TWI789123B

TWI789123B - 使用生長因子來治療關節炎

Info

Publication number: TWI789123B
Application number: TW110142734A
Authority: TW
Inventors: 張樂心; 邱彥碩; 林季千; 林士超; 賈尚真
Original assignee: 樂濎生醫股份有限公司
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2023-01-01
Also published as: JP7545165B2; CN116135227A; TW202320837A; JP2023074461A; US20230149510A1

Abstract

本發明揭示表皮生長因子可被用來治療關節炎。

Description

使用生長因子來治療關節炎

本發明是有關於使用表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)來治療關節炎(arthritis)，特別是有關於使用一含有表皮生長因子、醣胺聚醣(glycosaminoglycan)以及玻尿酸(hyaluronic acid, HA)的組成物。

關節炎(arthritis)是常見的慢性疾病，可發生在各種關節(例如，手、足、腕、肘、膝、髖以及踝關節)上，常見的種類包括退化性關節炎(degenerative arthritis)[又被稱為骨關節炎(osteoarthritis, OA)]、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)以及痛風性關節炎(gouty arthritis, GA)，主要會造成關節發炎、腫脹(swelling)、變形(deformity)、疼痛(pain)、萎縮(atrophy)以及僵硬(stiffness)，甚至喪失活動的能力。

目前臨床上針對關節炎的治療方法，一般是使用類固醇(steroid)來減緩發炎以及使用玻尿酸(hyaluronic acid, HA)來提供潤滑，並搭配物理復健，藉此控制軟骨的受損情況，但這些療法所達成的效果仍不盡理想，嚴重者甚至須藉由手術來置換人工關節。

富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)是血液經由移除紅血球所得到之濃縮液，含有大量的血小板以及多種生長因子，其中以似胰島素生長因子Ⅰ (insulin-like growth factor I, IGF-I)的含量最高，轉變生長因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)次之，而表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)的含量極低，大約為IGF-I的1/450倍(Ha C.W. et al. (2019), Arthroscopy, 35:2878-2884)。雖然PRP已有被嘗試用於改善關節炎，但其療效事實上仍待詳細的研究驗證。在近期所發表的Gazendam A. et al. (2021), Br. J. Sports Med., 55:256-261中，Gazendam A.等人依據PRISMA方法對1782篇關於髖骨關節炎的研究文獻進行篩選、系統性回顧(systematic review)以及網絡統合分析(network meta-analysis, NMA)。而分析結果發現，無論在關節功能或疼痛的改善上，PRP注射的療效與安慰劑(placebo)(亦即食鹽水注射)之間皆無統計學差異存在，特別地，PRP與玻尿酸組合使用的效用還不如單獨使用PRP。

另一方面，已有研究指出EGF會在帶有RA的病患中大量表現，而被認為可能參與了關節炎的發病機制，特別是RA的發炎進程(Nah S.S. et al. (2010), Rheumatol. Int., 30:443-449)。

而在Swanson C.D. et al. (2012), J. Immunol., 188:3513-3521中，Swanson C.D.等人則發現表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)會在帶有膠原蛋白-誘發的關節炎(collagen-induced arthritis)的小鼠以及帶有RA的病患中大量表現，而認為EGFR可能參與了關節炎的發病機制。Swanson C.D.等人進一步嘗試藉由抑制EGFR來進行治療，結果發現使用EGFR抑制劑厄洛替尼(erlotinib)能夠減緩膠原蛋白-誘發的關節炎，而認為EGFR可做為一個新穎的治療標的。

另一方面，在Sun H. et al. (2018), EBioMedicine, 32:223-233中，Sun H.等人發現EGFR會在OA的病患中高度活化，而認為EGFR的活化可能會導致關節的損壞。Sun H.等人亦嘗嘗試藉由抑制EGFR來進行治療，結果發現使用EGFR抑制劑吉非替尼(gefitinib)能夠改善帶有OA的小鼠，而認為可用來作為有效的治療策略。

發明概要

雖然存在上述關於表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)及其受體的先前研究，在本發明中申請人意外地發現，直接使用EGF反而能夠有效地治療關節炎(arthritis)，而進一步組合醣胺聚醣(glycosaminoglycan)以及玻尿酸(hyaluronic acid, HA)更能顯著提升其治療效用。

於是，本發明提供一種表皮生長因子供應用於製備一用來治療關節炎之組成物的用途。較佳地，該組成物進一步包含有醣胺聚醣與玻尿酸。

本發明亦提供一種用於治療關節炎的方法，其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的組成物。

較佳地，該關節炎是退化性關節炎或類風溼性關節炎。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

本發明提供一種表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)供應用於製備一用來治療關節炎(arthritis)之組成物的用途。

依據本發明，該關節炎可選自於由下列所構成之群組：退化性關節炎(degenerative arthritis)[又被稱為骨關節炎(osteoarthritis, OA)]、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)、痛風性關節炎(gouty arthritis, GA)、乾癬性關節炎(psoriatic arthritis, PA)、傳染性關節炎(infectious arthritis, IA)，以及它們的組合。

在本發明的一個較佳具體例中，該關節炎是退化性關節炎。在本發明的另一個較佳具體例中，該關節炎是類風溼性關節炎。

如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指預防(preventing)、減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)、或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。

依據本發明，該表皮生長因子可衍生自人類或各種不同的動物、植物與微生物，並且可以是商業上可購得的產品，或者藉由熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術而被製得的產物，例如，從生物材料中所分離出的自然產物或經由基因工程所得到的重組型蛋白。在本發明的一個較佳具體例中，該表皮生長因子是重組型人類表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor, rhEGF)。

依據本發明，該組成物可進一步包含有醣胺聚醣(glycosaminoglycan)與玻尿酸(hyaluronic acid, HA)。

較佳地，該醣胺聚醣是選自於由下列所構成之群組：硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、硫酸角質素(keratan sulfate)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、硫酸鹽葡萄糖胺(glucosamine sulfate)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該醣胺聚醣是硫酸軟骨素。

依據本發明，該表皮生長因子、該醣胺聚醣以及玻尿酸可呈一範圍落在1：10：100至1：1000：5000內的重量比。在本發明的一個較佳具體例中，該表皮生長因子、該醣胺聚醣以及玻尿酸的重量比為1：100：1000。

依據本發明，該組成物不包含富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)。

依據本發明，該組成物可以是一食品組成物(food composition)，例如，呈一食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至一可食性材料(edible material)中以製備一供人類或動物食用的食品產品。依據本發明，該食物產品的種類可包括，但不限於：奶粉(milk powder)、發酵乳(fermented milk)、優格(yogurt)、乳酪(butter)、飲料(beverages)(例如，茶、咖啡)、機能性飲料(functional beverages)、麵製品(flour product)、烘焙食品(baked foods)、甜點(confectionery)、糖果(candies)、發酵食品(fermented foods)、動物飼料(animal feeds)、保健食品(health foods)、嬰兒食品(infant food)，以及膳食補充品(dietary supplements)。

依據本發明，該組成物可以是一藥學組成物(pharmaceutical composition)。

依據本發明，該藥學組成物可呈一適合於非經腸道投藥(parenteral administration)、口服投藥(oral administration)或局部投藥(topical administration)之劑型(dosage form)。

依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道投藥的劑型[包括注射品(injection)，例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]，且以一選自於由下列所構成的群組中的途徑來投藥：腹腔內注射(intraperitoneal injection)、胸膜內注射(intrapleural injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、動脈內注射(intraarterial injection)、關節內注射(intraarticular injection)、滑液內注射(intrasynovial injection)、椎管內注射(intrathecal injection)、顱內注射(intracranial injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮內注射(intradermal injection)、病灶內注射(intralesional injection)、以及舌下投藥(sublingual administration)。較佳地，該藥學組成物被製造成適於以腹腔內注射或關節內注射而被投藥的劑型。

依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥的劑型，這包括，但不限於：無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明，該藥學組成物亦可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

本發明亦提供一種用於關節炎的方法，其包括對一有此需要的個體投予(administering)一如上所述之含有表皮生長因子的組成物。

如本文中所使用的，術語“投予(administering)”以及“投藥(administration)”可被交換地使用，並且意指藉由任何合適的途徑來對一個體導入(introducing)、提供(providing)或遞送(delivering)一預定的活性成分以執行其預期的效用。

如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類，諸如人類(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheep)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)、大鼠(rats)、兔(rabbits)、象(elephants)、熊(bears)、鹿(deer)、鯨魚(whales)與海豚(dolphins)；爬蟲類動物，諸如龜(turtles)與蜥蜴(lizards)；兩棲類，諸如蛙(frogs)與蠑螈(salamanders)；魚類；以及鳥類。

依據本發明，該組成物的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的組成物可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被口服地、非經腸道地或局部地投藥。 較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料：

以下成分皆是購自於樂業生化科技有限公司：表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)(Cat. No. 02-108)；硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)(Cat. No. 05-103)；以及玻尿酸(hyaluronic acid, HA)(Cat. No. 07-113)。 一般實驗方法： 1. 統計學分析(Statistical Analysis)：

在下面的實施例中，所得到的實驗數據是採用GraphPad Prism軟體第8.4版(v8.4)(GraphPad Software, San Diego, CA)來進行統計分析，並以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。所有的數據是藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance, ANOVA)，繼而以塔基檢定(Tukey’s test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的分析結果是 p＜0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 表皮生長因子在治療退化性關節炎 (degenerative arthritis)[ 又被稱為骨關節炎 (osteoarthritis, OA)] 上的效用評估 實驗材料： 1. 含有 EGF 、 CS 以及 HA 的組成物：

在本實施例中所使用之含有EGF、CS以及HA的組成物是藉由將上面“一般實驗材料”的EGF、CS以及HA以一為1：100：1000的重量比來予以混合並配於無菌水中而製得，其中含有20 µg/g的EGF。 2. 實驗動物：

在本實施例中所使用的雄性Sprague Dawley大鼠(male Sprague Dawley rats)(6週大，體重約為200至300 g)是購自於國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center, R.O.C.)。所有的實驗動物個別地被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在21-24℃以及相對濕度維持在45-70%的動物房中，而且被任意採食地( ad libitum)餵食以水分與飼料。有關實驗動物的一切實驗程序是由國立中興大學的實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of National Chung Hsing University)所認可，並依據美國國家衛生研究院(National Institutes of Health, NIH)的實驗動物飼養管理及使用規範(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)來進行。 實驗方法： A、 OA 的誘發與表皮生長因子的投藥：

首先，將雄性SD大鼠隨機地分為1個正常對照組、1個病理對照組、1個比較組以及2個實驗組(亦即，實驗組1與2)(每組n=5)。接著，藉由關節內注射(intraarticular injection)的方式對病理對照組、比較組以及各個實驗組的大鼠的右膝關節投予30 μL之50 g/L的碘醋酸單鈉(monosodium iodoacetate, MIA)溶液(配於0.9%生理鹽水中)，至於正常對照組則是被注射以等體積的0.9%生理鹽水。

在注射MIA溶液之後的第3天以及第14天，對比較組的大鼠的右膝關節注射以30 μL的HA，以及對實驗組1與2的大鼠的同一部位分別注射以30 μL 20 µg/g的EGF，以及30 μL之含有EGF、CS以及HA的組成物(含有20 µg/g的EGF)，病理對照組的大鼠則是被注射以等體積的生理鹽水，至於正常對照組的大鼠則不做任何處理。 B、 臨床症狀 (clinical signs) 的評估：

在注射MIA溶液之後的第28天結束之時，以卡尺(caliper)來量測各組大鼠右膝關節的直徑，然後依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 C、 生物樣品的製備：

在注射MIA溶液之後的第28天結束之時，完成上面第B項的臨床症狀的評估之後，先藉由二氧化碳犧牲各組的大鼠，隨即藉由25G針頭穿刺而從各組大鼠的心臟來進行採血，並在25℃下以1,500 ×g予以離心歷時10分鐘，藉此得到各組大鼠的血清樣品。

最後，取出各組大鼠的右膝關節組織，並以0.9%生理鹽水予以清洗。 D、 組織病理學評估：

首先，將在上面第C項中所得到的各組大鼠的右膝關節組織在室溫下以10%中性緩衝福馬林(neutral buffered formalin)(BiOTnA Biotech, Cat No. TABS06-4000)來進行固定(fixation)歷時24小時，繼而將經固定的組織樣品以石蠟(paraffin)予以包埋(embedding)，然後進行切片處理，藉此而得到具有厚度為5 μm的組織切片(tissue sections)。

之後，所得到的組織切片分別藉由使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)(Sigma Aldrich, Cat. No. 1.09249)以及番紅O-固綠(safranin O-fast green)染色試劑(Sigma Aldrich, S8884, Cat. No. F7258)並且依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行染色，繼而使用Olympus CKX41顯微鏡並在一為200倍的放大倍率下進行觀察，繼而隨機地選出2個區域來進行拍照，並參考Pauli C. et al.(2012), Osteoarthritis Cartilage,20:476-85當中所述的經改良的曼金評分系統(modified Mankin scoring system)來針對軟骨結構中的各項OA病理特徵[包括軟骨結構損傷(cartilage structure damage)、軟骨細胞流失(chondrocyte loss)以及蛋白聚醣流失(proteoglycan loss)]予以評分，俾以評估MIA誘發的OA的疾病進展。 E、 血清中 OA 生物標誌以及發炎相關因子的測定：

首先，將在上面第C項中所得到的各組大鼠的血清樣品以RPMI 1640培養基予以稀釋5倍，之後使用大鼠軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP) ELISA套組(Cusabio, Cat. No. CSB-E13833r)並依據製造商的操作指南來測定各組大鼠血清中OA生物標誌COMP含量；使用TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A ELISA套組(Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, Cat No. 88-7340-88, 88-6010-22, 88-50625-88, 88-7170-22)來測定這些血清中促發炎細胞激素(proinflammatory cytokines)的含量；以及使用PGE2 ELISA套組(Cusabio, Cat. No. CSB-E07967r)來測定血清中促發炎媒介因子(proinflammatory mediators)前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)的含量。

另外，促發炎媒介因子一氧化氮(nitric oxide, NO)的含量是藉由革利士試驗(Griess assay)而被測定。簡言之，對各組大鼠的血清樣品各取100 μL，並將之等量的革利士試劑(Griess reagent){含有0.2%的 N-(1-萘基)乙二胺[ N-(1-Naphthyl)ethylenediamine]、2%的對胺苯磺醯胺(sulfanilamide)以及5%的磷酸(phosphoric acid)}予以混合，於室溫下進行反應歷時10分鐘之後，於540 nm的波長下以分光光度計來讀取各井的吸光值(OD ₅₄₀)。將所獲得的OD ₅₄₀數值分別根據預先以硝酸鈉(sodium nitrate)相對於它們自身的OD ₅₄₀數值所作出的相關曲線而被換算成亞硝酸鹽濃度。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果： A、 臨床症狀的評估：

圖1顯示各組大鼠所測得的右膝關節直徑。由圖1可見，相較於正常對照組，病理對照組大鼠的膝關節有明顯腫脹的情形，這表示MIA已成功地誘發大鼠產生OA。而與病理對照組相較之下，比較組和實驗組1大鼠的膝關節腫脹情形皆有部分改善，而實驗組2的膝關節腫脹情形則有顯著的改善，甚至是近似於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：EGF可治療OA並改善關節腫脹情形，並且其效用是近似於習知用於治療關節炎之藥物所具者。此外，EGF在與CS以及HA組合使用下更能展現出協同的治療效用(synergistic therapeutic effect)。 B、 組織病理學評估：

從各組大鼠的膝關節組織樣品染色結果可觀察到，相較於正常對照組，病理對照組大鼠的軟骨形成有多處明顯的裂縫與不規則的表面，並且有嚴重的軟骨細胞與蛋白聚醣流失的情形，這表示MIA已成功地誘發OA並產生相關的組織病變。相較之下，比較組和實驗組1與2大鼠的軟骨裂縫皆較少且表面較為平整，軟骨細胞與蛋白聚醣流失較不明顯，而其中又以實驗組2的軟骨組織情況最佳，軟骨表面平滑且仍保有大部分的軟骨細胞與蛋白聚醣(數據未顯示)。

圖2顯示各組大鼠的膝關節組織樣品藉由經改良的曼金評分系統評估軟骨結構的結果。由圖2可見，正常對照組大鼠的軟骨組織完全沒有呈現出任何病理徵狀，相較之下，病理對照組大鼠的軟骨組織的病理徵狀最為嚴重。另一方面，比較組和實驗組1大鼠的軟骨組織的病理徵狀則有略為減輕的現象，而實驗組2大鼠的軟骨組織的病理徵狀則最為輕微，分數約只有1分。

這些實驗結果顯示：EGF可治療OA並改善相關的軟骨組織病變，並且其效用是近似於習知用於治療關節炎之藥物所具者。而EGF與CS以及HA在組合使用下更能展現出協同的治療效用。 C、 血清中 OA 生物標誌以及發炎相關因子的測定：

圖3顯示各組大鼠所測得的血清中COMP含量。由圖3可見，相較於正常對照組，病理對照組的血清COMP含量有顯著的提升，這表示MIA已成功地誘發OA並導致軟骨開始發生病變與退化。而相較於病理對照組，比較組與實驗組1的血清COMP含量皆有略微下降，而實驗組2的血清COMP含量下降幅度最大，並且是恢復至近似於正常對照組所具者。

圖4顯示各組大鼠所測得的血清中促發炎細胞激素TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-17A含量。由圖4可見，相較於正常對照組，病理對照組的血清促發炎細胞激素含量皆有顯著的提升，這表示MIA有成功的誘發OA並於膝關節中產生發炎反應。而相較於病理對照組，比較組與實驗組1的血清促發炎細胞激素含量皆觀察到有下降的趨勢，而實驗組2的血清促發炎細胞激素含量的下降幅度最多。

圖5顯示各組大鼠所測得的血清中促發炎媒介因子PGE2與NO的含量。由圖5可見，相較於正常對照組，病理對照組的血清PGE2與NO含量皆有顯著的提升。而相較於病理對照組，比較組與實驗組1的血清PGE2與NO含量則呈現出下降的趨勢，而實驗組2的血清PGE2與NO含量的下降幅度最多。

這些實驗結果顯示：EGF能夠有效地降低OA並改善相關的發炎反應，並且其效用是近似於習知用於治療關節炎之藥物所具者。此外，EGF與CS以及HA在組合使用下更能展現出協同的治療效用。 實施例 2. 表皮生長因子在治療類風濕性關節炎 (rheumatoid arthritis, RA) 上的效用評估 實驗動物：

在本實施例中所使用的雌性DBA/1小鼠(female DBA/1 mice)(8週大，體重約20 g)是購自於國家實驗動物中心。所有的實驗動物個別地被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在21-23℃以及相對濕度維持在45-60%的動物房中，而且被任意採食地餵食以水分與飼料。有關實驗動物的一切實驗程序是由國立中興大學的實驗動物照護及使用委員會所認可，並依據美國國家衛生研究院的實驗動物飼養管理及使用規範來進行。 實驗方法： A、 RA 的誘發與表皮生長因子的投藥：

首先，將2 mg/mL的雞第II型膠原蛋白(Chick type II collagen，簡稱為CII)(Chondrex, Cat. No. 20012)溶液(配於10 mM乙酸中)與弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant) (Sigma Aldrich, Cat. No. F5881-10ML)以一為1：1 (v/v)的比例來進行混合，而得到一CII第一乳化液(emulsion)，以及將2 mg/mL的CII溶液與弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant)(ChemCruzx, Cat. No. sc-24648)以一為1：1 (v/v)的比例來進行混合，而得到一CII第二乳化液。

接著，將雌性DBA/1小鼠隨機地分為1個正常對照組、1個病理對照組、1個比較組以及2個實驗組(亦即，實驗組1與2)(每組n=6)。接著，將200 μL的CII第一乳化液皮下注射至病理對照組、比較組以及各個實驗組的小鼠尾巴內來做第1次免疫，並於初次免疫後的第21天再注射以等量的CII第二乳化液來追加免疫(boost)一次，俾以誘發RA的發生。至於正常對照組的小鼠大體上被進行相同的注射，不同之處在於：在乳化液的配置時使用生理鹽水來替代CII溶液。

在初次免疫之後的第21天，完成追加免疫之後，對比較組的小鼠腹腔內注射(intraperitoneal injection)以100 μL的HA，以及對實驗組1與2的小鼠分別腹腔內注射以100 μL的20 µg/g的EGF，以及100 μL之含有EGF、CS以及HA的組成物(含有20 µg/g的EGF)。各組小鼠每天被注射一次，總共歷時20天。 B、 臨床症狀的評估：

在初次免疫之後的第21天結束之時，參考Brand D.D. et al. (2007), Nat. Protoc., 2:1269-1275以及Milici A.J. et al. (2008), Arthritis Res. Ther., 10:R14當中所述的視覺關節炎評分系統(visual arthritis scoring system)來針對各組小鼠腳掌關節、腳踝至膝關節的紅斑與水腫情形等各項病徵進行評分。之後，每3天進行一次上述的視覺關節炎評分，持續至初次免疫之後的第42天，總共進行8次的評分。 C、 組織病理學評估：

在完成上面第B項的臨床症狀的評估之後，藉由二氧化碳犧牲各組的小鼠，取出各組小鼠的後腿膝關節組織，並依照上面實施例1的第D項當中所述的方法來製備組織切片，繼而進行蘇木精-伊紅染色以及以顯微鏡進行觀察。之後，參考Deng G.M. et al.(2005), Nat Med.,11:1066-1072當中所述的關節炎組織學評分方法來針對RA的各項病理特徵[包括發炎細胞浸潤(inflammatory cells infiltration)、滑膜增生(synovial hyperplasia)以及軟骨表面侵蝕(cartilage surface erosion)]的程度進行評分，俾以評估CII誘發的RA的疾病進展。 D、 腳掌中促發炎細胞激素的測定：

在犧牲各組小鼠之後，剪取小鼠的腳掌組織100 mg，以液態氮予以冷凍之後再磨碎，加入1 mL的組織溶解緩衝液(tissue lysis buffer)(Gold Biotechnology, Inc., Cat. No. GB-181-100)[其中含有蛋白酶抑制劑雞尾酒(protease inhibitor cocktail)]並予以混合均勻。接著，使用TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A與IFN-γ ELISA套組(BioLegend, Cat No.430904, 432604, 431304, 432504, 430807)以及IL-8 ELISA套組(MyBioSource, Cat No. MBS261967)來測定各組小鼠腳掌組織中這些促發炎細胞激素的含量。 結果： A、 臨床症狀的評估：

圖6顯示各組小鼠在初次免疫後的第21至42天藉由視覺關節炎評分系統評估的結果。由圖6可見，正常對照組小鼠完全沒有展現出任何關節炎症狀，相較之下，病理對照組小鼠的關節炎評分是隨著時間而逐漸上升，顯示CII已成功誘發小鼠產生RA。相較於病理對照組，比較組以及實驗組1的關節炎評分隨著時間上升的趨勢較為緩慢。而實驗組2的關節炎病程進展則最為緩慢，且在初次免疫後的第33至42天之間的關節炎評分曲線趨於平緩並且皆明顯低於病理對照組所具者。

這個實驗結果顯示：EGF可治療與減緩RA並改善RA所導致的各項臨床症狀，其效用是近似於習知用於治療關節炎之藥物所具者。此外，EGF在與CS以及HA組合使用下更能展現出協同的治療效用。 B、 組織病理學評估：

從各組小鼠的軟骨組織樣品染色結果可觀察到，相較於正常對照組，病理對照組大鼠的軟骨結構破碎，無法觀察到平整的軟骨表面，這表示CII已成功地誘發小鼠產生RA並造成相關的組織病變。相較之下，比較組與實驗組1的軟骨結構僅有部分損傷，而可觀察到部分完整的軟骨表面，而實驗組2的軟骨結構則最為完整且表面平滑，近似於正常對照組的軟骨結構(數據未顯示)。

圖7顯示各組小鼠的膝關節軟骨組織樣品藉由關節炎組織學評分進行評估的結果。由圖7可見，正常對照組小鼠的軟骨組織完全沒有呈現出任何病理徵狀，相較之下，病理對照組的發炎細胞浸潤、滑膜增生、軟骨侵蝕程度評分皆有顯著的提升。而相較於病理對照組，比較組以及實驗組1的各項病理特徵評分皆有明顯的下降，而實驗組2在滑膜增生以及軟骨表面侵蝕的評分的下降幅度最為顯著。

這些實驗結果顯示：EGF可治療RA並改善相關的軟骨組織病變，並且其效用是近似於習知用於治療關節炎之藥物所具者。此外，EGF在與CS以及HA組合使用下更能在治療RA的軟骨組織病變上展現出協同效用。 C、 腳掌中促發炎細胞激素的測定：

圖8A與8B分別顯示各組小鼠所測得的腳掌組織中促發炎細胞激素TNF-α、IL-6與IL-1β以及IL-8、IL-17A與IFN-γ的含量。由圖8可見，相較於正常對照組，病理對照組的促發炎細胞激素含量皆有顯著的提升，這表示CII有成功的誘發RA並產生發炎反應。而相較於病理對照組，比較組以及實驗組1與2的促發炎細胞激素含量皆呈現出下降的趨勢，其中又以實驗組2的促發炎細胞激素含量的下降幅度最為顯著。

這個實驗結果顯示：EGF能夠有效地降低RA所導致的發炎反應，並且其效用是近似於習知用於治療關節炎之藥物所具者。此外，EGF與CS以及HA在組合使用下更能展現出協同的治療效用。

綜合以上的實驗結果，申請人認為：表皮生長因子具有供用於治療關節炎(特別是OA與RA)的高潛力，並且可進一步組合以醣胺聚醣(特別是硫酸軟骨素)以及玻尿酸來提升效用。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：圖1顯示各組大鼠在注射碘醋酸單鈉(monosodium iodoacetate, MIA)之後的第28天所測得的右膝關節直徑，其中“*”、“**”與“***”分別表示當與病理對照組作比較， p＜0.05、 p＜0.01與 p＜0.001；圖2顯示各組大鼠在注射MIA之後的第28天膝關節組織樣品藉由經改良的曼金評分系統對軟骨結構進行評估的結果，其中“*”與“***”分別表示當與病理對照組作比較， p＜0.05與 p＜0.001；圖3顯示各組大鼠在注射MIA之後的第28天所測得的血清中軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)含量，其中“**”表示當與病理對照組作比較， p＜0.01；圖4分別顯示各組大鼠在注射MIA之後的第28天所測得的血清中TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-17A含量，其中“*”、“**”與“***”分別表示當與病理對照組作比較， p＜0.05、 p＜0.01與 p＜0.001；圖5分別顯示各組大鼠在注射MIA之後的第28天所測得的血清中PGE2以及NO含量，其中“*”、“**”與“***”分別表示當與病理對照組作比較， p＜0.05、 p＜0.01與 p＜0.001；圖6顯示各組小鼠在以雞第II型膠原蛋白(Chick type II collagen，簡稱為CII)乳化液進行初次免疫之後的第21至42天期間藉由視覺關節炎評分系統進行評估的結果；圖7分別顯示各組小鼠在以CII乳化液進行初次免疫之後的第42天，膝關節的軟骨組織樣品藉由關節炎組織學評分進行評估的結果，其中“*”與“***”分別表示當與病理對照組作比較， p＜0.05與 p＜0.001；以及圖8A與8B分別顯示各組小鼠在以CII乳化液進行初次免疫之後的第42天腳掌組織中所測得的TNF-α、IL-6與IL-1β以及IL-8、IL-17A與IFN-γ的含量，“*”、“**”與“***”分別表示當與病理對照組作比較， p＜0.05、 p＜0.01與 p＜0.001。

Claims

一種表皮生長因子供應用於製備一用來治療關節炎之組成物的用途，其中該組成物進一步包含有醣胺聚醣與玻尿酸，該表皮生長因子、該醣胺聚醣以及玻尿酸是呈一範圍落在1：10：100至1：1000：5000內的重量比。
如請求項1的用途，其中該關節炎是退化性關節炎。
如請求項1的用途，其中該關節炎是類風溼性關節炎。
如請求項1的用途，其中該表皮生長因子、該醣胺聚醣以及玻尿酸的重量比為1：100：1000。
如請求項1的用途，其中該醣胺聚醣是選自於由下列所構成之群組：硫酸軟骨素、硫酸角質素、硫酸乙醯肝素、硫酸鹽葡萄糖胺，以及它們的組合。
如請求項5的用途，其中該醣胺聚醣是硫酸軟骨素。
如請求項1的用途，其中該組成物是食品組成物或藥學組成物。
如請求項7的用途，其中該藥學組成物是呈一供非經腸道投藥、口服投藥或局部投藥的劑型。