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TWI794145B - 包含整合性帶通濾波器之光學裝置陣列 - Google Patents

包含整合性帶通濾波器之光學裝置陣列 Download PDF

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TWI794145B
TWI794145B TW105134745A TW105134745A TWI794145B TW I794145 B TWI794145 B TW I794145B TW 105134745 A TW105134745 A TW 105134745A TW 105134745 A TW105134745 A TW 105134745A TW I794145 B TWI794145 B TW I794145B
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TW201727141A (zh
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拉維 薩克森納
安妮特 格羅特
尼古拉斯 塔克
皮拉 岡薩雷斯
伯特 杜伯斯
席夢尼 塞維
Original Assignee
美商加州太平洋生物科學公司
校際微電子研究中心
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Abstract

本發明提供整合性光學裝置陣列及該等陣列之生產方法。該等裝置包括整合性帶通濾波器層，該整合性帶通濾波器層包含具有不同中心帶通波長之至少兩個多空腔濾波器元件。該等裝置陣列在以高密度的大量高度多工之光學反應之分析中為有用的，該等高度多工之光學反應包括生化反應，諸如核酸定序反應。該等裝置提供來自光源的光激發能量至該等光學反應之有效及可靠耦合。自該等反應發射的光學信號因此可以高靈敏度及鑑別量測。該等裝置陣列極適合於小型化及高通量。

Description

包含整合性帶通濾波器之光學裝置陣列
本發明係有關於包含整合性帶通濾波器之光學裝置陣列及生產方法。
發明背景
在分析系統中，增加在任何給定時間由給定系統進行的分析之數目之能力已為增加實用及延長此類系統之壽命的關鍵組件。特定而言，藉由增加以給定系統進行的分析之多工因素，技術人員可增加系統之整體通量，藉此增加該系統之效用同時減少與該用途相關聯的成本。
在光學分析中，增加多工通常引起增加之困難，因為增加多工可需要更複雜的光學系統、增加的照明或偵測性能及新反應圍阻策略。在一些狀況下，系統設法藉由許多折疊及甚至數個數量級來增加多工，此進一步暗示此等考慮。同樣地，在某些狀況下，將使用系統所針對的分析環境為高度靈敏度的，使得給定系統中的不同分析之間的變化可並非可容忍的。此等目標通常與簡單地使系統較大及具有較高功率的蠻力法不一致，因為此等步驟通常導致甚至更大的後果，例如在互反應串音中，起因於較 低信號及較高雜訊的降低之信號雜訊比等。因此，將為合意的是，提供具有大體上增加之多工以用於分析系統之所要分析及尤其用於在高度靈敏的反應分析中使用的分析系統，且在許多狀況下，為進行此舉同時最小化此增加之多工之負面影響。
同時，繼續需要增加分析系統之效能且降低與製造及使用系統相關聯的成本。特定而言，繼續需要增加分析系統之通量。繼續需要降低分析系統之大小及複雜性。繼續需要具有靈活組態且容易可縮放的分析系統。
發明概要
本發明藉由在一態樣中提供整合性分析裝置陣列來解決此等及其他問題，每一裝置包含奈米級發射容積；偵測器層，其光學地耦合至該奈米級發射容積，其中該偵測器層包含第一像素及第二像素；以及色彩過濾層，其安置在該奈米級發射容積與該偵測器層之間。在此等裝置中，該色彩過濾層包含第一多空腔濾波器元件及第二多空腔濾波器元件，其中該奈米級發射容積藉由該第一多空腔濾波器元件光學地耦合至該第一像素，且藉由該第二多空腔濾波器元件光學地耦合至該第二像素。
在一些實施例中，該第一多空腔濾波器元件及該第二多空腔濾波器元件包含高折射指數材料及低折射指數材料之交替層。在一些實施例中，該第一多空腔濾波器元件及該第二多空腔濾波器元件各自獨立地包含多個低 折射指數空腔層。在一些實施例中，該第一多空腔濾波器元件及該第二多空腔濾波器元件各自獨立地包含多個反射器層，該等多個反射器層界限多個低折射指數空腔層。
在一些實施例中，該等陣列進一步包含透鏡元件層，該透鏡元件層安置在該奈米級發射容積與該偵測器層之間，且在一些實施例中，該等陣列進一步包含激發源，該激發源光學地耦合至該奈米級發射容積。
在一些實施例中，該偵測器層進一步包含第三像素，該色彩過濾層進一步包含第三多空腔濾波器元件，且該奈米級發射容積藉由該第三多空腔濾波器元件光學地耦合至該第三像素。
根據另一態樣，本揭示內容提供一種整合性分析裝置陣列，該整合性分析裝置陣列包含奈米級發射容積之陣列以及第一多空腔濾波器元件及第二多空腔濾波器元件之陣列，每一第一多空腔濾波器元件及第二多空腔濾波器元件光學地耦合至奈米級發射容積。在此等陣列中，每一多空腔濾波器元件包含底部反射器層，其包含低折射指數材料及高折射指數材料之交替層；第一空腔層，其安置在該底部反射器層上，其中該第一空腔層包含該低折射指數材料；第一耦合反射器層，其安置在該第一空腔層上，其中該第一耦合反射器層包含該低折射指數材料及該高折射指數材料之交替層；第二空腔層，其安置在該第一耦合反射器層上，其中該第二空腔層包含該低折射指數材料；以及頂部反射器層，其安置在該第二空腔層上，其中該頂 部反射器層包含該低折射指數材料及該高折射指數材料之交替層。在此等陣列中，該第一多空腔濾波器元件之該第一空腔層及該第二空腔層具有第一厚度，且該第二多空腔濾波器元件之該第一空腔層及該第二空腔層具有第二厚度。
在一些實施例中，該等陣列進一步包含偵測器元件之陣列，每一偵測器元件包含第一像素及第二像素，其中該等多空腔濾波器元件光學地耦合至該等偵測器元件。在一些實施例中，該等陣列進一步包含透鏡元件之陣列，該透鏡元件之陣列安置在該奈米級發射容積之陣列與該偵測器元件之陣列之間。在一些實施例中，該等陣列進一步包含激發源，該激發源光學地耦合至該等奈米級發射容積。
根據又一態樣，本揭示內容提供用於生產整合性分析裝置陣列之方法，該方法包含以下步驟：提供基板層；在該基板層上沉積底部反射器層，其中該底部反射器層包含低折射指數材料及高折射指數材料之交替層；在該底部反射器層上沉積第一空腔層，其中該第一空腔層包含該低折射指數材料；圖案化且蝕刻該第一空腔層以產生具有第一厚度之第一空腔濾波器元件及具有第二厚度之第二空腔濾波器元件的第一配置；在該第一空腔層上沉積第一耦合反射器層，其中該第一耦合反射器層包含該低折射指數材料及該高折射指數材料之交替層；在該第一耦合反射器層上沉積第二空腔層，其中該第二空腔層包含該低折 射指數材料；圖案化且蝕刻該第二空腔層以產生具有該第一厚度之第一空腔濾波器元件及具有該第二厚度之第二空腔濾波器元件的第二配置；以及在該陣列上沉積頂部反射器層，其中該頂部反射器層包含該低折射指數材料及該高折射指數材料之交替層。在此等方法中，該第一空腔層之該等第一空腔濾波器元件光學地耦合至該第二空腔層之該等第一空腔濾波器元件，且該第一空腔層之該等第二空腔濾波器元件光學地耦合至該第二空腔層之該第二空腔濾波器元件。
102:固定化複合物
104、304:虛線
106:零模波導
108、110:核苷酸
112:信號脈衝
114:信號
200、500:整合性分析裝置
202、502:反應槽
204:光學元件串
206、208、210、212:光學元件
220:偵測器元件
302:實線
306:垂直線
402、404、406、408:發射頻譜
410、412:濾通器線
504:整合性光學元件串
505:光學波導/波導層
508:透鏡元件層
510:色彩過濾層
510a、510b:濾波器元件
512:偵測器層
512a、512b:感測區域
圖1A至圖1B示意性地例示可使用所揭示整合性分析裝置陣列進行的示範性核酸定序過程。
圖2提供整合性分析裝置的示意性方塊圖。
圖3A提供用於兩個信號事件之激發頻譜及所指示窄頻帶激發照明的示意圖，同時圖3B示意性地例示基於兩個信號事件之窄頻帶照明的所得偵測信號。
圖4示意性地例示用於四個螢光標記基團中每一者之信號分佈，該等信號分佈上覆有兩個不同濾色器分佈中每一者。
圖5示意性地例示用於偵測來自定序反應之信號的整合性分析裝置，其中透鏡元件空間分離自反應槽發射的光，且導引光穿過色彩過濾層並將光導引至偵測器層上。
圖6示意性地例示用於二色、二振幅序列合 成反應之信號軌跡。
圖7A至圖7D例示本揭示內容之示範性陣列內的整合性裝置之佈局，從而展示裝置內的組件之不同配置。
圖8A例示示範性單空腔薄膜干涉濾波器之結構。圖8B例示示範性多空腔薄膜干涉濾波器之結構。圖8C例示本揭示內容之示範性整合性分析裝置之色彩過濾層之結構，其中色彩過濾層包括僅在空腔層之厚度方面不同的兩個多空腔濾波器元件。
圖9展示本揭示內容之示範性整合性分析裝置。
較佳實施例之詳細說明
整合性分析裝置
多工光學分析系統使用於多種不同應用中。此類應用可包括單個分子之分析，且可涉及在單個生物分子進行反應時即時觀察例如該等單個生物分子。出於論述之容易性，本文關於較佳應用論述此類多工系統：核酸序列資訊之分析，及尤其單分子核酸序列分析。雖然關於特定應用描述，但是應暸解，本文所描述之裝置及系統之應用具有較廣泛應用。
在單分子核酸定序分析之情形下，觀察單個固定化核酸合成複合物以在個別核苷酸併入延長引子序列中時識別該等個別核苷酸，該單個固定化核酸合成複合物 包含聚合酶、具有感興趣的核苷酸序列的模板核酸及與模板序列之一部分互補的引子序列。通常藉由在核苷酸之併入之前、期間或之後觀察核苷酸上的光學可偵測標記來監測併入。在一些狀況下，此類單分子分析使用「每次一個鹼基方法」，藉此每次將單個類型之標記核苷酸引入至複合物且與複合物接觸。在併入時，將未併入核苷酸自複合物沖走，且標記併入核苷酸經偵測為固定化複合物之一部分。
在一些情況下，添加僅單個類型之核苷酸以偵測併入。此等方法隨後需要各種不同類型之核苷酸(例如，A、T、G及C)之循環穿過，以便能夠決定模板之序列。因為在任何給定時間僅單個類型之核苷酸與複合物接觸，所以任何併入事件在定義上為接觸核苷酸之併入。此等方法雖然稍微有效，但當模板序列包括多個重複核苷酸時通常遭受困難，因為可併入自單個併入事件不可區分的多個鹼基。在一些狀況下，對此問題之所提議解決方案包括調整存在的核苷酸之濃度，以確保單個併入事件為動力上有利的。
在其他狀況下，同時添加多個類型之核苷酸，但該等核苷酸可藉由不同光學標記在每一類型之核苷酸上之存在區分。因此，此類方法可使用單個步驟來識別序列中之給定鹼基。特定而言，將各自帶有可區分標記的所有四個核苷酸添加至固定化複合物。複合物隨後經詢問以識別哪一類型之鹼基經併入，且因而識別模板序列中之 下一個鹼基。
在一些狀況下，此等方法每次僅監測一鹼基之添加，且因而，該等方法(且在一些狀況下，單核苷酸接觸方法)需要額外控制以避免多個鹼基在任何給定步驟中經添加，且因此由偵測系統遺漏。通常，此類方法使用核苷酸上之終止劑基團，一旦一核苷酸已經併入，該等終止劑基團防止引子之進一步伸長。此等終止劑基團通常為可移除的，從而允許在所偵測併入事件之後的受控重新伸長。同樣地，為避免混淆來自先前併入核苷酸之標記，此等核苷酸上之標記基團通常經組配為可移除的或以其他方式不可激活的。
在另一過程中，即時監測單分子引子伸長反應，以識別伸長產物中之核苷酸之繼續併入以說明下層模板序列。在此單分子即時(或SMRTTM)定序中，核苷酸在聚合酶媒介模板相依引子伸長反應中之併入過程在該聚合酶媒介模板相依引子伸長反應發生時經監測。在較佳態樣中，模板/聚合酶引子複合物經提供、通常固定化於諸如零模波導(ZMW)的光學受限區域內，或接近於透明基板、光學波導等之表面(參見例如美國專利第6,917,726號及第7,170,050號以及美國專利申請公告第2007/0134128號，該等美國專利及美國專利申請公告之全部揭示內容以引用方式整體併入本文以用於所有目的)。光學受限區域針對將要使用的螢光標記核苷酸以適當激發輻射照亮。因為複合物在光學受限區域或極小照明容積內，所以僅直接包圍複 合物的反應容積經受激發輻射。因此，例如在併入事件期間與複合物相互作用的該等螢光標記核苷酸在照明容積內存在充分的時間以將該等螢光標記核苷酸識別為已經併入。雖然本文所揭示的裝置中之感興趣的分析物為併入螢光標記核苷酸的模板/聚合酶引子複合物，但應理解，可使用本揭示內容之裝置監測其他感興趣的分析物，尤其感興趣的螢光分析物。
此定序過程之示意性說明展示於圖1中。如圖1A中所示，聚合酶、模板核酸及引子序列之固定化複合物102經提供於例如零模波導106之光學局限之觀察容積(如由虛線104所示)內。當適當核苷酸類似物例如核苷酸108經併入新生核酸股中時，該適當核苷酸類似物經照明對應於標記核苷酸類似物在併入期間處於觀察體積內之保留時間的延長時間段。延長照明產生與保留相關聯的信號，例如，如由圖1B中之A軌跡所示的信號脈衝112。一旦併入，附接至標記核苷酸類似物之多磷酸鹽組分的標記經釋放。當下一個適當核苷酸類似物例如核苷酸110與複合物接觸時，該下一個適當核苷酸類似物亦經併入，從而導致圖1B之T軌跡中的對應信號114。藉由監測如由模板序列之下層互補性所規定的鹼基至新生股中之併入，可獲得模板之序列資訊之長伸展。
以上定序反應可經併入通常為整合性分析裝置的裝置中，該裝置理想地即時提供多個定序反應之同時觀察。雖然每一裝置之組件及系統中之裝置之組態可變 化，但每一整合性分析裝置通常至少部分包含如圖2中之方塊圖所示的一般結構。如所示，整合性分析裝置200通常包括反應槽202，分析物(亦即，聚合酶模板複合物及相關聯螢光反應物)經安置於該反應槽中，且光學信號自該反應槽發出。分析系統進一步包括偵測器元件220，該偵測器元件經安置成處於與反應槽202光通訊中(本文亦被稱為「光學地耦合至」反應槽202)。反應槽202與偵測器元件220之間的光通訊係藉由光學元件串204提供，該光學元件串由大體上指定為206、208、210及212的一或多個光學元件組成，以用於有效地將來自反應槽202之信號導引至偵測器220。此等光學元件通常包含許多元件，諸如透鏡、濾波器、光柵、鏡、稜柱、折射材料、孔口等或此等元件之各種組合，取決於本申請案之特定性。藉由將此等元件整合至單個裝置架構中，改良反應槽與偵測器之間的光學耦合之效率。整合性分析系統之實例包括用於照明反應槽及偵測自反應槽發射的光學信號之各種方法描述於美國專利申請公告第2012/0014837號、第2012/0019828號及第2012/0021525號，該等美國專利申請公告以引用方式整體併入本文以用於所有目的。
如以上所述，安置於反應槽(例如，圖2中之元件202)內或以其他方式在裝置之表面上固定化的分析物(例如，聚合酶模板複合物與相關聯螢光反應物)發射傳輸至偵測器元件(例如，圖2中之元件220)的光。對於螢光分析物，該分析物藉由激發光源照亮，而對於其他分析物， 諸如化學發光或其他此類分析物，激發光源可並非必要的。反應槽容積之至少一部分亦即發射容積光學地耦合至偵測器元件，使得自此容積內之分析物發射的光藉由偵測器元件量測。為最大化同時量測的分析物之數目，盡可能地減小本分析裝置之大小，使得每一裝置內之發射容積為奈米級發射容積。理想地，奈米級發射容積與偵測器元件之間的光學耦合為高度有效的，以便最大化裝置之靈敏度且最大化信號輸出。如以下進一步詳細地描述，自奈米級發射容積發射的光可在到達偵測器元件之前進一步例如藉由透鏡元件及/或色彩過濾層操縱。
習知分析系統通常量測多個頻譜相異信號或信號事件，且因此必須利用複雜光學系統來分離且清楚地偵測該等不同信號事件。然而，可藉由經偵測的頻譜可區分信號之量或數目之減少來簡化整合性裝置之光學路徑然而。此減少可經理想地實現，而不減少可經偵測的相異反應事件之數目。例如，在基於四個不同可偵測信號事件來區分四個不同反應的分析系統中，其中典型系統將不同信號頻譜指派給每一不同反應，且藉此偵測且區分每一信號事件，在替代性方法中，四個不同信號事件將由少於四個不同信號頻譜表示，且實情為將至少部分依賴於信號事件之間的其他非頻譜區別。
例如，按照慣例將使用四個頻譜可區分信號例如「四色」定序系統，以便識別且表徵四個不同核苷酸中每一個之合併的定序操作在一替代性組態之情形下可使 用一色或二色分析，例如，依賴具有僅一或二個相異或區分頻譜信號的信號。然而，在此替代性組態中，對信號頻譜複雜性之依賴之此降低以區分來自多個亦即較大數目之不同信號產生反應事件的信號之能力為代價而不成功。特定而言，此替代性組態可依賴於不同於發射頻譜的一或多個信號特性(包括例如信號強度、激發頻譜或兩者)來區分來自彼此的信號事件，而非僅依賴於信號頻譜來區分反應事件。
在一特定替代性組態中，整合性分析裝置中之光學路徑因此可藉由利用信號強度作為兩個或兩個以上信號事件之間的區分特徵來簡化。在其最簡單迭代中，且參考示範性定序過程，兩個不同類型之核苷酸將帶有螢光標記，該等螢光標記各自在相同激發照明(亦即，具有相同或大體上重疊頻譜帶)下發射螢光，且因此將提供使用單個激發源激發之效益。來自每一螢光標記的所得信號在相同照明下將具有相異信號強度或振幅，且因此將可藉由該等信號之個別信號振幅來區分。此兩個信號可具有部分或完全重疊的發射頻譜，但基於發射頻譜之任何差異的信號之分離將為不必要的。
因此，對於使用信號振幅不同的兩個或兩個以上信號事件的分析系統，此類系統之整合性分析裝置可容易地經由通常將用來分離頻譜相異信號的該等組件中之一些或全部之移除受益，該等組件諸如多個激發源及該等激發源之相關聯光學元件串，以及用於信號事件之色彩分 離光學器件(例如，濾波器及二向色鏡)，此舉在許多狀況下需要至少部分分離用於每一頻譜相異信號之光學元件串及偵測器。因此，極大地簡化用於此等整合性分析裝置之光學路徑，從而允許將偵測器元件置放成更接近於反應槽，且改良用於此等裝置之偵測過程之整體效能。
將在特定激發照明分佈下產生不同信號振幅的信號產生分析物之供應可以許多方式實現。例如，可使用不同螢光標記，該等不同螢光標記呈現重疊但包括不同最大值的激發頻譜分佈。因而，在窄波長處的激發將通常導致用於每一螢光基團之不同信號強度。此例示於圖3A中，該圖展示兩個不同螢光標記基團(分別為實線302及虛線304)之激發頻譜。當經受在藉由垂直線306所示的波長範圍處的激發照明時，每一螢光標記將以對應振幅發射信號。在給定激發波長處的所得信號隨後在圖3B之條形圖中分別展示為實線條及虛線條。在給定激發波長處的此兩個信號產生標記之強度之差異易於用來區分兩個信號事件。如將暸解的，此類頻譜不清晰信號在同時發生時將並非容易可區分的，因為該等信號將導致附加重疊信號，除非如以下所論述，此類頻譜不清晰信號起因於頻譜相異激發波長。如將暸解的，此相同方法可與多於兩個標記基團一起使用，其中在給定激發頻譜處的所得發射具有可區分強度或振幅。
類似地，兩個不同螢光標記基團可具有相同或大體上類似激發頻譜，但由於該等標記基團之量子產率 而提供不同及可區分的信號發射強度。
此外，雖然關於兩個相異螢光染料描述，但是將暸解，每一不同標記基團可各自包括多個標記分子。例如，每一反應物可包括能量傳遞染料對，該能量傳遞染料對在以單個照明源激發時產生不同強度之發射。例如，標記基團可包括在給定激發波長處激發的供體螢光團及在供體之發射波長處激發的受體螢光團，從而導致能量傳遞至受體。藉由使用激發頻譜在不同程度上重疊供體之發射頻譜的不同受體，此方法可產生整體標記基團，該整體標記基團以用於給定激發波長及位準之不同信號振幅發射。同樣地，調整供體與受體之間的能量傳遞效率想同樣地導致在給定激發照明下的不同信號強度。
替代地，不同信號振幅可藉由給定反應物上之信號產生標記基團中之不同的多個提供，例如，將單個標記分子放置在一反應物上，而將2個、3個、4個或更多個單獨標記分子放置在不同反應物上。所得發射信號將反映存在於反應物上的標記之數目且因此將指示該反應物之身份。
對於以上目的有用的與如核苷酸類似物的螢光試劑有關的示範性組成及方法描述於例如美國專利申請公告第2012/0058473號；第2012/0077189號；第2012/0052506號；第2012/0058469號；第2012/0058482號；第2010/0255488號；第2009/0208957中，該等美國專利申請公告各自以引用方式整體併入本文以用於所有目 的。
如以上所描述，利用此類方法的整合性分析裝置想像藉由頻譜鑑別要求之消除進行的複雜性之降低，例如，使用信號振幅或其他非頻譜特性作為信號鑑別之基礎。組合此類非頻譜鑑別方法與更常見頻譜鑑別方法的整合性分析裝置亦可提供優於更複雜頻譜鑑別系統的優點。藉由自「四色」鑑別系統轉移至基於信號強度及色彩來區分信號的系統，技術人員仍可相對於習知四色分離方案降低整個光學系統之複雜性。例如，在偵測四個離散反應事件的分析操作中，例如，在核酸序列分析中，可提供在給定發射/偵測頻譜內的兩個信號事件，亦即，在相同頻譜窗內的發射信號，及在相異發射/偵測頻譜內的其他兩個事件。在每一頻譜窗內，信號事件之對產生相對於彼此的可區分信號強度。
為便於論述，關於螢光信號事件之兩個基團描述此概念，其中每一基團之成員藉由螢光強度不同，且基團藉助於該等基團之發射頻譜不同。如將暸解的，簡化光學系統之使用(例如，將兩個偵測通道用於兩個相異發射頻譜)不要求信號之兩個基團之發射分佈不重疊或每一基團之成員之發射頻譜極佳地重疊。實情為，在許多較佳態樣中，可使用每一不同信號事件擁有獨特發射頻譜的更複雜信號分佈，但以每一信號將基於每一通道中的信號強度來呈現兩個偵測通道內之獨特的信號分佈的方式。
為在本裝置中使用，樣本中之每一「發射體」 因此應具有獨特信號分佈，如剛剛所描述，以便經適當識別。含有多個發射體的樣本因此可容易地使用本裝置加以區分。在一些實施例中，裝置區分4個至18個發射體、4個至12個發射體，或甚至4個至8個發射體。在特定實施例中，裝置區分四個發射體，例如核酸定序反應之四個不同鹼基。
圖4示意性地例示用於四個螢光標記基團中每一者之信號分佈，該等信號分佈上覆有兩個不同濾波器分佈中每一者。如所示，四個標記基團分別產生發射頻譜402、404、406及408。雖然來自此四個基團的信號彼此部分重疊，但該等信號各自具有不同最大值。當經受如藉由濾通器線410及412所示的二通道濾波方案時，來自每一標記的信號將產生介於兩個偵測通道之間的獨特信號分佈。特定而言，使信號路由穿過光學元件串，該光學元件串包括根據所示頻譜分佈濾波的兩個路徑。對於每一信號，不同位準之發射光將通過每一路徑且在相關聯偵測器上經偵測。通過每一濾波路徑的信號之量由信號之頻譜特性規定。濾色器元件如以下更詳細地描述，負責提供用於裝置之所要帶通特性。
在以上所描述之混合模式方案之狀況下，可提供包括至少兩個相異偵測通道的偵測系統，其中每一偵測通道傳送不同於每一其他通道的頻譜內之光。此類系統亦包括在偵測通道之光學通訊內之反應混合物，其中反應混合物產生至少三個不同光學信號，該等不同光學信號與 其他光學信號相比各自在兩個偵測通道內產生獨特信號型樣。
在所有狀況下，每一信號產生反應物經選擇以提供信號強度及信號通道中至少一者與每一其他信號完全相異的信號。如以上所述，給定通道中之信號強度部分由光學信號之性質(例如，光學信號之發射頻譜)以及該信號通過的濾波器(例如，允許到達給定通道中之偵測器的該頻譜之部分)規定。然而，信號強度亦可藉由隨機變數調整，諸如當標記基團在其發射信號時之定向，或特定反應之其他變數。因此，對於保證為完全不同於給定通道內之另一信號之強度的信號之強度，在較佳態樣中，解釋此變化。
在降低數目的頻譜相異信號事件的情況下，用於整合性裝置之光學路徑之複雜性亦降低。圖5例示用於進行光學分析例如核酸定序過程之未按比例示例性裝置架構，該等光學分析部分依賴部分關於頻譜相異的不同信號之非頻譜鑑別。如所示，整合性分析裝置500可包括界定在裝置之表面層上的反應槽502。如此圖中所示，反應槽包含安置於表面層中的奈米井。此類奈米井可在基板表面中構成凹陷或經安置穿過額外基板層到達下層透明基板的孔口，例如，如在零模波導(ZMW)陣列(參見例如美國專利第7,181,122號及第7,907,800號)中所使用。然而，亦應理解，在一些實施例中，感興趣的樣本可在其他方面受限制，且可自分析裝置省略該等實施例中之奈米級 反應槽。例如，若感興趣的目標以無分離反應槽的裝置之表面上的圖案固定化，則可在該等位置處觀察結合事件或其他感興趣的事件，而無需樣本之實體分離。可適合地使用此方法監測例如固定化核酸與該等固定化核酸之互補序列之間的雜交反應或例如抗體與該等抗體之配位體之間的結合反應，其中結合對之任一成員可在裝置之表面上的特定位置處固定化，如此項技術中之一般技術者將理解。
將激發照明自激發光源(未示出)傳輸至反應槽或傳輸至固定化目標，該激發光源可與基板分離或亦整合至基板中。如所示，光學波導(或波導層)505可用來將激發光(藉由一方向上之箭頭所示，但是光可在任一方向或兩個方向上傳播)傳送於反應槽502或其他固定化目標，其中自波導505發出的消逝場照亮照明容積內之反應物。使用光學波導來照亮反應槽描述於例如美國專利第7,820,983號及美國專利申請公告第2012/0085894號中，該美國專利及該美國專利申請公告各自以引用方式整體併入本文以用於所有目的。奈米級反應槽(本文中亦被稱為「奈米井」或「ZMW」)可作用來增強螢光向下進入裝置中之發射且限制向上散射的光之量。
經由包含一或多個光學元件的整合性光學元件串504將來自奈米級反應槽或來自固定化目標的發射光導引至偵測器。光學元件串可包括透鏡元件層508，以將來自反應槽內之發射容積的發射光導引至安置在反應槽下方的偵測器層512。本揭示內容之整合性分析裝置中之 透鏡元件層可包含例如繞射波束整形元件或其他此組件，該繞射波束整形元件或其他此組件用來以高效率將發射光分離成至少兩個波束，以用於通過色彩過濾層510。參見例如2015年8月26日申請之美國專利申請案第14/836,629號，該美國專利申請案之揭示內容以引用方式併入本文以用於所有目的。繞射波束整形元件或其他透鏡元件可例如將發射光分離成經導引至偵測器層上的兩個、三個、四個或甚至更多至少部分分離的波束。取決於繞射波束整形元件或其他透鏡元件之組態，分裂波束可以線性方式組織，或該等分裂波束可配置於陣列中，例如，配置於2x2波束陣列中等。此類配置將通常由偵測器層之感測區域之組態規定。
偵測器層通常包含一個或較佳地包含多個感測區域512a-b，例如，陣列偵測器(例如CMOS偵測器)中之像素，該等感測區域經由繞射波束整形元件光學地耦合至給定分析裝置內之發射容積。雖然例示為像素512a-b之線性配置，但是將暸解此類像素可以柵格、n x n正方形、n x m矩形、環形陣列或任何其他便利定向配置。以下且在圖7中更詳細地描述示範性配置。
應理解，在本揭示內容之上下文中，裝置中之兩個組件之「光學耦合」不意欲隱含耦合之方向性。換言之，因為光能穿過光學裝置之傳輸為完全可逆的，所以第一組件至第二組件之光學耦合應視為等效於第二組件至第一分量之光學耦合。
來自圖5之反應槽502內之發射容積的衝擊偵測器層之像素的發射信號藉由電腦或與分析裝置相關聯的其他處理器偵測且記錄。如以上所述，且如以下將進一步詳細地描述，色彩過濾層510較佳地安置在偵測器層與奈米級發射容積之間，以容許不同頻譜相異信號行進至偵測器層512中之不同相關聯感測區域(亦即，像素)512a及512b。例如，過濾層510之濾波器元件510a僅允許具有相異第一發射頻譜的信號到達該濾波器元件之相關聯感測區域512a，而過濾層510之濾波器元件510b僅允許具有相異第二頻譜的信號到達該濾波器元件之相關聯感測區域512b。如如下所述，色彩過濾層之濾波器元件較佳地為多空腔濾波器元件，特定而言，多空腔薄膜干涉濾波器元件。
在利用此組態的定序系統之情形下，四個核苷酸中兩個之併入將產生信號，該等信號將經由濾波器元件510a傳送至感測區域512a且由濾波器元件510b阻擋。因為在此兩個信號之間，一信號將具有高於另一信號的信號強度，使得偵測器層512中之感測區域512a將能夠產生指示此類不同信號強度的信號回應。同樣地，四個核苷酸中其他兩個之併入將產生信號，該等信號將經由濾波器元件510b傳送至感測區域512b且由濾波器元件510a阻擋。因為在此兩個信號之間，一信號將具有高於另一信號的信號強度，使得偵測器層512中之感測區域512b將能夠產生指示此類不同信號強度的信號回應。
偵測器層可操作地耦合至通常整合至基板 中的適當電路，以用於將信號回應提供至處理器，該處理器選擇性地包括、整合於相同裝置結構內或與偵測器層及相關聯電路分離但電子地耦合至該偵測器層及相關聯電路。電路之類型之實例描述於美國專利申請公告第2012/0019828號中。
如將自先前揭示內容及圖5暸解的，本文所描述之整合性分析裝置不需要在利用習知四色光學器件的系統中必要的更複雜光學路徑，從而在一些狀況下消除對過量信號分離光學器件、二向色鏡、稜柱或濾波器層的需要。特定而言，雖然展示為具有透鏡元件層508，但在選擇性態樣中，透鏡元件層可經消除或可以例如阻擋來自激發源的雜散光的過濾層(例如雷射斥拒濾波器層(參見以下))的替代性光學組件替換，而非區分來自反應槽的不同發射信號。即使包括透鏡元件層508導致與習知四色系統相比的簡化及/或更有效的光學器件，但需要更複雜光學元件串，因此阻擋信號以任何給定發射波長到達感測區域子集中一或多個，從而導致來自每一信號事件的少得多的光子之偵測。另一方面，圖5中所示之光學器件組態僅阻擋全部五個信號光之一較小部分到達偵測器。為比較，習知系統將需要全部四個不同信號類型之分離及微分方向，從而導致包括額外光學元件，例如稜柱或光柵，以達成頻譜分離。包括頻譜轉向元件(亦即，基於色彩來空間分離光的光學元件)的奈米級整合性分析裝置之實例提供於美國專利申請公告第2012/0021525號中。
圖6展示用於使用來自本發明之整合性系統的二色/二振幅信號集合的即時定序操作之示意性示範信號輸出，其中一軌跡(虛線)表示與A(高強度信號)及T(較低強度信號)鹼基之併入相關聯的信號，而另一信號軌跡(實線)表示與G(高)及C(低)鹼基相關聯的不同發射頻譜之信號。如得自色彩通道及信號之強度的併入之計時及所併入鹼基之身份隨後用來解釋鹼基序列。
圖7例示有用地使用於本揭示內容之陣列中的示範性裝置佈局。在每一狀況下，自上方觀察陣列，其中暗圓表示ZMW/奈米井。如所示，ZMW/奈米井直接定位在波導上方，該等波導識別為寬箭頭。在圖7A及圖7C中所示之陣列之狀況下，波導之「節距」為2行(亦即，波導藉由兩行感測區域/像素之寬度分離)，而對於圖7B及圖7D之陣列，波導之節距為1行(亦即，波導藉由一行感測區域/像素之寬度分離)。受陣列中每一者中之繞射波束整形元件或其他透鏡元件影響的發射光之空間分離藉由與ZMW/奈米井中之一些相關聯的兩個細箭頭指示。例如，在圖7A之裝置中，透鏡元件將發射光導引至與波導垂直(亦即，以90°)對準的兩個感測區域上。在圖7B之裝置中，透鏡元件將發射光導引至與波導共線(亦即，以0°)的兩個感測區域上。對於圖7C及圖7D之裝置，透鏡元件將發射光導引至相對於波導對角(亦即，以45°)的兩個感測區域上。如自圖式顯而易見的，圖7C及圖7D之裝置關於各別波導之節距不同。
圖7中所示的整合性分析裝置陣列使用標準微晶片製造技術及過程容易地製造，如以下將進一步詳細地描述。例如，微影圖案化及蝕刻步驟可用來產生光學組件在陣列之每一裝置內之所要配置，該等光學組件例如色彩過濾元件、透鏡元件、波導、ZMW/奈米井等。多個微加工步驟在一些狀況下可為必要的，以產生光學組件中之一些，如一般技術者將理解。
濾色器元件
如以上所述，本揭示內容之整合性分析裝置包括色彩過濾層，包含多個濾色器元件，該等多個濾色器元件中每一個經設計來傳輸某些波長之光，同時顯著地減少或阻擋其他波長之光。特定而言，合意的是，將盡可能多的信號有關之光傳輸至偵測器之適當區域且阻擋所有或至少最多雜訊有關之光。此外，因為本裝置之透鏡元件及其他光學組件通常經設計來傳輸自分析物發射的所有波長之光，所以通常合意的是，使用介於透鏡元件與偵測器層之不同感測區域/像素之間的濾色器元件，以便區分分析物中之不同發射體。
本揭示內容之整合性分析裝置因此包括安置在奈米級發射容積與偵測器層之間的色彩過濾層。色彩過濾層內之不同色濾色器元件通常用於傳輸至偵測器的空間分離波束中每一者。空間分離光通常在藉由偵測器層中之對應感測區域偵測之前通過色彩過濾層。因此，色彩過濾層包含多個濾色器元件，每一濾色器元件特定於傳送一 定光波長範圍。在特定實施例中，色彩過濾層包含2個、3個、4個、5個、6個或甚至更多個濾色器元件。在更特定實施例中，色彩過濾層包含2個濾色器元件、感測區域及分離波束，例如圖5中系統化的阻擋裝置中並且在圖7中圖形地例示之裝置陣列中所示。
如剛剛提到的，濾色器元件經設計來傳輸某些光波長，而阻擋其他光波長。用於在本裝置之濾色器元件中使用的適合材料包括例如介電干涉堆疊、聚合物類抗蝕劑、摻雜PECVD氧化物、具有吸收染料之有機聚矽氧等。
在較佳實施例中，本裝置之濾色器元件為薄膜干涉濾波器，且特定而言為多空腔薄膜干涉濾波器。薄膜干涉濾波器可具有極陡的傳輸斜率，尤其在與吸收濾波器相比時，使得濾波器顯示陡峭的光學切通(cut-on)及切斷(cut-off)變遷邊界。典型的窄帶通、薄膜介電濾波器含有四分之一波光學厚度的「反射器」或「鏡子」層及半波光學厚度或多個半波光學厚度的「空腔」或「間隔件」層。參見例如Macleod(2001)Thin-Film Optical Filters，第3版第7章，Institute of Physics Publishing，Bristol及Philadelphia。對於單空腔帶通濾波器，透光度分佈顯示在空腔之中心頻率處具有高傳輸的三角形狀，且濾波器由單個空腔層之兩側上之反射器組成。參見例如Morton(2003)Design of Multi-Band Square Band Pass Filters, 46th Annual Technical Conference Proceedings, Society of Vacuum Coaters,505/856-7188,Moorestown, NJ。 圖8A示意性地展示未按比例單空腔薄膜干涉濾波器元件，其中空腔為透明介電材料之半波層，且頂部及底部反射器為四分之一波層之堆疊。
應理解，本文所揭示之厚度在一些狀況下為實體厚度，但在其他狀況下理解為與光譜中感興趣的波長有關。例如，如剛剛提到的，薄膜堆疊中之一些層使用四分之一波或半波光學厚度，其中光學厚度對應於光學路徑長度(乘以特定層之折射指數的實體厚度)。亦應理解，實體厚度及光學厚度並非絕對的，但可為例如在所述值之5%、10%、15%、20%或甚至更多內。在同一層例如反射器層由經設計來傳輸兩個不同波長範圍或重疊波長範圍的兩個濾波器元件共用的情況下，可為合意的是，該等層之四分之一波光學厚度將基於例如感興趣的兩個中心頻率之平均值且因此傳輸重疊波長範圍。
本濾色器元件之薄膜堆疊中的材料之單獨層之實體厚度可自5nm變動至5000nm。較佳實體厚度可自10nm變動至1000nm。用於反射器堆疊中之單獨層之更佳實體厚度可自10nm變動至200nm，且更具體而言，自20nm變動至100nm。用於空腔層之更佳實體厚度可自40nm變動至400nm，且更具體而言，自150nm變動至350nm。
單空腔或多空腔濾波器之頻寬取決於用來構造反射器層的材料之相對折射指數(「n」)、空腔層之組成，及層數及/或反射器之週期。通常，較佳的是，用來構 造反射器層的材料對於目標特定波長範圍具有盡可能大的折射指數差異，且另外，對於兩個材料之光學吸收損失為低的。
用於高折射指數材料之折射指數之較佳值例如自2.5變動至5，更佳地自2.5變動至3.5，且甚至更佳地自2.5變動至3.0。用於低折射指數材料之折射指數之較佳值例如自1變動至1.8，更佳地自1.2變動至1.7，且甚至更佳地自1.4變動至1.6。應理解，因為材料之折射指數隨著傳輸穿過材料的光之波長變化，所以給定折射指數通常對應於在感興趣的波長處的材料之折射指數。
使用於干涉堆疊中的材料之透明度水準藉由材料之消光係數(「k」)定義，該透明度水準為用於材料之光學吸收損失之指示。較佳的是，材料經選擇以在激發源(例如，雷射或其他光學輸入)之波長處具有相對高的消光係數(及因此低透光度)，且材料因此能夠幫助阻擋背景輸入信號到達偵測器。同時，較佳的是，材料經選擇以在感興趣的分析物之發射波長處具有相對低的消光係數(及因此高的透光度)，因此最大化經由濾波器傳送至偵測器的信號之量。用於薄膜堆疊中之材料的消光係數之較佳值在感興趣的分析物之發射波長處例如自0變動至0.2，且更佳地自0變動至0.1。
用於在本薄膜堆疊中使用的適合高折射指數及低折射指數材料可包括各種半導體材料、介電材料及金屬。例如，適合材料可包括但不限於C、Si、Ge、SiGe、 各種第III-V族化合物(例如，InxGayAl1-x-yAszPmSb1-z-m，其中x、y、m及z全部介於0與1之間)、InGaAsNSb、各種第II-VI族化合物(例如，各種組合中之ZnCdSeS)。示範性金屬可包括Au、Ag、Al等。示範性介電材料可包括BN、ZnOx、HfO等。材料之其他有用組合可包括例如Si/TiO2、Si/空氣、GaAs/AlOx、ZnSe/CaF2等。有機聚合物亦可用於高折射指數及低折射指數材料中任一者或兩者。
用於在本色彩過濾層之低折射指數層中使用的較佳材料為包含氧化矽之材料，特定而言，薄膜二氧化矽材料。用於在本色彩過濾層之高折射指數層中使用的較佳材料為包含矽的材料，例如揭示於以下參考文獻中的薄膜矽材料：Modreanu等人(1998)IEEE Semiconductor Conference Proceedings，第1卷，DOI：10.1109/SMICND.1998.732342；Deng等人(2010)IEEE Symposium on Photonics and Optoelectronic(SOPO)，DOI：10.1109/SOPO.2010.5504008；或Hu等人(2004)J.Crystal Growth 264：7。此等參考文獻中每一個以引用方式整體併入本文以用於所有目的。
在本整合性裝置之製造中的額外考慮可為用於低折射指數及高折射指數材料之處理溫度。在本揭示內容之裝置陣列製造於CMOS感測器之表面或其他溫度敏感表面上的情況下，在薄膜堆疊中使用的材料較佳地選自可在不破壞CMOS感測器或其他溫度敏感基板的溫度處製 造的材料。
用於MEMS製造之允許熱預算因此可取決於所考慮的CMOS技術。例如，用於具有基於鋁之互連體之0.35μm標準CMOS晶圓之熱預算由Sedky等人(2001)IEEE Trans.Electron Devices 48：377-385藉由退火測試試驗性地研究。如研究所表明，Al互連體之薄片電阻之增加(可能由用來形成TiAl3的Al與Ti之反應引起)而非電晶體效能為限制因素。由Takeuchi等人(2005)IEEE Trans.Electron Devices 52：2081-2086進行的類似研究表明，對於具有基於鋁之互連體之0.25μm標準CMOS晶圓，熱預算主要受鎢填充金屬間通孔之增加限制。在10%增加之故障準則的情況下，最大允許後處理熱預算為在450℃處2h或在475℃處30min。對於更先進的CMOS技術，其中使用基於銅之互連體及低電容率介電質作為絕緣金屬間層，熱約束可為甚至更嚴格的，例如，如由Witvrouw等人(2004)Materials Research Society Symp.Proc.782：A2.1.1所論述。高指數材料諸如多晶矽及磷酸鎵在顯示用於在薄膜濾波器堆疊中使用的適合光學性質時通常需要高處理溫度，且因此通常在將溫度敏感基板使用於製造裝置中的情況下不太適合。高指數材料諸如以上所述之薄膜矽材料較好地適合於較低溫度的製造，尤其在與薄膜二氧化矽材料組合用作低折射指數材料時。
薄膜干涉濾波器通常含有一個堆疊在另一個之頂部上的許多層。本整合性裝置之製造中的又一考慮 因此為濾波器堆疊分層之風險。此分層可歸因於層中之殘餘應力之間的失配，且可歸因於在層中由於後續層在堆疊中之沉積之熱預算而產生的應力。此外，下層層之除氣可導致氣泡形成，該氣泡形成可導致黏合問題及分層。此等問題可由於來自CMOS層的額外應力而在CMOS感測器之頂部上的濾波器之後處理期間加重。過度應力亦可導致晶圓之過度弓弧。此過度晶圓弓弧可防止藉由所需要的處理工具之真空吸盤進行的晶圓之適當保持，從而妨礙進一步處理。此等問題可以不同方式解決，例如，藉由選擇具有低殘餘應力之濾波器材料及/或藉由變化膜沉積條件來調諧應力、藉由在流程之不同部分中引入退火以使層除氣、藉由將應力補償層沉積在晶圓之背側上，或藉由其他適合方法。
藉由僅使用源自標準IC(積體電路)製造的技術及工具來製造光學濾波器，可確保薄膜之最佳品質。然而，此等IC處理工具通常在限制性污染水準下作用。因此，某些材料(例如金、Ag)較佳地未整合至濾波器流程中，因為該等材料可污染在標準IC處理流程中使用的工具。IC工具之污染轉而可由於污染材料至裝置層中之擴散而負面地影響在該等工具中處理的未來裝置之產率。因此，即使標準IC工具之使用意味濾波器可受益於改良之效能及產率，該使用亦在材料之選擇中提出限制。經選擇來用於本薄膜堆疊之材料因此較佳地經選擇以避免IC處理工具之污染。
多空腔濾波器具有額外部分反射器層，亦被稱為「耦合反射器」，及該等多空腔濾波器之結構內的空腔層。例如，圖8B展示具有兩個耦合反射器之三空腔帶通濾波器的未按比例示意性表示。單空腔濾波器可經描述為具有結構[HL]x[LH]x，其中H為高折射指數材料(例如，TiO2、薄膜矽材料等)，L為低折射指數材料(例如，SiO2)，且每一x獨立地為[HL]或[LH]對之層數(例如，4)。藉由比較，多空腔濾波器可結構[HL]x[LH]x[L] [HL]x[LH]x或[HL]x[LH]x[L] [HL]x[LH]x[L] [HL]x[LH]x，其中[HL]x及[LH]x結構表示反射器層，其中每一x獨立地為[HL]或[LH]對之層數。在所有狀況下，低指數空腔層之厚度決定濾波器之中心頻率，該厚度亦可為特定半波光學厚度之倍數，如此項技術中所理解。
多空腔濾波器與單空腔干涉濾波器相比有利地導致方形或矩形傳送區域。參見例如Morton(2003)Design of Multi-Band Square Band Pass Filters, 46th Annual Technical Conference Proceedings,Society of Vacuum Coaters,505/856-7188,Moorestown,NJ。亦參見美國專利第6,011,652號及美國專利申請公告第2013/0155515 A1號。具體而言，傳送區域隨著空腔數目增加而變得更為矩形。增加空腔內之低指數層之多重性導致較窄的帶通。多空腔濾波器內之空腔層之厚度之混合亦可影響帶通之寬度及形狀，如一般技術者將理解。然而，如美國專利申請公告第2013/0155515 A1號中所述，多空 腔濾波器之製造可導致濾波器之光學性質之可變性。
本分析裝置之多空腔濾波器提供優於通常在此類裝置中使用的其他類型之濾色器的某些優點，該等其他類型之濾色器包括單空腔濾波器。特定而言，如剛剛提及的，多空腔濾波器之傳送區域之形狀更為方形，且因此具有相較於單空腔濾波器之該等邊緣尖銳得多的邊緣。方形帶通在本裝置中可為有利的，其中來自分析物的二或更多個緊密間隔的發射色彩需要以高可靠性及靈敏度加以區分。此類濾波器因此最小化偵測器層內之相鄰感測區域/像素之間的串音。多空腔濾波器與其單空腔對應物相比亦允許較寬的傳輸範圍。在適當設計的情況下，此等多空腔濾波器亦可為更強健的，以處理變化。
另外，使用低成本、高產率微晶片製造技術，例如使用標準沉積、圖案化及蝕刻技術，可比其他類型之濾色器更有效地製造多空腔薄膜干涉濾波器。此類技術詳細地描述於2013年6月17日申請之美國專利申請第13/920,037號中，且描述於美國專利申請公告第2012/0327248 A1號中，該美國專利申請及該美國專利申請公告之揭示內容各自以引用方式整體併入本文以用於所有目的。特定而言，本裝置之不同多空腔濾波器元件可在基板上同時構建，因此大大地簡化製造。此係可能的，因為在不同色彩過濾元件中每一個中使用的材料可為相同的，且不同元件甚至可將相同堆疊結構使用於底部反射器及頂部反射器層且用於中間耦合反射器層中每一個。不同 濾波器元件較佳地僅在低指數空腔層之厚度方面變化，該等低指數空腔層經選擇以提供由感興趣的分析物發射的特定波長處的信號之最大通過。圖8C展示具有兩個多空腔濾波器元件(a)及(b)之色彩過濾層的未按比例示意性表示。如所示，兩者元件具有相同反射器層。濾波器元件僅在兩個空腔層之厚度方面不同，該等厚度為半波光學厚度或該半波光學厚度之倍數，且該等厚度經設計且經最佳化以傳送兩個不同所要波長範圍之光。
本揭示內容之濾波器元件通常經設計來傳輸在電磁頻譜之可見及紅外區域內的光。濾波器元件較佳地傳輸可見光，因為大多數DNA定序試劑經設計來在頻譜之此區域內發螢光。在一些實施例中，濾波器元件傳輸具有自550nm至750nm之波長範圍的光。在更特定實施例中，濾波器元件傳輸具有自580nm至680nm之波長範圍的光。在甚至更特定實施例中，濾波器元件傳輸在600nm及660nm處之光。
作為以上所描述之設計之結果，與在不同濾波器元件中具有不同材料的裝置或需要區分較大數目之色彩的裝置所需要的製程相比，亦可大大地簡化用於本裝置之色彩過濾層之製造製程。例如，可藉由用來產生藉由[HL]x表示的第一反射器層的高指數及低指數材料之多個層之沉積來構建色彩過濾層。如以上所提及，第一反射器層較佳地跨於給定裝置內之所有濾色器元件為相同的，其中四分之一波光學厚度經選擇來適應藉由感興趣的分析物 發射的整個波長範圍。沉積在第一反射器層上的頂部最低指數層為半波光學厚度層，且充當第一空腔層。該頂部最低指數層較佳地以感興趣的最長波長所需要的厚度沉積。所沉積空腔層隨後可在感興趣的較短波長將經傳輸至偵測器所在的區域處經圖案化且蝕刻。對於每裝置具有兩個不同濾色器元件的二色裝置，諸如圖7中所示之裝置，此單個微影術及蝕刻步驟產生在第一空腔層內具有兩個不同厚度之空腔濾波器元件之所要配置。對於經設計來偵測多於兩種色彩的裝置，額外圖案化及蝕刻步驟可用來產生具有所要空腔厚度之空腔濾波器元件之所要配置。此等製造步驟在一般技術者之技能內。
隨後可藉由高指數材料及低指數材料之額外交替層之沉積跨於第一空腔層之整個表面增添對應於耦合反射器層的第二反射器層。如第一反射器層之沉積的情況，低折射率材料之最後沉積可進行得充分厚，以便充當用於感興趣的最長波長之半波光學厚度。下空腔層藉由適合的圖案化及蝕刻來完成以產生在裝置陣列上之所要位置處的所要厚度之低指數空腔之配置。可重複以上步驟以根據需要產生許多空腔層及耦合反射器層。最後空腔層通常藉由頂部反射器層覆蓋，該頂部反射器層可為任何適合材料且較佳地為高指數材料之適合層。
應理解，以上步驟可根據需要變化來達成不同色彩過濾元件之所要光學及實體特性。雖然每一元件可經廣泛地描述為多空腔濾色器，其中結構係自底部反射器 穿過一系列空腔及耦合反射器構建，且其中最後空腔層以頂部反射器覆蓋，但此一般結構隨後可在軟體模型中使用模擬及最佳化循環加以最佳化以用於特定回應。示範性設計提供於本揭示內容之實例部分中。
薄膜干涉濾波器元件，特定而言多空腔干涉濾波器元件理想地適合於本文所揭示之大規模整合性分析裝置陣列，其中有限數目之不同濾色器元件，例如用於在定序反應中區分兩種色彩之2個不同濾波器元件在基板之表面上的大陣列中重複。此類方法在大量不同色彩需要在單個單元槽內彼此加以區分的裝置中不太適合，因為所需要的圖案化及蝕刻步驟之數目與需要區分的不同色彩之數目有關。參見例如Wang等人(2006)Appl.Phys.B 82：637及美國專利申請公告第2008/0042782號及第2012/0327248 A1號，該等美國專利申請公告揭示需要多個遮罩及蝕刻步驟以便獲得必要的空腔厚度的帶通濾波器。此類複雜製程要求將通常排除多空腔干涉濾波器在此等裝置中之使用。
整合性分析裝置陣列
為獲得遺傳定序之廣泛應用(例如在研究及診斷中)可需要的大量序列資訊，需要高通量系統。如以上所述且藉由實例之方式，為增強系統之定序通量，通常監測多個複合物，其中每一複合物定序單獨模板序列。在基因體定序或其他大DNA組分之定序之狀況下，此等模板將通常包含基因體DNA之重疊片段。藉由定序每一片段，技 術人員隨後可自來自片段的重疊序列資料組裝鄰接序列。
如以上所描述且如圖1中所示，此定序系統之模板/DNA聚合酶引子複合物提供於光學受限區域內、通常經固定化，該光學受限區域諸如零模波導(ZMW)或奈米井，或透明基板之表面近端、光學波導等。較佳地，此類反應槽大量地排列在基板上，以便達成基因體或其他大規模DNA定序方法必要的規模。此類陣列較佳地包含完成整合性分析裝置陣列，該等完成整合性分析裝置諸如例如圖2及圖5之方塊圖中所示之裝置。包含光學分析裝置之陣列的整合性系統之實例提供於美國專利申請公告第2012/0014837號；第2012/0019828號；以及第2012/0021525號中。
根據一些態樣，本揭示內容提供以上詳細描述之整合性分析裝置陣列。此類可以超高密度製造，從而提供自每平方公分1000個奈米級發射容積至每平方公分1,000,000個奈米級發射容積或更多之間的任何數量。因此，在任何給定時間，分析發生在自100、1000、3000、5000、10,000、20,000、50,000、100,000、1百萬、5百萬、1千萬或單個分析系統內或甚至單個基板上的甚至更多奈米級發射容積或其他反應區域中的反應可為可能的。
使用前述系統，陣列中之數千、數萬、數十萬、數百萬或甚至數千萬個奈米級發射容積之同時分析為可能的。然而，當對多工之需要增加時，陣列上的奈米級發射容積之密度及區分此類陣列內之信號之能力難度增 加，因為串音(來自鄰近奈米級發射容積的信號，該等信號在其退出陣列時污染每一其他信號)、起因於較高水準之較密照明的減小之信號雜訊比等之問題增加。本揭示內容之陣列及方法藉由提供通過陣列之整合性裝置的光學信號之改良之色彩過濾來解決此等問題中之一些。
用於生產整合性分析裝置陣列之方法
在另一態樣中，本揭示內容提供用於生產整合性分析裝置陣列之方法。如以上所描述，此類陣列為有用的，例如，在核酸之大規模定序(尤其包括基因體定序)中。此類陣列可藉由各種方法生產。用於生產本陣列之一較佳方法涉及諸如半導體或MEMS(微機電系統)處理方法的微製造方法之使用，該等微製造方法已經高度發展以用於積體電路之生產。類似製程已用來產生用於各種應用之MEMS，該等各種應用包括噴墨印表機、加速計、壓力轉換器及顯示器(諸如數位微鏡顯示器(DMD))。微製造方法可應用於諸如晶圓的大基板，該大基板稍後可經切粒成許多單獨陣列，從而允許一次許多裝置陣列之生產。
本發明之方法可例如施加諸如光阻劑的抗蝕劑製程，以在基板或其他層上界定結構元件。刻蝕製程可用來生產三維結構，包括整合性分析裝置中之組件結構。沉積製程可用來將層增添至裝置上。諸如灰化、研磨、釋放、剝離及濕式清潔的其他半導體製程亦可用來產生本發明之結構，如以下更詳細地描述。
例如，微影技術可用來使用例如習知光刻、 電子束微影術等以自諸如光阻劑的聚合材料之中界定遮罩層。替代地，微影技術可連同層沉積方法一起施加至例如使用鋁、金、鉑、鉻或其他按照慣例使用的金屬的沉積金屬遮罩層，或其他無機遮罩層，例如，諸如矽、SiO2等的矽石基基板。替代地，負性諧調製程可用來界定對應於例如奈米井的抗蝕劑柱。參見例如美國專利第7,170,050號，該美國專利以引用方式整體併入本文以用於所有目的。遮罩層隨後可經沉積在抗蝕劑柱上，且該等柱隨後經移除。在尤其較佳態樣中，下層基板及遮罩層兩者係由相同材料製造，該材料在尤其較佳態樣中為透明基板材料，諸如SiO2基基板，諸如玻璃、石英或熔融矽石。藉由提供相同材料之遮罩層及下層層，技術人員可確保兩個層具有與該等層所暴露的環境之相同互動性，且因此最小化任何混合表面相互作用。
在SiO2基基板及遮罩層之狀況下，可使用習知製造製程。例如，帶有諸如波導的表面暴露特徵的玻璃基板可具有沉積在該玻璃基板之表面上的抗蝕劑層。遮罩層之負片隨後藉由抗蝕劑層之適當暴露及顯影來界定以提供抗蝕劑島狀物，技術人員希望在該等抗蝕劑島狀物處保持對下層特徵之接取。遮罩層隨後經沉積在表面上且剩餘抗蝕劑島狀物例如藉由剝離製程移除，以提供至下層特徵的開口。在金屬層之狀況下，沉積可藉由若干方式來實現，包括蒸發、濺射等。此類製程描述於例如美國專利第7,170,050號中。在矽石基遮罩層之狀況下，化學汽相沉 積(CVD)製程可用來將矽層沉積至表面上。在抗蝕劑層之剝離之後，熱氧化製程可將遮罩層轉換成SiO2。替代地，刻蝕方法可用來使用習知製程以蝕刻至下層層的接取點。例如，矽層可經沉積在下層基板上。抗蝕劑層隨後經沉積在矽層之表面上，且經暴露及顯影以界定遮罩之圖案。隨後使用適當微分蝕刻以移除矽但不移除下層SiO2基板來自矽層蝕刻接取點。一旦遮罩層經界定，使用例如熱氧化製程再次將矽層轉換成SiO2。
本發明之一態樣係關於用於生產整合性分析裝置陣列之製程，該製程包含以下步驟：提供基板層，該基板層可為光敏偵測器層，諸如CMOS感測器層、CCD層等；在基板層上沉積底部反射器層，其中該底部反射器層包含低折射指數材料及高折射指數材料之交替層；在底部反射器層上沉積第一空腔層，其中該第一空腔層包含低折射指數材料；圖案化且蝕刻第一空腔層以產生具有第一厚度之第一空腔濾波器元件及具有第二厚度之第二空腔濾波器元件的第一配置；在第一空腔層上沉積第一耦合反射器層，其中該第一耦合反射器層包含低折射指數材料及高折射指數材料之交替層；在第一耦合反射器層上沉積第二空腔層，其中該第二空腔層包含低折射指數材料；圖案化且蝕刻第二空腔層以產生具有第一厚度之第一空腔濾波器元件及具有第二厚度之第二空腔濾波器元件的第二配置；以及在陣列上沉積頂部反射器層，其中該頂部反射器層包含低折射指數材料及高折射指數材料之交替層。除非具體 描述，否則可在適合的情況下改變本文所描述之製程步驟之順序。在一些實施例中，可增添額外步驟，尤其陣列之其他層之間的額外層之沉積及圖案化。以下詳細提供此製造製程之一特定實例。在整合性分析裝置陣列之生產中有用的製程之進一步實例可見於美國專利申請案第13/920,037號中。
在以上示範性微製造技術中每一者中，製程始於一清潔基板層。在本方法中使用的基板層可具有任何適合剛性材料。基板層材料可包含例如諸如矽石的無機氧化物材料。較佳基板層材料包含偵測器層，諸如例如CMOS晶圓，亦即，由CMOS感測器或CCD陣列組成的晶圓。參見例如CMOS Imagers From Phototransduction to Image Processing(2004)Yadid-Pecht and Etienne-Cummings,eds.；CMOS/CCD Sensors and Camera Systems(2007)Holst及Lomheim；SPIE出版社。在一些狀況下，基板可已具有製造於表面上的裝置之一些組件。例如，在一些方法中，薄膜雷射斥拒濾波器之陣列可在色彩過濾層之製造之前已製造於基板上。
如以上所提及，本發明之方法在一些狀況下使用抗蝕劑來以微影術界定及生產結構。此等抗蝕劑可為例如光阻劑或電子束抗蝕劑。光阻劑可使用UV、深UV、G線、H線、I線或其他適合波長或波長之集合加以顯影。使用的抗蝕劑之類型及因此使用於處理的測試設備之類型將取決於產生的特徵之尺寸。許多抗蝕劑在此項技術中為 已知的，且許多抗蝕劑可商購自諸如Rohm及Haas以及Shipley的公司。在本發明之製程中使用的抗蝕劑可為負性光阻劑或正性光阻劑。在本文使用負性光阻劑來描述製程的情況下，將理解，在切實可行的情況下亦可使用適合的正性光阻劑，且反之亦然。在適當的情況下，亦可使用化學放大以便增加抗蝕劑之靈敏度。抗蝕劑之移除、清潔、沖洗、灰化及基板之乾燥可在適當時且如此項技術中所教導且已知地加以執行。
在本發明之一些態樣中使用刻蝕製程以便在基板中或在其他層中生產三維特徵，以適合例如空腔濾波器元件、光學元件或透鏡或反應容積諸如奈米井。使用的刻蝕製程將取決於所使用的材料之類型、特徵之尺寸及抗蝕劑系統。在一些狀況下，使用濕式蝕刻或濕式化學蝕刻。亦可使用電化學蝕刻。在一些實施例中，將電漿蝕刻或反應性離子蝕刻(RIE)用作刻蝕製程。亦可例如在需要具有高縱橫比之結構的情況下使用深反應性離子蝕刻。亦可使用例如以二氟化氙進行的乾式汽相蝕刻。塊體微機械加工或表面微機械加工可在適當時用來產生本揭示內容之裝置結構。在本揭示內容之方法中使用的蝕刻可為灰階蝕刻。抗蝕劑形成及蝕刻之條件經控制以生產具有所要幾何形狀(諸如具有所要側壁角度)的側壁。
本發明之一些製程涉及反射層或包覆層之沉積。此等反射層之沉積可藉由包括自溶液在層上噴絲的濕式製程或藉由氣相製程來實現。適合製程包括電鍍、濺 射沉積、物理汽相沉積、蒸發、分子束磊晶、原子層沉積及化學汽相沉積。可將金屬用作反射層及包覆層。適合的金屬包括金、鎳、鋁、鉻、鈦、鉑及銀。反射層及/或包覆層可包含鋁，該等反射層及/或包覆層可例如使用可自CVC、Novellus或MRC獲得的可商購濺射工具藉由濺射沉積。
在於本發明之製程期間沉積層的情況下，在一些狀況下，該等層在移動至製程中之下一步驟之前經處置。例如，沉積層可經退火、平面化、清潔、鈍化或稍微蝕刻以便改良該沉積層之性質。
在本發明之一些方法中，沉積保護層或犧牲層。保護層可為聚合層，或可為無機層。適合的保護層或犧牲層包括鍺(Ge)及非晶矽(a-Si)。保護層可用來生產如本文所描述之特徵。用於保護層或犧牲層的材料之類型可針對該層例如對濕式化學蝕刻劑之選擇反應性加以選取。例如，在一些狀況下，在存在二氧化矽及鋁的情況下以熱過氧化氫選擇性地蝕刻鍺之能力導致鍺經利用來生產與奈米井組合的光學結構。
在一些製程中，可使用拉回製程。拉回製程通常涉及自層內之特徵之邊緣蝕刻進入，以便減小特徵之尺寸。可使用濕化學試劑進行拉回，該濕化學試劑選擇性地與具有暴露邊緣的層反應。在一些狀況下，使用過氧化氫拉回鍺層。
一些方法使用研磨步驟以自表面移除表面 區域。適合的方法包括化學機械研磨或化學機械平面化(CMP)。
本發明之一些方法併入平面化層。用於沉積平面化層之方法取決於使用的材料之類型。平面化層可為硬材料，諸如無機材料，例如氮化矽；該平面化層可為金屬材料，諸如鋁；或該平面化層可為軟材料，諸如聚合材料，例如有機或矽基聚合物。平面化層可為玻璃，諸如二氧化矽材料。在一些狀況下，平面化層包含旋塗式玻璃，諸如矽酸鹽、磷矽酸鹽或矽氧烷材料。適合的旋塗式玻璃材料例如可得自Honeywell公司。平面化層可包含例如玻璃，該玻璃以其他試劑摻雜以控制該玻璃之融熔性質，諸如硼磷矽玻璃(BPSG)。適合的聚合平面化材料包括例如聚醯亞胺。
在本揭示內容之陣列諸如藉由例如遵循以下實例之裝置設計完成之後，該等陣列可進一步諸如例如藉由將陣列分離成個別晶片及使該等晶片準備好定序來處理。進一步處理步驟將取決於情形但可通常包括以下處理：表面處理(用以降低將DNA聚合酶吸引至奈米井之底部的比表面的一系列濕式/汽相處理)；堆疊(用以保護表面處理後裝置晶圓之頂表面且在一些狀況下產生用於定序混合物之井的製程)；薄化(複合頂板及表面處理後裝置晶圓可經薄化的製程一一包括磨光、精削、研磨或其他處理)；切粒(使用標準半導體切粒鋸將複合晶圓分成個別晶片的製程)；以及封裝(涉及標準拾取及置放工具以將晶片安裝 至基板上且產生用於資料收集之電氣輸出/光學輸出的製程)。此等進一步處理步驟為此項技術中已知的，或揭示於諸如美國專利申請公告第2008/0176769號及第2011/0183409號的參考文獻中，該等美國專利申請公告以引用方式整體併入本文以用於所有目的。
如先前所述，本發明之陣列可併入分析系統中以用於分析發生在陣列之奈米井中的多個反應。本文所描述之陣列通常具有流體自頂部可達及針對光學分析自底部可達的奈米井。因此通常將陣列併入感興趣的反應混合物經引入的容器中。在一些狀況下，個別奈米井全部處於與流體之一容積接觸中，該流體可具有例如可經分析的多個核酸模板分子，且該流體可具有核苷酸、輔因素及其他添加劑，以用於進行將要分析的反應。
包含陣列的容器可經置放於具有適當光學組件、電腦控制器及資料分析系統的儀器內。包含陣列的容器可保持在儀器內，使得可控制諸如容器溫度及容器大氣條件的反應條件。容器大氣條件可包含樣本上的例如濕氣的氣體之補給，及諸如氧的其他氣體物種之水平。
相關技術中之一般技術者將易於顯而易見，可在不脫離本發明或本發明之任何實施例之範疇的情況下進行對本文所描述之裝置陣列及方法之其他適合修改及調適。
現已詳細地描述本發明，參考以下實例將更清楚地理解本發明，以下實例與本文包括在一起以僅用於 例示之目的且不意欲為本發明之限制。
實例
在圖9中提供示範性裝置之示意圖，該示範性裝置包含雷射斥拒濾波器及色彩過濾層，該色彩過濾層包含兩個三空腔介電濾波器元件。為製造此類裝置之陣列，首先在基板上沉積雷射斥拒濾波器(RF)層，該雷射斥拒濾波器層包含低指數層/高指數層之若干對。接下來沉積低折射指數材料之層。此層充當雷射斥拒濾波器(RF)層與色彩過濾層之間的界面。
表1展示圖9之裝置之兩個三空腔濾波器堆疊之結構，該兩個三空腔濾波器堆疊分別充當濾色器元件1及濾色器元件2。濾色器元件1經設計來傳送600nm的光，而濾色器元件2經設計來傳送660nm的光。此等多空腔濾波器包含反射器及透明空腔之交替堆疊。
此色彩過濾層之多空腔濾波器中的反射器包括兩種材料之交替層：作為低指數材料的薄膜SiO2及作為高指數材料的薄膜矽材料。反射器中之層之厚度為四分之一波光學厚度。
在此實例中，兩個濾色器元件僅在其三個低指數空腔層(SiO2)之厚度方面不同。為產生不同空腔，首先沉積具有等於兩個所需要的空腔之厚度的厚度之低折射指數層。此層隨後經圖案化且蝕刻以達成較薄空腔之所需要的厚度。蝕刻步驟產生第一空腔濾波器元件及第二空腔濾波器元件之配置，該等第一空腔濾波器元件及第二空腔 濾波器元件與偵測器層上之第一像素及第二像素之圖案對準。
表1用於在色彩過濾層中用來傳送在600nm及660nm處的光學信號的兩個三空腔介電干涉堆疊之設計特徵。堆疊中之層以該等層之製造順序，亦即自偵測器層之表面至最接近於光源的層列表。識別為反射器的層含有薄膜矽材料及SiO2之具有四分之一波光學厚度之交替層。識別為空腔的層含有具有所指示實體厚度的SiO2之單個層。
Figure 105134745-A0305-02-0047-1
本文提及之所有專利、專利公開及其他公佈參考文獻由此以引用方式整體併入本文，尤如各自已單獨地且具體地以引用方式併入本文。
雖然已提供特定實例，但是以上描述為例示性的而非限制性的。先前描述之實施例之特徵中任何一或多個可以任何方式與本發明中之任何其他實施例之一或多個特徵組合。此外，熟習此項技術者在回顧本說明書後將 變得明白本發明之許多變化。因此，本發明之範疇應參考隨附申請專利範圍以及該等申請專利範圍之等效物之全部範疇來決定。

Claims (30)

  1. 一種整合性分析裝置陣列，其包含：一奈米級發射容積之陣列；一第一多空腔濾波器元件及第二多空腔濾波器元件之陣列，每一第一多空腔濾波器元件及第二多空腔濾波器元件光學地耦合至一奈米級發射容積；一偵測器元件之陣列，每一偵測器元件包含一第一像素及一第二像素，其中該等多空腔濾波器元件光學地耦合至該等偵測器元件；以及一透鏡元件之陣列，該透鏡元件之陣列安置在該奈米級發射容積之陣列與該偵測器元件之陣列之間；其中每一透鏡元件包含一繞射波束整形元件，其中該等奈米級發射容積藉由該等波束整形元件及該等第一多空腔濾波器元件光學地耦合至該等第一像素，且藉由該等波束整形元件及該等第二多空腔濾波器元件光學地耦合至該等第二像素；其中每一多空腔濾波器元件包含一底部反射器層，其包含一低折射指數材料及一高折射指數材料之交替層；一第一空腔層，其安置在該底部反射器層上，其中該第一空腔層包含該低折射指數材料；一第一耦合反射器層，其安置在該第一空腔層上，其中該第一耦合反射器層包含該低折射指數材料及該高折射指數材料之交替層； 一第二空腔層，其安置在該第一耦合反射器層上，其中該第二空腔層包含該低折射指數材料；以及一頂部反射器層，其安置在該第二空腔層上，其中該頂部反射器層包含該低折射指數材料及該高折射指數材料之交替層；其中該第一多空腔濾波器元件之該第一空腔層及該第二空腔層具有一第一厚度，以及該第二多空腔濾波器元件之該第一空腔層及該第二空腔層具有一第二厚度。
  2. 如請求項1之陣列，其中該高折射指數材料包含矽。
  3. 如請求項2之陣列，其中該高折射指數材料為一薄膜矽材料。
  4. 如請求項1之陣列，其中該高折射指數材料具有自2.5至5.0之一折射指數。
  5. 如請求項1之陣列，其中該低折射指數材料包含氧化矽。
  6. 如請求項5之陣列，其中該低折射指數材料為一薄膜二氧化矽材料。
  7. 如請求項1之陣列，其中該低折射指數材料具有自1.0至1.8之一折射指數。
  8. 如請求項1之陣列，其中每一第一多空腔濾波器元件及第二多空腔濾波器元件獨立地包含2至6個低折射指數空腔層。
  9. 如請求項1之陣列，其中每一第一多空 腔濾波器元件及第二多空腔濾波器元件獨立地包含3至7個反射器層。
  10. 如請求項1之陣列，其中該第一多空腔濾波器元件之該等空腔層之該第一厚度為一第一半波光學厚度或該第一半波光學厚度之倍數，以及該第二多空腔濾波器元件之該等空腔層之該第二厚度為一第二半波光學厚度或該第二半波光學厚度之倍數。
  11. 如請求項10之陣列，其中該第一厚度及該第二厚度在自150nm至350nm之一範圍內。
  12. 如請求項1之陣列，其中該第一多空腔濾波器元件之該等反射器層及該第二多空腔濾波器元件之該等反射器層為相同的。
  13. 如請求項1之陣列，其中該等濾波器元件傳輸可見光，且該等反射器層包含一四分之一波光學厚度之交替層。
  14. 如請求項1之陣列，其進一步包含一激發源，該激發源光學地耦合至該等奈米級發射容積。
  15. 如請求項14之陣列，其中該激發源為一波導激發源。
  16. 如請求項14之陣列，其進一步包含一雷射斥拒濾波器元件，該雷射斥拒濾波器元件安置在該激發源與該偵測器元件之陣列之間。
  17. 如請求項16之陣列，其中該雷射斥拒濾波器元件安置在該多空腔濾波器元件之陣列與該偵測器 層之間。
  18. 如請求項16之陣列，其中該雷射斥拒濾波器元件為一薄膜干涉濾波器。
  19. 如請求項18之陣列，其中該薄膜干涉濾波器包含一高折射指數材料及一低折射指數材料之交替層。
  20. 如請求項19之陣列，其中該高折射指數材料包含矽。
  21. 如請求項20之陣列，其中該高折射指數材料為一薄膜矽材料。
  22. 如請求項19之陣列，其中該高折射指數材料具有自2.5至5.0之一折射指數。
  23. 如請求項19之陣列，其中該低折射指數材料包含氧化矽。
  24. 如請求項23之陣列，其中該低折射指數材料為一薄膜二氧化矽材料。
  25. 如請求項19之陣列，其中該低折射指數材料具有自1.0至1.8之一折射指數。
  26. 如請求項1至25中任一項之陣列，其進一步包含一分析物，該分析物安置在該等奈米級發射容積內。
  27. 如請求項26之陣列，其中該分析物包含一生物樣本。
  28. 如請求項27之陣列，其中該生物樣本 包含一核酸。
  29. 如請求項28之陣列，其中該生物樣本包含一聚合酶酵素。
  30. 如請求項1至25中任一項之陣列，其中該陣列包含至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000或至少10,000,000個奈米級發射容積。
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