TWI791433B

TWI791433B - 治療ａ型血友病之基因治療

Info

Publication number: TWI791433B
Application number: TW106112302A
Authority: TW
Inventors: 利利王; 詹姆士Ｍ威爾森; 珍妮艾格妮絲史德尼
Original assignee: 賓州大學委員會
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2017-04-13
Publication date: 2023-02-11
Also published as: PE20250736A1; RU2018136611A; SA518400233B1; MX2018012537A; US11779656B2; EP3452102A1; KR20190032274A; KR102450833B1; AU2017248659A1; BR112018071200A2; IL262215A; AU2017248659B2; US20190343966A1; CN109562191A; US10888628B2; US20240000974A1; JP7347933B2; TW201741458A; JP2019513794A; RU2762257C2

Abstract

提供有用於治療A型血友病之組成物及療法。該組成物包括重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)，該重組腺相關病毒具驅動人類因子VIII表現之轉甲狀腺素蛋白增強子及啟動子。

Description

治療A型血友病之基因治療

本案主張於2016年4月15日申請之US臨時專利申請案第62/323,336號、2016年5月4日申請之US臨時專利申請案第62/331,807號、及2016年12月1日申請之US臨時專利申請案第62/428,866號優先權。此等申請案以參考文獻完整併入本文。

1.前言

本申請案係關於有用於治療A型血友病之基因治療的具體實施例。

2.背景

A型血友病(HA或HemA)為最常見的遺傳性出血性疾病。依據美國疾病控制及預防中心，於5,000個新生兒中約有1例發生A型血友病。於美國有約20,000人患有A型血友病。A型血友病如同B型血友病常見，為B型血友病的四倍，一半以上的A型血友病患者具有血友病的嚴重型式。HA係由VIII因子(FVIII)缺乏引起，且非常適合於基因替代方法，主要係因為FVIII量的適度增加(>正常值的1%)可以改善嚴重的出血表型。腺相關病毒(Adeno-associated viral(AAV))載體目前顯示出對基因治療應用的最大指望，因為它們的優異安全性及從諸如肝臟的有絲分裂後組織中引導長期轉基因表現的能力。

然而，由於人FVIII(「hFVIII」)的不同分子和生物化學性質，AAV載體於HA基因治療的使用帶來新的挑戰。與其它大小相似的蛋白質相比，hFVIII的表現係效能非常差的。FVIII分子的生物工程造成FVIII表現之改善。例如，輔助因子活性所不需要的hFVIII B結構域(domain)已被刪除(BDD)，並由短的14個胺基酸連結物(FVIII SQ)代替，導致mRNA量較全長野生型FVIII增加17倍，且分泌的蛋白質增加30%。參見Ward,Natalie J.,et al. "Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression." Blood 117.3(2011)：798-807及U.S.專利No 9,393,323，亦公開為WO 2011/005968。重組FVIII-BDD-SQ於臨床上使用作為替換重組FVIII產品(Refacto,Wyeth Pharma；Xyntha,Pfizer)。

用於HA基因治療的AAV媒介的基因轉移之另一障礙是FVIII編碼序列的大小，其在7.0kb，遠遠超過AAV載體的正常包裝(packaging)能力。已經報導了大表現匣至AAV載體中的包裝，但此為高度不一致的方法，導致具有降低感染性之載體顆粒的低產量且需要可能誘發肝損傷的高劑量。參見例如Sarkar,R.,W.Xiao,and H.H.Kazazian. "A single adeno-associated virus(AAV)-murine factor VIII vector partially corrects the hemophilia A phenotype." Journal of Thrombosis and Haemostasis 1.2(2003)：220-226及McIntosh,Jenny,et al. "Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant." Blood 121.17(2013)：3335-3344。

如此，於HA治療需要更有效的AAV.FVIII載體。

3.摘述

本文描述之具體實施例係關於遞送正常人類FVIII至需要其之受試者用的AAV基因治療載體，於靜脈內投予此載體後造成長期，也許10年以上之出血性缺陷之臨床上有意義的校正。受試者患者族群為具有中度至重度A型血友病的患者。預期的載體劑量意旨在遞送約3-10%或5%的FVIII血液量。AAV載體治療之目標係嚴重A型血友病患者至中度或輕度A型血友病之轉換，如此使此種需要進行預防療程的患者得以緩解。

本文描述之基因治療產物為目前可用於嚴重A型血友病的處理之預防方法提供了多個重要的優點。首先，研究產品的前臨床結果與其達成正常量的10%或更多的因子VIII的循環量的潛力是一致的，該量於目標患者群體中為起改造作用的量。第二，該產品應導致有效而一致的因子VIII血液量，避免目前以外源因子的投予所見的波谷量。第三，藉由僅需要一個單一投予，於一段長時間，也許十年或更長時間，可減少頻繁的靜脈投予的要求。

此申請案提供複製缺陷腺相關病毒(AAV)遞送人類因子VIII(human Factor VIII(hFVIII或hF8))基因至診斷有A型血友病的病患(人類受試者)肝臟細胞之用途。用於遞送此hFVIII基因(「rAAV.hFVIII」)之此重組AAV載體(rAAV)應具有對於肝臟的向性(tropism)(例如，帶有AAVhu.37或AAVrh.10衣殼的rAAV)，且此hFVIII轉基因應受肝臟特異性表現控制組件(liver-specific expression control elements)控制。於一具體實施例中，此表現控制組件包括下列一或多個：轉甲狀腺素蛋白(transthyretin，enTTR)增強子；轉甲狀腺素蛋白(TTR)啟動子；及polyA訊號。於另一具體實施例，此表現控制組件包括下列一或多個：縮短的α1-微球蛋白/比庫蛋白前驅物(α1-microglogulin/bikunin precursor，ABPS)增強子，及enTTR；轉甲狀腺素蛋白(TTR)啟動子；及polyA訊號。於一具體實施例中，此表現控制組件包括下列一或多個：轉甲狀腺素蛋白增強子(enTTR)；alpha 1抗-胰蛋白酶(A1AT)啟動子；及polyA訊號。於另一具體實施例中，此表現控制組件包括下列一或多個：ABPS增強子、及enTTR；A1AT啟動子；及polyA訊號。本文中進一步說明此等組件。

於一具體實施例中，此hFVIII基因編碼因子VIII之B-結構域經刪除的(BDD)型，其中B-結構域經短的胺基酸連結物(FVIII-BDD-SQ，本文中亦稱為hFVIII) 替換。於一具體實施例中，此FVIII-BDD-SQ蛋白質序列示於SEQ ID NO：3。於一具體實施例中，此FVIII-BDD-SQ編碼序列示於SEQ ID NO：1。此hFVIII之編碼序列，於一具體實施例中，密碼子被最佳化以於人類中表現。對天然的hFVIII編碼序列(SEQ ID NO：1)，此種序列可分享少於80%之一致性。於一具體實施例中，此hFVIII編碼序列示於SEQ ID NO：2。

於另一態樣，本文提供者為一適於投予至A型血友病患者之水性懸浮液，其包括本文所述之rAAV。於一些具體實施例中，此懸浮液包括一水性懸浮液體及rAAV/mL之約1×10¹²至約1×10¹⁴個基因體拷貝數(GC)。此懸浮液，於一具體實施例中，係適合用於靜脈注射。於其它具體實施例中，此懸浮液進一步包括界面活性劑、防腐劑及/或緩衝液溶解於此水性懸浮液體。

於另一具體實施例中，本文所提供者為一種以如本文所述之rAAV治療具有A型血友病之患者之方法。於一具體實施例中，約1×10¹¹至約3×10¹³個基因體拷貝數(GC)之rAAV/患者體重kg於水性懸浮液中被遞送至患者。

治療之目標係經由基於rAAV的肝指向基因治療作為可行的途徑以功能性地替代患者缺陷的hFVIII，以治療該疾病並改善對目前療法的反應。本申請案中描述的具體實施例部分地基於允許有效劑量之安全遞送的治療組成物及方法的開發；及改善製造方法以符合於人類受試者中有效投劑的純化生產要求。

4.圖式簡單說明

圖1為pAAV.E03.P3.hF8co-SQ.PA75順式質體之示意圖。

圖2為pAAV.E12.P3.hF8co-SQ.PA75順式質體之示意圖。

圖3為pAAV.E03.P2.hF8co-SQ.PA75順式質體之示意圖。

圖4為pAAV.E12.P2.hF8co-SQ.PA75順式質體之示意圖。

圖5顯示於FVIII KO小鼠中抗體產生之前，hFVIII活性的變化。以10¹⁰GC之來自42增強子/啟動子組合之一者的AAVrh10載體表現hFVIIIco-SQ經IV投予FVIII KO小鼠。此增強子排列(表示為E01-E14，表1)之每一者與TBG-S1(來自各集團的左側區)、A1AT(中間區)及TTR(右側區)啟動子組合。hFVIII活性(A)及抗-hFVIII IgG力價(B)分別以COATEST試驗及抗-hFVIII IgG ELISA決定。載體投予後第2週於分離的小鼠血漿進行試驗。對於顯示的活性，小鼠以平均值±SEM個別繪製(n=10隻/組)。

圖6顯示於FVIII KO小鼠中IV投予載體後8週，hFVIII活性及抗-hFVIII抗體力價。FVIII KO小鼠以IV投予10¹⁰GC之由42增強子/啟動子組合之一者的表現hFVIIIco-SQ之AAVrh10載體。此增強子排列(表示為 E01-E14，表1)之每一者與TBG-S1(來自各集團的左側區)、A1AT(中間區)及TTR(右側區)啟動子組合。hFVIII活性(A)及抗-hFVIII IgG力價(B)分別以COATEST試驗及抗-hFVIII IgG ELISA決定。載體投予後第8週於分離的小鼠血漿進行試驗。對於顯示的活性，小鼠以平均值±SEM個別繪製(n=10隻/組)。

圖7顯示於FVIII KO小鼠中IV投予42增強子/啟動子組合載體一段時間後之hFVIII活性。FVIII KO小鼠以IV投予10¹⁰GC之由42增強子/啟動子組合之一者的表現hFVIIIco-SQ之AAVrh10載體。此增強子排列(表示為E01-E14，表1)之每一者與TBG-S1(來自各集團的左側區)、A1AT(中間區)及TTR(右側區)啟動子組合。hFVIII活性於載體投予後於小鼠分離的血漿以COATEST試驗雙週測定。小鼠以平均值±SEM個別繪製(n=10隻/組)。

圖8顯示於FVIII KO小鼠中IV投予42增強子/啟動子組合載體一段時間後之抗-hFVIII抗體力價。FVIII KO小鼠以IV投予10¹⁰GC之由42增強子/啟動子組合之一者的表現hFVIIIco-SQ之AAVrh10載體。此增強子排列(表示為E01-E14，表1)之每一者與TBG-S1(來自各集團的左側區)、A1AT(中間區)及TTR(右側區)啟動子組合。抗-hFVIII IgG力價藉由抗-hFVIII IgG ELISA於分離的小鼠血漿雙週測定。小鼠被個別繪製(n=10隻/組)。

圖9提供hFVIII活性與抗-hFVIII抗體力價以多種載體衣殼於IV投予E06.TTR.hFVIIIco-SQ基因體之比較。FVIII KO小鼠以IV投予10¹⁰GC之來自E06.TTR 表現hFVIIIco-SQ的AAVrh10、AAV8、AAV9、AAVhu37、或AAVrh64R1載體。雙週收集血漿並分別以COATEST試驗及抗-hFVIII IgG ELISA測定hFVIII活性(A)及抗-hFVIII IgG力價(B)。對於顯示的活性，小鼠以平均值±SEM個別繪製(n=10隻/組)。

圖10提供於試驗的非人靈長類動物(NHP)研究中hFVIII的表現。(A)以3×10¹²GC/kg IV投予AAVrh10.ABP2.TBG-S1.hFVIIIco-SQ至兩隻雄性恒河獼猴(Rhesus macaques)。(B)以3×10¹²GC/kg IV投予AAVhu37.ABP2.TBG-S1.hFVIIIco-SQ至兩隻雄性食蟹獼猴(cynomolgus macaques)。獼猴每週或雙週採血以評估hFVIII表現及抗hFVIII轉基因的抗體的存在。hFVIII表現於血漿以ELISA(實線)測定且結果表示為平均值±SEM。抗-hFVIII IgG力價亦於血漿中以ELISA(虛線)測定。

圖11提供hFVIII於食蟹獼猴之表現。IV投予1.2×10¹³GC/kg之AAVrh10.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75、AAVrh10.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75、AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75、或AAVhu37.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75之一者至五隻雄性恒河獼猴。獼猴雙週採血以ELISA於血漿評估hFVIII表現且結果表示為平均值±SEM。

圖12顯示食蟹獼猴中抗-hFVIII抗體之產生。以1.2×10¹³GC/kg之AAVrh10.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75、AAVrh10.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75、AAVhu37.E03. TTR.hFVIIIco-SQ.PA75、或AAVhu37.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75之一者IV投予至五隻雄性恒河獼猴。獼猴雙週採血以評估抗hFVIII轉基因抗體之存在。抗-hFVIII IgG力價以ELISA於血漿評估。統計分析示於圖14。

圖13提供一種製造的圖解。

圖14提供圖12所示的抗-FVIII抗體之生產的時間事件分析。使用Log-rank(Mantel-Cox)試驗，於AAVrh.10及AAVhu.37之間可見統計學上顯著的差異。

圖15顯示藉由AAVrh10、AAV8、AAV3B及AAV5載體(第一載體注射)之rhCG表現量的比較。

圖16A-16D顯示於不同時間點之肝臟中rhCG載體DNA複製數(AAVrh10，圖16A；AAV8，圖16B；AAV3B，圖16C；AAV5，圖16D)。

圖17A-17B顯示以表現rhAFP之AAV3B(圖17A)或AAV5(圖17B)載體(第二載體注射)再投予後之rhAFP量。

圖18A-18B顯示肝臟中rhAFP載體基因體拷貝數(圖18A，AAV3B.TBG.rhAFP；圖18B，AAV5.TBG.rhAFP)。

圖19顯示獼猴中差別的AAV Nab反應。

圖20A-20B提供如6.3.8節所述之於IV注射表現hFVIIIco之AAVrh10增強子/啟動子載體，於小鼠之肝臟中肝臟載體GC(圖20A)或RNA轉錄量(圖20B)。

圖21提供如6.3.8節所述之IV注射表現hFVIIIco之AAVrh10增強子/啟動子載體之小鼠的肌肉(右腓腸肌)、右睪丸、胰臟、右腎臟、脾臟、右肺臟及心臟中hFVIIIRNA轉錄量。

圖22為一圖表顯示以3x10¹²GC/kg單一靜脈內注射AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA75後於食蟹獼猴(35個月)中長期安定表現之人類FVIII。

圖23為一圖表顯示圖22之獼猴中肝臟酵素量(ALT，U/mL，正方形；AST，U/mL，圓形)。

圖24為一圖表顯示對AAVhu.37衣殼反應之中和抗體(Nab)。

圖25為hFVIIIco序列(SEQ ID NO：2)相對於hFVIII天然的(SEQ ID NO：1)序列之比對。

5.詳細說明

本申請案所述之具體實施例係關於複製缺陷腺相關病毒(AAV)遞送人類因子VIII(hFVIII)基因至診斷為A型血友病(HA)病患肝臟細胞(人類受試者)之用途。用於遞送該hFVIII基因之重組AAV載體(rAAV)(「rAAV.hFVIII」)應具有對肝臟的向性(例如，帶有AAVhu.37或AAVrh.10衣殼之rAAV)，且該hFVIII轉基因應受肝臟特異性表現控制組件所控制。於一具體實施例中，該表現控制組件包括下列一或多個：轉甲狀腺素蛋白(TTR)增強子；轉甲狀腺素蛋白(TTR)啟動子；及polyA訊號。於本文中進一步描述此種組件。

如本文所使用，「AAVhu.37衣殼」係指具有GenBank編號：AAS99285，SEQ ID NO：17之胺基酸序列之hu.37，其藉由引用被併入本文。允許來自此編碼序列的一些變異，其可以包括與AAS99285及US 2015/0315612中所引用的胺基酸序列具有約99%同一性的序列(其藉由引用被併入)(即，自該引述序列少於約1%的變異)。因此，生產此衣殼之方法、編碼序列、及生產rAAV病毒載體之方法已被描述。參見例如，Gao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10),6081-6086(2003)及US 2015/0315612。

如本文所使用，「AAVrh10衣殼」係指具有GenBank編號：AAO88201，SEQ ID NO：18胺基酸序列之rh.10，其藉由引用被併入本文。允許來自此編碼序列的一些變異，其可以包括與AAO88201及US 2013/0045186A1中所引用的胺基酸序列具有約99%同一性的序列(其藉由引用被併入)(即，自該引述序列少於約1%的變異)，條件為保持用於親和性捕獲純化的配體結合位點的完整性，並且序列的變化基本上不改變用於離子交換樹脂純化的衣殼的pH範圍(如本文進一步討論)。因此，生產衣殼、編碼序列之方法、及生產rAAV病毒載體之方法已被描述。參見例如，Gao等人，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.100(10),6081-6086(2003)and US 2013/0045186A1。

本文所使用，「NAb力價」一詞係產生多少中和抗體(例如，抗-AAV Nab)之測量，其中抗體中和其目標抗原決定基(例如，AAV)的生理作用。抗-AAV NAb力價可被測量，如下所述，例如，Calcedo,R.等人，Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses.Journal of Infectious Diseases,2009.199(3)：p.381-390，其藉由引用被併入本文。

於胺基酸序列之上下文中「同一性百分比(%)」、「序列同一性」、「序列同一性百分比」、或「百分比一致的」一詞係指當對應排列比較時，兩序列中為相同的殘基。在蛋白質全長、多肽、約32個胺基酸、約330個胺基酸、或其胜肽片段或對應的核酸序列編碼序列器上可容易測定胺基酸序列百分比同一性。適合的胺基酸片段可為至少約8個胺基酸長度，且可為至多約700個胺基酸，一般而言，當於兩不同序列之間指「同一性」、「同源性」或「相似性」時，「同一性」、「同源性」或「相似性」係由「排列比對的(aligned)」序列來測定。「排列比對的」序列或「排列比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常包含缺失或額外的鹼基或胺基酸的校正。使用許多公開或市售Multiple Sequence Alignment Programs進行排列比對。序列排列比對程式可用於胺基酸序列，例如，「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及「Match-Box」程式。一般而言，此等程式之任一者皆於內定值下使用，儘管本項技術領域中具通常知識者可根據需要改變這些設定。或者，本項技術領域中具通常知識者可以利用提供至少由參考的算法及程式提供的同一性的程度或排列比對之另一算法或電腦程式。參見，例如，J.D.Thomson等人，Nucl.Acids.Res.,「A comprehensive comparison of multiple sequence alignments」,27(13)：2682-2690(1999)。

如本文所使用，「操縱連結」一詞係指表現控制序列與感興趣的基因及表現控制序列相連，該表現控制序列以反向或遠距離的作用來控制感興趣的基因。

「複製缺陷病毒」或「病毒載體」係指一重組、合成或人工病毒顆粒，其中含感興趣的基因之表現匣(expression cassette)被包裝於病毒衣殼或封套中，其亦包裝在病毒衣殼或封套中的任何病毒基因體序列皆為複製缺陷的；即，其無法產生後代病毒顆粒但保有感染目標細胞的能力。於一具體實施例中，此病毒載體之基因體不包括編碼複製所需酵素的基因(基因體可被工程處理為「無膽的(gutless)」-僅含與人工基因體增幅及包裝所需訊號側接的感興趣的轉基因)，但此等基因可能在生產過程中被提供。因此，它被認為於基因治療之使用為安全的，因為除非存在複製所需的病毒酵素，否則後代病毒顆粒的複製及感染無法發生。

應注意「一」或「一個」一詞係指一或以上。因此，「一」(或「一個」)、「一個或多個」和「至少一個」一詞在本文中可互換使用。

「包含」、「含有」、及「包括」一詞被解釋為包括但不是排他性的。「組成」、「構成」及其變化被單獨解釋，而不是包含在內。儘管在說明書中的各種具體實施例使用「包含」語言來呈現，但在其它情況下，相關具體實施例亦意圖用「由...組成」或「基本上由...組成」語言進行解釋和描述。

如本文所使用，除非另有說明，「約」一詞意指所給參考文獻之10%的變異性。

除非在本說明書中另有定義，否則本文中使用的技術及科學術語具有與本項技術領域中具通常知識者通常所了解及參考的公開文獻的相同意義，其提供了本項技術領域中具通常知識者對於本申請案所使用許多用語的一般指引。

5.1 基因治療載體

於一態樣，提供一帶有人類凝血因子8(hF8或hFVIII)基因之重組物腺相關病毒(rAAV)載體以用於基因治療。此rAAV.hFVIII載體應具有對肝臟的向性(例如，帶有AAVhu.37或AAVrh.10衣殼之rAAV)且該hFVIII轉基因應受肝臟特異性表現控制組件所控制。此載體被調配於適合輸注至人類患者之緩衝液/載劑中。此緩衝液/載劑應包括一防止rAAV黏至輸注管但不干擾活體內rAAV結合活性之成分。

5.1.1. rAAV.hFVIII載體 5.1.1.1. hFVIII序列

人凝血因子VIII產生為具有結構域結構A1-A2-B-A3-C1-C2之大的330-kDa醣蛋白，其中A和C結構域兩者皆具有內序列同源性(internal sequence homology)以及與因子V(FV)之A及C之約40%的序列同一性，其共享相同的結構域結構。B結構域，其構成38%之全部序列，對於促凝活性為非必要的。FVIII中B結構域被刪除(BDD)且經短14個胺基酸連結物(FVIII SQ) 取代者係於臨床上使用作為替換重組物FVIII產品，且已顯示導致全長野生型FVIII的mRNA量增加17倍，分泌蛋白質增加30%。參見，McIntosh等人，Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant,Blood,121(17)：3335-44(Feb 2013)and Ward et al,Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression,Blood,117(3)：798-807(Jan 2011)，其藉由引用被併入本文。

於一具體實施例中，此hFVIII基因編碼示於SEQ ID NO：3之hFVIII蛋白質，其為一FVIII，其中B結構域被刪除(BDD)且以短的14個胺基酸連結物(FVIII-BDD-SQ)取代。如此，於一具體實施例中，此hFVIII轉基因可包括，但不限於，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2提供之一或多個序列，其被提供於附上的序列表中，其藉由引用被併入本文。SEQ ID NO：1提供天然的人類FVIII-BDD-SQ之cDNA。SEQ ID NO：2提供人類FVIII-BDD-SQ之經工程處理的cDNA，其已被密碼子優化用於在人類中表達(有時於本文中稱為hFVIIIco-SQ或hFVIIIco-BDD-SQ)。應了解於一些具體實施例中，本文提及hFVIII可能係指天然或經密碼子優化序列之hFVIII-BDD-SQ。或者或另外，基於網絡或可商業上取得的電腦程式以及基於服務的公司可用於將胺基酸序列反向轉譯成核酸編碼序列，包括RNA及/或cDNA兩者。參見，例如，EMBOSS之backtranseq，www.ebi.ac.uk/Tools/st/； Gene Infinity(www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html)；ExPasy(www.cxpasy.org/tools/)。其意旨在包含編碼所述hFVIII多肽序列的所有核酸，包括已針對所欲目標受試者中表達之優化的核酸序列(例如藉由密碼子優化)。於一具體實施例中，此編碼hEVIII之核酸序列共享至少95%同一性，與SEQ ID NO：1之天然hFVIII編碼序列。於另一具體實施例中，此編碼hFVIII之核酸序列共享至少90、85、80、75、70或65%同一性，與SEQ ID NO：1之天然hFVIII編碼序列。於一具體實施例中，此編碼hFVIII之核酸序列共享約77%同一性，與SEQ ID NO：1之天然hFVIII編碼序列。於一具體實施例中，此編碼hFVIII之核酸序列為SEQ ID NO：2。於另一具體實施例中，此編碼hFVIII之核酸序列共享至少99%、97%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、或65%同一性，與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之hFVIII編碼序列。於另一具體實施例中，此編碼hFVIII之核酸序列為SEQ ID NO：19。於另一具體實施例中，此編碼hFVIII之核酸序列共享至少90、85、80、75、70、或65%同一性，與SEQ ID NO：19之hFVIII編碼序列。於又另一具體實施例中，此編碼hFVIII之核酸序列共享至少40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99%同一性，與SEQ ID NO： 1或SEQ ID NO：2之hFVIII編碼序列。於又另一具體實施例中，此編碼hFVIII之核酸序列共享至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99%同一性，與SEQ ID NO：19之hFVIII編碼序列。參見，Ward等人，Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression,Blood,117(3)：798-807(Jan 2011)，其藉由引用被併入本文，用於討論FVIII-SQ的各種變異體，包括密碼子優化的變異體。

密碼子優化的編碼區可以各種方法設計。此優化可以使用可線上使用的方法(例如，GeneArt)、公開的方法或提供密碼子優化服務的公司來執行該優化，例如，DNA2.0(Menlo Park,CA)。一種密碼子優化方法被描述，例如，於國際專利公開號No.WO 2015/012924，其藉由引用被併入本文。亦參見，例如，US專利公開號No.2014/0032186及US專利公開號No.2006/0136184。適當地，產物的開放讀碼框(open reading frame，ORF)的整個長度被修飾。然而，於一些具體實施例中，僅ORF之一片段被變更。藉由使用此等方法之一者，可以應用頻率於任何指定的多肽序列，且產生編碼多肽之密碼子優化的編碼區的核酸片段。

許多選項可用於進行密碼子的實際改變或用於合成如本文所述之設計的密碼子優化的編碼區。使用本項技術領域中具通常知識者熟知的標準及常規分子生物學操作可進行此種修飾或合成。於一方法中，藉由標準方法合成一系列長度為80-90個核苷酸及跨越所需序列長度之互補寡核苷酸對。合成此等寡核苷酸對，使得在退火(annealing)時它們形成80-90個鹼基對的雙股片段，其含有黏性末端，例如，合成該對中的各寡核苷酸以延伸超出與該對中的其它寡核苷酸互補的區域之3、4、5、6、7、8、9、10或更多個鹼基。每對寡核苷酸之單股末端設計為與另一對寡核苷酸的單股末端退火。使寡核苷酸對退火，然後將約5至6個此等雙股片段經由內聚單股末端(cohesive single stranded ends)一起退火，然後連接在一起並克隆到標準細菌克隆載體中，例如，可獲自Thermo Fisher Scientific Inc.之TOPO®載體。然後此構築體以標準方法定序。製備由連接在一起的80至90個鹼基對片段的5至6個片段組成的幾個構築體，即約500個鹼基對的片段，使得整個所欲序列於一系列質體構築體中表現。然後以適當的限制酶切割此等質體的插入物並連接一起以形成最終構築體。然後將最終的構築體克隆到標準細菌克隆載體中並定序。對本項技術領域中具通常知識者來說，另外的方法將為顯而易見的。此外，基因合成為商業上容易獲得的。

5.1.1.2. rAAV載體

因為hFVIII天生於肝臟中表現，使用顯示肝臟向性之AAV為冀望的。於一具體實施例中，此供應衣殼之AAV為AAVrh.37。於另一具體實施例中，此供應衣殼之AAV為AAVrh.10。然而，可使用具肝臟向性之多種rAAV載體之任一者。

於下列實施例所描述之一特定具體實施例，該基因治療載體為於轉甲狀腺素蛋白啟動子控制下表現hFVIII轉基因之AAVhu.37載體，稱為rAAVhu.37.TTR.hFVIII。外部AAV載體成分為一血清型hu.37，T=1，二十面體衣殼，由三種AAV病毒蛋白質VP1、VP2及VP3以比率1：1：10所構成之60個複製數。該衣殼含有一單股DNA rAAV載體基因體。

該rAAVhu.37.TTR.hFVIII基因體含有以兩個AAV反向末端重複(Inverted terminal repeats，ITRs)側接的hFVIII轉基因。該hFVIII轉基因包括增強子、啟動子、hFVIII編碼序列、及多腺苷酸化(polyA)訊號。此等控制序列為「操縱連結」至hFVIII基因序列。此表現匣可被工程處理至用於生產之病毒載體質體上。

ITRs是負責於載體生產過程中基因體之複製及包裝的遺傳組件，且為生成rAAV所需的唯一病毒順式(cis)組件。將表達匣包裝至AAV病毒顆粒中所需的最小序列為AAV 5'和3'ITR，其可為與衣殼具有相同的AAV來源，或不同AAV來源(產生AAV假型(pseudotype))。於一具體實施例中，使用來自AAV2的 ITR序列或其缺失型(△ITR)。然而，可選擇來自其它AAV來源。當ITR的來源為來自AAV2且AAV衣殼來自另一個AAV來源時，生成的載體可被稱為假型。典型地，AAV載體的表現匣包含AAV 5'ITR、hFVIII編碼序列及任何調節序列，以及AAV 3' ITR。然而，此等組件之其它構形可能為合適的。已經描述了稱為△ITR的5'ITR之縮短版，其中D序列及終端解析位點(terminal resolution site，trs)被刪除。於其它具體實施例中，使用全長AAV 5’及3’ITRs。於一具體實施例中，此5' ITR序列示於SEQ ID NO：11。於一具體實施例中，3' ITR序列示於SEQ ID NO：12。

由肝臟特異性啟動子驅動hFVIII編碼序列的表現。因為hFVIII轉基因之大小，使用相對較小尺寸的啟動子為所欲地。本文所述的說明性質體及載體使用甲狀腺素蛋白(TTR)(本文亦稱為P3)啟動子或其修飾形式。TTR啟動子序列示於SEQ ID NO：7。或者，可使用其它肝臟特異性啟動子，諸如甲狀腺素結合球蛋白(TBG)(本文中亦稱為P1)啟動子，或其縮短版，TBG-S1，其序列示於SEQ ID NO：8。另一適合的啟動子為α 1抗-胰蛋白酶(A1AT)，或其修飾版(本文中亦稱為P2)，示於SEQ ID NO：9。其它適合的啟動子包括人類白蛋白(Miyatake et al.,J.Virol.,71：512432(1997))，humAlb；及B型肝炎病毒核啟動子(Sandig等人，Gene Ther.,3：10029(1996))。參見，例如，The Liver Specific Gene Promoter Database,Cold Spring Harbor, rulai.schl.edu/LSPD，其經引用被併入。儘管不太希望，本文所述載體中可使用及利用其它啟動子，諸如病毒啟動子、組成型啟動子、可調節的啟動子[參見，例如，WO 2011/126808及WO 2013/04943]、或對生理暗示有反應的啟動子。

於一具體實施例中，此表現控制序列包括一或多個增強子。於一具體實施例中，包括轉甲狀腺素蛋白(enTTR)(來自轉甲狀腺素蛋白之100bp增強子序列)，其序列示於SEQ ID NO：5。參見Wu等人，Molecular Therapy,16(2)：280-289,Feb.2008，其藉由引用被併入。於另一具體實施例中，包括En34增強子(來自人類脂蛋白元(ap olipoprotein)肝控制區之34bp核增強子)，其示於SEQ ID NO：4。於又另一具體實施例，包括ABPS(來自α1-微球蛋白之100bp遠端的增強子/比庫蛋白前驅物[ABP]至42bp之縮短版)增強子。此種序列示於SEQ ID NO：6。於另一具體實施例中，存有多於一個增強子。此種組合可包括多於一個之本文所述任何增強子之一拷貝，及/或多於一型之增強子。於各種具體實施例中，以下列組合之一者存有增強子：

於一具體實施例中，增強子以下列順序組合：5’-EnTTR-ABPS-En34-啟動子-3’。於另一具體實施例中，增強子以下列順序組合：5’-啟動子-EnTTR-ABPS-En34-3’。於一具體實施例中，表現控制序列包括enTTR。於另一具體實施例中，表現控制序列包括兩拷貝之ABPS及1拷貝之enTTR。

除了啟動子，表現匣及/或載體可含有其它適當的轉錄啟始、終止、增強子序列、及有效的RNA處理訊號。此種序列包括拼接及多腺苷酸化(polyA)訊號；安定細胞質mRNA的序列；增強轉錄效力的序列(即，Kozak consensus sequence)；增進蛋白質安定性的序列；及當冀望時，增進編碼產物的分泌的序列。於一具體實施例中，多腺苷酸化(polyA)訊號被包括以調節hFVIII mRNA轉錄之終止。本文中有用的polyA訊號為人工polyA，其大小為約75bp(PA75)，示於SEQ ID NO：10。其它適合的polyA序列之例包括例如，牛生長荷爾蒙、SV40、兔β球蛋白、及TK polyA，於其它者中者。

於一具體實施例中，調節序列被選擇使得總rAAV載體基因體大小為約5至約5.5千鹼基。於另一具體實施例中，調節序列被選擇以使總rAAV載體大小為約5.1kb。於另一具體實施例中，調節序列被選擇以使總rAAV載體基因體大小為約5.2kb。於另一具體實施例中，總rAAV載體基因體大小為少於5kb。

於一具體實施例中，載體基因體為SEQ ID NO：13之nt 1至nt 5110。於一具體實施例中，載體基因體為SEQ ID NO：14之nt 1至nt 5194。於一具體實施例中，載體基因體為SEQ ID NO：15之nt 1至nt 5138。於另一具體實施例中，載體基因體為SEQ ID NO：16之nt 1至nt 5222。

5.1.2. rAAV.hFVIII調配物

於一具體實施例中，rAAV.hFVIII載體被提供於醫藥組成物中，其包含水性載劑、賦形劑、稀釋劑或緩衝液。於一具體實施例中，該緩衝液為PBS。於一特定具體實施例，rAAV.hFVIII調配物為含有有效量之rAAV.hFVIII載體懸浮於含0.001%Pluronic F-68於TMN200(200mM氯化鈉、1mM氯化鎂、20mM Tris，pH 8.0)的水溶液之懸浮液。然而，已知各種適合的溶液，包括該等包括緩衝鹽水、界面活性劑及生理上相容的鹽或鹽的混合物中的一種或多種的溶液，其被調節至等於約100mM氯化鈉(NaCl)至約250mM的離子強度之氯化鈉或調節至等效離子濃度之生理上相容的鹽。

例如，本文提供之懸浮液可含有NaCl及KCl兩者。pH可為於範圍6.5至8.5，或7至8.5，或7.5至8。適合的界面活性劑、或界面活性劑之組合，可選自：泊洛沙姆(Poloxamers)，即由以兩個聚氧乙烯(聚(氧化乙烯))之親水鏈位於兩側的聚氧丙烯(聚(氧化丙烯))的中心疏水鏈構成之非離子性三嵌段共聚物；SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯)；LABRASOL(聚氧基辛酸甘油酯)；聚氧基10油醯基醚；TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)，乙醇及聚乙二酶。於一具體實施例中，此調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常以字母「P」(由於泊洛沙姆)後面跟隨三個數字：前兩個數字×100得到聚氧丙烯核心之大約分子量，最後一個數字×10得到聚氧乙烯含量百分比。於一具體實施例中，選擇泊洛沙姆188。此界面活性劑可以懸浮劑之至多約0.0005%至約0.001%之量的範圍存在。於另一具體實施例中，載體被懸浮於含180mM氯化鈉、10mM磷酸鈉、0.001%泊洛沙姆188，pH 7.3的水溶液。

於一具體實施例中，此調配物係適合使用於人類受試者且經靜脈內投予。於一具體實施例中，此調配物係經由團式注射(bolus injection)由周圍靜脈遞送。於一具體實施例中，此調配物係經由輸注約10分鐘(±5分鐘)而由周圍靜脈遞送。於一具體實施例中，此調配物經由輸注約90分鐘(±10分鐘)而由周圍靜脈遞送。於另一具體實施例中，此調配物經由輸注約20分鐘(±5分鐘)而由周圍靜脈遞送。於另一具體實施例中，此調配物經由輸注約30分鐘(±5分鐘)而由周圍靜脈遞送。於另一具體實施例中，此調配物經由輸注約40分鐘(±5分鐘)而由周圍靜脈遞送。於另一具體實施例中，此調配物經由輸注約50分鐘(±5分鐘)而由周圍靜脈遞送。於另一具體實施例中，此調配物經由輸注約60分鐘(±5分鐘)而由15周圍靜脈遞送。於另一具體實施例中，此調配物經由輸注約70分鐘(±5分鐘)而由周圍靜脈遞送。於另一具體實施例中，此調配物經由輸注約80分鐘(±5分鐘)而由周圍靜脈遞送。然而，此時間可依需要或冀望而被調整。可使用任何適當的方法或路徑以遞送如本文所述之含AAV的組成物，且可選擇地，共同投予其它活性藥物或與本文所述的hFVIII之AAV調節的遞送結合之療法。投予途徑包括例如全身、口服、吸入、鼻內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內及其它非經口的投予途徑。

於一具體實施例中，此調配物可含有例如，每公斤患者體重約1.0×10¹¹基因體拷貝數(GC/kg)至約1×10¹⁴GC/kg，每公斤患者體重約5×10¹¹基因體拷貝數(GC/kg)至約3×10¹³GC/kg，或約1×10¹²至約1×10¹⁴GC/kg，如藉由oqPCR或微滴式數位PCR(digital droplet PCR(ddPCR))測量，如描述於例如，M.Lock et al,Hum Gene Ther Methods.2014 Apr；25(2)：115-25.doi：10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14，其藉由引用被併入。於一具體實施例中，rAAV.hFVIII調配物為一含有至少1×10¹³或以上之基因體拷貝數(GC)/mL之懸浮液，如藉由oqPCR或微滴式數位PCR(ddPCR)測量，如描述於例如，上述M.Lock等人。

為了保證空衣殼自投予至病患的AAV.hFVIII的投劑被移除，於載體純化製程期間將空衣殼自載體顆粒分離，例如，使用本文討論之方法。於一具體實施例中，含經包裝的基因體之載體顆粒自空衣殼純化，使用描述於2016年12月9日申請之國際專利申請案No.PCT/US2016/066013之方法，及2016年4月13日申請之US專利申請案No.62/322,055，標題為「對於AAVrh.10可量測的純化方法」，其藉由引用被併入本文。簡言之，兩步驟純化方案被描述，其選擇性地捕捉及自rAAV生產細胞培養物之澄清、濃縮的上清液中分離含基因組之rAAV載體顆粒。此製程利用於高鹽濃度下進行之親和性捕捉法隨後以陰離子交換樹脂法於高pH下進行，以提供rAAV載體顆粒，其實質上無rAAV中間物。於AAVhu.37系載體可使用相似的純化法。其它純化法被描述於例如，US專利申請案Nos.62/266,347、62/266,357、62/322,071、62/266,351、62/322,083、62/266,341、及62/322,098，其每一者藉由引用被併入。

儘管可利用任何常規的製造方法，本文所描述之方法(及於國際專利申請案號PCT/US2016/066013)得到載體製劑，其中50至70%間之該顆粒具有一個載體基因體，即50%至70%的完整顆粒。如此，對於1.6×10¹²GC/kg的示例性劑量，及總顆粒劑量將介於2.3×10¹²至 3×10¹²顆粒。於另一具體實施例中，建議的劑量是半對數更高，或5×10¹²GC/kg，且總顆粒劑量將為7.6×10¹²至1.1×10¹³顆粒之間。於一具體實施例中，此調配物之特徵為rAAV存料具有「空」對「完整」之比率為1以下，較佳為少於0.75，更佳為0.5，較佳少於0.3。

簡言之，於一具體實施例中，提供一種自AAV衣殼中間物分離AAV病毒顆粒之方法，其涉及：使包含重組物AAV病毒顆粒及AAV衣殼中間體之混合物作快速液相層析，其中AAV病毒顆粒及AAV中間體結合至於pH約10.0下平衡的陰離子交換樹脂且經歷鹽梯度同時監測析出液於約260和約280的紫外吸收，其中AAV完整衣殼從當A260/A280比率達到轉折點時被析出的餾分收集。

於一具體實施例中，此方法進一步包括(a)混合包含AAV病毒顆粒及AAV衣殼中間物之懸浮液與包含20mM至50mM Bis-Tris丙烷(BTP)且pH約10.0之緩衝液A；(b)裝填(a)之懸浮液至強陰離子交換樹脂管柱(c)以緩衝液1%B洗滌裝填的陰離子交換樹脂，其中緩衝液1%B包含具有10mM至40mM NaCl離子強度之鹽及BTP，具pH約10.0；(d)對裝填和洗滌的陰離子交換樹脂應用增加的鹽濃度梯度，其中鹽梯度相當於約10mM至約40mM NaCl；及(e)自於鹽濃度相當於至少70mM NaCl時獲得的洗滌液收集rAAV顆粒，而該rAAV顆粒為至少約90%純化自AAV中間物。於一具體實施例中，此藉由基因體拷貝測定。

於一具體實施例中，此中間物洗析自陰離子交換樹脂，當鹽濃度相當於大於約50mM NaCl。於更另一具體實施例，緩衝液A進一步與NaCl混合成最終濃度1M以便形成或製備緩衝液B。於又另一具體實施例，鹽梯度具有離子強度相當於10mM至約190mM NaCl。洗析梯度可為由1%緩衝液B至約19%緩衝液B。可選擇地，含陰離子交換樹脂的容器為單塊式管柱(monolith column)且於緩衝液A、緩衝液B、及鹽梯度為約60個管柱體積。

rAAV顆粒(包裝基因體)之存料或製品係「實質上無」AAV空衣殼(及其它中間物)，當存料中rAAV顆粒為至少約75%至約100%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少99%之rAAV於存料且「空衣殼」少於約1%、少於約5%、少於約10%、少於約15%之rAAV於存料或製品。

於另一具體實施例，rAAV顆粒之平均產量為至少約70%。此可藉由確定裝填到管柱上的混合物中的力價(基因體拷貝)和最終洗析中存在的量來計算。此外，此等可以基於q-PCR分析及/或SDS-PAGE技術來確定，例如本文所述之彼等技術或本領域已經描述之彼等技術。

例如，為了計算空及完整顆粒含量，對於裝填的GC顆粒繪製所選樣品(例如，其中顆粒之GC=#的#之碘克沙醇(iodixanol)梯度純化製劑)的VP3帶體積。所得到的線性方程式(y=mx+c)用於計算測試製品波峰的帶體積中的顆粒數。然後將每20μL裝填的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL得到顆粒與基因體拷貝數的比率(pt/GC)。Pt/mL-GC/mL給予空的pt/mL。空的pt/mL除以pt/mL及×100，得到空顆粒的百分比。

一般而言，本領域已知用於測定具有包裝基因體的空衣殼及AAV載體顆粒的方法。參見，例如，Grimm et al.,Gene Therapy(1999)6：1322-1330；Sommer et al.,Molec.Ther.(2003)7：122-128。為了測試變性衣殼，該方法包括使經過處理的AAV存料進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，由能夠分離三種衣殼蛋白的任何凝膠組成，例如含有緩衝液中3-8%Tris-乙酸鹽的梯度凝膠，然後運行凝膠直到樣品材料分離，並將凝膠吸漬(blotting)到尼龍或硝酸纖維素膜上，較佳為尼龍。然後使用抗-AAV衣殼抗體作為結合變性衣殼蛋白質之一次抗體，較佳為抗-AAV衣殼單株抗體，最佳為B1抗-AAV-2單株抗體(Wobus et al.,J.Virol.(2000)74：9281-9293)。然後使用二次抗體，其與一次抗體結合，並含有檢測與一次抗體結合的方法，更佳為含有與其共價結合的檢測分子的抗-IgG抗體，最佳為與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)共價連接的綿羊抗-小鼠IgG抗體。用於檢測結合的方法用於半定量測定一次和二次抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組。例如，對於SDS-PAGE，可以取出來自管柱濾份的樣品並在含有還原劑(例如DTT)的SDS-PAGE裝填緩衝液中加熱，並將衣殼蛋白質在預傾斜梯度聚醯胺凝膠(例如Novex)上解析。銀染色可使用SilverXpress(Invitrogen，CA)根據製造商的說明進行。在一具體實施例中，管柱濾份中的AAV載體基因體(vg)的濃度可以藉由定量即時PCR(Q-PCR)測量。將樣品稀釋並以DNase I(或另一種合適的核酸酶)消化以移除外源DNA。在核酸酶失活後，使用引子及對引子之間的DNA序列特異的TaqMan^TM螢光探針進一步稀釋和增幅樣品。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量每一樣品達到規定螢光量(閾值循環，Ct)所需的循環次數。使用與AAV載體中含有相同序列的質體DNA以產生Q-PCR反應中的標準曲線。從樣品獲得的循環閾值(Ct)值以藉由將其標準化為質體標準曲線的Ct值來確定載體基因體力價。亦可使用基於數位PCR的終點測定法。

於一態樣，本文提供了最佳化的q-PCR方法，其利用廣效絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K(例如可自Qiagen商購獲得)。更具體而言，最佳化的qPCR基因體力價測定與標準測定相似，只是除了在DNase I消化後，將樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，隨後經熱失活。適當地，樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋，其量等於樣品量。蛋白酶K緩衝液可以濃縮至2倍以上。通常，蛋白酶K處理為約0.2mg/mL，但可由0.1mg/mL至約1mg/mL變化。處理步驟通常在約55℃下進行約15分鐘，但可於較低溫度(例如約37℃至約50℃)下進行較長時間(例如，約20分鐘至約30分鐘)，或於較高溫度(例如，高達約60℃)，於較短的時間期間(例如約5至10分鐘)。相似地，熱失活通常在約95℃下約15分鐘，但溫度可能降低(例如約70至約90℃)並延長時間(例如約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如1000倍)，並如標準測定中所述進行TaqMan分析。

另外，或者可以使用微滴式數位PCR(ddPCR)。例如，已經描述了藉由ddPCR測定單股及自身互補的AAV載體基因體力價的方法。參見例如M.Lock等人，Hu Gene Therapy Methods，Hum Gene Ther Methods；2014年4月；25(2)：115-25。doi：10.1089/hgtb.2013.131。Epub 2014年2月14日。

5.1.3 製造

可以如圖13所示的流程圖所示製造rAAV.hFVIII載體。簡而言之，細胞(例如HEK 293細胞)在合適的細胞培養系統中增殖並轉染用於產生載體。然後可以收取rAAV.hFVIII載體，濃縮並純化以製備主體載體(bulk vector)，然後在下游製程中填充及完成。

製造本文所述的基因治療載體的方法包括本領域熟知之方法，例如用於產生基因治療載體的質體DNA之生產、載體之生產、及載體之純化。在一些具體實施例中，基因治療載體為AAV載體，且所產生的質體係編碼AAV基因體及感興趣基因的AAV順式質體、含有AAV rep和cap基因的AAV反式質體、及腺病毒輔助質體。載體生產過程可以包括方法步驟，例如細胞培養的開始、細胞繼代、細胞的接種、以質體DNA之轉染細胞、將轉染後的培養基更換為無血清培養基、以及含有載體的細胞的收取及培養基。收取的含載體的細胞及培養基在本文中稱為粗細胞收取。

粗細胞收穫物之後可為有關方法步驟，例如載體收穫物的濃縮、載體收穫物的滲濾、載體收穫物的微流化、載體收穫物的核酸酶消化、微流化中間體的過濾、色層法的純化、藉由超速離心的純化、藉由切向流過濾進行緩衝液交換、製備及過濾以製備主體載體。

於一具體實施例中，生產質體為示於SEQ ID NO：13者。於一具體實施例中，生產質體為示於SEQ ID NO：14者。於一具體實施例中，生產質體為示於SEQ ID NO：15者。於另一具體實施例中，生產質體為示於SEQ ID NO：16者。

於一特定具體實施例，用於製造基因治療載體之方法被描述於下文第8節。

5.2 患者族群

基於數個原因而選擇重度或中度A型血友病(HemA)患者研究群。重度A型血友病患者被定義為具有少於1%之正常因子VIII(FVIII)活性如此須經常輸注FVIII以控制其易出血體質。這代表了正常生活的重大負擔，此外，FVIII的血液量通過眾所周知的峰谷模式，其為不理想的。嚴重患者的FVIII血液量低於1%的事實使得可以在施用rAAV.hVIII後，可以可靠地測量FVIII血液中血液量即使低至中等程度的增加。最近的臨床試驗證實了此方法的有效性。中度HemA患者定義為血液中FVIII量之1%至多5%。

為治療候選人的患者較佳是

18歲的成年男性，診斷為中度/重度或重度A型血友病。於一具體實施例中，患者具有基線FVIII活性

正常之2%或記錄的FVIII活性史

2%。於一些具體實施例中，可以治療<18歲的患者。治療候選人包括每年至少出現3次出血事件的受試者，需要以FVIII依需要進行治療。其它治療候選人包括以FVIII預防療程治療的受試者。證明該受試者適合治療的其它標準包括FVIII至少100天之暴露史；無暴露外源性FVIII的抑制劑(中和抗體)歷史之記錄；對外源FVIII或rAAV.FVIII載體組成物的任何組分無已知的過敏反應。

在治療之前，A型血友病患者應評估用於遞送hFVIII基因(例如AAVhu.37或AAVrh.10)的AAV血清型的NAb。此種NAb可以干擾轉導效率及降低治療效果。具有基線血清NAb力價

1：5的A型血友病患者是用rAAV.hFVIII基因治療方案來治療的良好候選者。

受試者可被允許在其照護醫師的判斷之前及基因治療治療之前同時繼續其照護治療之標準(例如，重組FVIII治療)。或者，在施用基因治療之前，醫生可能寧願選擇停止照護療法的標準，並且可選擇性地在施用基因治療後恢復照理治療標準作為輔助療法。

基因治療療程之期望終點係在治療治療給予後，FVIII活性從基線增加到正常的3%至多52週。於一具體實施例中，患者在以rAAV.hFVIII治療後，單獨及/或與輔助治療組合使用，達到期望的循環FVIII量(例如5%或更高)。於另一具體實施例中，以rAAV.hFVIII治療後，單獨及/或與輔助治療組合使用，患者達到循環FVIII量之10%、15%、20%或以上。於另一具體實施例中，在以rAAV.hFVIII治療後，單獨及/或與輔助治療組合使用，患者達到循環FVIII量之25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、95%、95%或以上。

然而，具有以下特徵中之一種或多種的患者可以由其照護醫師的判斷下排除在治療之外：

1.重大肝病史(即門靜脈高壓)。

2.顯著肝炎或肝硬化。

3.活性B型肝炎病毒(HBV)或C型肝炎病毒(HCV)感染的證據。

4.人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的病史及以下任何一種：CD4+細胞計數<350個細胞/mm³，在第0天之前6個月內或血漿病毒載量大於200個拷貝/ml的抗反轉錄病毒治療療程的變化，於2個不同的場合，藉由PCR測量。

5.抗AAVhu.37(或抗AAVrh10，視情況而定)中和抗體力價>1：5或

1：10。

6.參與(目前或之前)另一個基因治療研究。

7.在篩選前3個月內參與另一項調查性藥物研究。

在其它具體實施例中，照護醫師可確定此等生理特徵(醫療史)中的一種或多種的存在不應排除本文提供的治療。

5.3.投劑&投予路徑

於一具體實施例中，rAAV.hFVIII載體於每一患者中呈單劑被遞送。於另一具體實施例中，rAAV.hFVIII載體於每一患者中呈多劑被遞送。於另一具體實施例中，rAAV.hFVIII載體於每一患者中呈兩劑被遞送。於一具體實施例中，受試者以最小有效劑量(MED)(於本文實施例中所述的前臨床研究證實)被遞送。如本文所使用，MED係指所需達成正常因子VIII活性之5%的rAAV.hFVIII劑量。

如常規，載體力價係根據載體製劑的DNA含量來確定。於一個具體實施例中，使用如實施例所述的定量PCR或最佳化的定量PCR來測定rAAV.hFVIII載體製劑的DNA含量。於一具體實施例中，使用如實施例所述的微滴式數位PCR來測定rAAV.hFVIII載體製劑之DNA含量。於一具體實施例中，劑量為約1×10¹¹基因體拷貝數(GC)/kg體重至約1×10¹³GC/kg，包含終點。於一具體實施例中，劑量為5×10¹¹GC/kg。於另一具體實施例中，劑量為5×10¹²GC/kg。於特定具體實施例中，投予患者rAAV.hFVIII之劑量為至少5×10¹¹GC/kg、1×10¹²GC/kg、1.5×10¹²GC/kg、2.0×10¹²GC/kg、2.5×10¹²GC/kg、3.0×10¹²GC/kg、3.5×10¹²GC/kg、4.0×10¹²GC/kg、4.5×10¹²GC/kg、5.0×10¹²GC/kg、5.5×10¹²GC/kg、 6.0×10¹²GC/kg、6.5×10¹²GC/kg、7.0×10¹²GC/kg、或7.5×10¹²GC/kg。再者，複製缺陷病毒組成物可被調劑成劑量單位以含有複製缺陷病毒的量為約1.0×10⁹GC至約1.0×10¹⁵GC的範圍。如本文所使用，「劑量」一詞可指於治療過程中遞送給受試者的總劑量或在單次(多次)投予中遞送的量。

於另一具體實施例中，組合物將於之後再次被投予。可選擇地，允許多次重新投予。此種再次投予可以是與本文所述的相同類型的載體或不同的病毒載體。

於一具體實施例中，劑量足以將患者中的因子VIII量增加至正常的1%。於一具體實施例中，劑量足以將患者中的因子VIII量增加至正常的2%。於一具體實施例中，劑量足以將患者中的因子VIII量增加至正常的3%。於一具體實施例中，劑量足以將患者中的因子VIII量增加至正常的4%。於一具體實施例中，劑量足以將患者中的因子VIII量增加至正常的5%。於另一具體實施例中，劑量足以將患者中的因子VIII量增加至正常的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%或以上。

於一些具體實施例中，rAAV.hEVIII與一種或多種用於治療A型血友病的治療組合投予，諸如投予重組FVIII。

5.4.測量臨床目標

治療效果的測量可藉由血漿因子VIII量及因子VIII活性測定的轉基因表現及活性來測量。功效的進一步評估可藉由替代因子VIII要求和自發性出血發作頻率的臨床評估來確定。此種評估可以在產品投予4週後每週進行兩次，每週從第6週至第12週，在第一年的剩餘時間內每月進行一次，間隔6個月，共5年。

投予後的基因治療載體的安全性可藉由在藥物投予後至多約52週的多個時間點評估的不良事件的數量、身體檢查的變化及/或臨床實驗室參數進行評估。儘管可較早觀察到生理學效應，例如在約一週內，於一具體實施例中，穩定態水平的表現量達到約12週。於產品投予4週後，可以每週兩次，每週從第6週至第12週進行以下評估，在第一年的剩餘時間內每月進行一次，間隔時間為6個月，共5年。此種評估包括：

a.身體檢查

b.ECG

c.生物化學評估：血清電解質、BUN、肌酸酐、鈣、磷酸鹽、總蛋白質、白蛋白、LDH、CPK、AST、ALT、鹼性磷酸酶、膽紅素

d.血液學評估：CBC及差異的凝血概況

e.尿液分析

f.免疫學評估：

g.血清學對hu.37衣殼(或rh.10衣殼，視情況而定)及因子VIII的反應

h.T細胞對hu.37衣殼(或rh.10衣殼，視情況而定)及因子VIII抗原的反應

i.載體DNA之評估；血漿、尿液及唾液中的qPCR測量。

與沒有A型血友病的患者的hFVIII量相比，在約12週或其它期望的時間點，可以將藉由rAAV.hFVIII投予達到的hFVIII增加評估為定義的hFVIII的百分比變化，即所謂的約100%之正常hFVIII量。於另一具體實施例中，此變化係與患者的基線hFVIII量比較。於一具體實施例中，期望的功效係將患者中因子VIII量增加至正常的3%。於一具體實施例中，期望的功效係將患者中因子VIII量增加至正常的4%。於一具體實施例中，期望的功效係將患者中因子VIII量增加至正常的5%。於一具體實施例中，期望的功效係將患者中因子VIII量增加至正常的6%。於一具體實施例中，期望的功效係將患者中因子VIII量增加至正常的7%。於一具體實施例中，期望的功效係將患者中因子VIII量增加至正常的8%。於一具體實施例中，期望的功效係將患者中因子VIII量增加至正常的9%。於另一具體實施例中，劑量足以將患者中的因子VIII量增加至正常的10%。於另一具體實施例中，劑量足以將患者中的因子VIII量增加至正常的15%。於另一具體實施例中，劑量足以將患者中的因子VIII水平增加至正常的20%或更高。於一具體實施例中，凝血組作為推斷FVIII活性的標準測試的一部分進行。

如本文所使用，當患者表現足夠量的FVIII以到達此等臨床終點中的至少一個時，本文中的rAAV.hFVIII載體「功能性替代」或「功能性補充」患者缺陷的FVIII以活性FVIII。在非血友病患者中達到低至正常野生型臨床終點水平的約1%至小於100%的hFVIII的表現量可提供功能性替代。

於一具體實施例中，可以在投予後約8小時至約24小時早期觀察到表現。可以在投予後數天至數週內觀察到上述所欲臨床效果之一種或多種。

長期(長達260週)的安全性及功效可於rAAV.hFVIII投予後進行評估。

在一方面，提供將hFVIII基因產物遞送至人類患者的療法。該療法包括(a)遞送包含如本文所述表現匣的第一rAAV.hFVIII載體；及(b)遞送包含如本文所述表現匣的第二rAAV.hFVIII載體，其中第一重組AAV載體或第二AAV載體具有AAV3B衣殼。AAV3B之序列示於SEQ ID NO：29及目錄編號No.AAB95452.1。於一具體實施例中，第一或第二AAV載體之另一者具有rh.10衣殼。於另一具體實施例中，第一或第二AAV載體之另一者具有AAVhu.37衣殼。此種療法被述於國際專利申請案No.PCT/US16/42472，其藉由引用被併入。

本文所述之病毒載體可用於製備遞送hFVIII至需要的受試者(例如，人類患者)之醫藥，供給功能性hFVIII至受試者，及/或用於治療A型血友病。

於一具體實施例中，給予rAAV.hFVIII載體之第二次投予。於一具體實施例中，此第二次投予之rAAV.hFVIII載體具有相同於如第一次劑量提供的AAV衣殼。於一具體實施例中，該第二次投予之rAAV.hFVIII載體具有AAVrh.10衣殼。於另一具體實施例中，該第二次投予之rAAV.hFVIII載體具有不同於第一劑之載體的AAV衣殼。於一具體實施例中，第二次投予之rAAV.hFVIII載體具有對肝臟的向性。於一具體實施例中，第二次投予之rAAV.hFVIII載體具有AAV3B衣殼。

於另一方面，本發明涉及標定患者之肝細胞。

於一方面，第一rAAV及第二rAAV之遞送被暫時分開至少約一個月、至少約三個月、或約1年至約10年。

下列實施例僅為說明且無意用來限制本發明。

實施例 6.實施例1：前臨床試驗 6.1 hFVIII載體

不像人類因子FIX(hFIX)，hFVIII的cDNA係大的多且需要進行調整以使此轉基因適應標準的AAV基因體。由於B結構域缺失(BDD)hFVIII轉基因為1457個胺基酸，並且包含轉錄的其它必需元件，AAV載體仍然處於其包裝能力的極限。因此，已經採取步驟來減少包括轉基因表現控制組件在內的其它組件的大小。

為了將hFVIII的表現限制在肝臟，同時保持組件的大小盡可能小，數個強的肝特異性啟動子被縮短並組合，與多達三個肝特異性增強子序列的組合產生42個增強子/啟動子組合。於投予AAV載體後，在FVIII KO小鼠中評價轉基因的hFVIII活性和免疫原性。

6.1.1 前臨床試驗的AAV載體生產

生產含增強子/啟動子組合之一者的42個質體。使用三個增強子序列生產14個增強子組合；En34(來自人類脂蛋白元肝控制區之34bp核增強子)、ABPS(來自α1-微球蛋白/比庫蛋白前驅物[ABP]至42bp的100bp遠端增強子縮短版)、及EnTTR(來自轉甲狀腺素蛋白之100bp增強子序列)。增強子組合的數目受限，由於總ITR-ITR大小及增強子於下列序列之組合：5’-EnTTR-ABPS-En34-啟動子-3’。表1.14種增強子組合中的每一種都插入三個啟動子之一的上游；TBG-S1(P1，肝特異性甲狀腺素結合球蛋白或TBG啟動子的縮短版)，A1AT(P2，修飾的SERINA1[α 1-抗胰蛋白酶]啟動子)和TTR(P3，轉甲狀腺素蛋白啟動子)。將所得構築體設計為表現人類因子VIII蛋白的密碼子優化版本，其中B結構域被刪除且經短的14個胺基酸的連結子hFVIIIco-SQ(SEQ ID NO：2)代替。

如Gao G,Lu Y,Calcedo R,et al.Biology of AAV serotype vectors in liver-directed gene transfer to nonhuman primates.Mol Ther.2006；13(1)：77-87所述製造所有AAV載體，其藉由引用被併入。簡言之，將來自 42個增強子/啟動子組合之一的表現hFVIII的質體以AAVrh10病毒衣殼包裝。來自E06.TTR的表現hFVIII的質體也包裝在AAV8，AAV9，AAVhu37和AAVrh64R1病毒衣殼中。

6.1.2 載體之SDS-PAGE分析

研究中使用的AAVrh10增強子/啟動子組合載體批次歷經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行純度評估，如Lock M,Alvira M,Vandenberghe LH,et al.Rapid,simple,and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.Hum Gene Ther.2010；21(10)：1259-1271所述，其藉由引用併入本文。簡言之，含有5×10⁹GC的變性及還原載體樣品裝填於SDS-PAGE。使用Syngene成像分析系統及GeneTool軟體(Syngene，Frederick，MD)，將固定後的SYPRO紅寶石染色劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色蛋白質，顯色，然後定量。計算衣殼(VP1、VP2和VP3蛋白質表示總蛋白質)的純度百分比。42個載體的純度百分比範圍為29%(AAVrh10.E12.P3)至100%，平均純度為90%(資料未顯示)。

6.1.3 小鼠

FVIII KO小鼠的育種對獲自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME，USA)，並且在特定無病原體條件下，在賓夕法尼亞大學的轉譯研究實驗室保存了一個菌落。賓夕法尼亞大學的Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准了所有的動物程序及計劃書。IV注射到6-12週齡的雄性FVIII KO的到尾靜脈中，每隻小鼠用10¹⁰GC載體。將載體在磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)中稀釋，並注入100μl載體稀釋液。藉由後眼眶出血，每兩週將血漿收集到檸檬酸鈉收集管中。

6.1.4 hFVIII活性之測定

依據製造商手冊以COATEST SP4套組測量血漿中hFVIII活性(DiaPharma,OH,USA)。於注射後2週，小鼠顯示由0.12-2.12IU/ml之大範圍hFVIII活性(圖5)。

五種構築體證實顯著增加的活性程度超過其它者；E03.TTR、E05.A1AT、E05.TTR、E06.TTR及E12.A1AT(圖5A)。在第2週時觀察到的hFVIII活性程度的變化是在產生針對轉基因的抗體之前(圖5B)。因此，於活性程度上有構築體依賴性顯著差異。

6.1.5 小鼠血漿中抗-hFVIII IgG之偵測

以ELISA偵測小鼠血漿中抗hFVIII之IgG抗體，其中所有試劑來自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)，除非另有陳述。將ELISA板用0.1M碳酸鹽緩衝液(pH9.6)中的1μg/ml BDD-hFVIII-SQ(Xyntha，Wyeth Pharmaceuticals Inc.，Dallas，TX，USA)塗覆，並於4℃培育隔夜。將孔以PBS中的0.05%Tween 20洗滌5次，並以PBS中的5%脫脂乳(Bio Rad，Hercules，CA，USA)於室溫下封阻1小時。移除封阻緩衝液後，將稀釋在5% 脫脂乳中的血漿樣品加入板中並在室溫下培育1小時。使用來自初始小鼠的血漿樣品作為對照組。然後將板洗滌5次，並以1：1000稀釋加入HRP-綴合的抗小鼠IgG之脫脂乳中。室溫培育90分鐘後，將板洗滌8次，加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)進行檢測。使用2N硫酸在室溫下5分鐘後停止反應，並使用BioTek μQuant平盤讀數器(Winooski，VT，USA)於450nm讀取板。

FVIII KO小鼠在載體投予後第4週顯示hFVIII的抗體產生，並且在第8週時，42個載體組中的大部分小鼠具有可檢測的抗hFVIII IgG程度，hFVIII活性程度對應降低(圖6)。分別於圖7及圖8中呈現以力價定量的hFVIII活性及抗體產生的時間過程。注射了構築體E05.A1AT、E10.A1AT及以E06增強子組合的所有啟動子的50%以上的小鼠在第8週時具有對轉基因的抗體。然而，在所有組中都未見到針對轉基因的抗體。對於42個載體組中的6個(E11.TTR、E13.TBG-S1、E13.A1AT及使用E01的所有構築體)中的6個，於第8週沒有檢測到hFVIII抗體(圖6)，兩組在整個12週的研究期間沒有可檢測的抗體(E01.A1AT及E11.TTR)。亦進行了產生對hFVIII抗體之事件分析的時間。小鼠以使用表現用之E01.A1AT、E11.TTR、E01.TBG-S1、E11.A1AT及E13.TBG-S1的載體注射具有最長的抗體表現時間，而含有E06.TTR、E06.A1AT、E05.A1AT、E09.TBG-S1及E14.TTR的構築體具有最短的抗體表現時間。

6.1.6 統計分析

為了依據第2週血漿中的hFVIII活性來鑑定類似的治療組，使用具有Tukey事後檢驗的單一固定因子ANOVA模型分析數據，以鑑定彼此不同的組平均活性水平。對於產生針對hFVIII的抗體進行事件分析的時間。

6.1.9 藉由各種AAV衣殼比較活性及免疫原性

其次，確定活性程度的差異，查明使用的AAV衣殼對免疫原性的潛在貢獻。於本研究，選擇了先前研究中最具免疫原性的基因組-E06.TTR。有趣的是，該構築體在第2週時產生比其它大多數構築體顯著更高的表現，但是在接下來的幾週中，於80%的注射小鼠中產生抗hFVIII轉基因抗體。

以五個AAV衣殼：AAVrh10、AAV8、AAV9、AAVhu37及AAVrh64R1中的一個包裝使用將E06增強子與肝特異性TTR啟動子組合的相同的載體基因體。再次，FVIII KO小鼠以每隻小鼠10¹⁰GC的劑量IV注射，並且在整個12週研究中遵循血漿hFVIII活性水平及抗hFVIII IgG力價。基於用於基因轉移的AAV載體，觀察到轉基因的表現及免疫原性的全然不同的差異(圖9)。在投予載體後第2週，血漿中的hFVIII活性變化由AAVrh64R1投予後0.51IU/ml，至AAVrh10投予為1.26IU/ml(圖9A)。在研究期間，數隻小鼠產生的抗hFVIII抗體，其範圍為從AAV8或AAV9載體投予的小鼠的20%至接受AAVrh10的63%的小鼠(圖9B)。因此，即使以高度免疫原性的增強子及啟動子組合，對轉基因的免疫反應可基於用於基因轉移的AAV衣殼而變化。

6.1.10 討論

先前於使用HLP啟動子表現的FVIII KO小鼠中的研究在整個研究期間沒有檢測到轉基因的抗體。HLP啟動子序列與E01.A1AT增強子/啟動子組合類似，其中在該12週研究期間，投予該AAVrh10載體的小鼠中沒有檢測到的抗體。不幸地，來自FVIII KO小鼠的該載體的活性相對較低，在載體投予後第2週僅在血漿中可檢測到0.189IU/ml，在第6週時的峰值程度為0.303IU/ml。

有趣地，用於相同轉基因匣的基因轉移用AAV衣殼顯著影響hFVIIII的免疫原性和峰值hFVIII活性兩者。為了研究衣殼對抗-hFVIII抗體產生的影響，使用最具免疫力的轉基因匣(E06.TTR)。研究的五種載體衣殼可分為兩組：彼等係

20%的產生了抗-hFVIII抗體(AAV8和AAV9)的小鼠，及彼等係>20%的發展了體液免疫反應(AAVrh10、AAVhu37和AAVrh64R1)的小鼠。對與AAV8衣殼相關的hFVIII轉基因的耐受性或許是不令人驚訝的，因為先前的研究顯示，此衣殼之IV遞送可於肝的耐受致病性質的背景下活化轉基因特異性調節性T細胞。此外，吾人先前已經顯示，於B型血友病小鼠中IM注射AAV8後，沒有可檢測到的FIX抑制劑。因此，即使以高度免疫原性的增強子和啟動子組合，對轉基因的免疫反應可基於用於基因轉移的AAV衣殼而變化。

在投予五種不同的AAV衣殼後，血漿中的hFVIII活性程度亦於載體投予後的第2週時由以AAVrh64R1的0.51IU/ml顯著地變化到AAVrh10的1.26IU/ml。與AAV8相比，來自AAVrh10載體的表現顯著升高，與於63%的小鼠中抗-hFVIII抗體的產生一致。此種衣殼比較研究使用高度免疫原性的轉基因匣進行，且很可能不仿造於人類中所見~30%的A型血友病患者對重組蛋白產生抗體。因此，在投予AAVrh10載體後產生的較高表現程度可能更有利於臨床情況，該情況為需要較低劑量的載體以顯著改善出血事件的發生率並補充重組hFVIII蛋白質。

由本研究的結果，選擇E03.TTR(圖1；SEQ ID NO：13)、E03.A1AT(圖3；SEQ ID NO：15)、E12.TTR(圖2；SEQ ID NO：14)及E12.A1AT(圖4；SEQ ID NO：16)構築體進行進一步測試。

6.2 劑量研究 6.2.1 於FVIII KO小鼠的研究告知適當的MED

FVIII KO小鼠於C57BL/6及129背景接受尾靜脈注射AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75之四個載體劑量之一者。此種載體劑量為5×10¹⁰GC/kg、5×10¹¹GC/kg、5×10¹²GC/kg及5×10¹³GC/kg。包括僅接收對照物品(媒劑緩衝液)的動物組作為媒劑對照。於載體投予後，每日監測動物進行一般觀察。於適當的時間點從動物收集血液以捕獲hFVIII活性程度。於投劑後第60天犧牲子群A中的動物，於投予後第28天犧牲子群B 中的動物，並且在投劑後第3天犧牲子群C中的動物。於屍檢時亦收集血液用於血清化學組及血液學。犧牲的動物將被屍體剖檢；收取用於生物分佈及組織病理學檢查的器官，如右側腹股溝淋巴結、右睪丸、胰臟、十二指腸、結腸、腦、右腓腸肌、胃、右腎、右肺、脾臟、心臟、肝臟、及若有的話，剖檢病變(gloss lesions)。對於接受載體之最高劑量的小鼠和接受對照物的小鼠，提取總細胞DNA及RNA。對提取的DNA/RNA進行qPCR及RT-qPCR測定，分別測量器官中的載體基因體拷貝數及轉錄程度。藉由COATEST試驗，測試物的功效由血漿中的hFVIII蛋白質活性程度確定。再者，藉由抗-hFVIII IgG ELISA試驗再次監測抗-hFVIII抗體，並藉由凝血酶原時間(PT)試驗評估凝血的外在途徑。

6.3 於非人類靈長類中的研究 6.3.1 於NHP中的表現研究

此非GLP研究的主要目的係評估NHP中潛在的載體相關毒性及生物分佈。

使用雄性獼猴及食蟹獼猴於此研究。於此研究中僅使用雄性動物，由於A型血友病係一種X-連結的遺傳性疾病。所有獼猴具有NAb力價<1：5，在如前所述確定的研究開始時(CALCEDO et al.(2009)Worldwide epidemiology of neutralizing antibodies to adeno-associated viruses.J Infect Dis,199,381-90)。於投予前，用IM注射氯胺酮(ketamine)(10-15mg/kg)與右美托咪定(dexmedetomidine)(0.05-0.10mg/kg)的混合物麻醉獼猴。通過隱靜脈向獼猴IV投予載體。於研究開始前採集血液樣本，並經由靜脈穿刺股靜脈進行兩週。血液樣本的所有臨床病理檢查均由Antech Diagnostics(Irvine，CA)進行，包括完整的血細胞計數和差異、完整的臨床化學物質和凝血組。

進行了在NHP中表現hFVIII的試驗性研究。分別以3×10¹²GC/kg的AAVrh10(圖10A)和來自ABP2.TGB-S1增強子/啟動子組合的表現hFVIII的AAVhu37(圖10B)載體IV投予兩隻恒河獼猴和兩隻食蟹獼猴。在所有動物中觀察到高峰表現，但是係於6-8週期間觀察到。以AAVrh10注射的獼猴中觀察到hFVIII的體液免疫反應。於接受AAVhu37的一隻動物中，抗-hFVIII抗體的發展被延遲，在載體投予後12週發生，且在整個研究過程中另一隻動物沒有發展。接受AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA7的獼猴注射後追蹤35個月(圖22至24)。

基於FVIII KO小鼠研究及此小型試驗性恒河獼猴研究，選擇原始的42種增強子/啟動子組合的兩個用於進一步評估食蟹獼猴，使用兩種不同的分化體(Clade)E衣殼進行表現。

6.3.2 於NHP中的進一步研究

隨後以下列四種載體之一種投劑至20隻雄性食蟹獼猴：AAVrh10.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75、AAVrh10.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75、AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75、及 AAVhu37.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75(n=5隻獼猴，每種載體)。IV投予載體，以1.2×10¹³GC/kg劑量(基於中間oqPCR力價)。使用一種衣殼加增強子/啟動子組合，於載體投予後第2週觀察到正常FVIII水平的37%的峰值表現，然後在正常值的20%上平滑化(圖11)。儘管在第8週時在大多數獼猴中檢測到hFVIII的抗體，但在載體投予後第30週，兩隻動物中的抗體仍然不可檢測(圖12)。下文討論方法。產生的抗體藉由使用時間進行事件分析，確定AAVrh10和AAVhu37之間存在顯著差異(圖14)。

6.3.3NHP血漿中hFVIII表現之測定

藉由ELISA測量hFVIII表現，其中所有試劑均來自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)，除非另有說明。以0.1M碳酸鹽緩衝液(pH9.6)中1：500稀釋的抗-hFVIII IgG(Green Mountain Antibodies，VT，USA)塗覆ELISA板，並於4℃下培育隔夜。將孔以PBS中的0.1%Tween20洗滌四次，並以PBS中的5%無脂乳(Bio Rad，Hercules，CA，USA)在室溫下封阻1小時。移除封阻緩衝液後，將稀釋在5%脫脂乳中的血漿樣品加入板中並於室溫下培育1小時。然後將板洗滌四次，並以1：1000稀釋於無脂乳中加入抗-hFVIII IgG(ThermoFisher Scientific，MA，USA)。於室溫下培育1小時後，洗滌四次，並以1：1000稀釋加入HRP綴合的抗綿羊IgG於無脂乳中。於室溫下培育90分鐘後，將板洗滌5次，加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)進行檢測。使用2N硫酸在室溫下5分鐘後停止反應，並使用BioTek μQuant平盤讀數器(Winooski，VT，USA)於450nm讀取板(圖11)。

將在單次靜脈內注射AAVhu37.TBG-S1.hFV III-SQ.PA75後於食蟹獼猴(35個月)中人FVIII的長期穩定表現的結果示於圖22。結果顯示直到35個月剖檢為穩定表現。肝臟酵素檢測結果示於圖23。結果顯示肝臟酵素程度在正常範圍內，除了肝臟生檢後暫時升高外。對AAVhu.37衣殼的中和抗體(Nab)反應如圖24所示。

使用單一細胞技術檢測NHP M11269的肝細胞中的AAV載體DNA及RNA，如上所述，其以3E12 GC/kg靜脈內投予AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA75。評估單一細胞肝細胞存在AAV基因體及表現。載體後150週，藉由以膠原酶/蛋白酶之混合物灌注而自肝楔分離肝細胞。將單一細胞分選到96孔板的各個孔中。來自一個96孔板的細胞係藉由使用針對人FVIII的探針的數位PCR定量的細胞中的全基因體增幅(WGA)及AAV基因體。第二個96孔板係用於評估FVIII表現的全轉錄體增幅(WTA)。

結果如下表3所示。AAV基因體可在約25%的單一細胞評估中檢測到。僅於~4%或20%之收取DNA的細胞中檢測出RNA表現。RNA表現細胞可分層成低及高的兩種類型。不清楚為什麼大量的細胞吸收載體但無法表現轉基因。此等結果藉由CMC核進行的原位雜交研究證實(數據未顯示)。

6.3.4 於NHP血漿中抗-hFVIII IgG的偵測

如前所述，藉由ELISA測量NHP血漿中的抗hFVIII的IgG抗體，除了以1：2000稀釋加入HRP綴合的抗-NPP IgG以進行檢測(圖12)。

6.3.5 於NHP血漿中貝什斯達(Bethesda)力價的偵測

藉由Nijmegen修飾的貝什斯達試驗測定抗人FVIII的抑制性抗體(Giles et al.,1998)。一貝什斯達單位表示正常人類血漿之凝血活性之50%的抑制。

6.3.6 肝臟生檢

於載體投予5週後藉由微剖腹術自每組的兩個NHP進行肝臟生檢。動物的選擇基於在第4週的血漿中的hFVIII表現。選擇的第一種動物是具有中值hFVIII水平的動物，所選擇的第二種動物是具有最接近或第二最接近hFVIII水平的動物(若最接近者為中值者)達到平均水平。取肝組織樣本進行組織病理學、載體生物分佈及轉基因mRNA分析。於肝臟生檢後第3天，採血用於完整的血球計數及差異、完整的臨床化學物質及凝血組。

6.3.7 免疫抑制程序

在載體投予後，於hFVIII的可檢測抗體(貝什斯達單位>1)存在下，於hFVIII表現的能力喪失的需要的動物中，啟動免疫抑制程序。免疫抑制程序如前所述，以利妥昔單抗(rituximab)(250mg/m²，IV，每週4次，總共4次輸注)及環磷醯胺(300mg/m²，每15天緩慢靜脈內輸注，總共8個劑量，4個月)(Mcintosh et al.(2013)。單一外周靜脈投予編碼新穎的人類因子VIII變異體的rAAV載體之FVIII的治療程度(Blood,121,3335-44.)。

6.3.8 載體生物分布

來自C57BL/6J小鼠的組織樣品(腹股溝淋巴結、腰骶淋巴結、肌肉[右腓腸肌]、右睪丸、胰臟、右腎、脾臟、右肺臟、心臟及肝臟)於屍檢時迅速冷凍，使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)提取DNA。於提取的DNA中的載體基因體拷貝數(GC)及提取的RNA中的相對hFVIII轉錄物表現的檢測及定量，如前所述藉由即時PCR進行。簡言之，使用針對載體之hFVIII轉基因序列設計的引子/探針定量載體GC及RNA。於每隻小鼠(n=3隻/組)之一個肝臟樣品上進行來自肝臟之GC的定量。使用常規化至18S表現的每個樣品之△△CT來確定RNA相對轉錄物表現。

於18個AAVrh10增強子/啟動子載體的子集評估載體生物分佈。表現hFVIIIco IV的AAVrh10載體以每隻小鼠10¹¹GC的劑量投予於6至8週齡的C57BL/6J野生型小鼠。於載體投予14日後屍檢小鼠並收集肌肉(右腓腸肌)、右睪丸、胰臟、右腎、脾、右肺、心臟及肝臟。提取DNA及RNA，並使用針對載體的hFVIII轉基因序列設計的引子/探針來量化載體GC及RNA轉錄物量。於載體投予組中，肝臟載體GC(圖20A)或RNA轉錄物量(圖20B)無顯著差異，且於對照(PBS)投予組中無可檢測的GC或RNA。然而，無論增強子序列如何，使用的A1AT啟動子進行表現的載體的肝臟中，RNA轉錄量有較高的趨勢(圖20B)。於收集的其它組織，hFVIII RNA轉錄物量比肝臟平均低1000倍，但於投予E01.TBG-S1、E02.A1AT、E09.A1AT及E09.TTR後，C57BL/6J小鼠的肌肉及心臟中觀察到較高的肝外表現(圖21)。

6.4.載體之試驗

進行包括血清型鑑別、空粒子含量及轉基因產物鑑別的表徵試驗。所有試驗的描述呈現如下。

6.4.1 基因體拷貝(GC)力價

使用最佳化的定量PCR(oqPCR)分析法藉由與同族質體標準品比較來確定基因體拷貝力價。oqPCR分析法利用DNase I及蛋白酶K的接續消化，然後進行qPCR分析來測量經包覆的載體基因體拷貝。使用靶向PA75 polyA區域的序列特異性引子及與該相同區域雜交的螢光標記的探針組合來完成DNA偵測。與質體DNA標準曲線的比較能夠力價測定，不需要任何後PCR樣品操作。已於試驗中導入許多標準、驗證樣品及對照(用於背景及DNA污染)。藉由建立及定義試驗參數，包括靈敏度、偵測限度、定量範圍以及測定內及精確度之間的限定，已判定此試驗合格。建立一個內部AAVrh.10參考批次，並用於進行資格研究。

6.4.2 載體衣殼同一性：VP3之AAV衣殼質譜分析

藉由基於以質譜(MS)分析VP3衣殼蛋白質的胜肽的測定來確認載體的AAV2/hu.37或AAV2/rh.10血清型。此方法涉及由SDS-PAGE凝膠切割的VP3蛋白質條帶的多酶消化(胰蛋白酶、乳糜蛋白酶及內蛋白酶Glu-C)，隨後在Q-Exactive Orbitrap質譜儀上的UPLC-MS/MS上表徵以定序衣殼蛋白質。開發了串聯質譜(MS)方法，其允許鑑定某些污染蛋白質並能從質譜衍生胜肽序列。

6.4.3 空的對完全粒子比率

載體粒子分佈概況使用分析超離心(AUC)於分析超離心機中測得的沉降速度作為獲得關於大分子結構異質性、確認差異及締合狀態或聚集狀態資訊的優異方法。將樣品裝入細胞並以12000RPM在Beckman Coulter Proteomelab XL-I分析超速離心機中沉澱。每兩分鐘記錄折射率掃描進行3.3小時。數據藉由c(s)模型(Sedfit程式)進行分析，計算的沉降係數與常規化的c(s)值繪製。應觀察代表此單體載體的主峰。遷移慢於主要單體峰的峰之出現指出空/錯組裝的顆粒。空顆粒峰的沉降係數係使用空AAV8顆粒製劑建立。主要單體峰及先前峰的直接定量能夠確定空粒子對完全粒子的比率。

6.4.4 感染力價

感染單位(IU)試驗係用於確認於RC32細胞(表現HeLa細胞的rep2)中載體的生產性攝取及複製。簡言之，96孔板中的RC32細胞藉由連續稀釋的載體及均勻稀釋的Ad5共同感染，每次稀釋rAAV時重複12次。感染後72小時分解細胞，進行qPCR以偵測輸入時rAAV載體增幅。進行終點稀釋TCID50計算(Spearman-Karber)以確認呈IU/ml表示的複製力價。由於「感染性」值端視與細胞接觸的顆粒、受體結合、內化、轉運到細胞核及基因體複製而定，它們受到分析幾何學及所使用的細胞系中適當受體與後結合路徑的存在的影響。對AAV載體導入至關重要的受體及後結合途徑通常於永生化細胞系中被維持，如此感染性分析力價並非「感染性」顆粒數量存在的絕對測量度。然而，經衣殼化的GC與「感染單位」的比率(描述為GC/IU比)可被使用作為每批次的產品的一致性。

7.實施例2：治療人類受試者的程序

此實施例係關於由於凝血因子8(FVIII)基因突變引起的具有遺傳學證實的X連鎖的A型血友病患者的基因療法治療。於該實施例中，向患有A型血友病的患者施予基因治療載體AAVhu.37.hFVIII，表現hFVIII的複製缺陷型腺相關病毒載體hu.37(AAVhu.37)。使用FVIII量作為轉基因表現的替代物可用來評估治療功效。主要功效評估包括治療後約12週的FVIII量，其後持續至少1年。於肝生檢樣品中，可於治療後測量長期安全性及轉基因表現的持續性。

7.1.基因治療載體-AAV.hFVIII 7.1.1.AAVhu.37.hFVIII

AAVhu.37.hFVIII載體由AAV載體活性成分及調配物緩衝液組成。外部AAV載體組分為血清型hu.37，T=1個二十面體衣殼，由AAV病毒蛋白質VP1、VP2及VP3的60個拷貝組成，預測比例為1：1：10。衣殼含有單鏈DNA重組AAV(rAAV)載體基因體(圖1-圖4)。

此基因體含有以兩個AAV反向末端重複(ITRs)側接的人類因子VIII(FVIII)轉基因。增強子、啟動子、人類因子VIII(hFVIII)編碼序列、及多腺苷酸化(polyA)訊號包含刪除的B結構域、密碼子最佳化人類FVIII轉基因。ITR係負責基因體於載體生產過程中複製及包裝的遺傳組件，且為生產rAAV所需的唯一病毒順式組件。於一具體實施例中，人類FVIII編碼序列之表現係由轉甲狀腺素蛋白啟動子(SEQ ID NO：7)驅動。於另一具體實施例中，人類FVIII編碼序列之表現係由經修飾的A1AT啟動子(SEQ ID NO：9)驅動。該構築體包括至少一增強子組件以刺激啟動子活性。於一具體實施例中，包括enTTR增強子(SEQ ID NO：5)。於另一具體實施例中，ABP-S增強子(SEQ ID NO：6)之兩個拷貝進行此enTTR增強子(SEQ ID NO：5)之一個拷貝。包括約75nt的合成polyA訊號(SEQ ID NO：10)以媒介人類FVIII mRNA轉錄物的終止。

該載體係作為調配物緩衝液中之AAVhu.37.hFVIII載體的懸浮液而提供。於一個具體實施例中，該調配物緩衝液為TMN200中的0.001%Pluronic F-68(200mM氯化鈉、1mM氯化鎂、20mM Tris，pH8.0)。

於下節描述載體的製備及特性記述的詳細內容。

7.1.2. AAVrh.10.hFVIII

AAVrh.10.hFVIII載體由AAV載體活性成分及調配物緩衝液組成。外部AAV載體組分為血清型rh.10，T=1個二十面體衣殼，由60拷貝數之三種AAV病毒蛋白VP1、VP2及VP3組成，預測比例為1：1：10。衣殼含有單股DNA重組AAV(rAAV)載體基因體(圖1-圖4)。

基因體含有由兩個AAV反向末端重複(ITR)兩端側接的人類因子VIII(FVIII)轉基因。增強子、啟動子、人類因子VIII(hFVIII)編碼序列及多腺苷酸化(polyA)訊號包含B結構域缺失的密碼子最佳化的人類FVIII轉基因。ITR係負責基因體於載體生產過程中複製及包裝的遺傳組件，為生成rAAV所需的唯一病毒順式組件。於一具體實施例中，人類FVIII編碼序列的表現由轉甲狀腺素蛋白啟動子(SEQ ID NO：7)驅動。於另一具體實施例中，人類FVIII編碼序列的表現由修飾的A1AT啟動子(SEQ ID NO：9)驅動。該構築體包含至少一個刺激啟動子活性的增強子組件。於一具體實施例中，包括一enTTR增強子(SEQ ID NO：5)。於另一具體實施例中，ABP-S增強子(SEQ ID NO：6)的兩拷貝進行enTTR增強子(SEQ ID NO：5)的一拷貝。包括約75 nt之合成的 polyA訊號(SEQ ID NO：10)以調節人類FVIII mRNA轉錄物的終止。

該載體係作為調配物緩衝液中AAVrh.10.hFVIII載體的懸浮液而被提供。於一具體實施例中，調配物緩衝液係TMN200中的0.001%Pluronic F-68(200mM氯化鈉、1mM氯化鎂、20mM Tris，pH8.0)。

7.2.患者族群

有幾個原因選擇嚴重的A型血友病患者作為研究族群。嚴重的A型血友病患者被定義為具有小於正常因子VIII(FVIII)活性的1%，因此需要頻繁地輸注FVIII以控制其易出血體質。此代表了進行正常生活的重大負擔，此外，FVIII的血液水平經過了眾所周知的峰谷模式，此係不理想的。嚴重患者的FVIII血液水平低於1%的事實使得可以在AAV.hFVIII已被投予後，可以可靠地測量FVIII血液水平中甚至低至中等程度的增加。最近的臨床試驗證實了此種方法的有效性。

作為治療候選人的患者較佳為

正常的2%或經記錄的FVIII活性史

2%。於一些具體實施例中，可以治療<18歲的患者。治療候選人包括每年至少出現3次依需要進行以FVIII治療之出血事件的受試者。其它治療候選人包括以FVIII預防性療程治療的受試者。證明該受試者適合治療的其它標準包括FVIII至少100天的暴露史；沒有記錄到對外源性FVIII的抑制劑(中和抗體)的歷史；對外源性FIX或AAV.hFVIII的任何成分無已知的過敏反應。

治療的患者可以具有基線血清AAV.37或AAVrh10(適合所選的載體)中和抗體(Nab)力價

1：5。

可以允許受試者在其照護醫師的判斷下於基因治療之前及與基因治療同時繼續其照護治療標準(例如，替換FVIII)。或者，在施予基因治療之前，醫生可能較喜歡停止照護療法的標準，並且可選擇地於施予基因治療後恢復護理治療標準作為輔助療法。

7.3.投劑&投予路徑

患者接受經由周圍靜脈輸注投予的單次劑量的AAVrh.10.hFVIII或AAVhu.37.hFVIII。投予於患者的AAVrh.10.hFVIII或AAVhu.37.hFVIII的劑量為約5×10¹¹GC/kg或1.6×10¹²GC/kg或5×10¹²GC/kg或1×10¹³GC/kg。為了確保從投予患者的AAVrh.10.hFVIII或AAVhu.37.hFVIII的藥劑中移除空衣殼，藉由氯化銫梯度超速離心或藉由離子交換層析，於淨化過程中將空衣殼自載體顆粒分離，如上所述。

7.4.測量臨床目標

主要的評估係是為了經投予產品的安全性。以下評估於產品投予後的4週，每週進行兩次，從第6週至第12週每週進行一次，於第一年的剩餘時間內每月進行一次，於共5年期間，以6個月間隔進行。

a.身體檢查；b.ECG； c.生化評估：血清電解質、BUN、肌酐、鈣、磷酸鹽、總蛋白質、白蛋白、LDH、CPK、AST、ALT、鹼性磷酸酶、膽紅素；d.血液學評估：CBC及區別的、凝血概況；e.尿液分析；f.免疫學評估；g.對hu.37或rh.10衣殼及對因子VIII的血清學反應；h.T細胞對hu.37或rh.10衣殼及因子VIII抗原的反應；i.載體DNA之評估；血漿、尿液及唾液中的qPCR測量。

次要評估係基於轉基因表現及活性的測量，如下列測定：a.血漿因子VIII程度及因子VIII活性；b.替代因子VIII需求及自發性出血發作頻率的臨床評估。

8.實施例3：AAV.hFVIII之製造 8.1.用於生產AAV.hFVIII的質體

AAVrh.10.hFVIII係藉由3種質體DNA轉染人類HEK 293 MCB細胞而產生

(i)如第8.2.1.1-8.2.1.4節所述之載體質體；(ii)一種AAV輔助質體，稱為pAAV2.rh10.KanR，含AAV rep2及cap rh10野生型基因，描述於第8.2.2.1節；及 (iii)一種輔助腺病毒質體，稱為pAdDeltaF6(Kan)，描述於第8.2.3節。

AAVhu.37.hFVIII係藉由3種質體DNA轉染人類HEK 293 MCB細胞產生AAVhu.37.hFVIII：(i)一種載體質體，如第8.2.1.1-8.2.1.4節所述；(ii)一種AAV輔助質體，稱為pAAV2.hu.37.KanR，含AAV rep2及cap hu.37野生型基因，述於第8.2.2.2節；及(iii)一種輔助腺病毒質體，稱為pAdDeltaF6(Kan)，述於第8.2.3節。

8.2.1 順式質體(載體基因體表現構築體)：

8.2.1.1 含有人類FVIII表現匣的pAAV.E03.p3.hF8co-SQ.PA75(圖1)。該順式質體編碼rAAV載體基因體。人類FVIII-SQco cDNA的表現係由具有enTTR增強子的TTR啟動子驅動。表現匣的polyA訊號為約75nt之人工polyA序列。

序列組件之描述

1.反向末端重複(ITR)：AAV ITR是兩端相同但方向相反的序列。當以反式提供AAV和腺病毒(ad)輔助功能時，AAV2(GenBank # NC001401)ITR序列作為載體DNA複製的起點及載體基因體的包裝訊號。因此，ITR序列代表載體基因體複製及包裝所需的唯一順式作用序列。示例性的載體中使用的5'ITR序列示於SEQ ID NO：11。示例性的載體中使用的3'ITR序列示於SEQ ID NO：12。

2.TTR啟動子：轉甲狀腺素蛋白啟動子(SEQ ID NO：7)且被用於驅動高程度的肝臟特異性hFVIII基因表現。

3.TTR增強子(enTTR)：來自轉甲狀腺素蛋白之100bp增強子序列(SEQ ID NO：5)係存於載體表現串級以增進FVIII表現。

4.人類凝血因子VIII(FVIII)cDNA(SEQ ID NO：1顯示天然的序；SEQ ID NO：2顯示最佳化序列的密碼子)。人類凝血因子8(FVIII)cDNA編碼血塊形成必需的凝血因子。該hFVIII為一B-結構域缺失的序列，其中B結構域已以短的「SQ」序列替代，如本文所述。該hFVIII cDNA係於人類中用於表現的經最佳化的密碼子。

5.人工多腺苷酸化訊號：(SEQ ID NO：10)75bp人工多腺苷酸化訊號提供於hFVIII mRNA之有效率的多腺苷酸化的順式序列。此組件功能作為轉錄終止之訊號，於初期轉錄物之3’端的特異性裂解事件後添加多腺苷酸化尾段。

8.2.1.2 含人類FVIII表現匣之pAAV.E12.p3.hF8co-SQ.PA75(圖2)。此順式質體編碼rAAV載體基因體。人類FVIII-SQco cDNA之表現係由具ABPS及enTTR增強子之TTR啟動子驅動。於表現匣之polyA訊號為約75nt之人工polyA序列。

序列組件之描述

1.反向末端重複(ITR)：相同於8.2.1.1

2.TTR啟動子：相同於8.2.1.1

3.增強子：來自α1-微球蛋白/比庫蛋白前驅物[ABP]至42bp(SEQ ID NO：6)的100bp遠端增強子的縮短版本，其中來自轉甲狀腺素蛋白(enTTR)(SEQ ID NO：5)的兩個拷貝的100bp增強子序列存在於載體表現匣中以增加FVIII的表現。

4.人類凝血因子VIII(FVIII)cDNA：相同於8.2.1.1

5.人工多腺苷酸化訊號：相同於8.2.1.1

8.2.1.3 含人類FVIII表現匣之pAAV.E03.p2.hF8co-SQ.PA75(圖3)。此順式質體編碼rAAV載體基因體。人類FVIII-SQco cDNA之表現由具enTTR增強子之經修飾的A1AT啟動子驅動。表現匣用之polyA訊號為約75nt之人工polyA序列。

序列組件之描述

1.反向末端重複(ITR)：相同於8.2.1.1

2.A1AT啟動子：修飾的SERINA1[α 1-抗胰蛋白酶]啟動子(SEQ ID NO：9)，用於驅動高水平的肝特異性hFVIII基因表現。

3.TTR增強子(enTTR)：來自轉甲狀腺素蛋白的100bp增強子序列存在於載體表達匣中以增加FVIII的表現。

4.人類凝血因子VIII(FVIII)cDNA：相同於8.2.1.1

5.人工多腺苷酸化訊號：相同於8.2.1.1

8.2.1.4 含人類FVIII表現匣的pAAV.E12.p2.hF8co-SQ.PA75(圖4)。此順式質體編碼rAAV載體基因體。人類FVIII-SQco cDNA之表現係由具ABPS及enTTR增強子的TTR啟動子驅動。表現匣之polyA訊號為約75nt之人工polyA序列。

序列組件之描述

1.反向末端重複(ITR)：相同於8.2.1.1

2.A1AT啟動子：相同於8.2.1.3

3.Enhancer：相同於8.2.1.1

4.人類凝血因子VIII(FVIII)cDNA：相同於8.2.1.1

5.人工多腺苷酸化訊號：相同於8.2.1.1

8.2.2 輔助質體 8.2.2.1 AAVrh10輔助質體pAAV2.rh10.KanR

此AAVrh10輔助質體(8,036bp)編碼4種野生型AAV2 rep蛋白質及3種野生型AAV VP衣殼蛋白質，來自血清型rh10。一新穎AAV序列獲自恒河獼猴的肝臟組織DNA並指定為AAV血清型rh10。為了產生嵌合包裝構築體，自質體p5E18中移除AAV2蓋帽基因，並以從靈長類動物肝DNA增幅的AAVrh10蓋帽基因的PCR片段替換，得到質體p5E18VD2/rh10。注意，通常驅動rep表現的AAV p5啟動子在此構築體中由rep的5'末端移動到rh10蓋帽基因之3'末端。此種排列用於啟動子與rep基因(即，質體骨架)之間引入間隔物，以向下調節rep的表現並增加支持高力價載體產生的能力。p5E18中的質體骨架係來自pBluescript KS。藉由直接定序驗證質體的所有組成部分。最後將安比西林(ampicillin)抗性基因替換為康黴素(kanamycin)抗性基因，得到pAAV2/rh10(Kan)。

8.2.2.2 AAVhu.37輔助質體pAAV2.hu.37.KanR

此AAVhu.37輔助質體(8,036bp)編碼4種野生型AAV2 rep蛋白質及來自血清型hu.37的3種野生型AAV VP衣殼蛋白質。pAAV2.rh10.KanR質體的示意圖如下所示。為了產生嵌合包裝構築體，從質體p5E18中移除AAV2蓋帽基因，並以從靈長類動物肝DNA增幅的AAVhu.37蓋帽基因的PCR片段替換，得到質體p5E18VD2/hu.37。p5E18中的質體骨架係來自pBluescript KS。藉由直接定序驗證質體的所有組成部分。最後將安比西林抗性基因替換為康黴素抗性基因，得到pAAV2/hu.37(Kan)。

8.2.3 pAdDeltaF6(Kan)adenovirus輔助質體

質體pAdDeltaF6(Kan)的大小為15,774bp。質體含有AAV複製重要的腺病毒基因體，即E2A、E4及VA RNA(腺病毒E1功能由293細胞提供)，但不含其它腺病毒複製或結構基因。該質體不含有複製關鍵的順式組件，諸如腺病毒反向末端重複序列，因此，預期不會產生感染性腺病毒。其衍生自E1、E3刪除的Ad5分子選殖株(pBHG10，基於pBR322的質體)。於Ad5 DNA中引入缺失以移除不需要的腺病毒基因的表現，並將腺病毒DNA的量從32kb減少至~12kb。最後將安比西林抗性基因替換為康黴素抗性基因，得到pAd△F6(kan)。此3種腺病毒基因的同一性藉由Qiagen Genomic Services在被送至Aldevron Inc.用於質體DNA製造的質體源庫中進行的DNA質體定序證實。DNA分析顯示與3種腺病毒5 型基因區域(GenBank登錄號AF369965)具有100%的同源性。

8.2.4 細菌種源細胞庫(Bacterial Master Cell Banks，MCB)

用於支持DTX101製造的三種DNA生產質體的細菌MCBs係由Aldevron Inc.生產。細胞庫由選定培養物的擴增製成，並進行廣泛的測試以對Aldevron SOPs後的每種細菌MCB進行鑑定，並依據與CBER建議。進行及記錄關於三種質體中的每一種的細菌MCB產生及測試的細節的資訊。

8.2.5 質體DNA製造

生產過程中使用的所有質體均由Aldevron Inc.以其GMP-S^TM品質體系及利用cGMP製造最顯著特徵的基礎設施生產；可溯源性、文件控制及材料隔離。進行及記錄關於每個質體的質體DNA產生與測試的細節的資訊。

8.2.6 人類胚胎腎臟(Human Embryonic Kidney，HEK)293種源細胞庫(MCB)

原始產自Frank Graham及其同事將HEK 293細胞轉化為具有剪切腺病毒5型DNA的HEK細胞。細胞表現高力價rAAV生產所需的E1a及E1b基因產物。HEK293細胞係黏附的且為高度可轉染，在DNA質體轉染時產生高力價的rAAV。

8.3 重組AAV載體製造 8.3.1 製造方法的描述

1.細胞接種：合格的人類胚胎腎臟293細胞株用於生產過程。將細胞培養在補充有10%γ輻射照射胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)的Dulbecco's Modified Eagle培養基(DMEM)的培養基中。細胞為依賴於錨定，且細胞解離使用非動物細胞解離試劑TrypLE Select來完成。於5%(+/-0.5%)CO₂環境氣體中將細胞保持於37℃(+/-1℃)。

2.暫時性轉染：在3日之生長(DMEM培養基+10%FBS)後，以新鮮無血清DMEM培養基替代Hyperstack細胞培養基，並使用最佳化的PEI沉澱法以3種生產質體轉染。

於BSC中製備足夠的DNA質體轉染複合物以轉染20個Corning 36層HyperStacks(每BDS批次)。最初製備含有3.0mg pDTX.hFIX.101載體質體、60mg pAdDeltaF6(Kan)、30mg pAAV2.rh10.KanR AAV輔助質體及GMP級PEI(PEIPro，PolyPlus Transfection SA)的DNA/PEI混合物。混合均勻後，將溶液於室溫下靜置25分鐘，然後加入到無血清培養基中淬滅該反應，然後加入Corning 36層Hyperstacks。轉染混合物於所有36層的Hyperstack之間均衡，細胞在5%(+/-0.5%)CO₂環境於37℃(+/-2℃)下培育5日。

3.細胞媒介收取：使用拋棄式生物處理袋從每個Hypertack收取轉染的細胞和培養基，藉由無菌地將培養基排出單位。於培養基收取後，將~80升體積補充以最終濃度為2mM的MgCl₂(Benzonase的輔助因子) 及添加Benzonase核酸酶(Cat #：1.016797.0001，Merck集團)，終濃度為25單位/ml。將產品(拋棄式生物處理袋)於37℃下培養箱中培育2-3小時，以提供足夠的時間用於轉染程序的結果的收取中殘留的細胞和質體DNA之酵素消化。進行此步驟以最小化最終載體DP中殘留DNA的量。於培育期間後，加入NaCl至最終濃度為500mM，以幫助在過濾及下游切向流過濾期間之產物回收。

4.澄清：使用由蠕動泵驅動的無菌密封管及袋組件的串聯連接的深度過濾器膠囊(1.2μm/0.22μm)，自產品中移除細胞及細胞碎片。媒劑通過Sartorius Sartoguard PES膠囊過濾器(1.2μm/0.22μm)(Sartorius Stedim Biotech Inc.)。

5. 大規模切向流過濾(Tangential Flow Filtration)：以使用Spectrum Labs生產的定製無菌密封的生物處理管、袋子及膜組件的切向流過濾(TFF)達成澄清物的體積減少(10-20倍)。

8.4 以第二載體再投予 8.4.1 AAV3B或AAV5之再投予

評估使用AAV3B或AAV5在先前以AAVrh10或AAV8載體處理的恒河獼猴中的載體再次投予的功效。如前所述製備如表4所示的載體，其中在HEK293細胞中三次轉染後從上清液中回收載體，並於碘克沙醇(iodixanol)梯度上純化。藉由數位PCR方法測定載體力價。

基於預先存在的NAb的狀況，將24隻雄性恒河獼猴(3-5歲)納入8組(n=3/組；表1)。獼猴在第0天以1.0×10¹³GC/kg AAV.TBG.hCG.WPRE注射，AAV載體如表4所示。於第12週，獼猴接種第二次注射，1.0×10¹³GC/kg AAV.TBG.hCG.WPRE，AAV載體如表4所示。肝臟生檢於第2週和第14週進行，屍檢在第26週進行。

藉由酵素連結免疫吸收試驗(ELISA)測量血清中轉基因(rhCG-恒河猴慢性促性腺素b次單元之表現程度。為了肝臟中測量載體DNA拷貝數，於萃取自於肝生檢及屍檢收集的肝臟樣品的全部細胞DNA進行QPCR試驗。AAV Nab試驗如前述進行。肝臟切片以抗-CG抗體染色用於顯像。

圖15顯示藉由AAVrh10、AAV8、AAV3B及AAV5載體(第一載體注射)之rhCG表現量的比較。圖16A-16D顯示於不同時間點的肝臟中rhCG載體DNA拷貝數。圖17A-17B顯示以表現rhAFP之AAV3B(圖17A)或AAV5(圖17B)載體再投予後rhAFP程度(第二載體注射)。圖18A及圖18B顯示肝臟中rhAFP載體基因體拷貝數。圖19顯示於獼猴有差異的AAV Nab反應。

於自然的動物中，分化體的E載體(AAVrh10 & AAV8)證實最高程度的門靜脈基因轉移，以AAV5載體具有最低；門靜脈區域最接近進入的血管供應，接受最充氧的血液，且為肝臟代謝過程的重要區域。AAVrh10及AAV5誘發較AAV8和AAV3B更高程度的中和抗體(NAb)。於血清陰性動物中AAV3B注意到轉基因表現中顯著的動物與動物之間的變化。於試驗的短時間框架內，由AAVrh10誘發的NAb似乎已經抑制隨後以血清學不同的AAV3B血清型的活體內轉導；先前暴露於AAV8並未干擾AAV3B轉導。

本說明書中引用的所有刊物以及美國臨時專利申請案第62/323,336、62/331,807及62/428,866號均藉由引用併入本文。相似地，本文參考並出現在附加的序列表中的SEQ ID NO以及序列表本身被併入作為參考。雖然已經參考特定具體實施例來描述本發明，但應當理解，於不脫離本發明精神下可作修飾。此等修飾意圖落入所附申請專利範圍的範疇內。

<110> 賓州大學委員會(THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA)

<120> 治療A型血友病之基因治療

<130> UPN-16-7798PCT

<140> 106112302

<141> 2017-04-13

<150> US 62/323,336

<151> 2016-04-15

<150> US 62/331,807

<151> 2016-05-04

<150> US 62/428,866

<151> 2016-12-01

<160> 20

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 4371

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 2

<210> 3

<211> 1457

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 4

<210> 5

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 5

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 6

<210> 7

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 7

<210> 8

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 8

<210> 9

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 9

<210> 10

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 10

<210> 11

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<210> 12

<211> 164

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 12

<210> 13

<211> 7920

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 13

<210> 14

<211> 8004

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 14

<210> 15

<211> 7948

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 15

<210> 16

<211> 8032

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 16

<210> 17

<211> 738

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> AAVhu.37衣殼

<400> 17

<210> 18

<211> 738

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> AAVrh.10衣殼

<400> 18

<210> 19

<211> 4371

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 構築的序列

<400> 19

<210> 20

<211> 736

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> AAV3B衣殼

<400> 20

Claims

一種有用於A型血友病之肝臟導向治療劑之重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼、及包裝於其中的載體基因體，該載體基因體包含：(a)AAV 5'反向末端重複(inverted terminal repeat，ITR)序列；(b)選自En34增強子、ABPS增強子、轉甲狀腺素蛋白增強子(enTTR)、及其組合的增強子；(c)選自TBG-S1啟動子、A1AT啟動子、及轉甲狀腺素蛋白(TTR)啟動子的肝臟特異性啟動子；(d)編碼具有凝血功能的人類因子VIII的編碼序列；及(e)AAV 3' ITR序列；其中該編碼序列包含SEQ ID NO：2所呈示的核苷酸序列。
如請求項1之rAAV，其中該轉甲狀腺素蛋白啟動子包含SEQ ID NO：7所呈示的核苷酸序列。
如請求項1之rAAV，其中AAV衣殼為hu37衣殼。
如請求項1之rAAV，其中AAV 5' ITR序列及/或AAV3' ITR序列係來自AAV2。
如請求項1之rAAV，其中該enTTR包含SEQ ID NO：5所呈示的核苷酸序列。
如請求項1之rAAV，其中該載體基因體進一步包含多腺苷酸(polyA)序列。
如請求項6之rAAV，其中該多腺苷酸序列包含SEQ ID NO：10所呈示的核苷酸序列。
如請求項1之rAAV，其中該載體基因體的大小為約5千鹼基至約5.5千鹼基。
如請求項1之rAAV，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：13所呈示的核苷酸序列之nt 1-5110。
如請求項1至9中任一項之rAAV，其用於治療具有A型血友病之患者，其中該rAAV係以約1×10¹²至約1×10¹⁴個基因體拷貝數(genome copies，GC)/kg之水性懸浮液被遞送至患者。
如請求項10之rAAV，其中該rAAV係於之後的時間點被再次投予。
一種適合投予至A型血友病患者之水性懸浮液，該懸浮液包含約1×10¹²拷貝數(GC)/mL至約1×10¹⁴GC/mL之如請求項1至10中任一項之rAAV。
如請求項12之水性懸浮液，其中該懸浮液係適合靜脈注射。
如請求項12之水性懸浮液，其中該懸浮液進一步包含界面活性劑、防腐劑、及/或緩衝液。
如請求項1之rAAV，其中該增強子為enTTR且包含SEQ ID NO：5所呈示的核苷酸序列；且該肝臟特異性啟動子為TTR啟動子且包含SEQ ID NO：7所呈示的核苷酸序列。
如請求項15之rAAV，其中該AAV 5’ITR序列包含SEQ ID NO：11所呈示的核苷酸序列且該AAV 3’ITR序列包含SEQ ID NO：12所呈示的核苷酸序列。
如請求項15之rAAV，其中該載體基因體進一步包含polyA序列。
如請求項17之rAAV，其中該polyA序列包含SEQ ID NO：10所呈示的核苷酸序列。
如請求項15之rAAV，其中該AAV衣殼為hu37衣殼。