TWI688657B

TWI688657B - 核酸、誘導型重組質體、轉形株、無醣基化乙醯膽鹼酯酶及其製備方法

Info

Publication number: TWI688657B
Application number: TW107120059A
Authority: TW
Inventors: 魏嘉鋒; 曾志正; 黃秀珍; 宋濟民
Original assignee: 吾幫土智慧生活有限公司
Priority date: 2018-06-11
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2020-03-21
Also published as: TW202000920A

Abstract

本發明係關於一種核酸、誘導型重組質體、轉形株、無醣基化乙醯膽鹼酯酶及無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法。所述核酸係編碼乙醯膽鹼酯酶融合蛋白。所述誘導型重組質體係包含前述編碼乙醯膽鹼酯酶融合蛋白的核酸。所述轉形株係將所述誘導型重組質體轉形於大腸桿菌(Escherichia coli)宿主細胞中而得。所述無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，係利用前述轉形株進行液態培養，當液態培養物達到預設菌體濃度時，於液態培養物中加入誘導物，以誘導前述誘導型重組質體表現乙醯膽鹼酯酶，並可經由純化後得到具高活性無醣基化乙醯膽鹼酯酶。

Description

核酸、誘導型重組質體、轉形株、無醣基化乙醯膽鹼酯酶及其製備方法

本發明係關於一種核酸、誘導型重組質體、轉形株、乙醯膽鹼酯酶以及乙醯膽鹼酯酶之製備方法。特別是編碼乙醯膽鹼酯酶融合蛋白的核酸、適用於大腸桿菌之誘導型重組質體、生產無醣基化乙醯膽鹼酯酶的轉形株、無醣基化乙醯膽鹼酯酶以及無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法。

乙醯膽鹼酯酶(Acetylcholinesterase；簡稱為AChE，EC 3.1.1.7)是一種透過水解作用降解神經傳導物質-乙醯膽鹼使其分解成為膽鹼和乙酸的酵素。乙醯膽鹼酯酶在生物體中經後修飾為醣蛋白，主要位於動物的神經系統突觸神經元細胞膜上。乙醯膽鹼酯酶的作用為分解乙醯膽鹼以終止神經傳導，分解後產生之膽鹼可以被重新利用合成新的乙醯膽鹼分子。然而，當乙醯膽鹼酯酶之活性區域與抗膽鹼激性物質(包括有機磷劑與氨基甲酸鹽類之殺蟲劑)結合，則無法分解乙醯膽鹼，造成神經傳導的紊亂。

由於敏感性家蠅之乙醯膽鹼酯酶對於有機磷劑與氨基甲酸鹽類農藥極為敏感，且其酵素活性易於檢測，因此農業試驗利用萃取自敏感性家蠅腦部之乙醯膽鹼酯酶開發一種生化檢驗法(Chiu et al.,1991)，其可用以檢測蔬果有機磷劑及氨基甲酸鹽兩類殺蟲劑殘留累計毒性。並自1985年起於產地及市場同步設置快速檢測站，建立農藥殘毒監測工作網。

除了由生物體中直接萃取乙醯膽鹼酯酶，近年來因分子生物學及基因工程之進步，亦有許多文獻嘗試以昆蟲細胞、酵母菌、大腸桿菌等不同的宿主細胞表達重組乙醯膽鹼酯酶。依據2012年發表的文獻資料指出，利用昆蟲細胞和酵母菌雖可以成功表達生產重組乙醯膽鹼酯酶，但重組乙醯膽鹼酯酶的產量不高且酵素活性尚可。而以昆蟲細胞和酵母菌作為宿主細胞所生產的重組乙醯膽鹼酯酶因具有蛋白後修飾作用，與從生物體來源的乙醯膽鹼酯酶一樣具有醣基化(glycosylation)。甚至以酵母菌作為宿主細胞所生產的重組乙醯膽鹼酯酶因過度醣基化後修飾，而造成重組乙醯膽鹼酯酶的活性不佳。另外，先前文獻亦有嘗試以大腸桿菌作為宿主細胞生產無醣基化(nonglycosylated)乙醯膽鹼酯酶(Dong et al.,2012)，但前述文獻無法得到穩定有活性的乙醯膽鹼酯酶。

有鑒於此，本發明之一態樣是提供一種單離的核酸，其序列如序列辨識編號1所示，係編碼一乙醯膽鹼酯酶融合蛋白。

本發明之另一態樣是提供一種誘導型重組質體，包含依序排列之如序列辨識編號2所示之誘導型表現元件序列、如序列辨識編號3所示之啟動子序列、如序列辨識編號1所示之核酸及如序列辨識編碼4所示之抵抗抗生素基因。

依據前述之誘導型重組質體，可更包含如序列辨識編號5所示之一標籤序列，其係連接於如序列辨識編號1所示之核酸之3’端。

本發明之再一態樣是提供一種轉形株，包含宿主細胞和誘導型重組質體。所述宿主細胞為大腸桿菌(Escherichia coli)。所述誘導型重組質體包含依序排列之如序列辨識編號2所示之誘導型表現元件序列、如序列辨識編號3所示之啟動子序列、如序列辨識編號1所示之核酸及如序列辨識編碼4所示之抵抗抗生素基因。

依據前述之轉形株，所述大腸桿菌可為氧化態大腸桿菌。較佳地，可為AD494(DE3)菌株或Origami(DE3)菌株。

本發明之又一態樣是提供一種無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，包含提供液態培養物、進行誘導步驟、進行分離步驟以及進行純化步驟。所述液態培養物包含前段所述之轉形株。所述誘導步驟係培養所述轉形株至菌體濃度的光學密度值達0.5至0.7時，於誘導溫度下加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導一誘導時間，使所述誘導型重組質體表現乙醯膽鹼酯酶融合蛋白，所述誘導溫度大於0℃小於等於30℃，誘導時間為7小時至150小時。所述分離步驟係將轉形株分離自液態培養物。所述純化步驟係破壞轉形株的細胞後，以一純化方式純化無醣基化乙醯膽鹼酯酶。

依據前述之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，其中所述誘導溫度可為4℃至16℃。

依據前述之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，其中所述誘導時間可為48小時至96小時。

依據前述之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，其中所述純化方式可為利用層析管柱純化所述無醣基化乙醯膽鹼酯酶，或可為利用濃度為3M至8M的尿素純化所述無醣基化乙醯膽鹼酯酶。

本發明之再一態樣是提供一種無醣基化乙醯膽鹼酯酶，其係依前段所述之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法所製得，其具有水解乙醯膽鹼的活性。

藉此，本發明所提供的核酸、誘導型重組質體、轉形株、無醣基化乙醯膽鹼酯酶以及無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，可以利用生產成本較低且易操作的大腸桿菌作為宿主細胞，大量製備無醣基化乙醯膽鹼酯酶，且所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶具有高水解乙醯膽鹼的活性，可進一步應用於農藥檢測。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

100‧‧‧無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法

110、120、130、140‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明一實施方式之誘導型重組質體之構築示意圖；第2圖繪示本發明另一實施方式之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法之步驟流程圖；以及第3圖為經本發明之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法所製得之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之蛋白質電泳分析圖。

本說明書揭露內容提出一種新穎的核酸、誘導型重組質體、轉形株以及無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法。其係透過生物資訊、蛋白分析以及全基因合成方式，將敏感性家蠅(SRS)之乙醯膽鹼酯酶基因優化，並於乙醯膽鹼酯酶基因的5’端接上融合序列後，得到編碼乙醯膽鹼酯酶融合蛋白的核酸。再經由遺傳工程技術構築包含前述編碼乙醯膽鹼酯酶融合蛋白的核酸的誘導型重組質體、將前述誘導型重組質體轉形至大腸桿菌(Escherichia coli)而得的轉形株，以及利用前述轉形株的無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法。可以利用生產成本較低且易操作的大腸桿菌作為宿主細胞，以誘導的方式大量生產無醣基化乙醯膽鹼酯酶，且所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶具有高活性，可進一步應用於農藥檢測。

本說明書中所述之「氧化態大腸桿菌」係指缺乏還原雙硫鍵基因(Thioredoxin reductase,trxB)的大腸桿菌菌株，其能於細胞質中形成雙硫鍵，使所表達的重組蛋白保留並折疊成正確構型。

本發明前述所稱之「誘導型」在此係指導入宿主細胞之質體，其啟動子為誘導型表現重組蛋白。誘導型表現系統需於特定誘導條件下才能誘發外源基因表現，可避免持續表現具細胞毒性的蛋白質所引起的傷害。在本發明一例示中，本發明適合的轉形株為誘導型表現系統，且適合的特定誘導條件可包括但不限於預設菌體濃度。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。

[試驗例]

一、本發明之核酸、誘導型重組質體以及轉形株

為了得到本發明之單離的核酸，將敏感性家蠅(SRS)的乙醯膽鹼酯酶胺基酸序列，去除訊息胜肽(signal peptide)和跨膜(transmembrane)的疏水性區域後，再依據大腸桿菌密碼子偏好情況優化編碼乙醯膽鹼酯酶的核酸序列，乙醯膽鹼酯酶基因的5’端接上S-tag融合序列，得到如序列辨識編號1所示序列之核酸，其編碼乙醯膽鹼酯酶融合蛋白。於乙醯膽鹼酯酶的N端融合S-tag(Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser)，可增加乙醯膽鹼酯酶於大腸桿菌表達後之水溶性。

再將如序列辨識編號1所示序列之核酸構築至誘導型表現載體中以得到本發明之誘導型重組質體。本發明之誘導型重組質體，包含依序排列之如序列辨識編號2所示之誘導型表現元件序列、如序列辨識編號3所示之啟動子序列、如序列辨識編號1所示之核酸及如序列辨識編碼4所示之抵抗抗生素基因。本發明之誘導型重組質體可更包含如序列辨識編號5所示之標籤序列，其係連接於如序列辨識編號1所示之核酸之3’端。請參照第1圖，其繪示本發明之誘導型重組質體(實施例)之構築示意圖。詳細地說，設計限制酶切位將如序列辨識編號1所示序列之核酸構築至pET29a表現載體中，並於乙醯膽鹼酯酶基因的3’端接上6個組氨酸(His)之組氨酸標籤(his-tag)作為純化之用。所得到的誘導型重組質體包含依序排列之如序列辨識編號2所示之lacl基因、如序列辨識編號3所示之T7啟動子序列、如序列辨識編號1所示之編碼乙醯膽鹼酯酶融合蛋白(ache)的核酸、如序列辨識編號5所示之組氨酸標籤序列及如序列辨識編碼4所示之抵抗卡納黴素基因(Kan^r)。本發明之誘導型重組質體可持續表現LacI作為誘導型重組質體乳糖操縱組之抑制物，以調控目標基因乙醯膽鹼酯酶融合蛋白之表現，當加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)時，乙醯膽鹼酯酶融合蛋白才會表現。

再將構築好的誘導型重組質體轉形至大腸桿菌中以得到本發明的轉形株，轉形的方式可以包含但不限定以氯化鈣處理等化學方式或電穿孔等物理方式進行。所轉形的大腸桿菌可為氧化態大腸桿菌，較佳地，可為AD494(DE3)菌株或Origami(DE3)菌株。

因家蠅來源之乙醯膽鹼酯酶存在3個以上之雙硫鍵，為確認本發明之轉形株於表達乙醯膽鹼酯酶融合蛋白時雙硫鍵之鍵結是否正確，使所表達的乙醯膽鹼酯酶能正確摺疊。於本試驗例中另將本發明之誘導型重組質體轉形至還原態大腸桿菌中作為比較，所轉形還原態大腸桿菌的菌株為BL21(DE3)。此外，本試驗另構築於乙醯膽鹼酯酶基因的5’端不具有融合蛋白序列的誘導型重組質體作為比較例1，以及乙醯膽鹼酯酶基因的5’端具有TRX融合蛋白序列的誘導型重組質體作為比較例2。比較例1的誘導型重組質體和比較例2的誘導型重組質體與實施例的誘導型重組質體，差異僅在於乙醯膽鹼酯酶基因的5’端融合蛋白序列，其餘部分相同。並再分別將比較例1的誘導型重組質體和比較例2的誘導型重組質體轉形至氧化態大腸桿菌中，以得到比較例1的轉形株和比較例2的轉形株，所轉形氧化態大腸桿菌的菌株為BL21(DE3)。

將前述所得到的轉形株分別以50mL的LB培養基搖瓶培養至OD₆₀₀=0.6時，加入0.5mM的IPTG於37℃下誘導2小時後，再經由Ni⁺-NTA純化無醣基化乙醯膽鹼酯酶，並以Ellman’s method測試所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性。

請參照下表一，為本發明之誘導型重組質體於不同大腸桿菌菌株表達所製備之無醣基化乙醯膽鹼酯酶的活性比較。以及本發明之誘導型重組質體與比較例之誘導型重組質體所製備之無醣基化乙醯膽鹼酯酶的活性比較。

表一的結果顯示，本發明之誘導型重組質體於一般還原態大腸桿菌菌株所表現的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性極低(1U/mg)，而於氧化態大腸桿菌菌株中表現，能促使無醣基化乙醯膽鹼酯酶形成正確之雙硫鍵，使所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性達到17U/mg，顯示氧化態大腸桿菌對於後續所表達無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性的重要性。此外，本發明之誘導型重組質體於乙醯膽鹼酯酶N端加入S-tag，使所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性可達到17 U/mg，比較乙醯膽鹼酯酶N端不帶有其它融合蛋白序列的比較例1，其所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性僅有3U/mg；以及乙醯膽鹼酯酶N端另外加上TRX融合蛋白序列的比較例2，其所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性亦僅有4U/mg。顯示本發明之核酸所編碼的乙醯膽鹼酯酶融合蛋白，對於後續收成之無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性差別，於乙醯膽鹼酯酶的N端加入S-tag可使後續製備方法獲得較高活性的無醣基化乙醯膽鹼酯酶。

二、本發明之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法

請參照第2圖，係繪示本發明之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法100之步驟流程圖。第2圖中，無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法100包含步驟110、步驟120、步驟130與步驟140。

步驟110是提供液態培養物，其中液態培養物中包含本發明之轉形株。

步驟120是進行誘導步驟，係培養所述轉形株至菌體濃度的光學密度值達0.5至0.7時，於誘導溫度下加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導一誘導時間，使所述誘導型重組質體表現乙醯膽鹼酯酶融合蛋白。其中所述誘導溫度可大於0℃小於等於30℃。較佳地，誘導溫度為4℃至10℃。所述誘導時間可為7小時至150小時。較佳地，誘導時間為48小時至96小時。

步驟130是進行分離步驟，係將轉形株分離自液態培養物。在誘導步驟完成後，因轉形株中已充滿表現後的乙醯膽鹼酯酶融合蛋白，因此將轉形株自液態培養物分離後，即可於轉形株中獲得無醣基化乙醯膽鹼酯酶，所述無醣基化乙醯膽鹼酯酶的胺基酸序列如序列辨識編號6所示。而分離方式可為過濾方式、離心方式或上述方式之組合。

步驟140是進行純化步驟，係破壞轉形株的細胞後，以一純化方式純化無醣基化乙醯膽鹼酯酶。所述純化方式可為利用一層析管柱純化無醣基化乙醯膽鹼酯酶，或可為利用濃度為3M至8M的尿素純化無醣基化乙醯膽鹼酯酶，所述的層析管柱可為Ni⁺-NTA。而轉形株的細胞可利用物理法或化學法破壞，例如使用研磨、壓力、超音波震盪等機械力進行破壞；利用反覆冷凍解凍的溫度變化，使轉形株體內的水於冷凍時變成固態結晶，而破壞其細胞膜等結構；利用鹽濃度不同導致滲透壓差異使轉形株漲破；或使用藥劑或酵素分解轉形株的細胞膜。

2.1.小量製備本發明之無醣基化乙醯膽鹼酯酶

本試驗先利用搖瓶方式小量培養本發明之轉形株，初步測試無醣基化乙醯膽鹼酯酶的誘導表現條件，以得到無醣基化乙醯膽鹼酯酶的最適誘導溫度與最佳誘導時間。

試驗時將本發明的轉形株以50mL的LB培養基搖瓶培養至OD₆₀₀=0.6時，加入0.5mM的IPTG，並分別於下表二所列之誘導溫度和誘導時間進行誘導步驟，待誘導步驟完成後，將轉形株以離心的方式與液態培養物分離，並破壞轉形株的細胞後將其分為可溶性蛋白(soluble fraction)及不可溶之內涵體(inclusion body)。可溶性蛋白的部分以Ni⁺-NTA純化無醣基化乙醯膽鹼酯酶，不可溶的內涵體以8M尿素純化無醣基化乙醯膽鹼酯酶。並以Ellman’s method測試所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性。

請參照下表二，為以不同的誘導條件下所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性。

表二的結果顯示，於30℃培養誘導7小時或12小時後，將破壞轉形株的細胞後分為可溶性蛋白及不可溶之內涵體，可溶性部分經由純化後可得到無醣基化乙醯膽鹼酯酶的活性分別為191U/mg(7小時)及684U/mg(12小時)，而從內涵體經由8M尿素方式變性回復之無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性則分別為30U/mg(7小時)及35U/mg(12小時)。此外，以非一般常用的低溫方式(16℃以下，4℃以上)作誘導，於100小時後純化可溶之蛋白部分，可得到活性高達2000U/mg之無醣基化乙醯膽鹼酯酶，可見在低溫長時間下有助於此酵素多個雙硫鍵以正確的方式結合，蛋白得以正確褶疊展現無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性。比較前人研究以酵母菌製備之醣基化乙醯膽鹼酯酶活性約為50U/mg(Tan et al.,2011)，活性高出許多。

2.2.醱酵槽高密度製備本發明之無醣基化乙醯膽鹼酯酶

本試驗進一步測試本發明之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法於醱酵槽高密度的條件下，所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶的活性和產量。

將本發明之轉形株從-80℃菌株保存瓶中以接種環直接沾取畫於LB agar(ampicillin)盤上，於37℃培養1天。以接種環挑取1-2個菌落養於200mL LB的三角瓶，於37℃震盪培養24小時。再於醱酵槽中以液態培養基加入1/20之隔夜菌液37℃培養至生長對數中期(mid-log phase)，降低溫度至30℃以下，加入0.5mM之IPTG誘導產生無醣基化乙醯膽鹼酯酶。再將轉形株以離心的方式與液態培養物分離，並破壞轉形株的細胞後，以Ni⁺-NTA管柱純化透析後可得到高活性之無醣基化乙醯膽鹼酯酶。

請參照第3圖，為經本發明之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法所製得之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之蛋白質電泳分析圖，其中Lysate表示破菌後上清液之可溶性總蛋白，FT表示未與Ni⁺-NTA結合而流出之蛋白，Wash表示純化過程中以10mM的咪唑(imidazole)沖洗出之蛋白，Purified表示純化後之蛋白質。箭頭所指之處為無醣基化乙醯膽鹼酯酶，結果顯示本發明之轉形株以及無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法亦適用於醱酵槽高密度的條件下大量製備無醣基化乙醯膽鹼酯酶。

本試驗例進一步於醱酵槽中，於16℃以下的低溫條件進行誘導，並分別在第2天、第4天、第6天收集液態培養物，再將轉形株以離心的方式與液態培養物分離，並破壞轉形株的細胞後，以Ni⁺-NTA管柱純化無醣基化乙醯膽鹼酯酶，以Ellman’s method測試所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性。

請參照下表三，為於低溫條件下以不同誘導時間進行誘導步驟，所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶活性。

表三的結果顯示，誘導時間為6天所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶的比活性較高，但於誘導時間為4天所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶的產量較高，若以產量的角度考量，進行誘導步驟後的第4天為收集樣品的最佳時間點。

三、本發明所製得之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之農藥抑制率測試

本試驗進一步將純化後之高活性無醣基化乙醯膽鹼酯酶(重組AChE)與納乃得(Methomyl)、陶斯松(Chlorpyrifos)及美文松(Mivenphos)等農藥進行抑制率測試，並且與現有家蠅萃取生產之醣基化乙醯膽鹼酯酶(野生型AChE)作比較，以確認以本發明之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法於所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶確實可用於農藥檢測。

請參照下表四，為本發明所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶對於不同農藥的抑制率。

表四的結果顯示，本發明所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶與萃取自家蠅的醣基化乙醯膽鹼酯酶對於納乃得和陶斯松具有相當的抑制率，且本發明所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶對於美文松更具敏感性，顯示本發明所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶對農藥為高敏感性，顯示其可應用於農藥檢測的潛力。

綜上所述，本發明所提供的核酸、誘導型重組質體、轉形株、無醣基化乙醯膽鹼酯酶以及無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，可以利用生產成本較低且易操作的大腸桿菌作為宿主細胞，大量製備無醣基化乙醯膽鹼酯酶，所製備的無醣基化乙醯膽鹼酯酶具有高水解乙醯膽鹼的活性，且對於農藥亦具有高敏感性，因此具有應用於農藥檢測的潛力。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

<110> 吾幫土智慧生活有限公司

<120> 核酸、誘導型重組質體、轉形株、無醣基化乙醯膽鹼酯酶及其製備方法

<160> 6

<210> 1

<211> 1824

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 編碼乙醯膽鹼酯酶融合蛋白之核酸

<400> 1

<210> 2

<211> 1640

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> lacl基因

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> T7啟動子序列

<400> 3

<210> 4

<211> 816

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 抵抗卡納黴素基因(Kan^r)

<400> 4

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 組胺酸標籤序列

<400> 5

<210> 6

<211> 589

<212> PRT

<213> Musca domestica

<223> 乙醯膽鹼酯酶

<400> 6

100‧‧‧無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法

110、120、130、140‧‧‧步驟

Claims

一種單離的核酸，其序列如序列辨識編號1所示，係編碼一乙醯膽鹼酯酶融合蛋白。
一種誘導型重組質體，包含依序排列之如序列辨識編號2所示之一誘導型表現元件序列、如序列辨識編號3所示之一啟動子序列、如序列辨識編號1所示之一核酸及如序列辨識編碼4所示之一抵抗抗生素基因。
如申請專利範圍第2項所述之誘導型重組質體，更包含一如序列辨識編號5所示之一標籤序列，其係連接於如序列辨識編號1所示之該核酸之3’端。
一種轉形株，包含：一宿主細胞，其中該宿主細胞為一大腸桿菌(Escherichia coli)；以及如申請專利範圍第2項所述之該誘導型重組質體。
如申請專利範圍第4項所述之轉形株，其中該大腸桿菌為一氧化態大腸桿菌。
如申請專利範圍第5項所述之轉形株，其中該氧化態大腸桿菌為AD494(DE3)菌株或Origami(DE3)菌株。
一種無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，包含：提供一液態培養物，其中該液態培養物包含如申請專利範圍第4項至第6項任一項所述之該轉形株；進行一誘導步驟，係培養該轉形株至一菌體濃度的一光學密度值達0.5至0.7時，於一誘導溫度下加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導一誘導時間，使該誘導型重組質體表現一乙醯膽鹼酯酶融合蛋白，其中該誘導溫度大於0℃小於等於37℃該誘導時間為7小時至150小時；進行一分離步驟，係將該轉形株分離自該液態培養物；以及進行一純化步驟，係破壞該轉形株的細胞後，以一純化方式純化該無醣基化乙醯膽鹼酯酶。
如申請專利範圍第7項所述之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，其中該誘導溫度為4℃至16℃。
如申請專利範圍第7項所述之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，其中該誘導時間為48小時至96小時。
如申請專利範圍第7項所述之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，其中該純化方式為利用一層析管柱純化該無醣基化乙醯膽鹼酯酶。
如申請專利範圍第7項所述之無醣基化乙醯膽鹼酯酶之製備方法，其中該純化方式為利用濃度為3M至8M的尿素純化該無醣基化乙醯膽鹼酯酶。
一種依申請專利範圍第7項之製備方法製得之無醣基化乙醯膽鹼酯酶，其具有水解乙醯膽鹼的活性。