TWI779251B

TWI779251B - 植物萃取物用於提升ＣＣＴ基因、Ａｔｇ基因、ＮＡＤＳＹＮ基因、ＭＲＰＳ５基因、ＳＯＤ３基因、及ＴＥＲＴ基因表現量及/或提升ＧＳＨ含量的用途

Info

Publication number: TWI779251B
Application number: TW108142378A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 吳佩蓉
Original assignee: 大江基因醫學股份有限公司
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2022-10-01
Also published as: CN112823782B; TW202120069A; CN116473889B; CN112823782A; CN116440197A; CN116473889A

Abstract

本發明提供一種植物萃取物用於提升CCT基因、Atg基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因表現量及/或提升GSH含量的用途，能夠全面的提升的抗老化活性及/或抗氧化活性，能促進反轉回青春有活力的狀態。其中本發明之植物萃取物係為一天山雪蓮萃取物、一龍眼殼萃取物、一蕎麥萃取物、及其任意組合所組成。

Description

植物萃取物用於提升CCT基因、Atg基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因表現量及/或提升GSH含量的用途

本發明係關於一種植物萃取物用於提升CCT基因、Atg基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因表現量與提升GSH含量的用途之用途，尤其是一種係為一天山雪蓮萃取物、一龍眼殼萃物、一蕎麥萃取物、及其任意組合所組成之植物萃取物用於製備提升CCT2基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、Atg8基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因表現量，及/或提升GSH的含量之組合物的用途。

在生物學及醫學上，老化(aging)是指一個生物體之生理狀態隨時間而惡化的現象，老化會造成身體各部分組織或器官機能衰退或功能減弱，使得生物體的健康功能變差，最後導致生物體死亡，現代人生活壓力大，長期壓力的累積會加速身體機能老化，也衍生出許多慢性疾病。

另外，隨著保健意識的抬頭及醫療技術的進步，人均壽命增長，但老化所造成的機能退化依然伴隨年齡的增長而加劇，因此除了在疾病的治療及預防外，老化的預防也是高齡社會的重要課題之一。

雖然目前已研究出許多與老化相關的基因以及相關的機制，但是目前仍然沒有能有效應用於延緩老化的藥物或方法，大多只能建議從飲食上多攝取具抗氧化活性物質的食物，並維持適當運動與保持正常作息及心情愉悅。

綜上所述，為了能方便又有效達到延緩老化的功效，開發一種能有效提升抗老化基因表現量、及抗氧化力的組合物，著實有其必要性。

緣此，本發明之一目的在提供一種植物萃取物用於製備提升含TCP1的折疊蛋白(Chaperonin containing TCP1,CCT)基因、自噬作用相關基因(Autophagy-related gene,Atg)基因、麩醯胺酸依賴性菸草醯胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(Glutamine-dependent NAD⁺ synthetase,NADSYN)基因、粒線體核糖體蛋白5(mitochondrial ribosomal protein S5,MRPS5)基因、超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,SOD3)基因、及端粒酶反轉錄酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)基因表現量之組合物的用途；其中該植物萃取物係由一天山雪蓮萃取物、一龍眼殼萃取物、一蕎麥萃取物、及其任意組合所組成。

本發明之另一目的在提供一種植物萃取物用於製備提升榖胱甘肽(Glutathione,GSH)含量之組合物的用途，其中該植物萃取物係由一天山雪蓮萃取物、一龍眼殼萃取物、一蕎麥萃取物、及其任意組合所組成。

在本發明之一實施例中，該CCT基因係含TCP1第2次單元的折疊蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit2,CCT2)基因、含TCP1第7次單元的折疊蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit 7,CCT7)基因、含TCP1第8次單元的折疊蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit 8,CCT8)基因、及其任意組合；且該Atg基因係自噬作用相關基因1(Autophagy-related gene 1,Atg1)基因、自噬作用相關基因8(Autophagy-related gene 8,Atg8)基因或其組合。

在本發明之又一實施例中，該植物萃取物係增加抗老化活性。

在本發明之又一實施例中，該植物萃取物係調節一細胞之調節NAD⁺濃度、及/或端粒長度。

在本發明之又一實施例中，該植物萃取物係增加抗氧化活性。

在本發明之又一實施例中，該植物萃取物係以一溶劑進行萃取，該溶劑為水、醇、或醇水混合物。

在本發明之又一實施例中，該植物萃取物的濃度為至少0.5%(v/v)。

在本發明之另一實施例中，該植物萃取物係該天山雪蓮萃取物、該龍眼殼萃取物、該一蕎麥萃取物以2.4-3.6：129.6-194.4：128.8-193.2比例混合所組成。

本發明之植物萃取物係為一天山雪蓮萃取物、一龍眼殼萃取物、一蕎麥萃取物、及其任意組合所組成；該天山雪蓮萃取物、該龍眼殼萃取物、及該蕎麥萃取物皆能有效提升血球細胞、皮膚細胞、心血管細胞、及/或視網膜細胞中與粒線體或細胞抗老化相關之基因的表現量，且該三種萃取物特別對心血管細胞有顯著的抗老化功效。而該三種萃取物的組合亦能夠直接且有效的提升CCT2基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、Atg8基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因的表現量，能夠全面的提升的抗老化活性，且本發明之植物萃取物能同時提升GSH的含量，以全面的提升體內的抗氧化活性；本發明之植物萃取物能有效促進體內反轉回青春有活力的狀態。因此，本發明之植物萃取物可用於製備抗老化之組合物的用途，其中該組合物是一醫藥品、一食品或一保養品，可藉由口服、皮膚塗抹等方式給予一個體。

圖1係為本發明之一實施例的天山雪蓮萃取物提升血球細胞中CCT2基因、CCT5基因、及CCT6A基因表現量之效果的長條圖。* p值<0.05。

圖2係為本發明之一實施例的龍眼殼萃取物提升血球細胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、及FOXO3基因表現量之效果的長條圖。* p值<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。

圖3係為本發明之一實施例的蕎麥萃取物提升血球細胞中CCT2基因、及CCT5基因表現量之效果的長條圖。* p值<0.05。

圖4係為本發明之一實施例的天山雪蓮萃取物提升皮膚細胞中CCT6A基因、CCT7基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因表現量之效果的長條圖。* p值<0.05；** p<0.01。

圖5係為本發明之一實施例的龍眼殼萃取物提升皮膚細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因表現量之效果的長條圖。* p值<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。

圖6係為本發明之一實施例的蕎麥萃取物提升皮膚細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、及Pink1基因表現量之效果的長條圖。*** p值<0.001。

圖7係為本發明之一實施例的天山雪蓮萃取物提升心血管細胞中CCT2基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、及SIRT1基因表現量之效果的長條圖。* p值<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。

圖8係為本發明之一實施例的龍眼殼萃取物提升心血管細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因表現量之效果的長條圖。* p值<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。

圖9係為本發明之一實施例的蕎麥萃取物提升心血管細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因表現量之效果的長條圖。* p值<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。

圖10係為本發明之一實施例的龍眼殼萃取物及蕎麥萃取物提升視網膜細胞中CCTs基因、Pink1基因、Atg8基因、SIRT1基因、或FOXO3基因表現量之效果的長條圖。** p<0.01；*** p<0.001。

圖11係為本發明之一實施例的植物萃取物的組合物提升CCTs基因表現量之效果的長條圖。* p<0.05；*** p<0.001。

圖12係為本發明之一實施例的植物萃取物的組合物提升Atg1基因及Atg8基因表現量之效果的長條圖。* p<0.05；*** p<0.001。

圖13係為本發明之一實施例的植物萃取物的組合物提升NADSYN基因、MRPS5基因、及SOD3基因表現量之效果的長條圖。* p<0.05；*** p<0.001。

圖14係為本發明之一實施例的植物萃取物的組合物提升TERT基因表現量之效果的長條圖。*** p<0.001。

圖15係為本發明之一實施例的植物萃取物的組合物提升GSH含量之效果的長條圖。** p<0.01；*** p<0.001。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個此之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。

天山雪蓮(Smallanthus sonchifolius)為菊科(Compositae)菊薯屬(Smallanthus)多年生草本植物，又稱菊薯，英文名為Peruvian ground apple，地下塊根肥大，可供食用且具有清涼解熱、降脂、及幫助排便的功效。

龍眼(Euphoria longana Lam.)為無患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Euphoria)常綠喬木植物，英文名為Longan，龍眼根具有通經絡功效；葉具有清熱解毒之功效；果核具有止血、止痛之功效；果實味甜且具有補氣血、安神之功效；果皮(即為龍眼殼)具有清熱涼血的功效。

蕎麥(Fagopyrum esculentum Moench.)為蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)一年生草本植物，又稱三角麥，英文名為Common buckwheat，蕎麥莖及葉具有止血、降血壓之功效；種子則具有消腫、解毒、退燒之功效。

如本文中所使用的，用語「天山雪蓮萃取物」意為天山雪蓮的癒傷組織與溶劑以1：1-5(w/w)比例經一特定時間與溫度萃取而得。

如本文中所使用的，用語「龍眼殼萃取物」意為龍眼殼與溶劑以1：5-10(w/w)比例經一特定時間與溫度萃取而得。

如本文中所使用的，用語「蕎麥萃取物」意為蕎麥的種皮與溶劑以1：10-15(w/w)比例經一特定時間與溫度萃取而得。

如本文中所使用的，用語「植物萃取物的組合物」意為將前述之天山雪蓮萃取物、前述之龍眼殼萃取物、及前述之蕎麥萃取物以2.4-3.6：129.6-194.4：128.8-193.2比例混合而得之組合物。

本發明提供一種植物萃取物用於製備抗老化之組合物的用途，本發明之植物萃取物係為一天山雪蓮萃取物、一龍眼殼萃取物、一蕎麥萃取物、及其任意組合所獲得，其可用於提升與抗老化相關之基因的表現量，能夠全面的提升抗老化活性，且能同時提升GSH的含量，能全面的提升人的的抗氧化活性，以使體內反轉回青春有活力的狀態。

同時，本發明用於製備抗老化之組合物，亦可包含一有效量之植物萃取物及一醫藥上可接受之載體，該組合物係一醫藥品、一食品或一保養品。

以下將詳細說明本發明天山雪蓮萃取物、龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物之詳細萃取方法；本發明天山雪蓮萃取物、龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物分別提升全身性、皮膚細胞、心血管細胞、及/或視網膜細胞中抗老化基因表現量之功效測試；以及本發明植物萃取物的組合物提升抗老化基因表現量、及提升GSH含量之功效測試。以證實本發明之植物萃取物能有效且全面的提升抗老化其抗氧化，以使體內反轉回青春有活力的狀態。

實施例1 本發明之天山雪蓮萃取物的製備方法

在本發明之一實施例中，首先將天山雪蓮的癒傷組織與水、醇、或醇水混合物之萃取溶劑，萃取溶劑較佳為水，以1：1-5之重量比混合，均質後在溶劑中以50-100℃進行萃取0.5-2小時後，將粗萃取物冷卻至室溫，並將該粗萃取物以400mesh之濾網過濾以獲得濾液，其中萃取溫度較佳為70-100℃。最後，將該濾液於45-70℃進行減壓濃縮後，即得到本發明之天山雪蓮萃取物。

實施例2 本發明之龍眼殼萃取物的製備方法

在本發明之一實施例中，首先將龍眼殼組織與水、醇、或醇水混合物之萃取溶劑，萃取溶劑較佳為水，以1：5-10之重量比混合，均質後在溶劑中以50-100℃進行萃取0.5-2小時後，將粗萃取物冷卻至室溫，並將該粗萃取物以400mesh之濾網過濾以獲得濾液，其中萃取溫度較佳為70-100℃。最後，將該濾液於45-70℃進行減壓濃縮後，即得到本發明之龍眼殼萃取物。

實施例3 本發明之蕎麥萃取物的製備方法

在本發明之一實施例中，首先將蕎麥的種皮與水、醇、或醇水混合物之萃取溶劑，萃取溶劑較佳為水，以1：10-15之重量比混合，均質後在溶劑中以50-100℃進行萃取0.5-2小時後，將粗萃取物冷卻至室溫，並將該粗萃取物以400mesh之濾網過濾以獲得濾液，其中萃取溫度較佳為70-100℃。最後，將該濾液於45-70℃進行減壓濃縮後，即得到本發明之蕎麥萃取物。

實施例4 本發明之天山雪蓮萃取物、龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物提升全身性抗老化基因表現量之功效

本發明之一實施例以人類周邊血液單核球細胞(Human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)測試本發明之天山雪蓮萃取物、龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物提升全身性抗老化基因表現量之功效測試。其中，該人類周邊血液單核球細胞係購自美國典型培養物保藏中心，編號為ATCC^® PCS-800-011^TM，且培養於X-VIVO^TM 10 Serum-free hematopoietic cell medium(購自Lonza，瑞士，編號BE02-055Q)中。

首先，將1×10⁵個PBMC細胞培養於含有2mL上述細胞培養液之6孔培養盤中，於37℃培養16-18小時，接著將細胞分成以下四組：(1)僅加入細胞培養液之控制組、(2)加入0.5%(v/v)本發明之天山雪蓮萃取物之實驗組、(3)加入0.25%(v/v)本發明之龍眼殼萃取物之實驗組、及(4)加入0.125%(v/v)本發明之蕎麥萃取物之實驗組，並將該些組別之細胞分別於37℃下作用24小時或48小時後，測試各組PBMC細胞中目標基因的表現量；其中，該天山雪蓮萃取物、該龍眼殼萃取物、及該蕎麥萃取物係以水為萃取溶劑。首先，將PBMC細胞以細胞裂解液(RB buffer，購自Geanaid公司，臺灣，Cat No.RBD300)回收細胞後，使用RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，臺灣，Cat No.RBD300)分別收集該四組細胞內之RNA，接著利用SuperScript^® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)以2000ng之萃取RNA為模板，並以表1之組合引子及反轉錄酶進行反轉錄作用，以產生該些基因之mRNA所相應之cDNA產物，接著利用ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，以及KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)將該四組反轉錄後產物分別以表1之組合引子進行定量即時聚合酶連鎖反應(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)試驗，條件為95℃反應1秒，60℃反應20秒，總共40個迴圈。用以定量CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、及UBL-5基因之mRNA的表現量，其中定量數值係取由閾值循環數(Ct)，而目標基因的mRNA相對量係推導自方程式2^-△△Ct，其中△C_T=C_{T比較組或實驗組目標基因/控制組目標基因}-C_{T GAPDH}(甘油醛-3- 磷酸脫氫酶，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)；△△C_T=C_{T比較組或實驗組目標基因}-C_{T控制組目標基因}；各組中各基因的fold change則為2^-△△Ct。接著，再利用Excel軟體決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

CCT基因為折疊蛋白(Chaperonin)的一種，主要功能為矯正錯誤摺疊的蛋白質，並將無法成功修復之蛋白質送進蛋白質水解酶複合體(Proteasome)中進行水解，先前研究已指若此蛋白質調控之重複使用系統發生故障，會導致錯誤摺疊的蛋白質會聚集在細胞中，並造成細胞功能衰退及加速細胞的老化與死亡，因此被認為與個體之老化調節相關。

Pink1基因為一種位在粒線體的絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase)，其功能為保護線粒體在細胞壓力期間發生故障，已知該基因之突變與帕金森氏症有關，而先前研究更指出該基因的過量表現能夠增加小鼠的壽命，因此也被認為與個體之老化調節有關。

Parkin基因為一種存在於泛素-蛋白酶體系(Ubiquitin-proteasome system)中之酵素，並作為蛋白質分解的調節劑，已知該基因之突變與帕金森氏症有關，且先前研究亦指出增加該基因的表現量能夠延緩細胞的老化作用，因此被認為與細胞的老化作用相關。

Atg基因則為自噬作用相關基因，會參與細胞中廢物降解、及循環的自噬作用，先前研究指出該基因的過量表現，能夠延長小鼠的壽命，因此被認為與細胞的老化作用相關。

先前研究已指出和年老的小鼠相比，年輕的小鼠體內含有較多的NAD⁺；且增加年老小鼠體內的NAD⁺濃度，能使其生理狀況更為年輕，因此NAD⁺被認為與延緩個體老化相關，研究結果已知SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、UBL-5基因、及SOD3基因與調節NAD⁺相關。

本發明之天山雪蓮萃取物提升血球細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖1所示。經本發明之天山雪蓮萃取物作用48小時後，相較於控制組，能提升PBMC細胞中CCT2基因、CCT5基因、及CCT6A基因之表現量達約1.2-1.4倍不等，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)，其中CCT6A基因之表現量具顯著差異。此結果顯示本發明之天山雪蓮萃取物能有效提升PBMC細胞中CCT2基因、CCT5基因、及CCT6A基因之表現量，能有效提升全身性抗老化的能力。

本發明之龍眼殼萃取物提升血球細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖2所示。經本發明之龍眼殼萃取物作用24小時後，相較於控制組，能顯著提升PBMC細胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、及FOXO3基因之表現量達約1.3-20倍不等，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)。此結果顯示本發明之龍眼殼萃取物能有效提升PBMC細胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、及FOXO3基因之表現量，能有效提升全身性抗老化的能力。

本發明之蕎麥萃取物提升血球細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖3所示。經本發明之蕎麥萃取物作用48小時後，相較於控制組，能提升PBMC細胞中CCT2基因、及CCT5基因之表現量達約1.2倍，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)，其中CCT2基因之表現量具顯著差異。此結果顯示本發明之蕎麥萃取物能有效提升PBMC細胞中CCT2基因、及CCT5基因之表現量，能有效提升全身性抗老化的能力。

實施例5 本發明之天山雪蓮萃取物、龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物提升皮膚細胞中抗老化基因表現量之功效

本發明之一實施例以人類皮膚纖維母細胞(Human skin fibroblast)CCD-966SK細胞測試本發明之天山雪蓮萃取物、龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物提升皮膚細胞中抗老化基因表現量之功效測試。其中，該CCD-966SK細胞係購自美國典型培養物保藏中心(ATCC，美國)，編號為ATCC^® CRL-1881，且該細胞係培養於含有10%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum)以及90%之Minimum Essential Medium(MEM)的培養液(購自Gibco，美國)，其中含有1mM之丙酮酸鈉(Sodium pyruvate，購自Gibco，美國)、及1%之青黴素-鏈黴素(penicillin/streptomycin)。

首先，將1.5x10⁵個CCD-966SK細胞培養於每孔含有2mL上述培養液之6孔培養盤中，於37℃培養16-18小時，接著將細胞分成以下四組：(1)僅加入細胞培養液之控制組、(2)加入0.5%(v/v)本發明之天山雪蓮萃取物之實驗組、(3)加入0.5%(v/v)本發明之龍眼殼萃取物之實驗組、及(4)加入0.125%(v/v)本發明之蕎麥萃取物之實驗組，並將該些組別之細胞於37℃下作用24小時或48小時後，測試各組CCD-966SK細胞中目標基因的表現量；其中，該天山雪蓮萃取物、該龍眼殼萃取物、及該蕎麥萃取物係以水為萃取溶劑。接著，將該四組之CCD-966SK細胞以細胞裂解液回收細胞後，以實施例4中所述之步驟定量該四組CCD-966SK細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、及UBL-5基因之mRNA表現量，再利用Excel 軟體決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本發明之天山雪蓮萃取物提升皮膚細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖4所示。經本發明之天山雪蓮萃取物作用24小時後，相較於控制組，能顯著提升CCD-966SK細胞中CCT6A基因、CCT7基因、Atg1基因、及Atg8基因之表現量達約1.1-2.2倍不等，SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量則約為1.05倍，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)。此結果顯示本發明之天山雪蓮萃取物能有效提升CCD-966SK細胞中CCT6A基因、CCT7基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量，能有效提升皮膚細胞抗老化的能力。

本發明之龍眼殼萃取物提升皮膚細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖5所示。經本發明之龍眼殼萃取物作用24小時後，相較於控制組，能提升CCD-966SK細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量達約1.1-1.9倍不等，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)，其中Pink1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量具顯著差異。此結果顯示本發明之龍眼殼萃取物能有效提升CCD-966SK細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、Pink1基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量，能有效提升皮膚細胞抗老化的能力。

本發明之蕎麥萃取物提升皮膚細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖6所示。經本發明之蕎麥萃取物作用48小時後，相較於控制組，能顯著提升CCD-966SK細胞中CCT2基因、CCT6A基因、CCT7基因、及CCT8基因之表現量達約1.2-2.9倍不等，CCT5基因、及Pink1基因之表現量則約為1.2倍，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)。此結果顯示本發明之蕎麥萃取物能有效提升CCD-966SK細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、及Pink1基因之表現量，能有效提升皮膚細胞抗老化的能力。

實施例6 本發明之天山雪蓮萃取物、龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物提升心血管細胞中抗老化基因表現量之功效

本發明之一實施例以人類臍帶靜脈/血管內皮細胞(Human umbilical vein/vascular endothelium cell,HUVEC)測試本發明之天山雪蓮萃取物、龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物提升心血管細胞中抗老化基因表現量之功效測試。其中，該HUVEC細胞係購自台灣生物資源保存與研究中心，編號為BCRC No.H-UV001ATCC^® CRL-1730^TM，且該細胞係培養於含有10mL之50x LSGS(購自Gibco，美國)之培養液Medium 200(購自Thermo，美國，編號M200500)中，其中含有及1%之青黴素-鏈黴素(penicillin/streptomycin)。

首先，將1.5x10⁵個HUVEC細胞培養於每孔含有2mL上述培養液之6孔培養盤中，於37℃培養16-18小時，接著將細胞分成以下四組：(1)僅加入細胞培養液之控制組、(2)加入0.5%(v/v)本發明之天山雪蓮萃取物之實驗組、(3)加入0.5%(v/v)本發明之龍眼殼萃取物之實驗組、及(4)加入0.125%(v/v)本發明之蕎麥萃取物之實驗組，並將該些組別之細胞分別於37℃下作用48小時後，測試各組HUVEC細胞中目標基因的表現量；其中，該天山雪蓮萃取物、該龍眼殼萃取物、及該蕎麥萃取物係以水為萃取溶劑。接著，將該四組之HUVEC細胞以細胞裂解液回收細胞後，以實施例4中所述之步驟定量該四組HUVEC細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、及UBL-5基因之mRNA表現量，再利用Excel軟體決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本發明之天山雪蓮萃取物提升心血管細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖7所示。經本發明之天山雪蓮萃取物作用後，相較於控制組，能顯著提升HUVEC細胞中CCT2基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、及SIRT1基因之表現量達約1.6-4.4倍不等，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)。此結果顯示本發明之天山雪蓮萃取物能有效提升HUVEC細胞中CCT2基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、及SIRT1基因之表現量，能有效提升心血管細胞抗老化的能力。

本發明之龍眼殼萃取物提升心血管細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖8所示。經本發明之龍眼殼萃取物作用後，相較於控制組，能顯著提升HUVEC細胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量達約1.8-4.3倍不等，CCT2基因之表現量則約為1.8倍、其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)。此結果顯示本發明之龍眼殼萃取物能有效提升HUVEC細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量，能有效提升心血管細胞抗老化的能力。

本發明之蕎麥萃取物提升心血管細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖9所示。經本發明之蕎麥萃取物作用後，相較於控制組，能顯著提升HUVEC細胞中CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量達約2-4倍不等，CCT2基因之表現量則約為1.1倍，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)。此結果顯示本發明之蕎麥萃取物能有效提升HUVEC細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量，能有效提升心血管細胞抗老化的能力。

實施例7本發明之龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物提升視網膜細胞中抗老化基因表現量之功效

本發明之一實施例以人類視網膜色素上皮細胞(Human retinal pigment epithelial)ARPE-19細胞測試本發明之天山雪蓮萃取物、龍眼殼萃取物、及蕎麥萃取物提升皮膚細胞中抗老化基因表現量之功效測試。其中，該ARPE-19細胞係購自ATCC公司(美國)，編號為CRL-2302，且該細胞係培養於含有10%之胎牛血清以及90%之DMEM/F12培養液，其中該培養液含有1：1比例之DMEM培養液(Dulbecco's Modified Eagle Medium，購自Gibco，美國，12100-046)與漢氏F12培養液(Ham's F12 Nutrient Mixture，購自Gibco，美國，12500-026)，且含有0.5mM之丙酮酸鈉(sodium pyruvate)及15mM之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid,HEPES)緩衝溶液。

首先，將1.5x10⁵個ARPE-19細胞培養於每孔含有2mL上述培養液之6孔培養盤中，於37℃培養16-18小時，接著將細胞分成以下五組：(1)僅加入細胞培養液且未照射藍光之空白控制組、(2)僅加入細胞培養液且照射藍光之正控制組、(3)加入0.5%(v/v)本發明之天山雪蓮萃取物之實驗組、(4)加入0.5%(v/v)本發明之龍眼殼萃取物之實驗組、及(5)加入0.5%(v/v)本發明之蕎麥萃取物之實驗組；其中第(2)-(5)組細胞係先放置於藍光箱中於室溫下照射藍光15分鐘後，再分別以樣品於37℃下作用48小時後，測試各組ARPE-19細胞中目標基因的表現量；其中，該龍眼殼萃取物、及該蕎麥萃取物係以水為萃取溶劑。接著，將該五組之ARPE-19細胞以細胞裂解液回收細胞後，以實施例4中所述之步驟定量該五組ARPE-19細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、及UBL-5基因之mRNA表現量，再利用Excel軟體決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本發明之龍眼殼萃取物及蕎麥萃取物提升視網膜細胞中抗老化基因之表現量的實驗結果如圖10所示。正控制組細胞內CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg8基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量接低於空白控制組，顯示照射藍光確實會降低視網膜色素上皮細胞中抗老化基因之表現量；而經本發明之龍眼殼萃取物作用後，相較於控制組，能提升ARPE-19細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Atg1基因、SIRT1基因、及FOXO3基因之表現量達1.1-1.7倍不等，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)；經本發明之蕎麥萃取物作用後，則能提升CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、Atg1基因、及FOXO3基因之表現量達1.2-1.5倍不等，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)；經本發明之天山雪蓮萃取物作用後，該些基因表現量皆與控制組差異不大(結果未顯示)。此些結果顯示本發明之龍眼殼萃取物及蕎麥萃取物能有效提升ARPE-19細胞中CCTs基因、Pink1基因、Atg8基因、SIRT1基因、或FOXO3基因之表現量，能有效提升視網膜細胞抗老化的能力。

實施例8 本發明之植物萃取物的組合的製備方法

在本發明之一實施例中，將本發明之天山雪蓮萃取物、本發明之龍眼殼萃取物、及本發明之蕎麥萃取物以2.4-3.6：129.6-194.4：128.8-193.2之重量比例混合後，即為本發明之植物萃取物的組合。

實施例9 本發明之植物萃取物的組合提升抗老化活性之功效

本發明之一實施例為測試本發明之植物萃取物的組合於提升抗老化活性之功效，首先募集7位30-50歲以上之成人為受試者，每日服用2顆(每顆含2.4-3.6mg本發明之天山雪蓮萃取物、129.6-194.4mg本發明之龍眼殼萃取物、128.8-193.2mg本發明之蕎麥萃取物)之本發明植物萃取物的組合，在給予該植物萃取物的第0週、第2週及第4週時，分別收集每位受試者的血液樣本進行抗老化基因表現量分析及生化蛋白分析；其中本實施例使用之本發明植物萃取物的組合中，該天山雪蓮萃取物、該龍眼殼萃取物、該蕎麥萃取物皆為以水為溶劑之萃取物。

其中抗老化基因表現量分析係先分別將受試者血液中的周邊血液單核細胞以淋巴球分離液分離，再以實施例4中所述之步驟、以及表1與表2之組合引子，定量該些周邊血液單核球細胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、UBL-5基因、SOD3基因、TERT基因、及TERC基因之mRNA表現量，再利用Excel軟體決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

其中，生化蛋白分析係利用細胞內GSH測定試劑套組(Intracellular GSH assay kit，購自abcam，編號ab112132)分析血球中榖胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量，其中係將受試者血液以PBS調整至106cells/mL，再以該細胞內GSH測定試劑套組於室溫下進行染色15分鐘，並以PBS清洗與回溶後，置於流式細胞儀(Accuri C6 Plus，BD)上機，偵測螢光為FL1 channel(Ex/Em=490/525nm)，並以該螢光訊號作為受試者血液中榖胱甘肽的含量。

端粒係為生物染色體末端的DNA重複序列，主要作用是保持染色體的完整性和控制細胞分裂週期，其中DNA每複製一次，端粒就會縮短一些，一旦端粒消耗殆盡，細胞則會走向凋亡，因此端粒的長度與細胞的年齡具相關，其中又已知TERT基因、及TERC基因與調節端粒的長短相關。

生化蛋白分析係分析受試者血液中榖胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量。其中榖胱甘肽又稱麩胱甘肽，為體內重要的抗氧化酵素，在肝臟中擁有較高的濃度，因此亦為重要的解毒劑，且榖胱甘肽也係體內新陳代謝重要的輔助成分，因此與維持體內各種生理代謝的穩定與順暢相關。已有許多研究指出，體內的榖胱甘肽會隨著老化、壓力等而減少，若體內榖胱甘肽量不足，可能會增加心血管、肝臟及神經退化性疾病等疾病風險。

本發明之植物萃取物的組合提升CCTs基因表現量之結果如圖11所示；提升Atg1基因及Atg8基因表現量之結果如圖12所示；提升NADSYN基因、MRPS5基因、及SOD3基因表現量之結果如圖13所示；提升TERT基因表現量之結果如圖14所示；其於提升血液中GSH含量之結果如圖15所示。

服用本發明之植物萃取物的組合共2週或4週後，受試者體內CCT2基因、及CCT7基因表現量皆顯著高於受試前約2.4-3.9倍不等，CCT8基因表現量則分別高於受試前約1.8及1.3倍；而Atg1基因表現量則分別顯著高於受試前約2.8及3.8倍，Atg8基因則分別高於受試前約1.4及2.5倍；NADSYN基因、及MRPS5基因表現量則皆顯著高於受試前約3.9-15倍不等，SOD3基因表現量則分別高於受試前約1.04及1.2倍，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)；而服用本發明之植物萃取物的組合共4週後，TERT基因表現量亦顯著高於受試前約1.5倍，其它基因表現量則與控制組差異不大(結果未顯示)。該些結果顯示本發明之植物萃取物的組合能有效提升CCT2基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、Atg8基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因的表現量，能有效的全面提升抗老化的活性。

服用本發明之植物萃取物的組合共2週或4週後，血液中GSH的含量皆顯著高於受試前約1.16倍及1.4倍。該結果顯示本發明之植物萃取物的組合能有效提升血液中GSH的含量，能夠有效且全面的提升抗氧化能力。

綜上所述，本發明之植物萃取物係為一天山雪蓮萃取物、一龍眼殼萃取物、一蕎麥萃取物、及其任意組合所組成；該天山雪蓮萃取物、該龍眼殼萃取物、及該蕎麥萃取物皆能有效提升血球細胞、皮膚細胞、心血管細胞、及/或視網膜細胞中與粒線體或細胞抗老化相關之基因的表現量，且該三種萃取物特別對心血管細胞有顯著的抗老化功效。而該三種萃取物的組合亦能夠直接且有效的提升CCT2基因、CCT7基因、CCT8基因、Atg1基因、Atg8基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因的表現量，能夠全面的提升抗老化活性，且本發明之植物萃取物能同時提升GSH的含量，以全面的提升的抗氧化活性；本發明之植物萃取物能有效促進體內反轉回青春有活力的狀態。因此，本發明之植物萃取物可用於製備抗老化之組合物的用途，其中該組合物是一醫藥品、一食品或一保養品，可藉由口服、皮膚塗抹等方式給予一個體。

<110> 大江生醫股份有限公司

<120> 植物萃取物用於提升CCT基因、Atg基因、NADSYN基因、MRPS5基因、SOD3基因、及TERT基因表現量及/或提升GSH含量的用途

<130> N/A

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 3

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 4

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 5

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 6

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 7

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 8

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 9

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 14

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 15

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 16

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 17

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 18

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 19

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 23

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 24

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 25

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 26

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 27

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 28

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 29

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 30

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 31

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 32

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 33

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 34

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 35

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引子

<400> 36

Claims

一種植物萃取物用於製備提升含TCP1的折疊蛋白(Chaperonin containing TCP1,CCT)基因、自噬作用相關基因(Autophagy-related gene,Atg)基因、麩醯胺酸依賴性菸草醯胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(Glutamine-dependent NAD⁺ synthetase,NADSYN)基因、粒線體核糖體蛋白5(mitochondrial ribosomal protein S5,MRPS5)基因、及端粒酶反轉錄酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)基因表現量之組合物的用途；其中該植物萃取物係由一蕎麥種皮萃取物所組成或係由該蕎麥種皮萃取物、一天山雪蓮癒傷組織萃取物與一龍眼殼萃取物的組合所組成，其中該組合之該天山雪蓮萃取物、該龍眼殼萃取物及該蕎麥萃取物之重量比為2.4-3.6：129.6-194.4：128.8-193.2，其中該植物萃取物係以一溶劑進行萃取，該溶劑為水。
如請求項1所述之用途，其中該CCT基因係含TCP1第2次單元的折疊蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit 2,CCT2)基因、含TCP1第7次單元的折疊蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit 7,CCT7)基因、含TCP1第8次單元的折疊蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit 8,CCT8)基因、或其任意組合。
如請求項1所述之用途，其中該Atg基因係自噬作用相關基因1(Autophagy-related gene 1,Atg1)基因、自噬作用相關基因8(Autophagy-related gene 8,Atg8)基因或其組合。
如請求項1所述之用途，其中該植物萃取物係增加抗老化活性。
如請求項1所述之用途，其中該植物萃取物係調節一細胞之調節NAD⁺濃度、及/或端粒長度。
一種植物萃取物用於製備提升榖胱甘肽(Glutathione,GSH)含量之組合物的用途，其中該植物萃取物係由一天山雪蓮癒傷組織萃取物所組成或係由該天山雪蓮癒傷組織萃取物、一蕎麥種皮萃取物與一龍眼殼萃取物的組合所組成，其中該組合之該天山雪蓮萃取物、該龍眼殼萃取物及該蕎麥萃取物之重量比為2.4-3.6：129.6-194.4：128.8-193.2，其中該植物萃取物係以一溶劑進行萃取，該溶劑為水。
如請求項6所述之用途，其中該植物萃取物係增加抗氧化活性。
如請求項1或6所述之用途，其中該植物萃取物的濃度為至少0.5%(v/v)。