TWI753455B - 用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法、其套組、其分析器及其生物標誌 - Google Patents

Abstract

一種用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法，包含以下步驟：提供自個體取得之樣本；測量樣本中目標基因的甲基化程度，其中目標基因為 SPG20；以及分析目標基因的甲基化程度，目標基因若存在甲基化狀態，則個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。另提供一種評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的套組、其分析器及其生物標誌，以達成早期檢測胃癌或癌前病變的效果。

Description

用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法、其套組、其分析器及其生物標誌

本揭露是關於一種評估個體罹患癌症或癌前病變之風險的方法、其套組、其分析器及其生物標誌，特別是有關於一種評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法、其套組、其分析器及其生物標誌。

胃癌是全世界癌症死亡的主要原因。儘管癌症治療的方式有所進展，但胃癌患者的5年生存率仍低於15%，這可能是由於缺乏早期檢測的生物標誌物所致。

表觀遺傳(epigenetic)的修飾，包括DNA甲基化，在轉錄以及胚胎和疾病的發展中扮演著重要調節作用。由於甲基化具穩定性，在組織和體液中(例如血漿和血清)都發現了相鄰的胞嘧啶與鳥嘌呤(CG)二核苷酸的胞嘧啶被甲基化。以游離DNA (cell free DNA，cfDNA)作為非侵入性檢測癌症而言，這些特性使DNA甲基化作為具吸引力的標的。

DNA可以在多種人類疾病(包括癌症)的體液中檢測到甲基化。但是目前尚未有針對早期發現胃癌可能性之非侵入性、具敏感性的生物標記物，因此現有技術實有待改善的必要。

本揭露之一實施方式的目的在於提供一種用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法、其套組及其分析器，以提供非侵入性、具敏感性的生物標記物能達成早期檢測胃癌或癌前病變的效果。

本揭露之一實施方式提供了一種用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法，包含以下步驟：提供自個體取得之樣本；測量樣本中目標基因的甲基化程度，其中目標基因為 SPG20；以及分析目標基因的甲基化程度，目標基因若存在甲基化狀態，則個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。

本揭露之另一實施方式提供了一種用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法，包含以下步驟：提供自個體取得之樣本；測量樣本中目標基因的甲基化程度，其中目標基因為 SPG20；以及比對對照組與樣本相同的目標基因的甲基化程度，當樣本目標基因的甲基化程度高於對照組目標基因的甲基化程度，則個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。

在一些實施方式中，對照組係取自正常人的樣本，包含血液、尿液、淚液、腹水、糞便、痰、胃液、胃部離體組織或其組合。

在一些實施方式中，目標基因的甲基化狀態檢測為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing，BS)、微陣列(microarray)、質譜儀分析(mass spectrometer，MS)、或焦磷酸定序(pyrosequencing)。

在一些實施方式中，目標基因 SPG20係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列。

在一些實施方式中，目標基因 SPG20甲基化狀態係由引子對如SEQ ID NOs：2及3、或5及6所示之核苷酸序列所偵測。

在一些實施方式中，目標基因 SPG20包含多個CpG序列，這些CpG序列位於 SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段。

在一些實施方式中，癌前病變包含腸上皮化生(intestinal metaplasia，IM)。

在一些實施方式中，樣本包含血液、尿液、淚液、腹水、糞便、痰、胃液、胃部離體組織或其組合。

本揭露之另一實施方式提供了一種用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的套組，包含：標的基因甲基化引子混合液，包含第一正向引子與第一反向引子，第一正向引子與第一反向引子的序列係選自於由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、與SEQ ID NO：2具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：3具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：5具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：6具約90%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:2之互補股、SEQ ID NO:3之互補股、SEQ ID NO:5之互補股、以及SEQ ID NO:6之互補股所組成的群組；標的基因無甲基化混合液，包含第二正向引子與第二反向引子，第二正向引子與第二反向引子的序列係選自於由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、與SEQ ID NO：7具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：8具約90%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:7之互補股、以及SEQ ID NO:8之互補股所組成的群組；以及聚合酶連鎖擴增反應混合液，包含聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)及鎂鹽。

在一些實施方式中，所述套組更包含探針，探針係選自於由SEQ ID NO：4、與SEQ ID NO：4具約90%至約99%相似度的序列、以及SEQ ID NO:4之互補股所組成的群組。

在一些實施方式中，所述套組更包含內部控制基因偵測混合液，包含第三正向引子及第三反向引子，內部控制基因係選自於由以下至少一種或一種以上之基因：GAPDH、β-actin、Col2A、及β-Globin所組成的群組。

在一些實施方式中，內部控制基因係GAPDH，第三正向引子與第三反向引子的序列係選自於由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、與SEQ ID NO：9具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：10具約90%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:9之互補股、以及SEQ ID NO:10之互補股所組成的群組。

本揭露之另一實施方式提供了一種用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的分析器，包含：偵測裝置，偵測由個體取得樣本中的目標基因甲基化程度，其中目標基因為 SPG20；運算裝置，將目標基因甲基化程度進行運算，獲得運算結果；以及判定裝置，分析運算結果，目標基因若存在甲基化狀態，則個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。

本揭露之另一實施方式提供了一種用於評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的分析器，包含：偵測裝置，偵測由個體取得樣本中的目標基因甲基化程度，其中目標基因為 SPG20；運算裝置，運算並比對對照組與樣本相同的目標基因甲基化程度，獲得運算結果；以及判定裝置，分析運算結果，當樣本目標基因的甲基化程度高於對照組目標基因的甲基化程度，則個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。

在一些實施方式中，目標基因 SPG20係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列。

在一些實施方式中，目標基因 SPG20的甲基化狀態係由引子對如SEQ ID NOs：2及3、或5及6所示之核苷酸序列所偵測。

在一些實施方式中，目標基因 SPG20包含多個CpG序列，這些CpG序列位於 SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段。

本揭露之另一實施方式提供了一種用於評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的生物標誌，包含 SPG20基因上的至少一個CpG序列甲基化，CpG序列位於 SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段。

在一些實施方式中，所述生物標誌更包含多個CpG序列甲基化，這些CpG序列位於 SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段。

為使本揭露的敘述更加詳盡與完備，下文針對本揭露的實施態樣與具體實施例提出說明性的描述，但這並非實施或運用本揭露具體實施例的唯一形式。以下所揭露的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。在以下描述中，將詳細敘述許多特定細節，以使讀者能夠充分理解以下的實施例。然而，亦可在無此等特定細節之情況下實踐本揭露之實施例。

於本文中，除非內文中對於冠詞有所特別限定，否則『一』與『該』可泛指單一個或多個。將進一步理解的是，本文中所使用之『包含』、『包括』、『具有』及相似詞彙，指明其所記載的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件與/或組件，但不排除其所述或額外的其一個或多個其它特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、組件，與/或其中之群組。

在以下的評估過程中，在所描述的步驟之中/之間可以存在一個或多個額外的操作步驟，並且可以改變操作步驟的順序。

本文中，術語「癌前病變」在文中表示是指人體上某些器官和組織出現細胞異常增生，這些異常增生是細胞從良性病變往惡性變病的中間過度階段，因為可能會有惡化發展成癌症的傾向。

本文中，「胃炎(gastritis)」是指胃壁內部的發炎反應，有可能短促而劇烈，也可能是長期持續的過程。常見的胃炎成因包含幽門螺旋桿菌( Helicobacter pylori)感染和使用非類固醇消炎止痛藥(NSAIDs)；相對少見的胃炎成因則包含喝酒、吸菸、吸食古柯鹼、自體免疫疾病、放射治療、克隆氏症及其他嚴重疾病。

本文中，「腸上皮化生(IM)」又稱為胃黏膜腸上皮化生(gastric intestinal metaplasia)，是指原本正常的胃黏膜因慢性發炎受損，結果一部分轉變類似「腸細胞外形」，久了之後有機會變成胃癌。

本文中，「偵測」、「篩檢」並非確定性診斷方法，根據現有技術中的醫學知識和本揭露的通過檢測目標基因在各類檢體CpG序列甲基化的狀態所獲得的資訊本身，並不能夠直接得出診斷結果或健康狀況，即是否患有癌症的診斷結果，而只是屬於“對已經脫離人體或動物體的組織、體液或排泄物進行處理或檢測以獲取作為中間結果的資訊的方法，或處理該資訊的方法”，為“不屬於診斷方法的發明”。依本領域具通常知識者(例如：醫生、醫學研究人員)皆了解，要診斷是否罹癌一定要進行病理切片等方式確定。

本文中，「位點」對應於單一位點，其可為單一鹼基位置或相關鹼基位置之群組，例如CpG位點。

在一些實施方式中，提供一種用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法，包含以下步驟：提供自個體取得之樣本；測量樣本中目標基因的甲基化程度，其中目標基因為 SPG20；以及分析目標基因的甲基化程度，目標基因若存在甲基化狀態，則個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。

本揭露之另一實施方式提供了一種用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法，包含以下步驟：提供自個體取得之樣本；測量樣本中目標基因的甲基化程度，其中目標基因為 SPG20；以及比對對照組與樣本相同的目標基因的甲基化程度，當樣本目標基因的甲基化程度高於對照組目標基因的甲基化程度，則個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。

在一實施方式中，胃癌或癌前病變如胃部出現腸上皮化生時，目標基因 SPG20會出現甲基化。

在一實施方式中，目標基因 SPG20包含多個CpG序列，該些CpG序列位於 SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段。在一些實施例中，包括6個CpG序列。

在一實施方式中，離體組織中以6個CpG序列平均計算甲基化時，甲基化程度由低至高依序為胃炎(近似於胃癌周邊的正常組織)、輕微腸上皮化生、腸上皮化生、及胃癌。在一些實施例中，亞洲人胃癌組織 SPG20的甲基化程度高於非亞洲人胃癌組織。

在一實施方式中，離體組織中以引子對如SEQ ID NOs：5及6所示之核苷酸序列所偵測，其中胃癌細胞株或具胃癌的血液中cfDNA都呈現有甲基化情形，其中正常血液中的cfDNA與具胃炎的血液中的cfDNA則無甲基化情形。在一些實施例中，樣本包含血液、尿液、淚液、腹水、糞便、痰、胃液、胃部離體組織或其組合。

在一些實施方式中，提供一種用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的套組，包含：標的基因甲基化引子混合液，包含第一正向引子與第一反向引子，第一正向引子與第一反向引子的序列包括，但不限於SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、與SEQ ID NO：2具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：3具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：5具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：6具約90%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:2之互補股、SEQ ID NO:3之互補股、SEQ ID NO:5之互補股、或SEQ ID NO:6之互補股；標的基因無甲基化混合液，包含第二正向引子與第二反向引子，第二正向引子與第二反向引子的序列包括，但不限於SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、與SEQ ID NO：7具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：8具約90%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:7之互補股、或SEQ ID NO:8之互補股；以及聚合酶連鎖擴增反應混合液，其主要成分至少包含聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)及鎂鹽。

在一實施方式中，所述套組更包含探針，探針包括，但不限於SEQ ID NO：4、與SEQ ID NO：4具約90%至約99%相似度的序列、或SEQ ID NO:4之互補股。

在一實施方式中，探針具有螢光標記，此螢光標記係選自由於包括，但不限於FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow,BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3之螢光。

在一實施方式中，聚合酶連鎖擴增反應混合液更包含可辨識連鎖擴增反應產物的螢光物質或與選自可與DNA雙股鍵結產生螢光進而被偵測到的物質。此物質包括，但不限於SYBR系列物質如SYBER Green、Syber Gold等。

在一實施方式中，所述套組更包含內部控制基因偵測混合液，包含第三正向引子及第三反向引子，內部控制基因包括，但不限於GAPDH、β-actin、Col2A、或β-Globin。在一實施例中，內部控制基因係GAPDH，第三正向引子與第三反向引子的序列包括，但不限於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、與SEQ ID NO：9具約90%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：10具約90%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:9之互補股、或SEQ ID NO:10之互補股。

在一實施方式中，SEQ ID NOs:2、3、4、5、6、7、8、9、及10所示的序列亦可容許某種程度的變異。也就是說，例如，與SEQ ID NOs:2、3、4、5、6、7、8、9、及10分別具約90%至約99%相似度的序列應用於本實施方式中亦有相同的功效。舉例而言，引子對的選擇可包含SEQ ID NOs:2、3、4、5、6、7、8、9、及10之簡併序列。此處所述之「簡併序列」係指本文所揭露的寡核苷酸序列中部分核苷酸為其他核苷酸所取代。換言之，SEQ ID NO:2之簡併序列意味著在SEQ ID NO:2序列長度不變的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約10%的變異程度，其他序列以此類推。在另一些實施例中，引子對的選擇亦可包含SEQ ID NOs:2、3、4、5、6、7、8、9、及10之衍生序列。此處所述「衍生序列」係指本文所揭露的寡核苷酸序列中在3’端或5’端可進行修飾，並且仍保留部分或全部序列。換言之，SEQ ID NO:2之衍生序列意味著在SEQ ID NO:2序列長度可進行增減的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約10%的變異程度，其他序列以此類推。

在一實施方式中，可先使用基於溶液相或固體相雜交之製程捕捉經亞硫酸氫鹽轉化之血漿游離DNA，隨後進行MPS。大規模定序可使用以下方式進行：例如Illumina ^®之邊合成邊定序平台、Life Technologies ^®之SOLiD ^®之邊接合邊定序平台、Life Technologies ^®之Ion Torrent ^®或Ion Proton ^®半導體定序系統、或基於奈米孔單一分子定序系統。基於奈米孔之定序包括使用例如脂質雙層及蛋白質奈米孔構築之奈米孔及固態奈米孔(如基於石墨烯之奈米孔)。因為所選單一分子定序平台將可以在不進行亞硫酸氫鹽轉化的情況下直接辨別DNA分子之甲基化狀態。

在一實施方式中，根據Infinium ^®甲基化分析方案，對於經亞硫酸氫鹽轉化之基因組DNA進行甲基化分析。在Illumina ^®儀器上掃描雜交微珠晶片，並藉由甲基化模組軟體針對內部對照組進行標準化並去除背景來分析DNA甲基化程度。個別CpG位點之甲基化指數由β值表示，該值係使用甲基化與未甲基化等位基因之間的螢光強度比來計算。

在一些實施方式中，提供一種用於評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的生物標誌，包含 SPG20基因上的至少一個CpG序列甲基化，CpG序列位於 SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段。具體而言，CpG序列包含位於 SPG20的轉錄起始位點+10、+15、+42、+45、+80、+90的其中一個。

在一實施方式中，所述生物標誌包含 SPG20基因上的多個CpG序列甲基化，CpG序列位於 SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段。具體而言，CpG序列包含位於 SPG20的轉錄起始位點+10、+15、+42、+45、+80、+90中兩個以上。在一些實施例中，生物標誌包含以下位點出現甲基化作為辨識：位於 SPG20的轉錄起始位點+10及+15、位點+10及+42、位點+10及+45、位點+10及+80、位點+10及+90、位點+10、+15及+42、位點+10、+15、+42及+45等任意組合。

雖然下文中利用一系列的操作或步驟來說明在此揭露之方法，但是這些操作或步驟所示的順序不應被解釋為本揭露的限制。例如，某些操作或步驟可以按不同順序進行及/或與其它步驟同時進行。此外，並非必須執行所有繪示的操作、步驟及/或特徵才能實現本揭露的實施方式。此外，在此所述的每一個操作或步驟可以包含數個子步驟或動作。

實施例1

為了進一步釐清DNA甲基化在調節 SPG20表達中的作用，評估在正常胃上皮細胞株(gastric epithelial cell，GES)和一系列胃癌細胞株。一系列胃癌細胞株包括AGS (ATCC ^®CRL-1739 ^™)、KATO III (ATCC ^®HTB-103 ^™)、MKN28、MKN45、SNU1 (ATCC ^®CRL-5971 ^™)、SNU16 (ATCC ^®CRL-5974 ^™)皆購自ATCC。所有細胞株培養在含有10% 胎牛血清(Fetal Bovine Sera，FBS)與1%青黴素/鏈黴素(Penicillin-Streptomycin)的培養基羅斯威爾帕克紀念研究所培養基(RPMI 1640)，並於37°C、5% CO ₂培養箱中。一批細胞於第0天收集並萃取RNA萃取以上所有細胞株的RNA。另一批細胞施予甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)抑製劑5aza-DC (5-aza-2’-deoxycytidine) 0.5μM於所有胃癌細胞株後，第三天收集並萃取RNA萃取以上所有細胞株的RNA，以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內控基因(引子對如SEQ ID NOs:9-10)，分析 SPG20基因的表現量。

如第1圖所示，除正常胃上皮細胞(GES)外，所有胃癌細胞株中均觀察到 SPG20的RNA表現量顯著下降。如第2圖所示，當施予甲基轉移酶抑製劑5aza-DC時，多數胃癌細胞株中 SPG20的RNA強烈地重新表達。

實施例2

為了進一步釐清 SPG20甲基化的位點，將實施例1經施予甲基轉移酶抑製劑5aza-DC的所有胃癌細胞株與GES細胞株中，萃取DNA後先以亞硫酸氫鹽轉化(bisulphite conversion)，接著以引子對SEQ ID NOs:2及3及探針SEQ ID NO:4進行焦磷酸定序(pyrosequencing)，所夾出的序列如SEQ ID NO:1所示。

如第3圖所示，這些經施予甲基轉移酶抑製劑5aza-DC的胃癌細胞株與GES細胞株中 SPG20的DNA，以亞硫酸氫鹽轉化和焦磷酸定序。序列SEQ ID NO:1中包括6個CpG序列有顯著甲基化，依序分別位於 SPG20的轉錄起始位點+10、+15、+42、+45、+80、與+90處。因此，當施予甲基轉移酶抑製劑5aza-DC時，多數胃癌細胞株中 SPG20的RNA強烈地重新表達，是與 SPG20啟動子區域的DNA去甲基化有關。

實施例3

為進一步檢測臨床上是否與胃癌細胞株的結果相符，取得患者離體檢體，包含34名胃炎患者的胃部檢體、40名胃癌患者腫瘤周邊的正常組織檢體、33名胃部腸上皮化生(IM)檢體、與53名胃癌患者的胃部檢體。將以上檢體以同實施例2的亞硫酸氫鹽轉化和焦磷酸定序方法，偵測 SPG20基因甲基化程度。

如第4圖所示，經過亞硫酸氫鹽焦磷酸定序後顯示，在胃癌檢體的 SPG20甲基化程度高於腸上皮化生組織、腫瘤周邊的正常組織和胃炎組織。值得注意的是，腸上皮化生組織的 SPG20甲基化程度還高於腫瘤周邊的正常組織和胃炎組織。

實施例4

從兩大資料庫GSE103186與TCGA中進行分析，並取其甲基化微陣列(microarray)數據，每個探針的甲基化水平(β值)由以下公式計算：

如第5圖所示，SPG20甲基化程度由高到低依序為胃癌組織、腸上皮化生組織、輕微腸上皮化生組織、與正常胃部組織。胃癌組織中又以亞洲入的甲基化程度高於非亞洲人。

實施例5

為了進一步檢查SPG20甲基化作為非侵入性之甲基化生物標誌物的可行性，取實施例1中一系列胃癌細胞株、GES、胃癌患者血漿中的游離DNA(組別為T1、T2、T6、T7、T9)、胃炎患者血漿中的游離DNA(組別為GS12、GS49)、具甲基化的正對照組(IVD，in vitro methylated DNA)、非癌症患者的血漿(NB，normal blood)作為負對照組、以及水(H₂O)作為控制組。將以上各組進行甲基化特異性PCR(MSP)，以引子對SEQ ID NOs：5及6辨識具甲基化的SPG20基因、以引子對SEQ ID NOs：7及8辨識無甲基化的SPG20基因。

如第6圖所示，與我們的亞硫酸氫鹽焦磷酸測序結果相符，SPG20甲基化以MSP檢測可在所有胃癌細胞株中檢測到。如第7圖所示，大多胃癌患者血漿中的游離DNA亦可檢測出 SPG20甲基化，在胃炎患者血漿中的游離DNA則無檢出 SPG20甲基化。

此外，由下表1可知，在以血漿中游離DNA的檢測中，使用 SPG20甲基化檢測胃癌的敏感性為88.6%、特異性為75%。值得一提的是，癌症或腸上皮化生檢測的敏感性仍可高達87.5%。 表1、

種類*	僅胃癌 (n = 53)	胃癌或IM (n = 53+3)
敏感性	88.6% (47/53)	87.5% (49/56)
特異性	75.0% (15/20)	75.0% (15/20)
陽性預測值(Positive Predictive Value，PPV)	90.3%	90.7%
陰性預測值(Negative Predictive Value，NPV)	71.4%	68.1%

*與20名非癌症患者血漿中的游離DNA做比對。

實施例6

請參閱第8圖所示，繪示出之一種評估個體罹患腹膜硬化症之風險的分析器示意圖。分析器100包含偵測裝置110、運算裝置120及判定裝置130。

(1)以甲基化特異性PCR (MSP) 運算

偵測裝置110偵測由個體取得樣本中的目標基因甲基化程度，其中目標基因為 SPG20。偵測方式如實施例5所示，以甲基化特異性PCR針對目標基因甲基化程度進行偵測。

運算裝置120將目標基因甲基化程度進行運算，獲得運算結果。運算方式如比對與背景值的差異。

判定裝置130分析運算結果，目標基因若存在甲基化狀態，則個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。

(2)以亞硫酸氫鹽轉化和焦磷酸定序、微陣列運算

偵測裝置110偵測由個體取得樣本中的目標基因甲基化程度，其中目標基因為 SPG20。偵測方式如實施例2所述，DNA先以亞硫酸氫鹽轉化，再進行焦磷酸定序；或是將DNA先以亞硫酸氫鹽轉化，再以如實施例4所述之微陣列進行偵測。

運算裝置120運算並比對對照組與樣本相同的目標基因甲基化程度，獲得運算結果。如運算出目標基因甲基化程度的百分比、或是β值。對照組係取自正常人的樣本，包含血液、尿液、淚液、腹水、糞便、痰、胃液、胃部離體組織或其組合。

判定裝置130分析運算結果，分析運算結果，當樣本目標基因的甲基化程度高於對照組目標基因的甲基化程度，則個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。

雖然本揭露已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭露，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭露之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本揭露之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

100：分析器 110：偵測裝置 120：運算裝置 130：判定裝置

為讓本揭露之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖繪示本揭露之一實施方式之 SPG20於不同細胞株的表現量的柱狀圖；***表示與GES相比 p>0.005。 第2圖繪示本揭露之一實施方式之 SPG20於不同細胞株以DMSO或5aza-DC處理下的表現量的柱狀圖；*表示 p>0.05，***表示 p>0.005，ns表示無顯著差異。 第3圖為本揭露之一實施方式之6個CpG位點在不同細胞株的甲基化比率的折線圖。 第4圖為本揭露之一實施方式之 SPG20於不同狀態胃部組織的甲基化比率的散佈圖；*表示p>0.05，***表示p>0.005，ns表示無顯著差異。 第5圖為本揭露之一實施方式之 SPG20於不同狀態胃部組織的甲基化比率的箱形圖；*表示p>0.05，***表示p>0.005。 第6圖為本揭露之一實施方式之 SPG20於不同細胞株或血液有無甲基化的電泳圖。 第7圖為本揭露之一實施方式之 SPG20於不同狀態胃部組織或血液有無甲基化的電泳圖。 第8圖為本揭露之一實施方式繪示出之一種評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的分析器的示意圖。

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Claims (17)

1. 一種用以評估一個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法，包含以下步驟：提供自該個體取得之一樣本，該樣本為血液；測量該樣本中一目標基因的甲基化程度，其中該目標基因為SPG20，其中該目標基因SPG20包含多個CpG序列，該些CpG序列位於SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段；以及分析該目標基因的甲基化程度，該目標基因若存在甲基化狀態，則該個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。
2. 一種用以評估一個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法，包含以下步驟：提供自該個體取得之一樣本，該樣本為血液；測量該樣本中一目標基因的甲基化程度，其中該目標基因為SPG20，其中該目標基因SPG20包含多個CpG序列，該些CpG序列位於SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段；以及比對一對照組與該樣本相同的該目標基因的甲基化程度，當該樣本目標基因的甲基化程度高於該對照組目標基因的甲基化程度，則該個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。
3. 如請求項2所述之方法，其中該對照組係取自正常人的樣本，該樣本為血液。
4. 如請求項1或2所述之方法，其中該目標基因的甲基化狀態檢測為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR，MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR，QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing，BS)、微陣列(microarray)、質譜儀分析(mass spectrometer，MS)、或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
5. 如請求項1或2所述之方法，其中該目標基因SPG20係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列。
6. 如請求項1或2所述之方法，其中該目標基因SPG20甲基化狀態係由引子對如SEQ ID NOs：2及3、或5及6所示之核苷酸序列所偵測。
7. 如請求項1或2所述之方法，其中該癌前病變包含腸上皮化生(intestinal metaplasia，IM)。
8. 一種用於評估一個體罹患胃癌或癌前病變 之風險的套組，包含：一標的基因甲基化引子混合液，包含一第一正向引子與一第一反向引子，該第一正向引子與該第一反向引子的序列係選自於由SEQ ID NO：2與SEQ ID NO：3、以及SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6所組成的群組之核苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列或其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NOs：2、3、5及6所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NOs：2、3、5及6具有90%以上同源性之核苷酸序列；一標的基因無甲基化混合液，包含一第二正向引子與一第二反向引子，該第二正向引子與該第二反向引子的序列係選自於由SEQ ID NO：7、以及SEQ ID NO：8所組成的群組之核苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列或其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NOs：7及8所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NOs：7及8具有90%以上同源性之核苷酸序列；以及一聚合酶連鎖擴增反應混合液，包含聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)及鎂鹽。
9. 如請求項8所述之套組，更包含一探針，該探針係選自於由SEQ ID NO：4所組成的群組之核 苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列或其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NO：4所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NO：4具有90%以上同源性之核苷酸序列。
10. 如請求項8所述之套組，更包含一內部控制基因偵測混合液，包含一第三正向引子及一第三反向引子，該內部控制基因係選自於由以下至少一種或一種以上之基因：GAPDH、β-actin、Col2A、及β-Globin所組成的群組。
11. 如請求項10所述之套組，其中該內部控制基因係GAPDH，該第三正向引子與該第三反向引子的序列係選自於由SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：10所組成的群組之核苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列或其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NOs：9及10所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NOs：9及10具有90%以上同源性之核苷酸序列。
12. 一種用於評估一個體罹患胃癌或癌前病變之風險的分析器，包含：一偵測裝置，偵測由該個體取得一樣本中的一目標基 因甲基化程度，其中該目標基因為SPG20，其中該目標基因SPG20包含多個CpG序列，該些CpG序列位於SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段，其中該樣本為血液；一運算裝置，將該目標基因甲基化程度進行運算，獲得一運算結果；以及一判定裝置，分析該運算結果，目標基因若存在甲基化狀態，則該個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。
13. 一種用於評估一個體罹患胃癌或癌前病變之風險的分析器，包含：一偵測裝置，偵測由該個體取得一樣本中的一目標基因甲基化程度，其中該目標基因為SPG20，其中該目標基因SPG20包含多個CpG序列，該些CpG序列位於SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段，其中該樣本為血液；一運算裝置，運算並比對一對照組與該樣本相同的該目標基因甲基化程度，獲得一運算結果；以及一判定裝置，分析該運算結果，當該樣本目標基因的甲基化程度高於該對照組目標基因的甲基化程度，則該個體被評估為具有罹患胃癌或癌前病變的風險。
14. 如請求項12或13所述之分析器，其中該 目標基因SPG20係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列。
15. 如請求項12或13所述之分析器，該目標基因SPG20的甲基化狀態係由引子對如SEQ ID NOs：2及3、或5及6所示之核苷酸序列所偵測。
16. 一種用於評估一個體罹患胃癌或癌前病變之風險的生物標誌，包含SPG20基因上的至少一個CpG序列甲基化，該CpG序列位於SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段。
17. 如請求項16所述之生物標誌，更包含多個CpG序列甲基化，該些CpG序列位於SPG20的轉錄起始位點+10至+91區域之區段。

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