TWI707041B - 減少引子二聚體擴增的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明於多重聚合酶連鎖反應(PCR)中減少引子二聚體擴增。當第一正向引子(F1)與第二逆向引子(R2)於其3’末端具有互補區域時，引子二聚體可形成。本發明之方法使用在第一標籤(t1)與R2間包含第一正向引子之5’末端部分序列或完整序列的引子(F1^)以減少引子二聚體(F1_R2)擴增。
Description
本發明係關於在多重聚合酶連鎖反應(PCR)中減少引子二聚體擴增的方法。
通過EFS-Web隨本說明書同時呈送呈ASCII格式的文字檔，檔名為序列表.txt，創造日為2016年6月16日，且大小為3.14千位元組的序列表。通過EFS-Web提申的序列表係本說明書之一部份且係以其整體以引用方式納入本文中。
多重PCR由於單一PCR混合物內的複數個引子組組成以製造不同DNA序列特有的擴增物。藉由同時瞄準複數個基因，可從單一測試運行獲得額外的資訊，其否則會需要數倍的試劑與努力以進行。
可減低多重PCR之分析敏感性的主要障礙之一係引子二聚體(PD)之累積。PD係由由於互補鹼基之連串(特別是位於引子之3’末端)而彼此雜合的引子分子組成。於多重PCR反應中非常高濃度的許多引
子對之存在會增加形成引子二聚體之機會。一旦形成後，短的PD傾向會非常有效地擴增，而潛在地藉由大量消耗引子與其他試劑而抑制所欲的DNA序列之擴增。PD形成可藉由不同方法(包含特殊的引子設計與修改方法、使用熱起始Taq聚合酶、PCR添加物與經最佳化PCR循環條件)之組合減少。
用於減少PD形成的種種引子設計與修改方法已被報導過。Brownie等人(Nucleic Acids Res,25(16)：3235-41,1997)描述了以相同標籤協助的非二聚體系統(Homo-Tag Assisted Non-Dimer System，HANDS)。於HANDS PCR中，所有的目標專一性引子皆含有低濃度的於其5’末端的共同尾部序列且係與較高濃度的單一尾部專一性引子混合。在至少二個目標專一性PCR之循環後，退火溫度為了完全由尾部專一性引子驅動的後續擴增循環而被提高。因此，來自所有PCR產物(包含所欲的擴增物與副產物，諸如PD)之單一股具有導致相同莖-環結構之形成的互補的5’與3’末端。由於尾部序列之高局部濃度，於短產物(諸如PD)中形成的莖-環結構係非常穩定的且競爭性排除尾部專一性引子之後續退火，造成PD擴增之抑制。然而，由於在所有引子之各個末端上使用相同的尾部序列，此方法需要所瞄準的擴增物足夠長以最小化莖環對真正的目標產物的抑制功效。取決於高度多重的PCR中所瞄準的擴增物之長度與組成，各個擴增物之莖環之緊密性會有變化，其可能導致顯著不平衡的擴增。此外，莖環可能穩定程度不足以抑制長引子間的PD形成。
美國專利編號5,792,607(Backman等人)與美國專利申請案公開編號20140329245揭示了使用內切核酸酶IV以剪切掉經引子之經修改
不可延伸的3’以在專一性引子-模板雜合後活化引子的方法。Dobosy等人(BMC Biotechnol.11：80,2011)報導了使用RNA酶H以剪切掉位置接近經封阻引子之3’末端的單一RNA鹼基以在引子-模板專一性雜合後活化引子的RNA酶H依賴性PCR(rhPCR)方法。此方法最近被IDT(Integrated DNA Technologies)商業化(美國專利申請案公開編號2009/0325169、PCT/US2012/030413)。所述方法之每一者皆需要經修改的引子中的鹼基與用於引子活化的另外的酵素，其造成較高的花費。
Peleg等人(Appl.Environ.Microbiol.,75：6393-6398,2009；WO/2009/004630)報導了PCR中DNA-RNA嵌合性引子會減少PD形成。雙重引發性寡核苷酸(Dual Priming Oligonucleotide，DPO)引子(Seegene Technologies)已被報導會減少PCR PD形成(Chun等人，Nucleic Acids Res.35(6)：e40,2007)。DPO包含兩個藉由聚去氧肌苷連接子連結的分開的引發區域(5'末端穩定子與3'末端決定子)。引子之非專一性雜合(諸如PD)由於包含聚去氧肌苷連接子之弱輕鍵的類「泡泡」結構而於DPO引子之3’末端減少。以上嵌合性引子中的RNA鹼基與DPO引子中的聚去氧肌苷連接子會顯著地增加引子製造之複雜性與花費。
Scatterfield(J.Mol.Diagn.,16：163-173,2013)報導了由通過聚乙二醇連接子以5’至5’或5’至3’連接的兩個DNA序列組成的合作性引子。結果表明使用合作性引子的單重PCR反應在添加的引子二聚體之存在下大大地減少了引子-引子增殖。
儘管有所述努力，PD形成仍然是多重PCR中的一大挑戰。尤其，當於相同的PCR反應池中存在數百或甚至數千個引子時，對於次世
代定序(next generation sequencing，NGS)應用中的目標富集的多重性水平極高。所述引子之每一者皆可能潛在地形成引子二聚體。
圖1A闡明了用於擴增兩個目標序列的PCR之第一循環與第二循環，其中t1F1、t2R1、t3F2、與t1F1^ R2係作為引子。圖1B闡明了F1與R2之交互作用、與引子二聚體之形成、擴增、與抑制。
圖2顯示F1與R2於其3'末端具有7個互補的鹼基並形成引子二聚體。
圖3顯示來自1-階段PCR擴增(上半圖)與2-階段PCR擴增(下半圖)的PCR產物之凝膠電泳之結果。第1道：1-重擴增物1、第2道：1-重擴增物2、第3-8道：2-重，使用引子t1_F1^x_R2，其中x分別=0、3、6、9、12、15個核苷酸。第M道：50個鹼基DNA梯。
「擴增物」係一片DNA或RNA，其係天然或人工擴增或複製事件之來源及/或產物。於此前後文中，「擴增」係關於基因片段或目標序列(具體言之是擴增物)之一或多個複本之產生。關於擴增反應之產物，擴增物可與一般實驗室術語(諸如PCR產物)互換使用。
「引子二聚體」(PD)係PCR中的潛在副產物。PD由由於引子中的互補性鹼基而彼此雜合的引子分子組成。
本發明係針對用於在多重聚合酶連鎖反應(PCR)中減少引子二聚體擴增的方法。當第一正向引子(F1)與第二逆相引子(R2)於其3’末端具有互補區域時，則可能發生引子二聚體形成。由於引子之高濃度，互補區域可能短至2-3個核苷酸就造成引子二聚體擴增。當互補區域係至少4或5個核苷酸時，幾乎可以肯定非所欲的引子二聚體擴增會發生。
本發明之方法在第一正向引子(F1)與第二逆相引子(R2)於其3’末端具有互補區域時減少引子二聚體問題。該方法包含以下步驟：(a)獲得包含第一標籤(t1)以及與第一目標核酸片段互補的第一正向引子(F1)的第一核酸序列，(b)獲得包含第二標籤(t2)以及與該第一目標核酸片段互補的第一逆相引子(R1)的第二核酸序列，(c)獲得包含第三標籤(t3)以及與第二目標核酸片段互補的第二正向引子(F2)的第三核酸序列，(d)獲得包含該第一標籤(t1)、與該第二核酸片段互補的第二逆相引子(R2)、以及在該第一標籤(t1)與該第二逆相引子(R2)之間的第一正向引子之5’末端部分序列(F1^)或完整序列的第四核酸序列，(e)混合該第一與第二目標核酸片段、該第一、該第二、該第三、與該第四核酸序列、與有效量的進行聚合酶連鎖反應(PCR)所需的試劑；與(f)進行PCR。
F1、R1、F2、R2係基因專一性引子，其與基因組DNA(目標DNA或擴增物)之特殊區域互補。所述引子之長度可由所屬技術領域中具有通常知識者挑選。一般而言，該等基因專一性引子之長度係6-40個、10-50個、或10-100個核苷酸。例如，所述基因專一性引子可為15-30個核苷酸。
F1^係於R2引子之5'末端加上標籤的F1引子序列之5’部
分；F1^為F1之部分序列。F1^之長度可取決於其GC含量，其當其與互補性鹼基雜合時會影響其之融點。在一個具體態樣中，F1^之部分序列比F1短1-20個、1-10個、或1-5個核苷酸。在一個具體態樣中，F1^之部分序列含有10-50%、20-80%、30-70%、40-90%、或50-90%的F1序列。在另一個具體態樣中，F1^之部分序列含有3-30個、或5-20個、或8-15個核苷酸。
標籤t1、t2、與t3係不與目標DNA結合的一般標籤序列。在一個具體態樣中，標籤t2與t3具有完全相同的序列。在另一個具體態樣中，t2與t3係不同的，即其並非100%完全相同的。標籤t2與t3兩者皆與標籤t1不同。各個標籤係位於基因專一性引子之5’末端。於本發明中，所述標籤序列長度係至少3個核苷酸，且可為5-100個、3-40個、或10-30個核苷酸長。典型地，標籤被設計成相較於未加標籤的基因專一性引子之融解溫度會加至少5℃。標籤序列可為經修改的或未修改的核酸。許多經修改的鹼基(例如鎖核酸或胜肽核酸)相較於其對應的天然鹼基具有較高的降溫貼合溫度。當由於種種理由想要較短的標籤序列時，可使用所述經修改的鹼基取代天然鹼基。
圖1A與1B係用於闡明目的且本發明非意欲受限於僅僅圖式。圖1A顯示有兩個無重疊區域的目標序列的典型PCR擴增。圖1B顯示透過F1與R2引子的PD形成與透過莖-環結構的PD累積之抑制。
圖1B闡明本發明如何預防引子二聚體之指數性擴增。於圖1B中，正向引子F1與逆向引子R2於其3’末端具有互補區域。在循環1後，PD股1與PD股2形成。於循環2中，在左側，PD股2形成莖環，其中t1與F1^分別降溫貼合至其互補配對物而形成一莖，而剩下的核苷酸形
成一環。由於t1與F1^以及其各自之互補配對物之高局部濃度(即其係在相同PD股2上且係彼此接近)，相較於與分開的t1F1引子降溫貼合，更傾向形成莖環；因此，進一步引子降溫貼合被封阻，且無法獲得PD股2之進一步擴增產物。對於完全封阻引子(t1_F1)降溫貼合至PD股2與然後的PD股2之擴增而言，F1^之存在係重要的。沒有F1^，引子t1_F1可能會競爭性排除僅僅含有t1的莖結構且然後降溫貼合至PD股2。在添加F1^下，引子t1_F1無法再競爭性排除含有t1_F1^的莖結構以降溫貼合至PD股2。
對於圖1B之循環2，在右側，與PD股2類似，PD股1亦形成莖環，其中t1與F1^分別降溫貼合至其互補配對物而形成一莖，而剩下的核苷酸形成一環。因為加上標籤的R2引子(t1_F1^_R2)之長度較長且因此融解點較高，此引子對於降溫貼合可競爭性排除於莖中的t1_F1^，且對於PD股1可能的線性擴增可被獲得。圖1B闡明了本發明，使用t1F1與t1_F1^_R2的引子設計，PD對於一股最多可線性擴增，且不會指數地擴增。
於本發明之方法之步驟(f)中，PCR可以一階段(一個循環條件)或二階段(二個不同的循環條件)進行。於二階段PCR中，降溫貼合溫度於第二循環條件中增加，其進一步減少引子二聚體形成。
於一階段中，PCR包含以下步驟：(f1)活化(e)之混合物中的DNA聚合酶與變性(e)之混合物中的DNA，與(f2)通過PCR之變性、降溫貼合與引子延伸步驟數次來循環(f1)之混合物以獲得擴增產物。
於二階段中，PCR包含以下步驟：(f-i)活化(e)之混合物中的DNA聚合酶與變性(e)之混合物中的DNA，(f-ii)通過PCR之變性、降溫貼合與引子延伸步驟至少二次來循環(f-i)之混合物，與(f-iii)以高於步驟(f-ii)中者
的降溫貼合溫度通過PCR之變性、降溫貼合與引子延伸步驟循環(f-i)之混合物以獲得擴增產物。
於二階段PCR中，於步驟(f-ii)中，核酸與試劑之混合物經歷變性、降溫貼合與引子延伸步驟之PCR之循環至少二次，諸如2-5次。於步驟(f-iii)中，(f)之混合物經歷更多次變性、降溫貼合與引子延伸之PCR之循環；這次於高於步驟(f-ii)中者的降溫貼合溫度。例如，步驟(f-iii)中的降溫貼合溫度比步驟(f-ii)中的降溫貼合溫度高約4-35℃、或5-25℃、或6-20℃、或6-15℃。例如，第一降溫貼合與延伸之循環(步驟f-ii)之第一溫度係58-62℃，例如60℃，且第二降溫貼合與延伸之循環(步驟f-iii)之第二溫度係66-70℃，例如68℃。
於二階段PCR中，第二階段(f-iii)中的降溫貼合溫度被增加以預防引子二聚體之重複起始。在PCR之第一階段(f-ii)後，各個經擴增的目標序列產物在兩個末端皆被標籤延長且因此降溫貼合區域被標籤延長。因此，於第二階段中增加降溫貼合溫度不會影響降溫貼合至專一目標DNA的引子。然而，於第二階段中增加降溫貼合溫度會減少引子二聚體起始，於其中互補區域維持相同長度。
以下實施例進一步闡明本發明。所述實施例僅係意欲用於闡明本發明而不應被理解成限制。
表1顯示用於以下實施例的寡核苷酸序列。
表1
表1中的Oligo 1-4係無標籤序列的針對BRCA1基因擴增物1與擴增物2的目標專一性引子；擴增物1與擴增物2不具有重疊序列。Oligo 5-6為來自Illumina TSCA標籤序列的標籤序列。Oligo 7-15為於實施例1-3中使用的加標籤引子。
F1與R2於其3'末端具有7個互補的鹼基且形成雜二聚體，如於圖2中顯示的。
表2顯示包含PD的擴增物大小，與在人類基因組19上的位置。
表3顯示於實施例1、2與3中的引子組合之資訊。
一典型的基因專一性PCR之25μL PCR反應混合物包含：2μL的人類基因組DNA(Promega Cat# G3041，使用Low TE緩衝液(USB Cat# 75793)稀釋至5ng/μL)、12.5μL的2x Master Mix(Qiagen Cat# 206413)、8.5μL無核酸酶水、與2μL的基因專一性引子混合物(各2.5μM，關於混合資訊，參見表3，而關於寡核苷酸序列，參見表1)。
1-重與2-重PCR反應兩者皆在熱循環儀上如下進行：
於此實施例中，降溫貼合與延伸溫度在循環期間維持恆定；因此，其被稱為1-階段PCR擴增。
使用與實施例1中者類似的PCR反應混合物，但在熱循環儀上使用2-階段PCR循環方案。首五個降溫貼合與延伸之循環係於60℃(與實施例1中使用者相同的溫度)下進行；後續25個降溫貼合與延伸之循環係於68℃的增加的溫度下進行以抑制引子二聚體之起始。
2-階段PCR方案係如下列出：
PCR產物係在E-Base儀器(Life Technologies)上分析。將2μL的各個PCR產物與18μL無核酸酶水混合且然後直接裝載到2% E-gel上。進行經稀釋的PCR產物與50bp DNA梯(Invitrogen Cat# 10488-043)之DNA電泳。於運行之最後，藉由E-gel成像器(Life Technologies)捕捉凝膠之數位影像。結果係於圖3中顯示。
於圖3中，上半圖顯示來自1-階段PCR方案(實施例1)的結果且下半圖顯示來自2-階段PCR方案(實施例2)的結果。第1與2道為顯示所瞄準的擴增物1與2之尺寸的1-重PCR。剩下的反應皆為2-重PCR(第3-8道)。當此二擴增物混合在一起時，由於F1與R2之3’末端之強交互作用，F1+R2二聚體擴增物形成且在1-階段與2-階段PCR條件兩者下皆佔PCR反應中的主要者(如於第3道顯示的)。於第4-8道中於PD中形成的莖結構分別除了F1序列之5’末端部分之3、6、9、12與15個核苷酸外含有t1序列(20nt)。與於第3道(無F1序列)中偵測到者相比，導入部分F1序列減少了於第4-8道中偵測到的二聚體量。當二聚體擴增被充分抑制時，所瞄準的擴增物變得可偵測(上半圖之第6道與下半圖之第5道)。當於上半與下半圖兩者中於第7-8道中達成二聚體擴增之幾乎完全抑制時，所瞄準的擴增物之兩個產物佔反應中的主要者。
本發明(以及製造與使用其的方法與程序)現已使用如此完整、清楚、簡潔與確切的術語描述以使所屬技術領域中具有通常知識者能夠製造與使用之。應瞭解以上者描述了本發明之較佳具體態樣且可於其中
作修改而不偏離申請專利範圍中提出的本發明之範圍。為明確地指出與清楚地請求被視為本發明的標的，以下申請專利範圍為本說明書作結束。
<110> 上海真固生物科技有限公司(PILLAR BIOSCIENCES INC.)
<120> 減少引子二聚體擴增的方法
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Claims (11)
- 一種於多重聚合酶連鎖反應(PCR)中減少引子二聚體擴增的方法，其包含以下步驟：(a)獲得包含第一標籤(t1)以及與第一目標核酸片段互補的第一正向引子(F1)的第一核酸序列，(b)獲得包含第二標籤(t2)以及與該第一目標核酸片段互補的第一逆向引子(R1)的第二核酸序列，(c)獲得包含第三標籤(t3)以及與第二目標核酸片段互補的第二正向引子(F2)的第三核酸序列，(d)獲得包含該第一標籤(t1)、與該第二核酸片段互補的第二逆向引子(R2)、以及在該第一標籤(t1)與該第二逆向引子(R2)間的該第一正向引子F1之5’末端部分序列(F1^)或完整序列的第四核酸序列，其中該第一正向引子(F1)與該第二逆向引子(R2)於其3’末端具有互補區域，F1^具有F1序列從5’末端開始的3-30個核苷酸或40-90%，(e)混合該第一與該第二目標核酸片段、該第一、該第二、該第三、與該第四核酸序列、與有效量的進行聚合酶連鎖反應(PCR)所需的試劑；與(f)進行PCR。
- 根據申請專利範圍第1項的方法，其中步驟(f)包含：(f1)活化(e)之混合物中的DNA聚合酶並變性(e)之混合物中的DNA，(f2)通過PCR之變性、降溫貼合與引子延伸步驟來循環(f1)之混合物數次以獲得擴增產物。
- 根據申請專利範圍第1項的方法，其中步驟(f)包含： (f-i)活化(e)之混合物中的DNA聚合酶與變性(e)之混合物中的DNA，(f-ii)通過PCR之變性、降溫貼合與引子延伸步驟來循環(f-i)之混合物至少二次，與(f-iii)以高於步驟(f-ii)中的降溫貼合溫度之降溫貼合溫度，通過PCR之變性、降溫貼合與引子延伸步驟來循環(f-ii)之混合物數次以獲得擴增產物。
- 根據申請專利範圍第3項的方法，其中步驟(f-iii)中的降溫貼合溫度比步驟(f-ii)中的降溫貼合溫度高4-35℃。
- 根據申請專利範圍第1項的方法，其中標籤t3與t2具有相同的序列。
- 根據申請專利範圍第1項的方法，其中標籤t3與t2兩者之序列皆與標籤t1之序列不同。
- 根據申請專利範圍第1項的方法，其中F1^具有F1序列從5’末端開始的3-30個核苷酸。
- 根據申請專利範圍第4項的方法，其中F1^具有F1序列從5’末端開始的3-30個核苷酸。
- 根據申請專利範圍第1項的方法，其中F1^具有F1序列從5’末端開始的40-90%。
- 根據申請專利範圍第4項的方法，其中F1^具有F1序列從5’末端開始的40-90%。
- 根據申請專利範圍第1項的方法，其中F1、F2、R1和R2是基因基因專一性引子。
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- 2016-09-30 TW TW105131614A patent/TWI707041B/zh active
Patent Citations (1)
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