TWI733005B

TWI733005B - 靈芝萃取物用於製備提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化之組合物的用途

Info

Publication number: TWI733005B
Application number: TW107107664A
Authority: TW
Inventors: 凃啟堂; 楊舜傑; 沈曼晴; 鄭漢中; 朱博湧
Original assignee: 台灣粒線體應用技術股份有限公司
Priority date: 2018-03-07
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2021-07-11
Also published as: TW201938182A; CN110237106A

Abstract

一種靈芝萃取物用於製備提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化之組合物的用途。此含有靈芝萃取物的組合物可促進神經細胞的突觸成長。

Description

靈芝萃取物用於製備提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化之組合物的用途

本發明係關於一種提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化之組合物，特別是一種靈芝萃取物用於製備提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化之組合物的用途。

粒線體(Mitochondria)是細胞內進行氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所。由於三磷酸腺苷為細胞活動的能量來源，所以粒線體又有「細胞能量工廠」之稱。除了為細胞提供能量外，粒線體還參與細胞分化、細胞資訊傳遞和細胞凋亡等過程，並擁有調控細胞生長周期的能力。當粒線體具有較佳的健康狀態時，細胞具有較高的生物能量健康指數，代表粒線體可提供充足的能量予細胞，且粒線體調節能量供給量的彈性較佳。如此一來，當具有較高的生物能量健康指數的細胞在承受壓力時，粒線體可根據細胞的需求提供能量，讓細胞有充足的能量去應對壓力。

然而，粒線體在進行氧化磷酸化反應時產生的部份副產物對於粒線體的內膜是有害的。這些有害物質長期累積下來所產生的壓力，將對粒線體的能量供給量與調節能量供給量的彈性產生不良影響，使得細胞的生物能量健康指數下降。更甚者，嚴重受損的粒線體內膜將觸發粒線體崩解，進而觸發細胞凋亡。因此，如何提升細胞的生物能量健康指數已成為一個重要的課題。

本發明係提供一種靈芝萃取物用於製備提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化之組合物的用途，藉由給予此組合物，可提高生物能量健康指數，並確保細胞進行分化時可得到充足的能量供給。

本發明一實施例揭露一種靈芝萃取物用於製備提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化之組合物的用途。

本發明另一實施例揭露一種靈芝萃取物用於製備促進細胞進行分化之組合物的用途。

在本發明部分實施例中，前述細胞為神經細胞，而靈芝萃取物可促進神經細胞的突觸成長。

在本發明部分實施例中，靈芝萃取物的濃度為每毫升100至300微克(μg/ml)。

在本發明部分實施例中，靈芝萃取物的有效劑量為1.081至3.244毫克(mg)。

根據上述本發明所揭露的靈芝萃取物用於製備提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化之組合物的用途，當將含有靈芝萃取物的組合物供予在壓力環境下的細胞時，靈芝萃取物可提高生物能量健康指數，並確保細胞可得到充足的能量供給以進行分化。如此一來，粒線體有能力根據細胞的需求提供能量，讓細胞有充足的能量去應對壓力與進行各種生命活動。

以上之關於本揭露內容之說明及以下之實施方式之說明係用以示範與解釋本發明之精神與原理，並且提供本發明之專利申請範圍更進一步之解釋。

圖1為實施例A1至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞在氧化壓力下的自由基生成量示意圖。

圖2為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞的海馬生物能量測定儀量測結果示意圖。

圖3為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞中粒線體之基礎耗氧量示意圖。

圖4為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞中粒線體之合成三磷酸線苷的耗氧量示意圖。

圖5為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞中粒線體之克服氫離子洩漏的耗氧量示意圖。

圖6為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞中粒線體之最大耗氧能力示意圖。

圖7為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞中粒線體之預存耗氧能力示意圖。

圖8為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞中粒線體之三磷酸線苷媒合效率示意圖。

圖9為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞中非粒線體之耗氧量示意圖。

圖10為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞的生物能量健康指數示意圖。

圖11為以靈芝萃取物處理後之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞的分化指標示意圖。

圖12至圖14為大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞以不同處理方式處理後的電子顯微鏡照片。

以下在實施方式中詳細敘述本發明之詳細特徵以及優點，其內容足以使任何熟習相關技藝者了解本發明之技術內容並據以實施，且根據本說明書所揭露之內容、申請專利範圍及圖式，任何熟習相關技藝者可輕易地理解本發明相關之目的及優點。以下之實施例係進一步詳細說明本發明之觀點，但非以任何觀點限制本發明之範疇。

本發明使用之靈芝萃取物是由靈芝的子實體或菌絲體萃取而得。靈芝萃取物中包含重量比1：2.5至1：3.0的三萜類及靈芝多醣(三萜類：靈芝多醣)。三萜類包含靈芝酸(Ganoderic acid)、赤靈酸(Ganoderenic acid)等。本發明使用之靈芝萃取物之取得方式例如以二氧化碳或純水作為超臨界流體萃取靈芝，或者是以純水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、重量百分濃度0.1至5%的氯化鈉水溶液、重量百分濃度0.1至5%的氯化鉀水溶液、重量百分濃度0.1至5%的氯化鈣水溶液、重量百分濃度0.1至5%的氯化鎂水溶液、重量百分濃度0.1至5%的氯化鈉乙醇溶液、重量百分濃度0.1至5%的氯化鉀乙醇溶液、重量百分濃度0.1至5%的氯化鈣乙醇溶液或是重量百分濃度0.1至5%的氯化鎂乙醇溶液作為溶劑萃取靈芝而得到靈芝初萃液。接著，將靈芝初萃液過濾純化後得到本發明所使用的靈芝萃取物。餘甘子萃取物可透過噴霧乾燥(Spray dry)、真空乾燥或冷凍乾燥之乾燥程序得到易於保存的靈芝萃取物粉末。

於本發明中，當含有靈芝萃取物的組合物被供予在壓力環境下的細胞，濃度為每毫升100至300微克(μg/ml)的靈芝萃取物可提高生物能量健康指數，並確保細胞可得到充足的能量供給以進行分化。如此一來，粒線體有能力根據細胞的需求提供能量，讓細胞有充足的能量去應對壓力與進行各種生命活動。

詳細來說，在壓力環境下，經靈芝萃取物處理的細胞中的粒線體，其進行氧化磷酸化反應合成的三磷酸線苷數量提高，且粒線體的最大耗氧能力(Maximal Respiration)、合成三磷酸線苷的耗氧量 (ATP Production)、預存耗氧能力(Spare Respiratory Capacity)以及三磷酸線苷媒合效率(Coupling Efficiency)皆提高，而粒線體的氫離子洩漏(Proton Leakage)下降。

再者，細胞的生物能量健康指數(Bioenergetic Healthy Index，BHI)值計算方式如下：BHI=[合成三磷酸線苷的耗氧量×預存耗氧能力]/[克服氫離子洩漏的耗氧量×非粒線體耗氧量]。經靈芝萃取物處理的細胞的生物能量健康指數得到提升，使得細胞面對壓力的應變能力亦得到提升。

將靈芝萃取物供予細胞的方法例如為以口服方式攝取包含靈芝萃取物的組合物或其製劑。以口服方式將靈芝萃取物供予細胞時，靈芝萃取物的人體有效劑量為1.081克(g)至3.244克。此處之有效劑量係根據細胞實驗之有效劑量與人體公斤數之換算公式進行換算得到。換算公式如下：人體有效劑量=細胞實驗之有效劑量×小鼠體重×折算係數×人體公斤數。其中，假設小鼠體重為20克，人體公斤數為60公斤，且折算係數為9.01，折算係數係由動物與人體的每公斤體重劑量折算係數表查表得到。

為方便以口服的方式攝取靈芝萃取物，包含靈芝萃取物之組合物可製成例如液體狀、固體狀、顆粒狀、粉體狀、糊狀或凝膠狀的製劑。

於本發明部分實施例中，此製劑中可僅包含靈芝萃取物。於本發明另一部分實施例中，在不影響本發明所能產生之功效及所能達成之目的下，此製劑中亦可包含其它成份或添加物，例如載劑、稀釋劑、輔劑、賦形劑或呈味劑。賦形劑可使製劑方便實用，而呈味劑可提升製劑的風味。

此製劑可為硬膠囊，藉以包覆乾燥粉末形式之包含靈芝萃取物之組合物。此製劑亦可為軟膠囊，藉以包覆溶液狀、懸浮液狀、糊狀、粉末狀或顆粒狀形式之包含靈芝萃取物之組合物。

軟膠囊中用於溶解或分散包含靈芝萃取物之組合物的油脂類例如為萼梨油、杏仁油、亞麻仁油、小茴香油、白蘇油、橄欖油、橄欖角鯊烯、甜橙油、胸棘鯛油(orange roughy oil)、芝麻油、蒜油、可可脂、南瓜子油、洋甘菊油、胡蘿蔔油、胡瓜油、牛油脂肪酸、夏威夷核果油、越橘子油、糙米胚芽油、大米油、小麥胚芽油、紅花油、牛油樹油脂、液狀牛油樹油脂、紫蘇油、大豆油、月見草油、山茶油、玉米油、菜子油、鋸葉棕萃取油(saw palmetto extract oil)、薏苡油、桃仁油、洋芹子油、蓖麻油、葵花子油、葡萄子油、琉璃苣油、澳洲胡桃油、繡線菊油(meadowfoam oil)、棉子油、花生油、龜油、貂油、蛋黃油、魚油、棕櫚油、棕櫚仁油、木蠟、椰子油、長鏈/中鏈/短鏈之脂肪酸三甘油酯、二酸甘油酯、牛油、豬油、角鯊烯、角鯊烷、姥鮫烷、以及該等油脂類之氫化物等。其中，琉璃苣油與月見草油含有大量伽瑪亞麻油酸(Gamma-Linolenic Acid，GLA)，伽瑪亞麻油酸屬於人體必須脂肪酸，其具有保濕、促進細胞再生以及提升棕色脂肪(Brown Fat)活躍度以促進脂肪燃燒的功能。

賦形劑例如為小麥澱粉、米澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、糊精、環糊精等澱粉類；結晶纖維素類；乳糖、葡萄糖、砂糖、還原麥芽糖、飴糖、果寡糖、乳化寡糖等糖類；山梨糖醇、赤藻糖醇、木糖醇、乳糖醇、甘露醇等糖醇類。

呈味劑例如為龍眼萃取物、荔枝萃取物、柚子萃取物等各種果汁萃取物；蘋果汁、橘子汁、檸檬汁等各種果汁；桃子香料、梅子香料、酸乳酪香料等各種香料；乙醯磺胺酸鉀、蔗糖素、赤藻糖醇、寡糖類、甘露糖、木糖醇、異構化糖類等各種甜味劑；檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、葡萄糖酸等各種酸味劑；綠茶、烏龍茶、巴拿巴茶(Banaba tea)、杜仲茶、鐵觀音茶、薏苡茶、七葉膽茶、茭白茶、昆布茶等各種茶成分等。

此外，著色劑、防腐劑、增黏劑、結合劑、崩解劑、分散劑、穩定劑、膠化劑、抗氧化劑、界面活性劑、防腐劑、pH值調整劑等符合政府單位規定之添加物亦可依照政府單位規定之劑量標準與加工生產之需求添加於包含靈芝萃取物的製劑中。

以下藉由本發明各實施例與各比較例說明本發明所揭露之靈芝萃取物在壓力環境下提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化的用途，並且進行實驗測試以說明本發明所揭露之靈芝萃取物在壓力環境下提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化的用途之功效。

本發明各實施例使用之靈芝萃取物的取得方式如下。

首先，將靈芝(鹿角靈芝，Ganoderma lucidum，Antler)的子實體研磨為粉末狀的靈芝粉末。研磨方式可以是利用研磨器研磨10秒後暫停30秒為一回合，總共進行三回合的方式進行研磨。藉此，避免連續進行研磨所產生的高溫破壞靈芝中所含的成分，進而影響靈芝萃取物的品質。

接下來，對靈芝粉末進行水萃。水萃方式為將靈芝粉末投入水中，並以100℃的溫度加熱60分鐘。靈芝粉末與水的重量比例如為1比40。本發明各實施例使用的靈芝萃取物，係使用5克靈芝粉末與200克純水進行水淬所得。藉此，使靈芝中的靈芝多醣(0.5wt%)及三萜類(0.18wt%)等成分溶入水中，得到靈芝初萃液。

接下來，以離心機對靈芝初萃液進行離心以得到靈芝上清液。離心方式例如將205克的靈芝初萃液以8000rpm的離心力，在4。℃的環境下離心30分鐘。

接下來，對靈芝上清液進行冷凍乾燥以得到粉末狀的靈芝萃取物。自離心後的靈芝初萃液中取出靈芝上清液，接著將靈芝上清液進行冷凍乾燥3天，得到0.12g的粉末狀靈芝萃取物。此粉末狀靈芝萃取物溶解於水中，即為後續實驗所使用的靈芝萃取物水溶液。靈芝萃取物水溶液中含有重量百分比0.18%的三萜類及重量百分比0.5%的靈芝多醣。

本發明各實驗使用的細胞為大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞(PC-12)，由食品工業研究所之生物資源保存及研究中心(BCRC)購入，BCRC編號60048。實驗用細胞的準備方式為於24孔孔盤的每一個孔中植入20000個大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞(PC-12)，培養24個小時後供後續分析實驗使用。

自由基檢測實驗與海馬生物能量測定分析實驗使用的大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞，在培養時使用的培養液成分為含有體積百分濃度10%的馬血清以及體積百分濃度5%的胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培養基。神經分化實驗使用的大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞，在培養時使用的培養液成分為含有體積百分濃度1%的馬血清以及體積百分濃度0.5%的胎牛血清的RPMI 1640培養基。

在自由基檢測實驗與海馬生物能量測定分析實驗中，實施例A1之PC-12細胞係以濃度為每毫升100微克(μg/ml)的靈芝萃取物水溶液處理的PC-12細胞。處理方式為在前述已培養24個小時的PC-12細胞所在的孔盤中，加入濃度100μg/ml的靈芝萃取物水溶液1微升(μl)，使PC-12細胞在濃度為每毫升100微克(μg/ml)的靈芝萃取物水溶液中浸泡24個小時。實施例A2至實施例A4之PC-12細胞的處理方式相似於實施例A1之PC-12細胞，其差異在於實施例A2至實施例A4係分別以濃度150μg/ml、200μg/ml以及250μg/ml的靈芝萃取物水溶液處理的PC-12細胞。比較例A與控制例A之PC-12細胞係未使用靈芝萃取物水溶液進行處理的PC-12細胞。

以下首先說明自由基檢測實驗之操作方式與檢測結果。

首先，移除實施例A1至實施例A4以及比較例A之PC-12細胞所在孔中的水溶液。接著，將濃度為20μM的過氧化氫(H₂O₂)水溶液加入實施例A1至實施例A4以及比較例A之PC-12細胞所在的孔中，並浸泡60分鐘。接著，移除實施例A1至實施例A4、比較例A以及控制例A之PC-12細胞所在的孔中的水溶液，並以磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)清洗孔中的PC-12細胞。接著，將含20mM DCFH-DA(Dichlorofluorescin-DA)的二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液加入孔中並浸泡45分鐘。最後，以分光光度計檢測實施例A1至實施例A4、比較例A以及控制例A之PC-12細胞中的螢光強度，藉此得到自由基生成量。

自由基檢測實驗的檢測結果請參照圖1。圖1為實施例A1至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞在氧化壓力下的自由基生成量示意圖。如圖1所示，實施例A1至實施例A4之PC-12細胞在氧化壓力下所產生的自由基量明顯低於比較例A之PC-12細胞在氧化壓力下所產生的自由基量。由此可知，濃度100μg/ml至300μg/ml的靈芝萃取物水溶液具有降低細胞在氧化壓力下的自由基生成量的功效。

接下來，說明粒線體活性檢測實驗之操作方式與檢測結果。

首先，移除實施例A1至實施例A4以及比較例A之PC-12細胞所在孔中的水溶液。接著，將濃度為50μM的過氧化氫(H₂O₂)水溶液加入實施例A1至實施例A4以及比較例A之PC-12細胞所在的孔中，並浸泡60分鐘。接著，移除實施例A1至實施例A4、比較例A以及控制例A之PC-12細胞所在的孔中的水溶液，並以磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)清洗孔中的PC-12細胞。最後，以海馬生物能量測定儀檢測實施例A1至實施例A4、比較例A以及控制例A之PC-12細胞的氧氣消耗量，並進行計算得到PC-12細胞中的粒線體活性。

海馬生物能量測定儀的測量原理與流程如下。首先，將孔中的培養基更換成分析用培養基。接著，偵測孔中細胞的基礎耗氧量。接著，加入三磷酸線苷合成酶抑制劑以抑制粒線體產生三磷酸線苷，此時減少的耗氧量即為合成三磷酸線苷的耗氧量。三磷酸線苷合成酶抑制劑例如為寡黴素(Oligomycin)。接著，加入適當濃度的抗耦合劑，在不破壞粒線體內膜的電子傳遞鏈的情況下，讓粒線體以極限狀況空轉以評估粒線體之最大耗氧能力。抗耦合劑例如為Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone(FCCP)。最後，加入電子傳遞鏈抑制劑已完全關閉粒線體的耗氧量，藉此確認量測的背景值，亦即非粒線體耗氧量(Non-mitochondrial Respiration)。電子傳遞鏈抑制劑例如為魚藤酮(Rotenone)與抗黴素A(Antimycin A)之組合。

粒線體之基礎耗氧量等於細胞之基礎耗氧量減去非粒線體耗氧量。粒線體的基礎耗氧量減去合成三磷酸線苷消耗的氧氣量等於克服氫離子洩漏(Proton Leakage)的耗氧量。粒線體之最大耗氧能力減去粒線體之基礎耗氧量等於粒線體之預存耗氧能力。粒線體之三磷酸線苷媒合效率等於合成三磷酸線苷的耗氧量除以粒線體之基礎耗氧量。

PC-12細胞中的粒線體活性的檢測結果請參照圖2至圖9以及表一。圖2為實施例、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞的海馬生物能量測定儀量測結果示意圖。

如圖2中第0分鐘至第30分鐘之區段所示，以靈芝萃取物水溶液處理的細胞中的粒線體，在氧化壓力下仍可維持較高的合成三磷酸線苷的耗氧量。如圖2中第60分鐘至第80分鐘之區段所示，以靈芝萃取物水溶液處理的細胞中的粒線體，在氧化壓力下具有明顯高的最大耗氧能力。

圖3為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞中粒線體之預存耗氧能力示意圖。圖4為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之人類纖維母細胞中粒線體之基礎耗氧量示意圖。圖5為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之人類纖維母細胞中粒線體之最大耗氧能力示意圖。圖6為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之人類纖維母細胞中粒線體之合成三磷酸線苷的耗氧量示意圖。圖7為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之人類纖維母細胞中粒線體之三磷酸線苷媒合效率示意圖。圖8為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之正常人類纖維母細胞中粒線體之克服氫離子洩漏的耗氧量示意圖。圖9為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之正常人類纖維母細胞中非粒線體之耗氧量示意圖。表一為實施例A2至A4、比較例A與控制例A的包含靈芝萃取物之組合物的濃度與實驗量測結果。

如圖2與圖3所示，實施例A2至實施例A4與比較例A之基礎耗氧量無明顯差異。如圖2與圖4所示，實施例A2至實施例A4之合成三磷酸線苷的耗氧量高於比較例A之合成三磷酸線苷的耗氧量。如圖2與圖5所示，實施例A2之克服氫離子洩漏的耗氧量低於比較例A之克服氫離子洩漏的耗氧量，實施例A3與實施例A4之克服氫離子洩漏的耗氧量明顯低於比較例A之克服氫離子洩漏的耗氧量(p<0.05)。如圖2與圖6所示，實施例A2與實施例A3之最大耗氧能力高於比較例A之最大耗氧能力，實施例A4之最大耗氧能力明顯高於比較例A之最大耗氧能力(p<0.05)。如圖2與圖7所示，實施例A2與實施例A3之預存耗氧能力高於比較例A之預存耗氧能力，且實施例A4之預存耗氧能力明顯高於比較例A之預存耗氧能力(p<0.05)。如圖2與圖8所示，實施例A2與實施例A3之三磷酸線苷媒合效率高於比較例A之三磷酸線苷媒合效率，實施例A4之三磷酸線苷媒合效率明顯高於比較例A之三磷酸線苷媒合效率(p<0.05)。如圖2與圖9所示，實施例A2至實施例A4之非粒線體耗氧量高於比較例A之非粒線體耗氧量。

接著，將表一中的數值帶入下述公式，計算得到實施例A2至實施例A4、比較例A與控制例A之生物能量健康指數(Bioenergetic Healthy Index，BHI)值。

BHI=[合成三磷酸線苷的耗氧量×預存耗氧能力]/[克服氫離子洩漏的耗氧量×非粒線體耗氧量]

由上述公式計算可知，實施例A2之BHI值為1.05，實施例A3之BHI值為1.07，實施例A4之BHI值為1.15，比較例A之BHI值為0.92。

圖10為實施例A2至A4、比較例A與控制例A之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞的生物能量健康指數示意圖。由圖10可知，實施例A2與實施例A3之生物能量健康指數高於比較例A之生物能量健康指數，且實施例A4之生物能量健康指數明顯高於比較例A之生物能量健康指數(p<0.05)。

根據上述實驗測試結果可知，以靈芝萃取物水溶液處理後的細胞相較無未經靈芝萃取物水溶液處理的細胞，儘管處在氧化壓力之下，粒線體之最大耗氧能力、預存耗氧能力以及媒和效率得到提升，使得粒線體遇到變化或壓力時可自我調整能量的供給量，進而使得承受變化或壓力的彈性提高。

接下來，說明細胞分化實驗之操作方式與實驗結果。

首先說明神經分化實驗中使用的實施例B、比較例B與控制例B之PC-12細胞的處理方式。實施例B之PC-12細胞於24孔孔盤中培養24小時後，將含有體積百分濃度1%的馬血清以及體積百分濃度0.5%的胎牛血清的RPMI 1640培養基更換為未含血清的RPMI 1640培養基，並繼續培養24小時。接著，再將未含血清的RPMI 1640培養基更換為含有體積百分濃度1%的馬血清、體積百分濃度0.5%的胎牛血清以及濃度為每毫升100奈克(ng/ml)的神經生長因子(Nerve Growth Factor，NGF)的RPMI 1640培養基，並加入濃度100mg/ml的靈芝萃取物水溶液1.5微升(μl)繼續培養48小時(培養基中的靈芝萃取物濃度為20μg/ml)。接著，更新孔中的含有體積百分濃度1%的馬血清、體積百分濃度0.5%的胎牛血清以及濃度為每毫升100奈克(ng/ml)的神經生長因子(Nerve Growth Factor，NGF)的RPMI 1640培養基，並重新加入濃度100mg/ml的靈芝萃取物水溶液1.5微升繼續培養36小時(培養基中的靈芝萃取物濃度為20μg/ml)。接著，量測孔中的乙醯膽鹼酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)含量。

比較例B之PC-12細胞的處理方式相似於實施例B之PC-12細胞，其差異在於比較例B之PC-12細胞係未使用靈芝萃取物水溶液進行處理的PC-12細胞。控制例B之PC-12細胞的處理方式相似於實施例B之PC-12細胞，其差異在於控制例B之PC-12細胞係未使用神經生長因子與靈芝萃取物水溶液進行處理的PC-12細胞。

乙醯膽鹼酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)含量的檢測結果請參照圖11。圖11為以靈芝萃取物處理後之大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞的分化指標示意圖。在圖11中係以純乙醯膽鹼酯酶的濃度做為檢測的基準值。乙醯膽鹼酯酶主要存在於神經細胞的突觸，因此乙醯膽鹼酯酶的含量可做為神經細胞分化程度的指標。如圖11所示，實施例B之PC-12細胞產生的乙醯膽鹼酯酶的濃度明顯高於比較例B之PC-12細胞產生的乙醯膽鹼酯酶的濃度(p<0.05)，實施例B之PC-12細胞產生的乙醯膽鹼酯酶的濃度亦明顯高於控制例B之PC-12細胞產生的乙醯膽鹼酯酶的濃度(p<0.001)。

圖12至圖14為大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞以不同處理方式處理後的電子顯微鏡照片。如圖12所示，控制例B之PC-12細胞上未見到向外延伸的神經突觸。如圖13所示，比較例B之PC-12細胞上可見到略微向外延伸的神經突觸。如圖14所示，實施例B之PC-12細胞上可見到明顯向外延伸的神經突觸，且神經突觸延伸的長度可達PC-12細胞尺寸的數倍。

由上述細胞分化實驗的結果可知，靈芝萃取物可確保細胞得到充足的能量供給，以便細胞進行分化。此外，由前述實驗結果可知，靈芝萃取物具有確保細胞得到充足能量供給，以便細胞分化為神經細胞的功效。因此，靈芝萃取物亦具有用於治療退化性腦或神經疾病，或是減緩退化性腦或神經疾病惡化的用途。

再者，將靈芝萃取物供予細胞可降低細胞中的自由基生成量，藉以保護粒線體的內膜不受自由基的破壞，進而延緩粒線體發生崩解的時間。如此一來，將靈芝萃取物供予細胞，可減緩細胞內的粒線體崩解而觸發細胞凋亡的速度。

雖然本發明以前述之實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明。在不脫離本發明之精神和範圍內，所為之更動與潤飾，均屬本發明之專利保護範圍。關於本發明所界定之保護範圍請參考所附之申請專利範圍。

Claims

一種靈芝萃取物用於製備在壓力環境下提高生物能量健康指數與促進細胞進行分化之組合物的用途，其中該靈芝萃取物中包含重量比1：2.5至1：3的三萜類及靈芝多醣。
一種靈芝萃取物用於製備在壓力環境下提高生物能量健康指數之組合物的用途，其中該靈芝萃取物中包含重量比1：2.5至1：3的三萜類及靈芝多醣。
如請求項1或請求項2所述之用途，其中該靈芝萃取物中包含重量百分比0.18%的三萜類及重量百分比0.5%的靈芝多醣。
如請求項1所述之用途，其中該些細胞為神經細胞，該靈芝萃取物促進神經細胞的突觸成長。
如請求項1或請求項2所述之用途，其中該靈芝萃取物的濃度為每毫升100至300微克(μg/ml)。
如請求項1或請求項2所述之用途，其中該靈芝萃取物的有效劑量為1.081至3.244克(g)。
如請求項1所述之用途，其中，在該壓力環境下，該靈芝萃取物更具有降低該些細胞中的複數個粒線體的氫離子洩漏(Proton Leakage)的用途。
如請求項1所述之用途，其中，在該壓力環境下，該靈芝萃取物更具有提升該些細胞中的複數個粒線體的最大耗氧能力(Maximal Respiration)的用途。
如請求項1所述之用途，其中，在該壓力環境下，該靈芝萃取物更具有提升該些細胞中的複數個粒線體的預存耗氧能力(Spare Respiratory Capacity)的用途。
如請求項1所述之用途，其中，在該壓力環境下，該靈芝萃取物更具有提升該些細胞中的複數個粒線體的三磷酸線苷媒合效率(Coupling Efficiency)的用途。
如請求項1所述之用途，其中，在該壓力環境下，該靈芝萃取物更具有提升該些細胞中的複數個粒線體合成三磷酸線苷(ATP Production)的耗氧率的用途。
如請求項1或請求項2所述之用途，其中該組合物更包含藥學上或藥劑上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或輔劑。