TWI610680B - 含有去鼠李糖洋丁香酚苷（Ｄｅｓ Ｒｈａｍｎｏｓｙｌ Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ）之橄欖萃取物 - Google Patents

Abstract

本發明之課題係提供於身體內長時間發揮高抗氧化作用之飲食品、醫藥部外用品及醫藥。

本發明之解決方法係於橄欖萃取物，藉由使含有去鼠李糖洋丁香酚苷，可賦予高抗氧化活性。另外，將含有洋丁香酚苷組成物，藉由糖苷水解酵素進行處理，可調製含有去鼠李糖洋丁香酚苷組成物。

Description

含有去鼠李糖洋丁香酚苷(Des Rhamnosyl Acteoside)之橄欖萃取物

本發明係關於含有去鼠李糖洋丁香酚苷(以下稱為「DRA」。)之橄欖萃取物、血中抗氧化劑及其製造方法。具體上係關於含有DRA之具有血中抗氧化作用之橄欖萃取物、含有DRA作為有效成份之血中抗氧化劑及其製造方法。

橄欖(Olea europaea)係屬於木犀科橄欖屬之植物，以地中海區域為首，廣泛地被栽培。其果實係以橄欖油萃取或作為食用，於全世界廣泛地被利用，食用經驗非常豐富。

報告揭示橄欖的果實係含有橄欖苦苷、水合酪胺醇、洋丁香酚苷等之多酚(非專利文獻1、2)，橄欖萃取物或此等之多酚成份係具有動脈硬化作用(非專利文獻3)、高血壓抑制作用(專利文獻1)、骨重量減少抑制作用(非專利文獻4)等。另外，報告揭示橄欖萃取物係具有抗氧化、美白、皮膚之抗老化、抗腫瘤效果(揭示專 利文獻2)。

洋丁香酚苷係橄欖所含之代表性多酚成份之一，已知具有抗氧化活性(非專利文獻2)。

另一方面，DRA係具有自洋丁香酚苷去掉鼠李糖單位之結構，報告揭示最先自玄參科植物(Calceolaria hypericina)以Calceolarioside A被單離(非專利文獻5)，存在於各種植物，但無於橄欖的報告。另外，關於抗氧化活性，報告揭示於in vitro之抗氧化活性之比較，洋丁香酚苷的活性比DRA高(非專利文獻6)。

然而，報告揭示調查人類攝取橄欖果實時之多酚類的吸收及排出、血中抗氧化之經時變化時，皆於短時間內被清除(非專利文獻7)。進而，亦有報告揭示已知具有抗氧化作用之洋丁香酚苷，經口攝取時，其吸收性有問題(非專利文獻8)。

先前技術文獻 專利文獻

[專利文獻1]特開2005-334022號公報

[專利文獻2]特開2002-186453號公報

非專利文獻

[非專利文獻1] J. Agric Food Chem, vol.52, pp479-484, 2004

[非專利文獻2] J. Agric Food Chem, vol.53, pp8963-8969, 2005

[非專利文獻3] Atherosclerosis, vol.188, No.1, pp35-42, 2006

[非專利文獻4] Clin Nutr, vol.25, No.5, 859-868, 2006

[非專利文獻5] Gazzetta Chimica Italiana, 116, P431-433, 1986

[非專利文獻6] Planta Medica, 70 (1), 50-53, 2004

[非專利文獻7] Phytomedicine, vol.14, pp659-667, 2007

[非專利文獻8] J. Chromatogr. B, 844 (1), pp89-95, 2006

如前所述，橄欖的果實係含有抗氧化多酚之洋丁香酚苷，但洋丁香酚苷有體內吸收性的問題，經口攝取時之效果並不充份。另外，其抗氧化作用係攝取後暫時性的，作為營養補給品等時，期望效果持續更長時間。

本發明係以提供可使於身體內有效地發揮效能，顯示長時間血中抗氧化作用之食品、醫藥部外用品及醫藥為目的。

本發明者等為解決前述課題，進行努力檢討的結果，令人驚訝的是發現與in vitro的結果不同，顯示身體內 DRA的抗氧化作用比洋丁香酚苷高。另外，發現其抗氧化作用係因DRA與洋丁香酚苷之消化性差異而顯示長時間作用。進而，DRA與洋丁香酚苷相比較，顯示體內吸收性高，有效率地發揮代謝物水合酪胺醇及咖啡酸具有之各種生理活性。另外，發現DRA係將洋丁香酚苷藉由糖苷水解酵素處理而可調製，達成完成本發明。

亦即，本發明並非受後述限定者，但包含後述之發明。

(1)含有DRA之橄欖萃取物(後述稱為「含有DRA之橄欖萃取物」)。

(2)含有0.1重量%以上之DRA之(1)記載之橄欖萃取物。

(3)含有1重量%以上之DRA之(2)記載之橄欖萃取物。

(4)摻混(1)~(3)中任一項之組成物。

(5)組成物係飲食品之(4)記載之組成物。

(6)含有0.1重量%以上之DRA之飲食品。

(7)含有橄欖萃取物之(6)記載之飲食品。

(8)含有DRA之血中抗氧化劑。

(9)含有0.1重量%以上之DRA之(8)記載之血中抗氧化劑。

(10)摻混(8)或(9)之血中抗氧化劑之組成物。

(11)組成物係飲食品之(10)記載之組成物。

(12)為含有DRA之組成物之製造方法，包含將含 有洋丁香酚苷組成物，以具有去鼠李糖活性之糖苷水解酵素進行處理之步驟之(12)記載之步驟。

(13)含有洋丁香酚苷組成物為橄欖萃取物之(12)記載之製造方法。

(14)糖苷水解酵素係柚苷酶(naringinase)之(12)或(13)記載之製造方法。

本發明之含有DRA之橄欖萃取物及血中抗氧化劑係於身體內長時間發揮高抗氧化作用。因此，適用於飲食品、醫藥部外用品及醫藥。

用以實施發明之最佳型態

本發明係關於含有DRA，於身體內長時間發揮高抗氧化作用之橄欖油萃取物、含有DRA之飲食品、血中抗氧化劑及其製造方法。

以下係對本發明之實施型態，更詳細地說明。

<含有DRA之橄欖萃取物>

本發明之含有DRA之橄欖萃取物係含有DRA。

後述表示DRA之結構式。

如前所述，DRA係於1986初期，自玄參科植物(Calceolaria hypericina)以Calceolarioside A被單離(非專利文獻5)，之後，揭示存在於各種植物，但未報告橄欖中有。對此，本發明之含有DRA之橄欖萃取物中DRA含量雖可為極微量，但含有0.1重量%以上，以1重量%以上為宜，進而以5重量%以上尤佳。

DRA係可為將後述之洋丁香酚苷藉由酵素處理所得者，亦可為以其他方法所得者。例如對含有洋丁香酚苷之橄欖萃取物，藉由使用可去除洋丁香酚苷之鼠李糖部份之酵素，使於適當條件下進行反應，可得到含有DRA之橄欖萃取物。另外，亦可藉由自含有DRA之植物原料等萃取DRA，添加於橄欖萃取物而得。

後述表示洋丁香酚苷之結構式。

本發明之含有DRA之橄欖萃取物係只要含有DRA即 可，其他含有成份並無特別限制。作為其他含有成份，可舉例如來自橄欖成份之洋丁香酚苷、水合酪胺醇。其他成份之含量或DRA與其他含有成份之量比係可任意地設定。

橄欖係屬於木犀科橄欖屬之植物，可使用任一種品種作為調製萃取物之原料。可適合使用例如Manzanillo、Lucca、Nevadillo blanco、Mission、Picual、Arbechina、Hojiblanca、Cornicabra、Gordal、Moraiolo、Frantoio、Coratina、Leccino等品種。

調製橄欖萃取物係可使用橄欖的果實、種子、葉、莖等中任一個部位，但以使用洋丁香酚苷含量多之部份，例如果實為宜。橄欖果實係可使用生的狀態，亦可使用藉由冷凍乾燥等之乾燥物。另外，自橄欖果實榨油後之殘渣亦可直接或以乾燥的狀態使用。調製橄欖萃取物係可以前述任一種作為原料，進行溶劑萃取所得之萃取物。溶劑萃取所使用的溶劑，可為極性溶劑，亦可為非極性溶劑。例如水、甲醇或乙醇等之醇類、乙二醇或丙二醇等之多元醇類、酮類等。以60℃~90℃的熱水為宜。

本發明之含有DRA之橄欖萃取物係因為含有DRA，所以具有各種功效。例如DRA與洋丁香酚苷相比，於體內吸收量高，可更有效率地發揮代謝物之水合酪胺醇及咖啡酸具有的各種生理活性。另外，攝取後長時間顯示血中抗氧化活性。

DRA等之體內吸收量係例如藉由投與試驗溶液於實 驗動物，於一定時間後採取血液，測定濃度而可評估。表示一例，使絕食一晚的大鼠，以5ml/kg的用量，使用管子(Sonde)經口投與DRA之橄欖油懸浮液(0.8mM)。接著，投與後一定間隔自尾靜脈採取血液於肝素採血管，藉由離心分離操作而得血漿樣品，藉由進行濃度分析而評估。

DRA之代謝物之水合酪胺醇及咖啡酸之構造式如後所示。

已知水合酪胺醇具有非常強的抗氧化作用，並且具有防止壞膽固醇LDL進一步惡化成為氧化LDL的作用。

咖啡酸係咖啡中所含多酚的一種，已知為香氣成份。揭示此咖啡酸具有抑制癌細胞轉移或增殖之效果。

橄欖萃取物係作為食用，於全世界廣泛地使用，食用經驗非常豐富。因此，本發明之含有DRA之橄欖萃取物 係可直接作為飲食品等使用，並且亦可摻混於飲食品或醫藥品等。

直接作為飲食品等使用時，只要不損及DRA效果，亦即不與DRA發生不佳的相互作用，因應需要，可混合其他生理活性成份，例如礦物質；維生素E、維生素C、維生素A等之維生素類；營養成份；香料；色素等之其他添加物。此等添加物係任一種皆可使用飲食品一般所使用者。

另外，摻混含有DRA之橄欖萃取物，可作為機能性食品(健康輔助食品、營養機能食品、特別用途食品、特定保健用食品等之健康食品、動物用營養補給品)、動物用飼料等。

<飲食品>

本發明係關於含有0.1重量%以上之DRA之飲食品。以含橄欖萃取物為宜。

DRA可為將洋丁香酚苷藉由酵素處理所得者，亦可藉由其他方法所得者。例如對洋丁香酚苷含有物，藉由使用可去除洋丁香酚苷之鼠李糖部份之酵素，使於適當條件下反應，可得到DRA含有物。另外，亦可為自含有DRA之植物原料等萃取DRA所得者。

飲食品之型態可為錠劑、膠囊劑、粉末劑、顆粒劑、口服液劑(包括溶液劑及懸浮液劑)等之健康食品之型態，亦可為清涼飲料、茶飲料、優酪乳或乳酸菌飲料等之 乳製品、調味料、加工食品、點心類、零食(例如口香糖、硬糖、果凍)等之型態。本發明之飲食品亦可含有作為食品所容許之賦形劑、結合劑、被覆劑、崩散劑、添加劑等。

本發明之飲食品係藉由具有抗氧化活性，適用於預防或改善活性氧參與之障礙/疾病等。

<血中抗氧化劑>

本發明亦關於含DRA之血中抗氧化劑。

如前所述，與至今之報告不同，相對於投與洋丁香酚苷，認為血中之抗氧化活性幾乎沒有上升，顯示投與DRA係投與後血中抗氧化活性明顯上升。進而，因為其效果係長時間持續著，所以本發明之含有DRA之血中抗氧化劑係緩釋性血中抗氧化劑。藉由具有抗氧化活性，適用於預防、改善或治療活性氧參與之障礙/疾病等。

血中抗氧化活性係可使用例如FRAP(Ferric Reducing Ability of Plasma，血漿還原三價鐵的能力)、ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity，氧自由基吸收能力)進行評估。

本發明之血中抗氧化劑中之DRA含量雖無特別限制，但就效果上，為0.1重量%以上，以1重量%以上為宜，以2重量%以上尤佳，以5重量%以上更好。DRA可為將洋丁香酚苷藉由酵素處理所得者，亦可為藉由其他方法所得者。例如藉由對洋丁香酚苷含有物，使用可去除 洋丁香酚苷之鼠李糖部份之酵素，使於適當條件下反應，可得到DRA含有物。另外，亦可為自含有DRA之植物原料等萃取DRA所得者。

本發明之血中抗氧化劑係可以例如錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等作為經口投與劑，或亦可以注射劑等之非經口投與之型態。接著，本發明之血中抗氧化劑亦可添加製劑上所容許之賦形劑、結合劑、增量劑、分散劑或保存劑等。

本發明之血中抗氧化劑係可直接使用，亦可摻混於飲食品或醫藥品等。

直接作為飲食品等使用時，只要不損及DRA效果，亦即不與DRA發生不佳的相互作用，因應需要，可混合其他生理活性成份，例如礦物質；維生素E、維生素C、維生素A等之維生素類；營養成份；香料；色素等之其他添加物。此等添加物中任一種皆可使用飲食品一般所使用者。

<含有DRA之組成物之製造方法>

本發明之製造方法係自含有洋丁香酚苷之組成物調製含有DRA之組成物。具體上，藉由糖苷水解酵素處理，去除洋丁香酚苷之鼠李糖部份，可簡單地調製含有DRA之組成物。

作為原料使用之含有洋丁香酚苷之組成物，只要係含有洋丁香酚苷者即可，亦可為經精製之洋丁香酚苷，亦可 為洋丁香酚苷與橄欖苦苷、水合酪胺醇等之其他多酚化合物等之混合物。另外，亦可使用含有洋丁香酚苷之植物萃取物。原料中之洋丁香酚苷濃度係考慮目的產物中之DRA含量而可適當決定。如前所述，因為橄欖含有較多的洋丁香酚苷，適當地使用已知的方法，可得到含有所需比率之含有洋丁香酚苷之萃取物，所以為本發明之製造方法中適合的原料。就此點，以橄欖果實為宜，亦可使用市售之橄欖果實之萃取粉末之溶解液。

使用的糖苷水解酵素係只要具有自洋丁香酚苷去除鼠李糖之鼠李糖水解酶活性者即可使用，並無限制。作為具有鼠李糖水解酶活性之酵素，可舉例如柚苷酶(naringinase)或橘皮苷酶。酵素處理條件係考慮使用的酵素之最適合反應溫度或pH等而可適當決定。例如使用柚苷酶時，使用適當的試劑類，調整pH於3.5~5之範圍，於30~60℃，以35~45℃尤佳之溫度範圍進行反應。酵素處理後，使用例如調整溶液成pH3，以80℃以上加熱10分鐘等之已知的適當方法，使酵素失去活性。

所產生之含有DRA之組成物中之DRA濃度係藉由適當地設定原料中之洋丁香酚苷濃度、酵素添加量、反應時間等，可得到所需濃度者。

藉由酵素反應所得之含有DRA之組成物中之DRA濃度、及殘留洋丁香酚苷濃度係藉由該業者已知方法，例如HPLC分析而可測定。

自所得之含有DRA之組成物，亦可分離精製DRA而 使用。DRA之分離精製方法係可以溶劑萃取、色層分離等之該業者所知方法適當地實施。

[圖1]圖1係以藉由酵素反應所產生之DRA量之HPLC波峰面積為指標之經時變化圖。

[圖2]圖2係以藉由酵素反應而洋丁香酚苷減少之HPLC波峰面積為指標之經時變化圖。

[圖3]圖3係表示以CMC懸浮液投與DRA或洋丁香酚苷時之血中FRAP(Ferric Reducing Ability of Plasma，血漿還原三價鐵的能力)活性之經時變化。

[圖4]圖4係表示以橄欖油溶液投與DRA時之血中FRAP活性之經時變化。

[圖5]圖5係表示以CMC懸浮液投與DRA或洋丁香酚苷時之血中ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity，氧自由基吸收能力)活性之經時變化。

[圖6]圖6係以橄欖油溶液投與DRA時之血中ORAC活性之經時變化。

[圖7]圖7係投與0.5%之CMC懸浮水時之大鼠血中之洋丁香酚苷、DRA、水合酪胺醇、咖啡酸濃度之經時變化圖。

[圖8]圖8係投與500mg之洋丁香酚苷/0.5%之CMC懸浮水時之大鼠血中之洋丁香酚苷、DRA、水合酪胺醇、咖啡酸濃度之經時變化圖。

[圖9]圖9係投與423mg之DRA/0.5%之CMC懸浮水時之大鼠血中之水合酪胺醇、咖啡酸濃度之經時變化圖。

[圖10]圖10係表示DRA之體內吸收量(AUC)比洋丁香酚苷多之圖。

[圖11]圖11係表示單次投與作為橄欖油溶解液之含有DRA萃取物時之血中FRAP活性之經時變化。

[圖12]圖12係表示單次投與作為橄欖油懸浮液之含有DRA橄欖萃取物或未經酵素處理之橄欖萃取物時之血中FRAP活性之經時變化。

[圖13]圖13係表示連續投與作為橄欖油懸浮液之含有DRA橄欖油萃取物或未經酵素處理之橄欖萃取物時之最後投與9小時後之血中FRAP活性。

[實施例]

以下係基於實施例說明本發明，但本發明並非受限於此等實施例者。

調製例1.橄欖萃取物之調製

將8kg之橄欖果實之榨油渣，以32L之80℃熱水，各萃取30分鐘2次。以尼龍濾網(日本理化學器械股份有限公司製，商品名：NRS-500)過濾後，藉由使用2張#131(

330mm)+200g之Hyflo Super-cel(Nacalai tesque股份有限公司)之吸引過濾以去除榨油渣，得到萃 取液。將此萃取液全量負荷於以50%之丙酮洗淨，以水平衡之5L之amberlite XAD7-HP樹脂(Rohm and Haas Japan(股))(管柱尺寸

14×32cm)。以5L的水洗淨後，以20L的水、35L的15%之乙醇水溶液、20L的60%之乙醇水溶液依序沖提。將15%之沖提部份及60%之沖提部份，分別減壓濃縮後，冷凍乾燥，分別得到37.2g及66.0g之分離物。其中，自60%之沖提部份所得之分離物，作為橄欖萃取物(洋丁香酚苷含量為9.1%)，使用於之後的動物實驗。

調製例2.洋丁香酚苷之調製

將100g之橄欖果肉之萃取物粉末(Indena社製之OLEASELECT(商標)(Batch No.10219))，溶解於1200ml之甲基乙基酮及600ml之蒸餾水，以3L容積之分液漏斗充份振動，回收有機層。加入1200ml之甲基乙基酮於水層，充份振動，回收有機層。再重複相同的操作。合併計3次的有機層，進行濃縮、冷凍乾燥，得到52.5g之乾燥物。

使此乾燥物總量，溶解於200ml之70%之乙醇水溶液，進一步以水稀釋成10倍後，負荷於以水平衡之1L之MCI GEL CHP-20P(三菱化學股份有限公司製，75-150μm)。流入10L之10%之乙醇水溶液後，以各1L之12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%、27.5%、30%、35%之乙醇水溶液，進而2L之40%之乙醇水溶液 依序進行沖提(乙醇濃度皆為V/V%)。自12.5%至27.5%之沖提液，分離回收各250ml之4個分離部份，將其中20%之沖提液之第4分離部份至25%之沖提液之第3分離部份，合併濃縮，得到5.98g之精製洋丁香酚苷。

實施例1. DRA之製造-1

將0.37mg之柚苷酶(來自Penicillium decumbens，300units/g，Sigma社製)，懸浮於1.68ml之0.1M醋酸緩衝溶液(pH4.0)，調製0.22mg/ml之酵素液(簡稱：1/10)。將此1/10酵素液，使用0.1M醋酸緩衝溶液(pH4.o)稀釋，調製3倍、10倍、30倍稀釋之酵素液(分別簡稱：1/30、1/100、1/300)。採取0.9ml之各酵素液於螺旋口試管，添加0.1ml之調製例2所得之精製洋丁香酚苷之50%之乙醇水溶液(20mg/ml)，於40℃下振動(100-130次/分，Water Bath Shaker MM-10型，大洋科學工業(股)(現在TAITEC(股)製))。反應開始1、2、3、4、5、24小時後，採取0.1ml，以去除蛋白質為目的，添加等量之冰冷乙腈後進行攪拌，於冰冷下靜置10分鐘後，進行離心分離(10000旋轉數，10分鐘，5℃，微量高速冷卻離心分離機MX-100型，(股)TOMY精工製)。將4μl所得之離心分離上清液，供予後述分析條件之HPLC分析。酵素無添加組之第5、24小時，同樣地進行處理，檢查洋丁香酚苷之安定性(簡稱：Ez(-))。另外，反應產物為DRA係藉由LC/MS分析而確 認。

<HPLC分析條件>

系統：Waters 2690/2695分離模組，996光二極體陣列偵測器

管柱：Develosil(商標)RPAQUEOUS-AR-5(3*150mm)

移動相：A：0.1%甲酸-15%乙腈/蒸餾水，B：0.1%甲酸-50%乙腈/蒸餾水

程式：0分鐘(0% B)，30分鐘(100% B)

流速：0.43ml/分

注入量：4μl

偵測波長：280nm

前述分析條件，DRA係於8.958±0.008分(n=24)，洋丁香酚苷係於9.348±0.009分(n=18)被沖提出。以HPLC之波峰面積為指標之經時變化之結果如圖1及圖2所示。確認隨著洋丁香酚苷減少而產生DRA。

實施例2. DRA之製造-2

將4g之調製例2所得之精製洋丁香酚苷，溶解於100ml之50%乙醇水溶液。加入2L之0.1M醋酸緩衝溶液(pH4.0)於此溶解液總量，保持40℃，添加400mg之柚苷酶(來自Penicillium decumbens，300units/g，Sigma社製)。於40℃下，攪拌3小時後，立即將反應液總 量，負荷於以水平衡之700ml之MCI GEL CHP-20P(三菱化學股份有限公司製，75-150μm)。以2L的水洗淨後，流入2L之15%之乙醇水溶液、1200ml之20%之乙醇水溶液。接著，以各750ml之22.5%、25%、27.5%之乙醇水溶液進行沖提，分別分離成各250ml之3個分離部份。進而，以1250ml之30%之乙醇水溶液沖提，分成各250ml之5個分離部份。其中，將27.5%之沖提液之第1及第2分離部份合併物、自27.5%之沖提液之第3分離部份至30%沖提液之第3分離部份合併物，分別濃縮，得到各438mg及1.562g之乾燥物。使用自27.5%之沖提液之第3分離部份至30%之沖提液之第3分離部份之乾燥物，進行MS及NMR分析，確認為DRA。

實施例3. 含有DRA之橄欖萃取物之製造-1

將160ml之蒸餾水，保溫於40℃，添加4g之橄欖果肉之萃取物粉末(Indena社製之OLEASELECT(商標)(Batch No.10219))之20ml之50%之乙醇水溶液，進行攪拌(此時為pH4.7)，使用冰醋酸，調整成pH4.0。接著，加入40mg之柚苷酶(來自Penicillium decumbens，300units/g，Sigma社製)之20ml之蒸餾水懸浮液，開始反應。於0.5分鐘、2分鐘至30分鐘每隔2分鐘、60分鐘至210分鐘每隔30分鐘採取100μl，以去除蛋白質為目的，添加100μl等量之冰冷乙腈後進行攪拌，進行離心分離(10000旋轉數，10分鐘，5℃，微量 高速冷卻離心分離機MX-100型，(股)TOMY精工製)。加溫210分鐘後之反應液為pH4.1。另外，取代酵素液，添加蒸餾水，同樣地處理之樣品作為對照。將4μl所得之離心分離上清液，供予HPLC分析。求出DRA與洋丁香酚苷之波峰面積。另外，使用DRA及洋丁香酚苷，以50%之乙腈調製梯度稀釋液，以相同條件分析，製作校正曲線(DRA之校正曲線R²=0.9999，洋丁香酚苷之校正曲線R²=1)。製作校正曲線所使用之DRA及洋丁香酚苷之標準品係分別使用實施例2、調製例2所得者。由波峰面積值及校正曲線算出濃度，依據下述計算式求出原本樣品中(分析時相當為10mg/ml)之DRA及洋丁香酚苷含量。結果如表1所示。

<HPLC分析條件>

系統：Waters 2690/2695分離模組，996光二極體陣列偵測器

管柱：Develosil(商標)RPAQUEOUS-AR-5(3*150mm)

移動相：A：0.1%甲酸-15%乙腈/蒸餾水，B：0.1%甲酸-60%乙腈/蒸餾水

程式：0分鐘(0% B)，30分鐘(100% B)

流速：0.43ml/分

注入量：4μl

偵測波長：280nm

<計算式>

反應時之樣品濃度為20mg/ml，進一步以乙腈稀釋2倍，因為樣品濃度為分析時10mg/ml相當量，所以含量(%)=100*濃度(μg/ml)/10000(μg/ml)

表1係表示DRA及洋丁香酚苷含量之經時變化者。確認隨著洋丁香酚苷減少而產生DRA。

實施例4. 含有DRA之橄欖萃取物之製造-2 <萃取>

將2kg之橄欖果實之榨油渣，以16L之80℃熱水，萃取2小時。以尼龍濾網(日本理化學器械股份有限公司製，商品名：NRS-500)過濾後，藉由使用2張#131(

330mm)+400g之Hyflo Super-cel(Nacalai股份有限公司)之吸引過濾以去除榨油渣，得到萃取液。

<去鼠李糖反應>

將萃取液冷卻至40℃，添加32ml之醋酸，降低至pH3.93。於水浴中保持40℃下，添加130mg之柚苷酶(來自Penicillium decumben，540units/g，Sigma社製)，進行反應3.5小時。為使反應結束，藉由添加35ml之6N硫酸，調整成pH3.0，以80℃加熱10分鐘，使酵素失去活性。之後，以水浴冷卻至40℃以下，添加52.5ml之當量4N之NaOH水溶液。

<精製>

將前述反應液總量負荷於以50%之丙酮洗淨，以水平衡之1L之amberlite XAD7-HP樹脂(Rohm and Haas Japan(股))(管柱尺寸

8×20cm)。以2L的水洗淨後，以6L的15%之乙醇水溶液、4L的60%之乙醇水溶液依序沖提。將此15%之沖提部份及60%之沖提部份，分別減壓濃縮後，冷凍乾燥，分別得到8.73g及16.8g之分離物。其中，自60%之沖提部份所得之分離物，作為含有DRA之橄欖萃取物(DRA含量為8.9%)，使用於之後之動物實驗。

實施例5. DRA之血中抗氧化活性 <測定方法>

使用大鼠評估DRA對血中抗氧化活性造成的影響。評估血中抗氧化活性係使用FRAP、ORAC。另外，DRA及洋丁香酚苷係分別使用與實施例2及調製例2相同的方法調製者。

自日本Charles River社購買SD(IGS)系雄性大鼠(6週齡)，以試驗環境馴化1週後，將顯示發育順利的動物供予試驗。使絕食一晚的大鼠，分成5組，各組3隻。分別以5ml/kg之用量，使用管子(Sonde)經口投與，1組為0.5%之CMC溶液，2組為DRA之0.5%之CMC懸浮液(0.8mM)，3組為精製洋丁香酚苷之0.5%之CMC懸浮液(0.8mM)，4組為橄欖油溶液(Nacalai tesque code.073-26)，5組為DRA之橄欖油懸浮液(0.8mM)。1-3組於投與前、投與後0.5、1、3、6、9、24小時後，4-5組於投與前、投與後1、3、6、9、24小時後，自尾靜脈採取血液於肝素採血管，藉由離心分離操作(8,000rpm,10min)，得到血漿樣品。日後，測定血漿FRAP活性及丙酮去蛋白質處理後之上清液之ORAC活性。

結果如圖3~圖6所示。認為洋丁香酚苷投與組之血中抗氧化活性幾乎無上升，但認為DRA投與組於投與後之血中抗氧化活性明顯上升。尤其就FRAP活性來看，因為認為有投與初期(1-3小時後)與第9小時之2相性抗氧化活性波峰，所以可確認DRA具有緩釋性的作用。

實施例6. 體內吸收

使用實施例5中測定血中抗氧化活性用所採取的血漿樣品中1組(0.5%之CMC溶液投與組)，2組(DRA之0.5%之CMC懸浮液投與組)，3組(洋丁香酚苷之0.5%之CMC懸浮液投與組)之部份血漿，進行各樣品投與時之血中濃度測定。

<測定方法>

將各組3隻的血漿等量混合均勻後，於90μl之血漿，添加90μl之來自蝸牛之β-葡萄醣醛酸酶/芳香基硫酸酯酶/醋酸緩衝溶液(pH5.0)，於37℃進行培養1小時。添加900μl之乙腈，結束反應，接著，添加混合10μl之1%之抗壞血酸水溶液，10μl之內部標準溶液，回收離心分離操作(15,000rpm，10min)後之上清液。將回收之上清液減壓濃縮後，再溶解於50%之甲醇，以濾器過濾，交予LC-MS/MS，進行洋丁香酚苷、DRA及水合酪胺醇、咖啡酸之定量。洋丁香酚苷、DRA、水合酪胺醇、咖啡酸量係藉由波峰面積與使用作為內部標準之橙皮苷(Waco)之波峰面積的比而決定。LC-MS/MS之分析條件如下所示。

<HPLC分析條件>

管柱：ACQUITY BEH18(1.7μm，2.1 Φ×100mm， 日本Waters)

移動相：A；0.1%甲酸水溶液，B；乙腈

流速：0.30ml/min

梯度：5% B液，5分鐘，之後以5分鐘，B液由5%至10%，維持10% B液2分鐘，之後以7分鐘，B液由10%至24%，再以4分鐘，B液由24%至80%之線性梯度

<MS/MS分析條件> 測定模式：選擇反應監測 偵測

：洋丁香酚苷(滯留時間約17.4分鐘)；前驅離子m/z=623([M-H]-)，產生離子m/z=161

：DRA(滯留時間約17.0分鐘)；前驅離子m/z=477([M-H]-)，產生離子m/z=161

：水合酪胺醇(滯留時間約3.1分鐘)；前驅離子m/z=153([M-H]-)，產生離子m/z=123

：咖啡酸(滯留時間約8.1分鐘)；前驅離子m/z=179([M-H]-)，產生離子m/z=135

：橙皮苷(滯留時間約18.7分鐘)；前驅離子m/z=609([M-H]-)，產生離子m/z=301

離子化法：ESI法

結果如圖7、圖8、圖9所示。投與洋丁香酚苷時之 洋丁香酚苷之最大血中濃度(Cmax)雖未達1μM，但檢查出代謝物之水合酪胺醇及咖啡酸。水合酪胺醇之最大血中濃度(Cmax)為11.7μM，咖啡酸之最大血中濃度(Cmax)為0.7μM。對此，投與DRA時之DRA之最大血中濃度(Cmax)雖亦仍未達1μM，但檢查出高濃度之代謝物之水合酪胺醇及咖啡酸。水合酪胺醇之最大血中濃度(Cmax)為32.8μM，咖啡酸之最大血中濃度(Cmax)為7.3μM。

因為洋丁香酚苷、DRA中任一種皆不以其原本形態吸收、血中循環，以代謝物之水合酪胺醇或咖啡酸存在於體內，所以使用水合酪胺醇及咖啡酸之AUC，比較體內吸收量之結果如圖10所示。DRA之體內吸收量以水合酪胺醇之AUC比較時，為洋丁香酚苷的約3倍，以咖啡酸之AUC比較時，上升約13倍。

由前述結果，DRA與洋丁香酚苷相比，顯示體內吸收量增加，代謝物之水合酪胺醇及咖啡酸所具有的各種生理活性高。

實施例7. 血中抗氧化作用之含量依賴性評估

比較含有各種濃度的DRA之橄欖萃取物之血中抗氧化作用。

<測定方法>

自日本Charles River社購買SD(IGS)系雄性大鼠 (6週齡)，以試驗環境馴化1週後，使顯示發育順利的動物絕食一晚，分成5組，各組4隻。使用以與實施例2相同的方法製造的DRA、及調製例1所得之橄欖萃取物，調製含有DRA之橄欖萃取物。使此含有DRA之橄欖萃取物，溶解於橄欖油，製成含有0、0.5、1、2、5%之DRA之投與液，以5ml/kg之用量，使用管子(Sonde)經口投與。於投與前、投與後1、3、6、9、24小時後，自尾靜脈採取血液於肝素採血管，藉由離心分離操作(8,000rpm，10min)，得到血漿樣品。日後，測定血漿FRAP活性。

結果如圖11所示。認為DRA之含量依賴性地血中抗氧化活性上升，於2%以上之濃度，明顯的血中抗氧化活性之上升作用。

實施例8. 血中抗氧化活性

依據橄欖萃取物之去鼠李糖反應有無，藉由FRAP活性比較血中抗氧化活性。

<測定方法>

樣品係使用實施例4所調製之含有DRA之橄欖萃取物(DRA含量為8.9%)及實施例4之步驟中僅不進行去鼠李糖反應，其他步驟則同樣地處理之未經酵素處理之橄欖萃取物(洋丁香酚苷含量為9.1%)。

自日本Charles River社購買SD(IGS)系雄性大鼠 (6週齡)，以試驗環境馴化1週後，將顯示發育順利的動物供予試驗。使絕食一晚的大鼠，分成3組，各組4隻。分別以500mg/5ml/kg之用量，使用管子(Sonde)經口投與，1組為橄欖油溶液，2組為含有DRA之橄欖萃取物之橄欖油懸浮液，3組為未經酵素處理之橄欖萃取物之橄欖油懸浮液。於投與前、投與後1、3、6、9、24小時後，自尾靜脈採取血液於肝素採血管，藉由離心分離操作(8,000rpm，10min)，得到血漿樣品。日後，測定血漿FRAP活性。

結果如圖12所示。可確認藉由酵素處理以提高DRA之含量，可使抗氧化活性上升。

實施例9. DRA之緩釋性

試驗動物及投與液係與實施例8相同的方法準備。投與係以500mg/5ml/kg之用量，24小時間隔，連續投與5天，最終投與9小時後，採取血液於肝素採血管，藉由離心分離操作(8,000rpm，10min)，得到血漿樣品。日後，測定血漿FRAP活性。

結果如圖13所示。含有DRA之橄欖萃取物投與組與未經酵素處理之橄欖萃取物投與組比較，認為最終投與9小時後之血中抗氧化活性有意義地上升，確認DRA之緩釋性。

製劑例1. 錠劑

均勻地混合前述各成份，以單發式打錠機打錠，製造直徑為10mm，1粒300mg之錠劑。每1日4粒為推薦攝取量。

製劑例2. 顆粒劑

均勻地混合前述各成份後，加入100ml之10%羥丙基纖維素之乙醇溶液，以常法混練，壓出後乾燥而得顆粒劑。此小袋1.5g/包，每1天攝取1包。

製劑例3. 軟膠囊劑

每1日摻混量 1天2粒為推薦攝取量。

由前述成份而成之軟膠囊劑膜中，依據常法填充以下所示之組成物，得到1粒300mg之軟膠囊。此軟膠囊1天2粒為推薦攝取量。

製劑例4. 口服液劑

摻混前述成份，加水而成10L。此口服液劑係每1次飲用約100ml。

產業上利用性

依據本發明，可提供於身體內發揮高抗氧化作用之飲食品、醫藥部外用品及醫藥。

Claims (8)

1. 一種橄欖萃取物，其特徵係含有1重量%以上之去鼠李糖洋丁香酚苷。
2. 如申請專利範圍第1項之橄欖萃取物，其含有5重量%以上之去鼠李糖洋丁香酚苷。
3. 一種組成物，其特徵係摻混如申請專利範圍第1或2項之橄欖萃取物。
4. 如申請專利範圍第3項之組成物，其中組成物係飲食品。
5. 一種飲食品，其特徵係含有1重量%以上之去鼠李糖洋丁香酚苷，且含有橄欖萃取物。
6. 一種含有1重量%以上之去鼠李糖洋丁香酚苷之橄欖萃取物之用途，其特徵係用於血中抗氧化劑之製造。
7. 一種製造方法，其係含有1重量%以上之去鼠李糖洋丁香酚苷之橄欖萃取物之製造方法，其特徵係包含將含有洋丁香酚苷之橄欖萃取物，以具有去鼠李糖活性之糖苷水解酵素進行處理之步驟。
8. 如申請專利範圍第7項之製造方法，其中糖苷水解酵素係柚苷酶(naringinase)。