TWI793110B

TWI793110B - 反義寡核苷酸及肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物

Info

Publication number: TWI793110B
Application number: TW107108239A
Authority: TW
Inventors: 但馬剛; 岡田賢; 津村弥来
Original assignee: 日本國立研究開發法人國立成育醫療研究中心; 日本國立大學法人廣島大學; 日商第一三共股份有限公司
Priority date: 2017-03-10
Filing date: 2018-03-12
Publication date: 2023-02-21
Also published as: JP2024009169A; US20200246369A1; JP2022093334A; KR20190127781A; TW202321453A; CN110536964A; WO2018164275A1; EP3594346A4; US11963974B2; TW201833325A; US20250101431A1; EP3594346A1; JP7048574B2; KR102520654B1; JPWO2018164275A1

Abstract

提供一種新穎的反義寡核苷酸及肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物。於本案發明，提供一種反義寡核苷酸，其係與包含GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之至少一個鹼基的區域的前驅mRNA之序列雜交，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性的反義寡核苷酸。

Description

反義寡核苷酸及肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物

本發明係關於反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide)及肝糖貯積病第Ia型(glycogen storage disease type Ⅰa)預防或治療用組成物。

肝糖貯積病第Ia型係伴隨催化內因性血糖供給路徑的最終階段的酵素「葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)」之機能降低所致的先天代謝異常的疾病。肝糖貯積病第Ia型之主要治療為含澱粉物質的多次進食食療法，併用對酸中毒的檸檬酸製劑、對高尿酸血症的尿酸合成抑制劑等，但遠遠不能導正由於代謝障礙所致的各種異常所見者，長期地病態進行時，亦有導致肝癌發生、腎衰竭的情形。於此種肝癌發生例，選擇肝移植，於腎衰竭例，選擇腎移植(非專利文獻1)。

於日本人肝糖貯積病第Ia型患者中，已知於約9成的該患者具有下列常見變異(c.648G＞T)：位於為該疾病之責任基因的編碼G6Pase的基因G6PC上，編碼區DNA之648號的鹼基鳥嘌呤(G)取代為胸腺嘧啶(T)(非專利文獻2)。此變異不引起胺基酸取代，而相鄰序列成為異位剪接受體位(ectopic splicing acceptor site)，引起異常剪接，其結果產生91個鹼基對縮短的轉錄產物(非專利文獻3)。近年來，關於剪接變異，已知利用與該區域的鹼基序列互補的核酸衍生物「反義寡核苷酸(ASO)」而使正常轉錄回復的技術(非專利文獻4)。

[先前技術文獻] [非專利文獻] [非專利文獻1]Chou JY et al., J Inherit Metab Dis 38： 511-519, 2014. [非專利文獻2]Akanuma J et al., Am J Med Genet 91： 107-12, 2000. [非專利文獻3]Kajihara S et al., Am J Hum Genet 57： 549-55, 1995. [非專利文獻4]Havens MA et al., WIREs RNA 4： 247-66, 2013.

[發明所欲解決的課題] 迄今，並未存有對肝糖貯積病第Ia型的特異性治療藥。本發明係鑑於上述之問題點而完成，其目的係提供一種新穎的反義寡核苷酸及肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物。

[用於解決課題之手段] 本發明者為了解決上述課題而深入進行檢討，發現於肝糖貯積病第Ia型患者之細胞，藉由添加以c.648G＞T變異型G6PC基因之前驅mRNA(pre-mRNA)序列作為標的序列的反義寡核苷酸，c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接被抑制，且產生具有正常鹼基長度的基因轉錄產物，遂而完成本發明。即，本發明係包含以下之任一態樣。

＜1＞一種反義寡核苷酸，其係與包含GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之至少一個鹼基的區域的前驅mRNA之序列雜交的反義寡核苷酸，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性。＜2＞一種肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其為包含反義寡核苷酸作為藥效成分的肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，上述反義寡核苷酸係與包含GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之至少一個鹼基的區域的前驅mRNA之序列雜交，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性。

[發明的效果] 本發明係提供一種新穎的反義寡核苷酸及肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其包含該反義寡核苷酸作為藥效成分。本發明係於肝糖貯積病第Ia型之預防或治療為有效的。

[用以實施發明之形態] 以下，對於本發明之實施形態，詳細地説明。

〔用語之説明〕「葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)」係催化自糖新生及肝醣分解的最終階段的葡萄糖-6-磷酸(G6P)水解成葡萄糖及磷酸，又，於葡萄糖恒定性的維持的重要酵素蛋白質。又，「G6PC」係編碼G6Pase的基因(基因座17q21)。

「肝糖貯積病(glycogen storage diseases，以下亦稱為GSD)」係指由於肝醣代謝路徑的酵素或轉運子(transporter)之基因異常所致的肝醣合成或分解受阻的疾病，已知有11種病型。由於G6PC基因之突變，引起肝糖貯積病第Ia型(GSD-Ia)。

「肝糖貯積病第Ia型(亦稱為GSD-Ia)」係最代表性的肝糖貯積病，發生率為每出生數100,000人為約1人。又，亦已知別名為馮吉爾克病(Von Gierke's disease)。GSD-Ia係G6Pase的先天性缺損所致而產生的基因疾病。肝糖貯積病第Ia型係由於責任基因的同型接合(homozygote)或複合異型接合(compound heterozygote)的變異而發病。

於GSD-Ia，由於G6Pase的缺損，自肝醣、及糖新生，產生游離的葡萄糖的肝臓能力受損。伴隨肝臓及腎臓中的肝醣及脂肪之蓄積，特徵為嚴重的空腹時低血糖。自肝醣及糖新生前驅體產生的過剩量之葡萄糖-6-磷酸不產生葡萄糖，而進入醣解系統，發生血中的乳酸、尿酸、膽固醇及三酸甘油酯的繼發性上升。反應基因G6PC因於肝臓、腎臓及小腸表現，由於肝醣的蓄積，此等組織慢性地遭受損害。如此，罹患GSD-Ia的患者，無法維持葡萄糖恒定性，顯示反復性低血糖症、慢性的乳酸酸中毒、成長障礙、肝障礙、腎肥大症、高脂血症、高尿酸血症、肝臓肥大、血中之胺基轉移酶(aminotransferase)的持續上升及絲球體過度過濾等。此外，此等症狀常常引起肝臓的多發性腺瘤、蛋白尿發作，最嚴重的情形有惡性肝腫瘤及慢性腎衰竭發作的情形。

於本說明書，「蛋白質」亦可稱為「多肽」。「蛋白質」包含胺基酸以肽鍵結而成的結構，又可包含例如，糖鏈、或類異戊二烯(isoprenoid)基等之結構。「蛋白質」包含含有天然存在的胺基酸之已知類似體的多肽，於未特別指明的情形，其可與天然存在的胺基酸同樣地產生機能。

於本說明書，「核酸」包含由任意之單純核苷酸及/或修飾核苷酸而成的多核苷酸，例如cDNA、mRNA、全RNA、hnRNA等。

於本說明書，「基因」係可與「多核苷酸」、「核酸」或「核酸分子」交替使用。「多核苷酸」係意指核苷酸的聚合物。因此，本說明書中的用語「基因」，不僅包含雙股DNA，亦包含構成其之正義股(sense strand)及反義股(antisense strand)等的各單股DNA、RNA(mRNA等)。

於本說明書，「寡核苷酸」係意指由指定個數的核苷酸聚合而成的核苷酸之聚合物。於本說明書，稱為「寡核苷酸」時，其長度雖未被限定，但意圖指於「多核苷酸」之中，具有比較短的核苷酸鏈者。又，「反義寡核苷酸(Antisense Oligonucleotide，亦稱為ASO)」係與標的核酸序列(相當於正義序列)雜交，具有調節經由包含該標的核酸序列的核酸序列所編碼的標的基因之表現的機能的寡核苷酸的總稱。

於本說明書，「DNA」包含例如藉由選殖(cloning)、化學合成技術、或彼等之組合而獲得的cDNA、基因體DNA等。即，DNA可為動物之基因體中所含的形態的包含內含子(intron)等之非編碼序列的「基因體」形DNA，或可為使用反轉錄酶、聚合酶而經由mRNA獲得的cDNA，即不含內含子等之非編碼序列的「轉錄」形DNA。

「前驅mRNA」亦稱為mRNA前驅體，指包含外顯子(exon)與內含子兩者的RNA。「mRNA」係指去除內含子，且外顯子彼此被結合的RNA。蛋白質由此mRNA轉譯。

於本說明書，「標的序列」係指反義寡核苷酸所雜交的標的核酸序列的部分，即，指反義寡核苷酸互補雜交形成的序列。

於本說明書，「預防」係指預防罹患疾病、病症或障礙。又，「治療」係指將已經罹患的疾病、病症或障礙、或伴隨其之症狀緩和或去除。

於本說明書，「健康」係指未罹患肝糖貯積病第Ia型。又，於本說明書，「健康」亦包含例如由於具有G6Pase之缺損等，雖有罹患肝糖貯積病第Ia型的風險，但尚未有臨床的症狀發作的情形。

〔1.反義寡核苷酸〕近年來，使用反義寡核苷酸的基因治療正被確立作為修正特定種類之基因缺陷的有效選擇的手法。mRNA之異常剪接可能成為ASO療法之有效標的[參考文獻1]。

於本發明，提供一種反義寡核苷酸，其係與包含GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之至少一個鹼基的區域的前驅mRNA之序列雜交，具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性的反義寡核苷酸。

關於肝糖貯積病第Ia型，已報告G6PC中的編碼區DNA之648號的鹼基G(鳥嘌呤)被取代為T(胸腺嘧啶)的變異體(c.648G＞T)，係於日本、韓國、台灣及中國等之東亞諸國，被特異性地觀察到的主要變異[參考文獻2]。

此變異於先前的標記法已知為727G＞T，並非成為胺基酸變異的要因，而是將作為異位剪接受體位之G6PC中的編碼區DNA的652號的鹼基腺嘌呤(A)至653號的鳥嘌呤(G)的序列(c.652_653AG)加以活性化，產生自外顯子5之563號的G(c.563G，下文同樣地標記)至c.653G的91bp的缺失(序列識別號5)(實施例之圖1)。如此，有影響前驅mRNA之剪接機序的突變存在時，該突變引起前驅mRNA的異常剪接，產生與自通常之前驅mRNA所生成的mRNA不同的異常mRNA或mRNA片段。其結果，正常的G6Pase轉錄產物之產生被抑制。

更詳言之，於為變異型之G6PC基因的c.648G＞T變異型G6PC，GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列之第42909418號的鳥嘌呤(cDNA(序列識別號4)中的c.562G)的3’側的2個鹼基，即第42909419號的鳥嘌呤(G)(cDNA(序列識別號4)中的c.562+1G)與第42909420號的胸腺嘧啶(T)(cDNA(序列識別號4)中的c.562+2T)成為剪接供體位(splice donor site)，第42911006號的胞嘧啶(C)(cDNA(序列識別號4)中的c.654C)之5’側的2個鹼基，即第42911004號的腺嘌呤(A)(cDNA(序列識別號4)中的c.652A)及第42911005號的鳥嘌呤(G)(cDNA(序列識別號4)中的c.653G)成為新的剪接受體位(splice acceptor site)(異位剪接受體位)。即，於c.648G＞T變異型G6PC，產生自GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列之第42909419號的鳥嘌呤至第42911005號的鳥嘌呤辨識為內含子，自第42911006號的胞嘧啶至第42914433號的腺嘌呤辨識為外顯子的異常剪接。因此，若抑制由第42909419號的鳥嘌呤(G)(cDNA(序列識別號4)中的c.562+1G)及第42909420號的胸腺嘧啶(T)(cDNA(序列識別號4)中的c.562+2T)而成的剪接供體位、及抑制使用第42911004號的腺嘌呤(A)(cDNA(序列識別號4)中的c.652A)及第42911005號的鳥嘌呤(G)(cDNA(序列識別號4)中的c.653G)而成的剪接受體位的異常剪接，減少異常mRNA的表現量，同時基於正常剪接而回復具有正常鹼基長度的G6PC mRNA的表現，結果為正常型G6Pase蛋白質之生成回復。即，「具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性」係意圖指具有所謂抑制上述之異常剪接，及其結果，使異常mRNA的表現量減少、基於正常剪接而使具有正常鹼基長度的G6PC mRNA的表現回復、及使正常型G6Pase蛋白質生成的機能之至少任一者的機能。

又，G6PC之鹼基序列及G6Pase蛋白質之胺基酸序列的資訊可由例如，NCBI參考序列(RefSeq)、GenBank等取得。例如，作為G6Pase蛋白質，具體而言，可列舉具有序列識別號6所示的胺基酸序列的人類之G6Pase蛋白質之胺基酸序列(RefSeq 登錄號：NP_000142.2)。

於此，GRCh38/hg38係登錄於https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/等的人類基因體資料之組裝(RefSeq assembly accession： GCF_000001405.36, GenBank assembly accession： GCA_000001405.25)，人類第17染色體區域示於GenBank 登錄號： CM000679.2。

又將人類第17染色體之G6PC區域的鹼基序列的基因體DNA的鹼基序列示於序列識別號1。該序列示於RefSeq登錄號：NG_011808.1。又，c.648G＞T變異型G6PC之基因體DNA的鹼基序列係GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列之第42911000號的鹼基由G取代為T的序列。

又，於GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基，對應於序列識別號1之15203號的鹼基、序列識別號2或序列識別號3之694號的鹼基、序列識別號4之648號的鹼基及序列識別號13之728號的鹼基，於GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911004號的鹼基，對應於序列識別號1之15207號的鹼基、序列識別號2或序列識別號3之698號的鹼基、序列識別號4之652號的鹼基及序列識別號13之732號的鹼基，於GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911005號的鹼基，對應於序列識別號1之15208號的鹼基、序列識別號2或序列識別號3之699號的鹼基、序列識別號4之653號的鹼基及序列識別號13之733號的鹼基。

又，G6PC mRNA之鹼基序列示於RefSeq登錄號：NM_000151.3(序列識別號13)。再者又G6PC之編碼區之鹼基序列示於GenBank登錄號：BC130478.1(序列識別號2)及BC136369.1(序列識別號3)。又，BC130478.1之序列識別號2所示的序列係僅有BC136369.1(序列識別號3)之2349號的T及2350號的G之間進一步插入1個鹼基T的點的不同以外，其餘相同的序列。

反義寡核苷酸係可為編碼上述之變異型G6PC基因的鹼基序列之一部分。例如，可基於正常型G6PC或c.648G＞T變異型G6PC之基因體DNA、cDNA、前驅mRNA或mRNA之鹼基序列而設計。本發明之反義寡核苷酸與前驅mRNA分子雜交形成，於可剪接的條件作成雙股分子。即，本發明之反義核苷酸係於c.648G＞T變異型G6PC基因之轉錄階段，抑制為一次轉錄產物的前驅mRNA之上述異常剪接，回復為正常剪接反應。藉此，使具有正常的鹼基長度的G6PC mRNA表現，可使正常型G6Pase蛋白質之生成回復。

於本發明，亦包含﹕與下列前驅mRNA的序列雜交，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA之異常剪接的活性的反義寡核苷酸，其中該前驅mRNA的序列包含與GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列不同之人類第17染色體鹼基序列中的對應(相當)於上述之GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列之第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基鹼基及單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism)中之至少一個鹼基的區域。其中，「對應(相當)的鹼基及單核苷酸多型性」係意指與GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列不同之人類第17染色體鹼基序列之可應用的鹼基及單核苷酸多型性，依人類的個體的不同等而有若干變化的人類第17染色體鹼基序列等亦包含於標的序列。

就反義核苷酸之具體的序列而言，可為將用於上述之異常剪接的異位剪接受體位的周邊序列作為標的序列者。就一實施形態而言，反義核苷酸係可為將GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之至少一個鹼基作為基準，與自50個鹼基上游的鹼基至50個鹼基下游的鹼基區域所含的序列之前驅mRNA的序列雜交者。換言之，一實施形態之反義寡核苷酸係與GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42910951號~第42911054號的鹼基(cDNA(序列識別號4)之c.599G~c.702C)之區域的前驅mRNA的序列雜交，具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA之異常剪接的活性的反義寡核苷酸。就其他實施形態而言，可為將GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之至少一個鹼基作為基準，與自30個鹼基上游的鹼基至30個鹼基下游的鹼基的區域所含的序列之前驅mRNA之序列雜交者。換言之，其他實施形態之反義寡核苷酸係與GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42910971號~第42911034號的鹼基(cDNA(序列識別號4)之c.619A~c.682A)的區域的前驅mRNA之序列雜交，具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA之異常剪接的活性的反義寡核苷酸。

某實施形態之反義寡核苷酸係與包含GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列株中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之一個、二個或三個全部鹼基的區域之前驅mRNA之序列雜交，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA之異常剪接的活性。

選擇本發明之反義寡核苷酸之序列以阻斷成為異常剪接發生的要因的異位剪接受體位。

若使用此反義核苷酸，經由正常剪接去除正常內含子區域，且產生編碼正常型G6Pase蛋白質的mRNA。本發明之反義寡核苷酸包含可與上述之標的序列雜交的鹼基序列，具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性。

一實施形態之反義寡核苷酸係包含與包含c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA序列之外顯子5內區域的異位剪接受體位的區域為充分互補的鹼基序列。該反義寡核苷酸係抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接，據此，可使具有正常活性的正常型G6Pase蛋白質之表現增加。就此種反義寡核苷酸之具體序列而言，可列舉例如，包含與序列識別號7雜交的鹼基序列(序列識別號14)的寡核苷酸。序列識別號7所示的鹼基序列係與G6PC之編碼區之DNA的鹼基序列(序列識別號4)之c.648G＞T變異型中的第630號~第654號一致的序列。

與一實施形態有關的反義寡核苷酸，具體而言，為選自以下之(a)~(c)的反義寡核苷酸。 (a)包含序列識別號14所示的鹼基序列的反義寡核苷酸； (b)包含於序列識別號14所示的鹼基序列有1~10個，較佳為1~5個之鹼基缺失、取代、插入、及/或附加的鹼基序列，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性之反義寡核苷酸； (c)包含對於序列識別號14所示的鹼基序列，有60%以上之序列同一性的鹼基序列，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性之反義寡核苷酸。於此，序列同一性係65%以上為較佳，70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上為更佳，95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上為特佳。

上述(b)及(c)之反義寡核苷酸，具體而言，可稱為上述(a)之反義寡核苷酸之變異體。即，意圖對應集團的基因間的多型等。

即，一實施形態之反義核苷酸係對於包含G6PC之前驅mRNA的rs80356484(G/T之多型)所表示的單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism(SNP))的區域為互補的反義寡核苷酸，為具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性之反義寡核苷酸。rs80356484之rs編號係表示國家生物技術訊息中心(National Center for Biotechnology Information)之dbSNP資料庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)之登錄編號，可由網站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=80356484&pt=1ZSlUX0_YR_X1REc5s-B-00w7e7HgeIfXE3I8aMuPnEiTRLgNu)取得。

又，於rs80356484，包含SNP的鹼基(c.648G/T)、c.652A及c.653G及其前後區域的合計104bp之長度的序列(c.599G~c.702C)，示於序列識別號8。第50號的鹼基為具有多型。

又，與本發明之另外的實施形態有關的反義寡核苷酸，具體而言，為選自以下之(d)~(h)的反義寡核苷酸。 (d)該鹼基序列為序列識別號15(與序列識別號8雜交的序列)之全體或一部分的序列所表示者，至少包含序列識別號15之第50號~第55號所示的全部鹼基的反義寡核苷酸； (e)序列之長度為7個鹼基以上、10個鹼基以上、11個鹼基以上、12個鹼基以上、13個鹼基以上、14個鹼基以上、15個鹼基以上、16個鹼基以上、17個鹼基以上、18個鹼基以上、19個鹼基以上、20個鹼基以上、21個鹼基以上、22個鹼基以上、23個鹼基以上、24個鹼基以上、或25個鹼基以上的上述(d)之反義寡核苷酸； (f)序列之長度為104個鹼基以下、103個鹼基以下、102個鹼基以下、101個鹼基以下、100個鹼基以下、90個鹼基以下、80個鹼基以下、70個鹼基以下、60個鹼基以下、50個鹼基以下、40個鹼基以下、35個鹼基以下、30個鹼基以下、29個鹼基以下、28個鹼基以下、27個鹼基以下、或26個鹼基以下之上述(d)或(e)之反義寡核苷酸； (g)對於上述(d)~(f)之任一者記載的反義寡核苷酸，顯示95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之序列同一性的反義寡核苷酸； (h)較佳為滿足所謂A)序列識別號15之第50號的鹼基為C，B)第51號的鹼基為T，C)第55號的鹼基為A的條件中之至少一個、至少二個、或三個的上述(d)~(g)之任一者的反義寡核苷酸。

又，反義寡核苷酸對標的序列雜交並未限定於雜交發生的區域中反義寡核苷酸之鹼基序列與標的序列之鹼基序列為完全互補的關係的情形。於一例，發生雜交的上述區域為25bp以上的情形，相對於與該區域中的前驅mRNA之鹼基序列完全互補的序列，反義寡核苷酸可為具有60%以上之序列同一性的反義寡核苷酸，較佳為65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更佳為85%以上，進一步較佳為90%以上，特佳為95%以上。或者，於可發生雜交的上述區域為25bp以上的情形，相對於完全互補的上述序列，反義寡核苷酸可為具有10個鹼基以下的差異的反義寡核苷酸，較佳為5個鹼基以下，4個鹼基以下，更佳為3個鹼基以下，進一步較佳為2個鹼基以下，特佳為1個鹼基的差異。或者，於另一個例中，於可發生雜交的上述區域為7bp以上的情形，相對於與該區域中的前驅mRNA之鹼基序列完全互補的序列，反義寡核苷酸較佳為具有2個鹼基以下的差異的反義寡核苷酸，更較佳為1個鹼基的差異。

反義寡核苷酸可為DNA分子、RNA分子、及DNA與RNA之雜交分子之任一種。由安定性的觀點，為DNA分子係較佳的情形。

與本發明有關的反義寡核苷酸之長度並未特別限定，但有依寡核苷酸的修飾的種類等而適合的長度為不同的情形。於某實施形態之反義寡核苷酸，7~104個鹼基為較佳，10~104個鹼基為更佳，15~64個鹼基為進一步較佳，15~44個鹼基為特佳，15~30個鹼基為最佳。作為另外的例示，與本發明有關的反義寡核苷酸為後述的嗎啉寡核苷酸(morpholino-oligonucleotide)的情形，14~30個鹼基為較佳，20~30個鹼基為特佳。又作為另外的例示，與本發明有關的反義寡核苷酸為含有後述的鎖核酸(locked nucleic acids、LNA)的寡核苷酸(即，LNA寡核苷酸)的情形，7~25個鹼基為較佳，7~23個鹼基為更佳，9~20個鹼基為進一步較佳，10~17鹼基為特佳。

又，與本發明有關的反義寡核苷酸可為天然型之寡核苷酸，亦可為非天然型之寡核苷酸。就非天然型之寡核苷酸而言，可列舉例如，具有嗎啉(morpholino)骨架、胺甲酸酯(carbamate)骨架、矽氧烷(siloxane)骨架、硫醚(sulfide)骨架、亞碸(sulfoxide)骨架、碸(sulfone)骨架、甲醯基(formacetyl)骨架、硫代甲醯基(thioformacetyl)骨架、亞甲基甲醯基(methylene formacetyl)骨架、核醣乙醯基(riboacetyl)骨架、含鏈烯(alkene-containing)骨架、胺基磺酸鹽(sulfamate)骨架、磺酸鹽(sulfonate)骨架、磺醯胺(sulfonamide)骨架、亞甲基亞胺基(methyleneimino)骨架、亞甲基肼基(methylene hydrazino)骨架、醯胺(amide)骨架等之修飾骨架的寡核苷酸。所以就非天然型之寡核苷酸而言，可列舉磷醯胺嗎啉寡核苷酸(phosphoramidate morpholino oligonucleotide)或磷醯二胺嗎啉寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide (PMO))等之嗎啉寡核苷酸、PMO-X、PPMO、肽核酸(PNA)、鎖核酸(locked nucleic acids、LNA)、硫代硫酸酯寡核苷酸(phosphorothioate oligonucleotide)、三環-DNA寡核苷酸、三環-硫代磷酸酯寡核苷酸、2’O-Me修飾寡核苷酸、2’-O,4’-C-乙烯橋接型核酸種(2'-O,4'-C-ethylene bridged nucleic acid，ENA)等。此等之非天然型的寡核苷酸因難以經由核酸酶分解，於細胞內有效率地作用。例如，已知嗎啉寡核苷酸使對核酸酶的安定性提升，促進細胞的攝取。嗎啉寡核苷酸具有與嗎啉環結合而非與去氧核醣環或核醣環結合的核酸鹼基。又，LNA的情形，已知提高對成為標的的核酸的結合親和性，且具有對核酸酶的耐性。LNA寡核苷酸係可藉由將天然型之寡核苷酸中之1個以上的核苷酸取代為LNA而製作。於本發明之反義寡核苷酸為LNA寡核苷酸的情形，每個寡核苷酸的較佳LNA含有比率係依反義寡核苷酸的長度而不同。例如，LNA寡核苷酸的長度為10~17個鹼基的情形，較佳含有20%~55%之LNA，更佳為25%~55%，進一步更佳為30%~50%。

另一方面，例如，LNA寡核苷酸的長度為7~9個鹼基的情形，較佳含有40%~100%之LNA，更佳為50%~100%，進一步更佳為70%~100%。

與某實施形態有關的反義寡核苷酸係選自上述(d)~(h)，且核苷酸之一部或全部為LNA的反義寡核苷酸。又，一實施形態之反義寡核苷酸係選自上述(d)~(h)，且核苷酸係每隔一個鹼基的LNA的反義寡核苷酸。一例為15個鹼基長，3’末端及5’末端的鹼基作為天然型之核苷酸，每隔1個殘基導入LNA，各鹼基間形成硫代磷酸酯鍵之包含序列識別號17、序列識別號20或序列識別號23所示的鹼基序列的反義寡核苷酸。

再者，本發明之反義寡核苷酸可為5’末端及/或3’末端經修飾。就修飾之例示而言，可列舉三乙二醇(TEG)修飾、六乙二醇(HEG)修飾、十二乙二醇(DODEG)修飾等。或者，構成反義寡核苷酸的鹼基與鹼基之間可具有間隔物(spacer)化合物。又，反義寡核苷酸可含有1個以上之經修飾的核苷酸、核苷酸間之經修飾或改變的1個以上的鍵等。例如就核苷酸間之鍵之例而言，可列舉硫代磷酸酯(PS)鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基膦酸酯鍵、磷醯胺(phosphoroamidate)鍵、硼烷磷酸酯(boranophosphate)鍵等。

反義寡核苷酸可藉由周知基因步驟學的手法及多核苷酸合成方法而獲得。具體而言，可使用化學合成、活體外轉錄(in vitro transcription)等之周知方法而調製。

(載體) 本發明亦提供可表現併入本發明之反義寡核苷酸的載體。編碼反義寡核苷酸的寡核苷酸被併入的載體，雖未特別限定，但可適用於基因治療的載體為較佳。例如，腺病毒(adenovirus)載體、腺相關病毒(adeno-associated virus)載體、皰疹病毒(herpes virus)載體、痘病毒(vaccinia virus)載體、及反轉錄病毒(retrovirus)載體等之病毒載體、以及質體載體等。病毒載體係較佳為被改變為欠缺自己複製能力者。

於上述載體，併入使上述反義寡核苷酸於受試體(subject)的細胞中特異性表現的表現調節序列者為較佳。於此，表現調節序列係可列舉例如，啟動子(promoter)或增強子(enhancer)等。表現載體的構築係可使用周知之基因步驟學的手法進行。

於上述載體，併入使上述反義寡核苷酸於投予對象的受試體之標的器官中特異性表現的表調節序列者為較佳。於此，表現調節序列係可列舉例如，啟動子或增強子。

(宿主細胞) 本發明亦提供導入含有本發明之反義寡核苷酸的載體的宿主細胞。例如，經單離的宿主細胞可為適合製作重組細胞的細胞(或細胞株)。於一些例，宿主細胞為HEK-293細胞及BHK細胞等之哺乳動物細胞。

〔2. 抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的方法〕即，作為本發明之某態樣，本發明之反義寡核苷酸及後述之包含本發明之反義寡核苷酸的組成物亦當然用於作為用以抑制c.648G＞T變異型G6PC基因中的異常剪接之活體外或活體內之方法或分子生物學的研究手段為有效的。

因此，本發明亦提供抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的方法。一實施形態中的方法，為一種包含於活體外或活體內之細胞，添加上述之反義寡核苷酸，而抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的方法。本方法亦可進一步包含前驅mRNA之剪接的步驟、及使經由前驅mRNA之該剪接產生的mRNA轉譯的步驟。又，活體外或活體內之對細胞的反義寡核苷酸的添加量及添加後之細胞培養期間等可因應細胞種類或目的等而適當設定。

又，異常剪接是否被抑制可藉由調查該剪接區域周邊的G6PCmRNA的鹼基序列而進行。就調查序列的方法而言，可使用直接定序(direct sequencing)法等之周知的序列決定方法。或者，例如，亦可使用巢式PCR等之周知的多核苷酸增幅方法，藉由增幅的序列長度作判斷。

抑制異常剪接、及回復具有正常的鹼基長度的G6PC mRNA之表現係可藉由使用例如，於受試體之細胞(例如，淋巴母細胞)中導入本發明之反義寡核苷酸，將該細胞作為試料而使用定量RT-PCR等之周知的mRNA測定方法來確認。又，正常型G6Pase蛋白質之生成回復係可藉由使用將受試體之細胞作為試料而使用西方墨漬法(Western blotting)、ELISA等之周知的蛋白質測定法而確認。又，利用正常的剪接所生成的具有正常鹼基長度的G6PC mRNA之表現量越高，預期正常型G6Pase蛋白質的表現量亦越高。

〔3.肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物〕與本發明有關的肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物係含有反義寡核苷酸作為藥效成分，上述反義寡核苷酸係與包含GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之至少一個鹼基的區域的前驅mRNA之序列雜交，具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性的組成物。

與本發明之一實施形態有關的預防或治療用組成物中所含的反義寡核苷酸係為如於上述〔1.反義寡核苷酸〕之項目中者。又，於單一之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，可含有複數種之反義寡核苷酸。又，與本發明有關的組成物中所含的反義寡核苷酸可為例如，以該寡核苷酸本身的狀態含有且被投予受試體的形態者，亦可為作為併入適當啟動子序列的下游的反義RNA表現載體，被攝入受試體的活體內的形態者。

本實施形態之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物係由於抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接，故藉由將其對受試體投予，可預防或治療肝糖貯積病第Ia型。據此，若使用本實施形態之組成物，有用於例如，罹患肝糖貯積病第Ia型的患者之治療。又，本發明之組成物可用於用以治療或預防性處置肝糖貯積病第Ia型發病的危險性(風險)變高的受試體。

一實施形態之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，因含有以上述G6PC之c.648G＞T常見變異作為標的的反義寡核苷酸，可期待實現對具有常見變異的肝糖貯積病第Ia型患者，即對如上述包含日本的東亞諸國之大多數患者的特異性的藥物療法。

(溶媒) 就一實施形態之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之溶媒之例而言，可列舉水、緩衝液等，作為緩衝液，具體而言，可列舉生理食鹽水、磷酸緩衝液、林格氏液(Ringer's solution)等。又，於組成物所使用的溶媒可為上述之溶媒的二種類以上的混合物。

(其他成分) 一實施形態之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物可進一步含有上述之反義寡核苷酸以外之其他成分。該其他成分並未特別限定，可列舉例如，藥學上可容許的載體(carrier)、潤滑劑、保存劑、安定劑、濕潤劑、乳化劑、緩衝劑、著色劑、香味料、甘味料、抗氧化劑、及黏度調整劑等。又，因應必要，可添加周知之藥劑作為與本發明有關的肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之一構成而構成複合劑。於組成物所含有的此等成分係具備不抑制反義寡核苷酸的機能，且對成為投予對象的受試體無實質性的不良影響的性質者為較佳。

就上述其他成分而言，可廣泛使用此領域周知者，具體而言，可列舉例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、澱粉、醇、植物油、聚乙二醇、明膠、阿拉伯膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、滑石、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)，但未特別限定於此等。載體之種類係因應組成物之劑型及投予方法等而適當選擇即可。

(劑型) 上述肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之劑型亦未特別限定，可作成液體、固體或半固體或半液體。又亦可為冷凍乾燥製劑。可列舉例如，錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑、及注射劑等，較佳為注射劑或錠劑等之經口投予用之劑型。

(投予路徑) 就上述肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之投予路徑而言，可列舉經口、局部、皮下、肌肉內、靜脈內、皮內、經皮等，但未限定於此等。

(投予方法) 上述肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之投予方法並未特別限定，可藉由經口投予、血管內投予、腸內投予等手法而被全身投予，亦可藉由經皮投予、舌下投予等手法而被局部投予。對受試體的投予，只要基於周知的方法進行即可，具體而言，可列舉對皮下、靜脈內、肌肉內、腹腔內、皮內等之直接注射；鼻腔內、口腔內、肺內、陰道內、直腸內等之對黏膜的噴霧；經口投予；對靜脈內或動脈內之血管內投予等。一個較佳投予方法係利用對皮下、靜脈內或動脈內的直接注射的全身投予。由投予為容易的觀點，另外的較佳投予方法為經口投予。

(投予量及投予期間) 上述肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之投予量(治療有效量)可依成為投予的對象的受試體之年齡、體重、性別、投予的劑型、作為目的的肝糖貯積病第Ia型預防或治療效果之程度等而適當選擇。又，於肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之投予期間，亦可適當選擇而獲得作為目的的肝糖貯積病第Ia型預防或治療效果。

又，例如，只要無損肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之肝糖貯積病第Ia型預防或治療效果即可，可與其他的具有肝糖貯積病第Ia型預防或治療效果的醫藥品或具有另外的效果的醫藥品併用投予。

(投予之對象) 就成為與本發明有關的組成物之投予對象的受試體而言，可列舉所有動物，但脊椎動物為較佳，哺乳類為更佳。再者，就哺乳類之受試體而言，除了人類之外，可列舉家畜類(雞、豬、馬、山羊、綿羊、牛等)、寵物動物(貓、狗、倉鼠、兔、天竺鼠等)及實驗動物(小鼠、大鼠等之齧齒類、猴等)，特別是人類為較佳。再者，受試體為人類的情形，尤以東亞(日本、中國、韓國、台灣等)之人種為較佳。

例示的受試體為具有肝糖貯積病第Ia型的患者、或具有肝糖貯積病第Ia型發病的風險。又，於其他實施形態，受試體係於同型接合或複合異型接合具有G6PC中的c.648G＞T之變異，較佳為於同型接合具有該變異。

再者受試體可為任何年齡。又，因肝糖貯積病第Ia型為能從嬰兒期就發病的疾病，故希望儘可能早期開始對包含0歲的受試體投予。藉由自較低年齡投予，可早期防止成長障礙及腎障礙等。又，藉由疾病的早期預防及治療之早期開始，可防止嚴重的障礙等發生。

一實施形態之受試體係包含肝臓、腎臓及小腸的一種以上的組織中之肝醣蓄積增加、或呈現上述的肝糖貯積病第Ia型之至少一種臨床的症狀。

本發明之組成物因投予容易，且安全性高，因此亦可用於歷經長期間的投予、或對嬰幼兒的投予。因此，可適合使用於肝糖貯積病第Ia型預防或治療。

〔4.肝糖貯積病第Ia型(GSD-Ia)之治療方法〕與本發明有關的肝糖貯積病第Ia型之治療方法係包含將上述之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物對受試體投予治療有效量的步驟。於一實施形態，對成為投予對象的受試體，可僅單獨投予該組成物，或可作為適合投予目的的藥學的組成物之一構成成分而投予。

(投予量及投予期間) 上述肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之投予量(治療有效量)可因應成為投予對象的受試體之年齡、性別、體重、症狀、投予路徑、投予次數、及投予期間等而適宜設定。投予方法、投予量、投予期間等係如〔3.肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物〕記載。

上述肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物之投予次數亦只要可獲得治療效果即可，並未特別限定，例如，因應受試體之疾病症狀的嚴重程度、上述投予量、投予路徑、症狀、受試體之年齡、性別、體重等而適宜設定即可。

又，包含對臨床上健康的受試體，於肝糖貯積病第Ia型發病前投予該肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物的步驟的預防投予的形態亦包含於本發明之治療方法之範疇。即，於活體內以超過有效量的量投予受試體，並事先預防肝糖貯積病第Ia型的態樣。

(併用療法) 於與本發明有關之肝糖貯積病第Ia型之治療方法，可進行組合下列的併用療法﹕與本發明有關的肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物以外之肝糖貯積病第Ia型之治療所使用的藥劑(例如，對酸中毒的檸檬酸製劑、對高尿酸血症的尿酸合成抑制劑等)之投予、及含澱粉物質之多次進食食療法等之歷來療法中的一種以上。與本發明有關的肝糖貯積病第Ia型之治療方法係利用與歷來的肝糖貯積病第Ia型之治療不同機制的新穎治療方法。因此，若採用本併用療法，可期待與併用劑之治療效果相乘的治療效果。

使用上述治療方法而於治療中之受試者的治療效果亦可適當使用下列方法調查﹕〔2.抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的方法〕記載之調查異常剪接的抑制有無的方法、調查具有正常鹼基長度的G6PC mRNA的表現的方法、調查正常型G6Pase蛋白質的表現的方法。活體中的G6Pase蛋白質之量可與該活體之具有的肝糖貯積病第Ia型之嚴重程度成比例。因此，於治療的各階段，可進行治療效果的有無的檢査。

〔5.與本發明有關的具體態樣的例示〕本發明包含以下任一種的態樣。＜1＞一種反義寡核苷酸，其係與包含GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之至少一個鹼基的區域的前驅mRNA之序列雜交，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性的反義寡核苷酸。＜2＞如＜1＞記載之反義寡核苷酸，其中上述反義寡核苷酸係與GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42910951號~第42911054號的鹼基的區域的前驅mRNA之序列雜交，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性。＜3＞如＜1＞或＜2＞記載之反義寡核苷酸，其係由7~104個鹼基所組成。＜4＞如＜1＞~＜3＞中任一項記載之反義寡核苷酸，其中上述反義寡核苷酸係選自以下之(a)及(b)﹕ (a)包含序列識別號14、序列識別號17、序列識別號20或序列識別號23所示的鹼基序列的反義寡核苷酸 (b)包含對於序列識別號14、序列識別號17、序列識別號20或序列識別號23所示的鹼基序列，具有60%以上之序列同一性的鹼基序列，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性之反義寡核苷酸。＜5＞如＜1＞~＜4＞中任一項記載之反義寡核苷酸，其中上述反義寡核苷酸係由14~30個鹼基所組成的嗎啉反義寡核苷酸或由7~25個鹼基所組成的鎖核酸(LNA)反義寡核苷酸。＜6＞一種肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其係包含反義寡核苷酸作為藥效成分，且上述反義寡核苷酸與包含GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42911000號的鹼基、第42911004號的鹼基及第42911005號的鹼基中之至少一個鹼基的區域的前驅mRNA之序列雜交，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性的肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物、。＜7＞如＜6＞記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中上述反義寡核苷酸係與GRCh38/hg38之人類第17染色體鹼基序列中的第42910951號~第42911054號的鹼基的區域之前驅mRNA之序列雜交，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性之反義寡核苷酸。＜8＞如＜6＞或＜7＞記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中上述反義寡核苷酸係由7~104個鹼基所組成。＜9＞如＜6＞~＜8＞中任一項記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中上述反義寡核苷酸係選自以下之(a)及(b)的反義寡核苷酸﹕ (a)包含序列識別號14、序列識別號17、序列識別號20或序列識別號23所示的鹼基序列的反義寡核苷酸 (b)包含對於序列識別號14、序列識別號17、序列識別號20或序列識別號23所示的鹼基序列，具有60%以上之序列同一性的鹼基序列，且具有抑制c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性之反義寡核苷酸。＜10＞如＜6＞~＜9＞中任一項記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中上述反義寡核苷酸係由14~30個鹼基所組成的嗎啉反義寡核苷酸或由7~25個鹼基所組成的鎖核酸(LNA)反義寡核苷酸。

如以上所示，本發明並未被限定於上述各實施形態，於請求項所示的範圍內可有各式各樣的變更，適當組合於不同的實施形態各自所揭示的技術手段而獲得的實施形態亦包含於本發明之技術範圍中。

[實施例] 以下，針對本發明之實施例進行説明。

〔實施例1〕首先，關於c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接部位，參照圖式加以説明。圖1係顯示藉由c.648G＞T之變異所產生的G6PC之前驅mRNA的異常剪接區域的圖。

G6PC變異體c.648G＞T係產生外顯子5之5’側的91bp的核苷酸(序列識別號5)有缺失的mRNA。此可能係由於變異序列“ccttcttcctTttcAG”的延伸多嘧啶(polypyrimidine)區域具有超出正常序列“ccttcttcctGttcAG”及野生型的剪接受體位“ctttcttccactcAG”的序列的增大的剪接效果。反義寡核苷酸係設計成阻斷外顯子5中的變異型序列中的異位剪接受體位。

＝材料及方法＝ (反義寡核苷酸) 設計以c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA中的異常剪接的異位剪接受體位為標的之25 mer的嗎啉反義寡核苷酸(mASO)。由Gene Tools, LLC (法洛馬斯(Philomath)，俄勒岡州)合成mASO及相同長度的對照組嗎啉寡核苷酸(mCO)，其中mASO係設計成c.648G被取代為c.648T的G6PC之序列中，自c.630T至c.654C的序列(5'-TCTCATTACCTTCTTCCTTTTCAGC-3'(序列識別號7))的互補序列(5'-GCTGAAAAGGAAGAAGGTAATGAGA-3'(序列識別號14))；(mCO)(5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3'(序列識別號9))。將Endo-Porter (Gene Tools)用於將嗎啉寡核苷酸送入細胞。

(患者及細胞株) 自來自具有臨床症狀及GSD-Ia之生物學的異常表現型之日本人嬰兒期的患者之血液將白血球分離。通過基因體DNA的雙方向定序，探索為c.648G＞T之同型接合體者。

利用Epstein-Barr病毒(EBV)轉形後，將淋巴母細胞(lymphoblast)以含有10%胎牛血清(HyClone, Logan, Utah, USA)、100U/mL之盤尼西林(penicillin)及100mg/mL之鏈黴素(streptomycin)的RMPI 1640培養基，於37℃、5%CO₂ 下維持。準備來自健康成人的另外的細胞作為健康對照組。

(反義寡核苷酸之曝露) 將10⁵ 個細胞再懸浮於含1.0μmol/L之mASO或mCO之任一者及0.8μL之Endo-Porter的新培養基200μL。於37℃培育48小時後，以磷酸緩衝生理食鹽水將細胞洗淨、回收。

(RNA調製、RT-PCR及巢式PCR) 將總RNA使用RNeasy kit (Qiagen，瓦倫西亞(Valencia)，加州)進行提取，藉由使用RT-PCR用的第一股合成系統(first-strand synthesis system for RT-PCR)(SuperScript; Invitrogen，卡爾斯巴德(Carlsbad)，加州)的反轉錄反應而合成cDNA。

接著，進行巢式PCR，調查mRNA的剪接中的mASO的效果。巢式PCR所使用的引子示於表1。於第一次PCR，使用引子組G6PC-F1/G6PC-R，將含有c.648G＞T的片段增幅。於第二次PCR，使用另外的引子組G6PC-F2/G6PC-R。源自正常剪接的PCR產物的預定大小為305bp，源自異常剪接的PCR產物的預定大小為214bp。藉由瓊脂糖凝膠電泳分離後，將PCR產物自瓊脂糖凝膠提取，使用BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems，福斯特城(Foster City)，加州，USA)及ABI PRISM 310 genetic analyzer (Applied Biosystems)，直接定序決定。

[表1] 表1.對G6PC cDNA之外顯子4-外顯子5的邊界區域之巢式PCR的引子

*關於引子G6PC-F2及G6PC-R，係參照以前的報告[參考文獻5]。

＝結果＝ (巢式PCR產物之瓊脂糖凝膠電泳) 圖2係顯示源自健康對照受試者(第1~3道)及源自GSD-Ia之患者(第4~6道)之巢式PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳的結果的圖。於第1~3道可見約300bp的長度的單一條帶，於第5及6道可見約200bp的長度的單一條帶，兩者的條帶於第4道被觀察。於第4道的★符號可見更長的巢式PCR產物的條帶。此係顯示利用嗎啉反義寡核苷酸的G6PC c.648G＞T之異常剪接的回復。接著，自凝膠將圖2所示的巢式PCR產物提取，直接定序決定。圖3係顯示巢式PCR產物之直接定序的結果的圖。圖3之(a)係顯示第1~3道中的單一條帶(305bp)之序列。於外顯子4之3’末端(c.561_562AG)，正常的外顯子5(c.563G_753C)接續。圖3之(b)係顯示第5及6道中的單一條帶(214bp)及第4道的較短者的條帶(214bp)之序列。於外顯子4之3’末端(c.561_562AG)，接著c.654C_753C。此係顯示91bp(c.563G_653G)的缺失。圖3之(c)係顯示第4道中的較長者的條帶(305bp)之序列。雖發生更短者的條帶片段造成的污染，但於外顯子4之3’末端(c.561_562AG)，接續c.563G_753C，c.648G被取代為c.648T。於健康對照組的樣品，經mASO或mCO處理的樣品之間、或於處理的有無未觀察到相異，全部樣品中出現約300bp的單一條帶。同樣地，於有或沒有經mCO處理的患者樣品，可見約200bp的單一條帶。與此相比較，於經mASO處理的患者樣品，顯示約200bp及約300p的2個條帶。此係暗示患者樣品中的正常剪接之部分的回復(圖3)。於健康對照組樣品，外顯子4及外顯子5之結合區域的序列於mASO或mCO之任一者的處理的情形亦為正常。另一方面於患者樣品，觀察到利用mCO的處理或無處理的樣品之約200bp的條帶有91bp缺失。經mASO處理的樣品之約300bp之條帶包含2種類之DNA片段。1個片段顯示作為包含鹼基取代c.648T的正常長度之cDNA的序列，另一片段顯示包含91bp的缺失的異常長度的序列。此係，於瓊脂糖凝膠電泳之步驟，位於較上述之正常長度的cDNA片段更下游的異常長度的片段引起污染。

＝討論＝已廣泛顯示反義寡核苷酸使對包含先天性代謝異常的各式各樣的遺傳疾病的剪接變異回復[參考文獻1]。各式各樣的種類之ASO分子中，尤以嗎啉ASO係活體內可效果地被投予、輸送。各式各樣的種類之ASO分子中，尤以嗎啉ASO藉由與樹狀分子轉運子的結合而可被有效果地投予、輸送至活體內。對於球蛋白基因之內含子具有剪接變異的轉基因小鼠，樹狀分子轉運子與嗎啉ASO之複合體的靜脈投予顯示於骨骼肌、肝臓、腎臓及小腸幾乎完全的正常mRNA的回復。另一方面，於脾臓、心臓、肺及腦，可見不太有效果[參考文獻3]。G6PC係僅於肝臓、腎臓及小腸表現G6Pase的緣故，G6PC c.648G＞T之變異所致的GSD-Ia可成為ASO系治療用的適合標的。

一般而言，遺傳疾病中的許多變異體係散發性，故對此種藥劑實用性的使用的導入大多困難，亦有並非醫藥開發的適合標的的情形，但G6PC c.648G＞T變異體的情形係適合作為ASO療法的標的。

此變異所致的異常剪接最初被報告於罹患患者的肝臓組織[參考文獻4]，接著，有報告EBV所致的於轉形淋巴母細胞成功的另一觀察的報告[參考文獻5]。此等發現後，得知此變異體等位基因頻率(allele frequency)於東亞人集團中非常高(表2)。於日本，罹患集團的80~85%為G6PC c.648G＞T的同型接合體，其餘主要為c.648G＞T的異型接合體(heterozygote)及散發性的變異[參考文獻5, 6]。

[表2]迄今關於東亞人集團中的G6PC c.648G＞T變異頻率的報告

*於此等2個研究，認為部分的患者有重複。

由此等結果看來，日本人的GSD-Ia患者之約95%係於至少一個等位基因具有該變異。若依據於台灣[參考文獻7]、中國[參考文獻8]及韓國[參考文獻9]幾個關於此變異檢測到的報告，具有c.648G＞T之至少一個之等位基因的患者之比率係各自於韓國人為92.3%，中國人為88.6%。

此等之知識見解暗示對於上述所列舉的國家之GSD-Ia患者的大部分，單一ASO系的治療藥為有效。是否改善於罹患ASO的患者所觀察到的病理學的變化可藉由下列方法確認，例如，確立源自具有c.648G＞T 變異型G6PC的GSD-Ia患者的人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem (iPS) cells)細胞株，使彼等之細胞分化為顯示肝醣於細胞內的蓄積的肝細胞樣的細胞的方法等[參考文獻10]。

如上所述，本發明係獲得確立新穎的GSD-Ia型特異的醫藥之非常有效的知識見解者。

＝實施例1之參考文獻之一覽＝ [參考文獻1] M.A. Havens, D.M. Duelli, M.L. Hastings, 用於疾病治療之靶向RNA剪接(Targeting RNA splicing for disease therapy), Wiley Interdiscip. Rev. RNA 4 (3) (2013) 247-266. [參考文獻2] J.Y. Chou, B.C. Mansfield, 導致肝糖貯積病第Ia型的葡萄糖-6-磷酸酶-α（G6PC）基因的突變(Mutations in the Glucose-6-Phosphatase-α (G6PC) gene that cause type Ia glycogen storage disease), Hum. Mutat. 29 (7) (2008) 921-930. [參考文獻3] Y.F. Li, P.A. Morcos, 樹狀分子轉運子的設計和合成，達成有效率的體內遞送嗎啉代反義寡核苷酸(Design and synthesis of dendritic molecular transporter that achieves efficient in vivo delivery of morpholino antisense oligo), Bioconjugate Chem. 19 (7) (2008) 1464-1470. [參考文獻4] S. Kajihara, S. Matsuhashi, K. Yamamoto, K. Kido, K. Tsuji, A. Tanae, S. Fujiyama, T. Itoh, K. Tanigawa, M. Uchida, Y. Setoguchi, M. Motomura, T. Mizuta, T. Sakai, 外顯子藉由葡萄糖-6-磷酸酶基因的外顯子5之點突變重新定義外顯子係日本肝糖貯積病第Ia型的主要原因(Exon redefinition by a point mutation within exon 5 of the glucose-6-phosphatase gene is the major cause of glycogen storage disease type Ia in Japan), Am. J. Hum. Genet. 57 (3) (1995) 549-555. [參考文獻5] J. Akanuma, T. Nishigaki, K. Fujii, Y. Matsubara, K. Inui, K. Takahashi, S. Kure, Y. Suzuki, T. Ohura, S. Miyabayashi, E. Ogawa, K. Iinuma, S. Okada, K. Narisawa, 肝糖貯積病第Ia型：51例日本患者的分子診斷及藉由分析從淋巴母細胞樣細胞異位性轉錄的mRNA的剪接突變特徵化(Glycogen storage disease type 1a： molecular diagnosis of 51 Japanese patients and characterization of splicing mutations by analysis of ectopically transcribed mRNA from lymphoblastoid cells), Am. J. Med. Genet. 91 (2) (2000) 107-112. [參考文獻6] J. Kido, K. Nakamura, S. Matsumoto, H. Mitsubuchi, T. Ohura, Y. Shigematsu, T. Yorifuji, M. Kasahara, R. Horikawa, F. Endo, 日本肝糖貯積病的現狀：臨床表現、治療及長期結果。(Current status of hepatic glycogen storage disease in Japan： clinical manifestations, treatments and long-term outcomes.) J. Hum. Genet. 58 (5) (2013) 285-292. [參考文獻7] S.C. Chiang, Y.M. Lee, M.H. Chang, T.R. Wang, T.M. Ko, W.L. Hwu, 台灣中國人肝糖貯積病第Ia型患者的葡萄糖-6-磷酸酶基因突變(Glucose-6-phosphatase gene mutations in Taiwan Chinese patients with glycogen storage disease type 1a), J. Hum. Genet. 45 (4) (2000) 197-199. [參考文獻8] W.J. Qiu, X.F. Gu, J. Ye, L.S. Han, Y.F. Zhang, X.Q. Liu, 26例中國人患者之肝糖貯積病第Ia型的分子遺傳學分析(Molecular genetic analysis of glycogen storage disease type Ia in 26 Chinese patients), J. Inherit. Metab. Dis. 26 (8) (2003) 811-812. [參考文獻9] C.S. Ki, S.H. Han, H.J. Kim, S.G. Lee, E.J. Kim, J.W. Kim, Y.H. Choe, J.K. Seo, Y.J. Chang, J.Y. Park, 葡萄糖-6-磷酸酶基因的突變譜及其於具肝糖貯積病第Ia型的韓國患者於分子診斷中的意義(Mutation spectrum of the glucose-6-phosphatase gene and its implication in molecular diagnosis of Korean patients with glycogen storage disease type Ia), Clin. Genet. 65 (6) (2004) 487-489. [參考文獻10] S.T. Rashid, S. Corbineau, N. Hannan, S.J. Marciniak, E. Miranda, G. Alexander, I. Huang-Doran, J. Griffin, L. Ahrlund-Richter, J. Skepper, R. Semple, A. Weber, D.A. Lomas, L. Vallier, 使用人類誘導的多能幹細胞模擬遺傳性肝臟代謝失調(Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells), J. Clin. Invest. 120 (9) (2010) 3127-3136.

〔實施例2〕 LNA反義寡核苷酸，即使用含有可期待於活體投予的效果的鎖核酸(locked nucleic acid (LNA))的反義寡核苷酸，嘗試異常剪接的抑制。

＝材料及方法＝ (LNA反義寡核苷酸) 將以c.648G＞T變異型G6PC之前驅mRNA中的異常剪接的異位剪接受體位作為標的的15 mer的LNA反義寡核苷酸(LNA ASO)以下述條件設計。c.648G被取代為c.648T的G6PC之序列中，設計7種類之LNA ASO成為與自c.639C至c.665G的區域所含的15 mer之序列的互補序列。將7種類之LNA ASO各自作為LNA01、LNA03、LNA05、LNA07、LNA09、LNA11及LNA13。合成係藉由受託合成(GeneDesign股份有限公司，大阪府茨木市)進行。

(LNA ASO之設計條件) ・作成長15個鹼基，將LNA每隔1個殘基導入(表3之陰影部位)。・3’末端及5’末端之鹼基為天然DNA。・各鹼基間為硫代磷酸酯(PS)鍵。・將設計區域每2個鹼基移動而設計。

[表3]實施例2所使用的15mer的LNA反義寡核苷酸

(細胞株) 自鑑定出的c.648G＞T變異的肝糖貯積病第Ia型患者(同型接合體)，採取末梢血淋巴球，感染EBV而建立不死化淋巴球細胞株，以與實施例1同樣的方法維持。

(轉染) 將4.5×10⁴ 個細胞再懸浮於各自添加CaCl₂ 成最終濃度9mM、LNA01~13成為最終濃度1μM的新的培養基200μL中，接種於將聚-D-離胺酸塗布表面的微孔盤(96孔)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)。將LNA無添加的孔作為空白組。於37℃培育7日至成為匯合(confluency)後，以磷酸緩衝生理食鹽水將細胞洗淨，回收。

(RNA調製、RT-PCR及巢式PCR) 自回收的細胞提取總RNA，合成cDNA。接著，進行巢式PCR，藉由自G6PC 外顯子4及外顯子5的結合區域增幅含有c.648G＞T之變異部位及異位剪接受體位(c.652_653AG)的區域的序列，調查mRNA之剪接的LNA ASO之效果。巢式PCR係使用與實施例1所使用的引子組相同者進行。

與實施例1同樣地，源自正常剪接的PCR產物的預訂大小為305bp(正常長度)，源自異常剪接的PCR產物的預定大小為214bp(缺失長度)。藉由瓊脂糖凝膠電泳分離後，將凝膠的缺失長度條帶與正常長度條帶一起自瓊脂糖凝膠進行DNA提取，進行直接定序決定。

又，實施例2中的RNA的提取、cDNA之合成方法、瓊脂糖凝膠電泳及直接定序決定係使用與實施例1同樣的方法。

＝結果＝ (巢式PCR產物之瓊脂糖凝膠電泳) 圖4係顯示各種LNA ASO(LNA01~13)添加及LNA ASO無添加(空白組)樣品的巢式PCR產物之瓊脂糖凝膠電泳的結果的圖。於各種LNA ASO添加樣品觀察兩者的條帶。此係顯示利用LNA ASO的自G6PC c.648G＞T之異常剪接的回復，預計正常長條帶越濃，則自LNA ASO之異常剪接的回復效果越高。

圖5係顯示巢式PCR產物之直接定序的結果的圖。圖5之(a)係顯示LNA ASO無添加(LNA00)樣品中的巢式PCR產物之序列。圖5之(b)係顯示各種LNA ASO添加樣品中的巢式PCR產物之c.648G＞T附近的波形。

＝考察＝ LNA ASO已被報告與其他之各種結構的寡核苷酸比較，作用較強，即使不藉由導入藥劑或物理的刺激，對細胞的自然攝取(｢剝裸(gymnosis)｣或｢自由攝取(free-uptake)｣)亦發揮反義效果[參考文獻12,13]，於實施例2以此方法進行檢討。於EBV不死化淋巴球細胞株的c.648G＞T變異型G6PC的異常剪接所致的表現，正常剪接所致的正常型之表現產物亦自發地產生，雖為少許量。因正常長度條帶的濃淡相對於上述之瓊脂糖凝膠電泳所獲得的缺失長度條帶的濃度、源自凝膠提取中的缺失條帶的波高及源自正常長度條帶的波高的相對關係暗示有相關性，認為LNA01~LNA13中，特別是LNA01、LNA07及LNA13作為LNA ASO的候補為特別有希望的。

＝實施例2之參考文獻之一覽＝ [參考文獻11] Shimo T, Tachibana K, Saito K, Yoshida T, Tomita E, Waki R, Yamamoto T, Doi T, Inoue T, Kawakami J, Obika S, 活體外鎖核酸系剪接-切換寡核苷酸的設計和評估(Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro), Nucleic Acids Res. 42 (12) (2014) 8174-8187. [參考文獻12] Soifer HS, Koch T, Lai J, Hansen B, Hoeg A, Oerum H, Stein CA, 藉由反義寡核苷酸的自主遞送的基因表現沉默 (Silencing of gene expression by gymnotic delivery of antisense oligonucleotides), Methods Mol. Biol. 815 (2012) 333-346. [參考文獻 13] Hori S, Yamamoto T, Waki R, Wada S, Wada F, Noda M, Obika S, 培養基中富含Ca^{2 +} 增強寡核苷酸的作用(Ca²⁺ enrichment in culture medium potentiates effect of oligonucleotides), Nucleic Acids Res. 43 (19) (2015) e128.

[產業上的可利用性] 本發明係可利用於例如肝糖貯積病第Ia型之預防或治療。

無。序列表

[圖1] 顯示由於c.648G＞T之變異所產生的G6PC之前驅mRNA的異常剪接區域的圖。 [圖2] 顯示源自健康對照受試者(第1~3道)及源自GSD-Ia患者(第4~6道)的巢式PCR(Nested-PCR)產物之瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)的結果的圖。 [圖3] 顯示巢式PCR產物之直接定序的結果的圖。圖3之(a)係顯示第1~3道中的單一條帶(305bp)之序列。圖3之(b)係顯示第5及6道中的單一條帶(214bp)及第4道中的較短的條帶(214bp)之序列。圖3之(c)係顯示第4道中較長的條帶(305bp)之序列。 [圖4] 顯示各種LNA ASO(LNA01~13)添加及LNA ASO無添加(空白組)樣品的巢式PCR產物之瓊脂糖凝膠電泳的結果的圖。 [圖5] 顯示巢式PCR產物之直接定序的結果的圖。圖5之(a)顯示LNA ASO無添加樣品的巢式PCR產物之序列。圖5之(b)顯示各種LNA ASO添加樣品的巢式PCR產物之c.648G＞T附近的波形。

<110> 國家兒童健康及發展醫學中心廣島大學

<120> 反義寡核苷酸及肝糖貯積病第Ia型治療及/或預防用組成物

<130> S117402

<150> JP2017-046766

<151> 2017-03-10

<160> 23

<170> PatcntIn版本3.5

<210> 1

<211> 19572

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 2382

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 2381

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 1074

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 91

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

<210> 6

<211> 357

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

<210> 8

<211> 104

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 控制反義寡核苷酸

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一PCR用的前向引子

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二PCR用的前向引子

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一/第二PCR用的反向引子

<400> 12

<210> 13

<211> 4169

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 14

<210> 15

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 15

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 16

<210> 17

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 17

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 18

<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 19

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 20

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 21

<210> 22

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 22

<210> 23

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反義寡核苷酸

<400> 23

Claims

一種肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其含有反義寡核苷酸作為藥效成分，上述反義寡核苷酸係與包含至少一個下述鹼基的區域雜交，且具有抑制c.648G>T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性：序列識別號4所示之鹼基序列的648號的鹼基從鳥嘌呤(G)取代為胸腺嘧啶(T)之c.648G>T變異型G6PC的前驅mRNA的鹼基序列中之648號的鹼基、652號的鹼基及653號的鹼基。
如請求項1記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中上述反義寡核苷酸係與下述鹼基的區域雜交，且具有抑制c.648G>T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性：序列識別號4所示之鹼基序列的648號的鹼基從鳥嘌呤(G)取代為胸腺嘧啶(T)之c.648G>T變異型G6PC的前驅mRNA的鹼基序列中之599號~702號的鹼基。
如請求項1記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中上述反義寡核苷酸係由7~104鹼基所組成。
如請求項1記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中上述反義寡核苷酸是由具有相對於與上述雜交區域中的前驅mRNA完全互補的鹼基序列之95%以上的序列同一性的鹼基序列所組成。
如請求項1記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中上述反義寡核苷酸係選自以下之(a)及(b)的反義寡核苷酸： (a)包含序列識別號14、序列識別號17、序列識別號20或序列識別號23所示的鹼基序列的反義寡核苷酸；(b)包含對於序列識別號14、序列識別號17、序列識別號20或序列識別號23所示的鹼基序列，具有95%以上之序列同一性的鹼基序列，且具有抑制c.648G>T變異型G6PC之前驅mRNA的異常剪接的活性之反義寡核苷酸。
如請求項1至4中任一項記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中所述反義寡核苷酸含有至少一個修飾核苷酸。
如請求項2~4中任一項記載之肝糖貯積病第Ia型預防或治療用組成物，其中上述反義寡核苷酸含有至少一個嗎啉核苷酸並且為由14~30個鹼基所組成的嗎啉反義寡核苷酸，或是含有至少一個鎖核酸(LNA)並且為由7~25個鹼基所組成的鎖核酸(LNA)反義寡核苷酸。