TWI793503B

TWI793503B - 抗IL-1β抗體

Info

Publication number: TWI793503B
Application number: TW110101816A
Authority: TW
Inventors: 溫蒂羅瑞赫斯; 安德魯迪森斯寇瑞
Original assignee: 美商美國禮來大藥廠
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2023-02-21
Also published as: CN114945593A; WO2021150486A1; CN114945593B; TW202140549A; JP2023512481A; EP4093766A1; JP7419544B2; US20230057665A1

Abstract

本發明提供人類經工程改造之IL-1β抗體，包含編碼該抗體之DNA之細胞及載體，及製備該等抗體之方法。此外，本發明提供人類經工程改造之IL-1β抗體之用途，其用於治療發炎性疾病，諸如心血管疾病及癌症。

Description

抗IL-1β抗體

本發明係關於醫藥領域。更特定言之，本發明係關於結合人類IL-1β (本文中IL-1 β或IL-1β或介白素-1β具有相同含義)及可用於治療及/或預防發炎性疾病，包括(但不限於)動脈粥樣硬化心血管疾病(ASCVD)、心臟衰竭、癌症及罕見遺傳性病症(諸如導致IL-1β之過度產生之遺傳性突變)之抗體。本發明亦關於治療及/或預防此等發炎性疾病之方法。

心血管疾病(CVD)為涉及心臟或血管之一類疾病。CVD之常見表現尤其包括心絞痛、心肌梗塞(MI，通常稱作心臟病發作)、中風、心臟衰竭及心律失常。因為該疾病之複雜性質，已識別有助於該疾病之開始及進展之許多風險因素。此等包括血脂異常、高血壓、糖尿病、抽菸、不健康膳食、缺乏運動及肥胖症。然而，儘管努力控制此等傳統風險因素，但是心血管疾病仍為美國及全世界死亡之首要原因。

最近二十年之研究強調發炎過程作為CVD，特定言之動脈粥樣硬化心血管疾病(ASCVD)之發病機理之關鍵組分。來自1990年代中期之流行病學資料指示，如由高敏感性C-反應蛋白(hsCRP)或介白素-6 (IL-6)量測之發炎與主要及次要預防二者中之未來主要不良心血管事件(MACE)強烈相關，而與傳統風險因素無關(Ridker等人，(2018)J. Am. Coll. Cardiol. 72: 3320-3331)。臨床前研究亦已證實發炎於動脈粥樣硬化斑塊開始及進展中之作用(Aday等人，(2019)Front. Cardiovasc. Med. 6: 16doi: 10.3389/fcvm.2019.00016 )。重要的是，發炎亦有助於斑塊不穩定及破裂，從而誘發急性心血管事件，諸如MI及中風。

介白素-1家族為發炎之關鍵要素及已經作為各種發炎性疾病之治療標靶進行良好研究(Szekely等人，(2018)Cardiol. Ther. 7: 25-44)。存在IL-1基因家族之三個成員：IL-1α、IL-1β及IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)。IL-1α及IL-1β為IL-1受體之促效劑，然而IL-1ra為IL-1 (IL-1α或IL-1β)之特異性受體拮抗劑及因此為IL-1 (IL-1α或IL-1β)之內源競爭性抑制劑。IL-1β為IL-1之主要循環形式。其作為前驅體(前IL-1β)產生，該前驅體在各種發炎刺激下經由NLRP3 (含NOD-、LRR-及熱蛋白域之蛋白質3)發炎體活化。重要的是，最近已發現已知與動脈粥樣硬化相關聯之多種因素會活化NLRP3發炎體。此等包括膽固醇晶體、動脈粥樣易感性(atheroprone)振盪流、低氧及嗜中性白血球細胞外陷阱，從而支持NLRP3發炎體-IL1β路徑於動脈粥樣化形成中之關鍵作用(Ridker (2016)Circ. Res. 118: 145-156)。

IL-1β之活化形式具有自分泌、旁分泌及內分泌效應及因此，涉及廣譜發炎性病症。尤其罕見遺傳性病症，諸如穆-韋二氏(Muckle Wells)症候群(MWS)、隱熱蛋白(cryopyrin)相關週期性症候群(CAPS)及新生兒發作多系統發炎症候群(NOMIS)係與IL-1β之過度產生相關聯。利用卡那單抗(canakinumab) (IL-1β抗體)、阿那白滯素(anakinra) (IL-1R拮抗劑)及利諾西普(rilonocept) (IL-1陷阱)之干預均改善此等過度產生症候群之症狀(Ridker (2016)Circ. Res. 118: 145-156)。

IL-1β抑制亦可於治療具有發炎性基礎之癌症中起作用。許多惡性病於慢性發炎區域中出現，及發炎之不當解決可於腫瘤侵襲、進展及轉移中起著主要作用(Grivennikov等人，(2010)Cell 140: 883-899)。發炎於肺癌中具有病理生理學相關性；例如，抽煙及其他外部吸入毒素觸發持久發炎反應。此發炎性活化部分地通過NLRP3發炎體之活化介導，其中局部產生活性IL-1β。於臨床中，已發現hsCRP及IL-6之高基線濃度與隨後診斷之肺癌相關聯。利用卡那單抗之IL-1β阻斷係與總癌症死亡率、肺癌發生率及肺癌死亡率之減少相關聯(Ridker等人，(2017)Lancet 390: 1833-1842)。

因此，本發明可用於治療或預防各種癌症，包括(但不限於)肺癌，例如，非小細胞肺癌(NSCLC)；乳癌，例如，三陰性乳癌(TNBC)；前列腺癌，例如，轉移性前列腺癌；血液癌，諸如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如，低或中等風險骨髓性白血病；胃癌，包括食道癌；卵巢癌、腎癌、肝癌(例如，肝細胞癌(HCC))；皮膚癌，例如，黑色素瘤；頭頸癌；腦癌；結腸直腸癌；膀胱癌；胰癌；及腎癌，例如，局部腎癌。

仍需要提供結合人類IL-1β之治療性抗體。特定言之，仍需要提供具有有利臨床屬性之IL-1β抗體。

本發明包括抗人類IL-1β之經工程改造之人類抗體。本發明之抗體具有下列性質中之一或多者：(1)以所需結合親和力及/或締合及解離速率結合人類及食蟹獼猴IL-1β；(2)強效IL-1β中和活性；(3)針對IL-1β之高特異性；及(4)低免疫原性风险。

本發明提供經工程改造之IL-1β抗體及包含編碼其之DNA之載體，及製備該等抗體之方法。此外，本發明提供經工程改造之IL-1β抗體之用途，其用於治療發炎性疾病，諸如心血管疾病及癌症，該等疾病可自調節(例如，拮抗) IL-1β信號傳導及/或改善IL-1β之過度產生之效應中受益。

因此，於一些實施例中，本發明提供結合人類IL-1β蛋白之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，及該VL包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1包含AASGFTFSDHYMS (SEQ ID NO:7)，該HCDR2包含YISSSGSTIYYADSVKG (SEQ ID NO:8)，該HCDR3包含AREADSSGYYYVGVDV (SEQ ID NO:9)，該LCDR1包含RASQSISSYLN (SEQ ID NO:11)，該LCDR2包含YGASSDQS (SEQ ID NO:12)，及該LCDR3包含QQGYYFPPT (SEQ ID NO:13)。

於一些實施例中，本發明提供抗體，其中該VH包含SEQ ID NO:6及該VL包含SEQ ID NO:10。於其他實施例中，本發明提供抗體，其中該VH由SEQ ID NO:6組成及該VL由SEQ ID NO:10組成。

於一些實施例中，本發明提供抗體，其中該VH包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18及該VL包含SEQ ID NO:10。於其他實施例中，本發明提供抗體，其中該VH由SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18組成及該VL由SEQ ID NO:10組成。

於一些實施例中，本發明提供抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO:2之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO:4之輕鏈(LC)。於一些實施例中，該抗體包含由SEQ ID NO:2組成之HC及由SEQ ID NO:4組成之LC。

於一些實施例中，本發明提供抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO:4之輕鏈(LC)。於其他實施例中，本發明提供抗體，其中該抗體包含由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16組成之重鏈(HC)及由SEQ ID NO:4組成之輕鏈(LC)。

於一些實施例中，本發明提供抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO:2之胺基酸2-445之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO:4之輕鏈(LC)。於其他實施例中，本發明提供抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16之胺基酸2-445之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO:4之輕鏈(LC)。

於一些實施例中，抗體之抗原決定基係藉由獲得抗體:抗原複合物之X-射線晶體結構並識別抗原上之哪些殘基係於所關注抗體上之殘基之4.5Å內來測定。於一個實施例中，本發明之抗體在包含SEQ ID NO:1之殘基R120、E153、K219、E221、N224、M264、Q265、F266及S268中之一些或所有之抗原決定基處結合至人類IL-1β (SEQ ID NO:1)。

於一些實施例中，該抗體具有經工程改造之人類IgG1或IgG4同型。

於較佳實施例中，該抗體具有經工程改造之人類IgG4同型。

於一些實施例中，本發明包含編碼SEQ ID NO:2或4之核酸序列。

於一些實施例中，本發明包含編碼SEQ ID NO:15或4之核酸序列。

於一些實施例中，本發明包含編碼SEQ ID NO:16或4之核酸序列。

於一些實施例中，本發明提供包含編碼SEQ ID NO:2之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO:4之第二核酸序列之載體。

於一些實施例中，本發明提供包含編碼SEQ ID NO:15之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO:4之第二核酸序列之載體。

於一些實施例中，本發明提供包含編碼SEQ ID NO:16之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO:4之第二核酸序列之載體。

於一些實施例中，本發明提供包含編碼SEQ ID NO:2之核酸序列之第一載體及包含編碼SEQ ID NO:4之核酸序列之第二載體。

於一些實施例中，本發明提供包含編碼SEQ ID NO:15之核酸序列之第一載體及包含編碼SEQ ID NO:4之核酸序列之第二載體。

於一些實施例中，本發明提供包含編碼SEQ ID NO:16之核酸序列之第一載體及包含編碼SEQ ID NO:4之核酸序列之第二載體。

於一些實施例中，本發明提供細胞，其包含包含編碼SEQ ID NO:2之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO:4之第二核酸序列之載體。

於一些實施例中，本發明提供細胞，其包含包含編碼SEQ ID NO:15之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO:4之第二核酸序列之載體。

於一些實施例中，本發明提供細胞，其包含包含編碼SEQ ID NO:16之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO:4之第二核酸序列之載體。

於一些實施例中，本發明提供細胞，其包含包含編碼SEQ ID NO:2之核酸序列之第一載體及包含編碼SEQ ID NO:4之核酸序列之第二載體。

於一些實施例中，本發明提供細胞，其包含包含編碼SEQ ID NO:15之核酸序列之第一載體及包含編碼SEQ ID NO:4之核酸序列之第二載體。

於一些實施例中，本發明提供細胞，其包含包含編碼SEQ ID NO:16之核酸序列之第一載體及包含編碼SEQ ID NO:4之核酸序列之第二載體。

於一實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。

於一實施例中，本發明提供一種製備抗體之方法，其包括在使得該抗體表現之條件下培養如上所述之細胞及自培養基回收該表現之抗體。

於一實施例中，本發明提供抗體，其藉由在使得該抗體表現之條件下培養如上所述之細胞及自培養基回收該表現之抗體製得。

於一實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體及醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。

於一實施例中，本發明提供包含兩條輕鏈及兩條重鏈之抗體，其中各輕鏈具有SEQ ID NO:4中所提供之胺基酸序列及各重鏈具有SEQ ID NO:2中所提供之胺基酸序列。

於一實施例中，本發明提供包含兩條輕鏈及兩條重鏈之抗體，其中各輕鏈具有SEQ ID NO:4中所提供之胺基酸序列及各重鏈具有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16中所提供之胺基酸序列。

於一實施例中，本發明提供一種預防疾病之方法，其包括投與本發明之抗體及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。於特定實施例中，本發明提供一種治療發炎性疾病之方法，其中該發炎性疾病係選自包括(但不限於)以下之列表：心血管疾病、癌症、穆-韋二氏症候群(MWS)、隱熱蛋白相關週期性症候群(CAPS)、新生兒發作多系統發炎症候群(NOMIS)、類風濕性關節炎、全身發作幼年特發性關節炎(soJIA)、痛風性關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、1型糖尿病、2型糖尿病、家族性冷因性自體發炎症候群(FCAS)及眼部疾病，例如，年齡相關黃斑變性。

於特定實施例中，本發明提供一種治療心血管疾病之方法，其中該心血管疾病係選自包括(但不限於)動脈粥樣硬化心血管疾病(ASCVD)或心臟衰竭之列表。

於特定實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其中該癌症類型係選自包括(但不限於)以下之列表：肺癌(例如，非小細胞肺癌(NSCLC))、三陰性乳癌(TNBC)、轉移性前列腺癌、低或中等風險骨髓性白血病及局部腎癌。

於一實施例中，本發明提供本發明之抗體，其用於療法中。於一實施例中，本發明提供本發明之抗體，其用於治療發炎性疾病。於一實施例中，本發明提供本發明之抗體，其用於治療心血管疾病。於一實施例中，本發明提供本發明之抗體，其用於治療癌症。於另一實施例中，本發明提供本發明之抗體，其用於治療發炎性疾病，其中該發炎性疾病為心血管疾病。於另一實施例中，本發明提供本發明之抗體，其用於治療發炎性疾病，其中該發炎性疾病為癌症。

於另一實施例中，本發明提供本發明之抗體之用途，其用於製造用於治療發炎性疾病之藥劑。於另一實施例中，本發明提供本發明之抗體之用途，其用於製造用於治療心血管疾病或癌症之藥劑。

本專利申請案主張2020年1月20日申請之美國臨時申請案第62/963,327號根據35 U.S.C. §119(e)之權益；該案之揭示內容係以引用的方式併入本文中。

如本文(包含隨附申請專利範圍)中所用，除非上下文另有明確指定，否則詞語之單數形式，諸如「一(a/an)」及「該」包含其對應複數個指示物。

如本文中所用，「抗體」為結合抗原之免疫球蛋白多肽分子。當其天然存在時，全長抗體為包含藉由二硫鍵互連之2條重(H)鏈及2條輕(L)鏈之免疫球蛋白分子。各鏈之胺基端部分包含約100至110個胺基酸之可變區，其主要負責經由互補決定區(CDR)之抗原識別。各鏈之羧基端部分限定主要負責效應功能之恆定區。

CDR中穿插更保守之區，稱作框架區(FR)。各輕鏈可變區(LCVR，亦稱作VL)及重鏈可變區(HCVR，亦稱作VH)由3個CDR及4個FR組成，自胺基端至羧基端依下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈之3個CDR稱作「LCDR1、LCDR2及LCDR3」及重鏈之3個CDR稱作「HCDR1、HCDR2及HCDR3」。該等CDR含有與抗原形成特異性相互作用之大多數殘基。VL及VH區內之CDR胺基酸殘基之編號及定位係根據熟知的Kabat編號慣例。

輕鏈分為κ或λ，及其特徵在於此項技術中已知之特定恆定區。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，及抗體之同型各自定義為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗體可進一步分成子類，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。各重鏈類型之特徵在於此項技術中熟知之序列之特定恆定區。

於一些生物系統及製備方法中，除了此項技術中熟知之其他修飾外，抗體亦可進行共轉譯或後轉譯修飾，諸如醣基化、脫醯胺化、醯化、氧化、環化、岩藻糖基化。另一已知修飾為麩醯胺酸或麩胺酸在包含重鏈之重鏈可變區之N端處環化成焦麩胺酸(通常縮寫為pyrGlu、pyrE、pGlu、或pE)。取決於所用之方法及抗體，轉化成焦麩胺酸之麩胺酸之百分比會有變化，且可能出現混合物，涉及實質上產生之所有抗體或極低百分比之抗體。

如本文中所用，術語「單株抗體」(mAb)係指衍生自單一複本或純系(包括例如任何真核、原核或噬菌體純系)之抗體，且不指其製造方法。本發明之mAb較佳地呈源或實質上同源群體。完整mAb含有2條重鏈及2條輕鏈。單株抗體可(例如)藉由雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術(例如，CDR接枝)或此類或此項技術中已知之其他技術之組合製備。

短語「經工程改造之人類」或「經工程改造之人類IL-1β抗體」係指經創建及/或操纵以具有根據本發明之結合及功能性質，結合至人類IL-1β，且具有經工程改造以含有與人類變異體之框架序列實質上相似或相同之框架序列之框架區的單株抗體，該框架區圍繞源自非人類抗體之CDR。人類及人源化抗體係此項技術中熟知。本文中經工程改造之人類抗體可例如於恆定區中與初始序列相比經有意修飾，以改變效應特徵或其他生物功能特徵，或生物物理特徵，諸如尤其穩定性、可發展性及/或溶解度。本文中另一實施例包括經工程改造之人類抗體，其包含全人類或實質上全人類重鏈及/或輕鏈恆定區。本文中另一實施例包括包含藉由二硫鍵互連之2條HC及2條LC之免疫球蛋白分子，其包含全人類或實質上全人類HC及LC恆定區。

此等人類經工程改造之抗體之「抗原結合片段」包括(例如) Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂ 片段及單鏈Fv片段。

「框架區」或「框架序列」係指框架區1至4中之任一者。由本發明包含之人類經工程改造之抗體及其抗原結合片段包括分子，其中框架區1至4中之任一者或多者為實質上人類或全人類，即，其中個別實質上人類框架區或全人類框架區1至4之可能組合中之任一者係存在。例如，此包含分子，其中框架區1及框架區2；框架區1及框架區3；框架區1、2及3等為實質上人類或全人類。實質上人類框架為與已知人類生殖系框架序列具有至少約80%序列同一性之彼等。人類框架生殖系序列可獲自ImMunoGeneTics (IMGT)或由Marie-Paule Lefranc及Gerard Lefranc之The 20 Immunoglobulin FactsBook ，Academic Press, 2001, ISBN 012441351。例如，生殖系輕鏈框架可選自由A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、L1、L11、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2及O8組成之群，及生殖系重鏈框架區可選自由VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VH1-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69、VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59及VH5-51組成之群。

如本文中所用，「IL-1β」(亦稱作IL-1β或IL-1β或介白素-1β)係指IL-1之主要循環形式。其作為在各種發炎性疾病下經由NLRP3發炎體活化之前驅體(前IL-1β或IL-1β前蛋白)產生。人類前IL-1β包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或其變異體。成熟人類IL-1β蛋白包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列或其變異體。

如本文中所用，「發炎性」包含發炎性及自體發炎性疾病二者。術語「發炎性疾病」包括(但不限於)心血管疾病、癌症、導致IL-1β之過度產生之罕見遺傳性病症及可自調節(例如，拮抗) IL-1β信號傳導受益之其他疾病。「發炎性疾病」可包括(但不限於)心血管疾病、心臟衰竭、癌症、穆-韋二氏症候群(MWS)、隱熱蛋白相關週期性症候群(CAPS)、新生兒發作多系統發炎症候群(NOMIS)、類風濕性關節炎、全身發作幼年特發性關節炎(soJIA)、痛風性關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、1型糖尿病、2型糖尿病、家族性冷因性自體發炎症候群(FCAS)及眼部疾病，包括(例如)年齡相關黃斑變性。

本文中術語「心血管疾病」係指涉及心臟或血管之一類疾病。CVD之特徵之非詳細列表包括(但不限於)心絞痛、心肌梗塞(MI，通常稱作心臟病發作)、中風、心臟衰竭及心律失常。

本文中術語「癌症」係指涉及異常細胞生長具有侵襲或擴散至身體其他部位之潛力之疾病群組。癌症之類型之非詳細列表包括(但不限於)肺癌(例如，非小細胞肺癌(NSCLC))、三陰性乳癌(TNBC)、轉移性前列腺癌、低或中等風險骨髓性白血病及局部腎癌。因此，癌症可涉及來自以下之細胞：實體組織或器官，諸如腦、乳腺、結腸直腸、皮膚、肝、腎、肺、胰腺、前列腺、頭頸、卵巢、子宮、膀胱、胃(胃，包括食道)；結締組織，諸如肉瘤或骨癌；或血液，諸如淋巴瘤、白血病及骨髓瘤。癌症亦可藉由其細胞起源描述，諸如源自身體各部位之上皮細胞之癌，或源自腺之腺瘤。

當「治療」應用於動物、人類、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體時，其係指外源醫藥、治療劑或組合物與該動物、人類、個體、細胞、組織、器官或生物流體之接觸。當術語「治療(treatment/treat/treating)」應用於人類或研究個體時，其係指涉及減慢、干擾、抑制、控制、停止、降低或逆轉與IL-1β活性相關聯之症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重度，但是不一定涉及與IL-1β活性相關聯之所有疾病相關症狀、病狀或病症之總消除的過程。當「治療(treatment/treat/treating)」應用於藥物動力學、診斷、研究及實驗方法時，其包含試劑與細胞之接觸，以及試劑與流體之接觸，其中該流體係與細胞接觸中。術語「預防(preventing/prevent)」係指避免某事發生、存在或出現及/或阻止或停止做某事。

術語「活化」可係指細胞活化，如藉由內部機制以及藉由外部或環境因素所調節。

分子之「活性」可描述或係指分子與配位體或與受體之結合，係指催化活性；刺激基因表現或細胞信號傳導、分化或成熟之能力；抗原活性，其他分子之活性之調節及類似者。分子之「活性」亦可係指調節或維持細胞間相互作用(例如，黏附)之活性，或維持細胞結構(例如，細胞膜或細胞骨架)之活性。「活性」亦可意指特定活性(例如，[催化活性]/[mg蛋白質]或[免疫活性]/[mg蛋白質])、生物隔室中之濃度或類似者。

根據本發明之除了本文中所揭示之展示相似功能性質之彼等以外之經工程改造之人類抗體可使用若干種不同方法產生。本文中所揭示之特異性抗體化合物可用作製備附加抗體化合物之模板或親本抗體化合物。於一種方法中，親本抗體化合物CDR接枝至與親本抗體化合物框架具有高序列同一性之人類框架。新穎框架與親本抗體化合物中之對應框架之序列之序列同一性一般將為至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%相同。此接枝可導致結合親和力相較於親本抗體之結合親和力之降低。若情況如此，則該框架可在某些位置基於特定標準回突變至親本框架，如由Quee等人，Al (1991)Proc. Natl. Acad. Sci US 88:2869所揭示。描述可用於人源化抗體之方法之另外參考文獻包括美國專利第4,816,397號、第5,225,539號及第5,693,761號；如Levitt (1983)J. Mol. Biol. 168: 595-620中所述之電腦程式ABMOD及ENCAD；及Winter及同事之方法(Jones等人，(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等人，(1988)Nature 332:323-327；及Verhoeyen等人，(1988)Science 239:1534-1536)。

可如下進行考慮用於回突變之殘基之識別：

當胺基酸落入類別(其中受體框架之人類框架區中之胺基酸針對該位置處之人類框架為非尋常，而供體免疫球蛋白中之對應胺基酸針對該位置處之人類框架為典型)中時，正在使用之人類生殖系序列(「受體框架」)之框架胺基酸經來自親本抗體化合物之框架(「供體框架」)之框架胺基酸置換。

當受體框架之人類框架區中之胺基酸各者及供體框架中之對應胺基酸一般針對該位置處之人類框架為非尋常時，此胺基酸可經針對該位置處之人類框架典型之胺基酸置換。此回突變標準使吾人能恢復親本抗體化合物之活性。

產生展示與本文中所揭示之抗體化合物相似功能性質之經工程改造之人類抗體之另一種方法涉及將經接枝CDR內之胺基酸隨機突變而不改變框架且針對與親本抗體化合物之彼等一樣好或較之更好之結合親和力及其他功能性質篩選所得分子。單突變亦可在各CDR內之各胺基酸位置處引入，接著評估此等突變對結合親和力及其他功能性質之影響。可將產生改善之性質之單突變組合以評估其彼此組合之效應。

另外，上述方法二者之組合係可能的。於CDR接枝後，除了於該等CDR中引入胺基酸變化以外，吾人可將特異性框架區回突變。此方法述於Wu等人，(1999)J. Mol. Biol. 294: 151-162中。

本發明之經工程改造之人類抗體可用作人類醫藥之藥劑，藉由各種途徑投與。最佳地，此等組合物係用於非經腸投與。此等醫藥組合物可藉由此項技術中熟知之方法製備(參見，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy ；第19版(1995)，A. Gennaro等人，Mack Publishing Co.)及包含如本文中所揭示之經工程改造之人類抗體及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

下列檢定之結果證實，本發明之例示單株抗體及其抗原結合片段會結合及/或中和IL-1β及因此可用於治療發炎性疾病，諸如心血管疾病或癌症。

實例 1 ：抗體表現及純化 當建構本發明之抗IL-1β抗體時，遇到關於化學及物理穩定性之重大問題。例如，利用初始構築體遇到之問題包括低結合親和力、可變區脫醯胺化、氧化及低效能。

存在待克服之關於結合親和力及化學及物理穩定性之重大問題，及本發明之化學及物理修飾出人意料地克服此等問題。在重鏈及輕鏈二者中引入胺基酸修飾。本發明之抗體包含來自原始構築體之多個殘基變化，經識別為具有高結合親和力及為化學上及物理上穩定。本發明之抗體所包含之修飾中無一者於初始構築體中經識別。

表1中呈現本發明之示例性抗體。

本發明之抗體可如下製備及純化。適宜宿主細胞(諸如HEK 293或CHO)係利用用於分泌抗體之表現系統使用各自編碼抗體I_HC或抗體II_HC之序列及抗體I及II之共用LC序列之最佳化預定之HC:LC載體比率短暫轉染。將其中已分泌抗體之澄清介質使用許多常用技術中之任一者純化。例如，可將該介質方便施覆至已利用相容緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)平衡之蛋白質A或G管柱。將該管柱洗滌以移除非特異性結合組分。將結合之抗體(例如)藉由pH梯度(諸如0.1M磷酸鈉緩衝液pH 6.8至0.1M檸檬酸鈉緩衝液pH 2.5)溶離。抗體溶離份係藉由諸如SDS-PAGE檢測，及然後彙集。進一步純化係視情況可選，取決於預期用途而定。可將抗體使用常見技術濃縮及/或無菌過濾。可溶性聚集體及多聚體可藉由常見技術，包括尺寸排阻、疏水相互作用或離子交換層析法有效移除。於此等層析法步驟後抗體之純度係大於99%。產物可在-70℃下立即冷凍或可凍乾或在4℃下保存供立即使用。

實例 2 ：抗體發現及工程改造 一組人類抗IL-1β抗體係使用全人類酵母展示庫獲得及經篩選以識別可為有效IL-1β中和抗體之試劑。將突變系統地引入各抗體之個別互補決定區(CDR)及使所得變異體經受多輪選擇，其中減少抗原濃度及/或增加解離週期以分離具有改善之親和力之純系。個別變異體之序列經測定及可用於構築組合庫，該庫經受具有增加之嚴格性之另一輪選擇以識別個別CDR區之間之累加或協同突變對。將個別組合純系定序及測定結合特徵。亦可將選定之抗體誘變以固定轉譯後修改，諸如甲硫胺酸氧化，同時仍保留對IL-1β之結合親和力。此外，為減少潛在免疫原性，對抗體進行框架(FW)取代以使此等FW1序列恢復至其生殖系狀態。

獲得本文中稱作抗體I及抗體II之經工程改造及/或最佳化抗IL-1β抗體，其具有重鏈及輕鏈之可變區之胺基酸序列，及完全重鏈及輕鏈胺基酸序列，及編碼其之核苷酸序列，如題名為「胺基酸及核苷酸序列」之部分中所列。對應於此等片段之序列ID，以及輕鏈及重鏈CDR胺基酸序列示於下表1中。表 1.

	抗體 I (SEQ ID NO)	抗體 II (SEQ ID NO)
VH	17	18
VL	10	10
HC	15	16
LC	4	4
HC CDR1	7	7
HC CDR2	8	8
HC CDR3	9	9
LC CDR1	11	11
LC CDR2	12	12
LC CDR3	13	13

實例 3 ： 人類或食蟹獼猴 IL-1 β 於活體外之中和 於大腸桿菌(E.coli)中作為N端HIS-SUMO融合蛋白產生重組人類或食蟹獼猴IL-1β。將蛋白質使用HisPur Ni-NTA層析法純化及接著移除內毒素。然後將經純化之融合蛋白用SUMO蛋白酶Ulp1處理以將HIS-SUMO自融合蛋白裂解除去。然後將經裂解之HIS-SUMO蛋白藉由HisPur Ni-NTA自反應移除，及使用Superdex 75尺寸排阻層析法將未經標記之IL-1β進一步純化至均一性。

本發明之抗體預期會中和IL-1β。IL-1β活性藉由抗體I及/或抗體II之中和可藉由一或多種IL-1β細胞基活性檢定(例如，如下所述)來評估。

IL-1β/IL-1R結合之中和劑之篩選最初可通過高通量細胞基檢定使用表現螢光素酶基因之海拉細胞在NF-kB啟動子之控制下進行。此檢定使用NF-κB螢光素酶報告信號作為重組IL-1β誘導之信號傳導之讀出。然後將IL-1β之中和藉由量測螢光素酶活性在滴定抗IL-1β抗體後之減少程度來定量。或者，另一種活體外中和檢定(諸如HEK-Blue細胞基檢定)係詳細描述於下文中。

具體而言，將HEK-Blue™ IL-1β細胞於T-75燒瓶中之生長培養基(DMEM，4.5 g/l葡萄糖，2 mM L-麩醯胺酸，10% (v/v)胎牛血清，50 U/mL盤尼西林(penicillin)，50 µg/mL鏈黴素(streptomycin)、100 µg/mL Normocin™，100 μg/mL Zeocin™及200 μg/mL潮黴素(Hygromycin) B Gold)中培養直至90%匯合。將細胞用PBS (不含Ca⁺⁺ 及Mg⁺⁺ )洗滌兩次及於1 mL PBS中培育2分鐘。然後藉由在燒瓶側面輕拍將細胞分離，利用10 mL測試培養基(DMEM，4.5 g/l葡萄糖，2 mM L-麩醯胺酸，10% (v/v)熱失活FBS (在56℃下30分鐘)，50 U/mL盤尼西林，50 µg/mL鏈黴素，100 µg/mL Normocin™)再懸浮，計數及用測試培養基稀釋至0.33 x 10⁶ 個細胞/mL。於測試培養基中將重組人類或食蟹獼猴IL-1β及測試物品製備成所需濃度。將40 µL抗體(5x濃度)與10 µL IL-1β (20x濃度，檢定中之最終濃度為4 pM)於BioCoat聚-D-離胺酸板(Corning 354461)中混合及在室溫下培育30分鐘。將以0.33 x 10⁶ 個細胞/mL之150 µL HEK-Blue™ IL-1β細胞懸浮液分配至含有抗體及IL-1β混合物之聚-D-離胺酸板之各孔。將該板在37℃，5% CO₂ 及90%相對濕度下培育過夜。第二天，將來自聚-D-離胺酸板之25 µL培養基轉移至Costar檢定板(Corning 3695)。將預升溫至37℃之75 µL QUANTI-Blue檢測溶液(Invivogen目錄號rep-qb1，rep-qb2)添加至該檢定板。將該檢定板覆蓋及在37℃下培育1小時，之後在板讀取器(SpectraMax Plus, Molecular Device)上在OD₆₅₀ nm下讀取。將數據標準化及表示為4 pM IL-1β之抑制%：0%抑制= 4 pM IL-1β，100%抑制= 0 pM IL-1β。中和抗hIL-1β抗體阻斷重組人類IL-1β刺激HEK-Blue™ IL-1β細胞之活性。中和抗體之相對效能係使用4參數邏輯擬合計算及以IC50值表示。表 2 ：人類或食蟹獼猴 IL-1β 於活體外之中和

抗體	人類IL-1β抑制IC₅₀ (pM)	SD (pM)	食蟹獼猴IL-1β抑制IC₅₀ (pM)	SD (pM)
卡那單抗	29.17	1.04	＞10000	NA
抗體I	30.20	1.95	33.89	1.24
抗體II	28.69	1.17	31.52	3.25
	NA：不適用

實例 4 ：人類 IL-1β 於活體內之中和 人類IL-1β可結合至且刺激小鼠IL-1受體，從而導致血清中之小鼠細胞激素IL-6升高。採用時間及劑量範圍研究來判別人類IL-1β之最佳劑量及引入小鼠IL-6之最佳時間。為測試本發明之抗體之活體內中和活性，以下描述最佳化方案。具體而言，該研究採用來自Envigo之約9週齡雄性C57BL/6小鼠。小鼠接受飼餵正常飼料膳食(Harlan Teklad膳食，2014)及依據體重隨機至處理組(n = 5至8隻/組)。將本發明之抗體及對照抗體溶解於生理鹽水中，及依所指示之劑量程度經皮下投與。24小時後，將人類IL-1β溶解於生理鹽水中，及以1 µg/kg劑量程度經腹膜內給藥。2小時後，經由眼窩抽血收集血液樣品，接著在2000 g下離心3分鐘以分離血清樣品。

使用V-PLEX小鼠IL-6套組(Meso Scale Discovery，目錄號K152QXD-2)，按照製造商之說明測定血清中之小鼠IL-6含量。簡言之，將MSD板用150 µL洗滌緩衝液洗滌3次。將50 µL先前製備之校準劑(連續稀釋)、對照及測試樣品(稀釋1:10)轉移至板上之適宜孔中，接著在室溫下振盪(500至1000 rpm) 2小時。用150 µL洗滌緩衝液洗滌該板3次。然後將25 µL檢測抗體溶液添加至各孔，接著在室溫下振盪(500至1000 rpm) 2小時。用150 µL洗滌緩衝液洗滌該板3次。將150 µL 2x讀取緩衝液添加至各孔。立即在MSD SQ120板讀取器上讀取該板。使用4參數邏輯擬合法，從校準曲線分析測試樣品之IL-6濃度。

採用同型匹配之對照抗體(IgG4-PAA)作為該研究之陰性對照。所計算之數據為相較於對照組之平均IL-6含量之抑制%。使用單因子ANOVA、鄧尼特氏(Dunnett’s)事後與JMP11軟體評估平均值之差異之統計顯著性。本發明之抗體隨劑量阻斷人類IL-1β刺激小鼠IL-1受體所介導小鼠IL-6增加的效應(表3-1，3-2)。表 3-1 ：人類 IL-1β 使用抗體 I 於活體內之中和

分子	劑量程度 (µg/kg)	相對於 IgG4-PAA 對照之抑制 %	( 抑制 % 之 ) SE
IgG4-PAA 對照	4000	0.0	12.2
卡那單抗	60	14.9	10.3
卡那單抗	200	10.2	15.9
卡那單抗	600	-54.6	11.3
卡那單抗	2000	-86.6	2.8
卡那單抗	4000	-95.3	1.2
抗體 I	60	-36.2	9.7
抗體 I	200	-21.4	15.2
抗體 I	600	-73.1	4.9
抗體 I	2000	-95.9	0.9
抗體 I	4000	-96.6	0.8

表 3-2 ：人類 IL-1β 使用抗體 II 於活體內之中和

分子	劑量程度 (µg/kg)	相對於 IgG4-PAA 對照之抑制 %	( 抑制 % 之 ) SE
IgG4-PAA 對照	4000	0.0	16.0
卡那單抗	200	-28.4	15.3
卡那單抗	600	-80.9	2.0
卡那單抗	2000	-94.3	0.3
卡那單抗	4000	-96.8	0.3
抗體 II	60	-54.1	5.0
抗體 II	200	-44.0	10.6
抗體 II	600	-81.2	1.5
抗體 II	2000	-95.0	0.4
抗體 II	4000	-97.7	0.4

實例 5 ：抗體 I 及抗體 II 藉由 MSD-SET 之結合親和力量測 利用MSD (Meso Scale Discovery)電化學發光檢定來量測抗體I、抗體II及卡那單抗針對人類IL-1β之親和力。首先，建立抗體及人類IL-1β之平衡混合物；於該混合物中，將抗體濃度在1 pM、10 pM及100 pM下保持恆定，而將配位體以0.9 nM至0.00004 nM (在濃度之間2.5倍稀釋)範圍之濃度滴定。於密封的非結合96孔板中在37℃下建立平衡混合物持續72小時。

使用MSD Gold鏈黴抗生素(Streptavidin)板檢測平衡混合物中之游離抗體。將該等MSD板首先在設置在800 rpm下之振盪器上用阻斷緩衝液(PBS + 1% BSA)阻斷1小時及然後用洗滌緩衝液PBST (PBS + 0.05%吐溫20)洗滌3次。將該等板用經生物素化之人類IL-1β塗覆，接著用PBST洗滌3X。將平衡混合物添加至塗覆板中，在室溫與振盪下培育2.5分鐘及立即用PBST洗滌3X。將山羊抗人類Sulfo-TAG抗體添加至該板中及在室溫下培育1小時，同時振盪。於再三次洗滌後，將於MilliQ水中以1:2濃度稀釋之MSD讀取緩衝液添加至孔中。緊接著，使用MSD Sector 成像儀SI6000儀器讀取該等板。

針對數據評價，將MSD儀器之讀出輸入至基於客製Excel或GraphPad Prism 8之評價程式中，該程式自動將滴定數據作圖，及計算K_D 值以及統計參數。表 4 ：對抗體之結合親和力 ( 配位體 : 人類 IL-1β 在 37 ℃下 )

	親和力 K_D ± SE (pM)
抗體 I	25.7 ± 0.2
抗體 II	22.5 ± 0.4
卡那單抗	13.1 ± 0.2

實例 6 ：免疫原性風險評估 如下所示，針對臨床免疫原性之相對風險，使用電腦模擬(in silico)及離體方法經由與US 7,714,120 (本文中US’120)之代表性抗體及卡那單抗相比來表徵抗體II。

樹突狀細胞 (DC) 內部化檢定 此檢定評估人類DC將所測試抗體內部化之能力。利用IL-4及GM-CSF培養CD14+細胞及分化成不成熟DC。將測試抗體、同型對照或陽性對照用檢測劑(Fab-QSY7-TAMRA)以1:1比率預培育以形成複合物及然後添加至培養物。將細胞培育1天。在內部化及分裂後，藉由流動式細胞測量術檢測陽性TAMRA信號，及使用IgG1-EN同型對照及抗CXCR抗體計算標準化之內部化指數。

MAPPS 檢定 (MHC 相關聯之肽蛋白質組學 ) MAPPS譜化先前經測試抗體處理之人類樹突狀細胞上之MHC-II呈遞肽。自正常人類供體之PBMC分離之CD14+細胞藉由利用IL-4及GM-CSF培育來培養及分化成不成熟DC。第4天，將培養基用含有測試抗體之新鮮培養基替換。第5天，添加LPS以使細胞轉形成成熟DC。第6天，將細胞於具有蛋白酶抑制劑之RIPA緩衝液中溶解。使用偶合至鏈黴抗生物素珠之經生物素化之抗MHC-II抗體進行MHC-II複合物之免疫沉澱。將結合之複合物溶離及過濾。藉由質譜儀分析經分離之MHC-II肽。肽識別係藉由內部蛋白質組學管道使用搜索演算法在無酵素下及具有隨附測試序列之牛/人類資料庫生成以測定顯示來自測試候選之互補決定區之MHC-II肽之供體的百分比。使用KNIME工作流程處理樣品之識別檔案。將自測試物品識別之肽針對親本序列進行比對。

電腦模擬 TCEM (T 細胞暴露基序 ) 分析此分析評估由MAPPS識別之特異性肽簇將活化CD4+ T細胞之可能性。將含有非生殖系殘基之經MAPPS識別之肽序列輸入至ImmunoEpitope資料庫(IEDB)分析資源MHCII結合預測頁面。選擇IEDB建議之預測方法。該預測考慮27種最頻繁HLA-DR、-DP及-DQ對偶基因以覆蓋人類群體之大部分。將具有等於或大於15個殘基之長度之各輸入序列分成抵消1個胺基酸之重疊15聚體以跨整個序列。針對各肽，藉由比較肽之分數與選自SWISSPROT資料庫之五百萬隨機15聚體之分數產生百分位排名。位於暫存器之推定P-1、P2、P3、P5、P7及P8位置處之胺基酸生成TCEM，及基於此等位置處之非生殖系殘基之存在來限定風險。非生殖系殘基及核結合至多個對偶基因之可能性以圖形展現報告及考慮免疫原性風險評估。

MS 血清結合 此檢定評估測試候選與血清蛋白之脫靶結合。將所測試抗體塗覆至Immulon 4 HBX微量盤上。於阻斷後，添加人類血清並培育過夜。將結合蛋白溶離，還原，烷基化及消化。藉由質譜儀分析肽。藉由內部蛋白質組學管道使用搜索演算法利用胰蛋白酶酵素及具有隨附測試抗體序列之人類資料庫生成肽及蛋白質識別。將離子藉由內部蛋白質組學工具(Chrom-Alignment、Metaconsense及Quant)定量及於JMP中使用單因子分析/各對，史都登氏t檢驗平臺分析。針對離子使用JMP在log2auc上分析：按照各離子/比較平均值/所有對，塔基HSD，將Y用X擬合。

T 細胞增殖檢定 此檢定評估所測試抗體或所測試MAPPS肽藉由誘導細胞增殖來活化CD4+ T細胞之能力。製備CD8+ T細胞耗盡之PBMC及用CFSE標記。利用培養基對照、鑰孔血藍蛋白(KLH；陽性臨床基準對照)、所測試抗體或所測試MAPPS肽測試各樣品。將培養物培育7天。第7天，藉由流動式細胞測量術分析樣品。

先已存在之反應性 (ACE- 橋形式 ) 此檢定評估針對人類血清中之所測試抗體之先已存在之抗體的存在。將經稀釋血清在塗覆有經生物素化之測試抗體之板上捕獲過夜。第二天，將經捕獲之反應性蛋白質酸溶離，及然後在存在經生物素化及釕化之測試抗體下中和。若存在抗藥物抗體，則其將橋接經標記之測試抗體並形成複合物。將該等複合物藉由經鏈黴抗生物素塗覆之中尺度板捕獲，及將所得信號稱作Tier 1信號(表示為電化學發光)。於檢測步驟中，此信號藉由添加過量未經標記之測試抗體以Tier 2證實，其導致Tier 1信號之抑制。將先已存在之抗藥物抗體之存在表示為Tier 2抑制之第90百分位數之量級。表 5. 免疫原性風險評估概述

檢定	卡那單抗	US’120	抗體 II
DC 內部化	內部化指數：9.8	內部化指數：3.5	內部化指數：16.3
MAPPS 檢定具有不同MHC之10個供體	100%供體顯示3個非生殖系簇中之至少1者：H2 (10%)、VHFR3 (90%)、L2 (10%)	70%供體顯示4個非生殖系簇中之至少1者：H1 (40%)、H2 (40%)、L1 (10%)、L2 (10%)	20%供體顯示2個非生殖系簇中之至少1者：H3：10%、L2：10%
MAPPS肽之電腦模擬 TCEM 分析	H2含有2個及L2含有1個非生殖系T細胞接觸位置	所有簇在T細胞接觸位置處含有至少2至4個非生殖系殘基	H3在T細胞接觸位置處含有至少2個及L2含有1個非生殖系殘基
MS 血清結合 8至10個供體之池	未檢測到脫靶結合	完全引發補體複合物 (C1q/r/s-C4)	未檢測到脫靶結合
T 細胞增殖檢定：蛋白質具有不同MHC之10個供體	未測試	未測試	0%陽性供體頻率(0/8個供體)
T 細胞增殖檢定： MAPP 肽具有不同MHC之10個供體	未測試	未測試	針對H3之40%陽性供體(4/10個供體)
先已存在之反應性第90百分位數T2抑制＞50個供體	ACE-橋：68%	ACE-橋：19.5%	ACE-橋：18.7%

縮略語：ACE =酸捕獲溶離；CDR =互補決定區；DC =樹突狀細胞；H1 = VH CDR1；H2 = VH CDR2；H3 = VH CDR3；L1 = VL CDR1；L2 = VL CDR2；MAPPs = MHC相關聯之肽蛋白質組學；MHC =主要組織相容性複合物；MS =質譜法；T2 = Tier 2；TCEM = T細胞暴露基序；VH =可變重鏈；VL =可變輕鏈；VHFR3 =可變重鏈框架3

實例 7 ：抗人類 IL-1β 抗體 II 之抗原決定基定位 使用X射線結晶學獲得IL-1β抗體II Fab複合物之高解析度結構。為形成IL1β-抗體II Fab複合物，使IL-1β SEQ ID NO:14及抗體II表現，純化，及混合。將該複合物使用通常已知技術結晶。參見Vonrhein, C.等人，Biological Crystallography 67 , 293-302 (2011)，Evans, P. R.及Murshudov, G. N.，Biological Crystallography 69 , 1204-1214 (2013)，McCoy, A. J.等人，Journal of Applied Crystallography 40 , 658-674 (2007)，Emsley, P.、Lohkamp, B.、Scott, W. G.及Cowtan, K.，Biological Crystallography 66 , 486-501 (2010)，Murshudov, G. N.等人，Biological Crystallography 67 , 355-367 (2011)，Winn, M. D.等人，Biological Crystallography 67 , 235-242 (2011)，及Williams, C. J.等人，Protein Science 27 , 293-315 (2018)。

該抗原決定基顯示抗體II上之殘基之4.5Å內之IL-1β胺基酸殘基，包括R120、E153、K219、E221、N224、M264、Q265、F266及S268 (根據SEQ ID NO:1)。

胺基酸及核苷酸序列 SEQ ID NO:1：(人類IL-1β前蛋白或前-hIL-1β) MAEVPELASEMMAYYSGNEDDLFFEADGPKQMKCSFQDLDLCPLDGGIQLRISDHHYSKGFRQAASVVVAMDKLRKMLVPCPQTFQENDLSTFFPFIFEEEPIFFDTWDNEAYVHDAPVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS SEQ ID NO:2：(抗體I及抗體II之HC) X₁ VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREADSSGYYYVGVDVWGQGTX₂ VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 其中X₁ 為E或pE 其中X₂ 為M或L SEQ ID NO:3：(抗體I及II之HC DNA) gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgaggctctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtgaccactacatgagctggatccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtttcatacattagtagtagtggtagtaccatatactacgcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagggacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggcggtgtactactgcgccagagaggctgacagcagcggatactactacgtgggcgtagacgtatggggtcagggtacaatggtcaccgtctcctcagccagcaccaagggcccatcggtcttcccactagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagccggtgacggtgtcgtggaactcaggagccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtaacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt SEQ ID NO:4：(抗體I及抗體II之LC) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSDQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYYFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:5：(抗體I及抗體II之LC DNA) gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatggtgcatccagtgatcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcagcaaggatactacttccctcctacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaacgaaccgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc SEQ ID NO:6：(抗體I及抗體II之VH) X₁ VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREADSSGYYYVGVDVWGQGTX₂ VTVSS 其中X₁ 為E或pE 其中X₂ 為M或L SEQ ID NO:7：(抗體I及抗體II之HCDR1) AASGFTFSDHYMS SEQ ID NO:8：(抗體I及抗體II之HCDR2) YISSSGSTIYYADSVKG SEQ ID NO:9：(抗體I及抗體II之HCDR3) AREADSSGYYYVGVDV SEQ ID NO:10：(抗體I及抗體II之VL) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSDQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYYFPPTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:11：(抗體I及抗體II之LCDR1) RASQSISSYLN SEQ ID NO:12：(抗體I及抗體II之LCDR2) YGASSDQS SEQ ID NO:13：(抗體I及抗體II之LCDR3) QQGYYFPPT SEQ ID NO:14 (成熟人類IL-1β；SEQ ID NO:1之殘基117-269) APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS SEQ ID NO:15 (抗體I之HC) X₁ VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREADSSGYYYVGVDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 其中X₁ 為E或pE SEQ ID NO: 16 (抗體II之HC) X₁ VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREADSSGYYYVGVDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 其中X₁ 為E或pE SEQ ID NO:17：(抗體I之VH) X₁ VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREADSSGYYYVGVDVWGQGTMVTVSS 其中X₁ 為E或pE SEQ ID NO:18：(抗體II之VH) X₁ VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREADSSGYYYVGVDVWGQGTLVTVSS 其中X₁ 為E或pE SEQ ID NO:19 (卡那單抗HC) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO:20 (卡那單抗LC) EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims

一種結合人類IL-1β蛋白之抗體，其包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區(HCDR)HCDR1、HCDR2及HCDR3，及該VL包含輕鏈互補決定區(LCDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1係由AASGFTFSDHYMS(SEQ ID NO：7)組成，該HCDR2係由YISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO：8)組成，該HCDR3係由AREADSSGYYYVGVDV(SEQ ID NO：9)組成，該LCDR1係由RASQSISSYLN(SEQ ID NO：11)組成，該LCDR2係由YGASSDQS(SEQ ID NO：12)組成，及該LCDR3係由QQGYYFPPT(SEQ ID NO：13)組成。
如請求項1之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：6及該VL包含SEQ ID NO：10。
如請求項1之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：17及該VL包含SEQ ID NO：10。
如請求項1之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO：18及該VL包含SEQ ID NO：10。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：2之重鏈 (HC)及包含SEQ ID NO：4之輕鏈(LC)。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：15之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：4之輕鏈(LC)。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：16之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：4之輕鏈(LC)。
如請求項1之抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：2之胺基酸2-449之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：4之輕鏈(LC)。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含由SEQ ID NO：2組成之HC及由SEQ ID NO：4組成之LC。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體具有人類IgG1或IgG4同型。
如請求項10之抗體，其中該抗體具有人類IgG4同型。
一種核酸，其包含編碼SEQ ID NO：2或4之序列。
一種組合物，其包含(a)載體，該載體包含編碼SEQ ID NO：2之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO：4之第二核酸序列；或 (b)包含編碼SEQ ID NO：2之核酸序列之第一載體及包含編碼SEQ ID NO：4之核酸序列之第二載體。
一種細胞，其包含(a)載體，該載體包含編碼SEQ ID NO：2之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO：4之第二核酸序列；或(b)包含編碼SEQ ID NO：2之核酸序列之第一載體及包含編碼SEQ ID NO：4之核酸序列之第二載體。
如請求項14之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
一種製備抗體之方法，其包括在表現該抗體之條件下培養如請求項14至15中任一項之細胞，及自該培養基回收該表現之抗體。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之抗體，及醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
一種如請求項1至11中任一項之抗體或如請求項17之醫藥組合物之用途，其用於製造供治療發炎性疾病之醫藥。
如請求項18之用途，其中該發炎性疾病為穆-韋二氏症候群(Muckle Wells Syndrome)(MWS)、隱熱蛋白相關週期性症候群(CAPS)、新生兒發作多系統發炎症候群(NOMIS)、類風濕性關節炎、全身發作幼年特發性關節炎(soJIA)、痛風性關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、1型糖尿病、2型糖尿病、家族性冷因性自體發炎症候群(FCAS)或年齡相關黃斑變性。
一種如請求項1至11中任一項之抗體或如請求項17之醫藥組合物之用途，其用於製造供治療心血管疾病之醫藥。
如請求項20之用途，其中該心血管疾病為心絞痛、心肌梗塞(MI)、中風、心臟衰竭或心律失常。
一種如請求項1至11中任一項之抗體或如請求項17之醫藥組合物之用途，其用於製造供治療癌症之醫藥。
如請求項22之用途，其中該癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)、三陰性乳癌(TNBC)、轉移性前列腺癌、低或中等風險骨髓性白血病或局部腎癌。