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TWI718113B - 吡啶甲醯胺類衍生物、其製備方法及其在醫藥上的應用 - Google Patents

吡啶甲醯胺類衍生物、其製備方法及其在醫藥上的應用 Download PDF

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TWI718113B
TWI718113B TW104140503A TW104140503A TWI718113B TW I718113 B TWI718113 B TW I718113B TW 104140503 A TW104140503 A TW 104140503A TW 104140503 A TW104140503 A TW 104140503A TW I718113 B TWI718113 B TW I718113B
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董慶
孫飄揚
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大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
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Abstract

本發明涉及吡啶甲醯胺類衍生物、其製備方法及其在醫藥上的應用。具體而言，本發明涉及一種通式(I)所示吡啶甲醯胺類衍生物、其製備方法及含有該衍生物的藥物組成物，以及其作為治療劑，特別是作為腎外髓質分泌鉀通道(ROMK)抑制劑的用途和其在製備治療和/或預防高血壓和心臟衰竭的藥物中的用途，其中通式(I)中的各取代基的定義與說明書中的定義相同。

Description

吡啶甲醯胺類衍生物、其製備方法及其在醫藥上的應用
本發明涉及一類吡啶甲醯胺類衍生物、其製備方法及含有該衍生物的藥物組成物，以及其作為治療劑特別是作為特別是作為腎外髓質分泌鉀通道(ROMK)抑制劑的用途和其在製備治療和/或預防由過量的鹽和水滯留造成的失調症，包括高血壓和心臟衰竭的藥物中的用途。
加強腎臟的鹽重吸收功能，會引發高血壓風險。相反，抑制腎臟的重吸收功能，可以促進尿液的排泄，起到利尿降壓的功效。常見的利尿劑有噻
Figure 104140503-A0101-12-0001-62
類利尿藥，作為美國一線降壓藥，主要作用於Na+-Cl-轉運載體；Loop利尿劑對腎功能受損患者更為有效，主要藉由Na+-K+-2Cl-轉運蛋白發揮作用。但這兩種利尿劑均會引起低血鉀症(症狀：虛弱、疲勞、肌肉痙攣、便秘和心律問題如心律不齊)，增加心血管疾病的發病率和致死率的風險。
腎外髓質分泌鉀通道(renal outer medullary potassium channel,ROMK)也稱內向性整流型鉀離子通道1.1(inward-rectifying potassium channels 1.1,Kir1.1)。ROMK離子通道可以藉由腎臟髓袢粗升支(TAL)的頂端膜電導，與Na+-K+-2Cl-共轉運蛋白NKCC2(負責NaCl轉運)協同作用，調節Na+的重吸收。研究發現，ROMK與腎臟的分泌通道有直接的關聯，剔除ROMK基因，小鼠TAL和CCD的35-pS離子通道和TAL其他K+離子通道缺失。近腎絲球細胞增生症(Batter syndrome)是一種體染色體隱性遺傳性疾病，表現為腎臟大量鹽流失，低血鉀症，血壓較低。近腎絲球細胞增生症主要由ROMK或Na+-K+-2Cl-共轉運蛋白的突變引起的，不同的是由ROMK突變引起的近腎絲球細胞增生症的低血鉀症較Na+-K+-2Cl-共轉運蛋白突變引發的近腎絲球細胞增生症有極大的緩和。綜上，抑制ROMK的功能，可以在不引起低血鉀症的情況下，有效抑制Na+-K+-2Cl-轉運蛋白的鹽重吸收功能，促進尿液的排泄，起到利尿降壓的功效。
儘管目前已公開了一系列的ROMK抑制劑的化合物，其中包括WO2010129379、WO2012058134、WO2012058116、WO2012058134、WO2013066714、WO2013028474、WO2014085210、WO2014018764、WO2014015495、WO2014085210、WO2013039802、WO2013062892和WO2012058116等專利申請，但仍需開發提高hERG選擇性的化合物。本發明設計具有通式(I)所示的結構的化合物，增加了極性基團，在保持ROMK抑制活性的基礎上，降低 了ClogP，提升了hERG選擇性，增加了安全性。
本發明的目的在於提供一種通式(I)所示的化合物：
Figure 104140503-A0101-12-0003-4
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1為烷基，其中該烷基視需要進一步經選自鹵素、羥基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、羧基和羧酸酯基中的一個或多個取代基所取代；R2選自氫原子、烷基、鹵素、氰基、硝基、烷氧基、環烷基和雜環基，其中該烷基烷氧基、環烷基或雜環基視需要進一步經選自烷基、鹵素、羥基、羥烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、羧酸和羧酸酯中的一個或多個取代基所取代；R3選自下列基團：
Figure 104140503-A0101-12-0003-5
 R4或R5各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵素、氰基、硝基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基；R6選自氫原子、烷基和鹵素； n為0、1或2。
在本發明一個較佳方案中，一種通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中R1為烷基，其中該烷基視需要進一步經選自鹵素、羥基和烷氧基中的一個或多個取代基所取代；R1較佳為C1-6烷基，更佳為甲基、乙基或丙基。
在本發明一個較佳方案中，一種通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中R4為烷基，且R5為氫原子。
在本發明一個較佳方案中，一種通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其為通式(II)所示的化合物：
Figure 104140503-A0101-12-0004-6
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1、R2、R4、n如式(I)中所定義。
在本發明一個較佳方案中，一種通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非 對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其為通式(III)所示的化合物：
Figure 104140503-A0101-12-0005-7
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1、R2、R4、n如式(I)中所定義。
在本發明一個較佳方案中，一種通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其為通式(IV)所示的化合物：
Figure 104140503-A0101-12-0005-8
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1、R2、R3、n如式(I)中所定義。
在本發明一個較佳方案中，一種通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其為通式(V)所示的化合物：
Figure 104140503-A0101-12-0006-9
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1、R2、R4、n如式(I)中所定義。
在本發明一個較佳方案中，一種通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其為通式(VI)所示的化合物：
Figure 104140503-A0101-12-0006-10
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1、R2、R4、n如式(I)中所定義。
本發明典型的化合物包括，但不限於：
Figure 104140503-A0101-12-0007-11
Figure 104140503-A0101-12-0008-12
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用鹽。
本發明還提供一種通式(IA)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，作為製備通式(I)所示化合物的中間體：
Figure 104140503-A0101-12-0008-13
其中：R1為烷基，其中該烷基視需要進一步經選自鹵素、羥基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、羧基和羧酸酯基中的一個或多個取代基所取代；R2選自氫原子、烷基、鹵素、氰基、硝基、烷氧基、環烷基和雜環基，其中該烷基、烷氧基、環烷基或雜環基 視需要進一步經選自烷基、鹵素、羥基、羥烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、羧基和羧酸酯基中的一個或多個取代基所取代；可用於製備通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽的中間體；n為0、1或2。
在本發明一個較佳方案中，一種通式(IA)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其為通式(IVA)所示的化合物：
Figure 104140503-A0101-12-0009-14
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽；可用於製備通式(IV)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽的中間體；其中：R1、R2、n如式(IA)中所定義。
通式(IA)化合物的典型的化合物包括，但不限於：
Figure 104140503-A0101-12-0010-15
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用鹽。
本發明還提供一種製備通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽的方法，該方法包括：
Figure 104140503-A0101-12-0010-16
通式(IA)化合物與經取代的苯并呋喃類衍生物(IB)，較佳為與(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮加熱反應，得到通式(I)化合物；其中：R1-R3、n如通式(I)中所定義。
本發明進一步涉及一種藥物組成物，該藥物組成物含有治療有效量的如通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、 或其混合物形式，或其可藥用的鹽以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明進一步涉及通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，或包含其的藥物組成物在製備ROMK抑制劑中的用途。
本發明進一步涉及通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，或包含其的藥物組成物在製備治療或預防高血壓或心臟衰竭的藥物中的用途。
本發明進一步涉及通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，或包含其的藥物組成物在製備治療或預防ROMK介導的疾病的藥物中的用途，該疾病包括但不限於肝硬化、急性和慢性的腎功能不全、腎病症候群、肺動脈高血壓、心血管疾病、心肌梗塞、中風、心功能不全、肺張力過強、動脈粥樣硬化和腎結石。
本發明還涉及通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，或包含其的藥物組成物，其用作ROMK抑制劑。
本發明還涉及通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，或包含其的藥物組成 物，其用於治療或預防高血壓或心臟衰竭。
本發明還涉及通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，或包含其的藥物組成物，其用於治療或預防ROMK介導的疾病，該疾病較佳係選自肝硬化、急性和慢性的腎功能不全、腎病症候群、肺動脈高血壓、心血管疾病、心肌梗塞、中風、心功能不全、肺張力過強、動脈粥樣硬化和腎結石。
本發明還涉及一種抑制ROMK的方法，其包括給予所需患者治療有效量的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，或包含其的藥物組成物。
本發明還涉及一種治療或預防高血壓和/或心臟衰竭的方法，其包括給予所需患者治療有效量的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，或包含其的藥物組成物。
本發明涉及一種治療或預防ROMK介導的疾病或病症的方法，其包括給予所需患者治療有效量的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，或包含其的藥物組成物，該疾病較佳係選自肝硬化、急性和慢性的腎功能不全、腎病症候群、肺動脈高血壓、心血 管疾病、心肌梗塞、中風、心功能不全、肺張力過強、動脈粥樣硬化和腎結石。
含活性成分的藥物組成物可以是適用於口服的形式，例如片劑、糖錠劑、錠劑、水或油混懸液、可分散粉末或顆粒、乳液、硬或軟膠囊，或糖漿劑或酏劑。可按照本領域任何已知製備藥用組成物的方法製備口服組成物，此類組成物可含有一種或多種選自以下的成分：甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑，以提供悅目和可口的藥用製劑。片劑含有活性成分和用於混合的適宜製備片劑的無毒的可藥用的賦形劑。這些賦形劑可以是惰性賦形劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；造粒劑和崩解劑，例如微晶纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉、玉米澱粉或藻酸；黏合劑，例如澱粉、明膠、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯膠和潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。這些片劑可以不包衣或可藉由掩蓋藥物的味道或在胃腸道中延遲崩解和吸收，因而在較長時間內提供緩釋作用的已知技術將其包衣。例如，可使用水溶性味道掩蔽物質，例如羥丙基甲基纖維素或羥丙基纖維素，或延長時間物質例如乙基纖維素、醋酸丁酸纖維素。
也可用其中活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合的硬明膠膠囊，或其中活性成分與水溶性載體例如聚乙二醇或油溶媒例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合的軟明膠膠囊提供口服製劑。
水懸浮液含有活性物質和用於混合的適宜製備水懸浮 液的賦形劑。此類賦形劑是懸浮劑，例如羧基甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑可以是天然產生的磷脂例如卵磷脂，或烯化氧與脂肪酸的縮合產物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產物，例如十七碳亞乙基氧基鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxy cetanol)，或環氧乙烷與由脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的縮合產物，例如聚環氧乙烷山梨醇單油酸酯，或環氧乙烷與由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的縮合產物，例如聚環氧乙烷脫水山梨醇單油酸酯。水混懸液也可以含有一種或多種防腐劑例如尼泊金乙酯或尼泊金正丙酯、一種或多種著色劑、一種或多種矯味劑和一種或多種甜味劑，例如蔗糖、糖精或阿斯巴甜。
油混懸液可藉由使活性成分懸浮於植物油如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，或礦物油例如液體石蠟中配製而成。油懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可加入上述的甜味劑和矯味劑，以提供可口的製劑。可藉由加入抗氧化劑例如丁羥茴醚或α-生育酚保存這些組成物。
藉由加入水可使適用於製備水混懸液的可分散粉末和顆粒提供活性成分和用於混合的分散劑或濕潤劑、懸浮劑或一種或多種防腐劑。適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑可說明上述的例子。也可加入其他賦形劑例如甜味劑、矯味劑和著色劑。藉由加入抗氧化劑例如抗壞血酸保存這些組 成物。
本發明的藥物組成物也可以是水包油乳劑的形式。油相可以是植物油例如橄欖油或花生油，或礦物油例如液體石蠟或其混合物。適宜的乳化劑可以是天然產生的磷脂，例如大豆卵磷脂和由脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯或偏酯例如山梨坦單油酸酯，和該偏酯和環氧乙烷的縮合產物，例如聚環氧乙烷山梨醇單油酸酯。乳劑也可以含有甜味劑、矯味劑、防腐劑和抗氧劑。可用甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖配製糖漿和酏劑。此類製劑也可含有緩和劑、防腐劑、著色劑和抗氧劑。
藥物組成物可以是無菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶劑中有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性成分溶於油相的無菌注射水包油微乳。例如將活性成分溶於大豆油和卵磷脂的混合物中。然後將油溶液加入水和甘油的混合物中處理形成微乳。可藉由局部大量注射，將注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本發明化合物恒定迴圈濃度的方式給予溶液和微乳。為保持這種恒定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的實例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型靜脈注射泵。
藥物組成物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油混懸液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該混懸液。無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中製備的無菌注 射溶液或混懸液，例如1,3-丁二醇中製備的溶液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用包括合成甘油單或二酯在內的任何調和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以製備注射劑。
可按用於直腸給藥的栓劑形式給予本發明化合物。可藉由將藥物與在普通溫度下為固體但在直腸中為液體，因而在直腸中會溶化而釋放藥物的適宜的無刺激性賦形劑混合來製備這些藥物組成物。此類物質包括可可脂、甘油明膠、氫化植物油、各種分子量的聚乙二醇和聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物。
本領域技術人員所熟知的，藥物的給藥劑量依賴於多種因素，包括但並非限定以下因素：所用特定化合物的活性、病人的年齡、病人的體重、病人的健康狀況、病人的行被、病人的飲食、給藥時間、給藥方式、排泄的速率、藥物的組合等；另外，最佳的治療方式如治療的模式、通式化合物(I)的日用量或可藥用的鹽的種類可以根據傳統的治療方案來驗證。
[定義]
除非有相反陳述，否則下列用在說明書和申請專利範圍中的術語具有下述含義。
“烷基”指飽和的脂族烴基團，包括1至20個碳原子的直鏈和支鏈基團。較佳係含有1至10個碳原子的烷基，更佳係含有1至6個碳原子的烷基。非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁 基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更佳的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是經取代的或未經取代的，當經取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上經取代，較佳係選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷 基胺基、鹵素、疏基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、胺基、鹵代烷基、羥烷基、羧基和羧酸酯基中的一個或多個基團。
“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包括3至20個碳原子，較佳係包括3至12個碳原子，更佳係環烷基環包含3至10個碳原子，最佳係環烷基環包含3至6個碳原子。單環環烷基的非限制性實施例包含環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等，較佳係環丙基、環己烯基。多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。
“螺環烷基”指5至20員，單環之間共用一個碳原子(稱螺原子)的多環基團，這些可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺環烷基分為單螺環烷基、雙螺環烷基基或多螺環烷基，較佳為單螺環烷基和雙螺環烷基。更佳為4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺環烷基。螺環烷基的非限制性實施例包含
Figure 104140503-A0101-12-0018-17
“稠環烷基”指5至20員，系統中的每個環與體系中的其他環共用毗鄰的一對碳原子的全碳多環基團，其中一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠環烷基，較佳為雙環或三環，更佳為5員/5員或5員/6員雙環烷基。稠環烷基的非限制性實施例包含
Figure 104140503-A0101-12-0019-18
“橋環烷基”指5至20員，任意兩個環共用兩個不直接連接的碳原子的全碳多環基團，這些可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳係為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋環烷基，較佳為雙環、三環或四環，更有選為雙環或三環。橋環烷基的非限制性實施例包含
Figure 104140503-A0101-12-0019-19
該環烷基環可以稠合於芳基、雜芳基或雜環基環上， 其中與母體結構連接在一起的環為環烷基，非限制性實施例包括茚滿基、四氫萘基、苯并環庚烷基等。環烷基可以是視需要經取代的或未經取代的，當經取代時，取代基較佳係選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、疏基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、胺基、鹵代烷基、羥烷基、羧基和羧酸酯基中的一個或多個基團。
“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包括3至20個環原子，其中一個或多個環原子選自氮、氧或S(O)m(其中m是0至2的整數)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳係包括3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；更佳係雜環基環包含3至10個環原子，其中1~3個是雜原子；更佳係雜環基環包含5至6個環原子，其中1~2個是雜原子。單環雜環基的非限制性實施例包含吡咯烷基、哌啶基、哌
Figure 104140503-A0101-12-0020-63
基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高哌
Figure 104140503-A0101-12-0020-64
基、吡喃基、四氫呋喃基等。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。
“螺雜環基”指5至20員，單環之間共用一個原子(稱螺原子)的多環雜環基團，其中一個或多個環原子選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。這些可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺環烷基分為單 螺雜環基、雙螺雜環基或多螺雜環基，較佳為單螺雜環基和雙螺雜環基。更佳為4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺雜環基。螺雜環基的非限制性實施例包含
Figure 104140503-A0101-12-0021-20
“稠雜環基”指5至20員，系統中的每個環與體系中的其他環共用毗鄰的一對原子的多環雜環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠雜環基，較佳為雙環或三環，更佳為5員/5員或5員/6員雙環稠雜環基。稠雜環基的非限制性實施例包含
Figure 104140503-A0101-12-0021-21
“橋雜環基”指5至14員，任意兩個環共用兩個不直 接連接的原子的多環雜環基團，這些可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋雜環基，較佳為雙環、三環或四環，更有選為雙環或三環。橋雜環基的非限制性實施例包含：
Figure 104140503-A0101-12-0022-22
該雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，非限制性實施例包含：
Figure 104140503-A0101-12-0022-23
和
Figure 104140503-A0101-12-0022-24
等。
雜環基可以是視需要經取代的或未經取代的，當經取代時，取代基較佳係選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、疏基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、胺基、鹵代烷基、羥烷基、羧基和羧酸酯基中的一個或多個基團。
“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共用毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至10員，更佳係苯基和萘基，最佳係苯基。該芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體 結構連接在一起的環為芳基環，非限制性實施例包含：
Figure 104140503-A0101-12-0023-25
芳基可以是經取代的或未經取代的，當經取代時，取代基較佳係選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、疏基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、胺基、鹵代烷基、羥烷基、羧基和羧酸酯基中的一個或多個基團。
“雜芳基”指具有1至4個雜原子作為環原子，其餘的環原子為碳的5至14員芳基，其中雜原子包括氧、硫和氮。較佳為5至10員。雜芳基較佳為5員或6員，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡
Figure 104140503-A0101-12-0023-65
基、咪唑基、四唑基等。該雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，非限制性實施例包含：
Figure 104140503-A0101-12-0023-26
雜芳基可以是視需要經取代的或未經取代的，當經取代時，取代基較佳係選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷 硫基、烷基胺基、鹵素、疏基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、胺基、鹵代烷基、羥烷基、羧基和羧酸酯基中的一個或多個基團。
“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(未經取代的環烷基)，其中烷基如上所定義。非限制性實施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基等。烷氧基可以是視需要經取代的或未經取代的，當經取代時，取代基較佳係選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、疏基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、胺基、鹵代烷基、羥烷基、羧基和羧酸酯基中的一個或多個基團。
“鹵代烷基”指烷基經一個或多個鹵素取代，其中烷基如上所定義。
“羥基”指-OH基團。
“羥烷基”指經羥基取代的烷基，其中烷基如上所定義。
“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
“氰基”指-CN。
“羧基”指-C(O)OH。
“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件 或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要經烷基取代的雜環基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團經烷基取代的情形和雜環基團未經烷基取代的情形。
“經取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳為1~3個氫原子彼此獨立地經相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
“藥物組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學可藥用的載體和賦形劑。藥物組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
本發明的合成方法
為了完成本發明的合成目的，本發明採用如下的合成技術方案：
方案一、
本發明通式(I)所述的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用鹽的製備方法，該方法包括以下步驟：
Figure 104140503-A0101-12-0026-27
通式(IA)化合物與經取代的苯并呋喃類衍生物(IB)，較佳為與(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮在有機溶劑中進行加熱反應，得到通式(I)化合物；其中：R1~R3、n如通式(I)中所定義。
方案二、
本發明通式(II)所述的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用鹽的製備方法，該方法包括以下步驟：
Figure 104140503-A0101-12-0026-28
通式(IA)化合物與經取代的苯并呋喃類衍生物(IB)，較佳為與(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮在有機溶劑中進行加熱反應，得到通式(II)化合物；其中：R1、R2、R4、n如通式(II)中所定義。
方案三、
本發明通式(III)所述的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用鹽的製備方法，該方法包括以下步驟：
Figure 104140503-A0101-12-0027-29
通式(IA)化合物與經取代的苯并呋喃類衍生物(IB)，較佳為與(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮在有機溶劑中進行加熱反應，得到通式(III)化合物；其中：R1、R2、R4、n如式(III)中所定義。
方案四、
本發明通式(IV)所述的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用鹽的製備方法，該方法包括以下步驟：
Figure 104140503-A0101-12-0027-30
通式(IVA)化合物與經取代的苯并呋喃類衍生物(IB)，較佳為與(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮在有機溶劑中進行加熱反應，得到通式(IV)化合物；其中：R1~R3、n如通式(I)中所定義。
方案五、
本發明通式(V)所述的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物 形式，或其可藥用鹽的製備方法，該方法包括以下步驟：
Figure 104140503-A0101-12-0028-31
通式(IVA)化合物與經取代的苯并呋喃類衍生物(IB)，較佳為與(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮在有機溶劑中進行加熱反應，得到通式(V)化合物；其中：R1、R2、R4、n如通式(I)中所定義。
方案六、
本發明通式(VI)所述的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用鹽的製備方法，該方法包括以下步驟：
Figure 104140503-A0101-12-0028-32
通式(IVA)化合物與經取代的苯并呋喃類衍生物(IB)，較佳為與(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮在有機溶劑中進行加熱反應，得到通式(VI)化合物；其中：R1、R2、R4、n如式(I)中所定義。
所用溶劑包括但不限於：醋酸、甲醇、乙醇、乙腈、 四氫呋喃、二氯甲烷、二甲基亞碸、1,4-二氧六環、水、N，N-二甲基乙醯胺或N,N-二甲基甲醯胺，較佳係非極性溶劑，更佳為乙腈。
第1圖：ROMK抑制劑對SD大鼠尿量的影響；第2圖：ROMK抑制劑對SD大鼠尿鈉排泄的影響；第3圖：ROMK抑制劑對SD大鼠尿鉀排泄的影響；第4圖：ROMK抑制劑對SD大鼠血鈉的影響；第5圖：ROMK抑制劑對SD大鼠血鉀的影響。
以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制本發明的範圍。
本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
[實施例]
化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或質譜(MS)來確定的。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d 6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)，化學位移是以10-6(ppm)作為單位給定。
MS的測定用FINNIGAN LCQAd(ESI)質譜儀(生產商：Thermo，型號：Finnigan LCQ advantage MAX)。
薄層層析矽膠板使用菸臺黃海HSGF254或青島GF254 矽膠板，薄層層析法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm矽膠板。
柱層析一般使用菸臺黃海200~300目矽膠為載體。
本發明的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chcmical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。
實施例中如無特殊說明，反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。
氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。
氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。
微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。
實施例中如無特殊說明，反應中的溶液是指水溶液。
實施例中如無特殊說明，反應的溫度為室溫。
室溫為最適宜的反應溫度，溫度範圍是20℃~30℃。
實施例中的反應進程的監測採用薄層層析法(TLC)，反應所使用的展開劑的體系有：A：二氯甲烷和甲醇體系，B：正己烷和乙酸乙酯體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，D：丙酮，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節。
純化化合物採用的柱層析的洗脫劑的體系和薄層層析法的展開劑的體系包括：A：二氯甲烷和甲醇體系，B：正己烷和乙酸乙酯體系，C：正己烷和丙酮體系，D：正己烷， E：乙酸乙酯，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和酸性或鹼性試劑等進行調節。
實施例1
(R)-5-氰基-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)-4-甲氧基吡啶甲醯胺
Figure 104140503-A0101-12-0031-33
Figure 104140503-A0101-12-0031-34
第一步
5-溴-4-甲氧基吡啶甲酸
將5-溴-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯1a(250mg，1.01mmol)溶解於10mL甲醇，四氫呋喃和水(V：V：V=3：3：1)混合溶劑中，加入氫氧化鈉(100mg，2.5mmol)，攪拌反應2小時。反應液減壓濃縮，加10mL水，滴加2M鹽酸至反應液pH為2，用乙酸乙酯萃取(20mL×3)，用飽和氯化鈉 溶液(15mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到粗品標題產物5-溴-4-甲氧基吡啶甲酸1b(200mg，白色固體)，產物不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：229.9[M-1]。
第二步
4-(5-溴-4-甲氧基吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯
將粗品5-溴-4-甲氧基吡啶甲酸1b(150mg，0.65mmol)，4-胺基哌啶-1-甲酸第三丁酯(130mg，0.65mmol)，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳醯二亞胺(190mg，1mmol)，1-羥基苯并三唑(20mg，0.13mmol)和三乙胺(0.15mL，1mmol)溶解於20mL N,N-二甲基甲醯胺中，升溫至50℃，攪拌反應6小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4-(5-溴-4-甲氧基吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯1c(60mg，淡黃色油狀物)，產率：22.4%。
MS m/z(ESI)：414.1[M+1]。
第三步
4-(5-氰基-4-甲氧基吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯
將4-(5-溴-4-甲氧基吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯1c(60mg，0.15mmol)，氰化鋅(26mg，0.22mmol)和四(三苯基膦)鈀(18mg，0.015mmol)溶解於1.5mL N,N-二甲基甲醯胺中，135℃，微波反應40分鐘。反應液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4-(5-氰基-4-甲氧基吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯 1d(32mg，無色油狀物)，產率：61.5%。
MS m/z(ESI)：361.2[M+1]。
第四步
5-氰基-4-甲氧基-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺
將4-(5-氰基-4-甲氧基吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯1d(32mg，0.09mmol)溶解於5mL二氯甲烷中，加入1mL三氟乙酸，攪拌反應1.5小時。反應液減壓濃縮，加入15mL甲醇，滴加飽和碳酸氫鈉溶液至反應液pH為8，反應液減壓濃縮。用薄層層析法以展開劑體系A純化所得殘餘物，得到標題產物5-氰基-4-甲氧基-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺1e(23mg，白色黏稠物)，產率：100%。
MS m/z(ESI)：261.1[M+1]。
第五步
(R)-5-氰基-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)-4-甲氧基吡啶甲醯胺
將(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮(25mg，0.09mmol，採用專利申請“WO2010129379”公開的方法製備而得)和5-氰基-4-甲氧基-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺1e(23mg，0.09mmol)溶解於5mL乙腈中，加熱回流攪拌反應15小時。反應液減壓濃縮。用薄層層析法以展開劑體系A純化所得殘餘物，得到標題產物(R)-5-氰基-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)-4-甲氧基吡啶甲醯胺1(4.5mg，淡黃色固體)，產率：11.3%。
MS m/z(ESI)：450.2[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.88(s,1H),8.75(d,1H),7.77(s,1H),7.71-7.69(m,2H),5.43-5.40(m,2H),5.35(s,1H),5.08(s,1H),4.09(s,3H),3.78(s,1H),2.95(s,3H),2.38(s,1H),2.27(s,3H),2.25(s,2H),1.72(s,4H)。
實施例2
(R)-5-氰基-4-乙氧基-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)吡啶甲醯胺
Figure 104140503-A0101-12-0034-35
Figure 104140503-A0101-12-0034-36
第一步
6-氯-4-乙氧基菸腈
將4,6-二氯菸腈2a(500mg，2.89mmol)溶解於20mL四氫呋喃中，0℃下滴加10mL乙醇鈉(197mg，2.89mmol)的乙醇溶液，升溫至室溫，攪拌反應1小時。反應液減壓 濃縮，用薄層層析法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物6-氯-4-乙氧基菸腈2b(375mg，白色固體)，產率71%。
MS m/z(ESI)：183.1[M+1]
第二步
4-(5-氰基-4-乙氧基吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯
高壓釜中，加入6-氯-4-乙氧基菸腈2b(375mg，2.05mmol)，4-胺基哌啶-1-甲酸第三丁酯(422mg，2.05mmol)，醋酸鈀(23mg，0.1mmol)，1,3-雙(二苯基膦)丙烷(42mg，0.1mmol)，三乙胺(0.57mL，4.1mmol)和20mL乙腈，一氧化碳置換三次，壓力為10bar，升溫至80℃，攪拌反應16小時。反應液過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系A純化所得殘餘物，得到標題產物4-(5-氰基-4-乙氧基吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯2c(645mg，白色固體)，產率84%。
MS m/z(ESI)：373.2[M-1]
第三步
5-氰基-4-乙氧基-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽
將4-(5-氰基-4-乙氧基吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯2c(100mg，0.27mmol)溶解於5mL二氯甲烷中，加入1mL三氟乙酸，攪拌反應1小時。反應液減壓濃縮，得到粗品標題產物5-氰基-4-乙氧基-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽2d(110mg，黃色油狀物)，產物不經純化 直接進行下步反應。
第四步
(R)-5-氰基-4-乙氧基-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)吡啶甲醯胺
將(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮(50.7mg，0.27mmol)，粗品5-氰基-4-乙氧基-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽2d(110mg，0.27mmol)溶解於15mL乙腈中，加入碳酸鈉(56.6mg，0.53mmol)，升溫至80℃，攪拌反應48小時。反應液過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系A純化所得殘餘物，得到標題產物(R)-5-氰基-4-乙氧基-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2(50mg，淡黃色固體)，產率：40%。
MS m/z(ESI)：465.2[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 8.89(s,1H),8.74(d,1H),7.73(s,1H),7.65(s,2H),5.41(d,2H),5.09(br,1H),4.41(d,2H),3.71-3.85(m,2H),2.95(br,2H),2.41-2.55(m,2H),2.31(s,3H),2.12-2.27(m,2H),1.57-1.81(m,4H),1.40(t,3H).
實施例3
(R)-5-氰基-4-(2-氟乙氧基)-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)吡啶甲醯胺
Figure 104140503-A0101-12-0037-37
Figure 104140503-A0101-12-0037-38
第一步
6-氯-4-(2-氟乙氧基)菸腈
將2-氟乙醇(150mg，2.34mmol)溶解於10mL四氫呋喃中，加入氫化鈉(281mg，7.02mmol)，攪拌1小時。將4,6-二氯菸腈2a(405mg，2.34mmol)溶解於25mL四氫呋喃中，0℃下加入反應液，升溫至室溫，攪拌反應1小時。加入1mL水淬滅反應，反應液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物6-氯-4-(2-氟乙氧基)菸腈3a(210mg，白色固體)，產率45%。
MS m/z(ESI)：201.1[M+1]
第二步
4-(5-氰基-4-(2-氟乙氧基)吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁 酯
高壓釜中，加入6-氯-4-(2-氟乙氧基)菸腈3a(210mg，1.05mmol)，4-胺基哌啶-1-甲酸第三丁酯(216mg，1.05mmol)，醋酸鈀(12mg，0.05mmol)，1,3-雙(二苯基膦)丙烷(22mg，0.05mmol)，三乙胺(0.29mL，2.1mmol)和20mL乙腈，一氧化碳置換三次，壓力為10bar，升溫至80℃，攪拌反應16小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4-(5-氰基-4-(2-氟乙氧基)吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯3b(140mg，白色固體)，產率34%。
MS m/z(ESI)：391.1[M-1]
第三步
5-氰基-4-(2-氟乙氧基)-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽
將4-(5-氰基-4-(2-氟乙氧基)吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯3b(70mg，0.18mmol)溶解於5mL二氯甲烷中，加入1mL三氟乙酸，攪拌反應1小時。反應液減壓濃縮，得到粗品標題產物5-氰基-4-(2-氟乙氧基)-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽3c(80mg，黃色油狀物)，產物不經純化直接進行下步反應。
MS m/z(ESI)：293.1[M+1]
第四步
(R)-5-氰基-4-(2-氟乙氧基)-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)吡啶甲醯胺
將(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮(34mg，0.18mmol)，粗品5-氰基-4-(2-氟乙氧基)-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽3c(80mg，0.18mmol)溶解於20mL乙腈中，加入碳酸鈉(38mg，0.36mmol)，升溫至80℃，攪拌反應48小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系A純化所得殘餘物，得到標題產物(R)-5-氰基-4-(2-氟乙氧基)-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)吡啶甲醯胺3(10mg，白色固體)，產率：12%。
MS m/z(ESI)：481.2[M-1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 8.93(s,1H),8.79(d,1H),7.82(s,1H),7.71(d,2H),5.41(d,2H),5.14(br,1H),4.89(t,1H),4.77(t,1H),4.72(t,1H),4.65(t,1H),3.71-3.82(m,2H),2.85-3.15(m,2H),2.40-2.54(m,2H),2.31(s,3H),2.12-2.26(m,2H),1.61-1.90(m,4H).
實施例4
(R)-5-氰基-4-(二氟甲氧基)-N-(1-(2-經基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)吡啶甲醯胺
Figure 104140503-A0101-12-0039-39
Figure 104140503-A0101-12-0040-40
第一步
(2-溴-5-氯吡啶-4-基)硼酸
將2-溴-5-氯吡啶4a(2g，10.4mmol)溶解於40mL四氫呋喃中，-78℃下滴加7.8mL 2M的二異丙基胺基鋰溶液，攪拌1小時，加入三異丙基硼酸酯(2.94g，15.6mmol)，攪拌30分鐘，升溫至室溫，攪拌反應16小時。反應液中加入50mL 4%的氫氧化鈉溶液，攪拌30分鐘，分液，取水相，冰浴下滴加6M氫氧化鈉溶液至水相pH為3~4，用乙酸乙酯萃取(50mL×2)，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到粗品標題產物(2-溴-5-氯吡啶-4-基)硼酸4b(1.3g，白色固體)，產率53%。
第二步
2-溴-5-氯吡啶-4-醇
將粗品(2-溴-5-氯吡啶-4-基)硼酸4b(1.3g，5.51mmol) 溶解於40mL二氯甲烷中，加入雙氧水(1.87mL，16.5mmol)，攪拌反應16小時。反應液減壓濃縮，得到粗品標題產物2-溴-5-氯吡啶-4-醇4c(1g，白色固體)，產率88%。
MS m/z(ESI)：205.9/207.9[M+1]
第三步
2-溴-5-氯-4-(二氟甲氧基)吡啶
將粗品2-溴-5-氯吡啶-4-醇4c(320mg，1.54mmol)，2-氯-2,2-二氟乙酸鈉(470mg，3.08mmol)，碳酸鉀(470mg，3.39mmol)溶解於5mL N,N-二甲基乙醯胺中，120℃，微波反應1小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物2-溴-5-氯-4-(二氟甲氧基)吡啶4d(950mg，無色油狀物)，產率：60%。
第四步
4-(5-氯-4-(二氟甲氧基)吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯
高壓釜中，加入2-溴-5-氯-4-(二氟甲氧基)吡啶4d(1.03g，3.99mmol)，4-胺基哌啶-1-甲酸第三丁酯(800mg，3.99mmol)，醋酸鈀(45mg，0.2mmol)，1,3-雙(二苯基膦)丙烷(82mg，0.2mmol)，三乙胺(1.1mL，7.98mmol)和30mL乙腈，一氧化碳置換三次，壓力為10bar，攪拌反應16小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4-(5-氯-4-(二氟甲氧基)吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯4e(809mg，白色固體)，產率50%。
MS m/z(ESI)：404.1[M-1]
第五步
4-(5-氰基-4-(二氟甲氧基)吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯
將4-(5-氯-4-(二氟甲氧基)吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯4e(100mg，0.25mmol)，氰化鋅(57.6mg，0.49mmol)和四(三苯基膦)鈀(88mg，0.07mmol)溶解於5mL N,N-二甲基乙醯胺中，170℃，微波反應30分鐘。反應液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4-(5-氰基-4-(二氟甲氧基)吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯4f(83mg，白色固體)，產率：85%。
MS m/z(ESI)：395.0[M-1]
第六步
5-氰基-4-(二氟甲氧基)-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽
將4-(5-氰基-4-(二氟甲氧基)吡啶甲醯胺)哌啶-1-甲酸第三丁酯4f(250mg，0.63mmol)溶解於5mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，攪拌反應1小時。反應液減壓濃縮，得到粗品標題產物5-氰基-4-(二氟甲氧基)-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽4g(540mg，黃色油狀物)，產物不經純化直接進行下步反應。
MS m/z(ESI)：297.2[M+1]
第七步
(R)-5-氰基-4-(二氟甲氧基)-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)吡啶甲醯胺
將(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮(57.7mg，0.3mmol)，粗品5-氰基-4-(二氟甲氧基)-N-(哌啶-4-基)吡啶甲醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽4g(260mg，0.3mmol)和N,N-二異丙基乙胺(78.4mg，0.61mmol)溶解於3mL乙醇中，135℃，微波反應1小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析法以展開劑體系A純化所得殘餘物，得到標題產物(R)-5-氰基-4-(二氟甲氧基)-N-(1-(2-羥基-2-(4-甲基-1-羰基-1,3-二氫異苯并呋喃-5-基)乙基)哌啶-4-基)吡啶甲醯胺4(30mg，白色固體)，產率：20%。
MS m/z(ESI)：487.2[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 9.13(s,1H),8.87(d,1H),7.98(t,1H),7.83(s,1H),7.63-7.78(m,2H),5.40(d,2H),5.08(br,1H),3.70-3.81(m,2H),2.96(br,2H),2.40-2.54(m,2H),2.28(s,3H),2.11-2.26(m,2H),1.61-1.75(m,4H).
測試例： 生物學評價 測試例1、本發明化合物對人(human)ROMK和大鼠(rat)ROMK抑制活性的測定
以下方法用來測定本發明中化合物對人ROMK和大鼠ROMK活性的抑制作用。
1、實驗材料及儀器
(1)FluxORTM鉀離子通道檢測(potassium ion channel assay)(F10016，invitrogen)
(2)烏巴苷(O3125-1G，sigma)
(3)flexstation 3酶標儀(MD)
(4)人ROMK/HEK293細胞：轉染有人ROMK cDNA(NCBI序列號：NM_000220.4)與穩定表現ROMK通道的HEK293細胞株
(5)大鼠ROMK/HEK293細胞：轉染有大鼠ROMK cDNA(NCBI序列號：NM_017023.1)與穩定表現ROMK通道的HEK293細胞株
(6)HEK293細胞株：中國科學院細胞庫，GNHu43
2、實驗步驟
實驗中所用試劑除ddH2O，烏巴甘外均來自FluxORTM鉀離子通道檢測這個試劑盒，配製方法也參照試劑盒說明書
(1)提前一天在PDL(Poly-D-lysine)包被的培養板中接種人ROMK/HEK293細胞，20000個/孔；(2)過夜培養後倒掉板中的培養基，按照FluxORTM鉀離子通道檢測要求操作，加入100μL/孔染料，室溫培養90分鐘；(3)然後倒掉染料，每孔加入100μL含烏巴苷(300μM)和丙磺舒的檢測緩衝液；(4)再加入1μL化合物或DMSO到對應的反應孔中，在震盪儀上震盪30s，室溫培養30分鐘；(5)在flexstation3酶標儀中放置培養板，由機器加入25μL/孔刺激緩衝液(K2SO4：Tl2SO4：1XFluxOR Chloride-free Buffer：ddH2O=3：12：40：125)，立刻在EX/EM為490/525 nm處連續讀值5分鐘；(6)經Graphpad軟體處理prism資料得到化合物抑制人ROMK離子通道的IC50值。
重複以上實驗步驟，將人ROMK/HEK293細胞替換成大鼠ROMK/HEK293細胞，測試化合物抑制大鼠ROMK離子通道的IC50值。
本發明化合物對人ROMK或大鼠ROMK的抑制活性藉由以上的試驗進行測定，測得的IC50值見表1。
Figure 104140503-A0101-12-0045-41
結論：本發明的化合物對人ROMK或大鼠ROMK通道活性具有明顯的抑制效果，化合物的藥效高。
測試例2、本發明化合物對hERG抑制活性的測定
以下方法用來測定本發明中化合物對hERG活性的抑制作用
1、實驗材料及儀器
(1)FluxORTM鉀離子通道檢測(F10016，invitrogen)
(2)flexstation 3酶標儀(MD)
(3)hERG/HEK293細胞：轉染有人hERG cDNA(NCBI序列號：NM_000238(RC215928，origene))與穩定表現hERG 通道的HEK293細胞株
2、實驗步驟
實驗中所用試劑除ddH2O外均來自FluxORTM鉀離子通道檢測試劑盒，配製方法參照試劑盒說明書
(1)提前一天在PDL(Poly-D-lysine)包被的培養板中接種人hERG/HEK293細胞，25000個/孔；(2)過夜培養後倒掉板中的培養基，按照FluxORTM鉀離子通道檢測要求操作，加入100μL/孔染料，室溫培養90分鐘；(3)然後倒掉染料，每孔加入100μL含丙磺舒的檢測緩衝液；(4)再加入1μL化合物或DMSO到對應的反應孔中，在震盪儀上震盪30s，室溫培養30分鐘；(5)在flexstation3酶標儀中放置培養板，由機器加入25μL/孔刺激緩衝液(K2SO4：Tl2SO4：1XFluxOR Chloride-free Buffer：ddH2O=2：1：2：5)，立刻在EX/EM為490/525nm處連續讀值5分鐘；(6)經Graphpad軟體處理prism資料得到化合物對hERG這一離子通道的IC50值。
本發明化合物對hERG的抑制活性藉由以上的試驗進行測定，測得的IC50值見表2。
Figure 104140503-A0101-12-0047-42
結論：本發明的化合物對hERG通道活性的抑制作用弱，對心臟毒性低。
測試例3、電生理手動膜片鉗檢測對ROMK鉀離子通道的作用
1、實驗目的
本實驗的目的是為了檢測化合物在離體實驗中對HEK293細胞中ROMK鉀離子通道的影響。ROMK鉀離子通道穩定地表現在本發明的HEK293細胞上。在鉀離子電流穩定後，比較不同化合物濃度應用前後鉀離子電流的大小，可以得到化合物對鉀離子通道的影響。
2、實驗試劑和材料
(1)HEK293細胞：中國科學院細胞庫，GNHu43；(2)人ROMK/HEK293細胞：轉染有人ROMK cDNA(NCBI序列號：NM_000220.4)與穩定表現ROMK通道的HEK293細胞株；(3)細胞外液(mM)：NaCl,137；KCl,4；CaCl2,1.8；MgCl2,1；HEPES,10；葡萄糖10；pH 7.4(NaOH滴定)；(4)細胞內液(mM)：K Aspartate,130；MgCl2,5；EGTA 5；HEPES,10；Tris-ATP 4；pH 7.2(KOH滴定)；化合物除用於酸鹼滴定的NaOH和KOH外，均從Sigma (St.Louis,MO)公司購買。
細胞培養液：Ham’s F12培養基(Invitrogen)，10%(v/v)滅活的胎牛血清，100μg/ml潮黴素B，100μg/ml遺傳黴素(Geneticin)；手動膜片鉗系統：HEKA EPC-10信號放大器及數位轉換系統，購自德國HEKA Electronics；微操控儀器：MP-225；拉制電極儀器：PC-10(Narishige，Japan)。
3、實驗方法
測試化合物溶於二甲基亞碸(DMSO)室溫儲存，測試當天再按要求用細胞外液稀釋成下列梯度終濃度(3、10、30、100、300nM)，用於測試。測試化合物的DMSO最終濃度為0.3%。
人ROMK/HEK293細胞生長於含上述細胞培養液的培養皿中，並在37℃、含5% CO2的培養箱中進行培養。電生理實驗之前24到48小時，人ROMK/HEK293細胞被轉移到放置於培養皿中的圓形玻璃片上，並在以上相同的培養液及培養條件下生長。每個圓形玻片上人ROMK/HEK293細胞的密度需要達到絕大多數細胞是獨立、單個的要求。
本實驗採用手動膜片鉗系統作全細胞電流的記錄。表面生長有人ROMK/HEK293細胞的圓形玻片被放置於倒置顯微鏡下的電生理記錄槽中。記錄槽內以細胞外液作持續灌流(大約每分鐘1毫升)。實驗過程採用常規全細胞膜片鉗電流記錄技術。如無特殊說明，實驗都是在常規室溫下 進行(~25℃)。細胞鉗制在-80mV的電壓下。細胞鉗制電壓去極化到+20mV以啟動ROMK鉀通道，5秒後再鉗制到-50mV以消除失活並產生尾電流。尾電流峰值用作ROMK電流大小的數值。上述步驟所記錄的ROMK鉀電流在記錄槽內持續的細胞外液灌流下達到穩定後則可以疊加灌流待測試的藥物，直到藥物對ROMK電流的抑制作用達到穩定狀態。一般以最近的連續3個電流記錄線重合作為判斷是否穩定狀態的標準。達到穩定態勢以後以細胞外液灌流沖洗直到ROMK電流回復到加藥物之前的大小。一個細胞上可以測試一個或多個藥物，或者同一種藥物的多個濃度，但是在不同藥物之間需要以細胞外液沖洗。
4、資料分析
試驗資料由HEKA Patchmaster，XLFit以及Graphpad Prism提供的資料分析軟體進行分析，參見表3。
Figure 104140503-A0101-12-0049-43
結論：本發明的化合物對ROMK鉀離子通道抑制作用較強。
測試例4、電生理手動膜片鉗檢測對hERG鉀離子通道的作用
1、實驗目的
本實驗的目的是為了檢測化合物在離體實驗中對CHO 細胞中hERG鉀離子通道的影響。hERG鉀離子通道穩定地表現在本發明的CHO細胞上。在鉀離子電流穩定後，比較不同化合物濃度應用前後鉀離子電流的大小，可以得到化合物對鉀離子通道的影響。
2、實驗試劑和材料
(1)CHO細胞株：丹麥Sophion Bioscience公司；(2)hERG/CHO細胞：轉染有人hERG cDNA(NCBI序列號：NM_000238(RC215928，origene))與穩定表現hERG通道的CHO細胞株；(3)細胞外液(mM)：EC 0.0.0 NaCl-林格氏溶液(Ringer’s solution)，NaCl,145；KCl,4；CaCl2,2；MgCl2,1；HEPES,10；葡萄糖10；pH 7.4(NaOH滴定)，滲透壓~305mOsm；(4)細胞內液(mM)：IC 0.0.0 KCl-林格氏溶液，KCl,120，CaCl2,5.374，MgCl2,1.75；EGTA 5；HEPES,10；Na-ATP 4；pH 7.25(KOH滴定)，滲透壓~295mOsm；化合物除用於酸鹼滴定的NaOH和KOH外，均從Sigma(St.Louis,MO)公司購買。
細胞培養液：Ham’s F12培養基(Invitrogen)，10%(v/v)滅活的胎牛血清，100μg/ml潮黴素B，100μg/ml遺傳黴素；手動膜片鉗系統：HEKA EPC-10信號放大器及數位轉換系統，購自德國HEKA Electronics；微操控儀器：MP-225；拉制電極儀器：PC-10(Narishige，Japan)。
3、實驗方法
在試驗之前，首先用DMSO以梯度稀釋的方式稀釋成30、10、3、1、0.3和0.1mM的貯備液，再用細胞外液稀釋成最終的將化合物稀釋成下列濃度(30、10、3、1、0.3和0.1μM)來作測試。各濃度測試溶液中DMSO的最終濃度為0.1%。所有的貯備液和測試溶液都經過5-10分鐘的超音波和振盪以保證化合物完全溶解。
CHO hERG細胞生長於含上述細胞培養液的培養皿中，並在37℃、含5% CO2的培養箱中進行培養。電生理實驗之前24到48小時，CHO hERG細胞被轉移到放置於培養皿中的圓形玻璃片上，並在以上相同的培養液及培養條件下生長。每個圓形玻片上CHO hERG細胞的密度需要達到絕大多數細胞是獨立、單個的要求。
本實驗採用手動膜片鉗系統作全細胞電流的記錄。表面生長有CHO hERG細胞的圓形玻片被放置於倒置顯微鏡下的電生理記錄槽中。記錄槽內以細胞外液作持續灌流(大約每分鐘1毫升)。實驗過程採用常規全細胞膜片鉗電流記錄技術。如無特殊說明，實驗都是在常規室溫下進行(~25℃)。細胞鉗制在-80mV的電壓下。細胞鉗制電壓去極化到+20mV以啟動hERG鉀通道，5秒後再鉗制到-50mV以消除失活並產生尾電流。尾電流峰值用作hERG電流大小的數值。上述步驟所記錄的hERG鉀電流在記錄槽內持續的細胞外液灌流下達到穩定後則可以疊加灌流待測試的藥物，直到藥物對hERG電流的抑制作用達到穩定狀態。一 般以最近的連續3個電流記錄線重合作為判斷是否穩定狀態的標準。達到穩定態勢以後以細胞外液灌流沖洗直到hERG電流回復到加藥物之前的大小。一個細胞上可以測試一個或多個藥物，或者同一種藥物的多個濃度，但是在不同藥物之間需要以細胞外液沖洗。
4、資料分析
試驗資料由HEKA Patchmaster，XLFit以及Graphpad Prism提供的資料分析軟體進行分析，參見表4。
Figure 104140503-A0101-12-0052-44
結論：本發明的化合物對hERG鉀離子通道抑制作用較弱，對心臟毒性低。
測試例5、本發明化合物的藥物代謝動力學測試
1、摘要
以大鼠為受試動物，應用LC/MS/MS法測定了大鼠灌胃給予實施例化合物後不同時刻血漿中的藥物濃度。研究本發明的化合物在大鼠體內的藥代動力學行為，評價其藥動學特徵。
2、試驗方案
2.1試驗藥品
實施例1化合物。
2.2試驗動物
健康成年SD大鼠4只，雌雄各半，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK(滬)2008-0016。
2.3藥物配製
秤取適量樣品，加入0.5% CMC-Na至終體積，超音波製成0.5mg/ml混懸液。
2.4給藥
SD大鼠4只，雌雄各半，禁食一夜後分別灌胃給藥，劑量為5.0mg/kg，給藥體積10mL/kg。
3、操作
於給藥前及給藥後0.5、1、2、4、6、8、11、24小時採血0.1mL，置於EDTA抗凝試管中，3500rpm離心10分鐘，分離血漿，於-20℃保存。給藥後2小時進食。
用LC/MS/MS法測定不同化合物灌胃給藥後大鼠血漿中的待測化合物含量。血漿樣品經沉澱蛋白預處理後進行分析。
4、藥代動力學參數結果
本發明化合物的藥代動力學參數見表5。
Figure 104140503-A0101-12-0054-45
測試例6、ROMK抑制劑對SD大鼠的利尿效果實驗報告
1．實驗目的
評估ROMK抑制劑陽性對照藥物和化合物1對正常大鼠的利尿藥效。
2．實驗方法和實驗材料
2.1．實驗動物和飼養條件
實驗用SD雄性大鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司(中國上海，合格證編號2008001647752，許可證SCXK(滬)2013-0016)，購入時120-130g，5只/籠飼養，12/12小時光/暗週期調節，溫度23±1℃恒溫，濕度50~60%，自由進食進水。動物購進後，進行7天適應性飼養後開始實驗。
2.2．實驗藥品
化合物1；
陽性對照藥結構如下：
Figure 104140503-A0101-12-0055-46
0.9%氯化鈉溶液(500ml：4.5g)。
羧甲基纖維素鈉(CMC．Na)：批號為20131022，國藥集團化學試劑有限公司。
鈉檢測試劑盒：批號20150203，由南京建成生物公司提供。
鉀檢測試劑盒：批號20141112，由南京建成生物公司提供。
藥物劑量均按鹼基計算。
2.3．實驗設計和實驗方法
2.3.1.動物分組：
大鼠適應性飼養後，分組如下：
Figure 104140503-A0101-12-0055-47
2.3.2.實驗方法：
實驗方法按照專利(WO2010129379A1)中方法進行。將至 少適應性餵養的SD大鼠置於代謝籠中禁食過夜，秤完體重後隨機分成以下幾組：空白對照組，化合物1受試藥0.03mg/kg組和0.1mg/kg組、陽性對照藥組0.03mg/kg和組0.1mg/kg，每組大鼠10只。每只大鼠單次灌胃(i.g.，1ml/kg)各化合物，空白組灌胃相應的溶劑，灌胃後將鼠置於一般的籠盒，30min後給予25ml/kg生理鹽水，之後立即將大鼠放入代謝籠，禁食禁水，收集並計量4h的總尿量，測定4h的尿鈉和尿鉀排泄量。並於收集尿液後眼眶採血收集血清檢測血鈉和血鉀濃度。
2.4.實驗儀器
室溫離心機：型號5417C，由Eppendorf提供。
2.5．資料表達和統計學處理
實驗資料表示為平均數(Mean)±標準差(S.D.)。採用excel軟體t檢驗進行統計比較。將給藥組與空白對照組資料進行分析比較，是否存在顯著數理統計意義，*P<0.05表示給藥組與空白對照組比較具有顯著性差異，**P<0.01表示給藥組與空白對照組比較具有高度顯著性差異。
3．結果
實驗結果顯示，與空白對照組比較，陽性對照藥0.03mg/kg組和0.1mg/kg組尿量明顯增加(P<0.05)，尿量分別增加1.41倍和1.46倍，化合物1受試藥0.03mg/kg組和0.1mg/kg組尿量顯著增加(P<0.01)，尿量分別增加2.76倍和3.22倍(見第1圖)；陽性藥和各化合物1受試藥組尿鈉排泄顯著增加(P<0.01)，尿鈉排泄分別增加1.57倍、1.65 倍、3.12倍和3.31倍(見第2圖)；和正常對照組相比，陽性藥和受試藥尿鉀雖略有升高但無統計學意義(見第3圖)；同時，陽性藥和各受試藥組的血鈉和血鉀變化不大(P>0.05)(見第4和5圖)。
4．討論
根據功能特性的不同，K+通道可分為以下四種類型：慢(延遲)K+通道(K通道)、快(早期)K+通道(A通道)、Ca2+活化的K+通道〔K(Ca)通道〕和內向整流的K+通道四類。內向整流的K+通道(inwardly rectifying K channels，Kir)家族又分為七種類型：Kir1~Kir7，分別有不同的KCNJ基因編碼。腎外髓質分泌鉀通道(renal outer medullary potassium channel，ROMK)主要屬於Kir1型，在鼠腎中至少存在三種亞型的ROMK通道：ROMK1、ROMK2和ROMK3型，ROMK2大部分分佈於髓袢粗升支；ROMK1和ROMK3主要在集合管上表現。表現於髓袢粗升支的ROMK與Na/K/Cl轉運體一起調節鉀離子的分泌和重吸收，表現於皮質集合小管的ROMK與Na/K轉運體一起調節鉀離子的分泌，阻斷ROMK位點既可以促進NaCl分泌到管胺，又不至於使血鉀過度降低導致低鉀血症，是高血壓患者一個良好的利尿劑研究方向，本實驗主要探討ROMK抑制劑的利尿效果。
本次實驗過程中，受試藥化合物1溶解性很好，沒有出現分層現象，但陽性對照藥在秤取過程中有靜電，不易秤取，且在研磨初期結團不易溶解，充分研磨後溶解良好。 此次結果也顯示，與正常組比較，單次口服灌胃化合物1和陽性對照藥對大鼠具有明顯的利尿排鈉的作用，且受試藥化合物1和陽性對照藥各劑量間呈劑量依賴。
5．結論
受試藥化合物1和受試藥陽性對照藥均具有明顯的利尿排鈉效果，且對血鉀無影響；但化合物1的利尿藥效明顯優於陽性對照藥，各組間藥效呈劑量依賴。
Figure 104140503-A0101-11-0003-3

Claims (16)

  1. 一種通式(II)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其可藥用的鹽，
    Figure 104140503-A0305-02-0062-1
     其中：R1為含有1至6個碳原子的烷基，其中該烷基視需要進一步經一個或多個鹵素所取代；R2為氫原子；R4為氫原子或含有1至6個碳原子的烷基；n為2。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的通式(II)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其可藥用的鹽，其中R1為甲基、乙基或丙基。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的通式(II)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其可藥用的鹽，其為通式(III)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其可藥用的鹽，
    Figure 104140503-A0305-02-0063-2
     其中：R1、R2、R4、n如申請專利範圍第1項中所定義。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任意一項所述的通式(II)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其可藥用的鹽，該化合物選自：
    Figure 104140503-A0305-02-0063-12
  5. 一種通式(IA)所述的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其可藥用的鹽，
    Figure 104140503-A0305-02-0064-4
     其中：R1為含有1至6個碳原子的烷基，其中該烷基視需要進一步經一個或多個鹵素所取代；R2為氫原子；n為2。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的通式(IA)所示的化合物 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其可藥用的鹽，其為：
    Figure 104140503-A0305-02-0064-6
  7. 一種製備如申請專利範圍第1項所述的通式(II)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其可藥用的鹽的方法，該方法包括：
    Figure 104140503-A0305-02-0064-5
     通式(IA)化合物與經取代的苯并呋喃類衍生物(IB)加熱反應，得到通式(II)化合物；其中：R1至R3、n如申請專利範圍第1項中所定義。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的方法，苯并呋喃類衍生物(IB)為(R)-4-甲基-5-(環氧乙烷-2-基)異苯并呋喃-1(3H)-酮。
  9. 一種藥物組成物，其含有治療有效量的如申請專利範圍第1至4項中任意一項所述的通式(II)所示的化合物以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
  10. 一種如申請專利範圍第1至4項中任意一項所述的通式(II)所示的化合物在製備腎外髓質分泌鉀通道(ROMK)抑制劑中的用途。
  11. 一種如申請專利範圍第9項所述的藥物組成物在製備腎外髓質分泌鉀通道(ROMK)抑制劑中的用途。
  12. 一種如申請專利範圍第1至4項中任意一項所述的通式(II)所示的化合物在製備治療高血壓和/或心臟衰竭的藥物中的用途。
  13. 一種如申請專利範圍第9項所述的藥物組成物在製備治療高血壓和/或心臟衰竭的藥物中的用途。
  14. 一種如申請專利範圍第1至4項中任意一項所述的通式(II)所示的化合物在製備治療腎外髓質分泌鉀通道(ROMK)介導的疾病的藥物中的用途，該疾病係選自肝硬化、急性和慢性的腎功能不全、腎病症候群、肺動脈 高血壓、心血管疾病、肺張力過強和腎結石。
  15. 一種如申請專利範圍第9項所述的藥物組成物在製備治療腎外髓質分泌鉀通道(ROMK)介導的疾病的藥物中的用途，該疾病係選自肝硬化、急性和慢性的腎功能不全、腎病症候群、肺動脈高血壓、心血管疾病、肺張力過強和腎結石。
  16. 如申請專利範圍第14或15項所述的用途，其中，該心血管疾病為心肌梗塞、中風、心功能不全、動脈粥樣硬化。
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