TWI793059B - 用於流感病毒的減弱活疫苗 - Google Patents

Abstract

本發明涉及減弱流感病毒，以及相關的疫苗和方法，其包含遺傳上修飾的病毒基因組。所述遺傳上修飾的病毒基因組包含非-結構(NS1)編碼段中的中斷和基質膜蛋白編碼段中的一個或多個鹼基置換。所述遺傳修飾導致喪失NS1功能性但依然能夠複製的病毒。

Description

用於流感病毒的減弱活疫苗

與相關申請的交叉引用

本申請要求於2014年11月13日提交的美國臨時專利申請序號62/079,227的權益，所述臨時專利申請通過引用以其整體結合到本文中。

本發明關於用於流感病毒的減弱活疫苗。

由於併發症，流感(flu)的年度流行病和大流行在全球引起顯著的疾病負擔和超額死亡率。認為接種flu疫苗是減輕流感引起的疾病負擔和死亡率以及預防未來在人類中大流行的最有效方式。當前市場上存在兩種類型的flu疫苗，裂解疫苗(split flu vaccine)和冷適應減弱疫苗。兩種疫苗的缺陷早已得到公認。當前的裂解flu疫苗具有低免疫原性並且不能回應於迅速出現的毒株，例如引起2009大流行的H1N1毒株，在短時間內準備好。對於裂解疫苗弱免疫原性已廣為人知，特別是在老年人和幼兒之 中。另一方面，冷減弱疫苗僅允許在2-49歲的人群中使用。這些問題限制了flu疫苗對最需要它們的人群的益處。低成本、豐富和有效疫苗(能夠誘發更穩健的免疫應答)的快速生產對於流感，特別是幼兒和老人中的季節性流感的干預和預防是理想的。

自從1997年在香港出現人類感染禽H5N1病毒以來，人類感染禽流感病毒的其它亞型，包括H9N2、H7N7、H6N1、H7N9、H5N6和H10N8，已在家禽中傳播這些禽流感病毒亞型的國家報導。在這些新出現的流感病毒之中，至今已從16個國家鑒定了650例人類感染H5N1病毒，其中386例為致死的(參見，環球網站：who.int/influenza/human_animal_interface/EN_GIP_20140124CumulativeNumberH5N1cases.pdf？ua=1)。最近，2013年H7N9病毒在中國的出現已導致450個人類病例，其中165例為致死的(http：//www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/riskassessment_h7n9_27june14.pdf)。

在中國還報導了人類感染其它新的禽流感病毒亞型，例如H10N8和H5N6。令人擔心的是這些亞型中的一些可在人類中獲得進一步的適應或成為與季節性flu病毒的重配株並引起新的大流行。H1N1 2009大流行的經歷顯示製備用於人類接種的疫苗從病毒出現到可用於公眾之前需要6個月以上。當前的flu疫苗開發將不滿足大流行流感迅速傳播的性質的需求。可以肯定未來將有新的大流行；然而，預測時間和病毒亞型是不可能的。

新的減弱活流感(flu)疫苗將滿足季節性和大流行疫苗的需求。與裂解或滅活疫苗相比減弱活flu疫苗具有若干優點。第一，減弱活疫苗能夠在接受者中誘發更好的免疫應答；第二，減弱活疫苗使用更少的疫苗免疫；最後，減弱活flu疫苗可通過鼻腔給予容易地應用。

發明概述

開發新疫苗技術以滿足大流行預備狀態的需求極其重要。因此，本發明提供可快速和容易生產的減弱流感病毒和疫苗配方。

在一個方面，本發明提供包含遺傳上修飾的病毒基因組的減弱流感病毒。所述遺傳上修飾的病毒基因組包含非-結構(NS1)編碼段中的中斷和基質膜(matrix membrane)蛋白編碼段中的一個或多個鹼基置換。

在另一個方面，本發明提供包含減弱流感病毒和藥學上可接受的載體的疫苗配方，所述病毒包含病毒基因組的NS1編碼段中的中斷和病毒基因組的基質膜蛋白編碼段中的一個或多個鹼基置換。

在另一個方面，本發明提供用於產生減弱流感病毒的方法，包括：將中斷的流感病毒NS1基因編碼序列引入細胞或卵中；將流感病毒的基質膜編碼序列引入細胞或卵中，其中所述基質膜編碼序列包含一個或多個鹼基置換並且所述細胞或卵包含產生流感病毒顆粒所需的其餘流感病 毒基因段和病毒蛋白；和培養細胞或卵，在其中減弱流感病毒被複製。

在又一個方面，本發明提供用於誘發對流感病毒的免疫應答的方法，包括給予受試者有效量的包含經基因工程改造的減弱流感病毒和藥學上可接受的載體的疫苗配方，其中所述經基因工程改造的減弱流感病毒的基因組編碼中斷的NS1蛋白和一個或多個具有一個或多個錯義突變的基質膜蛋白。

在所提供方面的一些實施方案中，NS1編碼段中的中斷為導致敲除所編碼的NS1蛋白的缺失。所述減弱流感病毒可從流感病毒毒株，例如但不限於H7N9、H1N1和H5N1產生。在所提供的病毒、配方和方法的一些實施方案中，所述鹼基置換選自G917A置換、A14U置換和其組合。

本文所描述的方法和組合物可與藥學、醫學和獸醫應用，以及基礎科學研究和方法學結合使用，如當閱讀本公開內容時將對技術人員顯而易見的。當考慮附圖以及詳述時本發明的這些和其它物件、特徵和優勢將變得更清楚。

序列簡述

SEQ ID NO：1：NS-529F，用於反向PCR以缺失NS基因的內含子的正向引物。(5’-GACATACTGATGAGGATGTCAAAAATG-3’)

SEQ ID NO：2：NS-56R，用於反向PCR以缺失NS基因的內含子的反向引物。(5’-CTGAAAGCTTGACACAGTGTTTGG-3’)

SEQ ID NO：3：M-478F，用於WSN-M1和PR8-M1的即時PCR的正向引物。(5’-CGGTCTCATAGGCAAATGGT-3’)

SEQ ID NO：4：M-616R，用於WSN-M1的即時PCR的反向引物。(5’-CAATATCCATGGCCTCTGCT-3’)

SEQ ID NO：5：WSN-M2-F，用於WSN-M2和PR8-M2的即時PCR的正向引物。(5’-CCGAGGTCGAAACGCCTATC-3’)

SEQ ID NO：6：WSNM2-R，用於WSN-M2、WSN-mRNA3和WSN-M4的即時PCR的反向引物。(5’-CTCTGGCACTCCTTCGGTAG-3’)

SEQ ID NO：7：WSN-mRNA3-F，用於WSN-MRNA3和PR8-mRNA3的即時PCR的正向引物。(5’-AGCAAAAGCAGGCCTATC-3’)

SEQ ID NO：8：WSN-M4，用於WSN-M4的即時PCR的正向引物。(5’-ACCGATCTTGAGGCCTATC-3’)

SEQ ID NO：9：用於PR8-M1的即時PCR的反向引物。(5’-CAACCTCCATGGCCTCTGCT-3’)

SEQ ID NO：10：用於PR8-M2和PR8-mRNA3的反向引物。(5’-CTTTGGCACTCCTTCCGTAG-3’)

SEQ ID NO：11：NP-625F，用於WSN-NP的即時PCR的正向引物。(5’-GGTGAGAATGGACGGAGAAC-3’)

SEQ ID NO：12：NP-738R，用於WSN-NP的即時PCR的正向引物。(5’-CCGGCTCTCTCTCACTTGAT-3’)

SEQ ID NO：13：用於犬IFN-β的即時PCR的正向引物。(5’-CCAGTTCCAGAAGGAGGACA-3’)

SEQ ID NO：14：用於犬IFN-β的即時PCR的反向引物。(5’-CCTGTTGTCCCAGGTGAAGT-3’)

SEQ ID NO：15：用於犬β-肌動蛋白的即時PCR的正向引物。(5’-CCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3’)

SEQ ID NO：16：用於犬β-肌動蛋白的即時PCR的反向引物。(5’-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3’)

發明詳述

參考僅用於說明性目的的實施例，下文描述了本發明的幾個方面。應理解的是，許多具體細節、關係和方法為提供本發明的充分理解而列出。然而，相關領域普通技術人員將容易地認識到本發明可無一個或多個具體細節而實踐或用其它方法、方案、試劑、細胞系和動物實踐。本發明不受行為或事件的所說明的排序限制，因為一些行為可能以不同次序和/或與其它行為或事件同時發生。此外，實現本發明的方法學不需要所有的所說明的行為、步驟或事件。所描述的或本文引用的許多技術和程式為本領域技術人員所充分理解並使用常規方法學普通利用。

本發明提供製備敲除關鍵毒力基因，甲型流感病毒干擾素拮抗物，非結構蛋白(NS1)的減弱活甲型流感疫苗毒株(本文指定為NS1-del和DelNS1；術語可互換使用)的方法。NS1蛋白的敲除提供兩個優點。第一，該病毒毒株對人類無毒力；第二，更重要的是NS1-del疫苗可從宿主誘發好得多的免疫應答，這是因為NS1對於先天和適應性 免疫二者均為強拮抗物。通常，敲除NS1基因的甲型流感病毒不能在細胞或卵，例如含胚雞蛋中良好生長；然而，本發明提供用於通過病毒基因組編碼基質膜蛋白的段中的突變，例如A14U或G917A補償病毒複製中的這一缺陷的機制。因此，本發明提供一種產生對人類無毒力並且可在短時間內生產以應用於季節性和大流行流感的預防的減弱疫苗的新方法。

在一個方面，本發明提供包含遺傳上修飾的病毒基因組的減弱流感病毒。所述遺傳上修飾的病毒基因組包含非-結構(NS1)編碼段中的中斷和基質膜蛋白編碼段中的一個或多個鹼基置換。所述遺傳修飾導致無NS1蛋白的病毒；然而，該病毒保留其病毒複製能力(由於基質膜蛋白編碼段中的鹼基置換，其補償NS1丟失)。

在另一個方面，本發明提供包含減弱流感病毒和藥學上可接受的載體的疫苗配方，所述病毒包含病毒基因組NS1編碼段的中斷和病毒基因組的基質膜蛋白編碼段的一個或多個鹼基置換。

如本文所使用的，術語“疫苗”或“疫苗配方”是指刺激對特定一種抗原或多種抗原(即，流感病毒)的免疫應答的組合物。因此，疫苗指以建立對特定流感病毒的免疫應答和/或免疫記憶為目標給予受試者的組合物。也考慮疫苗組合物可包含設計用以增加疫苗產生免疫應答的能力的其它物質。還考慮本發明可在本文所公開組合物的混合物中提供一種以上的減弱病毒。例如，混合物可包含減弱 H1N1病毒和減弱H5N1病毒。同樣，所公開的方法可包括同時或分別給予多個疫苗。因此，本發明進一步包括給予第二種、第三種、第四種等減弱病毒；其中所述第二種、第三種、第四種等減弱病毒在單獨的疫苗中給予，用於與第一種減弱病毒同時或在第一種減弱病毒之後1、2、3、4、5、6、10、14、18、21、30、60、90、120、180、360天(或中間的任何天數)給予。

如本文關於組合物和配方所使用的，術語“藥學上可接受的”意指由聯邦或州政府的管理機關批准或在美國藥典或其它用於動物和/或人類的普遍承認的藥典中列出。

術語“載體”指與本文所述組合物一起給予的稀釋劑、賦形劑和/或溶媒。這樣的藥學載體可為無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、蔬菜或合成源的那些，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液體載體，特別是對於可注射的溶液。合適的藥學賦形劑包括，但不限於，澱粉、葡萄糖、蔗糖、明膠、乳糖、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。本文所述組合物和配方可還包含潤濕劑或乳化劑或懸浮/稀釋劑，或pH緩衝劑，或用於修飾或維持組合物的釋放速率的劑。配方可包括標準載體例如醫藥級的甘露醇、乳糖、糖精鈉、澱粉、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鎂等。這樣的組合物和疫苗將包含有效量的減弱病毒以及合適量的載體以便基於使用的給予方式為患者 提供適當形式。

如果用於靜脈內給予，可將所述疫苗和組合物包裝在無菌等滲水性緩衝的溶液中。若需要，所述組合物可還包含增溶劑。組合物的組分以單位劑量形式混合在一起或單獨提供。若組合物通過輸注給予，其可用包含無菌醫藥級水或鹽水的輸注瓶分配。若組合物通過注射給予，可提供無菌水或鹽水的安瓿以便成分可在注射前混合。所述疫苗和組合物還可鼻內、氣管內、口服、皮內、肌內、腹膜內或皮下給予受試者。

在另一個方面，本發明提供用於產生減弱流感病毒的方法，包括：將中斷的流感病毒NS1基因編碼序列引入細胞或卵中；將流感病毒的基質膜編碼序列引入細胞或卵中，其中所述基質膜編碼序列包含一個或多個鹼基置換並且其中所述細胞或卵包含產生流感病毒顆粒所需的其餘流感病毒基因段和病毒蛋白；和培養細胞或卵，在其中減弱流感病毒被複製。所述NS1中斷，與基質膜編碼序列中的一個或多個鹼基置換組合，導致保留其在宿主細胞或卵中的複製能力的減弱流感病毒。

在又一個方面，本發明提供用於誘發對流感病毒的免疫應答的方法，包括給予受試者有效量的包含經基因工程改造的減弱流感病毒和藥學上可接受的載體的疫苗配方，其中所述經基因工程改造的減弱流感病毒的基因組編碼中斷的NS1蛋白和一個或多個具有一個或多個錯義突變的基質膜蛋白。

如本文所使用的，術語“受試者”指動物。通常，提及受試者時術語“受試者”和“患者”在本文中可互換使用。正因如此，“受試者”包括進行免疫的動物，或本文所述組分的混合物，例如減弱病毒疫苗的接受者。術語“動物”包括，但不限於，小鼠、大鼠、狗、豚鼠、奶牛、馬、雞、貓、兔、豬、猴、黑猩猩和人類。

如本文所使用的，術語“有效量”指能夠誘發必需的免疫應答或另外能夠產生預期治療作用的量。

在本發明病毒、疫苗配方和方法的一些實施方案中，所述NS1編碼段中的中斷為導致敲除所編碼的NS1蛋白的缺失。在其它實施方案中，NS1編碼段的中斷導致截短的蛋白。截短的NS1蛋白喪失，至少，抑制受感染的細胞中干擾素β表達的能力。

在一些實施方案中，所述減弱的流感病毒可從甲型流感病毒毒株產生，例如，但不限於，H7N9、H1N1和H5N1。

在一些實施方案中，所述流感病毒基質膜編碼序列中的鹼基置換選自G917A置換、A14U置換和其組合。這樣的鹼基置換導致編碼的基質膜蛋白產物，其包含一個或多個錯義突變。這些突變導致補償NS1功能喪失的突變體基質膜蛋白產物，這導致細胞和/或卵中病毒複製的至少部分拯救。在一些實施方案中，減弱病毒中病毒複製的拯救水準與野生型活病毒相當。

為了更全面理解本發明的性質，應參考結合附圖所作的下列詳述。

圖1顯示證實與野生型(WSN-WT)相比NS1-del重組病毒(WSN-DelNS1)中NS1基因的缺失的DNA瓊脂糖凝膠結果。

圖2顯示表明在細胞中若干傳代後NS1缺失的H1N1(A/Wisconsin/1/33)毒株的M段中的置換的測序數據。在細胞中傳代H1N1 NS1-del病毒並在傳代病毒穩定後測序病毒基因組。在NS1-del H1N1病毒的M段中鑒定到單一置換，A14U。

圖3顯示表明在細胞中若干傳代後NS1缺失的H7N9病毒的M段中的置換的測序數據。在細胞中傳代H7N9 NS1-del病毒並在傳代病毒穩定後測序病毒基因組。在NS1-del H7N9病毒的M段中鑒定到單一置換，G917A。

圖4為顯示H1N1 NS1-del和野生型H1N1病毒在Vero細胞中的生長性質的圖。評估H1N1 NS1-del病毒的生長能力並與野生型病毒(WSN-WT)比較。WSN-delNS1-M-WT、WSN-delNS1-A14U和WSN-delNS1-M-CA2為分別包含具有WT、A14U和CA2置換的M段的NS1缺失病毒。CA2用作參考毒株，因為其先前在PR8病毒中已有描述(Wielink等人，2012,J.Virol 86(22)：12341.)。在本實驗中，分別用WSN WT或多種NS1-缺失突變體(以0.001MOI)感染Vero細胞。使用MDCK細胞通過噬菌斑 測定在不同的時間點(感染後天數)評估病毒滴度(pfu)。如圖中所示，我們發現WSN-delNS1-A14U病毒在Vero細胞中比delNS1-M-WT和WSN-delNS1-M-CA2複製更高的滴度。

圖5為顯示NS1-del和野生型H7N9病毒在Vero細胞中的生長性質的圖。評估H7N9 NS1-del病毒(ZJ1-DelNS1-M-G917A)的生長能力並與野生型病毒(ZJ1-WT)比較。

圖6為顯示NS1-del病毒(WSN-DelNS1-M-A14U)不能抑制受感染細胞中干擾素β表達的圖。

圖7顯示表明與野生型M段(表示為WSN-DelNS1-M-WT)相比NS1-del病毒(表示為WSN-DelNS1-M-A14U)的M段中的突變增強M2但下調M3從M段轉錄的圖。

圖8顯示小鼠模型中NS1-del和野生型病毒的致病性檢驗的結果圖。按照說明用5 x 10⁴的每種病毒或3μg的裂解H7N9疫苗的接種物接種6只小鼠的組群。每日觀察小鼠的體重變化持續14天(第0天-第14天)。喪失超過其感染前體重的25%的動物依照動物倫理學的方案安樂死並計入致死性結果。

圖9顯示對於標明的感染後天數小鼠中的平均體重變化百分數的圖，其表明接種NS1-del疫苗保護小鼠免於H7N9病毒的致死劑量攻擊。從圖8中所示的實驗存活的小鼠然後用1 x 10⁵pfu的H7N9 WT病毒攻擊。每日觀察小鼠的體重變化持續14天(第0天到第14天)。喪失超過 其感染前體重的25%的動物依照動物倫理學的方案安樂死並計入致死性結果。截至H7N9病毒攻擊後實驗的第10天用PBS接種的所有小鼠死亡。用裂解疫苗接種的小鼠顯示明顯的體重喪失但能夠從感染恢復。用WSN-delNSA-M-A14U接種的小鼠在感染開始時顯示體重輕微下降並迅速恢復。用WT H7N9病毒攻擊後在用H7N9-delNS1-M-G917A或H7N9-delNS1-M-G917A-A14U接種的小鼠之中未觀察到症狀或體重喪失。

圖10顯示DelNS1 H1N1病毒交叉保護高致病性禽H5N1病毒攻擊。小鼠用一劑(10⁴PFU)WSN-DelNS1-M-A14U、2009H1N1-DelNS1、2009 H1N1-冷適應病毒接種或用PBS類比接種持續兩周，然後用100MLD₅₀的A/Vietnam/1194/04 H5N1病毒攻擊。H5N1病毒攻擊之後記錄小鼠的體重喪失(A)和(B)存活率持續14天。

圖11顯示DelNS1減弱活疫苗提供比冷適應疫苗更好的對H5N1病毒的高劑量攻擊的交叉保護。小鼠用一劑(10⁴PFU)2009H1N1-DelNS1、H7N9De3NS1-MG917A、2009 H1N1-冷適應病毒接種，或用PBS模擬接種，持續兩周然後用1000MLD₅₀的A/Vietnam/1194/04 H5N1病毒攻擊。H5N1病毒攻擊之後記錄小鼠的體重喪失(A)和(B)存活率持續14天。

圖12顯示穩定WSN-DelNS1病毒的構建和建立。(A)NS段轉錄物以及具有NS1缺失的NS突變體的示意圖。DelNS1質粒通過缺失NS段中範圍為nt 57-528的內含子 區構建。NCR，非編碼區。(B)拯救的DelNS1病毒中NS1缺失的確認。從P1病毒提取病毒RNA，通過RT-PCR擴增NS段並使用瓊脂糖凝膠電泳分析。(C)DelNS1和野生型A/WSN/33病毒的噬菌斑尺寸。(D)每次傳代後DelNS1病毒的滴度(PFU/ml)。(E)DelNS1病毒基因組的序列分析揭示M段非編碼區中核苷酸14位元處的A-U置換。非編碼區用黑線標記，A14U突變用箭頭指示。(F)包含M-WT與M-A14U、M-A14U-CM15、M-A14C和M-A14G置換的WSN-DelNS1病毒的拯救效率比較。NR，未拯救到。(G)包含M-WT或M-A14U的PR8-DelNS1病毒的拯救效率。DelNS1病毒在混合的HEK293T和MDCK細胞培養物中用標注的M-WT或M突變體質粒拯救，然後通過噬菌斑測定滴定。標繪的值為平均值(±標準差[SD])(n=3)並且代表來自至少5個獨立實驗的資料。

圖13顯示M-A14U-DelNS1病毒在MDCK和Vero細胞的生長動力學。(A和B)使用柱-純化的反向遺傳WSN-WT、WSN-DelNS1-M-A14U和WSN-DelNS1-M-WT病毒以複合感染(MOI)0.1感染MDCK細胞(A)或Vero細胞(B)。在標明的時間點收集上清液並通過噬菌斑測定滴定病毒。(C)使用柱-純化的反向遺傳PR8-WT和PR8-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染MDCK細胞(左側面板)和Vero細胞(右側面板)。感染後24h收集上清液並通過噬菌斑測定滴定。標繪的值(平均值±SD；n=3)為來自至少3個獨立實驗的代表性資料。

圖14顯示WSN-DelNS1病毒中IFN-β抑制活性的喪失。(A)在用WSN-WT或WSN-DelNS1-M-A14U以MOI 1或用陽性對照，SeV，以50HA單位感染之前24小時用IFN-

告基因質粒轉染HEK293T細胞。24h後，收集細胞並準備細胞裂解物用於評估螢光素酶活性。螢光素酶測定一式三份進行，並將值對海腎(Renilla)螢光素酶對照歸一化。(B)MDCK細胞用WSN-WT或WSN-DelNS1-M-A14U以MOI 0.1感染並培養16h後通過qRT-PCR定量IFN-β和病毒NP mRNA水準。值對犬肌動蛋白歸一化。(C)通過非變性凝膠電泳分析用WSN-WT、WSN-DelNS1-M-A14U或SeV感染的HEK293T細胞中IRF3二聚作用的抑制。(D)比較在用WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒感染的MDCK細胞中抑制IFN-β表達的活性。與對於面板B所描述的實驗相似，MDCK細胞用標明的病毒以MOI 0.1感染，並在感染後16h通過qPCR定量IFN-β和NP mRNA水準。值對犬肌動蛋白歸一化。(E)6-8周齡的6只BALB/c小鼠的組群用5 x 10⁴PFU的WSN-WT或WSN-DelNS1-M-A14U突變體病毒鼻內接種，感染後每天監測體重持續14天。(F)受感染小鼠的肺組織中病毒的複製效率。3只小鼠的組群用10⁴PFU的WSN-WT、WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U突變體病毒感染，然後在感染後72h安樂死，收集每一小鼠的肺組織並均質化用於使用MDCK細胞通過噬菌斑測定滴定病毒。統計顯著性通過單向方差分析 (ANOVA)或Student’s t檢驗分析(**,p<0.01)。標繪的條顯示平均值±SD(n=3)，並且結果代表至少三個獨立實驗。

圖15顯示M-A14U突變對M1和M2蛋白表達的作用。(A)MDCK細胞用WSN-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 2感染。在標明的時間點收集細胞並通過蛋白質印跡用特異性抗體分析細胞裂解物，如材料與方法中所描述的。(B)MDCK細胞用WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染。感染後16h，收集細胞裂解物用於用特異性抗體蛋白質印跡。(C)MDCK細胞用WSN-WT或WSN-M-A14U病毒以MOI 5感染。在標明的時間點製備細胞裂解物用於用特異性抗體蛋白質印跡。β-微管蛋白作為上樣對照包含在內。所有的結果均代表三個獨立實驗。

圖16顯示M-A14U置換對M轉錄物的選擇性剪接的作用。(A)M段轉錄物的示意圖。vRNA M段的3’NCR的序列以紅色顯示，mRNA3剪接供體(SD)位元點用黃色突出顯示。供體位元點的剪接共有序列在非編碼區序列上用綠色標明(M、A或C；R、A或G)。(B)病毒-感染細胞中不同M mRNA水準的分析。MDCK細胞用標明的病毒以MOI 0.1感染。感染後16h分離總RNA。通過定量RT-PCR測定M1、M2、mRNA3和M4的mRNA水準，如材料與方法中所描述的。(C)HEK293T細胞用pHW2000-WSN-M-WT或pHW2000-WSN-M-A14U質粒轉染，用或不 用pCX-WSN-NS1共轉染用於共表達NS1。轉染後48h，分離總RNA。DNA酶處理後，通過定量RT-PCR測定mRNA水準。(D)MDCK細胞用PR8-WT、PR8-M-A14U或PR8-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染。感染後16h，分離總RNA並通過qPCR測量mRNA水準。示出了M2/M1 mRNA和mRNA3/M1 mRNA比率。標繪的所有結果均指示平均值±SD(n=3)並且代表三個獨立實驗。

圖17顯示M-A14U置換對M2/M1 mRNA比率的作用。(A)MDCK細胞用WSN-WT、WSN-M-A14U、WSN-M-A14G或WSN-MG12C-CM13病毒以MOI 5感染。在標明的時間點提取總RNA並通過定量RT-PCR測定mRNA3的水準。(B)WSN-WT、WSN-M-A14U、WSN-M-A14G和WSN-M-G12C-CM13病毒的生長動力學分析。MDCK細胞用這些病毒以MOI 0.001感染。在標明的時間點收集上清液並通過噬菌斑測定滴定。(C-E)MDCK細胞用WSN-WT、WSN-M-A14U、WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染。感染後16h，分離總RNA，並通過定量RT-PCR測定M2/M1、mRNA3/M1和M4/M1 mRNA比率。(F)mRNA3對病毒複製的作用。HEK293T細胞在用WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染之前24h用pCX-WSNmRNA3或對照載體轉染。在標明的時間點收集上清液並通過噬菌斑測定滴定病毒。標繪的所有條和點指示來自三個獨立實驗的平均值±SD(n=3)。**，學生t檢驗p=0.0013。

圖18顯示病毒NS1和聚合酶蛋白對M mRNA剪接宿主機構的調節。(A)HEK293T細胞用遞增量的pCX-WSN-NS1轉染。轉染後24h，細胞用WSN-DelNS1-M-WT、WSN-DelNS1-M-A14U或WSN-WT病毒以MOI 0.5感染。轉染後8h分離總RNA並通過定量RT-PCR分析M1 mRNA、M2 mRNA和mRNA3水準。(B)用克隆入的pHW2000質粒的M段(表達M vRNA)的WT和多個突變體，與或不與pCX-WSN-NS1質粒一起轉染HEK293T細胞。轉染後48h製備細胞裂解物用於用特異性抗體蛋白質印跡。β-微管蛋白作為上樣對照包含在內。(C)A14U置換對M vRNA複製的作用。MDCK細胞用WSN-WT、WSN-M-A14U或WSN-M-A14G病毒以MOI 5感染。轉染後4和10h，分離總RNA用於qRT-PCR分析，並如上所述測定vRNA的相對量。(D)A14U置換增強MvRNA複製。MDCK細胞用WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染。感染後16h分離總RNA。M和NP vRNA水準通過定量RT-PCR測定，如上所述。標繪的所有條顯示平均值±SD(n=3)。結果代表三個獨立實驗。**,p<0.01；***,p=0.0002(學生t檢驗)。

材料與方法

細胞和病毒

人胚腎(HEK)293T(ATCC)和Vero細胞(ATCC)在添加10%胎牛血清、100單位/ml盤尼西林和100μg/ml硫酸鏈黴素(Life Technologies)的Dulbecco’s最小必需培養基(DMEM)中于37℃培養，而MDCK(ATCC)細胞在添加相同量的血清和抗生素的Eagle’s最小必需培養基(MEM)中生長。甲型流感病毒通過反向遺傳學拯救並在MDCK細胞中擴增，如先前所描述的。病毒使用Amicon Ultra-15離心過濾元件(100KD)(Millipore)純化以除去培養基中的細胞因數。仙台病毒(SeV)在含胚雞蛋中繁殖。

質粒構建

進行反向PCR以缺失插入pHW2000載體的NS基因的內含子，將質粒磷酸化並自身連接。用於反向PCR的引物為5’-GACATACTGATGAGGATGTCAAAAATG-3’(NS-529F,SEQ ID NO：1)和5’-CTGAAAGCTTGACACAGTGTTTGG-3’(NS-56R,SEQ ID NO：2)。對於點突變，使用QuikChange II定點突變試劑盒(Stratagene)。

DelNS1病毒的傳代

本研究中進行DelNS1病毒的連續盲傳(blind serial passage)。首先通過將包含8段流感病毒基因組的8個pHW2000質粒共轉染入HEK293T/MDCK混合細胞培養物拯救DelNS1病毒；隨後在轉染後72h收集上清液並指定為0代(P0)病毒。使用從拯救程式獲得的P0病毒在T25 燒瓶中於37℃感染MDCK細胞。二或三天後，轉移上清液以感染新鮮MDCK細胞。在每代測量病毒滴度。5次傳代後，當亞培養物中的病毒滴度穩定時，獲取並分析每一代DelNS1病毒的全基因組序列。

報導基因測定

將HEK293T細胞接種在48-孔板上並用50ng包含來自M段的非編碼區的每一檢驗質粒和螢火蟲螢光素酶報導基因共轉染，連同10ng海腎螢光素酶報導基因作為對照。培養24h後，依照製造商的說明(Promega)測量螢光素酶活性。對於IFN-β啟動子活性報導基因測定，細胞在轉染後24h用標明的病毒以複合感染(MOI)1(甲型流感病毒)或50HA單位(SeV)感染。使用海腎螢光素酶值將螢火蟲螢光素酶值歸一化。

生長動力學

用標明的病毒以MOI 0.1感染接種在24-孔板中的80-100%匯合的MDCK或Vero細胞。吸收1h後，去除上清液並用500μl磷酸-緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞兩次。用包含1μg/ml甲苯磺醯基苯丙氨醯氯甲基酮(TPCK)-處理的胰蛋白酶(Sigma)的MEM覆蓋感染的細胞並於37℃孵育。在標明的時間點收集上清液並通過噬菌斑測定在MDCK細胞中測定病毒滴度。

噬菌斑測定

在MEM中製備每一待檢驗病毒的十倍連續稀釋。用病毒接種接種在6-孔板上的匯合MDCK細胞，37℃吸附1h然後去除上清液。細胞用PBS洗滌兩次然後用包含1μg/ml TPCK-處理的胰蛋白酶的1% MEM瓊脂糖覆蓋。將板倒置在37℃培養箱中48h。然後用25%福馬林室溫固定板至少2h。用1%結晶紫/20%乙醇染色後，用自來水洗滌板以去除過量染料。將噬菌斑肉眼視覺化並計數。噬菌斑測定檢測濃度

1PFU/ml的流感病毒。

蛋白質印跡

用標明的病毒以MOI 5感染MDCK細胞並在不同的時間點用細胞裂解緩衝液(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,和1% Triton X-100,pH 7.4)裂解。以12,000g的速度離心15min後丟棄細胞碎片。如下進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(NPAGE)。不添加SDS製備7-8%的聚丙烯醯胺凝膠並省略濃縮膠。

用於N-PAGE的樣品用螢光素酶測定中使用的被動裂解緩衝液裂解。與5X上樣緩衝液(1MTris-HCl[pH 6.8],50%甘油，1%溴酚藍)混合後，將樣品儲存在-80℃或立即分析，上樣前將凝膠在4℃以40mA的恒定電流預運行30min。然後以與對於SDS-PAGE相似的方式處理凝膠。小鼠單克隆抗-M1(sc-57881)和兔多克隆抗-IRF3(sc-9082)抗體購自Santa Cruz Biotechnology。小鼠單克隆抗-M2 (ab5416)購自Abcam。小鼠單克隆抗-β-微管蛋白購自Sigma。NP、HA和NS1使用實驗室自製的抗體分別以1：5,000、1：3,000和1：5,000的稀釋度檢測。

定量即時PCR(qRT-PCR)

在感染或轉染之後標明的時間點，使用RNAiso(TaKaRa)分離總RNA。通過DNase(Ambion)處理去除DNA污染。使用高容量cDNA反轉錄試劑盒(Life Technologies)反轉錄大約200ng總RNA。Uni12和oligo(dT)引物分別用於在反轉錄反應中製備mRNA和vRNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa)進行即時PCR。用於WSN-M1的引物為5’-CGGTCTCATAGGCAAATGGT-3’(M-478F,SEQ ID NO：3)和5’-CAATATCCATGGCCTCTGCT-3’(M-616R,SEQ ID NO：4)。用於WSN-M2的引物為5’-CCGAGGTCGAAACGCCTATC-3’(WSN-M2-F,SEQ ID NO：5)和5’-CTCTGGCACTCCTTCGGTAG-3’(WSNM2-R,SEQ ID NO：6)。用於WSN-mRNA3的正向引物為5’-AGCAAAAGCAGGCCTATC-3’(WSN-mRNA3-F,SEQ ID NO：7)，用於WSN-M4的正向引物為5’-ACCGATCTTGAGGCCTATC-3’(SEQ ID NO：8)。用於WSN-mRNA3和WSN-M4的反向引物為WSN-M2-R。用於PR8-M1的正向引物與WSN-M1的正向引物M-478F相同，並且反向引物為5’-CAACCTCCATGGCCTCTGCT-3’(SEQ ID NO：9)。用於PR8-M2和PR8-mRNA3的反向引物為5’-CTTTGGCACTCCTTCCGTAG-3’(SEQ ID NO： 10)，並且正向引物分別為WSN-M2-F和WSN-mRNA3-F。用於WSN-NP的引物為5’-GGTGAGAATGGACGGAGAAC-3’(NP-625F,SEQ ID NO：11)和5’-CCGGCTCTCTCTCACTTGAT-3’(NP-738R,SEQ ID NO：12)。用於犬IFN-β的引物為5’-CCAGTTCCAGAAGGAGGACA-3’(正向，SEQ ID NO：13)和5’-CCTGTTGTCCCAGGTGAAGT-3’(反向，SEQ ID NO：14)。

用於犬β-肌動蛋白的引物為5’-CCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3’(正向，SEQ ID NO：15)和5’-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3’(反向，SEQ ID NO：16)。

使用已建立的方案分析相對mRNA水準。qRT-PCR的擴增特異性通過每個程式結束時的熔解曲線分析確認。

小鼠感染

小鼠實驗使用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠進行。為了測定肺組織中的病毒複製，用稀釋在25μl PBS中的1x 10⁴PFU的WSN-WT、WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒鼻內感染3只小鼠的組群。三天後，將小鼠安樂死並移除肺以在1ml PBS中均質化。然後通過噬菌斑測定在MDCK細胞中測定病毒滴度。為了測定病毒的致病性，用25μl PBS中5 x 10⁴PFU的野生型(WT)或DelNS1-M-A14U病毒或僅用PBS鼻內接種6只小鼠的組群，每天記錄感染和對照組小鼠的體重持續14天。依照動物倫理學指南，將體重損失超過初始體重的 25%的小鼠安樂死。

本文參考或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和出版通過引用以其整體結合，其包括所有圖片和表格，至其不與本說明書的明確教導矛盾的程度。

下列為說明用於實踐本發明的程式的實施例。這些實施例不應解釋為限制性的。所有百分比均為按重量計並且所有的溶劑混合物比例均為按體積計，除非另外指明。

實施例1-NS1-del病毒中用於病毒複製的M段中的置換

為了獲得NS1-del病毒毒株，分別將衍生自H1N1、H7N9和H5N1的全長NS基因組段NS克隆入pHW2000載體。通過誘變方案敲除NS1的編碼區，而完整的NS2(或NEP)保留在基因組段中(圖1)。NS1-del病毒通過將每一病毒的8段共轉染入293T細胞中拯救。將所得的拯救病毒(滴度非常低或甚至通過常規測定檢測不到)在A549或VERO細胞中盲傳。收集上清液用於滴定和測序分析。一旦傳代中的病毒滴度穩定，比較每一代的序列。將所有8段的序列與親本基因組比較並鑒定置換。在重複實驗中始終觀察到M段中的兩個置換，即H1N1中的A14U和H7N9中的G917A(圖2和3)。

實施例2-M段中具有置換的NS1-del病毒的生長的表徵

在多個細胞系，包括MDCK、VERO和A549中分析了衍生自H1N1(WSN毒株)(圖4)和H7N9(Zhejiang毒 株)(圖5)的NS1-del病毒與野生型副本的生長動力學。發現NS1-del病毒能夠在MDCK或VERO細胞中生長至一定水準。在Vero細胞中WSN-delNS1-A14U病毒複製至遠高於delNS1-M-WT和WSN-delNS1-M-CA2的滴度。NS1-del病毒使用含胚雞蛋進一步評估，並且顯示這些病毒能夠在雞蛋中繁殖。

實施例3-NS1-del病毒的干擾素拮抗的表徵

NS1蛋白的主要功能為抑制受感染細胞中的干擾素表達。進行實驗以證明NS1-del病毒不能抑制宿主干擾素表達(圖6)。確定NS1-del病毒已喪失此功能尤其重要，因為其與流感病毒的毒力有關。

實施例4-NS1-del病毒的M段中的突變增強M2但下調M3從M段轉錄

由於M2、M3和M4 mRNA的差異剪接在病毒複製的調節中發揮作用，進行了實驗，其顯示M段中的置換增強M2但是下調M3 mRNA轉錄(圖7)。這一發現提供了對在缺乏NS1蛋白時M的置換對病毒複製的機制解釋。

實施例5-NS1-del病毒在小鼠中的表徵

為了進一步評估NS1-del病毒的致病性質，進行實驗以檢查小鼠中的NS1-del病毒。用野生型H7N9或NS1-del病毒感染6只小鼠的組群並每天記錄死亡率和體重持 續兩周。發現用NS-del病毒感染的小鼠不顯示疾病症狀並且保持穩定的體重，而用野生型H7N9病毒感染的小鼠從感染後第2天喪失體重；所有感染小鼠在第6天死亡。該結果證明NS-del病毒對小鼠無毒力，甚至在高劑量時(圖8)。

實施例6-通過NS1-del病毒免疫保護小鼠免於致死攻擊

為了檢驗NS1-del疫苗在小鼠中的功效，如圖9中所說明來進行實驗。首先用5 x 10⁴噬菌斑形成單位(pfu)的多個版本的NS-del病毒、裂解疫苗或PBS對照接種6只小鼠的組群。兩周後，用10⁵pfu的野生型H7N9病毒攻擊小鼠。監測小鼠的死亡率，並記錄體重持續14天。圖9中的結果顯示：(1)用PBS對照接種的小鼠從感染後第3天喪失體重並且所有小鼠在攻擊後第10天死亡；(2)用H7N9 NS1-del病毒接種的小鼠在整個實驗期間未顯示明顯體重喪失；(3)用H1N1 NS1-del病毒接種的小鼠在感染的最初4天期間顯示輕微體重喪失但其後恢復並在剩餘實驗中保持正常；(4)用一劑裂解H7N9疫苗接種的小鼠在第一周顯示明顯的體重喪失，但小鼠能夠從感染恢復並恢復體重。該實驗顯示了使小鼠免於致死劑量的高致病性H7N9病毒攻擊的保護。NS1-del疫苗提供比裂解疫苗更好的保護。NS1-del H1N1病毒保護小鼠免於H7N9攻擊進一步提示NS1-del疫苗可提供對異-亞型病毒感染的交叉保護。

實施例7-NS1-del疫苗對禽H5N1病毒致死攻擊的交叉保護

進行了實驗以驗證DelNS1疫苗對高致病性禽H5N1病毒致死攻擊的交叉保護。除了衍生自WSN和H7N9毒株的DelNS1病毒以外，還相似地構建了來自2009大流行H1N1病毒的DelNS1病毒，其被指定為2009H1N1-DelNS1並評估對A/Vietnam/1194/04 H5N1病毒致死攻擊的交叉保護。為了檢驗接種DelNS1病毒是否會提供對小鼠中H5N1病毒感染的更好保護，使用2009 H1N1冷適應病毒，其被指定為2009 H1N1-冷適應，作為對照。2009 H1N1-冷適應病毒在病毒基因組中包含野生型NS1基因。

如圖10中所示，儘管在感染開始時存在一些體重喪失(A)，80%的用WSN-DelNS1、2009H1N1-DelNS1和2009 H1N1-冷適應病毒接種的小鼠從較低致死劑量(100MLD₅₀)1194 H5N1病毒的攻擊中存活。該結果表明用冷適應或DelNS1病毒接種會提供對異亞型病毒感染的交叉保護。然而，基於病毒攻擊後的體重變化與包含野生型NS1基因的同種減弱活病毒相比，2009H1N1-DelNS1病毒似乎提供更好的保護(A)。為了進一步區分包含NS1和DelNS1的疫苗毒株之間的保護水準，評估了用較高致死劑量(1000MLD₅₀)的A/Vietnam/1194/04 H5N1病毒攻擊的小鼠中的保護。如圖11中所示，用PBS或2009 H1N1-冷適應病毒接種的小鼠在H5N1病毒攻擊後6和9天之後死 亡(A & B)。然而，80%的用2009 H1N1-DelNS1或H7N9DelNS1-MG917A病毒接種的小鼠從致死攻擊中存活(B)。在感染開始時僅觀察到小於15%的體重喪失並且小鼠能夠在H5N1病毒攻擊10天後恢復。綜合起來，這些結果顯示DelNS1流感病毒提供比包含野生型NS1的疫苗毒株強得多的交叉保護。

實施例8-病毒RNA的M段的3’非編碼區(NCR)中的A14U置換支援流感病毒的複製

本發明的這一實施方案提供病毒RNA的M段的3’NCR中的A14U置換通過調節M段mRNA的選擇性剪接支持具有NS1缺失的流感病毒的複製。流感病毒的NS1蛋白具有多種功能並且為毒力的決定因數。DelNS1流感病毒為用於研究病毒複製的有用工具並且可用作有效的減弱活疫苗；然而，NS1的缺失嚴重減少病毒複製，妨礙功能研究和疫苗生產。本發明提供在細胞中持續傳代的WSN-DelNS1病毒經適應而獲得在病毒RNA(vRNA)的M段的3’NCR中A14U置換，該置換恢復複製能力。DelNS1-M-A14U病毒不能抑制病毒-感染細胞中的干擾素表達，為研究NS1不存在時的病毒複製提供了基本模型。DelNS1-M-A14U病毒的表徵顯示NS1缺乏對其它病毒蛋白的表達無明顯作用，除了M mRNA。M轉錄物，M1、M2、mRNA3和mRNA4的表達受選擇性剪接調節。A14U置換改變mRNA3的剪接供體位點共有序列，更改 M轉錄物的表達，在DelNS1-M-A14U，而非DelNS1-M-WT病毒-感染的細胞中M2表達明顯增加並且mRNA3受到顯著抑制。進一步的分析揭示A14U置換還影響病毒基因組複製期間的啟動子功能。M-A14U突變增加DelNS1病毒感染中的MvRNA合成並且在其它病毒蛋白質缺乏時增強M2 mRNA的選擇性剪接。該發現證明NS1通過調節M轉錄物的選擇性剪接直接參與流感病毒複製並提供對於構建NS1缺失疫苗毒株重要的戰略資訊。

流感病毒的NS1具有多種功能。除了其在對抗宿主抗病毒活性中的作用外，還認為NS1牽涉調節病毒複製。NS1蛋白為抑制先天和適應性免疫二者的毒力決定因數並且NS1缺失的減弱活病毒有希望作為有效的疫苗。然而，NS1的缺失導致感染期間病毒複製的嚴重減弱，這妨礙功能研究和疫苗開發。提供了在vRNA M段的3’NCR中攜帶A14U置換的能夠複製的DelNS1病毒。M-A14U突變通過調節從M段轉錄的mRNA的選擇性剪接支援病毒複製。正因如此，本發明提供可用作減弱活疫苗的NS1缺失的可複製毒株。

甲型流感病毒是導致年度流行病以及偶見的大流行的重要的人呼吸道病原體。甲型流感病毒基因組包含8個負義單鏈RNA段。分段的基因組允許不同流感病毒之間頻繁發生重新分配事件，這導致重配病毒的致病性和傳播性質改變。感染週期期間甲型流感病毒的複製過程受宿主和病毒因數調節。流感病毒進入細胞通過病毒血凝素(HA)附 著至細胞唾液酸受體引發，所述細胞唾液酸受體介導內吞過程以將病毒基因組釋放入細胞質中。病毒基因組隨後經由輸入蛋白-α1/輸入蛋白-β1-依賴性核輸入途徑輸入核中，在此處流感病毒利用基因組-結合病毒RNP聚合酶複合體和宿主轉錄機構複製病毒基因組和表達病毒mRNA用於蛋白合成。已經從病毒-感染細胞鑒定了至少14種病毒蛋白。在這些病毒蛋白中，PB1、PB2、PA、NP、HA、NA、M1、M2、NS1和NS2(NEP)在受感染細胞中有規律地表達。PB1-F2、PB1-N40和PA-X的表達不那麼一致地被觀察到並且可能與病毒毒株和感染條件有關。用在M段轉錄物中mRNA4剪接供體位元點處突變的病毒感染期間還報導了一種M2-相關蛋白，M42的表達。然而，許多甲型流感病毒體可能未能表達至少一種必需病毒蛋白並變為不能複製的感染顆粒。病毒蛋白的表達受病毒和宿主二者控制並且病毒蛋白表達的差異調節可導致病毒複製效率差異，引起可變的致病性感染結果。

在甲型流感病毒的8個基因組段之中，NS和M段二者均表達差異剪接的轉錄物。從NS和M段分別表達兩種成熟mRNA，NS1和NS2(NEP)，和四種mRNA，M1、M2、M3和M4。儘管存在四種來自M段的差異剪接的轉錄物，在甲型流感感染中僅基質(M1)和離子通道(M2)蛋白具有已知作用。M1和M2在病毒複製期間在病毒核輸出、病毒體包裝和出芽中具有重要功能。對於從M段衍生的其它兩種mRNA，mRNA3和mRNA4，尚未發現已知 的功能。一個病毒mRNA動力學研究發現細胞的病毒感染期間M1和M2 mRNA的積累受到調節。在NS1和NS2(NEP)剪接調節中也觀察到相似的現象，其與病毒感染的進展協調。病毒聚合酶複合體調節流感病毒M1 mRNA中選擇性5’剪接位點的利用，與細胞剪接因數SF2/ASF協調，以控制病毒複製期間M2 mRNA的表達。然而，另一個研究顯示NS1蛋白調節M段mRNA的剪接並且該活性需要NS1具有RNA結合功能。據報導通過傳代包含來自A/turkey/Turkey/1/05的H5和N1以及來自A/PR/8/34毒株的其餘段但缺失NS1的重配病毒在M段中獲得適應性置換。雖然這些M段置換的具體功能尚未表徵，該研究似乎提示在病毒複製中NS1與M功能之間存在相互作用。儘管NS1蛋白對病毒複製不是必需的，但它具有多種功能，並且NS1基因的缺失引起流感病毒複製的嚴重減弱。DelNS1病毒的減弱可能是由於抑制宿主干擾素(IFN)表達能力的喪失，因為無NS1的病毒在干擾素-缺陷細胞中能夠正常複製。然而，若干研究顯示NS1可能還通過其它機制參與流感病毒轉錄和複製的調節。

本發明的一個實施方案提供從A/WSN/33和A/PR/8/34毒株衍生的DelNS1流感病毒。儘管NS1基因缺失在有干擾素能力的系統中通常引起嚴重的病毒減弱，但vRNA的M段的3’NCR中的適應性置換，A14U，顯著增強DelNS1病毒的複製。同樣，DelNS1病毒不能表達充足量的M2 mRNA，可能是因為NS1功能的缺乏，而M- A14U置換恢復M2表達。

M段中的A14U突變足以恢復DelNS1 WSN病毒的生長

儘管流感病毒的NS1蛋白對病毒複製不是必需，但不表達功能NS1的病毒嚴重減弱並且僅能在IFN-缺陷系統中複製。已使用在細胞中表達NS1的輔助病毒來支援用於疫苗研究的DelNS1病毒的生產。在一個使用包含來自H5N1病毒的HA和NA以及來自A/PR/8/34的內段的重配病毒的研究中顯示M和NS段中的置換恢復DelNS1病毒複製的生長。然而，恢復生長的機制尚未確定。為了更好地理解NS1在病毒複製中的作用以及為了開發用於製造DelNS1病毒的方法，生產了A/WSN/33毒株的DelNS1版本(圖12A)。NS1的缺失通過病毒基因組檢查確認。

噬菌斑分析顯示DelNS1病毒形成明顯比野生型病毒小的噬菌斑(圖12B和C)。在MDCK細胞中WSN-DelNS1病毒的複製能力在三代內增加，與原始DelNS1病毒(P1)相比病毒滴度上升幾乎2 logs(圖12D)。序列分析證實產生了變體病毒但僅在vRNA M段的3’NCR中發現一個置換，A14U(M-A14U)；在基因組中未發現其它突變(圖12E)。為了證實M段中M-A14U的引入不是隨機事件，重複該實驗並且獲得相同的A14U變體。為了進一步檢驗M-A14U突變是否足以增加DelNS1病毒的生長，比較WSN-DelNS1病毒與M-WT或使用反向遺傳學拯救的M- A14U、M-A14UCM15、M-A14G或M-A14C突變的效率，然後在MDCK細胞中噬菌斑滴定拯救的病毒。

A14G與A14U在生物化學上相似，因此也拯救了相應的病毒，而不是具有A14C突變的那些。為了檢驗A14U鹼基配對的潛在中斷，如已經觀察到12和13位元的突變可影響病毒生長，將在M cRNA 3’末端的15位處包含額外的互補突變的M-A14U-CM15突變體包含在內。A14U置換似乎是獨特的並且不需要互補突變。所拯救的DelNS1-M-A14U突變體病毒的滴度高達1.75 x 10⁵PFU/m，比M-WT DelNS1病毒高約750倍(圖12F)。為了檢驗A14U置換是否也可在其它細胞中出現，在Vero細胞中傳代WSN-DelNS1病毒。然而，在超過8次傳代後未觀察到突變。

為了進一步證實M-A14U還支援其它流感病毒毒株的複製，將該置換引入A/PR/8/34毒株的DelNS1版本的M段並且，與用WSN的觀察一致，M-A14U顯著提高所拯救的病毒的滴度(圖12G)，而無M-A14U置換的PR8-DelNS1病毒不能被拯救。這些結果表明M-14U置換可在缺乏NS1蛋白表達下恢復病毒複製。

M-A14U置換支援病毒複製但不抑制IFN表達

DelNS1流感病毒不能在MDCK細胞中複製並且僅可在Vero細胞中生長。生長動力學分析顯示M-A14U DelNS1病毒在MDCK和Vero細胞二者中能夠複製達到 與野生型病毒相當的滴度(相比低不到1 log)(圖13A和B)。相似地，M-A14U置換支援PR8 DelNS1病毒在Vero和MDCK細胞中複製，而無該置換的PR8 DelNS1病毒不能繁殖(圖13C)。NS1蛋白作為宿主抗病毒活性的病毒拮抗物的功能已明確定義。NS1的缺失減弱病毒抑制干擾素表達的能力，如在報告基因測定中和通過IFN-β活化的qRT-PCR所測量的(圖14A和B)。DelNS1-M-A14U病毒不能抑制受感染細胞中IRF3的活化(圖14C)。儘管M-A14U使DelNS1病毒能夠比WSN-DelNS1-M-WT病毒更有效地生長，該置換對干擾素的抑制無作用(圖14D)。為了進一步確定M段中的A14U置換是否可改變病毒在體內的致病性性質，在小鼠中比較了WSN-WT和WSN-DelNS1-M-A14U突變體病毒在肺組織中的毒力和複製。儘管野生型WSN毒株導致受感染小鼠中迅速的體重喪失和死亡，但用WSN-DelNS1-M-A14U突變體病毒未觀察到明顯的致病性。受感染小鼠的肺組織中的病毒滴度的評估顯示WSN-DelNS1-M-A14U和WSN-DelNS1-M-WT突變體二者在肺組織中均複製不佳，達到的水準與對於WSN-WT病毒所觀察到的相比低大約3 logs(圖14E和F)。因此，M-A14U置換的引入保留DelNS1病毒所具有的無毒力性質，這使其適合用於疫苗開發。

M-A14U置換影響病毒複製中M轉錄物的剪接。NS1蛋白不是病毒聚合酶複合體的組分。DelNS1病毒中M段中單獨的A14U置換恢復複製這一觀察提示NS1可牽涉調 節複製或從vRNA M段轉錄。為了理解M-A14U置換在支援NS1缺失病毒的複製中的作用的分子基礎，檢查了用DelNS1-M-A14U病毒感染MDCK細胞期間病毒蛋白的表達。儘管病毒HA和NP蛋白的表達模式在WSN-WT和DelNS1-MA14U病毒感染中很大程度上相似(圖15A)，與WSN-WT病毒感染相比M-A14U DelNS1中M2表達無變化並且M1水準顯著降低。DelNS1-M-A14U與DelNS1-M-WT病毒之間病毒蛋白表達的比較也顯示A14U置換對M1和M2蛋白有作用但對HA和NP無作用(圖15B)。然而，M-A14U置換對M2蛋白表達的增強作用在具有完整NS1功能的WSN病毒中不明顯(圖15C)，提示M-A14U可能對於補償調節M mRNA的表達和剪接中的NS1功能的喪失必不可少。

M-A14U突變通過在病毒複製期間下調mRNA3提高M2 mRNA的表達。流感病毒感染期間，在M段轉錄時，發生差異剪接以產生四種轉錄物，其中M1和M2 mRNA分別表達M1和M2蛋白(圖15A)。mRNA3和mRNA4的功能未知。值得注意的是，A14U突變位於mRNA3剪接共有序列中，該序列覆蓋M mRNA的非編碼區的5’末端的核苷酸(nt)9-17。A14U置換可將mRNA3的剪接供體(SD)位點共有序列從CAG/GUA改變為CAG/GUU並影響mRNA3的產生。同樣，vRNA M段中的A14U置換可通過下調mRNA3表達以增加M2與M1 mRNA表達的比率來支援DelNS1病毒生長。

為了驗證該假設，使用qRT-PCR分析檢查病毒-感染細胞中的mRNA3水準。正如預期的，在四種M mRNA轉錄物之中，WSN-DelNS1-MA14U病毒-感染的MDCK細胞中M1、M2和M4顯著增加但mRNA3幾乎完全消除(圖16B)。相比之下，DelNS1病毒中NP mRNA的表達不受M-A14U置換影響(圖16B)，提示NS1的缺失與從M段表達的調節特異性相關。

進一步地，用表達全長M mRNA的M-A14U或M-WT段質粒轉染HEK293T細胞。儘管對於M-WT和M-A14U質粒M1 mRNA的水準相似，但來自M-A14U質粒的mRNA3的表達顯著下調並且M2 mRNA的表達顯著上調(圖16C)。NS1的共表達進一步證明了NS1對M mRNA轉錄的正面作用；A14U置換可在DelNS1病毒中出現以補償NS1-相關的M mRNA表達的增強。M-A14U置換在支援從A/PR/8/34毒株衍生的DelNS1病毒的複製中具有相似的作用(圖12G和13C)。檢查來自PR8-DelNS1-M-A14U病毒-感染細胞的差異剪接的M轉錄物發現與用WSN-DelNS1-MA14U所觀察到的那些相似的模式(圖16D)，這支持該核苷酸在WSN和PR8兩種毒株中的功能保守性。因此，vRNA M段中的M-A14U置換改變病毒感染期間，甚至在缺乏其它病毒蛋白時，M1 mRNA的剪接模式。

M-A14U突變導致增加的M2 mRNA與M1 mRNA的比率

為了進一步探究NS1表達缺乏時M-A14U對病毒複 製的作用的潛在分子機制，製造下調mRNA3表達的突變體。M-G12C-CM13突變體病毒顯著下調mRNA3的表達。同樣，mRNA3的表達在WSN-MA14U、WSN-M-A14G和WSN-MG12C-CM13病毒感染中減少(圖17A)。然而，生長動力學分析顯示該病毒的複製減弱，WSN-DelNS1-M-G12CCM13病毒不能被有效拯救(圖17B)，提示mRNA3的下調可能不與病毒生長直接相關。M1基質蛋白牽涉vRNA核輸出，而M2具有離子通道功能並且牽涉流感病毒複製期間的病毒脫殼和出芽過程。通過調節M1 mRNA的選擇性剪接病毒複製進程期間可能存在M1與M2的表達的協調，並且NS1可能也在其中發揮作用。DelNS1病毒感染中M1與M2的比率可能改變，如上文所見(圖15和16)。據報導M2在病毒感染的早些時候選擇性表達，提示M2在病毒複製早期中的關鍵作用。除了在病毒脫殼和出牙過程中的作用外，據報導M2還與自噬體和炎症小體相互作用，提示其在病毒複製期間發揮其它作用。在缺乏具有多種功能以對抗宿主抗病毒活性的NS1時，DelNS1病毒可經適應優先表達M2以試圖維持病毒複製的最佳平衡。

為了理解M-A14U對M轉錄物差異剪接的調節的作用，測定了病毒-感染細胞中M2 mRNA與M1 mRNA的比率。比較用WSN-M-A14U、WSN-DelNS1-M-WT、WSNDelNS1-M-A14U和WT WSN病毒感染的細胞中的M2/M1比率。WSN-DelNS1-M-A14U-感染細胞中的 M2/M1剪接效率比WSN-DelNS1-M-WT-感染細胞中高約6倍(圖17C)。然而，WSN-WT與WSN-M-A14U M2/M1比率之間的比較揭示儘管A14U置換上調M2，但該作用不如在WSN-DelNS1病毒之間所見到的顯著(差異小於2倍)(圖17C)。在WSN-WT-M-A14U和WSNDelNS1-M-A14U病毒感染二者中mRNA3的表達減少並且M4 mRNA下調(圖17D和E)。

為了進一步檢驗mRNA3對病毒生長的作用，從質粒表達mRNA3，但未觀察到對病毒滴度的負面作用(圖17F)，這提示對於mRNA3表達的選擇性剪接可能是專為調節M1和M2 mRNA的水準。這些結果支持M-A14U突變導致增加的用於產生M2，並且可能也產生M1，mRNA的選擇性剪接以增強NS1表達缺乏時的病毒複製這一假設。

M-A14U突變增強M2 mRNA的選擇性剪接和M vRNA的合成

先前的研究已經提示M段mRNA的剪接可受病毒RNP複合體連同宿主因數SF2或NS1調節。這些機制可能與M-A14U置換有關。M-A14U置換影響M1 mRNA的剪接效率並且該性質為補償NS1表達的缺乏所需。在其中NS1牽涉病毒複製期間M轉錄物剪接為M2 mRNA的調節的機制中，看起來很有可能DelNS1病毒可被迫在通常與NS1相關的vRNA M段的啟動子區域處的調節元件 中獲得適應性置換以補償NS1功能的缺乏。

為了檢驗該假設，在DelNS1-M-WT病毒-感染細胞中檢查了恢復NS1表達對M2/M1比率的作用。用病毒感染之前24h將遞增量的NS1表達載體轉染入HEK293T細胞，通過定量RT-PCT評估M1和M2病毒mRNA的表達。DelNS1-M-WT病毒-感染細胞中M2剪接形式的量隨NS1表達水準增加而增加(圖18A)。使用表達M段的mRNA和vRNA二者的質粒，觀察到甚至在缺乏其它病毒蛋白時，所有在14位處具有置換的質粒表達比M-WT更高水準的M2蛋白，而非M1，這表明M-A14U與M2剪接形式的上調相關(圖18B)。NS1質粒M的共轉染顯著增強M1從所有這些質粒的表達，並且對於在第14位處或在第12位處具有置換以下調mRNA3的質粒(G12C-CM13)M2水準更顯著上調(圖17A和18B)。該結果強烈提示NS1可通過下調用於mRNA3的選擇性剪接位點發揮功能以允許優先表達M1和M2，而該剪接位點的置換允許將M1有效加工為M2剪接形式。

A14U置換發生在M vRNA段(cRNA的5’或5’mRNA)的3’非編碼區，該區域也是用於病毒基因組複製的啟動子區。該突變可能影響病毒聚合酶複合體的結合以增強vRNA從M段合成，在病毒複製期間產生更多的M1 mRNA用於剪接為M2 mRNA。檢驗了用在14位包含變異和具有完整NS1基因的突變體病毒感染的細胞中的M vRNA合成水準。從WSN-M-A14U突變體產生的M vRNA 的水準比WSN-WT病毒高大約15倍(圖18C)。相比之下，對於WSN-M-A14G突變體觀察到與WSN-WT病毒-感染細胞相比相對更低的M vRNA水準(圖18C)。

檢驗了提高的M vRNA產生是否與DelNS1-MA14U病毒感染相關。M vRNA的水準在WSN-DelNS1-M-A14U中與在WSNDelNS1-M-WT病毒感染中相比顯著更高，而對於NP vRNA未觀察到相似的傾向(圖18D)。因此，M-A14U正面影響M vRNA合成並且該作用可能對於NS1-缺陷病毒的複製是必需的。

流感病毒利用病毒聚合酶複合體和宿主機構在核中轉錄和複製病毒基因組。用於從轉錄轉換為複製和vRNA從核輸出至細胞質的病毒產物的表達的協調對最佳複製效率至關重要。病毒蛋白M1和NEP(NS2)牽涉vRNP的核輸出。M2為一種結構蛋白並且牽涉輸入早期期間的病毒脫殼過程和病毒感染晚期中的病毒體出芽。M1/M2和NS1/NS2(NEP)病毒蛋白分別通過來自M和NS段的選擇性剪接的mRNA表達。儘管來自M或NS段的蛋白不直接牽涉入病毒聚合酶複合體中，但有提示病毒複製可通過調節M1/M2和NS1/NEP(NS2)mRNA的選擇性剪接調節。儘管流感病毒利用病毒聚合酶複製並利用帽搶奪(cap-snatching)機制轉錄病毒基因組，但認為對於mRNA剪接病毒依賴於宿主機構。剪接的NS和M mRNA的表達受到高度調節。發現NS1通過與CPSF相互作用抑制宿主前體mRNA剪接並且還可對病毒mRNA具有相同 作用。

先前的研究顯示病毒和宿主機制二者均牽涉M mRNA的差異剪接的調節。由於M1和M2蛋白具有病毒感染的不同階段，例如RNP核輸出、病毒組裝和出芽過程所需的基本功能，控制M1和M2表達的時間以優化病毒基因組複製的效率對病毒感染至關重要。vRNA M段的3’NCR含有25個核苷酸，其包含用於轉錄起始的啟動子和用於mRNA的轉錄後加工的選擇性剪接位點(圖16A)。病毒聚合酶複合體可結合到NCR啟動子區以封閉用於mRNA3表達的剪接位點，導致替代地利用另一個用於M2 mRNA的剪接位點。另一個研究發現在病毒複製中NS1蛋白調節M2的積累。然而，在用DelNS1病毒感染的Vero細胞中未觀察到NS1對M2積累的調節作用。

通過構建從A/WSN/33流感病毒毒株衍生的NS1缺失病毒研究了NS1蛋白在病毒複製中的作用。幾次傳代後DelNS1病毒中出現M段的非編碼區中的A14U置換。在細胞中DelNS1-M-A14U病毒能夠複製至與野生型病毒大致相似的水準，表明了NS1蛋白與M vRNA轉錄或複製之間的功能連接。從M vRNA表達四種mNRA，M1、M2、mRNA3和M4。DelNS1-M-A14U病毒表達升高水準的從M1 mRNA剪接的M2，同時抑制mRNA3的表達，這將NS1的作用與M轉錄物的選擇性剪接的調節相聯繫。A14U對M mRNA的選擇性剪接的作用的證據來自在缺乏其它病毒蛋白時進行的包含A14U和其它置換的M段的表 達分析。M-A14U段表達更高水準的M2蛋白，而M1的水準未改變(圖18B)，提示A14U置換有利於通過宿主剪接機構產生M2。

A14U恰好位於用於mRNA3表達的剪接供體位點內(圖16A)，並且似乎有可能該置換消除或影響剪接因數與該基序的結合，導致選擇鄰近的替代地產生M2 mRNA的剪接供體位點。該假設受到該位點的其它置換在缺乏其它病毒蛋白時也增強M2表達這一證據的支持(圖18B)。病毒感染之前用NS1-表達質粒轉染細胞對NS1表達的恢復顯著增加DelNS1-M-WT病毒-感染細胞中的M2/M1 mRNA比率，證實NS1直接牽涉M2 mRNA剪接的調節。

A14U置換可具有雙重作用，調節vRNA合成和mRNA剪接，這是因為與DelNS1-M-WT感染相比M vRNA的水準在DelNS1-M-A14U病毒感染中顯著增強，而對於NP vRNA未觀察到相似作用。因此，M vRNA3’啟動子區中A14U置換的複合作用將導致更高的病毒聚合酶複合體效率，產生更多的vRNA用於轉錄為mRNA，與mRNA3剪接位元點的封閉組合以允許M2 mRNA表達。儘管NS1蛋白不被認為是病毒複製的基本元件，但其作為宿主抗病毒活性的拮抗物具有多重功能。

因此，對於缺乏NS1的病毒在細胞中複製，將需要對抗宿主抗病毒活性的替代的病毒元件。已經發現在流感病毒感染期間M2蛋白與炎症小體和自噬體相互作用。因此，對於處於其中缺乏NS1的條件下的病毒維持最佳複 製可能需要M2，因此為了該目的選擇A14U適應性突變體以驅動較高水準的M2表達。

由於病毒感染期間NS1干擾先天和適應性免疫應答二者並且為流感毒力決定因數，DelNS1病毒被認為是有希望的減弱活疫苗候選。動物實驗顯示缺乏NS1的減弱活疫苗可誘發更好的免疫應答。然而，NS1的缺失嚴重影響病毒複製，並且難以產生高滴度的減弱病毒用於疫苗應用。在本領域先前的將NS1-缺陷病毒繁殖至高滴度的嘗試中，發現DelNS1病毒受限於在有限的系統中擴增，例如，在IFN-缺陷系統或在NS1-表達系統中。本發明證明M段的NCR中的A14U置換足以支援DelNS1病毒在MDCK和Vero細胞二者中複製至接近野生型病毒的水準。A14U置換在A/WSN/33和A/PR/8/34毒株中對DelNS1病毒複製的作用可外推至其它流感病毒毒株和亞型。

實施例9-DelNS1疫苗保護小鼠免於野生型病毒的致死劑量攻擊

接種H7N9 DelNS1疫苗對小鼠無有害作用並且提供對野生型H7N9病毒的致死劑量攻擊的全面保護。接種H1N1 DelNS1疫苗對小鼠無有害作用並且在輕微延遲反應之後提供對野生型H7N9病毒的致死劑量攻擊的保護，表明DelNS1疫苗提供對異-亞型病毒感染的交叉保護。儘管裂解H7N9疫苗能夠保護小鼠免於致死攻擊，但該保護作 用小於用H7N9或H1N1 DelNS1疫苗。

本發明提供一種簡單和可靠的經由在病毒內部基因之一中引入置換生產任何亞型的甲型流感病毒的無毒毒株的方法。僅以內部基因段之一中的簡單修飾，NS1-缺失病毒即可容易地拯救並繁殖至高滴度，與野生型病毒相當。在本發明所提供的方法中，DelNS1病毒可不使用輔助病毒而容易地從普通細胞系拯救並且病毒可在細胞或卵中繁殖至相對高的滴度。編碼病毒基質膜蛋白的基因組M段中的單一核苷酸置換對相應NS1缺失病毒經由反向遺傳學的高拯救效率已經足夠。由於其在Vero細胞或卵中容易繁殖和已很好地表徵的安全性質，該NS1-del流感病毒疫苗系統具有其它潛在的應用。除了用作甲型流感病毒的多種亞型，包括未來的大流行毒株的減弱活疫苗之外，DelNS1流感病毒疫苗可用於製造預防當前仍無疫苗的其它呼吸道病毒劑的疫苗。從NS1缺失所產生的空間可插入來自其它病毒例如MERS冠狀病毒或EBOLA的另一個基因段以誘發細胞-介導的免疫來對抗這些病原體感染。

應理解的是本文所述的實施例和實施方案僅為了說明目的並且根據此將為本領域技術人員提示多種修飾或變化，這些修飾和變化包含在本申請的精神和範圍內。另外，本文所公開的任何發明或其實施方案的任何元素或限制可以與任何和/或所有其它元素或限制(單獨或任意組合)或本文所公開的任何其它發明或其實施方案組合，並且所有這些組合考慮在本發明的範圍內而不對其進行限制。

<110> 香港商港大科橋有限公司(Versitech Limited)

<120> 用於流感病毒的減弱活疫苗

<140> TW 105111505

<141> 2016-04-13

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<170> PatentIn版本3.3

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Claims (3)

1. 一種減弱流感病毒，其包含：含有以下的遺傳上修飾的病毒基因組：非結構(NS1)編碼段中的中斷，該中斷為導致敲除所編碼的NS1蛋白之缺失；和基質膜蛋白編碼段的鹼基置換，其中所述鹼基置換為相對於野生型H7N9 Zhejiang毒株之基質膜蛋白編碼段的核苷酸序列之G917A置換，其中所述減弱流感病毒為減弱甲型流感病毒毒株H7N9。
2. 一種疫苗配方，其包含：如請求項1的減弱流感病毒；和生理學上可接受的載體。
3. 一種用於產生如請求項1的減弱流感病毒的方法，所述方法包括：將中斷的流感病毒NS1基因編碼序列引入細胞或卵中，其中該中斷的該流感病毒NS1基因編碼序列為導致敲除所編碼的NS1蛋白之缺失；將流感病毒的基質膜蛋白編碼序列引入細胞或卵中，其中所述基質膜蛋白編碼序列包含相對於野生型H7N9 Zhejiang毒株之基質膜蛋白編碼段的核苷酸序列之G917A置換並且其中所述細胞或卵包含產生流感病毒顆粒所需的其餘流感病毒基因段和病毒蛋白；和培養該細胞或卵，在其中減弱流感病毒被複製， 其中所述減弱流感病毒為減弱甲型流感病毒毒株H7N9。

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