TWI726009B

TWI726009B - 用親和純化法分析生物樣品中源自腫瘤之無細胞核小體、分離生物樣品中純化之腫瘤dna、檢測生物樣品中源自腫瘤之核小體表觀遺傳表位或在動物或人類受試者中檢測癌症之方法或包括組蛋白h1結合劑之套組之用途

Info

Publication number: TWI726009B
Application number: TW105139037A
Authority: TW
Inventors: 雅各文森米考夫; 馬克愛德華愛寇斯頓
Original assignee: 比利時商比利時意志有限公司
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2016-11-28
Publication date: 2021-05-01
Also published as: TW201819922A

Abstract

本發明係關於一種組蛋白H1結合劑用於從生物樣品檢測、分離及/或純化源自腫瘤之無細胞核小體之用途。本發明還敘明了使用組蛋白H1結合劑進行陰性或陽性選擇方法，以增添源自腫瘤之無細胞核小體之樣品。

Description

用親和純化法分析生物樣品中源自腫瘤之無細胞核小體、分離生物樣品中純化之腫瘤DNA、檢測生物樣品中源自腫瘤之核小體表觀遺傳表位或在動物或人類受試者中檢測癌症之方法或包括組蛋白H1結合劑之套組之用途

本發明係關於一種純化或增加源自腫瘤之無細胞核小體以及血液、血清、血漿之相關腫瘤DNA之方法。

當細胞DNA以蛋白質-核酸複合物型式存在時稱為染色質。核小體是染色質結構的基本單元，由圍繞蛋白質複合物纏繞的雙股DNA(dsDNA)組成。此種DNA纏繞成連續核小體之結構通常稱為「繩珠」(beads on a string)，並且形成開放或為真染色質(euchromatin)之基本結構。在緊密或異染色質中，該繩珠為螺旋或超螺旋形成封閉且複雜的結構。

染色質中各核小體是由8個高保守性的核心組蛋白(包含組蛋白H2A、H2B、H3和H4各一對)組成的蛋白質複合物。大約146個鹼基對(bp)的DNA圍繞該蛋白質複合物。位在核小體核心組蛋白外的另外一個組蛋白H1或H5，負責連接且參與了染色質壓縮。無細胞核小體主要包含單核小體和因為細胞死亡時分解染色質產生染色質片段的相關DNA。

成人的正常細胞更新包括每天細胞分裂產生約10¹¹個細胞，並且主要經由細胞凋亡具有相近之細胞死亡數量。在細胞凋亡過程中，染色質被分解成單核小體和寡核體(oligonucleosomes)，其中一些可以在血液循環中發現。在正常情況下，在健康受試者中發現的循環核小體的數量不多。在具有不同病症(包括許多癌症、自體免疫疾病、發炎情況、中風和心肌梗塞)的受試者們中發現循環核小體數量升高(Holdenreider & Stieber，2009)。來自死細胞的核小體也可能流至其他體液，例如尿、糞便或痰中。

DNA異常是所有癌症的特徵。癌細胞的DNA在許多方面不同於健康細胞的DNA，包括但不限於點突變(point mutations)、易位(translocations)、基因複製數(gene copy number)和微衛星異常(micro-satellite abnormalities)、DNA鏈完整性(DNA strand integrity)和核苷酸修飾(例如胞嘧啶5號碳位置的甲基化)。用於臨床診斷、預後和治療選擇目的的切片檢查或手術中移除的癌細胞或組織中，針對腫瘤相關的DNA結構或序列改變進行例行之研究。腫瘤遺傳和表觀遺傳特徵在不同類型腫瘤之間和具有相同腫瘤疾病的不同患者間均不同。此外，這些特徵隨著疾病的進展和對藥物或其他療法的後天抗性的發展，在同一患者的同一癌症內隨著時間而變化。因此，對於在手術或切片檢查中移除的細胞中腫瘤DNA的連續的研究可以幫助臨床醫師在早期(可能比放射性檢測早幾個月)監測疾病進展並檢測任何復發或後天抗性，以及可能使治療療程有成功的功效。

然而，組織DNA測試具有局限性，這是因為不能因監測目的而重複執行侵入性的切片檢查。對於一些患者而言，可能根本不使用切片檢查。切片檢查執行昂貴、造成患者不適、以及造成患者風險，並且可能導致手術併發症。此外，患者的腫瘤可由位在相同腫瘤中的不同區域或在不同轉移位置(在轉移癌中)的多個腫瘤株組成，並非所有腫瘤株都可在切片檢查中取樣。故，組織切片檢查DNA研究提供在特定時間，位在腫瘤的不同區域內的不同腫瘤株中時間和空間上的腫瘤快照。

癌症患者的血液含有循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，其被認為係源自正在死亡或死亡的癌細胞釋放到循環中的染色質片段或核小體。針對來自癌症患者的血液和組織樣品的研究顯示，和癌症相關的突變出現在患者腫瘤中(但不在其健康細胞中)，其突變也出現在取自同一個患者的血液樣品裡的ctDNA中(Newman et al,2014)。同樣地，癌細胞中差異性甲基化(胞嘧啶殘基甲基化造成的表觀遺傳的改變)的DNA序列可在血液循環中的ctDNA中作為甲基化序列被測得。此外，由ctDNA組成的無細胞循環DNA(cell-free circulating DNA，cfDNA)的比例與腫瘤負荷相關，因此可藉由ctDNA出現比例的定量以及其遺傳及/或表觀遺傳組成的定性來監控疾病進展。ctDNA的分析可產生非常有用且臨床上準確的數據，其數據係關於源自腫瘤內全部或許多不同的細胞，因此在空間上整合腫瘤株。此外，隨著時間的重複取樣是一個更加實用和經濟的選擇。ctDNA的分析具有在腫瘤的檢測和監控方面革命性改變的潛力，以及藉由腫瘤DNA的研究而無侵入性組織切片檢查程序，對於有關腫瘤的復發和後天抗藥性的腫瘤治療具有潛力。此類ctDNA測試可以用於研究所有類型的癌症相關DNA異常(例如：點突變、核苷酸修飾狀態、易位、基因複製數和微衛星異常和DNA鏈完整性)，並且將適用於例行性癌症篩檢、常規地以及更頻繁地監控和最佳治療方案的定期檢查(Zhou et al,2012)。

血液、血漿或血清可用作為ctDNA測定的物質，並且可使用任何DNA分析方法，包括但不限於：DNA定序，表觀遺傳DNA定序分析(例如用於含有5-甲基胞嘧啶之序列)，PCR，珠乳擴磁技術(BEAMing)，NGS(次世代定序技術)(靶向或全基因組)，數位PCR(digital PCR)，冷PCR(cold PCR)(在較低變性溫度下進行共擴增PCR)，MAP(MIDI-活化焦磷酸解)，個人化重組分析(personalized analysis of rearranged ends，PARE)和質譜分析。

因為DNA異常是所有癌症疾病的特徵，並且在研究中，所有的癌症疾病中觀察得到ctDNA，因此ctDNA檢測適用於所有癌症疾病。所研究的癌症包括但不限於膀胱癌(bladder cancer)、乳癌(breast cancer)、大腸直腸癌(colorectal cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、肺癌(lung cancer)、皮膚癌(skin cancer)(例如黑色素瘤)、胰臟癌(pancreatic cancer)、肝癌(liver cancer)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、腸癌(bowel cancer)、淋巴瘤(lymphoma)、口腔癌(oral cancer)、白血病(leukaemia)頭頸癌(head and neck cancer)、和骨肉瘤(osteosarcoma)(Crowley et al,2013；Zhou et al,2012；Jung et al,2010)。將藉由敘述三種(不限於此三種)實例來說明ctDNA檢測的性質。

第一個實例涉及ctDNA中癌症相關基因序列突變的檢測。涉及檢測ctDNA的單基因突變的血液檢查通常具有低的臨床敏感度。這有兩個原因。首先，雖然所有癌症都具有突變，但是特定癌症疾病中任何特定突變的頻率通常較低。例如，雖然K-RAS和p53突變被認為是較常發生的癌症突變中的其中兩種，並且已經癌症中被廣泛研究，包括膀胱癌、乳癌、結腸癌、肺癌、肝癌、胰臟癌、子宮內膜癌和卵巢癌，在23%-64%和17%-54%的癌組織樣品中分別檢測到兩者。其次，即使患者的癌症組織有突變，患者血液中存在的突變ctDNA的水平或濃度可能為低並且難以檢測。例如，K-RAS和p53突變可以在0%-75%的K-RAS和p53組織陽性患者的ctDNA中檢測到。這兩種效應的總和即是在少於40%的癌症患者的血液中檢測到K-RAS或p53突變(Jung et al,2010)。

第二個實例涉及ctDNA中多個癌症相關基因序列突變的檢測。雖然任何特定基因的突變，例如K-RAS或p53，可以存在於少數癌症中，但是所有癌症都含有突變，因此原則上需要足夠的突變研究，以便於檢測大多數或者甚至是全部的腫瘤。因此，增加這些檢測的臨床敏感度的一種方法是檢測許多基因中的廣泛範圍的突變。Newman等人採用這種方法檢測非小細胞肺癌(NSCLC)，並從139個復發性突變基因中研究了521個外顯子和13個內含子序列。所研究的突變包括多種類型的癌症相關遺傳改變，包括單核苷酸變異(SNV)和融合基因，以及報導藉由此方法在ctDNA血液檢測中檢測超過95%的II-IV期腫瘤和50%的I期腫瘤具有96%的特異性(Newman et al,2014)。

第三個實例涉及ctDNA中特定基因序列的癌症相關表觀遺傳改變的檢測。這種方法可以應用於任何DNA或核苷酸修飾。該方法的主要實例是檢測在某些癌症中，在胞嘧啶殘基處差異性甲基化的基因。為了此目的，在多種癌症中大量的基因已被研究，其中幾個是在膀胱癌、乳癌、大腸直腸癌、黑素瘤、卵巢癌和前列腺癌中研究SEPTIN-9、APC、DAPK、GSTP1、MGMT、p16、RASSF1A、T1G1、BRCA1、ERα、PRB、TMS1、MLH1、HLTF、CDKN2A、 SOCS1、SOCS2、PAX5、PGR、PTGS2和RARβ2。該方法的一個說明性的實例是檢測ctDNA中的甲基化SEPTIN-9以檢測大腸直腸癌(CRC)，據報導其檢測68%的CRC病例具有89%的臨床特異性(Grutzmann et al,2008)。

腫瘤衍生的cfDNA之ctDNA片段以長度小於200bp的小DNA片段循環，與DNA片段以單核小體形式循環的預期一致(Newman et al,2014)。癌症患者據報具有比健康受試者更高的cfDNA水平。該領域的工作者指出健康受試者的cfDNA範圍落在0-100ng/ml(平均為30ng/ml)，而癌症受試者的cfDNA範圍落在0-1000ng/ml(平均為180ng/ml)(Schwarzenbach et al,2011)。循環cfDNA由不同長度的鹼基對組成不同大小的DNA分子所組成，其長度可達20,000個鹼基對(Zhou et al,2012)。與ctDNA主要以單核小體循環的假設一致，在癌症患者中循環無細胞核小體的檢測量，如同DNA量，比在健康受試者中高(Holdenrieder et al,2001)。然而，由於核小體為細胞死亡的非特異性產物，而且可在許多病症中，例如急性創傷，可觀察到核小體量增加，所以循環核小體量之增加本身並不作為臨床上癌症的生物標記(Holdenrieder and Stieber,2009)。作為細胞死亡的產物，在用細胞毒性藥物或放射療法治療時，循環核小體量顯著提高。然而，核小體也會從循環中被清除，因此其水平可能隨著治療而到尖峰，然後下降(Holdenrieder et al,2001)。

儘管循環無細胞核小體之量在臨床上尚未用作於癌症中基於血液的生物標記，但是循環無細胞小體的表觀遺傳組成，就組蛋白修飾(histone modification)、組蛋白變異體(histone variant)、DNA修飾(DNA modification)以及加合物含量(adduct content)等方面作為血液中癌症生物標記而進行研究(WO 2005/019826；WO 2013/030577；WO 2013/030579；WO 2013/084002)。

cfDNA的生物來源並無清楚地被了解。染色質斷裂以產生單核小體和寡核體是凋亡性細胞死亡的特徵。壞死細胞被認為產生長度為數千個鹼基對的較大DNA分子，但在壞死的一些情況下也可能發生DNA斷裂。此外，常見的DNA重複序列(例如ALU或LINE1序列)可作為200-400個鹼基對DNA片段，在進行非凋亡性或壞死性細胞死亡時被釋出(Schwarzenbach et al,2011)。DNA片段也可作為細胞間通訊的形式由細胞分泌。ctDNA的來源被認為與癌細胞的死亡有關。DNA片段可作為核小體從壞死及/或凋亡腫瘤細胞釋放。然而，壞死和凋亡細胞通常被巨噬細胞或其它清掃細胞吞噬，並且DNA可從吞噬壞死或凋亡細胞的巨噬細胞中釋出(Schwarzenbach et al,2011)。

有許多方法可用於從血液、血清或血漿中萃取cfDNA，並且已經就這些萃取的DNA的產量和萃取不同長度的DNA片段的效率進行比較。苯酚-氯仿和碘化鈉萃取方法提供最高的產量，並萃取長度小於200bp的小DNA片段。據報導其他經過測試的方法(包括市售方法)具有較低的DNA萃取產量，並且不能萃取長度小於200bp的小DNA片段(Fong et al,2009)。

用於分析ctDNA而從血液、血清或血漿進行cfDNA的萃取通常使用市售的DNA萃取產物進行。這些萃取方法具有循環DNA的高回收率(>50%)，另有其他產品(例如，Qiagen生產的QIAamp循環核酸試劑組)萃取短DNA片段。使用的樣品體積通常在1-5mL範圍內的血清或血漿。

由於一些限制，目前並沒有使用基於ctDNA檢測用於臨床腫瘤學之慣例。主要的方法上的限制是對高品質DNA的需求。由於樣品的性質，目前的ctDNA取樣方法產生劣質ctDNA樣品。其中主要的困難在於在循環中存在大量的非腫瘤cfDNA，令對於ctDNA的任何分析更加複雜。來自不同工作者的預估值不同，但是循環中存在的ctDNA片段可能太低而不能檢測或有多於50%的cfDNA。然而，對於大多數癌症患者而言，ctDNA片段是cfDNA的一小部分。例如，最近的研究報導指出，在治療前的肺癌患者中，ctDNA片段隨腫瘤大小而增加。在具有大的腫瘤負荷的患者中發現的最高量為3.2%，但是發現大多數患者具有低於0.1%的ctDNA片段(Newman et al,2014)。這意指對於許多患者樣品，必須在存在高量的非腫瘤來源的DNA的情況下分析非常低量的ctDNA。除此之外，該DNA來自相同的受試者，因此具有相似的序列，而且將干擾任何用於定量或分析ctDNA的方法。

類似的問題發生在測量循環無細胞核小體及/或循環核小體的表觀遺傳組成作為癌症的生物標記，因為核小體本身是細胞死亡的非特異性指示物，並且作為正常細胞更新過程的一部分釋放，以及和細胞死亡水平上升有關的病症相關，例如自體免疫疾病、中風、敗血症、創傷後、燒傷、心肌梗塞、腦中風、器官移植後的移植物排斥期間以及劇烈運動後。因此，源自腫瘤的核小體與源自各種細胞和組織的其他非腫瘤核小體一起循環。這些非腫瘤核小體將干擾任何源自腫瘤的核小體的定量或表觀遺傳分析方法。類似的效果可能發生在其他體液中。例如，糞便可能含有源自大腸直腸癌細胞的核小體和相關DNA，以及源自健康大腸或直腸細胞的核小體。痰可能含有源自肺癌細胞的核小體和相關DNA，以及源自健康肺細胞的核小體。類似的效果會發生在其他體液中。

因此，非常需要一種增添血液、血清或血漿樣品和其他體液樣品中源自腫瘤的核小體和DNA的方法。類似地，需要一種對於循環無細胞核小體的分析方法，用以區分源自腫瘤及非源自腫瘤的核小體以改良對癌症疾病狀態的檢測。

根據本發明的第一技術方案，提供了藉由親和純化法分析生物樣品中源自腫瘤的無細胞核小體的方法，所述方法包括以下步驟：(i)使樣品和組蛋白H1結合劑接觸；(ii)將核小體自未與組蛋白H1結合劑結合之樣品中分離；(iii)透過免疫分析或質譜分析方法分析該分離之核小體。

根據本發明的另一技術方案，提供了從生物樣品中分離純化的腫瘤DNA的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)使樣品和組蛋白H1結合劑接觸；(ii)分離未與組蛋白H1結合劑結合之核小體；(iii)從步驟(ii)所分離之核小體中萃取DNA；以及(iv)分析該萃取之DNA。

根據本發明的另一技術方案，提供了用於檢測生物樣品中源自腫瘤之核小體表觀遺傳表位之免疫分析方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)使樣品和包含組蛋白H1結合劑之第一結合劑接觸；(ii)分離未與第一結合劑結合之核小體；(iii)使該些核小體和第二結合劑接觸以與表位(epitope)結合；(iv)檢測及/或定量所述第二結合劑和所述之表位之結合；以及(v)使用這種結合的存在或程度作為樣品中腫瘤衍生之核小體之特定表位之存在之測量。

根據本發明的另一技術方案，提供了用於檢測動物或人受試者中的癌症的方法，其包括以下步驟：(i)從受試者取得生物樣品；(ii)經由使用兩種結合劑之免疫分析方法，分析樣品中含有表觀遺傳特徵並且含有組蛋白H1之無細胞核小體，其中一種結合劑用於結合特定的表觀遺傳特徵，另一種結合劑用於組蛋白H1；(iii)經由使用兩種結合劑之免疫分析方法，分析樣品中含有特定表觀遺傳特徵之無細胞核小體，該無細胞核小體為具有組蛋白H1和不具有組蛋白H1之核小體，其中一種結合劑結合表觀遺傳特徵，另一種結合劑結合共同核心核小體表位，其包括組蛋白H2、H3或H4表位中任何表位、任何DNA表位或存在於染色質片段中除了組蛋白H1表位之外之任何其它表位；(iv)使用前述步驟中獲得之免疫分析結果作為受試者中所述癌症之組合生物標記。

根據本發明的另一技術方案，提供了組蛋白H1結合劑用於檢測、分離及/或純化生物樣品中腫瘤之無細胞核小體之用途。

根據本發明的另一技術方案，提供了包含本文所述方法中之組蛋白H1結合劑之套組之用途。

圖1：OD比值(OD2：OD1)係指在69個人類受試者中[腫瘤衍生與非腫瘤衍生之核小體]：[主要為非腫瘤衍生之核小體]的相對比例。

就其表觀遺傳信號的組成，在癌細胞的核小體的結構可能與在健康細胞不同。利用針對結合表觀遺傳信號(其在癌細胞中比健康細胞更常見，或反之亦然)的抗體或其他結合劑，可從受試者中採集的含有無細胞核小體之源自細胞的混合物的生物樣品中，分離源自腫瘤的無細胞核小體(即藉由正或負選擇)。

核小體的核心由8個組蛋白蛋白質組成，包含H2A、H2B、H3和H4組蛋白各一對。組蛋白H1(H1)不是核心組蛋白，而是位於核心的外部並作為連接體。特別是H1涉及將「繩珠」子結構壓縮成高級結構。不受理論的束縛，本發明人已經確認源自腫瘤的無細胞核小體比源自健康細胞的核小體含有更少的組蛋白H1。源自腫瘤的核小體因此更可能僅由8個核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4(加上DNA和任何加合的分子)組成。因此可認為血液中源自腫瘤或非源自腫瘤的循環無細胞核小體在性質上不同，因為大多數源自腫瘤的核小體包含8個組蛋白以及相關DNA片段的核心核小體結構，而大多數源自非腫瘤的核小體包含相似的核心核小體結構再加上另外的組蛋白H1蛋白質部分和相關的DNA片段。該性質差異可作為用來增添從受試者或者病患採集的體液樣品的源自腫瘤的無細胞核小體的負選擇方法的基礎。

我們先前報導了用於血液和其他體液中的無細胞核小體的表觀遺傳分析方法(WO2013/030577、WO2013/030578、WO2013/030579、 WO2013/084002)。如上所述，源自腫瘤的無細胞核小體被釋放到具有腫瘤的受試者的循環中，但是由於正常細胞更新，他們被已存在於循環中的無細胞核小體稀釋。任何這樣的非源自腫瘤的核小體將干擾腫瘤核小體的遺傳或表觀遺傳分析。從體液樣品中除去非源自腫瘤的無細胞核小體將致更高純度的源自腫瘤無細胞核小體，從而改善樣品中腫瘤核小體或染色質片段的遺傳或表觀遺傳分析的結果。

在本發明較佳的技術方案，純化源自疾病的循環無細胞核小體並藉由免疫分析或質譜分析方法分析其表觀遺傳特徵。在此技術方案中，血液、血清、血漿或其他體液樣品係採自受試者，並且藉由除去含有組蛋白H1組成物的無細胞核小體，增添樣品中源自疾病的無細胞核小體。使用免疫分析或質譜分光光度法(mass spectrophotometric)分析剩餘的無細胞核小體的表觀遺傳特徵，該表觀遺傳特徵指示疾病。可被分析的表觀遺傳核小體特徵包括任何或所有的：特定組蛋白轉譯後修飾作用(post-translational modifications)、特定組蛋白同功異構物(isoforms)、特定核苷酸或修飾核苷酸(例如甲基化(methylated)、羥基甲基化(hydroxyl-methylated)或其他核苷酸修飾)。免疫分析和質譜分析的優點包括低成本，高分析靈敏度和特異性和高產量。

在一實施例中，提供了一種分離方法，其藉由生物樣品中源自疾病的無細胞核小體的親和純化法和表觀遺傳分析，所述方法包括以下步驟：(i)使樣品和組蛋白H1結合劑接觸；(ii)將未與組蛋白H1結合劑結合之核小體(即未結合的核小體)從樣品中分離；以及 (iii)藉由使用結合至修飾核苷酸之抗體或其他結合劑的免疫分析方法，分析具有修飾核苷酸的分離的核小體。

在另一實施例中，提供了一種分離方法，其藉由生物樣品中源自疾病的無細胞核小體的親和純化法和表觀遺傳分析，所述方法包括以下步驟：(i)使樣品和組蛋白H1結合劑接觸；(ii)將未與組蛋白H1結合劑結合之核小體(即未結合的核小體)從樣品中分離；以及(iii)藉由使用結合至轉譯後修飾組蛋白(post translationally modified histone)之抗體或其他結合劑的免疫分析方法，分析分離之具有轉譯後修飾組蛋白的核小體。

在另一實施例中，提供了一種分離方法，其藉由生物樣品中源自疾病的無細胞核小體的親和純化法和表觀遺傳分析，所述方法包括以下步驟：(i)使樣品和組蛋白H1結合劑接觸；(ii)將未與組蛋白H1結合劑結合之核小體(即未結合的核小體)從樣品中分離；以及(iii)藉由使用結合至組蛋白同功異構物(histone isoform)之抗體或其他結合劑的免疫分析方法，分析分離之具有組蛋白同功異構物的核小體。

在另一實施例中，提供了一種分離方法，其藉由生物樣品中源自疾病的無細胞核小體的親和純化法和表觀遺傳分析，所述方法包括以下步驟：(i)使樣品和組蛋白H1結合劑接觸；(ii)將未與組蛋白H1結合劑結合之核小體(即未結合的核小體)從樣品中分離；以及 (iii)藉由使用結合至非組蛋白之蛋白之抗體或其他結合劑的免疫分析方法，分析分離之結合加合非組蛋白之蛋白的核小體。

在另一實施例中，提供了一種分離方法，其藉由從患者採集的生物樣品中源自疾病的無細胞核小體的親和純化法和檢測，所述方法包括以下步驟：(i)使樣品和組蛋白H1結合劑接觸；(ii)將未與組蛋白H1結合劑結合之核小體(即未結合的核小體)從樣品中分離；(iii)藉由免疫分析定量該分離核小體；以及(iv)藉由不包括組蛋白H1部分的無細胞核小體的存在或量，作為受試者的疾病狀態的指標。

在本發明的較佳分析方案，在(i)含有組蛋白H1的核小體和(ii)具有和不具有組蛋白H1的所有核小體中，分析或測量樣品中存在的循環無細胞核小體的表觀遺傳特徵。測量含有組蛋白H1的核小體(即主要是非腫瘤核小體)的表觀遺傳特徵可藉由本領域已知的方法進行，包括但不限於，質譜分析或藉由使用兩種抗體(或其他結合劑)的免疫分析，其中一種抗體與感興趣的表觀遺傳特徵結合，另一種抗體與組蛋白H1結合。較佳地，使用本文所述的親和純化方法去除H1相關核小體進行增添後，再進行不含有組蛋白H1的核小體(即主要是腫瘤核小體)的表觀遺傳特徵的直接定量。然而，可以藉由質譜分析或藉由使用兩種抗體(或其他結合劑)的免疫分析來分析或測量具有和不具有組蛋白H1的(所有)循環無細胞核小體(即腫瘤和非腫瘤核小體)，其中一種抗體結合感興趣的表觀遺傳特徵，另一種抗體結合包括任何組蛋白H2、H3或H4表位、任何DNA表位或任何存在於染色質片段中除了組蛋白H1表位之外的共同核心核小體表位。在本發明此技術方案，可以測量含有表觀遺傳特徵和結合組蛋白H1的循環無細胞核小體(即非腫瘤核小體)，以及所有含有表觀遺傳特徵的循環無細胞核小體，包括具有和不具有H1組蛋白的核小體(即腫瘤和非腫瘤核小體)。此二分析或測量方法可合併用於樣品中循環無細胞核小體之量或比例之指標，其具有特定與組蛋白H1無關之表觀遺傳特徵。前述核小體之量或比例係源自於腫瘤。例如，可以使用兩個測量之間的差異，或者可以使用兩個測量的比例。

在本發明技術方案的一個較佳實施例中，提供了用於測量取自腫瘤來源的受試者的生物樣品中含有表觀遺傳表位的循環無細胞核小體的比例的方法，所述方法包括以下步驟：(i)從受試者取得體液樣品，(ii)進行第一免疫分析，其包括以下步驟：(1A)使所述樣品與結合所述表觀遺傳表位的第一結合劑接觸；(1B)使核小體或樣品與結合組蛋白H1的第二結合劑接觸；以及(1C)檢測或定量所述第二結合劑與樣品中的核小體的結合；(iii)進行第二免疫分析，其包括以下步驟：(2A)使所述樣品與結合所述表觀遺傳表位的第一結合劑接觸；(2B)使核小體或樣品與結合非組蛋白H1核小體或染色質片段表位的第三結合劑接觸；以及(2C)檢測或定量所述第三結合劑與樣品中的核小體的結合；(iv)將步驟(1C)和(2C)的測量結合，作為樣品中具有所述表觀遺傳表位並且是源自腫瘤的無細胞核小體的量或比例的指標。

在本發明技術方案的另一個較佳實施例中，提供了用於測量取自腫瘤來源的受試者的生物樣品中含有表觀遺傳表位的循環無細胞核小體的比例的方法，所述方法包括以下步驟：(i)從受試者取得體液樣品，(ii)進行第一免疫分析，其包括以下步驟：(1A)使所述樣品與結合組蛋白H1的第一結合劑接觸；(1B)使核小體或樣品與結合所述表觀遺傳表位的第二結合劑接觸；以及(1C)檢測或定量所述第二結合劑與樣品中的核小體的結合；(iii)進行第二免疫分析，其包括以下步驟：(2A)使所述樣品與結合非組蛋白H1核小體或染色質片段表位的第一結合劑接觸；(2B)使核小體或樣品與結合所述表觀遺傳表位的第三結合劑接觸；以及(2C)檢測或定量所述第三結合劑與樣品中的核小體的結合；(iv)將步驟(1C)和(2C)的測量結合，作為樣品中具有所述表觀遺傳表位並且是源自腫瘤的無細胞核小體的量或比例的指標。

本領域具有通常知識者應當清楚，上述「第一」和「第二」免疫分析可以以任何順序或以並行或以多重形式進行。也應清楚的是，在兩個免疫分析中使用的第一和第二或第一和第三結合劑的排列不需如上所述對稱。

在較佳的實施例中，表觀遺傳表位或特徵選自(i)組蛋白H2、H3或H4的同功異構物(isoform)、(ii)存在於組蛋白H2、H3或H4中的轉譯後修飾、(iii)包括修飾核苷酸的核苷酸、(iv)結合或加合至無細胞染色質片段的非組蛋白之蛋白。在另一實施例中，表觀遺傳表位是核小體本身中存在的共同表位，並且兩種免疫分析提供了腫瘤核小體本身的存在的指標。

在本發明的該技術方案的一個較佳實施例中，源自疾病的含有特定表觀遺傳表位的無細胞核小體的量或比例，可以用作為受試者疾病存在的生物標記，或用於評估受試者疾病狀態或治療方案的適合性。

我們已經成功發展如上所述以及實施例15的分析程序，其中通過兩種免疫分析測量非組蛋白核小體加合物，並且得到比值：[含有非組蛋白的核小體本身]：[含有組蛋白H1和非組蛋白的核小體]。因此，得到的比值是[所有核小體-蛋白質加合物]：[非腫瘤核小體蛋白加合物]的指標。因此，對於受試者獲得的血液、血清或血漿樣品而言，樣品的比值越大，一些核小體源自腫瘤的可能性越大。在29名健康受試者中，發現的平均免疫分析輸出(光密度，Optical Density)比值為8.7。在診斷為大腸直腸癌的29名受試者中，平均比值為15.9。在11個診斷為胰臟癌的受試者中，平均比值為17.1。這顯示增加的比值確實與源自癌症的核小體相關。

此外，每個受試者的個體結果依據上升臨界量而作為癌症生物標記。臨界值為12時，該比值對73%(8/11)診斷患有胰臟癌的受試者和41%(12/29)診斷為大腸直腸癌的受試者給予陽性結果，臨床特異性為79%(29名健康受試者中有6個偽陽性結果)。臨界值為22時，該比值對36%(4/11)診斷患有胰臟癌的受試者和34%(10/29)診斷為大腸直腸癌的受試者給予了陽性結果，臨床特異性為93%(29個健康受試者中的2個偽陽性結果)。這些結果證明本文所述的比值可以用作為癌症疾病的生物標記。

應當理解的是，本文提及的「組蛋白H1結合劑」(例如在負選擇方法中)通常是指結合組蛋白H1蛋白質的結合劑，包含任何組蛋白H1變異體、同功異構物或其修飾。因此，在一實施例中，組蛋白H1結合劑選自：結合組蛋白H1蛋白質、變異體、同功異構物或其修飾的結合劑。

在上述實施例中，源自疾病的增添的無細胞核小體本身的存在或量，或含有修飾核苷酸、轉譯後組蛋白修飾、組蛋白同功異構物或核小體-蛋白加合物的源自疾病的增添的無細胞核小體的存在或量，可被用作為疾病狀態、疾病預後、疾病監測、治療監測或對特定治療的疾病易感性或其他臨床應用的指標。

我們先前報導了適用於本發明的核小體免疫分析方法，包括WO2005/019826、WO2013/030577、WO2013/030578、WO2013/030579、WO2013/084002中所述的方法。這些方法中的任何一種都可以用於本發明，並沒有限制。

除此之外，本發明人已經確定，當源自腫瘤的核小體與H1相關時，核小體相關的H1為更進一步修飾的目標及/或可包含不同於源自健康細胞的核小體中存在的H1變異體或H1同功異構物。

主要組蛋白H1變異體或同功異構物包括但不限於：在增殖和休眠的體細胞中表現的H1.0、H1.10和H1X，以及H1變異體H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5和H1.6，其在分裂細胞中以高水平表現。此外，有生殖細胞系特異性變異體(germ line specific variants)，包括主要在睾丸中表現的H1.8和主要在卵母細胞中表現的H1.7。染色質的組蛋白變異體組成物在癌細胞中被改變，並且據報導指出在常見的H1同功異構物中，組蛋白H1.0同功異構物的表現在癌細胞中被下調，而組蛋白同功異構物H1.1、H1.2、H1.3、H1.4和H1.5在癌細胞中以高水平表現(Scaffidi；2015)。

組蛋白H1可以在位於N-和C-末端以及蛋白質的球狀功能區塊(domain)內的胺基酸殘基處進行轉譯後修飾，這些修飾可能與癌症相關(Izzo and Schneider；2015)。應當理解的是，本文提及「組蛋白H1修飾」是指H1轉譯後修飾(post-translational modifications，PTM)，其可包括乙醯化(acetylation)、甲基化(methylation)，其可以是單-(mono-)、二-(di-)或三-(tri-)甲基化、磷酸化、泛素化、ADP核糖苷化(ADP ribosylation)、瓜氨酸化(citrullination)、羥基化(hydroxylation)，醣化(glycosylation)，亞硝基化(nitrosylation)，麩醯胺酸化(glutamination)及/或異構化(isomerisation)。具有修飾的組蛋白胺基酸殘基，其修飾可為組蛋白胺基酸序列內的任何Ser、Lys、Arg、His、Glu、Pro或Thr殘基。

例如，核心組蛋白序列中的離胺酸殘基可以是單-(mono-)、二-(di-)或三-(tri-)甲基化(methylated)，乙醯化(acetylated)或泛素化(ubiquitinated)的，核心組蛋白序列中的精胺酸(arginine)殘基可以是單甲基化(monomethylated)的、對稱或不對稱二甲基化的或轉化成瓜氨酸(citrulline)，核心組蛋白序列中的絲胺酸(serine)或蘇胺酸(threonine)殘基可被磷酸化及/或核心序列內的脯胺酸(proline)殘基可被異構化。

本領域具有通常知識者應當理解，用於描述特定組蛋白修飾的標記表示哪種組蛋白已被修飾、已經修飾的特定胺基酸和已經發生的修飾類型。例如，H1K64(Ac)表示組蛋白H1在離胺酸64位置的乙醯化。

在一實施例中，用於本發明的結合劑結合與無細胞核小體相關的組蛋白H1修飾。在另一實施例中，組蛋白H1修飾選自磷酸化(phosphorylation)、乙醯化(acetylation)、甲基化(methylation)、泛素化(ubiquitination)及/或甲醯化(formylation)。H1修飾可包括：在S2、T4、T11、S/T18、S27、T31、S36、S37、 T39、S41、S44、S107、T138、T142、T146、T147、T154、T155、T165、S172、S173、T180、S/T187、S189位置磷酸化；在下列位置乙醯化：S2、K17、K26、K34、K46、K49、K52、K63、K64、K85、K88、K90、K93、K97、K109、K168、K169、K192、K209；在下列位置甲基化：K26、K27、K34、K52、K64、K97、K106、K119、K148、K168、K169、K187；在下列位置泛素化：K17、K21、K34、K46、K47、K64、K65、K75、K76、K85、K86、K90、K91、K97、K98、K106、K107；在下列位置甲醯化：K17、K34、K46、K63、K64、K67、K75、K85、K88、K90、K97、K110、K140、K141、K160。因此，在一實施例中，與無細胞核小體相關的組蛋白H1修飾包含如本文所列的至少一種組蛋白H1修飾。

在一個實施例中，用於本發明的結合劑結合與無細胞核小體相關的組蛋白H1變異體或同功異構物。H1變異體和同功異構物可以包括被認為在有絲分裂期間表現的H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5或H1.6，以及在休眠體細胞表現的H1.0、H1.10和H1X。其他H1變異體也在特定組織被辨別，例如睾丸中的變異體H1t、H1T2、H1LS，以及特定的細胞類型，例如末端分化細胞中的變異體H1.0。因此，在一實施例中，與無細胞核小體相關的組蛋白H1變異體或同功異構物包含本文所列的至少一種組蛋白H1變異體或同功異構物。

本領域具有通常知識者將清楚，基於定量H1結合或基於定性H1同功異構物及/或H1轉譯後修飾組成物，從人或動物受試者患者體內增添源自腫瘤的核小體的生物樣品將可能改善使用核小體或DNA生物標記的鑑別診斷的辨別。因此，在一實施例中，健康或腫瘤起源的核小體的免疫分離法利用了結合至少一種組蛋白H1修飾及/或與無細胞核小體相關的變異體及/或同功異構物的結合劑。

在一個實施例中，生物體液樣品係取自受試者，並且基於核小體組蛋白H1組合物，增添樣品中源自腫瘤的無細胞核小體。體液樣品可為取自受試者的任何生物體液樣品，包括但不限於腦脊髓液(CSF)、全血、血清、血漿、經血、子宮內膜液、尿液、唾液或其他體液(糞便、眼淚、關節液、痰)、呼氣，例如作為濃縮呼氣、其萃取物或純化物或其稀釋。生物樣品也包括來自活體受試者的樣本或死後剖析採集的樣品。可以例如適當稀釋或濃縮方式製備樣品，並以常規方式儲存。

在一實施例中，腫瘤起源的無細胞核小體源自於選自以下的癌症：乳癌(breast cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、大腸直腸癌(colorectal cancer)、皮膚癌(skin cancer)(例如黑素瘤)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、肺癌(lung cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、腸癌(bowel cancer)、肝癌(liver cancer)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、淋巴瘤(lymphoma)、口腔癌(oral cancer)、頭頸癌(head and neck cancer)、白血病(leukaemia)和骨肉瘤(osteosarcoma)。

在一個實施例中，核小體是無細胞的單核小體(mononucleosome)或寡核體(oligonucleosome)。

方法

負選擇

本領域具有通常知識者將清楚的是，在血液樣品內包含源自腫瘤細胞和健康細胞的核小體，基於組蛋白H1同功異構物或組蛋白H1轉譯後修飾模式，當源自腫瘤無細胞核小體保留以及含有H1蛋白質部分時，藉由親和結合源自腫瘤的無細胞核小體的正選擇才是可能的。然而，大多數源自腫瘤的循環無細胞核小體不包含H1部分。因此，負選擇是用於增添源自腫瘤的循環無細胞核小體的較佳方法。

根據本發明的第一技術方案，提供了一種藉由親和純化從生物樣品中分離/分析源自腫瘤的無細胞核小體的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)使樣品與組蛋白H1結合劑(包括任何組蛋白H1變異體、同功異構物或其修飾)接觸；(ii)從樣品中分離未結合組蛋白H1結合劑的核小體(即未結合的核小體)；以及(iii)分析該分離的核小體及/或相關DNA。

根據本發明此技術方案，提供了藉由含有組蛋白H1蛋白質、一或多種特定組蛋白H1變異體或一或多種特定組蛋白H1修飾的負選擇，增添生物樣品中源自腫瘤的核小體的方法。在一實施例中，使用結合組蛋白H1或組蛋白H1變異體H1.0、H1.10或H1X(或任何結合這些組合的結合劑)的抗體或其他結合劑來選擇和分離含有H1變異體的核小體，從而結合源自健康細胞的核小體。該方法因此從樣品中去除了源自健康細胞的核小體，因此增添源自腫瘤的核小體。在較佳的實施例中，結合劑是固定在固相上的抗體，用於免疫萃取源自健康細胞的核小體。可分析保留在液相的核小體及/或相關DNA的遺傳序列、表觀遺傳信號結構或其他特徵。

因此，根據本發明的一個技術方案，提供了一種藉由親和純化從生物樣品中分離/分析源自腫瘤的無細胞核小體的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)使樣品與結合組蛋白H1蛋白質本身的結合劑或選自H1.0、H1.10或H1.X的組蛋白H1變異體接觸； (ii)從樣品中分離未與結合劑結合的核小體(即未結合的核小體)；以及(iii)分析該分離的核小體及/或相關DNA。

在一實施例中，分離的核小體是藉由免疫分析或質譜分析法分析。源自腫瘤的核小體的水平或量及/或源自腫瘤的核小體的任何分子遺傳或表觀遺傳特徵，可用於檢測受試者的癌症或用於評估癌症受試者的任何臨床目的。在另一實施例中，藉由免疫分析或質譜分析法分析包含表觀遺傳特徵的分離核小體。在另一實施例中，表觀遺傳特徵包括轉譯後組蛋白修飾、組蛋白同功異構物(histone isoform)、修飾核苷酸(modified nucleotide)或加合的非組蛋白(adducted non-histone protein)。在另一實施例中，分析分離核小體的DNA組成物的DNA鹼基序列。

本文所述的陰性選擇方法中提及的「組蛋白H1蛋白質」包含天然或野生型組蛋白H1蛋白質。如前所述，源自腫瘤的無細胞核小體較源自健康細胞的核小體更不常含有組蛋白H1，因此該實施例能夠藉由檢測天然/野生型組蛋白H1蛋白質的存在與否來分離源自腫瘤的無細胞核小體。

正選擇

在本發明中，正選擇方法係基於使用結合轉譯後修飾的組蛋白H1蛋白分子或結合如上所述之分裂或增殖有關的H1蛋白質同功異構物的親和結合劑。特定地，用於正選擇的轉譯後修飾組蛋白H1蛋白質結合目標包括任何選自以上所列。用於陽性選擇的H1同功異構物包括選自H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5或H1.6的組蛋白H1同功異構物或變異體。

根據本發明的一技術方案，提供了一種藉由親和純化從生物樣品中分離/分析源自腫瘤的無細胞核小體的方法，其中所述方法包括以下步驟： (i)使樣品與結合癌症起源的核小體中普遍存在的組蛋白H1變異體、同功異構物或其修飾的結合劑接觸；(ii)從樣品中分離與組蛋白H1結合劑結合的核小體；以及(iii)分析分離的核小體及/或相關DNA。

根據本發明此技術方案，提供了藉由對於組蛋白H1蛋白質、一種或多種特定組蛋白H1變異體、源自癌症的核小體普遍含有的一種或多種特定組蛋白H1修飾的無細胞核小體正選擇，來增添生物樣品中源自腫瘤的核小體的方法。

在較佳的實施例中，結合H1變異體H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5或H1.6的抗體或其他結合劑(或與其修飾組合的任何結合劑)係用於選擇和分離含有H1變異體的核小體，從而增添源自腫瘤的核小體，而許多源自健康細胞的核小體保持未結合且可被分離。在另一個較佳的實施例中，使用結合H1修飾的抗體或其他結合劑(或與其修飾的組合結合的任何結合劑)來選擇和分離含有H1修飾的核小體，從而增添源自腫瘤的核小體，而許多源自健康細胞的核小體保持未結合且可被分離。在較佳的實施例中，結合劑是固定在固相上的抗體，用於源自腫瘤的核小體的免疫萃取。與固相結合的核小體及/或相關DNA的遺傳序列之表觀遺傳信號結構或其他特徵

因此，根據本發明的一技術方案，提供了一種藉由親和純化從生物樣品中分離/分析源自腫瘤的無細胞核小體的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)使樣品與結合劑接觸，所述結合劑係結合選自H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5或H1.6的組蛋白H1變異體或組蛋白H1修飾； (ii)從樣品中分離與結合劑結合的核小體；以及(iii)分析分離的核小體及/或相關DNA。

在一個實施例中，藉由免疫分析法或質譜分析法分析分離的核小體。在另一個實施例中，藉由免疫分析法或質譜分析法分析包含表觀遺傳特徵的分離的核小體。在另一個實施例中，表觀遺傳特徵包括轉譯後組蛋白修飾、組蛋白同功異構物、修飾核苷酸或加合的非組蛋白蛋白質。在另一個實施例中，分析分離的核小體的DNA組成的DNA鹼基序列。

源自腫瘤的無細胞核小體作為多種起源的核小體混合物的一部分，並且僅包含一部分存在的無細胞核小體，存在於生物流體中。可以藉由本文所述的親和純化分離方法的正或負選擇來進行源自腫瘤的核小體的增添或分離。

由於不定數、不同原因引起細胞突死亡的突然增加，循環核小體水平可在2-5天內顯著達到尖峰，其原因包括創傷、中風或用細胞毒性藥物或放射療法治療。然後該循環核小體之量在2-3天期間下降(Holdenrieder et al,2001)。這種效應是由於誘導細胞死亡後，接著在循環中被清除(Holdenrieder & Stieber,2009)。

被釋放到沒有腫瘤疾病的患者的循環中的核小體(包括如因為外科創傷)不是源自腫瘤。這些核小體構成cfDNA，但不包含ctDNA。

本文使用的術語「核小體」意在包括單核小體(mononucleosomes)和寡核體(oligonucleosomes)以及任何可以在液體介質中分析的此類染色質片段。在另一個實施例中，無細胞核小體是單核小體、寡核體或其他染色體片段。

本領域具有通常知識者可知，作為核小體的一部分存在的分離的腫瘤核小體之量可用於測量樣品中包含腫瘤DNA的DNA比例。此外，相對量是源自健康細胞的DNA在樣品中的比例。因此，本文所述的方法可用於檢測樣品中ctDNA的量或比例。這種測量類似於ctDNA中與癌症相關的突變的等位頻率(allelic frequency)測量，並且可以用作為腫瘤負荷和對治療的反應的量度。

在本發明的一個實施例中，全部或部分純化的腫瘤核小體製備是從生物液體樣品中分離出來。在一個實施例中，純化方法涉及含有組蛋白或健康組織的DNA表觀遺傳信號表位特徵的無細胞核小體的親和分離，藉由使用結合上述表觀表位的結合劑進行。因此，沖提液含有腫瘤核小體製備物及/或其相關的ctDNA，然後可以進行分析。

如本文所需之使樣品接觸和分離核小體的方法為本領域一般知識，並且可使用任何適合的分離方法。例如，分離方法可包括親和層析或磁性抗體珠(magnetic antibody beads)。如果使用親和柱層析裝置，例如，樣品可能通過包含H1結合劑的親和柱。根據如本文所述的正或負選擇方法的使用，可收集固相結合的核小體或收集液(即未結合的核小體)用以分析ctDNA。

在較佳的實施例中，藉由使用與組蛋白H1結合的結合劑的免疫親和純化方法進行腫瘤核小體和ctDNA分離。本領域具有通常知識者可知，任何能夠結合特定組蛋白H1的結合劑可用於本發明的親和純化方法。此類結合劑可包括但不限於抗體、適體(aptamer)或結合蛋白(binding proteins)(例如核小體結合蛋白)。

抗體可以藉由多種本領域已知的方法產生，包括免疫和蛋白展示庫法例如噬菌體展示。可以針對感興趣的部分或抗原誘導免疫反應，或者可以選擇展示庫與其結合。與組蛋白H1結合的抗體可以針對部分產生，包括整個H1 蛋白質胺基酸序列和可選擇性地包含轉譯後組蛋白修飾。蛋白質可從活細胞中純化或合成產生。或者，可以使用代表H1胺基酸序列的一部分的胜肽序列，並且這也可以選擇性地含有轉譯後組蛋白修飾。也可以使用含有組蛋白H1的核小體或其他染色質片段。

本領域具有通常知識者可知，與任何部分或整個組蛋白H1結合的結合劑可以用於本發明的方法。

可以使用任何合適的分析方法，分析分離的源自腫瘤的核小體，其中許多方法是本領域已知的。這些方法包括但不限於：利用第二抗體或其他結合劑，與常見核小體表位例如dsDNA、或感興趣的表觀遺傳結構(包括組蛋白修飾、組蛋白變異體、DNA修飾或加合核小體的另一分子)結合的免疫分析。這些方法包括文獻WO 2005/019826、WO 2013/030577、WO 2013/030579和WO 2013/084002中描述的所有方法，其中使用組蛋白H1結合劑代替一般的抗核小體表位結合劑。這些方法還包括用於分析源自腫瘤的循環核小體的多個表位的多重方法。

本發明分析分離的源自腫瘤的核小體的方法可涉及本領域已知蛋白質體學方法，包括但不限於：包括但不限於電泳分析(electrophoresis method)、色析法(chromatographic methods)和任何涉及質譜分析(mass spectrometry)的方法，包括涉及色譜(chromatography)和質譜(mass spectrometry)的方法，及/或穩定同位素標記的質譜法，及/或涉及蛋白質消化以產生肽的方法，用於質譜法或任何其他方法的任何組合質譜法辨認及/或定量

本發明的一個較佳實施例中，源自腫瘤的循環核小體製備品的增添係藉由從癌症患者取得之血液、血清或血漿樣品之循環核小體的親和純化，並且藉由涉及質譜分析方法來分析核小體製備品的表觀遺傳組成。因此，在一個實施例中，該方法包括以下步驟：(i)使樣品與組蛋白H1結合劑接觸；(ii)分離(separating)游離或結合至組蛋白H1結合劑的核小體部分，並分離(isolating)所述部分之一；以及(iii)使用包括質譜分析法以分析步驟(ii)中分離的核小體。

本領域具有通常知識者可知，根據使用本文所述的正或負選擇方法，將決定分離哪個核小體部分(即，陽性選擇方法的結合部分或者陰性選擇方法中游離/析出部分)。

根據本發明的另一個技術方案，提供了從生物樣品中分離純化的腫瘤DNA的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)使樣品與組蛋白H1結合劑接觸；(ii)分離未與結合劑結合的核小體；(iii)從步驟(ii)中分離的核小體樣品中萃取DNA；以及(iv)分析萃取的DNA。

根據本發明的另一個技術方案，提供了從生物樣品中分離純化的腫瘤DNA的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)使樣品與結合劑接觸，所述結合劑係結合選自H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5或H1.6的組蛋白H1變異體或組蛋白H1修飾；(ii)分離與結合劑結合的核小體；(iii)從步驟(ii)中分離的核小體樣品中萃取DNA；以及(iv)分析萃取的DNA。

純化或分離的腫瘤DNA的研究可能涉及任何或所有類型的癌症相關DNA異常的分析，其包括但不限於：表觀遺傳分析，包括DNA序列的甲基化，點突變(point mutations)、易位(translocations)、基因複製數(gene copy number)、微衛星異常(micro-satellite abnormalities)和DNA鏈完整性(DNA strand integrity)。此外，可以使用任何DNA分析方法，包括但不限於：DNA定序、甲基化DNA定序分析、PCR、珠乳擴磁技術(BEAMing)、NGS(靶向或全基因組)、數位PCR(digital PCR)、冷PCR(cold PCR)(在較低變性溫度下進行共擴增PCR)、MAP(MIDI-活化焦磷酸解)、個人化重組分析(personalized analysis of rearranged ends，PARE)和質譜分析。

在本發明方法的一個實施例中，生物樣品是全血、血清、血漿、腦脊髓液、尿液、糞便、痰、唾液或其他體液、或呼氣、濃縮呼氣或其萃取物或純化物、或其稀釋物。在另一個實施例中，生物樣品是血液、血清或血漿。在另一個實施例中，生物樣品是血清。

收集生物樣品的方法是本領域所習知的，並且應當理解的是，任何此類的收集方法都適合與本文所述的方法一起使用。

進一步的表觀遺傳標記

一旦已經分離了源自腫瘤的增添的核小體，便可進一步分析其表觀遺傳標記(「表觀遺傳表位」)或進行進一步的增添。

因此，根據本發明的一個技術方案，提供了一種用於檢測生物樣品中腫瘤衍生的核小體的表觀遺傳表位的免疫分析方法，其中所述方法包括以下步驟： (i)使樣品與第一結合劑接觸，所述第一結合劑係結合組蛋白H1或選自H1.0、H1.10或H1.X之組蛋白H1變異體；(ii)分離未結合第一結合劑的核小體(即未結合的核小體)；(iii)使步驟(ii)中獲得的核小體與結合所述表位的第二結合劑接觸；(iv)檢測及/或定量所述第二結合劑與所述表位的結合；以及(v)利用這種結合的存在或程度測定樣品中腫瘤衍生的核小體的特定表位的存在。

根據本發明的另一技術方案，提供了一種用於檢測生物樣品中腫瘤衍生的核小體的表觀遺傳表位的免疫分析方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)使樣品與第一結合劑接觸，所述第一結合劑係結合選自H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5或H1.6之組蛋白H1變異體或組蛋白H1修飾；(ii)分離與第一結合劑結合的核小體；(iii)使步驟(ii)中獲得的核小體與結合所述表位的第二結合劑接觸；(iv)檢測及/或定量所述第二結合劑與所述表位的結合；以及(v)使用這種結合的存在或程度測定樣品中腫瘤衍生的核小體的特定表位的存在。

在一個實施例中，表位選自組蛋白修飾、修飾的核苷酸、組蛋白變異體或同功異構物、或其核小體加合物或其變異體。在另一個實施例中，表位包含組蛋白修飾。在另一個實施例中，組蛋白修飾包含H3K27Ac和/或5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)。

文獻已經描述了多種表觀遺傳修飾的核苷酸，並且已知DNA及/或DNA核苷酸殘基中的表觀遺傳修飾模式在癌症中會被改變。其中最好的描述包括在5號位置胞嘧啶的甲基化。含有5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)的DNA通常被稱為「甲基化DNA」。與健康細胞的DNA相比，癌細胞中DNA的甲基化估計約減少50%(Guerrero-Preston et al,2007；Soares et al,1999)。然而，據報導，癌症相關的循環核小體水平的增加平均為970%(Holdenrieder et al,2001)，並且cfDNA約增加為600%(Schwarzenbach et al,2011)。

進一步表觀遺傳表位的測定可以單獨進行或作為測定組的一部分進行。

在一個實施例中，經由本文所述方法獲得的分離的核小體樣品來進行進一步的增添步驟。因此，在一個實施例中，本發明的方法還包括使分離的核小體與組蛋白H3.1及/或H3.2及/或H3t結合劑接觸。先前已經顯示組蛋白3變異體H3.1、H3.2和H3t可用於ctDNA的增添。在該實施例中，其方法步驟可包括：(i)使樣品與組蛋白H1結合劑接觸；(ii)分離游離或結合至組蛋白H1結合劑的核小體部分，並分離所述部分之一；(iii)使分離的部分與組蛋白H3.1及/或H3.2及/或H3t結合劑接觸；(iv)從樣品中分離結合的核小體；以及(v)分析分離的核小體及/或相關DNA。

應當理解的是，任何上述方法可以作為獨立方法或與現有測試方法組合使用。

診斷方法

本文所述的方法可以與診斷方法結合使用。例如，可以使用本文所述的方法增添樣品以分離源自腫瘤的DNA或無細胞核小體，然後此增添的樣品可被用於藉由檢測與疾病相關的另外的表觀遺傳標記的診斷方法中。

因此，根據本發明的另一技術方案，提供了診斷或檢測動物或人類受試者癌症的方法，所述方法包括以下步驟：(i)從受試者取得生物樣品；(ii)使該樣品與組蛋白H1結合劑接觸；(iii)分離游離或結合至組蛋白H1結合劑的核小體部分，並分離所述部分之一；(iv)使步驟(iii)中獲得的分離的核小體與結合腫瘤衍生的核小體的表觀遺傳表位的第二結合劑接觸；(v)檢測及/或定量所述第二結合劑與所述表位的結合；以及(vi)使用所測量的生物標記的量作為受試者中所述疾病存在的指標。

檢測和/或定量可以直接在純化或增添的核小體樣品進行，或間接在其萃取物或在其稀釋物上進行。定量樣品中存在的生物標記的量可包含測定樣品中存在的生物標記的濃度。本發明所述之檢測、監測和診斷的用途和方法可用於確認疾病的存在，藉由評估發病和進展來監測疾病的發展，或評估疾病的改善或消退。檢測、監測和診斷的用途和方法在評估臨床篩選、預後、治療選擇、治療效果評估的方法中也是有用的，即藥物篩選和藥物開發。

本文所述的診斷方法可更包括比較存在於生物樣品中的第二結合劑的水平與一或多對照組。在一實施例中，一或多個對照組的生物樣品取自健康(或「正常」)患者及/或具有相關良性疾病的患者。在另一實施例中，一或多個對照組的生物樣品取自健康患者。

如本文所述，本發明的方法可以組合使用兩種免疫分析。因此，根據本發明的另一技術方案，提供了用於診斷或檢測動物或人類受試者癌症的方法，所述方法包括以下步驟：(i)從受試者取得生物樣品；(ii)藉由使用兩種結合劑的免疫分析法分析樣品中含有表觀遺傳特徵並且也含有組蛋白H1的無細胞核小體，其中一種結合劑針對結合特定的表觀遺傳特徵，另一種針對結合組蛋白H1；(iii)藉由使用兩種結合劑的免疫分析法分析樣品中含有特定表觀遺傳特徵的無細胞核小體，所述表觀遺傳特徵係具有和不具有組蛋白H1，其中一種結合劑結合表觀遺傳特徵，另一種結合劑涉及結合包括任何組蛋白H2、H3或H4表位、任何DNA表位或任何存在於染色質片段中除了組蛋白H1表位之外的共同核心核小體表位；以及(iv)使用步驟(ii)和(iii)中獲得的免疫分析結果的組合作為指示受試者中所述癌症存在的組合生物標記。

治療方法

根據本發明的另一技術方案，提供了在動物或人類受試者中治療癌症的方法，所述方法包括以下步驟：(i)使從受試者取得的生物樣品與組蛋白H1結合劑接觸；(ii)分離游離或結合至組蛋白H1結合劑的核小體部分，並分離所述部分之一；(iii)使步驟(ii)中獲得的分離的核小體與結合腫瘤衍生的核小體的表位的第二結合劑接觸；(iv)檢測及/或測量所述第二結合劑與所述表位的結合量； (v)使用在步驟(iv)中測量的生物標記的量作為受試者中所述疾病存在的指標；以及(vi)對在步驟(v)中診斷出患有所述疾病的患者進行手術治療或投與治療劑。

如本文所述，根據所使用的組蛋白H1結合劑和需要負或正選擇方法判斷分離哪個部分。

如本文所述，本發明的方法可組合使用兩種免疫分析。因此，根據本發明的另一技術方案，提供了在動物或人類受試者中治療癌症的方法，所述方法包括以下步驟：(i)從受試者取得生物樣品；(ii)藉由使用兩種結合劑的免疫分析法分析樣品中的含有表觀遺傳特徵並且也含有組蛋白H1的無細胞核小體，其中一種結合劑用於結合特定的表觀遺傳特徵，另一種用結合組蛋白H1；(iii)藉由使用兩種結合劑的免疫分析法分析樣品中含有特定表觀遺傳特徵的無細胞核小體，所述表觀遺傳特徵係具有和不具有組蛋白H1，其中一種結合劑結合表觀遺傳特徵，另一種結合劑涉及結合包括任何組蛋白H2、H3或H4表位、任何DNA表位或任何存在於染色質片段中除了組蛋白H1表位之外的共同核心核小體表位；(iv)使用步驟(ii)和(iii)中測量到的生物標記的量作為受試者中所述癌症的存在的指示；以及(v)對在步驟(iv)中診斷出患有所述疾病的患者進行手術治療或投與治療劑。

本文所述的診斷方法可更包括比較存在於生物樣品中的生物標記的量與一或多對照組。在一實施例中，一或多個對照組的生物樣品取自健康(或「正常」)患者及/或具有相關良性疾病的患者。在另一實施例中，一或多個對照組的生物樣品取自健康患者。

因此，根據本發明的另一技術方案，提供了對有需要的個體治療癌症的方法，所述方法包括向生物樣品被鑑定為與對照組相比具有不同量的生物標記的患者投與治療劑的步驟。

在一實施例中，癌症選自：乳癌、膀胱癌、大腸直腸癌、皮膚癌(例如黑素瘤)、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰臟癌、腸癌、肝癌、子宮內膜癌、淋巴瘤、口腔癌、頭頸癌、白血病和骨肉瘤。

用於治療所述疾病的治療劑和手術方法是本領域具有通常知識者所習知的。治療癌症的方法包括但不限於：手術，化學療法，放射療法或其他治療劑(例如藥物或生物療法，例如單株抗體)。

用途

根據本發明的另一技術方案，提供了組蛋白H1結合劑用於檢測、分離及/或純化生物樣品中源自腫瘤的無細胞核小體的用途。或者，根據本發明的另一技術方案，提供組蛋白H1結合劑用於檢測、分離及/或純化生物樣品中源自健康組織的無細胞核小體的用途。如本文所述，組蛋白H1的存在或不存在或某些組蛋白H1變異體和修飾的存在與源自腫瘤或健康組織的無細胞核小體相關，因此組蛋白H1結合劑可作為生物標記以檢測所述核小體。

在一個實施例中，無細胞核小體係被分離及/或純化。

套組

根據本發明的另一方面，提供了包含本文所述的任何方法中的組蛋白H1結合劑的試劑套組的用途。

應當理解，本文所述的實施例可以應用於本發明的所有技術方案。除此之外，本說明書中引用的所有著作，包括但不限於專利和專利申請，如同本文所述一樣都藉由引用併入本文。

以下非限制性實施例將說明本發明。

實施例1

使用製造商建議方法生物素化(biotinylate)以及固定專與組蛋白H1變異體H1.0、H1.10或H1.X結合的抗體在塗有鏈黴親和素(streptavidin)的磁珠(Dynal)上。使用磁分離系統(magnetic separation system)將珠子用載入緩衝液(loading buffer)洗滌幾次。將取自癌症患者的血清或血漿在載入緩衝液中稀釋並加入珠中。具有組蛋白H1變異體的源自健康細胞的核小體被吸附到珠上。源自腫瘤的核小體(其不含有組蛋白H1變異體)留在溶液中。通過磁性分離除去珠子，留下含有源自腫瘤的核小體的溶液。藉由苯酚/氯仿方法(phenol/chloroform method)或其他標準萃取方法萃取核小體相關的ctDNA。可分析經萃取的DNA的癌症遺傳或表觀遺傳特徵。

實施例2

藉由固相管柱製造商建議的方法固定組蛋白H1變異體H1.0、H1.10或H1.X專一性結合的抗體在固相載體上，以產生親和純化層析管柱。將取自癌症患者的血清或血漿在載入緩衝液中稀釋並加入管柱中。源自健康細胞含有組蛋白H1變異體的核小體被吸附到管柱上。源自腫瘤的核小體(其不含有組蛋白H1變異體)保留在溶液中並且通過管柱，作為析出液被收集。藉由苯酚/氯仿方法(phenol/chloroform method)或其他標準萃取方法萃取核小體相關的ctDNA。分析經萃取的DNA之癌症的遺傳或表觀遺傳特徵。

實施例3

使用如實施例1或實施例2中的固相固定的抗-H1變異體抗體(anti-H1 variant antibody)以分離源自腫瘤的核小體的溶液。通過免疫分析或蛋白質體學方法(包括質譜法)分析溶液中存在的分離的核小體。

實施例4

藉由製造商建議的方法生物素化(biotinylate)以及固定組蛋白H1變異體H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5或H1.6專一性結合的抗體在塗有鏈黴親和素(streptavidin)的磁珠(Dynal)上。使用磁分離系統(magnetic separation system)將珠子用載入緩衝液(loading buffer)洗滌幾次。將取自癌症患者的血清或血漿在載入緩衝液中稀釋並加入珠中。具有組蛋白H1變異體的源自腫瘤的核小體被吸附到珠上。藉由磁性分離從溶液中分離珠子。藉由苯酚/氯仿方法或其他標準萃取方法從固相磁珠萃取核小體相關的ctDNA。分析經萃取的DNA的癌症遺傳或表觀遺傳特徵。

實施例5

藉由固相管柱製造商建議的方法固定組蛋白H1變異體H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5或H1.6專一性結合的抗體在固相載體上，以產生親和純化層析管柱。將取自癌症患者的血清或血漿在載入緩衝液中稀釋並加入管柱中。含有組蛋白H1變異體的源自腫瘤的核小體被吸附到管柱上。源自健康細胞的核小體(其不含有組蛋白H1變異體)保留在溶液中並且通過管柱。該管柱被洗滌並且藉由苯酚/氯仿方法或其他標準萃取方法萃取核小體相關的ctDNA。分析經萃取的DNA之癌症的遺傳或表觀遺傳特徵。

實施例6

使用如實施例4或實施例5中的固相抗-H1變異體抗體分離源自腫瘤的固相結合核小體的製備。藉由免疫分析或藉由包括質譜分析的蛋白質體學方法分析分離的核小體。

實施例7

藉由製造商建議的方法生物素化(biotinylate)以及固定組蛋白H1本身專一性結合的抗體在覆有鏈黴親和素(streptavidin)的磁珠(Dynal)上。使用磁分離系統(magnetic separation system)將珠子用載入緩衝液(loading buffer)洗滌數次。將取自癌症患者的血清或血漿在載入緩衝液中稀釋並加入珠中。具有組蛋白H1的核小體被吸附到珠上。源自腫瘤的核小體(不含有組蛋白H1)留在溶液中。藉由磁性分離從溶液中分離珠子。一但除去珠子，藉由免疫分析或包括質譜分析的蛋白質體學方法分析分離的核小體。

實施例8

藉由固相管柱製造商建議的方法固定組蛋白H1本身專一性結合的抗體固定在固相載體上，以產生親和純化層析管柱。將取自癌症患者的血清或血漿在載入緩衝液中稀釋並加入管柱中。含有組蛋白H1核小體被吸附到管柱上。源自腫瘤的核小體(其不含有組蛋白H1)保留在溶液中並且通過管柱。收集含有核小體之析出液。藉由ELISA或包括質譜分析的蛋白質體學方法分析分離的核小體。

實施例9

如實施例7或實施例8製備源自腫瘤的核小體溶液。藉由苯酚/氯仿方法或其他標準萃取方法從溶液中萃取核小體相關的ctDNA。可分析萃取DNA的癌症遺傳或表觀遺傳特徵。

實施例10

使用如實施例1-9中任一項所述的固相固定的抗H1抗體分離取自受試者體液樣品中源自腫瘤的核小體。藉由本領域已知的方法分析溶液中存在的分離的核小體及/或相關DNA。

實施例11

藉由製造商推薦的方法生物素化(biotinylate)以及固定專與組蛋白H1本身或組蛋白H1變異體結合的抗體在覆有鏈黴親和素的磁珠(Dynal)上。使用磁分離系統將珠子用載入緩衝液洗滌幾次。將取自癌症患者的血清或血漿在載入緩衝液中稀釋並加入珠中。具有組蛋白H1變異體的源自健康細胞的核小體被吸附到珠上。源自腫瘤的核小體(不含有組蛋白H1變異體)留在溶液中。藉由磁性分離從溶液中分離珠子以留下主要源自腫瘤的核小體溶液。

然後使用ELISA方法測定腫瘤核小體溶液中核小體相關核苷酸甲基化DNA，其使用結合完整核小體的固相抗組蛋白(solid phase anti-histone)H1、H3及/或H4表位或抗核小體(anti-nucleosome)捕獲抗體(capture antibody)，以及生物素化的單株抗體抗-5-甲基胞嘧啶(anti-5-methylcytosine)檢測抗體(detection antibody)，其步驟如以下所述：

將含有抗組蛋白H2、H3或H4抗體的0.1M磷酸鹽緩衝液溶液(pH 7.4)加入微量多孔盤(100微升(μL)/孔)中，並在4℃下培養過夜以將孔塗覆上捕獲抗體。緩慢倒出過量的抗組蛋白抗體。將牛血清白蛋白(20g/L)溶液加到孔盤中(200μL/孔)，並在室溫下培養30分鐘以阻斷孔上過量的蛋白質結合位。

去除過量的牛血清白蛋白溶液，並用洗滌緩衝液(200μL/孔，含有1%Tween 20的0.05M Tris/HCl緩衝液pH 7.5)洗滌孔三次。將樣品(10μL/孔)和緩衝液(50μL/孔，含有0.9%NaCl、0.05%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)以及1%Nonidet P40取代物的0.05M Tris/HCl pH 7.5)加到孔中，在室溫輕輕震盪90分鐘。緩慢去除樣品和緩衝液之混合液，並用洗滌緩衝液(200μL/孔)洗滌孔三次。

加入生物素化的抗5-甲基胞嘧啶(anti-5-methylcytosine)抗體溶液(50μL/孔)，並在室溫下緩和震盪90分鐘。去除過量的抗體，並用洗滌緩衝液(200μL/孔)再次洗滌孔三次。加入含有鏈黴親和素-辣根過氧化酵素共軛接合物(streptavidin-horse radish peroxidase conjugate)的溶液(50μL/孔)，並在室溫下溫和震盪30分鐘。

去除過量的共軛接合物，並用緩衝液(200μL/孔)再次洗滌孔三次。加入有色基質溶液(100μL/孔，2,2-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-Azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt))，並在室溫下溫和震盪20分鐘使其反應。使用標準微量孔盤讀取裝置在405nm的波長下測量孔的光密度(OD)。

觀察因為增加的核小體相關抗-5-甲基胞嘧啶(anti-5-methylcytosine)濃度而增加顏色的劑量反應曲線，對照沒有5-甲基胞嘧啶(胎牛血清)的情況下觀察到的低背景信號。陽性ELISA信號表示經由ELISA檢測到包括除了組蛋白H1之外的組蛋白和DNA的完整組蛋白中具有5-甲基胞嘧啶；因為(i)含有組蛋白H1的核小體已經通過親和純化除去，(ii)在樣品中捕獲抗體結合組蛋白H2、H3及/或H4表位，以及(iii)偵測抗體結合DNA的5-甲基胞嘧啶部分。

實施例12

使用如實施例11中所述的固相固定的抗H1抗體分離取自受試者的體液樣品中的源自腫瘤的核小體。藉由實施例11中所述的ELISA方法分析分離的核小體，但使用生物素化的單株抗修飾組蛋白抗體，例如結合H3K9(Me)3的抗體。

實施例13

使用如實施例11中所述的固相固定的抗H1抗體分離取自受試者的體液樣品中源自腫瘤的核小體。藉由實施例11中所述的ELISA方法分析分離的核小體，但使用生物素化的單株抗組蛋白變異體抗體，例如結合H2AZ的抗體。

實施例14

使用如實施例11中所述的固相固定的抗H1抗體分離取自受試者的體液樣品中源自腫瘤的核小體。藉由實施例11中描述的ELISA方法分析分離的核小體，但使用生物素化的單株抗體，該單株抗體結合加合至分離的循環無細胞核小體的非組蛋白蛋白質；例如結合雄激素受體的抗體。結果顯示，加合到所述蛋白質的源自腫瘤的無細胞核小體存在於受試者的血液循環(或其他體液)中。

實施例15

從29個健康受試者、29個診斷為大腸直腸癌的受試者和11個診斷為胰臟癌的受試者取得血清樣品。塑膠微量孔盤塗覆結合非組蛋白染色質蛋白質(non-histone chromatin protein)的抗體，並根據標準程序阻斷。藉由生物素化來標記結合組蛋白H1本身的抗體、和結合存在於所有或大多數核小體上的共同核心組蛋白的抗體。對每個樣品進行兩種免疫分析。

在第一免疫分析，將樣品(10μL/孔)和分析緩衝液(50μL/孔，含有 0.9%NaCl、0.05%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)以及1%Nonidet P40取代物的0.05M TRIS/HCl pH 7.5)加到孔中，在室溫下輕輕震盪90分鐘。去除樣品和緩衝液之混合物，並用洗滌緩衝液(200μL/孔)洗滌孔三次。加入生物素化的抗組蛋白H1偵測抗體溶液(50μL/孔)，並在室溫下溫和震盪90分鐘。去除過量的偵測抗體，並用洗滌緩衝液(200μL/孔)再次洗滌孔三次。加入含有鏈黴親和素-辣根過氧化酵素共軛接合物的溶液(50μL/孔)，並在室溫下溫和震盪30分鐘。去除過量的共軛接合物，並用洗滌緩衝液(200μL/孔)再次洗滌孔三次。加入有色基質溶液(100μL/孔，2,2-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-Azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt))，並在室溫下溫和震盪20分鐘。使用標準微量孔盤讀取裝置在405nm的波長下測量孔的免疫分析的光密度1(OD1)。所有測量皆進行2次，並使用平均結果。

在第二免疫分析，將樣品(10μL/孔)和分析緩衝液(50μL/孔，含有0.9%NaCl、0.05%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)以及1%Nonidet P40取代物的0.05M Tris/HCl pH 7.5)加到孔中，在室溫下輕輕震盪90分鐘。去除樣品和緩衝液混合物，並用洗滌緩衝液(200μL/孔)洗滌孔三次。加入生物素化的抗核心核小體(core histone)偵測抗體溶液(50μL/孔)，並在室溫下溫和震盪90分鐘。去除過量的偵測抗體，並用洗滌緩衝液(200μL/孔)再次洗滌孔三次。加入含有鏈黴親和素-辣根過氧化酵素共軛接合物的溶液(50μL/孔)，並在室溫下溫和震盪30分鐘。去除過量的共軛接合物，並用洗滌緩衝液(200μL/孔)再次洗滌孔三次。加入有色基質溶液(100μL/孔，2,2-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-Azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt))，並在室溫下溫和擾動20分鐘。使用標準微量孔盤讀取裝置在405nm的波長下測量孔的光密度2(OD2)。所有測量皆進行兩次測量，並使用平均結果。

對於每個樣品，計算OD2：OD1的比值。所有69名受試者的OD2：OD1比值結果示於圖1中。對於29名健康受試者，發現平均免疫分析比為8.7。對於診斷為大腸直腸癌的29名受試者，平均比值為15.9。對於診斷為胰臟癌的11個受試者，平均比值為17.1。這顯示增加的比值與源自癌症的核小體相關。

此外，每個受試者的個體結果被用作為具有上升臨界量的癌症生物標記。臨界值為12時，該比值對73%(8/11)診斷患有胰臟癌的受試者和41%(12/29)診斷為大腸直腸癌的受試者給予陽性結果，臨床特異性為79%(29名健康受試者中有6個偽陽性結果)。臨界值為22時，該比值對36%(4/11)診斷患有胰臟癌的受試者和34%(10/29)診斷為大腸直腸癌的受試者給予了陽性結果，臨床特異性為93%(29個健康受試者中的2個偽陽性結果)。圖1中的結果顯示本文所述的方法可用於檢測癌症。這些結果還證明如本文所述的組合免疫分析結果可用作癌症疾病的組合生物標記。

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Claims

一種用親和純化法分析生物樣品中源自腫瘤之無細胞核小體之方法，包括：使樣品和組蛋白H1結合劑接觸；自未與該組蛋白H1結合劑結合之該樣品中分離核小體；以及透過免疫分析或質譜分析方法分析分離之核小體。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該組蛋白H1結合劑係與組蛋白H1蛋白質、變異體、同功異構物、或其修飾結合之結合劑。
如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中，該組蛋白H1結合劑係與組蛋白H1、或選自組蛋白H1.0、H1.10或H1.X之組蛋白H1變異體結合之結合劑。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該分離之核小體透過免疫分析和質譜分析方法分析表觀遺傳特徵，該表觀遺傳特徵包括轉譯後組蛋白修飾、組蛋白同功異構物、修飾核苷酸、或加合非組蛋白。
如專利請求範圍第1項所述之方法，其中，分析該分離之核小體之步驟包含免疫分析。
如專利請求範圍第1項所述之方法，其中，分析該分離之核小體之步驟包含質譜分析。
一種分離生物樣品中純化之腫瘤DNA之方法，其中，該方法包括以下步驟：使樣品和組蛋白H1結合劑接觸；分離未與該組蛋白H1結合劑結合之核小體；從所分離之該核小體中萃取DNA；以及分析經萃取之DNA。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中分析萃取之DNA之步驟包含：DNA定序、甲基化DNA定序分析、聚合酶連鎖反應、珠乳擴磁技術、次世代定序技術(目標基因或全部基因)、數位PCR、冷PCR(較低變性溫度共擴增PCR)、MIDI-活化焦磷酸解(MIDI-Activated Pyrophosphorolysis)、個人化重組分析(Personalized Analysis of Rearranged Ends,PARE)、或質譜分析。
如申請專利範圍第1或7項所述之方法，其還包括使分離之該核小體與組蛋白H3.1及/或H3.2及/或H3.2及/或H3t結合劑接觸。
一種免疫分析之方法，係用於檢測生物樣品中源自腫瘤之核小體表觀遺傳表位，其中該方法包括：使樣品和包含組蛋白H1結合劑之第一結合劑接觸；分離未與該第一結合劑結合之核小體；使該核小體和第二結合劑接觸，以與該核小體之表位結合；檢測及/或定量該第二結合劑和該表位之結合；以及使用該結合之存在或程度測定樣品中腫瘤衍生之核小體之特定表位之存在。
如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，所述之表位包括組蛋白修飾。
如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該組蛋白修飾包括H3K27Ac及/或5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)。
如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該表位包括修飾核苷酸。
如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該表位包括組蛋白H2A、H2B、H3或H4之變異體或同功異構物。
如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該表位包括核小體加合物或其變異體。
如申請專利範圍第1、7或10項任一項所述之方法，其中該生物樣品包括血液、血清、血漿、經血、腦脊髓液、子宮內膜液、尿液、唾液、糞便、淚液、關節液、痰、或其他體液、呼氣、其萃取物、純化物、或稀釋物，該呼吸包括濃縮呼氣。
如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該生物樣品包括血液、血清或血漿。
一種在動物或人類受試者中檢測癌症的方法，包括以下步驟：從受試者取得生物樣品；經由使用二種結合劑之免疫分析方法，分析樣品中含有表觀遺傳特徵並且含有組蛋白H1之無細胞核小體，其中一結合劑用於結合特定的該表觀遺傳特徵，另一結合劑用於結合該組蛋白H1；經由使用二種結合劑之免疫分析方法，分析樣品中含有特定表觀遺傳特徵之循環無細胞核小體，該循環無細胞核小體包括具有組蛋白H1和不具有組蛋白H1之核小體，其中一結合劑結合該循環無細胞核小體之該表觀遺傳特徵，另一結合劑結合共同核心核小體表位，該共同核心核小體表位包括組蛋白H2、H3或H4表位中任何表位、任何DNA表位、或存在於染色質片段中除了組蛋白H1表位之外之任何其它表位；以及綜合免疫分析之結果作為受試者罹患癌症之生物標記。
如申請專利範圍第18項所述之方法，其中，該癌症係選自：乳癌、膀胱癌、大腸直腸癌、皮膚癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰臟癌、腸癌、肝癌、子宮內膜癌、淋巴癌、口腔癌、頭頸癌、白血病和骨肉瘤所構成之群組，該皮膚癌包括黑色素瘤。
一種如申請專利範圍第1、7、10或18項所述之方法中包括組蛋白H1結合劑之套組之用途。