TWI774661B - 培養基組成物、細胞或組織培養調製物、細胞或組織的培養方法及細胞或組織之單離方法 - Google Patents

Abstract

本發明是提供一種培養基組成物，其係含有去醯基化結蘭膠或其鹽，及酸性多醣類或其鹽而可將細胞或組織懸浮培養者，該酸性多醣類或其鹽係在二價金屬陽離子介質中維持無規則線圈狀態，並且經由二價金屬離子可進行交聯者，培養基組成物中的去醯基化結蘭膠或其鹽的濃度是0.002至0.01(w/v)%，前述酸性多醣類或其鹽的濃度是0.004至0.1(w/v)%，相對於去醯基化結蘭膠或其鹽，前述酸性多醣類或其鹽的質量比是1以上的培養基組成物。又，本發明是提供由含有該培養基組成物及細胞或組織之培養調製物單離細胞或組織的方法，其係包含對該培養調製物加上剪切力的方法。

Description

培養基組成物、細胞或組織培養調製物、細胞或組織的培養方法及細胞或組織之單離方法

本發明是關於容易回收細胞的懸浮培養用培養基組成物，及由含有該培養基組成物的細胞培養物回收細胞的方法。

去醯基化結蘭膠(DAG)等的多醣類是經由金屬陽離子(例如鈣離子等二價金屬陽離子)聚集，而在水中形成三維網格(不定型的構造體)。在含有此三維網格的液體培養基中培養細胞時，培養基中的細胞是被此三維網格捕捉而不沉澱，因而不需要振盪、迴轉操作等，即可將細胞以分散均勻的懸浮狀態進行培養(懸浮靜置培養)。又，由於實質上不提高液體培養基的黏度而可以形成上述的三維網格，因而含有該三維網格的培養基組成物在繼代等的操作性也優異(專利文獻1)。此可以懸浮靜置培養的培養基組成物由於具有促進種種的細胞增殖活性等，各種各樣的優異特性之故，在再生醫療、蛋白質等大量生產等的廣大範圍技術領域的應用受期待。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2014/017513號

本發明者等發現，在使用含有去醯基化結蘭膠(DAG)的可懸浮靜置培養的培養基組成物，培養細胞或組織後，由培養物以離心分離回收該細胞或組織時，由於該培養基組成物具有維持細胞或組織的懸浮狀態的效果，細胞或組織的沈澱不充分，而有回收率低的課題。

本發明的目的是提供容易回收細胞的懸浮培養用培養基組成物，及由含有該培養基組成物的細胞培養物回收細胞的方法等。

本發明者等為了解決上述課題而精心檢討。本發明者等推想，維持細胞或組織的懸浮狀態的效果是起因於去醯基化結蘭膠經由金屬陽離子(例如鈣離子等二價金屬陽離子)聚集而形成的三維網格(不定型的構造體)，因而在懸浮培養完成後即將細胞或組織自懸浮培養物以離心分離回收之前，如能將此三維網格破壞，而失去維持細胞或組織的懸浮狀態的效果，則細胞或組織會迅速沈澱，而可提高回收率。於是在只含有去醯基化結蘭膠(DAG) 作為多醣類的可懸浮靜置培養的培養基組成物中，將細胞懸浮靜置培養後，實施吸管吸取(pipetting)或過濾器過濾等的操作，對培養基組成物加上剪切力，而嘗試破壞上述三維網格。其結果，雖得到一定程度的細胞回收率的改善，但不是充分滿足的程度。於是對於培養基組成物的成分加以檢討，發現在去醯基化結蘭膠之外，將海藻酸鈉以特定的濃度添加於培養基中時，在維持靜置培養時的細胞或組織的懸浮狀態的維持效果下，必要時添加螯合劑，藉由吸管吸取或過濾器過濾等而加上剪切力，則發生該維持細胞或組織的懸浮狀態的效果迅速消失之此種優異的特性(維持細胞或組織的懸浮狀態的效果對剪切力的脆弱性)。使用該含有去醯基化結蘭膠及海藻酸鈉的培養基組成物時，可將細胞或組織長期間懸浮靜置培養，再以吸管吸取或過濾器過濾等的較簡易的操作，而使維持細胞或組織的懸浮狀態效果迅速消失後，進行離心分離，則能以高收率回收細胞或組織。去醯基化結蘭膠具有較直線狀構造的構成單元，由於培養基組成物中多數個去醯基化結蘭膠鏈的鏈束化，而形成緊密且安定的三維網格之故，以吸管吸取或過濾器過濾等不容易破壞此三維網格，以至於造成細胞回收率的低下；與此相對，將由於含有α 1-4鍵結的L-葡萄醣醛酸及β 1-4鍵結的D-甘露醣醛酸的兩種醣醛酸而具有較高體積構造的海藻酸添加於培養基組成物中，則除了可將培養基組成物中的去醯基化結蘭膠的濃度相對的降低之外，由於去醯基化結蘭膠的鏈束化受到抑制，因而由吸管 吸取或過濾器過濾等加上剪切力，則三維網格容易被破壞，以至於維持細胞或組織的懸浮狀態的效果迅速消失並顯示有導致細胞回收率的改善的可能性。依據這些知識，再加檢討，而完成本發明的完成。

即，本發明如下述：

[1]一種培養基組成物，係含有去醯基化結蘭膠或其鹽，以及在二價金屬陽離子介質中維持無規則線圈狀態，並經由二價金屬離子可交聯之酸性多醣類或其鹽，而可將細胞或組織懸浮而培養之培養基組成物，其中，培養基組成物中的去醯基化結蘭膠或其鹽的濃度是0.002至0.01(w/v)%，前述酸性多醣類或其鹽的濃度是0.004至0.1(w/v)%，相對於去醯基化結蘭膠或其鹽，前述酸性多醣類或其鹽的質量比是1以上。

[2]如[1]項中所述的培養基組成物，其中，前述酸性多醣類是由海藻酸、果膠及果膠酸所成的群組選出的任一種。

[3]如[2]項中所述的培養基組成物，其中，前述酸性多醣類是海藻酸。

[4]如[1]至[3]項中任一項所述的培養基組成物，其中，再含有金屬陽離子。

[5]如[4]項中所述的培養基組成物，其中，前述金屬陽離子是鈣離子。

[6]如[1]至[5]項中任一項所述的培養基組成物，其中，前述酸性多醣類或其鹽是經過高壓蒸氣滅菌處理。

[7]一種細胞或組織培養調製物，係含有如[1]至[6]項中任一項所述的培養基組成物，及細胞或組織。

[8]一種細胞或組織的培養方法，係包含在[1]至[6]項中任一項所述的培養基組成物中進行培養細胞或組織。

[9]一種方法，係由如[7]項中所述的培養調製物單離細胞或組織的方法，係包含對該培養調製物加上剪切力。

[10]如[9]項所述的方法，其中，係藉由吸管吸取或過濾器過濾對培養調製物加上剪切力。

[11]如[9]或[10]項中所述的方法，其中，再包含在培養調製物中添加螯合劑。

[12]如[9]至[11]項中任一項所述的方法，其中，再包含對培養調製物加上剪切力後，將該培養調製物進行離心分離。

本發明的培養基組成物的特性是具有維持細胞或組織的懸浮狀態的效果，必要時添加螯合劑，並藉由吸管吸取或過濾器過濾等加上剪切力，則可使此效果迅速消失。因此，如使用本發明的培養基組成物，則可將細胞或組織懸浮培養(理想是懸浮靜置培養)，此外可由所得的培養調製物將細胞或組織以高回收率回收。尤其是在維持所得培養調製物的體積下，亦即不需要將培養調製物以培養基溶液、緩衝液、水等稀釋，而可將細胞或組織以高回收率回收。

以下，更詳細說明本發明。

培養基組成物

本發明是提供可將細胞或組織懸浮而培養的培養基組成物。該培養基組成物是在維持懸浮狀態下，將培養對象的細胞或含有該細胞的組織加以培養。

本發明中的細胞就係指構成動物或植物的最基本的單元，而在細胞膜的內部有細胞質及各種細胞小器官作為其要素。這時，內包DNA的核是在細胞內部含有或不含都可以。例如，在本發明中的動物來源的細胞，包含精子及卵子等的生殖細胞、構成活體的體細胞、幹細胞、前驅細胞、由活體分離的癌細胞、由活體分離的獲得不死化能力而在體外可安定維持的細胞(細胞株)、由活體分離的人為的改變基因的細胞，由活體分離的人為的交換核的細胞等。構成活體的體細胞之例而言，不限定於下述者，但包含纖維母細胞、骨髄細胞、B淋巴球、T淋巴球、嗜中性球、紅血球、血小板、巨噬細胞、單核球(monocyte)、骨細胞、骨髄細胞、外被細胞(pericyte)、樹狀細胞(dendritic cell)、角質細胞、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、內皮細胞、血管內皮細胞、肝實質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神經系細胞、神經膠細胞、神經元細胞、寡樹突膠細胞(oligodendrocyte)、微神經膠細胞、星狀膠細胞、心臟細胞、食道細胞、肌肉細胞(例如，平滑肌細胞或骨格 肌細胞)、胰臟β細胞、黑色素細胞、造血前驅細胞，及單核細胞(mononuclear cell)等。該體細胞是包含由皮膚、腎臟、脾臟、上腎、肝臟、肺、卵巢、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臟、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臟、眼、腦或神經組織等的任意組織採取的細胞。幹細胞就是有複製本身的能力並兼備分化成為其他多數個系統的細胞的能力的細胞，其例而言，不限定於下列，但包含胚胎幹細胞(embryonic stem cell，ES細胞)、胚胎性癌(embryonic carcinoma)、胚胎生殖幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(induced pluripotent stem cell，iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、脾幹細胞、肌幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞(hair follicle stem cell)等。前驅細胞就是由前述幹細胞分化成為特定的體細胞或生殖細胞的中途階段的細胞。癌細胞就是由體細胞衍生而獲得無限增殖能力的細胞。細胞株就是在活體外以人為的操作而獲得無限增殖能力的細胞，其例而言，不限定於下列，但包含CHO(中國倉鼠卵巢細胞株)、HCT116、Huh7、HEK293(人胎兒腎細胞)、HeLa(人子宮癌細胞株)、HepG2(人肝癌細胞株)、UT7/TPO(人白血病細胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(註冊商標)、Vero等。

在本發明中的植物來源的細胞中，包含由 植物體的各組織分離的細胞，也包含由該細胞將細胞壁以人為除去的原生質體。

本發明中的組織就係指有幾種具有不同性質或功能的細胞以一定的模式聚集的構造的單元，動物組織之例而言，包含上皮組織、結締組織、肌組織、神經組織等。植物組織之例而言，包含分生組織(meristem)、表皮組織、同化組織、葉肉組織、輸導組織、機械組織、軟組織、去分化的細胞塊(callus)等。

培養細胞或組織時，要培養的細胞或組織可由前述的細胞或組織任意選擇而進行培養。細胞或組織可由動物或植物體直接採取。細胞或組織是亦可加上特定的處理而由動物或植物體衍生、生長，或形質轉換後採取。此時，該處理可在活體內或在活體外。動物而言，例如可舉魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類、泛甲殼類、六脚類、哺乳類等。哺乳動物之例而言，並沒有限定，但可舉大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、松鼠、倉鼠、田鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨魚、狗、貓、山羊、牛、馬、羊、豬、象、狨猴(common marmoset)、松鼠猴、恆河獼猴(Macaca mulatta)，黑猩猩及人。植物而言，只要採取的細胞或組織可以液體培養時，則無特別的限定。例如，可舉生產生藥類(例如，皂素(saponin)、生物鹼類，小蘗鹼(berberine)，莨菪苷(scopolin)，植物固醇等)的植物(例如，藥用人參、日日春、天仙子(Hyoscyamus niger)、黃連、顛茄(Atropa belladonna)等)，及可成為生產化粧品、食品原料的色素及多醣體(例如，花青 素、紅花色素、茜草色素、番紅花色素、黃酮類等)的植物(例如，藍莓、紅花、西洋茜草、番紅花等)、或生產醫藥品原體的植物等，但不限定於此等。

本發明的細胞或組織的懸浮係指對培養容器而言，細胞或組織為不黏著的狀態(非黏著)。再者，在本發明中，將培養細胞或組織時，液體培養基組成物無來自外部的壓力或振動或在該組成物中無振盪、迴轉操作等，而細胞或組織係在該液體培養基組成物中分散均勻並且呈現懸浮狀態的狀態稱之為「懸浮靜置」，在該狀態下培養細胞或組織稱之為「懸浮靜置培養」。又，「懸浮靜置」中可使其懸浮的期間而言，包含5分鐘以上(例，至少要5至60分鐘)、1小時以上(例，1小時至24小時)、24小時以上(例，1日至21日)、48小時以上、7日以上等，但只要能保持懸浮狀態則不限定於這些期間。

本發明的培養基組成物是在可以維持或培養細胞或組織的溫度範圍(例如，0至40℃)的至少1點上，可以將細胞及/或組織加以懸浮靜置。本發明所用的培養基組成物是理想是在25至37℃的溫度範圍的至少1點上，最理想是在37℃，可以將細胞及/或組織加以懸浮靜置。

是否可懸浮靜置是例如，將培養對象的細胞，以2×10⁴cell/mL的濃度，在評估對象的培養基組成物中均勻分散，在15mL的錐形管中注入10mL，在37℃靜置至少5分鐘以上(例如，1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上)，觀察有無維持該細胞的懸浮狀態， 即可評估。全部細胞中的70%以上呈現懸浮狀態時，可結論有維持懸浮狀態。代替細胞，亦可換為聚苯乙烯珠粒(大小500至600μM，Polysciences Inc.製)而進行評估。

本發明的培養基組成物含有去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽。本發明的培養基組成物藉由含有去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽，而具備可將細胞或組織懸浮培養(理想是懸浮靜置培養)的特性(維持細胞或組織的懸浮狀態的效果)。

去醯基化結蘭膠是以1-3鍵結的葡萄糖、1-4鍵結的葡萄糖醛酸、1-4鍵結的葡萄糖及1-4鍵結的鼠李糖的4分子的糖作為構成單元的直鏈狀的高分子多醣類，由以下的通式(I)(此處，R₁、R₂均為氫原子，n是2以上的整數)表示的多醣類。但是R₁亦可含有甘油基，R₂亦可含有乙醯基，但乙醯基及甘油基的含有量理想是10%以下，較理想是1%以下。

去醯基化結蘭膠是以發酵培養基培養結蘭膠生產微生物，將在菌體外生產的黏膜物加以鹼處理，將與1-3鍵結的葡萄糖殘基鍵結的甘油基及乙醯基加以去醯基化後回收，經乾燥、粉碎等的步驟後，製成粉末狀，而可製造。精製方法而言，例如，液對液萃取、分級沈澱、 結晶化、各種的離子交換層析法、使用葡聚糖凝膠(sephadex-LH-20)等的凝膠過濾層析法，活性碳、氧膠等的吸附層析法或薄層層析法的活性物質的吸脫附處理、或使用逆相管柱的高效液體層析法等，可單獨或以任意的順序組合，或反復使用，即可除去不純物而精製。結蘭膠的生產微生物之例而言，不限定於此，但可舉鞘氨醇單孢菌(Sphingomonas elodea)及改變該微生物的基因的微生物。

去醯基化結蘭膠亦可使用經磷酸化者。該磷酸化是可以使用公知的手法實行。

通式(I)表示的化合物的相當於R₁及/或R₂的羥基，經C_1-3烷氧基，C_1-3烷磺醯基、葡萄糖或果糖等的單糖殘基、蔗糖、乳糖等的寡糖殘基，甘胺酸、精氨酸等的胺基酸殘基等取代的去醯基化結蘭膠的衍生物也可在本發明中使用。又，使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)等的交聯劑也可將去醯基化結蘭膠加以交聯。

鹽而言，可舉鋰、鈉、鉀等鹼金屬的鹽；鈣、鋇、鎂等鹼土金屬的鹽；鋁、鋅、銅、鐵等的鹽；銨鹽；四乙基銨、四丁基銨、甲基三丁基銨、鯨蠟基三甲基銨、苄基甲基己基癸基銨、膽鹼等四級銨鹽；吡啶、三乙基胺、二異丙基胺、乙醇胺、二乙醇胺、胺基丁三醇(tromethamine)、葡甲胺(meglumine)、普羅卡因、氯普羅卡因等有機胺的鹽；甘胺酸、丙胺酸，纈胺酸等的胺基酸的鹽；等。

去醯基化結蘭膠或其鹽的重量平均分子量 理想是10,000至50,000,000，較理想是100,000至20,000,000，更理想是1,000,000至10,000,000。該分子量例如，可由凝膠滲透層析法(GPC)換算聚三葡萄糖(pullulan)而測定。

去醯基化結蘭膠或其鹽可使用市售製品，例如，三晶股份公司製「KELCOGEL(CP KELCO公司的註冊商標)CG-LA」、三榮源F.F.I.股份公司製「KELCOGEL(CP Kelco公司的註冊商標)」等。

海藻酸是具有α 1-4鍵結的L-葡萄醣醛酸及β 1-4鍵結的D-甘露醣醛酸二者的醣醛酸係直鏈聚合的構造的多醣類。

海藻酸或其鹽是由海帶及裙帶菜所代表的褐藻類，對其海藻酸具有的羧基實施離子交換反應而可萃取、精製。由於藻體中的海藻酸是與鈣離子等多價陽離子形成不溶性的鹽，因而將其與鈉進行離子交換成為水溶性的海藻酸鈉，而萃取到藻體外。再對海藻酸鈉的水溶液添加酸，使不溶性的海藻酸凝固析出，將凝固析出的海藻酸單離，而可得精製的海藻酸。

鹽而言，可舉鋰、鈉、鉀等鹼金屬的鹽；鈣、鋇、鎂等鹼土金屬的鹽；鋁、鋅、銅、鐵等的鹽；銨鹽；四乙基銨、四丁基銨，甲基三丁基銨、鯨蠟基三甲基銨、苄基甲基己基癸基銨、膽鹼等四級銨鹽；吡啶、三乙基胺、二異丙基胺、乙醇胺、二乙醇胺、氨基丁三醇、葡甲胺、普羅卡因、氯普羅卡因等有機胺的鹽；甘胺酸、丙 胺酸、纈胺酸等胺基酸的鹽；等。在本發明中，由對水的溶解性的觀點上，使用海藻酸鈉為合適。

海藻酸或其鹽的重量平均分子量理想是300至50,000,000，較理想是500至10,000,000，更理想是1,000至5,000,000。該分子量例如，可由凝膠浸透層析法(GPC)換算聚三葡萄糖測定。

海藻酸或其鹽也可使用市售製品，例如，以下的製品。

喜美克股份有限公司(KIMICA CORPORATION)：Kmica Algin Series IL-2、IL-6、I-1、I-3、I-5、I-8、ULV-L3、ULV-L5、ULV-1、ULV-3、ULV-5、ULV-20、ULV-L3G、IL-6G、I-1G、I-3G、IL-6M、BL-2、BL-6、B-1、B-3、B-5、B-8、SKAT-ONE、SKAT-ULV

Algitex Series LL、L、M、H

龜甲萬百歐凱米發股份有限公司(KIKKOMAN BIOCHEMIFA COMPANY)：Duck Algin NSPH2R、NSPHR、NSPMR、NSPLR、NSPLLR三晶股份公司：Sukohgin、San Algin

北海道三井化學股份有限公司：海藻酸寡醣ALGIN

海藻酸是在二價金屬陽離子介質中維持無規則線圈狀態，且經由二價金屬離子能交聯的酸性多醣類。代替海藻酸或其鹽而使用在二價金屬陽離子介質中維 持無規則線圈狀態，並且經由二價金屬陽離子可交聯的海藻酸以外的酸性多醣類或其鹽，也可以期待會發揮與本發明的培養基組成物同樣的效果。在二價金屬陽離子介質中維持無規則線圈狀態，並且經由二價金屬陽離子能交聯的酸性多醣類而言，可舉海藻酸、果膠、果膠酸等。二價金屬陽離子而言，可舉鈣離子、鎂離子、鋇離子、銅離子、鐵離子、鋅離子、錫離子、鉛離子等。本發明也包含：代替海藻酸或其鹽，而使用在二價金屬陽離子介質中維持無規則線圈狀態，並且經由二價金屬陽離子而能交聯的海藻酸以外的酸性多醣類或其鹽的態樣。

去醯基化結蘭膠及海藻酸也可以成為由環內或環外異構化而生成的互變異構體、幾何異構體、互變異構體或幾何異構體的混合物，或該等混合物的形態而存在。去醯基化結蘭膠及海藻酸不論是否由異構化而生成，如具有不對稱中心時，可以成為經分割的光學異構體或含有此等任意比率的混合物的形態而存在。

去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽與液體培養基混合時，經由液體培養基中的金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集，而形成三維網格(不定型的構造體)。多醣類經由金屬陽離子而形成微凝膠是公知的事(例如，特開2004-129596號公報)，在前述不定型的構造體中，也包含該微凝膠為一種態樣。去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽是經由金屬陽離子而聚集者，做為其一態樣而可舉膜狀的構造體。本發明的培養基組成物是 含有此去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽，經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集而形成的三維網格(不定型的構造體)。在本發明的培養基組成物中，培養細胞或組織時，在培養基組成物中懸濁的細胞或組織是被此三維網格捕捉而不沈降，因而不需要振盪、迴轉操作等，即可以將細胞或組織在懸浮狀態均勻分散的狀態下，加以培養(懸浮靜置培養)。本發明的培養基組成物理想是包含前述三維網格(不定型的構造體)經均勻分散的態樣。

在理想的態樣中，上述三維網格(不定型的構造體)的形成實質上不提高本發明的培養基組成物的黏度。「實質上不提高培養基組成物的黏度」係指培養基組成物的黏度不超過8mPa．s的意思。此時該培養基組成物的黏度在37℃下為8mPa．s以下，理想是4mPa．s以下，較理想是2mPa．s以下。

培養基組成物的黏度例如由後述的實施例所述的方法可測定。具體而言在37℃條件下可使用E型黏度計(東機產業股份公司製，TV-22型黏度計，機種：TVE-22L，錐形轉子：標準轉子1°34’×R24，迴轉數100rpm)測定。

本發明的培養基組成物亦可含有「去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽」以外的多醣類或其鹽。該多醣類理想是具有陰離子性官能基的酸性多醣類。酸性多醣類就是只要構造中有陰離子性官能基則無特別的限 制，例如，含有醛酸(例如，葡萄醣醛酸、艾杜糖醛酸(iduronic acid)、半乳糖醛酸、甘露醣醛酸)的多醣類，構造中的一部分有硫酸根或磷酸根的多醣類，或具有該二者的構造的多醣類，不只是天然可得的多醣類，也包含由微生物產生的多醣類，由基因工程產生的多醣類，或使用酵素人工合成的多醣類。更具體而言，玻尿酸、天然結蘭膠、鼠李聚醣膠(rhamsan gum)、迪特膠(diutan gum)、黃原膠(xanthan gum)、鹿角菜膠(carrageenan)，三仙膠、己糖醛酸、褐藻糖膠(fucoidan)、果膠、果膠酸、果膠酯酸、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸類肝素(heparitin sulfate)、硫酸角質素(keratosulfate)、硫酸軟骨膠、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)、或該等的鹽。

本發明的培養基組成物中的去醯基化結蘭膠或其鹽的濃度是例如0.002至0.01(w/v)%，理想是0.002至0.009(w/v)%，較理想是0.003至0.009(w/v)%。

本發明的培養基組成物中的海藻酸或其鹽的濃度是例如，0.004至0.1(w/v)%，理想是0.004至0.02(w/v)%，較理想是0.004至0.015(w/v)%，更理想是0.005至0.015(w/v)%。

就確保充分使細胞或組織懸浮的作用的觀點上，去醯基化結蘭膠或其鹽的濃度理想是設定為0.002(w/v)%以上，0.003(w/v)%以上更為理想。另一方面，此濃度太高時，懸浮作用變強而細胞回收率降低，或培養基本身的操作性恐有降低，因而理想是設定為0.01(w/v)% 以下，更理想是0.009(w/v)%以下。就確保藉由剪切力可使維持細胞或組織的懸浮狀態的效果迅速消失的特性(維持細胞或組織的懸浮狀態的效果之對剪切力的脆弱性)的觀點上，海藻酸或其鹽的濃度，理想是設定為0.004(w/v)%以上，0.005(w/v)%以上更為理想。此濃度過高時恐有凝膠化，所以理想是設定為0.1(w/v)%以下，更理想是0.02(w/v)%以下，又更理想是設定為0.015(w/v)%以下。

本發明的培養基組成物中含有的去醯基化結蘭膠或其鹽，與海藻酸或其鹽的質量比就藉由剪切力達成使維持細胞或組織的懸浮狀態的效果迅速消失的特性的觀點上，相對於去醯基化結蘭膠或其鹽的1質量份，設定海藻酸或其鹽為1質量份以上，理想是2質量份以上。在一種態樣中，相對於去醯基化結蘭膠或其鹽的1質量份，設定海藻酸或其鹽為例如1至4質量份，理想是1至3質量份，較理想是1至2質量份。

又，培養基組成物中的化合物濃度可以由下式算出。

濃度[%(W/V)]=化合物的重量(g)/培養基組成物的容積(mL)×100

本發明的培養基組成物是藉由含有上述含有量的去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽，而可得到維持細胞或組織的懸浮狀態的效果。又，本發明的培養基組成物具備由含有上述含有量的去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽，而具有的維持細胞或組織的懸浮狀態的效 果，係藉由吸管吸取或過濾器過濾等的剪切力而迅速消失的特性(維持細胞或組織的懸浮狀態的效果對剪切力的脆弱性)。

本發明的培養基組成物包含去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集而形成的三維網格(不定型的構造體)，由此網格產生維持細胞或組織的懸浮狀態的效果，但由於含有海藻酸或其鹽，對螯合劑或剪切力三維網格變得脆弱，藉由吸管吸取或過濾器過濾等的剪切力，此三維網格容易破壞，維持細胞或組織的懸浮狀態的效果會迅速消失。去醯基化結蘭膠是具有較直線構造的構成單元，培養基組成物中有多數個的去醯基化結蘭膠鏈會鏈束(bundle)化，而形成緊密安定的三維網格，因而以螯合劑或吸管吸取或過濾器過濾等不容易破壞此三維網格；與此相對，咸認將含有α 1-4鍵結的L-葡萄糖醛酸及β 1-4鍵結的D-甘露醣醛酸二者的醣醛酸而具有較大體積構造的海藻酸，添加於培養基組成物中時，去醯基化結蘭膠的鏈束化受抑制，三維網格對吸管吸取或過濾器過濾等的剪切力會變得脆弱，但並非特別受此理論所限制。因此，本發明也可理解為：對去醯基化結蘭膠或其鹽，經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集而形成的培養基組成物中的三維網格(不定型的構造體)增進對剪切力的脆弱性的方法，該方法中包含在該培養基組成物中添加海藻酸或其鹽。

如上所述，去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻 酸或其鹽與液體培養基混合時，為了經由液體培養基中的金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集，而形成三維網格(不定型的構造體)，因而本發明的培養基組成物含有金屬陽離子，例如2價的金屬陽離子(鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子等)，理想是含有鈣離子。該金屬陽離子是例如可以鈣離子與鎂離子、鈣離子與鋅離子、鈣離子與鐵離子、鈣離子與銅離子之方式，將2種類以上組合而使用。本領域具通常知識者可以適宜決定其組合。本發明的培養基組成物中的金屬陽離子濃度是0.1mM至300mM，理想是0.5mM至100mM，但不限定於此等。該金屬陽離子是與培養基一起混合，或，亦可另外調製鹽溶液，而添加於培養基。

由吸管吸取或過濾器過濾等的剪切力，使維持細胞或組織的懸浮狀態的效果的消失是可逆反應。此係由於剪切力破壞的三維網格(不定型的構造體)的片段經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)再聚集，而會再生三維網格(不定型的構造體)之故。

本發明的培養基組成物是將培養細胞或組織時所用的培養基(理想是液體培養基)，及去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽混合即可調製。

培養動物(例如，哺乳動物)來源的細胞或組織時所用的培養基，例如可舉Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)、Ham’s Nutrient Mixture F12、DMEM/F12培養基、McCoy’s 5A medium、Eagle MEM培養基(Eagle’s Minimum Essential Medium，EMEM)、α MEM培養基(alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium，α MEM)、MEM培養基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基、IPL41培養基，Fischer’s培養基、StemPro34(Invitrogen公司製)、X-VIVO 10(Cambrex公司製)、X-VIVO 15(Cambrex公司製)、HPGM(Cambrex公司製)、StemSpan H3000(Stemcell Technology公司製)、StemSpanSFEM(Stemcell Technology公司製)、StemLine II(Sigma Aldrich公司製)、QBSF-60(Quality Biological公司製)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司製)、mTeSR1或2培養基(Stemcell Technology公司製)、Sf-900II(Invitrogen公司製)、Opti-Pro(Invitrogen公司製)，等。

細胞或組織是植物來源時，作為培養基可列舉如植物組織培養通常使用Murashige-Skoog(MS)培養基、Linsmaier-Skoog(LS)培養基、White培養基、Gamborg B5培養基、Niche培養基、Heller培養基、Morel培養基等的基本培養基，或，將該等培養基成分修正為最適濃度的修正培養基(例如，將氨態氮濃度減半等)，將植物生長激素(auxins)類及必要時將細胞分裂激素(cytokinins)類等的植物生長調節物質(植物激素)以適當的濃度添加的培養基。該等培養基，必要時可再補充酪蛋白分解酶、玉米浸液、維他命類等。植物生長激素類而言，例如，可舉3-吲哚乙酸(IAA)、3-吲哚酪酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯 氧乙酸(2,4-D)等，但不限定於此等。植物生長激素類例如，得以約0.1至約10ppm的濃度添加於培養基。細胞分裂激素類而言，例如，可舉細胞裂殖素(kinetin)、苄基腺嘌呤(benzyladenine，BA)、玉米素(zeatin)等，但不限定於這些。細胞分裂激素類例如，得以約0.1至約10ppm的濃度添加於培養基。

在上述的培養基中，亦可依本領域具通常知識者之目的自由添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維他命、抗生物質、血清、脂肪酸、糖等。培養動物來源的細胞及/或組織時，本領域具通常知識者視目的也可將其他的化學成分或活體成分的一種類以上組合而添加。在動物來源的細胞及/或組織的培養基中所添加的成分，可舉胎牛血清、人血清、馬血清、胰島素、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、單硫甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維他命、各種胺基酸、洋菜、瓊脂糖(agarose)、膠原蛋白、甲基纖維素、各種細胞介素(cytokine)、各種激素、各種增殖因子、各種細胞外基質及各種細胞黏著分子等。添加於培養基的細胞介素而言，例如可舉介白素-1(interleukin-1，IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)、介白素-7(IL-7)、介白素-8(IL-8)、介白素-9(IL-9)、介白素-10IL-10)、介白素-11(IL-11)、介白素-12IL-12)、介白素-13(IL-13)、介白素-14(IL-14)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素 -21(IL-21)、干擾素-α(interferon-α，IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、顆粒性白血球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、單核球群落刺激因子(monocyte colony stimulating factor，M-CSF)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage-colony stimulating factors，GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、f1k2/f1t3配位體(FL)、白血病細胞抑制因子(LIF)、制瘤素M(oncostatin M，OM)、紅血球生成素(erythropoietin，EPO)、促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)等，但並不限定於此等。

添加於培養基的激素而言，可舉褪黑激素、血清素、甲狀腺素、三碘甲腺胺酸、腎上腺素、去甲基腎上腺素、多巴胺，抗穆勒氏管激素、脂聯素、腎上腺皮質素、血管收縮素原及血管收縮素、抗利尿激素、心房鈉利尿性肽、抑鈣素、膽囊收縮素、促腎上腺皮質激素釋放激素、紅血球生成素、促濾泡素(follicle-stimulating hormone)、胃泌素、飢餓肽(ghrelin)、升糖素釋放激素、促性腺素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone)、生長激素釋放激素、人類絨毛膜激性腺素(human chorionic gonadotropin)、人胎盤生乳素、生長激素、抑制素、胰島素、似胰島素生長因子、瘦素、黄體生長激素、黑色素細胞刺激素、催產素、副甲狀腺素、泌乳素、分泌素、生長抑制素、促血小板生成素、甲狀腺刺激素、甲狀腺促素釋放激素、皮質醇、醛固醇、睪固酮、去氫差向雄甾酮 (dehydroepiandrosterone)、雄固烯二酮、二氫睪固酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黃體固酮、鈣化三醇、鈣化二醇、前列腺素、白三烯、前列腺環素、凝血脂素、泌乳素釋放激素、脂促素、腦鈉利尿肽、神經肽Y、組織胺、內皮素、胰臟聚肽、腎素、及腦啡肽，但並不限定於這些。

在培養基添加的增殖因子而言，可舉轉變生長因子-α(TGF-α)、轉變生長因子-β(TGF-β)、巨噬細胞炎症蛋白質-1 α(MIP-1 α)、上皮細胞增殖因子(EGF)、纖維母細胞增殖因子-1、2、3、4、5、6、7、8、或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神經細胞增殖因子(NGF)、肝細胞增殖因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶連接蛋白I、蛋白酶連接蛋白II、血小板衍生生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、膽鹼能分化因子(cholinergic differentiation factor、CDF)、趨化介素(chemokine)、Notch配位體(Delta 1等)、Wnt蛋白質，類血管生成素蛋白質2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、類胰島素生長因子(IGF)、類胰島素生長因子結合蛋白質(IGFBP)、多效生長因子(Pleiotrophin)等，但並不限定於這些。

又，也可添加藉由基因重組技術將該等細胞介素或增殖因子的胺基酸序列加以人為改變者。其例而言，可舉IL-6/可溶性IL-6受體複合體或Hyper IL-6(IL-6及可溶性IL-6受體的融合蛋白質)等。

各種細胞外基質或各種細胞黏著分子之例 而言，可舉膠原蛋白I至XIX、纖網蛋白(fibronectin)、玻璃黏連蛋白(vitronectin)、層連結蛋白-1至12、巢蛋白(nidogen)、生腱蛋白(tenascin)、凝血栓蛋白(thrombospondin)、馮威里氏(von Willebrand)因子、骨橋蛋白(osteopontin)、纖維蛋白原、各種彈性蛋白、各種蛋白多醣、各種鈣黏蛋白、橋粒膠蛋白(desmocollin)、橋粒芯蛋白(desmoglein)、各種整聯蛋白(integrin)、E-選滯蛋白、P-選滯蛋白、L-選滯蛋白、免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily,IgSF)、基底膜基質(matrigel)、聚-D-離胺酸、聚-L-離胺酸，幾丁質、幾丁聚醣、瓊脂糖(sepharose)，玻尿酸，海藻酸凝膠，各種水凝膠，還有這些的切斷片段等。

在培養基添加的抗生物質之例而言，可舉硫胺劑、青黴素、苯氧乙基青黴素(phenethicillin)、甲氧苯青黴素(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、氯噻青黴素(cloxacillin)、二氯噻青黴素、氟氯噻青黴素(flucloxacillin)、奈夫西林(nafcillin)、安比西林(ampicillin)、青黴素、阿莫西林(amoxicillin)、環西林(cyclacillin)、卡本西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、哌拉西林(piperacillin)、阿洛西林(azlocillin)、美洛西林(mezlocillin)，美西林(mecillinam)、阿德諾西林(amdinocillin)，頭孢菌素(cephalosporin)及其衍生物、歐索林酸(oxolinic acid)、氨氟哌酸(amifloxacin)、替馬沙星(temafloxacin)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、吡咯米酸(piromidic acid)、環丙氟哌酸(ciprofloxacin)、西諾沙星 (cinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、羅索沙星(rosoxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、匹培咪迪酸(pipemidic acid)、舒呱酮(sulbactam)、鎖瑚菌酸(clavulanic acid)、β-溴青黴烷酸(β-bromopenicillanic acid)、β-氯青黴烷酸、6-乙醯亞甲基-青黴烷酸、頭孢噁唑(cephoxazol)、舒他西林(sultampicillin)、氨卓西林(adinocillin)及舒呱酮的甲醛水合物酯(aldehyde hydrate ester)、他唑巴坦(tazobactam)、氨曲南(aztreonam)、磺胺澤辛(sulfazecin)、異磺胺澤辛、諾卡殺菌素(nocardicin)、m-羧基苯基(m-carboxyphenyl)、苯基乙醯胺膦酸甲酯(methyl phenylacetoamidephosphonate)、氯四環素(chlorotetracycline)、氧四環素(oxytetracycline)、四環素(tetracycline)、去甲基氯四環素(demeclocycline)、多喜黴素(doxycycline)、美他環素(methacycline)，以及米諾四環素(minocycline)。

理想態樣中的培養基(理想是液體培養基)是含有金屬陽離子(例如2價金屬陽離子(鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子等)，理想是鈣離子)。因為與液體培養基混合時，去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽是經由液體培養基中的金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集，而形成三維網格(不定型的構造體)。培養基中的金屬陽離子(理想是鈣離子)濃度只要是去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽，可經由該金屬陽離子聚集，而形成三維網格(不定型的構造體)之足夠濃度，即無特別 的限制，例如，0.1mM至300mM，理想是0.5mM至100mM。可將該含有金屬陽離子的培養基與去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽混合，亦可將不含該金屬陽離子的培養基，與去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽混合，之後，將另外調製的含有該金屬陽離子的水溶液添加於混合液。

將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽添加於上述的培養基時，先以適當的溶媒，將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽溶解或分散(將此做為培養基添加劑)。之後，培養基組成物中最後的去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的濃度是將該培養基添加劑添加於培養基中，使其成為如上詳述的濃度即可。亦可將含有去醯基化結蘭膠或其鹽的培養基添加劑，及含有海藻酸或其鹽的培養基添加劑個別調製，將其分別添加於培養基中，亦可調製含有去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽二者的培養基添加劑(即，調製去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的混合物)，將其添加於培養基中。理想是調製含有去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽二者的培養基添加劑(即，去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的混合物)，將其添加於培養基中。

在此處，用於調製培養基添加劑的適當的溶媒之例，可舉水、二甲基亞碸(DMSO)、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、甘油、丙二醇、丁二醇等各種醇等的水性溶媒，但並不限定於這些。此時，培養基添加劑中的去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的濃度是如上詳述的培養基組 成物中的最後濃度的例如10至500倍，理想是設定為25至100倍左右的濃度為理想。

去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽是必要時亦可實施滅菌處理。滅菌方法並無特別的限制，例如，可舉放射線滅菌、環氧乙烷氣滅菌、高壓蒸氣滅菌(高壓釜滅菌)、過濾器滅菌等。在實施過濾器滅菌(以下，有時稱為過濾滅菌)時的過濾器部分的材質是無特別的限制，例如，可舉玻璃纖維、尼龍、PES(聚醚碸)、親水性PVDF(聚氟亞乙烯)、纖維素混合酯、纖維素乙酸酯、聚四氟乙烯等。過濾器的細孔的大小並無特別的限制，但理想是0.1μm至10μm，較理想是0.1μm至1μm，最理想是0.1μm至0.5μm。該等滅菌處理是去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽是以固體的狀態實施也可以，以溶液的狀態實施也可以。

在高壓蒸氣滅菌處理中的溫度通常是105至135℃，理想是115℃至130℃、較理想是118至123℃(例，121±1℃)。滅菌處理時的壓力通常是0.12至0.32MPa，理想是0.17至0.27MPa，較理想是0.19至0.23MPa(例，0.21±0.1MPa)。滅菌處理時間通常是1至60分鐘，理想是5至45分鐘，較理想是15至25分鐘(例，20±1分鐘)。

高壓蒸氣滅菌處理條件的組合是例如，105至135℃，0.12至0.32MPa，1至60分鐘；理想是115℃至130℃，0.17至0.27MPa，5至45分鐘； 較理想是118至123℃(例，121±℃，0.19至0.23MPa(例，0.21±0.1MPa)，15至25分鐘(例，20±1分鐘)。

藉由將上述調製之去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的溶液或分散液添加於液體培養基，而在液體培養基中，去乙醯化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集，而形成三維網格(不定型的構造體)，即可得本發明的培養基組成物。在培養基中通常是含有使去醯基化結蘭膠或其鹽，及海藻酸或其鹽足以聚集而形成三維網格(不定型的構造體)的充分濃度的金屬陽離子(例如，鈣離子)，因而只將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽或分散液添加於液體培養基，即可得本發明的培養基組成物。或，亦可在本發明的培養基添加劑(去醯基化結蘭膠或其鹽，及海藻酸或其鹽的溶液或分散液)中添加培養基。再者，本發明的培養基組成物亦可將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽及培養基成分(粉末培養基或濃縮培養基)，在水性溶媒(例如含有離子交換水或超純水等之水)中混合而調製。混合的態樣而言，可舉(1)將液體培養基及培養基添加劑(溶液)混合，(2)在液體培養基中添加去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的固體(粉末等)，(3)在培養基添加劑(溶液)中混合粉末培養基，(4)將粉末培養基及去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的固體(粉末等)及水性溶媒混合等，但不限定於這些。為了防止培養基組成物中去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的分布不均勻，而以(1)的態樣為理 想。

將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽溶解於溶媒(例，水、液體培養基等的水性溶媒)，或，將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽，以及粉末培養基溶解於溶媒時，為了促進溶解之，亦可將該混合液加熱。加熱的溫度而言，例如可舉80℃至130℃，理想是可加熱滅菌的100℃至125℃(例，121℃)。加熱後，將所得的去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的溶液冷卻至室溫。在該溶液中，藉由添加上述的金屬陽離子(例，鈣離子等2價金屬陽離子)(例如，將該溶液添加於液體培養基)，則去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集，形成三維網格(不定型的構造體)，而可得本發明的培養基組成物。或，將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽，溶解於含有上述金屬陽離子(例，鈣離子等2價金屬陽離子)的溶媒(例，水、液體培養基等的水性溶媒)時，藉由加熱(例如80℃至130℃，理想是100℃至125℃(例，121℃))，並將所得的溶液冷卻至室溫，去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽也可經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集，而形成三維網格(不定型的構造體)。

又，去醯基化結蘭膠或其鹽由於具有較直線性構造的構成單元，添加於溶媒(例，水)中時，多數個的糖鏈會鏈束化，因而不容易溶解，但在其中添加海藻酸或其鹽，則由於含有α 1-4鍵結的L-葡萄糖醛酸及β 1-4 鍵結的D-甘露醣醛酸二者的醣醛酸而具有較大體積構造之故，去醯基化結蘭膠或其鹽的鏈束化受抑制，而比較容易溶解。因此，去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽不需要加熱而在較低溫(例如0至37℃，理想是10至30℃)即可溶解於溶媒(例，水、液體培養基等的水性溶媒)。

下面例示本發明的培養基組成物的製造方法，但並不受這些的限定。

將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽添加於離子交換水或超純水。然後，將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽在可溶解的溫度(例如，5至60℃、理想是5至40℃，更理想是10至30℃)攪拌溶解至呈透明的狀態。

溶解後，必要時在攪拌下放冷，實施滅菌(例如，在121℃下20分鐘的高壓釜滅菌，過濾器過濾)。將靜置培養使用的任意的培養基在攪拌(例如，均質混合機等)下，在該培養基添加前述滅菌後的水溶液，與該培養基混合均勻。本水溶液與培養基的混合方法並無特別的限制，例如可舉吸管吸取等的手動混合，使用電磁攪拌器或機械攪拌器，均質混合機，均質機等的機器混合。

為使去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽均勻分散於液體培養基中，例如，在錐形管內放入液體培養基，以漩渦攪拌機(Voltex)等維持攪拌狀態，由裝配注射針的注射筒，將去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的水溶液用力射入於液體培養基中。使用培養基作成套件 (日產化學工業FCeM^TM-series Preparation Kit)，而可容易調製，去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集而形成的三維網格(不定型的構造體)是均勻分散的本發明的培養基組成物。

混合後，亦可將本發明的培養基組成物以過濾器過濾。過濾處理時所用的過濾器的細孔的大小是5μm至100μm，理想是5μm至70μm，較理想是10μm至70μm。

細胞或組織的培養方法

本發明是提供一種細胞或組織的培養方法，其係包含在上述本發明的培養基組成物中培養細胞或組織。再者，本發明也提供藉由該本發明的培養方法等所得的本發明的培養基組成物，及含有細胞或組織的培養調製物。培養調製物就是指由培養細胞或組織所得的結果物，其係含有細胞或組織、培養基(培養基組成物)，視情況也含有細胞分泌性成分等。

本發明的培養基組成物由於含有去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集而形成的三維網格(不定塑的構造體)，因而在本發明的培養基組成物中培養細胞或組織時，在培養基組成物中懸濁的細胞或組織會被此三維網格捕捉而不會沈降，故不需要振盪、迴轉操作等，而可將細胞或組織以分散均勻的懸浮狀態培養(懸浮靜置培養)。因 此，本發明的培養方法可以成為將細胞或組織懸浮培養(理想是浮遊靜置培養)的方法。

如上述，由吸管吸取或過濾器過濾等的剪切力使維持細胞或組織的懸浮狀態的效果消失是可逆性反應，所以在懸浮培養開始時，將細胞或組織在本發明的培養基組成物中懸浮時，即使由吸管吸取或攪拌等的剪切力，去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)聚集而形成的三維網格(不定型的構造體)被破壞，但如將其靜置，則隨時間的經過，被破壞的三維網格(不定型的構造體)的片段，經由金屬陽離子(例如，鈣離子等二價金屬陽離子)再度聚集，而再生成三維網格(不定型的構造體)，再度呈現維持細胞或組織的懸浮狀態的效果，而可以將分散的細胞或組織繼續懸浮靜置培養。

在懸浮靜置培養中使細胞或組織懸浮的期間而言，包含5分鐘以上(例，至少5至60分鐘)、1小時以上(例，1小時至24小時)、24小時以上(例，1日至21日)、48小時以上、7日以上等，只要能保持懸浮狀態則不受上述期間所限定。

在本發明的培養基組成物中培養細胞或組織時，在本發明的培養基組成物添加另外調製的細胞或組織，均勻分散而混合即可。此時的混合方法並無特別的限制，例如可舉吸管吸取等的手動混合，使用攪拌器(stirrer)、漩渦混合器(voltex mixer)、微盤混合器(microplate mixer)、振盪機(shaker)等的機器混合。混合後亦可將培養液置於靜置狀態，亦可必要時將培養液旋轉，振盪或攪拌。其迴轉數及頻率是配合本領域具通常知識者的目的而適宜設定即可。

在靜置培養的期間有必要更換培養基組成物時，實施離心或過濾處理而將細胞或組織與培養基組成物分離，回收細胞或組織後，將新鮮的本發明的培養基組成物添加於回收的細胞或組織即可。或，實施離心或過濾處理而將細胞或組織適宜濃縮後，添加新的培養基組成物於此濃縮液即可。例如，離心時的重力加速度(G)是10至400G，實施過濾處理時所用的過濾器的細孔的大小是10μm至100μm，但並不受這些的限制。又，使用表面上塗有與目的細胞特異性結合的抗體的磁性微粒子，藉由磁力將培養的細胞及/或組織分離。這樣的磁性微粒子之例而言，可舉Dynabeads(Veritas公司製)、MACS Microbeads(Miltenyi Biotec公司製)、BioMag(Technochemical公司製)等。細胞或組織的回收亦可使用後述的本發明的細胞或組織的回收方法。本發明的培養基組成物是去醯基化結蘭膠或其鹽之外，另含有海藻酸或其鹽，因而具有維持細胞或組織的懸浮狀態的效果，以及必要時藉由添加螯合劑，以吸管吸取或過濾器過濾等加上剪切力而使此效果迅速消失的特性。因此，使用本發明的培養基組成物時，將細胞或組織懸浮培養(理想是懸浮靜置培養)，藉由離心分離操作而由所得之培養調製物以高收率回收細胞，在抑制細胞的 損失下，能以高效率繼代。

培養細胞或組織時的溫度，對動物細胞時通常是25至39℃，理想是33至39℃。CO₂濃度通常是在培養的環境中，4至10體積%，4至6體積%為理想。培養期間通常是3至35日，但配合培養的目的而自由設定即可。對植物細胞的培養溫度通常是20至30℃、如需要光時則在照度2000至8000lux的照度條件下培養即可。培養期間通常是3至70日，但配合培養的目的自由設定即可。

在本發明的培養方法中，可使用在細胞或組織培養一般使用的培養板(shale)、燒瓶(flask)、塑膠袋(plastic bag)、鐵氟龍(Teflon，註冊商標)袋、盤(dish)、培養皿(Petri dish)、組織培養用盤(tissue culture dish)、多孔盤(multi dish)、微小盤(microplate)、微孔盤(microwell plate)、多孔盤(multi plate)、多孔盤(multiwell plate)、多孔片(chamber slide)、管、盤(tray)、培養袋(culture bag)、轉瓶(roller bottle)等的培養器材。

細胞及/或組織的培養是在機械性控制的封閉環境下自動實行細胞播種、更換培養基、取得細胞影像、培養細胞回收，在控制pH、溫度、氧濃度等之下，也可使用可高密度培養的生物反應器或自動培養裝置進行。於使用這些裝置培養的中途補給新的培養基，做為將所求的物質無過多亦無不足地供給細胞及/或組織的手法，有加料分批培養(fed-batch culture or semi-batch culture)、連續培養(continuous culture)及灌注培養(perfusion culture)，但任一 手法都可在本發明中的培養方法中使用。

在本發明中，培養的細胞或組織的形態或狀態本領域具通常知識者可任意選擇。其理想的具體例而言，並無特別限制，但可舉細胞或組織以單獨分散於培養基組成物中的狀態、細胞或組織接著在載體表面上的狀態、細胞或組織包埋在載體內部的狀態、多數個的細胞聚集而形成細胞塊(球)的狀態、或2種以上的細胞聚集而形成細胞塊(球)的狀態等。這些狀態中，形成細胞塊(球)的狀態由於有再構築接近活體內環境的細胞-細胞間相互作用及細胞構造體，在維持細胞功能下可以長期培養，又細胞的回收較容易之故，可舉此為本發明中，培養方法的理想態樣。

將細胞或組織承載在表面上的載體而言，可舉由種種的高分子所構成的微載體及玻璃珠、陶瓷珠等。該載體的直徑是由數十μm至數百μm，較理想是由100μm至200μm，其比重是接近1為理想，較理想是0.9至1.2，特別理想是約1.0。將細胞或組織承載在表面上的載體是由於使用本發明的培養基組成物，不實施振盪等的操作而可分散均勻，因而可在不損失作為目的之細胞或組織的細胞功能下進行培養。由本發明的方法培養的細胞或組織是在培養後在承載於載體上的狀態下藉由實施離心或過濾處理而可回收。由本方法培養的細胞或組織是可使用各種螯合劑、熱處理或酵素，使其由載體剝離而回收。

將細胞或組織包埋在載體內部時，可選擇 由種種高分子所構成的材料作為載體。將細胞或組織包埋的載體由於使用本發明的培養基組成物即可不實施攪拌等的操作而可分散均勻，可在不損失其細胞功能下培養作為目的之細胞或組織。由本發明的方法培養的細胞及/或組織是在培養後可在載體包埋的狀態下，實施離心或過濾處理而回收。由本方法培養的細胞或組織是可使用各種螯合劑、熱或酵素等的處理，將載體分解使其分散而回收。

形成細胞凝集塊(球)的方法並無特別的限制，本領域具通常知識者可適宜選擇。其例而言，可舉使用有細胞非接著性表面的容器的方法、懸滴法(hannging drop method)、旋轉培養法、3維支架法(3D scaffolding method)、離心法、使用藉由電場或磁場凝集的方法等。使用本發明的培養基組成物也可形成球。例如，在本發明的培養基組成物中將作為目的之細胞以單一細胞的狀態分散均勻，靜置而培養3日至10日，使其增殖而可調製該細胞的球。球是可將其原狀在本發明的培養基組成物中繼續懸浮靜置培養10日以上，理想是13日以上，更理想是30日以上的期間可保持增殖能力，但在懸浮靜置培養中定期的實行機械性的分割，或再實施單一細胞化處理及凝集，而實質上可無期限保持增殖能力。由於使用本發明的培養基組成物，則不實施振盪等的操作而在培養液中可均勻分散，因而可將作為目的之細胞在不損失其細胞功能之下培養成球。

由於本發明的培養基組成物具有使細胞或 組織懸浮的效果，因而使用本發明的培養基組成物時，與單層培養相比，可增加每一定體積中的細胞或組織量而培養之。又，在以往的需要迴轉或振盪操作的懸浮培養中，對細胞或組織有剪切力作用之故，細胞或組織的增殖率或回收率低，或細胞的功能有受損傷的情況，但使用本發明的培養基組成物時，不需要實施振盪等的操作也可將細胞或組織在該培養基組成物中均勻分散之故，可不損失細胞功能且容易的大量取得作為目的之細胞或組織。又，在以往的凝膠狀的培養基中懸浮培養細胞或組織時，細胞或組織的觀察或回收有困難，或在回收時有損傷其功能的情況，但使用本發明的培養基組成物，則可將細胞或組織懸浮培養，且在不損失其功能下觀察或回收。又，凝膠狀的培養基有黏度高而更換培養基困難的情況，但本發明的培養基組成物因低黏度之故，可使用吸管或幫浦等而容易更換培養基。

又，本發明的培養基組成物是除了去醯基化結蘭膠或其鹽之外，另含有預定量的海藻酸或其鹽。由於此海藻酸或其鹽會抑制去醯基化結蘭膠的鏈束化，因而使用本發明的培養基組成物時，與使用不含海藻酸或其鹽而含有去醯基化結蘭膠或其鹽的對照懸浮培養用培養基組成物相較時，在靜置培養時同等的維持細胞或組織的懸浮特性，而在必要時添加螯合劑狀態下，藉由加上剪切力的操作，其特性迅速消失，因而離心分離操作時的細胞回收率會飛躍性地提高，可使繼代時的細胞損失最小化。

再者，使用本發明的培養方法時，由於可使細胞或組織有效率地增殖，因而本發明的培養基組成物是可作為細胞的研究用試藥而使用。例如，在解明調節細胞或組織的分化或增殖的因子時，要解析將細胞與目的之因子共存下培養時，細胞數或種類、細胞表面分化指標或表現基因的變化，在這時藉由使用本發明的培養基組成物則不只可作為有效率的放大解析對象的細胞數，還可有效率地回收。

細胞或組織的單離方法

本發明提供上述本發明的培養基組成物、及由含有細胞或組織或細胞或組織的培養調製物，將該細胞或組織有效率的單離的方法。本發明的單離方法其特徵是對該培養調製物加上剪切力。

如上述，在本發明的培養基組成物中，由於去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽經由金屬陽離子(例如，鈣等二價金屬陽離子)聚集，而形成三維網格(不定型的構造體)，在本發明的培養基組成物中培養細胞或組織時，在培養基組成物中懸濁的細胞或組織會被此三維網格捕捉，而不沈降之故，因而不需要振盪、迴轉操作等，即可將細胞或組織以懸浮狀態分散均勻的原狀進行培養(懸浮靜置培養)。另一方面，此三維網格由於含有海藻酸或其鹽，對剪切力脆弱，對含有本發明的培養基組成物及細胞或組織的，細胞或組織的培養調製物，必要時添加螯合劑，而加上足於破壞此三維網格的剪切力時，可迅速使基於此 三維網格的維持細胞或組織的懸浮的特性消失，而細胞或組織藉由重力容易沈降。在這樣的狀態下，將該培養調製物進行離心分離時，所含的細胞或組織容易沈降，藉由除去上清的培養基組成物，而可將該細胞或組織單離。

對培養調製物加上剪切力的操作是只要能破壞去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽經由金屬陽離子(例如，鈣離子的二價金屬陽離子)聚集而形成的三維網格(不定型的構造體)，則無特別限定，但例如，可舉吸管吸取、過濾器過濾、攪拌、超音波等。

為了對培養調製物加上足夠的剪切力，而使用尖端較細的吸管(尖端的內徑是例如5mm以下，理想是0.1至3.0mm，較理想是0.5至2.0mm)，實施吸管吸取為理想。

又，為了將培養調製物全體迅速地攪拌，將培養調製物的體積以例如1%以上，理想是10%以上，較理想是20%以上，更理想是30%以上，再更理想是50%以上，1次吸入及排出為理想。

為了要對培養調製物加上足夠的剪切力，例如，以1mL/秒以上，理想是2至20mL/秒，較理想是5至10mL/秒的流速，實施吸入及/或排出的操作為理想。

吸管吸取的次數只要足以破壞上述三維網格，則沒有特別的限制，通常是連續實施1次以上，理想是3次以上，較理想是5次以上。由於吸管吸取次數越多，上述三維網格越可確實被破壞，因而越理想，理論上並無 其上限，但吸管吸取次數過多時，細胞或組織的生存率會降低，所以通常是設定為50次以下，理想是20次以下，較理想是15次以下。吸管吸取的次數是通常1至50次，理想是3至20次，較理想是5至15次。

過濾器的細孔的大小(孔徑)只要是可破壞上述三維網格的範圍則沒有特別的限制，通常是500μm以下，理想是200μm以下，較理想是100μm以下。孔徑越小，對培養調製物有越強的剪切力作用，可將上述三維網格越確實加以破壞，但太小則培養基組成物不容易通過過濾器。因此之故，過濾器的細孔的大小(孔徑)通常是5μm以上，理想是10μm以上，較理想是20μm以上，更理想是40μm以上。

過濾器的孔徑是以培養調製物中的細胞或組織可以通過的大小為理想。在此處，「細胞或組織可以通過的大小」就是指在維持生存下，能使細胞或組織通過的大小的意思。例如，過濾器的孔徑不只是比培養對象的細胞或組織的直徑較大之情況，培養調製物中的細胞塊、球或組織，藉由通過比其直徑更小孔徑的過濾器，而在維持生存下，分級成為多數的細胞、細胞塊、球或組織的態樣，也包含在「細胞或組織可以通過的大小」。細胞的大小是因細胞的種類而定因而不能一概而規定，但如是直徑7.5至20μm左右的一般性的細胞時，在單一細胞的狀態下，以20μm以上，理想是40μm的孔徑的過濾器可在維持良好的生存性下容易通過。因此，在維持細胞或組織的良好的 生存性下，由將上述三維網格有效率的破壞的觀點上，過濾膜的孔徑是例如理想是設定在20至200μm，40至100μm的範圍內較為理想。

過濾器的材料而言，可舉聚乙烯、聚丙烯、聚醯胺(尼龍)、聚碸、聚丙烯、壓克力、聚乳酸、纖維素混合酯、聚碳酸酯、聚酯，玻璃等、但無特別的限定。因材料而其極性、帶電性、親水性等的性能有差異，但這些性能與回收率的相關性不高，使用任一種材料時也可期待有良好的回收率。聚醯胺(尼龍)、聚乙烯、聚酯、玻璃等由入手容易性等的觀點為理想。

這些過濾器亦可使用市售商品，其具體例而言，可舉Partec公司製CellTrics過濾器(商標)：孔徑5μm(型號06-04-004-2323)、10μm(型號06-04-004-2324)、20μm(型號06-04-004-2325)、30μm(型號06-04-004-2326)、50μm(型號06-04-004-2327)、100μm(型號06-04-004-2328)及150μm(型號06-04-004-2329)、Beckton Dickinson公司製Cell Strainer(商標)：孔徑40μm(型號352340)、70μm(型號352350)及100μm(型號352360)、As One公司製Filcon S(商標)：孔徑20μm(型號2-7211-01)、30μm(型號2-7211-02)、50μm(型號2-7211-03)、70μm(型號2-7211-04)、100μm(型號2-7211-05)及200μm(型號2-7211-06)等。

通過過濾器次數是1次也可以，但必要時，通過過濾器多次，可提高細胞或組織的回收率。通過過濾 器的次數是通常1至10次。

通過過濾器多次時，將細胞或組織的培養調製物通過1片過濾器，將通過的懸濁液回收的操作實施多次也可以，將細胞或組織的培養調製物通過含有重疊多片(例如，3至5片)的過濾膜的多重過濾器也可以。由操作效率的觀點，使用多重過濾器較為有利。多次通過過濾器時，使用同一孔徑的多數個的過濾器也可以，將不同孔徑的多數個的過濾器組合而使用也可以。理想是將同一孔徑(例如40至100μm)的過濾器多數個(例如，3至5片)重疊而使用。

攪拌操作而言，可舉漩渦攪拌器(Voltex)、反轉混和、電磁攪拌器、槳式攪拌器(paddle)等。漩渦混合器的速度是例如，200至3,000rpm。

對培養調製物加上剪切力時，必要時亦可在該培養調製物中添加螯合劑。由於添加螯合劑，由培養基組成物中所含的上述三維網格除去金屬陽離子(理想是鈣離子、鎂離子等2價金屬陽離子)，經由該三維網格中的金屬陽離子的多醣類(去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽)間的結合鬆開，該三維網格部分性破壞，而可期待細胞或組織的回收率的提高。

螯合劑而言，只要是與鈣離子、鎂離子等2價金屬陽離子(理想是鈣離子)可以形成錯合物的化合物，則無特別的限制，例如，可舉檸檬酸或其鹽(例，檸檬酸3鈉)；EDTA或其鹽(例，EDTA2Na、EDTA3Na、EDTA4Na 等的依地酸鈉鹽(sodium edetate))、HEDTA3Na等的羥乙基乙二胺三乙酸鹽；EGTA或其鹽；噴替酸鹽(pentetate，二乙三胺五乙酸鹽)；植酸；艾提壯酸(etidronic acid)等的膦酸及其鈉鹽等的鹽類；草酸鈉；聚天門冬酸、聚麩胺酸等的聚胺基酸類；聚磷酸鈉；偏磷酸鈉；磷酸；丙胺酸；二羥乙基甘胺酸；葡萄糖酸；抗壞血酸；琥珀酸；酒石酸等。在提高細胞或組織的回收率的觀點上，檸檬酸或其鹽(例，檸檬酸3鈉)或EDTA或其鹽(例，EDTA2Na、EDTA3Na、EDTA4Na等的依地酸鈉鹽)為理想。螯合劑是將2種以上混合使用也可以。螯合劑的組合而言，沒有特別的限定，但例如，可舉檸檬酸或其鹽(例，檸檬酸3鈉)，EDTA或其鹽(例，EDTA2Na、EDTA3Na、EDTA4Na等的依地酸鈉鹽)的組合。

螯合劑的添加量是能使本發明的培養基組成物所含有的上述三維網格中，經由金屬陽離子的多醣類(去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽)間的結合鬆開的量。

例如，檸檬酸或其鹽(例，檸檬酸3鈉)時，通常是剛添加後的終濃度是0.001w/v%以上，理想是0.005w/v%以上。理論上的上限值是檸檬酸或其鹽的飽和濃度，但濃度過高時對細胞或組織的生存性恐有影響之故，通常是0.2w/v%以下，較理想是0.1w/v%以下。

又，EDTA或其鹽(例，EDTA2Na、EDTA3Na、EDTA4Na、等的依地酸鈉鹽)之情況，通常是剛添加後的終濃度是 0.001w/v%以上，理想是0.005w/v%以上。理論上的上限值是EDTA或其鹽的飽和濃度，但濃度過高時對細胞或組織的生存恐有影響之故，通常是0.2w/v%以下，較理想是0.1w/v%以下。

對前述培養調製物，在添加螯合劑後，為使螯合劑均勻而對上述的培養調製物實施加上剪切力的操作，而給予充分攪拌為理想。

上述的前處理步驟之後，將所得的含有細胞或組織的混合物進行離心分離，使細胞或組織沈澱，除去細胞或組織以外的部分(例如，本發明的培養基組成物的上清液)，最後由細胞或組織的培養調製物，可單離細胞或組織。藉由離心分離使細胞或組織沈澱的技術是本領域具通常知識者所周知，視細胞或組織的種類，只要是本領域具通常知識者應可設定適當的條件。一般以10至400G左右的離心力實施離心分離，使細胞或組織沈澱，即可與上清液分離。

如上述，藉由吸管吸取或過濾器過濾等的剪切力而導致的維持細胞或組織的懸浮狀態效果的消失是可逆反應，因而上述的前處理步驟之後，以在三維網格(不定型的構造體)再生之前，進行離心分離為理想。例如，上述前處理步驟完成後，在60分鐘以內，理想是在30分鐘以內，較理想是10分以內，開始離心分離。

用於單離細胞或組織的試藥(套組)

又，本發明也提供一種試藥(套組)，其係包含上述過 濾器，及用於由含有上述本發明的培養基組成物及細胞或組織的，細胞或組織的培養調製物，單離該細胞或組織。

本發明的試藥亦可再含有上述螯合劑。

使用本發明的試藥，實施上述本發明的單離方法，可由含有上述本發明的培養基組成物，及細胞或組織的，細胞或組織的培養調製物，容易地將該細胞或組織單離。各用語的定義是如上述的「細胞或組織的單離方法」項目所述。

本發明的試藥是可再含有用於調製上述本發明的培養基組成物的去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽的組合。由使用如此態樣的本發明的試藥，使用者可使用去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽，而調製上述本發明的培養基組成物，在該培養基組成物中將所欲的細胞或組織浮遊培養，由所得的細胞或組織的培養調製物，以上述本發明的單離方法可單離細胞或組織。

去醯基化結蘭膠或其鹽及海藻酸或其鹽是可以單離的化合物或水溶液而包含在本發明的試藥中，以上述本發明的培養基組成物的態樣，包含在本發明的試藥中也可以。

在下面將本發明的培養基組成物的實施例具體說明，以將本發明更詳細說明，但本發明並不受這些所限定。

[實施例]

[試驗例1]多醣混合液的製作

在玻璃製培養基瓶加入1質量份或2質量份的海藻酸鈉(ALG)及99質量份或98質量份的精製水，實施高壓釜滅菌處理(121℃、20分鐘)，而製作1質量%濃度或2質量%濃度的ALG水溶液。

以同樣方法製作1質量%濃度及2質量%濃度的去醯基化結蘭膠(DAG)(KELCOGEL CG-LA、三晶股份公司製)水溶液。

將預定量的ALG水溶液及DAG水溶液分取至微管，使用裝配注射針的拋棄式注射筒細心地進行吸管吸取混合使均勻化，而製作多醣混合液。

[試驗例2]培養基組成物的製作

(1)使用漩渦混合器的培養基組成物的製作

在錐形管(住友Bakelite 15mL、50mL、或225mL-離心沉澱管)分注預定量的培養基，在開放下以漩渦混合器使成為攪拌狀態。於其中以裝配有注射針(Fuchigami器械公司FN5200)並裝填預定量多醣類混合液的拋棄式注射筒(Terumo公司Terumo注射筒)，用力將多醣混合液添加於培養基而製作培養基組成物。

(2)使用培養基製作套組(日產化學工業FCeM^TM-series Preparation Kit)的培養基組成物的製作

在錐形管(住友Bakelite公司50mL-離心沉澱管)分注預定量的培養基，並裝配為套組構成品的接頭帽(adapter cap)。將裝填預定量多醣混合液的拋棄式注射筒的尖端部套進接頭帽的圓筒部而連接，將注射筒的柱塞(plunger)以 人力推進，用力將注射筒內的多醣混合液往容器內射入，使其與培養基接觸而製作培養基組成物。

[試驗例3]懸浮作用的確認

在試驗例2製作的培養基組成物中，添加模擬再現懸浮細胞用的聚苯乙烯珠粒(直徑500至600μm、Polysciences Inc.製)並攪拌，在停止攪拌10分鐘後，目視確認液中珠粒的分散狀態。DAG及ALG經由二價金屬陽離子(Ca等)交聯而形成的構造體的充分量是在液中適當地微細分散時，珠粒也會在液中分散而保持懸浮狀態。另一方面，該構造體的分散不充分時，珠粒也隨著沈降。關於珠粒的分散狀態，以理想分散懸浮的狀態為○、分散但一部分沈降的狀態為△、所有的珠粒都沈降的狀態為×。

(1)使用DAG及ALG(1：1)時的懸浮作用

(2)使用DAG及ALG(0.5：1)時的懸浮作用

[試驗例4]由吸管吸取回收細胞

準備對數增殖期的正常人新生兒包皮皮膚纖維母細胞(NHDF、倉敷紡績)1800×10⁴細胞，各分注300×10⁴細胞。實施離心分離(300×g，3分鐘)除去上清後，添加以種種比率含有DAG及ALG(合計濃度0.015(w/v)%)的培養基組成物(表3的實施例C369至C373)30mL，緩緩攪拌而製作細胞懸浮液(10×10⁴細胞/mL)。在24孔細胞培養用盤(住友Bakelite公司製)將含有10×10⁴細胞的細胞懸濁液每孔添加1mL，在37℃、5%碳酸氣條件下培養1週。將培養後的細胞懸濁液的細胞濃度使用細胞計數計(5C-20，BI0-RAD)計測後，將該懸濁液移入於1.5mL微管，以設定吸引/排出容量為0.2mL的微吸管(Thermo Scientific公司製，Clip Tip 1000μL)吸管吸取20次使均勻化。之後實施離心分離(300×g，3分鐘)，除去上清液1.1mL並添加含有10%胎牛血清之DMEM-LG 0.9mL再懸濁後，使用CellTiter-Glo(Promega公司)以Plate Reader(Tecan公司)定量細胞中含有 的ATP量。以測定細胞回收操作前的培養後細胞懸濁液所得的RLU值作為基準(細胞回收率100%)，與添加懸浮抑制劑而實施回收細胞操作時所得的RLU值比較，算出細胞回收率。以上的試驗全部實施3次，將其平均值示於表中。

[試驗例5]吸管吸取次數的檢討

準備對數增殖期的正常人新生兒包皮皮膺纖維母細胞(NHDF、倉敷紡績)1440×10⁴細胞，在表3實施例C371的培養基組成物48mL中懸濁，在24孔細胞培養用盤(住友Bakelite公司製)每孔分注30×10⁴細胞(1mL)，在37℃、5%碳酸氣條件下培養3日。培養後的細胞懸浮液的細胞濃度使用細胞計數計(TC-20、BI0-RAD)測定後，將該懸濁液移入於1.5mL微管，以設定吸引/排出容量為0.2mL的微吸管(Thermo Scientific公司製，Clip Tip1000μL)吸管吸取預定次數。之後實施離心分離(300×g，3分鐘)，除去上清液1.1mL並添加含有0.9mL的10%胎牛血清的DMEM-LG而再懸濁後，使用CellTiter Glo(Promega社)以Plate Reader(Tecan公司製)定量細胞中含有的ATP量，並算出細胞回收率。以上的試驗都實施5次，將其平均值示於表中。

[試驗例6]螯合劑的添加

準備對數增殖期的正常人新生兒包皮皮膚/纖維母細胞(NHDF、倉敷紡績)450×10⁴細胞而懸濁於表3實施例C371的培養基組成物15mL，在24孔細胞培養用盤(住友Bakelite公司製)每孔分注30×10⁴細胞(1mL)，在37℃、5%碳酸氣條件下培養3日。培養後的細胞懸濁液的細胞濃度使用細胞計數計(TC-20、BI0-RAD)測定後，將該懸濁液移入於1.5mL-微管，添加預定量的螯合劑(EDTA-2Na 0.033(w/v)%及檸檬酸鈉0.007(w/v)%的混合水溶液)0至0.1mL，以設定吸引/排出容量為0.2mL的微吸管(Thermo Scientific公司製，Clip Tip1000μL)吸管吸取0或10次。之後實施離心分離(300×g，3分鐘)，除去上清液1.1mL並添加含有0.9mL的10%胎牛血清的DMEM-LG而再懸濁後，使用CellTiter Glo(Promega社)以Plate Reader(Tecan公司製)定量細胞中含有的ATP量，並算出細胞回收率。以上的試驗全部實施3次，將其平均值示於表中。

[試驗例7]Jurkat細胞增殖

準備對數增殖期的人T細胞性白血病來源細胞(Jurkat E6.1，DS Pharma Biomedical股份公司)240×10⁴細胞，每40×10⁴細胞實施離心分離(300×g，3分鐘)而除去上清後，添加含有種種濃度的DAG及ALG(質量比1：0.5)的培養基組成物(表的實施例DHb020至DHb023)，及含有DAG而不含ALG的培養基組成物(表6的比較例DHb024)8mL，緩緩攪拌而製作細胞懸濁液(5×10⁴細胞/mL)。在96孔U底細胞培養用盤(住友Bakelite公司製，MS-309UR)將0.5×10⁴個細胞的細胞懸濁液每孔添加0.1mL，在37℃、5%碳酸氣條件下培養1或4日。培養前後的細胞數以細胞中含有的ATP量表示，並使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司，G7571)以Plate Reader(Tecan公司製，infiniteM200PRO)進行比較。以上的試驗全部實施4次，將其平均值示於表。

評估的結果，使用本發明的培養基組成物，也達成與比較例同等的細胞增殖性。

[試驗例8]A549細胞增殖

準備對數增殖期的人肺胞基底上皮腺癌細胞(A549，DS Pharma Biomedical股份公司)86.4×10⁴細胞，實施離心分離(300×g，3分鐘)除去上清後，添加8mL的含有種種濃度的DAG及ALG(質量比1：0.5)的培養基組成物(表7的實施例E041及實施例E045、E047、E048)，及8mL的含有DAG而不含ALG的培養基組成物(表7的比較例FP001)，緩緩攪拌而製作細胞懸濁液(5×10⁴細胞/mL)。在96孔U底細胞培養用盤(住友Bakelite公司製，MS-309UR)每孔添加0.5×10⁴個細胞的細胞懸濁液0.1mL，在37℃、5%碳酸氣條件下培養1或4日。培養前後的細胞數以細胞中含有的ATP量表示，並使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司，G7571)而以Plate Reader(Tecan公司製，infiniteM200PRO)進行比較。以上的試驗全部實施6次，將其平均值示於表。

評估的結果，使用本發明的培養基組成物，也達成與比較例同等的細胞增殖性。

[試驗例9]10mL規模的細胞回收

在表7的實施例E041的培養基組成物200mL接種 A549細胞而成為10×10⁴細胞/mL，在37℃、5%碳酸氣條件下培養2日。培養後，各分取細胞懸濁液10mL，添加螯合劑(EDTA-2Na 0.033(w/v)%及檸檬酸鈉0.007(w/v)%的混合水溶液)1mL，即時通過細胞濾網(40μm、70μm、100μm，Falcon(R)Cell Strainer)而在種種條件下實施離心分離(3分鐘)(50×g、100×g、300×g、g：gravity重力加速度)。前述回收細胞操作前後的細胞數以細胞中含有的ATP量表示，並使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司，G7571)以Plate Reader(Tecan公司製，infiniteM200PRO)進行比較。

評估的結果，顯示本發明的培養基組成物以通過濾網(細胞濾網)代替吸管吸取操作也可以達成高的細胞回收率。

[產業上的利用可能性]

本發明的培養基組成物具有維持細胞或組織的懸浮狀態的效果，並具有必要時添加螯合劑，藉由吸管吸取或過濾器過濾等加上剪切力而使該效果迅速消失的特性。因此，如使用本發明的培養基組成物，則可將細胞或組織懸浮培養(理想是懸浮靜置培養)，再者可由所得的 培養調製物將細胞或組織以高回收率加以回收。

本說明書所述的包含專利、專利申請說明書、科學文獻全部的刊物所述的內容，經由引用而與將其全部明示相同的程度編入於本說明書。

本申請案是在日本提出的特願2016-046365(申請日：2016年3月9日)為基礎，其內容全部包含於本說明書。

Claims (10)

1. 一種培養基組成物，係含有：去醯基化結蘭膠或其鹽，及在二價金屬陽離子介質中維持無規則線圈狀態，並經由二價金屬離子可交聯的海藻酸或其鹽，而可將細胞或組織懸浮而培養之培養基組成物，該培養基組成物中的去醯基化結蘭膠或其鹽的濃度是0.002至0.01(w/v)%，前述海藻酸或其鹽的濃度是0.004至0.1(w/v)%，相對於前述去醯基化結蘭膠或其鹽之前述海藻酸或其鹽的質量比(海藻酸或其鹽/去醯基化結蘭膠或其鹽)是1至4。
2. 如申請專利範圍第1項所述的培養基組成物，其中，再含有金屬陽離子。
3. 如申請專利範圍第2項所述的培養基組成物，其中，前述金屬陽離子是鈣離子。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的培養基組成物，其中，前述海藻酸或其鹽是經過高壓蒸氣滅菌處理。
5. 一種細胞或組織培養調製物，係含有申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的培養基組成物，及細胞或組織。
6. 一種細胞或組織的培養方法，係包含在申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的培養基組成物中培養細胞或組織。
7. 一種細胞或組織之單離方法，係由申請專利範圍第5項 所述的培養調製物將細胞或組織進行單離的方法，其中包含對該培養調製物加上剪切力。
8. 如申請專利範圍第7項所述的細胞或組織之單離方法，其中，係藉由吸管吸取或過濾器過濾而對培養調製物加上剪切力。
9. 如申請專利範圍第7項或第8項所述的細胞或組織之單離方法，其中再包含：在培養調製物中添加螯合劑。
10. 如申請專利範圍第7項或第8項所述的細胞或組織之單離方法，其中再包含：對培養調製物加上剪切力後，將該培養調製物進行離心分離。