷雙磷酸(dADP)、去氧胸腺苷雙磷酸(dTDP)、去氧胞苷雙磷酸(dCDP)及/或去氧鳥苷雙磷酸(dGDP)。
在本發明中，可使用腺苷三磷酸(ATP)或去氧腺苷三磷酸(dATP)作為磷酸根的來源。在一高溫、鹼性環境下與本發明之dNMP激酶，進行反應，將核醣核苷單磷酸(NMP)或去氧核醣核苷單磷酸(dNMP)轉換成核醣核苷雙磷酸(NDP)或去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)。
本發明方法中所述之“高溫”係指50℃以上、50~60℃、60~70℃、70~80℃、80~90℃以及、90~100℃。
本發明方法中所述之“鹼性”係指pH5以上、pH5~6.5、pH6.5~7、pH7~8、pH8~9。
本發明更提供一種去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)的製備方法，此方法包括2步驟，第1步驟為產生去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)，第2步驟為產生去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)，如第1圖示。
第1步驟與上述使用本發明dNMP激酶製備去氧核醣核苷雙
磷酸(dNDP)的方法相同。將去氧核醣核苷單磷酸(dNMP)與本發明之dNMP激酶混合，以去氧腺苷三磷酸(dATP)作為磷酸根的來源，在一高溫、鹼性環境下進行反應，可產生去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)。
第2步驟為將第1步驟所獲得的去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)與一磷酸根物質及一磷酸轉移酶在65℃水浴槽混和反應10分鐘，以產生去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)。第2步驟中所使用的磷酸根物質可包括，例如，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)或乙醯磷酸(AcP)，且磷酸轉移酶可包括，例如丙酮酸激酶或乙酸激酶。將所獲得的去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)純化後，即可獲得高純度的去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)。
本發明之方法為一生物合成方法，相較以往的化學合成，僅只需要兩種酵素(dNMP激酶、丙酮酸激酶或乙酸激酶)就可以進行dNTP的生物合成，且整體反應的時間也大幅降低(僅需約40分鐘)。此外，因為是在高溫環境下反應，可以抑制許多環境中酵素的活性(如磷酸水解酶)，減少其他可能會影響dNTP合成的因素。在產率方面，dNTP的產率可以達到50%以上，較佳為55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%以上，相較以往的酵素合成方法高出許多。
實施例1. 嗜熱菌P23噬菌體NMK的製備
將嗜熱菌P23噬菌體之NMK的基因片段經由PCR擴增反應後，由限制酶NdeI和XhoI酵切處理，接合到蛋白質的表現載體pET-30a(Novagen)上，並轉形至大腸桿菌BL21中，以進行表現。
可理解的，製備蛋白質係為本發明所屬技術領域之慣用技術，是以其他製備蛋白質之方法，應視為等同本發明均等範圍。
實施例2. 嗜熱菌P23噬菌體NMK最佳活性測定
取1μg經純化的嗜熱菌P23噬菌體NMK，加入不同pH值(pH6.5、pH 7、pH 7.5、pH 8及pH 8.5)的反應溶液(50mM Tris-HCl；80mM KCL；8mM MgCl2；5mM dNMP；2mM ATP)，在不同溫度(55℃、60℃、65℃、70℃及75℃)的水浴槽反應30分鐘。產物以高效層析儀進行分析。
參照第2圖，在溫度65℃的情況下，在pH 8.5的情況下具有最佳的活性。與pH 8.5的活性(100%)相比，在pH 8.0時活性為86%，在pH 7.5的活性為85%，在pH 7.0的活性為74%，且在pH 6.5的活性為73%。結果顯示在pH值7到8.5之間嗜熱菌P23噬菌體NMK都還能保有70%左右的活性。
由第3圖可知，嗜熱菌P23噬菌體NMK在70℃時有最佳活性。與70℃的活性(100%)相比，在75℃的活性為45%，在65℃的活性為95%，在60℃的活性為72%，且在55℃的活性為55%。結果顯示在溫度70℃到65℃之間有著最好的活性，且發現嗜熱菌P23噬菌體NMK對溫度有很強烈的敏感性，在最佳活性以外的溫度，活性都降低至50%左右。
實施例3. 嗜熱菌P23噬菌體NMK的活性
取最終濃度1μg/μL經純化後的NMK，加入反應溶液(50mM Tris-HCl；80mM KCL；8mM MgCl2；5mM dNMP；2mM ATP或dATP；pH 8.0)，反應總體積為100μl，反應溫度為65℃，在水浴槽反應30分鐘後獲得產物。使用Water X-BridgeTM C18管柱(4.6 x 20mm，顆粒大小3μm)，在37°C恆溫環境下以高效層析儀分析產物。
由第4A-4D圖可知，不論是以ATP或dATP為磷酸根來源，在以dAMP、dTMP、dCMP或dGMP作為受質的情況下，嗜熱菌P23噬菌體NMK可產生dADP、dTDP、dCDP或dGDP。
實施例4. 利用嗜熱菌P23噬菌體NMK合成dNTP
取最終濃度4μg/μL純化的嗜熱菌P23噬菌體NMK加入含有反應溶液(50mM Tris-HCl；80mM KCL；8mM MgCl2；5mM dNMP；2mM ATP；pH 8.0)的微量離心管中，反應總體積為400μl，於65℃反應30分鐘。之後再加入最終濃度4μg/μL純化之Me.thermophile、Th.maritima的乙酸激酶(acetate kinase,AK)或T.thermophilus hb8的丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)，並提供最終濃度2mM磷酸根(AcP或PEP)，然後在65℃水浴槽反應10分鐘。
由第5A-5D圖可知，透過二磷酸激酶(NDP kinase,NDK)，以ATP提供磷酸根，再以嗜熱菌P23噬菌體NMK生成的dADP、dTDP、dCDP或dGDP作為受質的情況下，可產生dADP、dTDP、dCDP或dGDP，反應及其結果皆與先前技術相同。
取20μl反應後的產物作為dNTP的來源，並以PCR擴增進行檢測。PCR產物以1%瓊脂凝膠進行電泳分析。參照第6A-6B圖，本發明嗜熱菌P23噬菌體NMK所合成之dNTP確實可來進行PCR使用。
<110> 國立清華大學
<120> dNMP激酶及使用此激酶製備核苷酸的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 177
<212> PRT
<213> Thermus virus P23
<400> 1
Claims (1)
- 一種分離之蛋白質製備核醣核苷三磷酸或去氧核醣核苷三磷酸的方法，包括：(i)混合(a)一核醣核苷單磷酸(NMP)或一去氧核醣核苷單磷酸(dNMP)、(b)一腺苷三磷酸(ATP)或一去氧腺苷三磷酸(dATP)及(c)一分離之蛋白質；以及(ii)在一高溫環境下進行反應，產生一核醣核苷雙磷酸(NDP)或一去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)；其中，該分離之蛋白質具有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列；該高溫環境為65~70℃；該高溫環境為pH 7~8.5；其中該方法包括去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)的製備步驟，包括：(iii)混合該去氧核醣核苷雙磷酸(dNDP)、一磷酸根及一磷酸轉移酶，以產生去氧核醣核苷三磷酸(dNTP)，該磷酸根包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)或乙醯磷酸(AcP)；該磷酸轉移酶包括丙酮酸激酶或乙酸激酶。
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| US20170292138A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
-
2019
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US20170292138A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Bao Jie et al., "Total biosynthesis of deoxynucleoside triphosphates using deoxynucleoside monophosphate kinases for PCR application" Biotechnology and bioengineering 98.1: 1-11, 2007/05/18 |
| NCBI accession no. YP_001467881, dNMP kinase [Thermus virus P23-45], 2018/08/13 |
| NCBI accession no. YP_001467881, dNMP kinase [Thermus virus P23-45], 2018/08/13 Bao Jie et al., "Total biosynthesis of deoxynucleoside triphosphates using deoxynucleoside monophosphate kinases for PCR application" Biotechnology and bioengineering 98.1: 1-11, 2007/05/18 許翼軒，Thermus thermophilus HB8核苷酸激酶與核苷二磷酸激酶基因之選殖與應用於去氧核醣核苷三磷酸之合成，國立清華大學分子醫學研究所碩士論文，上架日:2019/03/27 * |
| 許翼軒，Thermus thermophilus HB8核苷酸激酶與核苷二磷酸激酶基因之選殖與應用於去氧核醣核苷三磷酸之合成，國立清華大學分子醫學研究所碩士論文，上架日:2019/03/27 |
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